INDEX, ÍNDICE

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SYMBOLS SIMBOLOS SIMBOLI SYMBOL SYMBOLES ΣΎΜΒΟΛΟ SIMBOLIS SYMBOLY SYMBOLE

SENSITITRE®

Broth Microdilution (MIC) Method:

For Rapidly Growing Mycobacteria (RGM), Slowly Growing Nontuberculosis

Mycobacteria, Nocardia and other Aerobic Actinomycetes

CE In vitro Diagnostic Use Only

For full plate information, including plate layout, QC information refer to www.trekds.com/techinfo. The plate code and batch number will be required.

INTENDED USE Susceptibility testing of rapidly growing mycobacteria including Mycobacterium fortuitum group (M. fortuitum, M. peregrinum, M. fortuitum third biovariant complex), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum) and M. smegmatis group (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi). Nocardia spp and other aerobic actinomycetes. Slowly growing nontuberculosis mycobacteria (NTM), i.e. Mycobacterium avium complex, Mycobacterium kansasii and Mycobacterium marinum.

Please refer to CLSI for details of testing M. marinum

TREK Diagnostic Systems manufactured broth has only been validated with Sensititre® Products.

PRINCIPALS OF USE Each plate is dosed with antimicrobial agents at appropriate dilutions. Results can be read manually by visual reading of growth.

PRECAUTIONS Only personnel trained and qualified in susceptibility testing techniques should use the system. The laboratory should have established biosafety guidelines for handling mycobacteria. Since living micro-organisms used with this product can be infectious to the user, proper handling and disposal methods should be used. Only instruments supported by Sensititre i.e. a simple mirror viewer, Sensitouch, Vizion must be used to report results with CE IVD and FDA cleared Sensititre products, any other system used will not be supported.

STORAGE AND SHELF LIFE The plates should be stored at room temperature (15-25°C) away from direct sunlight and direct heat. Each plate is packaged in foil with a silica gel desiccant. Do not use the plate if past its expiration date, or the desiccant colour is not blue or orange or the foil pouch is damaged. Inoculate plate within 5 hours of removal from pouch.

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PROCEDURE Materials included: Sensititre® plate Adhesive seal

Materials not included: Sensititre® demineralized water [T3339] Sensititre® cation adjusted Mueller-Hinton broth with TES buffer (CAMHBT) [T3462] Sensititre® cation adjusted Mueller-Hinton broth with OADC [T8006] Sensititre® doseheads (for use with AutoInoculator®/AIM®) [E3010] Sensititre® AutoInoculator®AIM®[V3010] Sensititre® AIM® [V3020] Sensititre Vizion® [V2021]

Sensititre Nephelometer® [V3011] Manual Viewer [V4007] 0.5 McFarland turbidity polymer standard [E1041] 50µL or 100µL pipettor and disposable tips Quality control strains Agar plates Incubator 30-350C, non-CO2 Vortex mixer Demineralized water with glass beads Current CLSI documents

SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Specimens should be collected, transported, stored and then plated on to primary isolation medium to give isolated colonies using standard procedures .

SELECTION OF SUSCEPTIBILITY TEST BROTH Use only Sensititre®

CAMHBT for rapid growing mycobacteria, Nocardia and other aerobic Actinomycetes or Sensititre® Mueller Hinton broth with OADC for slow growing mycobacteria. Sensititre® broths are performance tested for use with Sensititre® susceptibility products.

INOCULATION AND INCUBATION Rapid growing mycobacteria, Nocardia spp and other aerobic actinomycetes Allow all broths to come up to room temperature before use.

1. Sweep the confluent portion of growth from growth on an agar plate with a swab. Emulsify in demineralized water and adjust to a 0.5 McFarland Standard visually or using the Sensititre® nephelometer. If particles are visible, vortex well. Actinomycetes typically have very hard crusty colonies. It may be necessary to vortex with glass beads to make a homogeneous suspension. If large clumps remain after vortexing, they should be allowed to settle and the supernatant used for the inoculum suspension.

Moistening the swab with demineralized water may facilitate a more homogeneous solution… Warning- the use of water supplemented with Tween may affect MICs

2. Transfer 50µl of the suspension into a tube of cation adjusted Mueller-Hinton broth with TES buffer to give an inoculum of 5x105 cfu/mL (range 1x105 to 1x106 cfu/mL). Mix well.

Steps 1 and 2 must be completed within 30 minutes.

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3. Plates containing ≥ 32µg/mL doxycycline or minocycline may show a precipitate after incubation. This can be prevented by reconstituting these well with 5µL sterile distilled water before addition of broth. 4. Transfer 100µL to each well by either: a. Sensititre® AutoInoculator®/AIM® . Replace the tube cap with a Sensititre® single-use dosehead and inoculate the plate according to the AutoInoculator®/AIM® instructions. Remove the test tube dosehead combination from the AutoInoculator/AIM within 30 seconds of dosing a plate and store inverted in a rack or discard. b. Manual pipette. Pour the broth into a sterile seed trough and inoculate the plate using an appropriate pipette. Dose the panel with the Sensititre® label facing the user. Pipettes should be periodically serviced and checked for calibration Inoculate broth into a plate within 30 minutes. 5. A periodic check of the colony count of the positive control well should be done. (See Appendix 1) Isolates should have an inoculum of 5x105 CFU/mL, (range 1x105 – 1x106) 6. Cover all wells with the adhesive seal. Press all wells firmly to assure adequate sealing. Avoid creases as these can lead to skips. 7. Incubate rapid growing mycobacteria aerobically at 300C in a non-CO2 incubator for 72 hours. Check for growth. If poor, reincubate for up to a further 48 hours. Incubate Nocardia and other aerobic Actinomycetes at 350C in a non-CO2 incubator for 2-3 days. Incubation of 4-5 days may be required for isolates of M. chelonae and M. abscessus. CLSI recommends nonpigmented rapidly growing Mycobacteria be incubated for 14 days to ensure detection of inducible macrolide resistance, unless the isolate is resistant at an earlier reading. Plates can be stacked up to three high. Slow Growing Nontuberculous Mycobacteria (NTM including MAC) Same procedure as above except transfer 50µL of the organism suspension into 11mL of Sensititre® Mueller-Hinton broth with 5% v/v OADC growth supplement. Invert the tube 8-10 times. It may help to vortex with demineralised water and glass beads to make a homogeneous suspension. Incubate at 350C in a non-CO2 incubator and read after 7 days. If growth is good in the positive control, read results. Otherwise re-incubate for up to 14 days. CLSI M24 provides reading guidelines and illustrations of various growth patterns. Prolonged incubation may require taking steps to prevent loss of well contents through evaporation. Place the plates in a plastic container with the top ajar to facilitate gas exchange.

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READING TEST RESULTS Results can be read using the Sensititre® manual viewer or the Vizion®. See Vizion® User Manual. It is not necessary to remove the adhesive seal. Place the plate with the label facing the user. Growth appears as turbidity or as a deposit of cells at the bottom of a well. The MIC is recorded as the lowest concentration of antimicrobic that inhibits visible growth. Please refer to CLSI M24 for guidance on reading endpoints. Reading faint growth on Vizion® can be improved by use of bright indirect lighting against a dark background. The positive growth control wells should be read first. If any show no growth, results are invalid. Mycobacteria end points can be difficult to interpret. CLSI M24 provides reading guidelines and illustrations of various growth patterns. Negative wells can show a slight precipitate related to the inoculum. Reading QC strains with known MICs should be used for training Growth can range from a few colonies with no turbidity to heavy growth comparable to positive growth control. The MIC is the lowest concentration that completely inhibits growth except for sulphonamides, where the MIC is read as the lowest concentration that inhibits 80% growth compared to the positive control. The following points should be noted: a. Contamination Contamination may result in growth in a well bordered by wells showing no growth. Such a single well contamination can be ignored, but if multiple well contaminants are suspected, the test should be repeated. b. Skips Occasionally a “skip” may be seen - a well showing no growth bordered by wells showing growth. There are variety of explanations including contamination, mutation, creased seal and misaligned dosing. A single skip can be ignored. However, in order to ensure effective antimicrobic therapy NEVER read the skipped well as the MIC; always read the lowest well concentration above which there is consistently no growth. c. Mixed Cultures Except as referred to in (a) above, if two end points are seen as a distinct “button” of cells followed by several wells of diffuse growth with the “button” no longer visible (or seen as smaller buttons), there may be a mixed bacterial population. Purity should be checked by sub-culturing growth onto suitable agar. Test results are invalid if a mixed culture is detected.

INTERPRETATIVE GUIDELINES Refer to the MIC Interpretive guidelines as provided by the CLSI , or your national reference group.

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INDICATIONS FOR USE

Antimicrobial RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacin X X XX X

Amoxicillin/ Clavulanic acid

XX X

Capreomycin

Cefepime XX

Cefoxitin X

Cefotaxime XX

Ceftriaxone X

Ciprofloxacin X X XX X

Clarithromycin7 X X XX

3 X X

Clofazimine4

X X X

Doxycycline X XX

Ethambutol XX X

Ethionamide

Gentamicin XX

Imipenem X X

Isoniazid5

XX XX

Kanamycin

Levofloxacin X

Linezolid X X XX X

Meropenem XX XX

Minocycline X X XX X

Moxifloxacin X X XX X

Ofloxacin6

Rifabutin XX X

Rifampin X X

Streptomycin XX XX

Sulfamethoxazole X X XX XX

Tigecycline X

Tobramycin X X

Trimethoprim/ Sulfamethoxazole

X X XX X

Key RGM Rapid growing mycobacteria NOC Nocardia spp. SGM Slow growing mycobacteria MAC M.avium complex

X: First line XX: Second line

1 Information on M.kansasii 2 Slow growers other than MAC or M.kansasii 3 Clarithromycin is the only antimicrobial reported for M.avium complex. Hence it is a first line drug for this organism 4 Requires a single patient IND to obtain clofazimine in the USA. Susceptibility methods and breakpoints have not been established or standardized by CLSI. 5 Problematic for testing NTM; breakpoints have yet to be established for NTM. 6 May not be available in the USA.

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7 CLSI recommends nonpigmented rapidly growing Mycobacteria be incubated for 14 days to ensure detection of inducible macrolide resistance, unless the isolate is resistant at an earlier reading. QUALITY CONTROL Frequency of quality control testing should be according to local guidelines. Inocula should be cultured on a suitable medium to check for purity and/or colony morphology composition a. Test results are invalid if a mixed culture is detected. All Sensititre® plates include positive control wells. Tests are invalid unless there is distinct growth in all positive control wells A number of factors influence MIC’s including organism state, inoculum density, temperature and broth. In practice, replicate MIC’s form a normal distribution with the majority of results lying within one dilution of the modal value. The test procedure can be considered satisfactory if control organism MIC’s are within range. Results should not be reported if QC results are not in range. Table 1 lists tentative QC ranges using mycobacteria strains. Until other data becomes available, S.aureus ATCC 29213 and other non-mycobacterial QC strains and ranges from CLSI document M100 can be used for panel QC (Table 2). CLSI M100 QC strains should use the same inoculation method as for rapid growing mycobacteria except that 50µL of inoculum should be added to Sensititre® Mueller Hinton broth with TES. Do not use broth supplemented with OADC. Panels should be read after 18 to 24 hours incubation at 35°C. M. avium 700898 QC strain should be incubated at 350C in a non-CO2 incubator and read at 7 days. If growth is good in the positive control, read results. Otherwise re-incubate for up to 10 days. CLSI M24 provides reading guidelines and illustrations of various growth patterns. a Morphological variation has been observed with M. avium 700898. Up to three colony types have been identified (1. Smooth dome, 2. Opaque dome with transparent rough edge, 3. Flat and transparent with rough edge). MIC may be affected by colony type(s) used for inoculum. MIC of Isoniazid, Moxifloxacin and Rifampin may vary between M. avium 700898 cultures.

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Table 1: Tentative Quality Control Ranges for mycobacteria QC strains1 and S.aureus ATCC 29213 Antimicrobial agent S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacin ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amoxicillin/clavulanate 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Capreomycin - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Cefotaxime 1-4

Cefepime 1-4

Cefoxitin 1-4* 4-32*

Ceftriaxone 1-8

Ciprofloxacin 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Clarithromycin 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Clofazimine - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Doxycycline 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Ethambutol - 2-16 2-16

Ethionamide - >20 20-80****

0.6 – 5 (7 days incubation)

1.25 – 10 (10-11 days incubation)

Gatifloxacin 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Isoniazid - 1-4 ≥13

Kanamycin 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Levofloxacin 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolid 1-4* 1-8* 8-323

Meropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minocycline 0.06-0.54

0.12-0.5*

Moxifloxacin 0.015-0.12 ≤ 0.06 – 0.25*

0.25 – 43

Ofloxacin 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Rifabutin (Ansamycin) - 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicin

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Streptomycin - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulphamethoxazole 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetracycline 0.12-1

Tigecycline 0.03-0.25

Tobramycin 0.12-1* 2-8*

Trimethoprim / sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5* ≤ 0.25/4.8–2/38* 0.25/4.8-2/38

Notes 1 CLSI M100 QC range

2 The MIC range listed is for sulfizoxazole for S.aureus 3 Ranges based on Sensititre® in house testing; MIC with M. avium 700898 may be affected by colony morphology type.

* CLSI M24 QC range ** Range based on data from Reference 3 *** Range based on data from Reference 4

**** Incubation time dependent. Range based on 72 hours incubation only.

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Table 2: Additional QC ranges1

Antimicrobial agent E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacin 0.5-4 1-4

Amoxicillin/clavulanate 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaxime 0.03-0.12 8-32

Cefepime 0.015-0.12 1-8

Cefoxitin 2-8

Ceftriaxone 0.03-0.12 8-64

Ciprofloxacin 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Doxycycline 2-8 0.5-2 4-322

Gatifloxacin 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamycin 16-64 1-4

Levofloxacin 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolid 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minocycline 1-4 0.25-1

Moxifloxacin 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Ofloxacin 1-4 0.015-0.12 1-8

Rifabutin (Ansamycin) 4-162

Rifampicin 0.5-4 4-16 16-64

Streptomycin 4-162

Tetracycline 8-32 0.5-2 8-32

Tigecycline 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramycin 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimethoprim/ sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 CLSI M100 QC range unless otherwise stated 2 Range based on Sensititre® in-house testing Contact Sensititre® Distributor or TREK Diagnostic Systems in the event that quality control discrepancies cannot be resolved. PERFORMANCE Panels are designed to give comparable performance to CLSI reference micro-broth procedures. Performance has been independently investigated (references 5-7) For further information contact TREK Diagnostic systems or your local distributor. LIMITATIONS 1. Imipenem results for M.chelonae and M.abscessus should not be reported 2. Tobramycin is the aminoglycoside of choice for M. chelonae and should only be reported for this organism (1)

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APPENDIX 1: Colony Count Procedure 1.Immediately following inoculation plate, using a 1µl loop, sample from the positive growth control well and inoculate onto an appropriate agar. 2.Take another loop (1µl) and sample from the same growth well and mix with 50µl sterile deionised water. Inoculate 1µl of this dilution onto an appropriate agar plate to obtain countable colonies. 3.Incubate both plates at 30 or 35 0C (depending on type of organism ) over night . 4.Read as follows:

Number of colonies on plate Colony Count 0.001 plate 0.001of 1/50 dilution <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 BIBLIOGRAPHY 1. CLSI M24. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878 8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press.

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DISCLAIMER The information provided in this technical insert is current at the time of printing and may change without notice. The latest information can be downloaded from www.trekds.com\techinfo or by contacting TREK Technical services.

b Manufactured by TREK Diagnostic Systems

Units 17-19 Birches Industrial Estate, East Grinstead, West Sussex, RH19 1XZ, UK Tel: +44-1342-318777

Distributed by TREK Diagnostic Systems, 982 Keynote Circle, Suite 6, Cleveland, Ohio 44131 Technical Service USA: 1 (800) 642-7029

033-NONTBMYCO_CE-GB_ V2.2 Date Updated: 30 April 2013

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SENSITITRE®

Método de microdilución en caldo (MIC):

Para micobacterias de crecimiento rápido (RGM), micobacterias no tuberculosas de

crecimiento lento, género Nocardia y otros actinomicetos aeróbicos.

CE uso diagnóstico in vitro Solamente

Para información completa sobre la placa, incluidos su distribución, el control de calidad, visite la página www.trekds.com/techinfo. Se le solicitará el código de placa y

número de lote

APLICACIONES PREVISTAS Pruebas de sensibilidad de micobacterias de crecimiento rápido, incluyendo el grupo Mycobacterium fortuitum (tercer complejo de variedad biológica M. fortuitum, M. peregrinum, M. fortuitum), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum) y el grupo M. smegmatis (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi). Género Nocardia y otros actinomicetos aeróbicos. Las micobacterias no tuberculosas (NTM) de crecimiento lento, e. d., el complejo Mycobacterium avium, y Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum.

Para más datos sobre el análisis de M. marinum, consulte CLSI

El caldo fabricado por TREK Diagnostic Systems sólo ha sido validado con Productos Sensititre®.

PRINCIPIOS DE USO Cada placa contiene diversos agentes antifúngicos en las diluciones correspondientes. Los resultados pueden leerse manualmente mediante una lectura visual del crecimiento.

PRECAUCIONES Únicamente el personal cualificado y formado en técnicas de pruebas de sensibilidad debe utilizar el sistema. El laboratorio debe tener directrices de bioseguridad para la manipulación de micobacterias. Dado que los microorganismos vivos que se usan en este producto pueden infectar al usuario, deben usarse métodos de manipulación y eliminación apropiados. Para informar resultados con productos Sensititre autorizados por la directiva CE IVD y la FDA sólo se deben utilizar instrumentos soportados por Sensititre, es decir, un visor de espejo sencillo, Sensitouch, Vizion; ningún otro sistema será soportado.

ALMACENAMIENTO Y VIDA ÚTIL Las placas deben almacenarse a temperatura ambiente (15-25 °C), alejadas de la luz solar y el calor directos. Cada placa está embalada en papel de aluminio con un desecante de gel de sílice. No usar la placa si ha cumplido la fecha de caducidad, si el color del desecante no es azul ó naranja o si el embalaje de aluminio está dañado.

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Inocular la placa antes de transcurridas 5 horas desde su apertura. PROCEDIMIENTO Materiales incluidos Placa Sensititre® Láminas adhesivas Materiales no incluidos: Agua desmineralizada Sensititre® [T3339] Caldo Mueller-Hinton Sensititre® con cationes ajustados y con solución amortiguadora TES Caldo Mueller-Hinton Sensititre® con cationes ajustados y con OADC [T8006] Cabezales dosificados Sensititre® (para utilizar con AutoInoculator®/AIM®) [E3010] AutoInoculator® Sensititre® [V3010] AIM® Sensititre® [V3020] Sensititre® Vizion® [V2021]

Sensititre® Nephelometer® [V3011]

Visor manual [V4007] Estándar de turbidez del polímero McFarland de 0,5 [E1041] Pipeta de 50µL o 100µL y puntas desechables Cepas de control de calidad Placas de agar Incubadora 30-35 °C, no de CO2 Agitador de vórtex Agua desmineralizada con microesferas de vidrio Documentos actuales CLSI RECOGIDA DE MUESTRAS Y PREPARACIÓN Las muestras deben obtenerse, transportarse, almacenarse y sembrarse en placas en un medio de aislamiento primario que proporcione colonias aisladas mediante procedimientos estándar. SELECCIÓN DEL CALDO DE PRUEBA DE SENSIBILIDAD Para micobacterias de crecimiento rápido, género Nocardia y otros actinomicetos aeróbicos usar solamente Sensititre®

CAMHBT o, para micobacterias de crecimiento lento, Caldo Sensititre® Mueller Hinton con OADC. Se ha testado el rendimiento de los caldos Sensititre® para su uso con productos de sensibilidad Sensititre®. INOCULACIÓN E INCUBACIÓN Micobacterias de crecimiento rápido, género Nocardia y otros actinomicetos aeróbicos Antes de usar deje que todos los caldos adquieran la temperatura ambiente. 1. Con un hisopo barra la parte confluente de un crecimiento a otro de una placa de agar. Emulsione en agua desmineralizada y ajuste visualmente a un estándar McFarland 0,5 o mediante un nefelómetro Sensititre®. Si las partículas son visibles, mezclar bien. Generalmente, los actinomicetos tienen colonias de corteza muy dura. Puede que sea necesario mezclar usando microesferas de vidrio para obtener una suspensión homogénea. Si después de mezclar quedan grandes terrones, hay que dejar que se sedimenten y usar el sobrenadante para la suspensión del inóculo. Se puede obtener una solución más homogénea humedeciendo el hisopo con agua desmineralizada.

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Aviso: el uso de agua enriquecida con Tween puede afectar las MIC 2. Transfiera 50µl de la suspensión a un tubo de caldo Mueller-Hinton con cationes ajustados y con solución amortiguadora TES para obtener un inóculo de 5x105 cfu/mL (límite de 1x105 a 1x106 cfu/mL). Mezcle bien.

Los pasos 1 y 2 se deben completar en 30 minutos. 3. Las placas que contienen ≥ 32 µg/mL de doxiciclina o minociclina pueden mostrar un precipitado después de la incubación. Esto puede impedirse reconstituyendo estos pocillos con 5µL de agua destilada estéril antes de añadir el caldo. 4. Transfiera 100µL en cada pocillo mediante uno de los siguientes métodos: a. AutoInoculator/AIM Sensititre®. Sustituya el tapón del tubo por un cabezal de dosis de un solo uso Sensititre® e inocule la placa según las instrucciones del AutoInoculator®/AIM®. Retire la combinación de cabezal dosificador-tubo de ensayo del AutoInoculator®/AIM®. en 30 segundos de haber dosificado una placa y proceda a desecharlo o almacenarlo boca abajo en un soporte. b. Pipeta manual. Vierta el caldo en una batea estéril e inocule la placa por medio de una pipeta adecuada. Dosifique el panel con la etiqueta de Sensititre® mirando hacia el usuario. Las pipetas deben revisarse periódicamente y comprobar la calibración. Inocule el caldo en una placa antes de 30 minutos. 5. Debe realizarse una comprobación periódica del número de colonias del pocillo de control positivo. (Véase el Apéndice 1). Los aislados deben tener un inóculo de 5x105 CFU/mL, (límites 1x105 – 1x106) 6. Cubra todos los pocillos con la lámina adhesiva. Presione firmemente todos los pocillos para garantizar un sellado adecuado. Evite la formación de arrugas, ya que se pueden producir saltos. 7. Incube aeróbicamente las micobacterias de crecimiento rápido a 300C en un incubador sin CO2 durante 72 horas. Compruebe si hay crecimiento. Si es malo, reincube durante un máximo de 48 horas. Incube el género Nocardia y los otros actinomicetos aeróbicos a 350C en un incubador sin CO2 durante 2-3 días. Para los aislados de M. chelonae y M. abscessus puede ser necesaria una incubación de 4-5 días. El CLSI (Instituto de normas clínicas y de laboratorio) recomienda incubar durante 14 días las Mycobacterias no pigmentadas de crecimiento rápido a fin de asegurarse de que se detecta la resistencia inducible a macrólidos, a menos que ya se haya demostrado, en una lectura anterior, que la cepa es resistente. Las placas pueden apilarse de tres en tres.

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Micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento (NTM incluyendo MAC) Mismo procedimiento que antes salvo que deberá transferir 50µL de suspensión del microorganismo a 11mL al caldo Mueller-Hinton Sensititre® enriquecido para el crecimiento con 5% v/v OADC. Invierta el tubo 8-10 veces. Incube a 350C en un incubador sin CO2 y haga la lectura pasados 7 días. Si el crecimiento es bueno en el control positivo, lea los resultados; de lo contrario, reincube hasta un máximo de 14 días. CLSI M24 proporciona directrices de lectura e ilustraciones de varios patrones de crecimiento. En caso de incubación prolongada, pueden ser necesarias medidas de prevención contra la pérdida de contenido del pocillo debido a la evaporación. Coloque las placas en un contenedor de plástico con la tapa entreabierta para facilitar el intercambio gaseoso. LECTURA DE LOS RESULTADOS DE PRUEBAS

Los resultados pueden leerse utilizando el visor manual Sensititre® o Vizion®. Véase el manual del usuario de Vizion®. No es necesario quitar la lámina adhesiva. Coloque la placa con la etiqueta mirando hacia el usuario. El crecimiento aparece como una turbidez o como un depósito de células en el fondo del pocillo. La MIC se registra como la menor concentración antimicrobiana que inhibe el crecimiento visible. Para una guía sobre la lectura de puntos finales, consulte CLSI M24. La lectura de crecimiento apenas visible con Vizion® puede mejorarse usando una luz brillante indirecta contra un fondo oscuro. Primeramente deben leerse los pocillos de control de crecimiento positivo. Si alguno no muestra crecimiento, los resultados no son válidos. Los puntos finales de micobacterias pueden ser difíciles de interpretar. CLSI M24 proporciona directrices de lectura e ilustraciones de varios patrones de crecimiento. Los pocillos negativos pueden mostrar un ligero precipitado relacionado con el inóculo. En los cursos de formación deben usarse lecturas de cepas QC con las MIC comprobadas. El crecimiento puede oscilar de unas pocas colonias sin turbidez a un gran crecimiento comparable al control positivo de crecimiento. La MIC es la menor concentración que inhibe por completo el crecimiento salvo por las sulfamidas, en las que la MIC se lee como la menor concentración que inhibe el 80% del crecimiento comparado con el control positivo. Debe prestarse atención a los siguientes puntos: a. Contaminación La contaminación puede resultar en crecimiento en un pocillo bordeado de pocillos sin crecimiento. Este tipo de contaminación de un solo pocillo puede ignorarse, pero si hay sospecha de múltiples contaminantes de pocillos la prueba debe repetirse. b. Saltos De vez en cuando puede observarse un “salto”, es decir, un pocillo que no muestra crecimiento bordeado de pocillos que muestran crecimiento. Existen varias explicaciones para esto, incluyendo contaminación, mutación, lámina de sellado arrugada y defecto de alineación en la dosis. Un solo salto puede ignorarse. Sin embargo, con el fin de garantizar la terapia antimicrobiana eficaz NUNCA debe leerse el pocillo con un salto como si fuese la MIC; siempre debe leerse la concentración de pocillo más baja por encima de la cual no hay crecimiento constantemente. c. Cultivos mixtos Salvo por lo dicho más arriba en (a), si dos puntos finales se ven claramente como un “botón” de células seguidos de varios pocillos de crecimiento difuso en que el “botón” ya no es visible (o se ven como botones más pequeños), podría existir una población bacteriana mixta. La pureza debe comprobarse haciendo subcultivos de crecimiento en una placa de agar apropiada. Los resultados de la prueba no son válidos si se detecta un cultivo mixto.

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DIRECTRICES DE INTERPRETACIÓN Consulte las directrices de interpretación de las MIC según las proporciona CLSI, o su grupo de referencia nacional.

INDICACIONES DE USO

Antimicrobiano RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacina X X XX X

Amoxicilina-Ácido clavulánico

XX X

Capreomicina

Cefepima XX

Cefoxitina X

Cefotaxima XX

Ceftriaxona X

Ciprofloxacina X X XX X

Claritromicina7 X X XX

3 X X

Clofazimina4

X X X

Doxiciclina X XX

Etambutol XX X

Etionamida

Gentamicina XX

Imipenem X X

Isoniazida5

XX XX

Kanamicina

Levofloxacina X

Linezolida X X XX X

Meropenem XX XX

Minociclina X X XX X

Moxifloxacina X X XX X

Ofloxacina6

Rifabutina XX X

Rifampina X X

Estreptomicina XX XX

Sulfametoxazol X X XX XX

Tigeciclina X

Tobramicina X X

Trimetoprim/ Sulfametoxazol

X X XX X

Leyendas: RGM Micobacterias de crecimiento rápido NOC Género Nocardia SGM Micobacterias de crecimiento lento MAC Complejo M. avium

X: Primera línea XX: Segunda línea

1 Información sobre M. kansasii. 2 Crecimientos lentos aparte de MAC o M. kansasii. 3 Claritromicina es el único antimicrobiano notificado para el complejo M. avium. Por tanto, es un fármaco de primera línea para este microorganismo. 4 Es necesario un IND de paciente para obtener clofazimina en EE.UU. CLSI no ha establecido o estandarizado los métodos de sensibilidad o valores críticos. 5 Problemático para las pruebas de NTM; todavía no se han establecido los valores críticos de NTM.

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6 Puede que no esté disponible en EE.UU. 7 El CLSI (Instituto de normas clínicas y de laboratorio) recomienda incubar durante 14 días las Mycobacterias no pigmentadas de crecimiento rápido a fin de asegurarse de que se detecta la resistencia inducible a macrólidos, a menos que ya se haya demostrado, en una lectura anterior, que la cepa es resistente. CONTROL DE CALIDAD La frecuencia de las pruebas de control de calidad debe ajustarse a las directrices locales El inóculo debe cultivarse en un medio apropiado para comprobar la pureza y/o la composición morfológica de la coloniaa. Los resultados de la prueba no son válidos si se detecta un cultivo mixto. Todas las placas Sensititre® incluyen pocillos de control positivo. Las pruebas no son válidas a menos que exista crecimiento definido en todos los pocillos de control positivo. Varios factores influyen en las MIC, incluyendo estado del microorganismo, densidad del inóculo, temperatura y caldo. En la práctica, las MIC replicadas forman una distribución normal con la mayoría de los resultados dentro de una dilución del valor modal. El procedimiento de la prueba puede considerarse satisfactorio si los organismos de control de las MIC están dentro de los límites. Los resultados no deben notificarse si los resultados QC no están dentro de los límites. En la Tabla 1 se enumeran los límites QC provisionales usando cepas micobacterianas. Hasta que dispongamos de más datos, se puede usar S. aureus ATCC 29213 y otras cepas QC no micobacterianas y los límites del documento CLSI M100 para el panel QC (Tabla 2). Las cepas CLSI M100 QC deben usar el mismo método de inoculación que para las micobacterias de crecimiento rápido, salvo que debe añadirse 50µL de inóculo al caldo Mueller Hinton Sensititre® con TES. No usar caldo enriquecido con OADC. Los paneles deben leerse después de 18 a 24 horas de incubación a 35°C. La cepa de M. avium 700898 QC debe incubarse a 350C en un incubador sin CO2 y leerse a los 7 días. Si el crecimiento es bueno en el control positivo, léanse los resultados. De lo contrario, deberá reincubarse hasta un máximo de 10 días. CLSI M24 proporciona directrices de lectura e ilustraciones de varios patrones de crecimiento. a En M. avium 700898 se ha observado variación morfológica. Se han identificado hasta tres clases de colonias (1. bóveda lisa, 2. bóveda opaca con borde irregular transparente, 3. plana y transparente con borde irregular). La MIC puede verse afectada por los tipos de colonia que se usan para el inóculo. La MIC de isoniazida, moxifloxacina y rifampina puede variar en los cultivos de M. avium 700898.

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Tabla 1: Límites de control de calidad provisionales para las cepas de micobacterias QC1 y S. aureus ATCC 29213 Agente antimicrobiano S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacina ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amoxicilina-clavulanato 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Capreomicina - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Cefotaxima 1-4

Cefepima 1-4

Cefoxitina 1-4* 4-32*

Ceftriaxona 1-8

Ciprofloxacina 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Claritromicina 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Clofazimina - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Doxiciclina 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Etambutol - 2-16 2-16

Etionamida - >20 20-80****

0.6 – 5 (7 días incubación)

1.25 – 10 (10-11 días incubación)

Gatifloxacina 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Isoniazida - 1-4 ≥13

Kanamicina 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Levofloxacina 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolida 1-4* 1-8* 8-323

Meropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minociclina 0.06-0.54

0.12-0.5*

Moxifloxacina 0.015-0.12 ≤0.06-0.25*

0.25 – 43

Ofloxacina 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Rifabutina (Ansamicina)

- 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicina

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Estreptomicina - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulfametoxazol 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetraciclina 0.12-1

Tigeciclina 0.03-0.25

Tobramicina 0.12-1* 2-8*

Trimetoprim-sulfametoxazol

≤ 0.5/9.5* ≤0.25/4.8-2/38* 0.25/4.8-2/38

Notas 1 Límites de CLSI M100 QC

2 Los límites de la MIC enumerados son para sulfafurazol con S. aureus 3 Límites basados en las pruebas internas de Sensititre®; la MIC con M. avium 700898 puede verse afectada por la clase morfológica de la colonia.

* Límites CLSI M24 QC ** Límites basados en los de datos de la Referencia 3 *** Límites basados en los de datos de la Referencia 4

**** La incubación depende del tiempo. Límites basados solamente en incubación de 72 horas.

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Tabla 2: Límites QC adicionales1

Agente antimicrobiano E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacina 0.5-4 1-4

Amoxicilina-clavulanato 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaxima 0.03-0.12 8-32

Cefepima 0.015-0.12 1-8

Cefoxitina 2-8

Ceftriaxona 0.03-0.12 8-64

Ciprofloxacina 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Doxiciclina 2-8 0.5-2 4-322

Gatifloxacina 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamicina 16-64 1-4

Levofloxacina 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolida 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minociclina 1-4 0.25-1

Moxifloxacina 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Ofloxacina 1-4 0.015-0.12 1-8

Rifabutina (Ansamicina) 4-162

Rifampicina 0.5-4 4-16 16-64

Estreptomicina 4-162

Tetraciclina 8-32 0.5-2 8-32

Tigeciclina 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramicina 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimetoprim-sulfametoxazol

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 Salvo que se indique lo contrario, límites CLSI M100 QC 2 Límites basados en las pruebas internas de Sensititre® Póngase en contacto con el distribuidor de Sensititre® o con TREK Diagnostic Systems en caso de que no se puedan resolver las discrepancias del control de calidad. RENDIMIENTO Los paneles están diseñados para ofrecer un rendimiento comparable a los procedimientos de microcultivo de referencia CLSI . El rendimiento ha sido investigado independientemente (referencias 5-7) Para más información, contacte con TREK Diagnostic Systems o su distribuidor local. LIMITACIONES 1. Los resultados de imipenem para M. chelonae y M. abscessus no deben notificarse 2. Tobramicina es el aminoglucósido de elección para M. chelonae y debe notificarse solamente para este microorganismo

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APÉNDICE 1: Procedimiento de recuento de colonias 1. Inmediatamente después de la inoculación de la placa, usando un asa de siembra de 1µl, obtenga muestras del pocillo de control de crecimiento positivo e inocule en una placa de agar apropiada. 2. Coja otra asa de siembra (1µl) y obtenga muestras del mismo pocillo de crecimiento y mezcle bien con 50µl de agua desionizada estéril. Inocule 1µl de esta dilución en una placa de agar apropiada para obtener colonias contables. 3. Incube ambas placas a 30 ó 35 0C (dependiendo del tipo de microorganismos) toda la noche. 4. Realice la lectura de la forma siguiente Número de colonias en placa Recuento de colonias Placa de 0,001 0,001 de dilución 1/50 <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 BIBLIOGRAPHY 1. CLSI M24. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878 8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press.

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EXENCIÓN DE RESPONSABILIDAD La información proporcionada en este documento técnico está actualizada en el momento de la impresión, pero puede ser modificada sin previo aviso. La información más actualizada puede obtenerse en de www.trekds.com\Techinfo o contactando con los servicios técnicos de TREK.

b Fabricante: TREK Diagnostic Systems

Units 17-19 Birches Industrial Estate, East Grinstead, West Sussex, RH19 1XZ, UK Tel: +44-1342-318777

Distribuido por TREK Diagnostic Systems, 982 Keynote Circle, Suite 6, Cleveland, Ohio 44131 Technical Service USA: 1 (800) 642-7029

033-NONTBMYCO_CE-E_V2.2 Date Updated: 30 April 2013

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SENSITITRE®

Metodo con microdiluizione in brodo (MIC):

per micobatteri a crescita rapida (RGM), micobatteri non tubercolari a crescita lenta,

nocardia e altri actinomiceti aerobici

Solo CE Uso Diagnostico in vitro

Per informazioni complete sulle piastre, quali la struttura, i dati di controllo qualità, visitare il sito Web www.trekds.com/techinfo. Nel sito verranno richiesti il codice e il

numero di lotto di ciascuna piastra.

USO PREVISTO Saggio della sensibilità per micobatteri a crescita rapida, tra cui il gruppo Mycobacterium fortuitum (M. fortuitum, M. peregrinum, M. fortuitum terza biovariante complessa), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum) e il gruppo M. smegmatis (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi). Nocardia spp e altri actinomiceti aerobici. Micobatteri non tubercolari (NTM) a crescita lenta, ossia Mycobacterium avium complex, Mycobacterium kansasii e Mycobacterium marinum.

Per informazioni sul saggio del M. marinum consultare il documento del CLSI.

Il brodo di coltura prodotto da TREK Diagnostic Systems è stato convalidato solo con i prodotti Sensititre®.

PRINCIPI DI IMPIEGO Ciascuna piastra viene dosata con agenti antifungini a diluizioni appropriate. I risultati possono essere ottenuti manualmente mediante lettura visiva della crescita.

PRECAUZIONI Il sistema deve essere utilizzato solo da personale qualificato e addestrato all’impiego delle tecniche di prova della sensibilità. Il laboratorio è tenuto ad adottare le linee guida stabilite per la manipolazione dei micobatteri. I microrganismi viventi utilizzati con questo prodotto possono essere infetti per gli operatori. Pertanto, si raccomanda l’adozione di metodi di manipolazione e smaltimento adeguati. Solo strumenti supportati da Sensititre, quali un semplice visore a specchio, Sensitouch, Vizion, devono essere utilizzati per refertare i risultati con prodotti per IVD marcati CE e approvati dalla FDA statunitense. Qualsiasi altro sistema utilizzato non sarà supportato.

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CONSERVAZIONE E SCADENZA Conservare le piastre a temperatura ambiente (15-25°C) al riparo dalla luce diretta del sole e dal calore. Ogni piastra è imballata in fogli di alluminio con all’interno un essiccante a base di gel di silice. Non utilizzare la piastra oltre la data di scadenza riportata o nel caso in cui il colore del dessiccante non sia blu o arancione o il sacchetto in foil risulti danneggiato. Inoculare il pannello entro 5 ore da quando è stato rimosso dall’imballaggio.

PROCEDURA Materiali inclusi: Pannello Sensititre® Pellicola adesiva

Materiali non inclusi: Acqua demineralizzata Sensititre® [T3339] Brodo Mueller-Hinton Sensititre® a cationi precisati con tampone TES (CAMHBT) Brodo Mueller-Hinton Sensititre® a cationi precisati con OADC [T8006] Tappi dosatori Sensititre® (da utilizzare con AutoInoculator/AIM [E3010] Sensititre® AutoInoculator® [V3010] Sensititre® AIM® [V3020] Sensititre® Vizion® [V2021]

Sensititre® Nephelometer® [V3011] Specchio per lettura manuale [V4007]

0.5 Standard di torbidità polimero McFarland [E1041] Pipetta da 50µL o 100µL e puntali monouso Ceppi di controllo qualità Piastre di agar Incubatore a 30-350C, non-CO2 Miscelatore Vortex Acqua demineralizzata con sfere di vetro Documentazione CLSI aggiornata

RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI I campioni devono essere raccolti, trasportati, conservati e quindi seminati su un terreno di coltura di isolamento primario per ottenere colonie isolate, come da procedure standard.

SELEZIONE DEL BRODO PER L’ANTIBIOGRAMMA Usare solo CAMHBT Sensititre®

per i micobatteri a crescita rapida, Nocardia e altri actinomiceti aerobici o brodo Mueller Hinton Sensititre® con OADC per i micobatteri a crescita lenta. I brodi Sensititre® sono testati per l’impiego con i prodotti di prova della sensibilità Sensititre®.

INOCULAZIONE E INCUBAZIONE Micobatteri a crescita rapida, Nocardia spp e altri actinomiceti aerobici Prima dell’utilizzo è necessario che i brodi abbiano raggiunto la temperatura ambiente.

1. Passare un tampone sulla parte confluente della crescita nella piastra di agar. Emulsionare in acqua demineralizzata e regolare allo 0,5 dello standard McFarland, visivamente o mediante nefelometro Sensititre®. Se le particelle risultano visibili, miscelare bene con Vortex. Tipicamente, le colonie di actinomiceti presentano una crescita crostosa. Pertanto, per ottenere una sospensione omogenea, può essere necessario miscelarle con le sfere di vetro. Se dopo la miscelazione rimangono grossi grumi, lasciare sedimentare e usare il supernatante per la preparazione della sospensione da inoculare.

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Per facilitare l’ottenimento di una soluzione omogenea si consiglia di inumidire il tampone con acqua demineralizzata … Attenzione – l’utilizzo di acqua supplementata con Tween può pregiudicare la validità delle MIC 2. Trasferire 50µl di sospensione in una provetta di brodo Mueller-Hinton a cationi precisati con tampone TES in modo da ottenere un inoculo di 5x105 cfu/mL (range compreso tra 1x105 e 1x106 cfu/mL). Miscelare bene.

Le fasi 1 e 2 devono essere completate in 30 minuti. 3. Dopo incubazione, le piastre contenenti ≥ 32µg/mL di dossiciclina o minociclina possono evidenziare un precipitato. Per prevenire il problema si raccomanda di ricostituire i pozzetti con 5µL di acqua demineralizzata distillata prima di aggiungere il brodo. 4. Trasferire 100µL in ciascun pozzetto secondo uno dei metodi seguenti: a. Sensititre AutoInoculator®/AIM®. Sostituire il tappo della provetta con una tappo dosatore Sensititre® monouso e inoculare la piastra secondo le istruzioni dell’AutoInoculator®/AIM®. Rimuovere il gruppo provetta/tappo dosatore dall’AutoInoculator®/AIM® entro 30 secondi dal dosaggio di un pannello e posizionarlo in posizione capovolta in una griglia o eliminare. b. Pipetta manuale. Versare il brodo in un contenitore sterile e inoculare la piastra utilizzando una pipetta adeguata. Introdurre l’inoculo nel pannello, controllando che l’etichetta Sensititre® sia rivolta verso l’operatore. Le pipette devono essere sottoposte a manutenzione periodica e alla verifica della taratura Inoculare il brodo nella piastra entro 30 minuti. 5. Eseguire una verifica periodica del conteggio nella colonia del pozzetto di controllo positivo (V. Appendice 1). Gli isolati devono avere un inoculo di 5x105 CFU/mL (range 1x105 – 1x106) 6. Coprire tutti i pozzetti con pellicola adesiva. Premere bene tutti i pozzetti per garantire una tenuta adeguata. Evitare la formazione di pieghe che potrebbero pregiudicare la crescita nei pozzetti. 7. Incubare aerobicamente i micobatteri a crescita rapida alla temperatura di 300C in incubatore senza CO2 per 72 ore. Controllare la crescita. Se scarsa, reincubare per un massimo di 48 ore. Incubare Nocardia e altri actinomiceti aerobici a 350C in incubatore senza CO2 per 2-3 giorni. Gli isolati di M. chelonae e M. abscessus possono richiedere un’incubazione di 4-5 giorni (1) CLSI raccomanda che i micobatteri non pigmentati a rapida crescita siano incubati per 14 giorni per garantire la rilevazione di resistenza inducibile ai macrolidi, a meno che l’isolato non sia resistente ad una lettura iniziale. Non impilare più di tre piastre. Micobatteri non tubercolari a crescita lenta (NTM compresi MAC) Adottare la stessa procedura indicata sopra, fatto salvo per il trasferimento di 50µL della sospensione di organismi in 11mL di brodo Mueller-Hinton Sensititre® con supplemento di crescita v/v OADC al 5%. Invertire la provetta 8-10 volte.

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Incubare a 350C in un incubatore senza CO2 ed eseguire la lettura dopo 7 giorni. Se la crescita nel controllo positivo è buona, leggere i risultati. In caso contrario, reincubare per un massimo di 14 giorni. Lo standard M24 del CLSI contiene le linee guida per la lettura e illustrazioni dei vari pattern di crescita. L’incubazione prolungata può richiedere l’adozione di misure volte a prevenire la perdita dei contenuti dei pozzetti per evaporazione. Posizionare le piastre in un contenitore di plastica tenendo il coperchio socchiuso per facilitare lo scambio gassoso. LETTURA DEI RISULTATI I risultati possono essere letti usando il visualizzatore manuale Sensititre® Vizion®. Consultare il manuale d’uso di Vizion®. Non è necessario rimuovere la pellicola adesiva. Posizionare la piastra in modo che l’etichetta sia rivolta verso l’operatore. La crescita appare come torbidità o come deposito di cellule sul fondo di un pozzetto. La MIC viene registrata come la concentrazione più bassa di antimicrobico in grado di inibire la crescita visibile. Per istruzioni sugli endpoint di lettura consultare lo standard M24 del CLSI. La lettura di una crescita debole su Vizion® può essere migliorata utilizzando una luce intensa e indiretta contro uno sfondo scuro. Leggere per primi i pozzetti di controllo positivi. Se non si evidenzia alcuna crescita, i risultati del saggio non sono validi. L’interpretazione degli endpoint dei micobatteri può risultare difficile. Lo standard M24 del CLSI contiene le linee guida per la lettura e le illustrazioni dei vari pattern di crescita. I pozzetti negativi possono evidenziare un leggero precipitato correlato all’inoculo. Per imparare a interpretare i risultati in modo corretto, si consiglia di leggere i ceppi QC con le MIC già note. La crescita può andare da poche colonie senza torbidità a un’intensità paragonabile al controllo di crescita positivo. La MIC equivale alla concentrazione più bassa in grado di inibire completamente la crescita a eccezione dei sulfonamidi, per i quali la MIC viene letta come la concentrazione più bassa in grado di inibire l’80% della crescita rispetto al controllo positivo. Si raccomanda di notare quanto segue a. Contaminazione La contaminazione può determinare crescita in un pozzetto circondato da pozzetti che non ne evidenziano alcuna. La contaminazione di un singolo pozzetto può essere ignorata; tuttavia, se si sospetta contaminazione in più pozzetti, il saggio deve essere ripetuto. b. Salti Occasionalmente si può verificare un “salto”, ossia un pozzetto senza crescita circondato da pozzetti con crescita. Questa situazione può dipendere da vari fattori, quali contaminazione, mutazione, pieghe nella pellicola adesiva o errori di allineamento nel dosaggio. La presenza di un unico salto può essere ignorata. Tuttavia, per garantire una terapia antimicrobica efficace, un salto non deve MAI essere letto come MIC; leggere sempre il pozzetto con la concentrazione più bassa oltre la quale non si verifica alcuna crescita. c. Culture miste Salvo quanto riferito sopra al punto (a), la presenza di due endpoint aventi l’aspetto di un “bottone” di cellule distinto e seguiti da vari pozzetti di crescita diffusa in cui il “bottone” non è più visibile (o appare più piccolo), può indicare una popolazione batterica mista. In tal caso, verificare la purezza procedendo alla subcoltura della crescita in agar idoneo. L’individuazione di una coltura mista invalida i risultati del saggio.

LINEE GUIDA INTERPRETATIVE Consultare le linee guida per l’interpretazione delle MIC stabilite dal CLSI, o dal proprio gruppo di riferimento nazionale.

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INDICAZIONI PER L’USO

Antimicrobico RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacina X X XX X

Amossicillina/ Acido clavulanico

XX X

Capreomicina

Cefepime XX

Cefossitina X

Cefotaxime XX

Ceftriaxone X

Ciproflossacina X X XX X

Claritromicina7 X X XX

3 X X

Clofazimina4

X X X

Dossiciclina X XX

Etambutolo XX X

Etionamide

Gentamicina XX

Imipenem X X

Isoniazid5

XX XX

Kanamicina

Levoflossacina X

Linezolid X X XX X

Meropenem XX XX

Minociclina X X XX X

Mossiflossacina X X XX X

Oflossacina6

Rifabutina XX X

Rifampina X X

Streptomicina XX XX

Sulfametossazolo X X XX XX

Tigeciclina X

Tobramicina X X

Trimetoprima/ Sulfametossazolo

X X XX X

Legenda RGM Micobatteri a crescita rapida NOC Nocardia spp. SGM Micobatteri a crescita lenta MAC M.avium complex

X: Prima linea XX: Seconda linea

1 Informazioni su M.kansasii 2 Microrganismi a crescita lenta oltre a MAC e M.kansasii 3 La claritromicina è l’unico antimicrobico refertato per M.avium complex. Pertanto, è un farmaco di prima linea per questo organismo 4 Per ottenere la clofazimina negli USA è richiesto un solo IND paziente. Il CLSI non ha stabilito o standardizzato metodi e breakpoint per la sensibilità. 5 Problematico per il saggio; i breakpoint per NTM devono ancora essere stabiliti. 6 Potrebbe non essere disponibile negli USA. 7 CLSI raccomanda che i micobatteri non pigmentati a rapida crescita siano incubati per 14 giorni per garantire la rilevazione di resistenza inducibile ai macrolidi, a meno che l’isolato non sia resistente ad una lettura iniziale.

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CONTROLLO DI QUALITÀ La frequenza dei test di controllo qualità deve essere conforme alle linee di guida locali. Gli inoculi devono essere coltivati su un medium idoneo per verificare la purezza e/o la composizione morfologica della coloniaa. L’eventuale individuazione di una coltura mista invalida i risultati del saggio. Tutte le piastre Sensititre contengono pozzetti di controllo positivo. I test non sono validi se non vi è una netta crescita in tutti i pozzetti di controllo positivo. Le MIC dipendono da vari fattori, tra cui lo stato degli organismi, la densità dell’inoculo, la temperatura e il brodo di coltura. In pratica, le MIC ottenute mediante replica formano una distribuzione normale e la maggior parte dei risultati possono essere ottenuti da una diluizione del valore modale. La procedura di prova può essere considerata soddisfacente se le MIC degli organismi di controllo rientrano nel range. Se i QC non rientrano nel range, i risultati non devono essere refertati. La tabella 1 elenca alcuni range QC provvisori ottenuti utilizzando ceppi di micobatteri. In attesa che si rendano disponibili ulteriori dati, è possibile utilizzare S.aureus ATCC 29213 e altri ceppi QC non micobatterici e adottare i range riportati nello standard M100 del CLSI (Tabella 2). Per i ceppi QC CLSI M100 occorre impiegare lo stesso metodo di inoculazione dei micobatteri a crescita rapida, fatto salvo per l’aggiunta di 50µL di inoculo al brodo Mueller Hinton Sensititre® con TES. Non usare brodo supplementato con OADC. Leggere i pannelli dopo 18-24 ore di incubazione a 35°C. Il ceppo QC M. avium 700898 deve essere incubato a 350C in incubatore senza CO2 e letto al giorno 7. Se la crescita nel controllo positivo è buona, leggere i risultati. In caso contrario, reincubare per 10 giorni. Lo standard M24 del CLSI contiene le linee guida per la lettura e illustrazioni dei vari pattern di crescita. a Una variazione morfologica è stata osservata con M. avium 700898. Sono state identificate fino a tre tipi di colonie (1. A cupola liscia, 2. A cupola opaca con bordo irregolare, 3. Piatta e trasparente con bordo irregolare). La MIC può essere influenzata dal tipo o dai tipi di colonie usati per l’inoculo. La MIC di Isoniazid, Moxiflossacina e Rifampina può variare per ciascuna delle colture di M. avium 700898.

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Tabella 1: Range provvisori del controllo qualità per i ceppi di micobatteri QC1 e S.aureus ATCC 29213 Agente antimicrobico S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacina ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amossicillina/clavulanato 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Capreomicina - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Cefotaxime 1-4

Cefepime 1-4

Cefossitina 1-4* 4-32*

Ceftriaxone 1-8

Ciproflossacina 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Claritromicina 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Clofazimina - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Dossiciclina 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Etambutolo - 2-16 2-16

Etionamide - >20 20-80****

0.6 – 5 (7 giorni incubazione)

1.25 – 10 (10-11 giorni incubazione)

Gatiflossacina 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Isoniazid - 1-4 ≥13

Kanamicina 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Levoflossacina 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolid 1-4* 1-8* 8-323

Meropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minociclina 0.06-0.54

0.12-0.5*

Mossiflossacina 0.015-0.12 ≤ 0.06 – 0.25*

0.25 – 43

Oflossacina 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Rifabutin (Ansamicina) - 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicina

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Streptomicina - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulfametossazolo 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetraciclina 0.12-1

Tigeciclina 0.03-0.25

Tobramicina 0.12-1* 2-8*

Trimetoprim / sulfametossazolo

≤ 0.5/9.5* ≤ 0.25/4.8–2/38* 0.25/4.8-2/38

Note 1 Range QC fissato dal CLSI

2 Il range della MIC riportato in tabella si riferisce al sulfizossazolo per S.aureus 3 Range basati su saggi interni condotti con Sensititre®; la MIC con M. avium 700898 può essere influenzata dal tipo di morfologia della colonia.

* Range QC basato sullo standard M24del CLSI ** Range basato sui dati ottenuti dal Riferimento 3 *** Range basato sui dati ottenuti dal Riferimento 4

**** Dipendente dal tempo di incubazione. Range basato solo su 72 ore di incubazione.

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Tabella 2: Range QC aggiuntivi1

Agente antimicrobico E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacina 0.5-4 1-4

Amossicillina/clavulanate 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaxime 0.03-0.12 8-32

Cefepime 0.015-0.12 1-8

Cefossitina 2-8

Ceftriaxone 0.03-0.12 8-64

Ciproflossacina 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Dossiciclina 2-8 0.5-2 4-322

Gatiflossacina 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamicina 16-64 1-4

Levoflossacina 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolid 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minociclina 1-4 0.25-1

Mossiflossacina 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Oflossacina 1-4 0.015-0.12 1-8

Rifabutin (Ansamicina) 4-162

Rifampicina 0.5-4 4-16 16-64

Streptomicina 4-162

Tetraciclina 8-32 0.5-2 8-32

Tigeciclina 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramicina 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimetoprim/ sulfametossazolo

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 Range QC basato sullo standard M100 del CLSI salvo diversa indicazione 2 Range basato su saggi interni condotti con Sensititre® Nel caso non sia possibile risolvere discrepanze nel controllo di qualità, contattare il distributore Sensititre® o TREK Diagnostic Systems. PERFORMANCE I pannelli sono progettati per ottenere performance paragonabili alle procedure di riferimento del CLSI per la microdiluizione in brodo. La performance è stata esaminata da terzi indipendenti (riferimenti 5-7). Per ulteriori informazioni, contattare TREK Diagnostic systems o il rivenditore locale

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LIMITAZIONI 1. I risultati di Imipenem per M.chelonae e M.abscessus non devono essere refertati 2. La tobramicina è l’aminoglicoside d’elezione per M. chelonae e deve essere refertata solo per questo organismo APPENDICE 1: Procedura di conteggio colonie 1. Subito dopo avere inoculato la piastra, prendere un’ansa da 1µ, campionare dal pozzetto di controllo della crescita positivo e inoculare su agar idoneo. 2. Prendere un’altra ansa (1µl), campionare dallo stesso pozzetto di crescita e miscelare con 50µl di acqua deionizzata sterile. Inoculare 1µl di questa diluizione su una piastra contenente agar idoneo per ottenere colonie contabili. 3. Incubare entrambe le piastre a 30 o 35 0C (in base al tipo di organismo) over night (16 ore circa). 4. Effettuare la lettura come segue:

Numero di colonie su piastra Conteggio colonie Piastra 0.001 0,001 di diluizione 1/50 <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 BIBLIOGRAPHY 1. CLSI M24. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878

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8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press. DISCLAIMER Le informazioni fornite in questa scheda tecnica riflettono la situazione al momento della stampa e sono soggette a modifica senza preavviso. Le ultime informazioni possono essere scaricate da www.trekds.com\techinfo o contattando il servizio.

b Manufactured by TREK Diagnostic Systems

Units 17-19 Birches Industrial Estate, East Grinstead, West Sussex, RH19 1XZ, UK Tel: +44-1342-318777

Distributed by TREK Diagnostic Systems, 982 Keynote Circle, Suite 6, Cleveland, Ohio 44131 Technical Service USA: 1 (800) 642-7029

033-NONTBMYCO_CE_I_ V2.2 Date Updated: 30 April 2013

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SENSITITRE®

Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) par microdilution en milieu

liquide:

Pour les mycobactéries à croissance rapide, les mycobactéries à croissance lente n’appartenant pas au complexe Tuberculosis, Nocardia et autres actynomicètes

aérobies.

CE Pour diagnostic in vitro uniquement.

Pour des informations détaillées sur l’agencement de la microplaque ou le contrôle de qualité, se reporter sur le site www.trekds.com/techinfo muni de la référence de la

microplaque et du numéro de lot.

DOMAINE D’UTILISATION Test de sensibilité aux antibiotiques des mycobactéries à croissance rapide, comprenant le groupe Mycobacterium fortuitum (M. fortuitum, M. peregrinum, 3eme complexe biovariant M. fortuitum), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum) et le groupe M. smegmatis (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi), l’espèce Nocardia et autres actinomycètes aérobies, ainsi que les mycobactéries à croissance lente n’appartenant pas au complexe Tuberculosis comme le complexe Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii et Mycobacterium marinum. Pour plus de détails sur l’évaluation de M. marinum, se reporter aux recommandations du CLSI

Les milieux liquides fabriqués par TREK Diagnostic Systems ont été validés uniquement avec les produits Sensititre®.

PRINCIPE Chaque microplaque contient des agents antimicrobiens à des dilutions appropriées. Les résultats peuvent être lus manuellement par reconnaissance visuelle de la croissance.

PRECAUTIONS Seul le personnel qualifié et formé aux techniques d’études de la sensibilité aux antimicrobiens est habilité à utiliser ces tests. Le laboratoire devra avoir établi des directives de biosécurité pour la manipulation des mycobactéries. Les micro-organismes vivants utilisés dans le cadre de ce produit étant potentiellement infectieux, manipuler et éliminer tous les déchets en respectant les précautions d’usage. Pour rapporter les résultats obtenus avec les produits Sensititre CE IVD et FDA dégagés, utiliser uniquement les instruments compatibles avec Sensititre, c’est-à-dire les instruments à simple visualisation à miroir, à touches Sensitouch, Vizion. Nul autre système ne sera accepté.

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CONSERVATION ET PEREMPTION Les plaques doivent être conservées à température ambiante (15 à 25°C) à l’abri du soleil et de la chaleur. Chaque plaque est emballée dans un sachet aluminium contenant un gel de silice dessicant. Ne pas utiliser la plaque ou le bouillon si la date de péremption est dépassée, si la couleur du dessicant n’est plus bleue ou orange, ou si le sachet aluminium est endommagé. Inoculer la plaque dans les 5 heures qui suivent l’ouverture du sachet.

PROCEDURE Matériel fourni Microplaque Sensititre® Feuillet adhésif

Matériel non fourni Eau déminéralisée Sensititre® [T3339] Bouillon Sensititre® Mueller-Hinton ajusté par cations avec tampon TES (CAMHBT) Bouillon Sensititre® Mueller-Hinton ajusté par cations avec OADC [T8006] Têtes doseuses Sensititre® (à utiliser avec l’AutoInoculator®/l’AIM®) [E3010] AutoInoculator®Sensititre® [V3010] AIM® Sensititre® [V3020] Vizion® Sensititre® [V2021]

Nephelometer® Sensititre® [V3011] Lecteur manuel [V4007] Standard de turbidité 0.5 McFarland [E1041] Micropipette 50µL ou 100µL avec embouts jetables. Souches de Contrôle de Qualité Boites de gélose Etuve 30-350C, sans CO2 Agitateur Vortex Eau déminéralisée avec billes de verre Documentation CLSI à jour

RECUEIL ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Les échantillons doivent être recueillis, acheminés, conservés et ensemencés en milieu d’isolement primaire afin d’obtenir des colonies isolées selon les procédures standard .

CHOIX DU BOUILLON D’ANTIBIOGRAMME Utiliser le bouillon Sensititre®

CAMHBT uniquement pour les mycobactéries à croissance rapide, Nocardiae et autres Actinomycètes aérobies. Pour les mycobactéries à croissance lente, utiliser le bouillon Sensititre® Mueller Hinton avec OADC. Les bouillons Sensititre® ont été conçus pour obtenir des performances optimales avec les antibiogrammes Sensititre®.

INOCULATION ET INCUBATION Mycobactéries à croissance rapide, Nocardiae et autres Actinomycètes aérobies Permettre à tous les bouillons de monter à température ambiante avant utilisation.

1. Prélever une anse de culture sur gélose à l’aide d’un écouvillon stérile. Transférer et émulsifier dans de l’eau déminéralisée, puis ajuster à 0,5 McFarland, soit visuellement, soit à l’aide du néphélomètre Sensititre®. Si des particules restent visibles, vortexer vigoureusement. Les Actinomycètes présentent des colonies épaisses et très résistantes et il peut être nécessaire de les vortexer en présence de billes de verre afin d’obtenir une suspension

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homogène. Si des agrégats restent visibles après homogénéisation, laisser décanter et utiliser le surnageant pour l’inoculum.

Humidifier l’écouvillon avec de l’eau déminéralisée peut faciliter l’obtention d’une solution plus homogène.

Attention- L’utilisation d’eau contenant du Tween peut affecter les CMIs.

2. Transférer 50 µl de la suspension dans un tube de Bouillon Mueller-Hinton ajusté par cations avec tampon TES afin d’obtenir un inoculum de 5x105 UFC/mL (gamme 1x105 à 1x106 UFC/mL). Bien homogénéiser.

Les étapes 1 et 2 doivent être réalisées en maximum 30 minutes.

3. Les puits contenant la doxycycline ou la minocycline à des concentrations ≥ 32µg/mL peuvent présenter un précipité après incubation. Ce phénomène peut être évité en reconstituant les puits concernés avec 5 µl d’eau distillée stérile avant l’addition du bouillon. 4. Transférer 100µL dans chaque puits, à l’aide soit : a. de l’AutoInoculator/l’AIM Sensititre®. Remplacer le bouchon du tube par une tête doseuse Sensititre® à usage unique et inoculer la microplaque en suivant le mode d’emploi de l’AutoInoculator®/l’AIM®. Enlever la combinaison tube à essai / tête de dosage de l’AutoInoculator® / l’AIM® dans les 30 secondes après avoir doser une plaque et stocker inversée dans un présentoir ou jeter. b. d’une micropipette manuelle. Verser le bouillon dans une gouttière stérile et inoculer la microplaque à l’aide d’une micropipette appropriée. Identifier le panel à l’aide de l’étiquette Sensititre® faisant face à l’utilisateur. La calibration des micropipettes doit être régulièrement entretenue et vérifiée.

Distribuer le bouillon dans la microplaque en maximum 30 minutes.

5. Le nombre de colonies dans le contrôle positif doit être périodiquement vérifié. (voir appendice 1). Les isolats doivent présenter un inoculum de 5x105 UFC/mL (gamme 1x105 à 1x106 UFC/mL).

6. Recouvrir tous les puits à l’aide du feuillet adhésif. Appliquer fermement sur chaque puits de façon à sceller hermétiquement. Eviter les plis afin de prévenir toutes fuites entre puits.

7. Incuber les mycobactéries à croissance rapide en atmosphère aérobie à 30°C pendant 72 heures dans une étuve non-CO2. Vérifier la croissance. En cas de faible croissance, ré-incuber jusqu’à 48 heures supplémentaires. Incuber les Nocardia et autres Actinomycètes aérobies à croissance rapide en atmosphère aérobie à 35°C pendant 2 à 3 jours dans une étuve non-CO2.

Une incubation de 4 à 5 jours peut s’avérer nécessaire pour les isolats de M. chelonae and M. abscessus

CLSI recommande que les mycobactéries à croissance rapide non pigmentées soient incubées pendant 14 jours afin de garantir la détection de la résistance inductible aux macrolides, sauf si l'isolat est résistant lors d'une lecture antérieure.

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Les microplaques peuvent être empilées trois par trois. Mycobactéries non-tuberculeuses à croissance lente (y compris MAC) Suivre le même mode opératoire que décrit plus haut, à l’exception du transfert de 50 µL de la suspension du microorganisme dans 11 mL de Bouillon Sensititre®Mueller-Hinton ajusté par cations avec 5% v/v de supplément de croissance OADC. Retourner le tube 8 à 10 fois.

Incuber à 350C dans une étuve non-CO2 et lire à 7 jours. Si la croissance du contrôle positif est correcte, lire les résultats. Sinon, incuber jusqu’à 14 jours. Le CLSI M24 fournit des directives de lecture et des illustrations de différents profils de croissance. En cas d’incubation prolongée, il peut être nécessaire de prendre des mesures de prévention contre l’évaporation du contenu des puits. Placer les microplaques dans un container en plastique avec le couvercle entrouvert afin de faciliter les échanges gazeux.

LECTURE DES RESULTATS Les résultats peuvent être lus à l’aide du Lecteur manuel Sensititre® ou bien du Vizion®. Se reporter au mode d’emploi du Vizion®. Il n’est pas nécessaire de retirer le film adhésif. Disposer la microplaque avec l’étiquette faisant face à l’utilisateur. La croissance se traduit par un trouble ou un dépôt cellulaire au fond des puits. La CMI est la plus faible concentration d’un antibiotique ayant inhibé une croissance visible. Il est conseillé de se reporter au CLSI M24 pour une assistance dans la lecture des points finaux. La lecture de faibles croissances à l’aide du Vizion® peut être améliorée à l’aide d’un éclairage indirect puissant sur fond sombre.

Les puits de contrôle positif doivent être lus en premier. Si aucun ne présente de croissance, les résultats sont invalides.

Les points finaux des mycobactéries peuvent être difficiles à interpréter. Le CLSI M24 fournit des directives de lecture et des illustrations de différents profils de croissance. Les puits négatifs peuvent également présenter un faible précipité dû à l’inoculum. Il est conseillé de se former à la lecture à l’aide de souches de Contrôle de Qualité de CMIs connues.

La croissance peut varier de quelques colonies sans trouble jusqu’à des fortes croissances comparables à celles des contrôles positifs. La CMI est la concentration la plus faible qui inhibe totalement la croissance, à l’exception des sulphonamides, pour lesquels la CMI est la plus faible concentration qui inhibe 80% de la croissance comparée au contrôle positif.

Les points suivants doivent être notés: a. Contamination Une contamination peut entraîner une croissance dans un puits entouré de puits ne présentant aucune croissance. Une telle contamination dans un unique puits peut être ignorée. Néanmoins, si de nombreux puits sont suspectés de contamination, le test doit être répété. b. Sauts Un “saut” peut être occasionnellement rencontré (puits ne présentant pas de croissance entouré de puits présentant une croissance). De nombreux phénomènes peuvent en expliquer l’origine, comme une contamination, une mutation, un pli au niveau du feuillet adhésif, ou un dosage mal aligné. Un “saut” unique peut être ignoré. Néanmoins, afin d’assurer l’efficacité d’une antiobiothérapie, ne JAMAIS interpréter un puits “sauté” comme la CMI. Toujours lire la concentration la plus faible au-delà de laquelle aucune croissance n’est détectée de façon consistante.

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c. Cultures mixtes A l’exception du paragraphe “a” ci-dessus, si deux points finaux sont identifiés avec des boutons cellulaires bien distincts, suivis de plusieurs puits de croissance diffuse sans “culot” visible (ou avec des culots plus petits), une population bactérienne mixte doit être envisagée. La pureté doit être contrôlée par sous-culture sur gélose appropriée. Les résultats sont invalides en cas de cultures mixtes.

INTERPRETATION Se référer aux directives d’interprétation des CMIs fournies par le CLSI , ou votre groupe national de référence.

DOMAINE D’UTILISATION

Antibiotiques RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacine X X XX X

Amoxicilline/ Acide Clavulanique

XX X

Capreomycine

Cefepime XX

Cefoxitine X

Cefotaxime XX

Ceftriaxone X

Ciprofloxacine X X XX X

Clarithromycine7 X X XX

3 X X

Clofazimine4

X X X

Doxycycline X XX

Ethambutol XX X

Ethionamide

Gentamicine XX

Imipenem X X

Isoniazide5

XX XX

Kanamycine

Levofloxacine X

Linezolide X X XX X

Meropenem XX XX

Minocycline X X XX X

Moxifloxacine X X XX X

Ofloxacin6

Rifabutine XX X

Rifampine X X

Streptomycine XX XX

Sulfamethoxazole X X XX XX

Tigecycline X

Tobramycine X X

Trimethoprime/ Sulfamethoxazole

X X XX X

RGM Mycobactéries à croissance rapide NOC Nocardia spp. SGM Mycobactéries à croissance lente MAC Complexe M.avium

X: Première ligne XX: Seconde ligne

1 Information sur M.kansasii 2 Mycobactéries à croissance lente autres que MAC ou M.kansasii

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3 La clarithromycine étant le seul antibiotique rapporté pour le complexe M.avium, il est indiqué comme antibiotique de première ligne pour cet organisme. 4 Nécessite une demande d’expérimentation sur nouveau médicament pour obtenir la clofazime aux USA. Les tests de susceptibilité et les concentrations critiques n’ont toujours pas été établis ou standardisés par le CLSI. 5 Problématique pour tester les mycobactéries non tuberculeuses à croissance lente pour lesquelles les concentrations critiques restent à établir. 6 susceptible d’être indisponible aux USA. 7 CLSI recommande que les mycobactéries à croissance rapide non pigmentées soient incubées pendant 14 jours afin de garantir la détection de la résistance inductible aux macrolides, sauf si l'isolat est résistant lors d'une lecture antérieure. CONTROLE DE QUALITE La fréquence des contrôles de qualité doit être établie en fonction des règles locales. Les inocula doivent être cultivés sur milieux appropriés afin de vérifier la pureté et/ou la morphologie des colonies a. Les résultats des tests sont invalides en cas de culture mixte. Toutes les microplaques Sensititre® comprennent des puits de contrôle positif. Les résultats sont considérés comme invalides à moins que la croissance n’ait eu lieu dans tous les puits de contrôle positif. Un certain nombre de facteurs influencent les CMIs, parmi lesquels l’état de l’organisme, la densité de l’inoculum, la température ainsi que la nature du bouillon. En pratique, les CMIs répliquées présentent une distribution normale avec la majorité des résultats qui s’étendent autour d’une dilution de la valeur modale. Le mode opératoire peut être considéré comme satisfaisant si les CMIs des organismes de contrôle sont de cet ordre. Les résultats ne doivent pas être rendus si les résultats du contrôle de qualité ne sont pas de cet ordre. La table 1 présente une gamme expérimentale de contrôle de qualité sur des souches mycobactériennes. Tant que d’autres données ne sont pas disponibles, S.aureus ATCC 29213 et d’autres souches de CQ non mycobactériennes ainsi que les gammes du document M100 du CLSI peuvent être utilisées pour le panel de Contrôle de Qualité (Table 2). Les souches de contrôle de qualité M100 du CLSI doivent être inoculées selon le même mode opératoire relatif aux mycobactéries à croissance rapide, excepté que 50 µL d’inoculum doivent être ajoutés au bouillon Sensititre® Mueller Hinton avec TES. Ne pas utiliser de bouillon supplémenté avec de l’OADC. Lire les microplaques à 18 et 24 heures d’incubation à 35°C. La souche de contrôle de qualité M. avium 700898 doit être incubée à 35°C dans une étuve non- CO2 et lue à 7 jours. Si la croissance du contrôle positif est bonne, lire les résultats. Sinon, ré-incuber jusqu’à 10 jours. Le CLSI M24 fournit des directives de lecture et des illustrations de différents profils de croissance. a Des variations morphologiques ont été observées avec M. avium 700898. Jusqu’à trois types de colonies ont été identifiés: 1) bombée lisse, 2) bombée opaque avec bordure rugueuse et transparente, 3) plate et transparente avec bordure rugueuse. La CMI peut être affectée par le type de colonie utilisée pour la préparation de l’inoculum. Les CMIs pour l’isoniazide, la moxifloxacine et la rifampine peuvent varier avec les cultures de M. avium 700898.

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Table 1: Gamme expérimentale de contrôle de qualité sur des souches mycobactériennes1 et S.aureus ATCC 29213 Antibiotiques S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacine ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amoxicilline/acide clavulanique 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Capréomycine - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Céfotaxime 1-4

Céfépime 1-4

Céfoxitin 1-4* 4-32*

Céftriaxone 1-8

Ciprofloxacine 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Clarithromycine 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Clofazimine - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Doxycycline 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Ethambutol - 2-16 2-16

Ethionamide - >20 20-80****

0.6 – 5 (7 jours incubation)

1.25 – 10 (10-11 jours incubation)

Gatifloxacin 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Isoniazide - 1-4 ≥13

Kanamycine 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Lévofloxacine 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolid 1-4* 1-8* 8-323

Méropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minocycline 0.06-0.54

0.12-0.5*

Moxifloxacine 0.015-0.12 ≤ 0.06 – 0.25*

0.25 – 43

Ofloxacine 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Rifabutine (Ansamycine)

- 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicine

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Streptomycine - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulphamethoxazole 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetracycline 0.12-1

Tigécycline 0.03-0.25

Tobramycine 0.12-1* 2-8*

Triméthoprime / sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5* ≤ 0.25/4.8–2/38* 0.25/4.8-2/38

Notes 1 Gamme contrôle de qualité M100 CLSI

2 les CMIs listées font référence au sulfizoxazole pour S.aureus 3 Echelle de valeurs obtenue à partir de tests Sensititre® réalisés par Trek ; Les CMIs de M. avium 700898 peuvent varier en fonction de la morphologie des colonies.

* Gamme contrôle de qualité M24 CLSI ** Echelle de valeurs basée sur les données de la référence 3 *** Echelle de valeurs basée sur les données de la référence 4

**** Dépend du temps d’incubation. Echelle de valeurs basée sur une incubation de 72 heures seulement.

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Table 2: Echelles de valeurs de contrôles de qualité supplémentaires

Antibiotique E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacine 0.5-4 1-4

Amoxicilline/acide clavulanique 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaxime 0.03-0.12 8-32

Cefepime 0.015-0.12 1-8

Cefoxitin 2-8

Ceftriaxone 0.03-0.12 8-64

Ciprofloxacine 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Doxycycline 2-8 0.5-2 4-322

Gatifloxacin 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamycine 16-64 1-4

Levofloxacine 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolide 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minocycline 1-4 0.25-1

Moxifloxacine 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Ofloxacine 1-4 0.015-0.12 1-8

Rifabutine (Ansamycine) 4-162

Rifampicine 0.5-4 4-16 16-64

Streptomycine 4-162

Tetracycline 8-32 0.5-2 8-32

Tigecycline 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramycine 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimethoprime/ sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 Echelle de valeurs de QC M100 CLSI 2 Echelle de valeurs obtenue à partir de tests Sensititre® realisés par Trek Contacter TREK Diagnostic systems ou votre distributeur local si des discordances au niveau du contrôle de qualité ne peuvent être résolues. PERFORMANCES Les panels sont conçus pour procurer des performances comparables au protocole de référence du CLSI en micro-bouillons. Les performances ont été évaluées indépendamment. (références 5-7) Pour de plus amples informations, contacter TREK Diagnostic systems ou votre distributeur local. LIMITATIONS 1. Les résultats Imipenem pour M.chelonae et M.abscessus ne doivent pas être rendus 2. Tobramycine est l’aminoglycoside de choix pour M. chelonae et doit être rendu uniquement pour cet organisme.

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APPENDICE 1: Mode opératoire pour le comptage des colonies 1. Immédiatement après l’inoculation de la plaque, prélever à l’aide d’une oese de 1 µL, un échantillon du puits de contrôle positif et l’inoculer sur une gélose appropriée. 2. A l’aide d’une nouvelle oese de 1 µL, prélever un nouvel échantillon du même puits et le diluer dans 50 µL d’eau stérile déionisée. Inoculer sur une gélose afin d’obtenir des colonies pouvant être comptées. 3. Incuber les géloses une nuit à 30° ou 35 0C (en fonction de l’organisme). 4. Lire comme suit:

Nombre de colonies sur la gélose Concentration gélose 0,001 0,001 de dilution1/50 <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 BIBLIOGRAPHIE 1. CLSI M24. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878 8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press.

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AVERTISSEMENT L’information contenue dans ce manuel d’utilisation est à jour à la date de son impression et est susceptible d’être modifiée sans préavis. Les informations les plus récentes peuvent être obtenues soit par téléchargement à l’adresse www.trekds.com\techinfo soit en contactant le support technique de TREK.

b Fabriqué par TREK Diagnostic Systems

Units 17-19 Birches Industrial Estate, East Grinstead, West Sussex, RH19 1XZ, UK Tel: +44-1342-318777

Distribué par TREK Diagnostic Systems, 982 Keynote Circle, Suite 6, Cleveland, Ohio 44131 Technical Service USA: 1 (800) 642-7029

033-NONTBMYCO_CE-F_V2.2 Date Updated: 30 April 2013

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SENSITITRE®

Meio para Método de Microdiluição:

Para Micobactéria de Crescimento Rápido (MCR), Micobactéria Não-Tuberculose de

Crescimento Lento, Nocardia e outros Actinomicetes Anaeróbios

CE Para Uso somente em Diagnóstico In vitro

Para informações completas das placas, incluindo layout e informações de Controle de Qualidade, refira-se a www.trekds.com/techinfo. o código da placa e o número de lote

serão solicitados.

INSTRUÇÕES DE USO Teste de suscetibilidade para Micobactérias de crescimento rápido, incluindo grupo Mycobacterium fortuitum (M. fortuitum, M. peregrinum, M. fortuitum third biovariant complex), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum e grupo M. smegmatis (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi). Nocardia spp e outros actinomicetes aeróbios. Micobactérias não-tuberculose de crescimento lento (NTM), como Mycobacterium avium complex, Mycobacterium kansasii e Mycobacterium marinum.

Favor referir-se ao CLSI para detalhes do teste de M. marinum

Os meios manufaturados pela TREK Diagnostic Systems somente foram validados com os produtos Sensititre®.

PRINCÍPIO DO USO Cada placa é dosada com agentes antimicrobianos nas diluições apropriadas. Os resultados podem ser lidos manualmente por leitura visual do crescimento.

PRECAUÇÕES Somente pessoal treinado e qualificado em técnicas de teste de suscetibilidade devem utilizar o system a. O Laboratório deve estabelecer as normas de biosegurança para manipulação de micobactérias. Microorganismos utilizados com este produto podem ser infectantes para o usuário, portanto o manuseio apropriado e os métodos de descarte devem der usados. Apenas os instrumentos suportados pelo Sensititre, nomeadamente, um simples visualizador reflector, o Sensitouch, o Vizion, devem ser utilizados para registar resultados com os produtos Sensititre aprovados pelas directivas CE IVD e pela FDA, não sendo suportado qualquer outro sistema.

ARMAZENAMENTO E VALIDADE As placas devem ser armazenadas a temperatura ambiente (15-25°C) longe de luz solar direta e calor. Cada placa é embalada em folha metálica protetora com sílica gel dessecante. Não utilize

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após data de expiração, ou se a cor do dessecante não for azul ou laranja ou se a folha metálica protetora estiver danificada. Inocular a placa em até 5 horas da remoção da folha metálica protetora PROCEDIMENTO Materiais includsos: Placa Sensititre® Selo adesivo Materiais não inclusos: Água desmineralizada Sensititre® [T3339] Meio Mueller-Hinton cátion –ajustado com tampão TES (CAMHBT) Sensititre®

Meio Mueller-Hinton cátio-ajustado com OADC Sensititre® [T8006] Doseheads Sensititre® (para uso com AutoInoculator®/AIM®) [E3010] Sensititre® AutoInoculator® [V3010] Sensititre® AIM® [V3020] Sensititre® Nephelometer® [V3011] Sensititre® Vizion® [V2021] Manual Viewer [V4007] Escala 0.5 de McFarland [E1041] Pipeta de 50µL ou 100µL e ponteiras descartáveis Cepas para Controle de Qualidade Placas de meio de cultura Incubador 30-350C, sem-CO2 Vortex Água Demineralizada com grânulos de vidro Documentos atuais do CLSI

COLETA E PREPARAÇÃO Espécimes devem ser coletados, transportados, armazenados e então plaqueados para inoculação primária para isolamento de colônias utilizando os procedimentos padrões. SELEÇÃO E MEIO PARA TESTE DE SUSCETIBILIDADE Utilize somente CAMHBT Sensititre®

para micobactérias de crescimento rápido, Nocardia e outros Actinomicetes anaeróbios ou meio Mueller Hinton com OADC Sensititre® para micobactérias de crescimento lento. Os meios Sensititre® tiveram suas performances testadas para uso com produtos para suscetibilidade Sensititre®. INOCULAÇÃO E INCUBAÇÃO Micobactérias de crescimento rápido, Nocardia spp e outros Actinomicetes anaeróbios Permita que todos os caldos de cultura atinjam a temperatura ambiente antes da utilização. 1. Retire a parte confluente do crescimento da colônia para uma placa com o swab. Emulsifique em água destilada desmineralizada e ajuste visualmente a 0.5 da escala de McFarland ou utilizando o Sensititre Nefelômetro®. Caso haja partículas visíveis, agite bem. Actinomycetos tipicamente têm colônias muito sólidas, podendo ser necessário uso de vortex para obter uma suspensão homogênea. Caso grandes fragmentos ainda persistam após o uso do vortex, deve-se deixar depositar no tubo e então utilizar o sobrenadante para suspensão do inoculo. Molhar o swab com água destilada desmineralizada pode facilitar a obtenção de uma solução mais homogênea…

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AVISO – o uso de água suplementada com Tween pode afetar os MICs 2. Transfira 50µl da suspensão em um tubo de meio Mueller-Hinton com tampão TES cátion ajustado para obter um inoculo de 5x105 cfu/mL (intervalo 1x105 a 1x106 cfu/mL). Misture bem.

Passos 1 e 2 devem ser realizados em até 30 minutos. 3. Placas contendo ≥ 32µg/mL de doxiciclina ou minociclina podem apresentar um precipitado após incubação. Isto pode ser prevenindo pela reconstituição destes com 5µL de água destilada desmineralizada antes da adição do meio. 4. Transferir 100µL a cada pocinho através de: a. Sensititre® AutoInoculator® / AIM®. Substitua a tampa do tubo por uma Sensititre® Dosehead nova e inocule a placa de acordo com as instruções do AutoInoculator® /AIM®. Retire a combinação da cabeça de dosagem e tubo de teste do AutoInoculator® /AIM®num espaço de 30 segundos após dosear uma placa e guarde-a virada ao contrário numa prateleira ouelimine-a. b. Pipetagem Manual. Distribua o meio na placa com uso de pipeta estéril apropriada. Utilize a placa com o selo Sensititre® voltado para o usuário. Pipetas devem ser periodicamente calibradas. Inocule o meio na placa dentro de 30 minutos. 5. Checagens periódicas da contagem de colônias do controle positivo devem ser feitas. (Veja Appendix 1) Os isolados devem ter um inoculo de 5x105 CFU/mL, (intervalo 1x105 – 1x106) 6. Cubra todos os poços com o selo adesivo. Pressione todos os poços firmemente para garantir a selagem adequada. Evite vincos pois estes podem ser pulados.” 7. Incube a micobacteria de crescimento rápido aerobicamente a 300C em uma incubadora livre de CO2 por 72 horas. Cheque o crescimento. Caso este seja pobre, re-incube por até 48 horas. Incube Nocardia e outros Actinomycetos a 350C em incubadora livre de CO2 por 2-3 dias. Incubação de 4-5 dias pode ser necessária para isolados de M. chelonae e M. abscessus O instituto CLSI recomenda que as micobactérias de crescimento rápido sejam incubadas durante 14 dias para assegurar a detecção da resistência induzível aos macrólidos, excepto quando nos casos em que o isolado se relevar resistente numa leitura anterior. As placas podem ser empilhadas em até 3 placas. Micobactérias de Crescimento Lento (NTM incluindo MAC) Utilizar o mesmo procedimento acima, porém transfira de 50µL da suspensão microbiana em 11 ml de meio Sensititre® Mueller-Hinton com 5% v/v de suplemento de crescimento OADC. Inverta o tubo8-10 vezes. Incube a 350C em incubadora livre de CO2 e leia após 7 dias. Caso o crescimento esteja bom no controle positivo, leia os controles. Caso contrário, re-incube por até 14 dias. O CLSI M24 fornece procedimentos de leitura e ilustrações de vários padrões de crescimento.

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Incubações prolongadas podem requerer etapas para previnir a perda de conteudo por evaporação. Acomode as placas em um container plástico com tampa entreaberta para facilitar a troca de gases. LEITURA DOS RESULTADOS Os resultados podem ser lidos utilizando Sensititre® leitor manual ou através do Vizion®. Veja manual do usuário do Vizion®. Não é necessário remover o selo adesivo. Acomode a placa com o selo voltado para o usuário. O crescimento aparece como turbidez ou como depósito de células no fundo do pocinho. O MIC é considerado como a menor concentração de antibiótico capaz de inibir o crescimento visível. Referir-se ao CLSI M24 para procedimento de leitura de ponto final. A leitura de fracos crescimentos no Vizion® pode ser melhorada utilizando-se fonte de luz indireta contra o fundo. O pocinho do controle positive deve ser lido primeiro. Caso não apresente crescimento, os resultados estarão inválidos. O Ponto Final de Micobacterias pode ser difícil de interpretar. O CLSI M24 oferece procedimentos de leitura e ilustrações de vários padrões de crescimento. Poços negativos podem apresentar um leve precipitado devido ao inoculo. Leituras de cepas de Controle de Qualidade com MICs conhecidos devem ser realizadas como treinamento. O crescimento bacteriano pode variar de poucas colônias sem turbidez a fortes crescimentos comparáveis ao controle positivo. O MIC é a menor concentração que inibe completamente o crescimento exceto para as sulfonamidas, onde o MIC é lido como a menor concentração que inibe 80% do crescimento comparado com o controle positivo. Os seguintes pontos devem ser notados: a. Contaminação Pode-se considerar contaminação onde ocorra crescimento em um poço circundado por poços que não demonstrem crescimento. Uma contaminação isolada pode ser ignorada, porém se houver suspeita de contaminação em múltiplos poços, o teste deverá ser repetido. b. Falha Ocasionalmente uma falha pode ser vista – um poço que não mostre crescimento circundado por poços com crescimento. Há várias explicações incluindo contaminação, mutação, enrugamento do selo e desalinhamento na pipetagem. Uma falha isolada pode ser ignorada, entretanto, com o intuito de garantir a efetividade da terapia antimicrobiana, NUNCA considere a falha como o MIC; sempre considere a menor concentração acima da que apresentar falta de crescimento consistente. c. Culturas mistas Exceto conforme referido no item (a) acima, caso dois pontos finais forem vistos como “botões” distintos de células, seguidos de vários poços de crescimento difuso e o “botão” não mais visível (ou visualizado como pequenos botões), pode haver população mista de bactérias. A pureza da colônia pode ser checada pelo sub-cultivo em Agar apropriado. Resultados devem ser invalidados caso seja detectado cultura mista.

PROCEDIMENTOS DE INTERPRETAÇÃO Refira-se aos procedimentos de interpretação de MIC conforme disponibilizado pelo CLSI , ou grupo de referência nacional.

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INDICAÇÕES DE USO

Antimicrobiano RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacin X X XX X

Amoxicillin/ Clavulanic acid

XX X

Capreomycin

Cefepime XX

Cefoxitin X

Cefotaxime XX

Ceftriaxone X

Ciprofloxacin X X XX X

Clarithromycin7 X X XX

3 X X

Clofazimine4

X X X

Doxycycline X XX

Ethambutol XX X

Ethionamide

Gentamicin XX

Imipenem X X

Isoniazid5

XX XX

Kanamycin

Levofloxacin X

Linezolid X X XX X

Meropenem XX XX

Minocycline X X XX X

Moxifloxacin X X XX X

Ofloxacin6

Rifabutin XX X

Rifampin X X

Streptomycin XX XX

Sulfamethoxazole X X XX XX

Tigecycline X

Tobramycin X X

Trimethoprim/ Sulfamethoxazole

X X XX X

Legenda RGM (Rapid growing mycobacteria) Micobactéria de crescimento rápido NOC Nocardia spp. SGM (Slow growing mycobacteria) Micobactéria de crescimento lento MAC M.avium complex

X: Primeira linha XX: Segunda linha

1 Informação de M.kansasii 2 De Crescimento Lento, outros que MAC ou M.kansasii 3 Claritromicina é o único antimicrobiano reportado para M.avium complex. Destes é droga de primeira linha para este organismo. 4 Nos EUA requer apenas um paciente IND para obter clofazimine. Métodos de susceptibilidade e breakpoints não foram estabelecidos ou padronizados pelo CLSI. 5 Problematico para testar NTM; breakpoints ainda não foram estabelecidos para NTM. 6 Pode não estar disponível para os EUA. 7 O instituto CLSI recomenda que as micobactérias de crescimento rápido sejam incubadas durante 14 dias para assegurar a detecção da resistência induzível aos macrólidos, excepto quando nos casos em que o isolado se relevar resistente numa leitura anterior.

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CONTROLE DE QUALIDADE A freqüência dos testes de controle de qualidade deve estar de acordo com as diretrizes locais. Inoculos devem ser cultivados em meio apropriado para checar a pureza e/ou morfologia das colônias a. Resultados dos Testes são inválidos se culturas mistas forem detectadas. Todas as placas Sensititre® incluem poços com controle positivo. Testes são inválidos a menos que haja crescimento distinto em todos os poços de controles positivos. Uma série de fatores pode influenciar os MIC’s, incluindo o estado dos organismos, densidade do inoculo, temperatura e meio de cultura. Na prática, replicar os MIC’s de uma distribuição normal com a maioria dos resultados em uma diluição do valor provável. O teste pode ser considerado satisfatório se os MIC’s de organismos controle estiverem dentro do intervalo. Resultados não deverão ser reportados se o resultado do controle de qualidade não estiver dentro do intervalo. Tabela 1 lista os intervalos do Controle de Qualidade utilizando cepas de micobactérias. Até que outros dados tornem-se disponíveis, S.aureus ATCC 29213 e outras cepas de CQ não-micobacterianas e intervalos do documento CLSI M100 pode ser utilizado para painéis de CQ (Tabela 2). Cepas de CQ CLSI M100 devem utilizar mesmo método de inoculação das micobactérias de crescimento rápido, exceto que 50µL do inoculo deve ser adicionada ao meio Sensititre® Mueller Hinton com tampão TES. Não utilize meio suplementado com OADC. Painéis devem ser lidos de 18 a 24 horas após incubação a 35°C. Cepas de CQ M. avium 700898 devem ser incubadas a 350C em incubadora livre de CO2 e lidas em 7 dias. Caso o crescimento em controle positivo seja bom, leia os resultados. Caso contrário, re-incube em até 10 dias. CLSI M24 fornece procedimentos de leitura e ilustrações de vários padrões de crescimento. a Variações morfológicas foram observadas com M. avium 700898. Até três tipos de colônias foram identificadas (1. abóboda lisa, 2. abóboda opaca com borda áspera transparente, 3. Lisa e transparente com abóboda áspera). MIC pode ser afetado pelo tipo de colônia usada para inoculo. MIC de Isoniazida, Moxifloxacin e Rifampin podem variar entre culturas de M. avium 700898.

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Tabela 1: Tentativa de intervalos de Controle de Qualidade para cepas de micobacteria1 e S.aureus ATCC 29213 Agente antimicrobiano S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacin ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amoxicillin/clavulanate 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Capreomycin - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Cefotaxime 1-4

Cefepime 1-4

Cefoxitin 1-4* 4-32*

Ceftriaxone 1-8

Ciprofloxacin 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Clarithromycin 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Clofazimine - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Doxycycline 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Ethambutol - 2-16 2-16

Ethionamide - >20 20-80****

0.6 – 5 (7 dias Incubação)

1.25 – 10 (10-11 dias Incubação)

Gatifloxacin 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Isoniazid - 1-4 ≥13

Kanamycin 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Levofloxacin 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolid 1-4* 1-8* 8-323

Meropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minocycline 0.06-0.54

0.12-0.5*

Moxifloxacin 0.015-0.12 ≤ 0.06 – 0.25*

0.25 – 43

Ofloxacin 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Rifabutin (Ansamycin) - 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicin

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Streptomycin - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulphamethoxazole 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetracycline 0.12-1

Tigecycline 0.03-0.25

Tobramycin 0.12-1* 2-8*

Trimethoprim / sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5* ≤ 0.25/4.8–2/38* 0.25/4.8-2/38

Notas 1 Intervalo CLSI M100 QC

2 O MIC listado é para sulfizoxazol para S.aureus 3 Intervalos baseados em testes “in house” com Sensititre®; MIC com M. avium 700898 pode ser afetado pelos tipos de morfologia das colônias.

* Intervalo CLSI M24 QC ** Intervalo baseado em dados da Referência 3 *** Intervalo baseado em dados da Referência 4

**** Incubação depende do tempo. Intervalo baseado somente em incubação de 72 horas.

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Tabela 2: Intervalos adicionais de CQ1

Agente antimicrobiano E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacin 0.5-4 1-4

Amoxicillin/clavulanate 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaxime 0.03-0.12 8-32

Cefepime 0.015-0.12 1-8

Cefoxitin 2-8

Ceftriaxone 0.03-0.12 8-64

Ciprofloxacin 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Doxycycline 2-8 0.5-2 4-322

Gatifloxacin 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamycin 16-64 1-4

Levofloxacin 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolid 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minocycline 1-4 0.25-1

Moxifloxacin 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Ofloxacin 1-4 0.015-0.12 1-8

Rifabutin (Ansamycin) 4-162

Rifampicin 0.5-4 4-16 16-64

Streptomycin 4-162

Tetracycline 8-32 0.5-2 8-32

Tigecycline 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramycin 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimethoprim/ sulphamethoxazole

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 CLSI M100 QC intervalo a menos que indicado de outra maneira 2 Intervalo baseado em testes “in house” com Sensititre® Contacte o distribuidor dos produtos Sensititre® ou a TREK Diagnostic Systems nos casos em que discrepâncias nos controles de qualidade não possam ser resolvidas. PERFORMANCE Painéis são desenhados para oferecer performance compatível aos procedimentos de micro-diluições do CLSI. Performances foram investigadas independentemente (referências 5-7) Para maiores informações contacte a TREK Diagnostic systems ou seu distribuidor local. LIMITAÇÕES 1. Resultados de Imipenen para M.chelonae e M.abscessus não devem ser reportados 2. Tobramicina é o aminoglicosídeo de escolha para M. chelonae e deve ser reportado somente para este organismo

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APÊNDICE 1: Procedimento para contagem de colônia 1.Siga Imediatamente com a inoculação da placa, utilizando uma alça de 1µl loop, amostra do crescimento do poço de controle de qualidade positivo e inocule em Agar apropriado. 2.Retire outra alça (1µl) e amostre do mesmo poço de crescimento e misture com 50µl de água deionizada estéril. Inocule 1µl desta diluição em placa de agar apropriado para obter colônias contáveis. 3.Incube over night ambas as placas a 30 ou 35 0C (dependendo do tipo de organismo). 4.Leia conforme segue:

Número de colônias na placa Contagem de colôniast 0.001 placa 0.001 da diluição 1/50 <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 BIBLIOGRAFIA 1. CLSI M24. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 . Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878 8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press.

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DISCLAIMER As informações fornecidas nesta bula técnica é atual no momento da impressão e pode ser alterada sem aviso prévio. As informaç~çoes atualizadas podem ser baixadas do website: www.trekds.com\techinfo ou contactando os serviços da TREK .

b Fabricado por TREK Diagnostic Systems

Units 17-19 Birches Industrial Estate, East Grinstead, West Sussex, RH19 1XZ, UK Tel: +44-1342-318777

Distribuido por TREK Diagnostic Systems, 982 Keynote Circle, Suite 6, Cleveland, Ohio 44131 Technical Service USA: 1 (800) 642-7029

033-NONTBMYCO_CE_PT_V2.2 Date Updated: 30 April 2013

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SENSITITRE®

Metoda mikro-rozcieńczeń pożywki (MIC):

dla szybko rosnących mykobakterii (RGM), wolno rosnących mykobakterii nie-

gruźliczych, bakterii Nocardia i innych tlenowych promieniowców

CE Wyłącznie do użytku diagnostycznego in vitro

Aby uzyskać pełną informację dotyczącą płytki, włącznie z układem, informacją dotyczącą kontroli jakości, proszę odwiedzić stronę www.trekds.com/techinfo.

Wymagany będzie kod płytki i numer partii.

ZASTOSOWANIE Badanie wrażliwości szybko rosnących mykobakterii, włącznie z grupą Mycobacterium fortuitum (M. fortuitum, M. peregrinum, M. fortuitum trzeci kompleks biowariantów), M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum) oraz grupą M. smegmatis (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi). Nocardia spp i innych tlenowych promieniowców. Wolno rosnących mykobakterii nie gruźliczych (NTM), tzn. Mycobacterium avium kompleks, Mycobacterium kansasii i Mycobacterium marinum.

Szczegółowe dane dotyczące testów M. marinum zawarte są w CLSI.

Pożywka produkowana przez firmę TREK Diagnostic Systems została poddana walidacji wyłącznie z produktami Sensititre®.

ZASADY UŻYTKOWANIA Każda płytka zawiera dawki środków antybakteryjnych w odpowiednich stężeniach. Wyniki można odczytywać manualnie poprzez wzrokowy odczyt wzrostu.

ŚRODKI OSTROŻNOŚCI System powinien być używany jedynie przez osoby przeszkolone i posiadające kwalifikacje w zakresie technik badania wrażliwości. W laboratorium powinny zostać ustalone zasady bezpieczeństwa biologicznego w odniesieniu do prac z Mycobacteria. W związku z możliwością zakażenia użytkownika przez żywe mikroorganizmy, używane z tym produktem, należy stosować odpowiednie metody obsługi i utylizacji.

PRZECHOWYWANIE I OKRES TRWAŁOŚCI Płytki powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej (15–25°C) z dala od bezpośredniego działania słońca lub źródeł ciepła. Każda płytka znajduje się w opakowaniu foliowym razem z pochłaniaczem wilgoci w postaci silikażelu. Nie należy używać płytki, jeżeli upłynęła data przydatności lub jeśli barwa pochłaniacza wilgoci nie jest niebieska lub pomarańczowy , albo torebka foliowa jest uszkodzona. Inokulacja płytki powinna nastąpić w ciągu 5 godzin od wyjęcia z torebki.

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PROCEDURA Materiały zawarte w zestawie: Płytka Sensititre® Samoprzylepna folia uszczelniająca

Materiały nie zawarte w zestawie: Woda demineralizowana Sensititre® Sól fizjologiczna Sensititre® z koralikami szklanymi Pożywka Sensititre® Mueller-Hinton o znanej zawartości kationów z buforem TES (CAMHBT) Suplement OADC Pożywka Sensititre® Mueller-Hinton o znanej zawartości kationów z OADC Pożywka Sensititre® 7H9 Głowice dozujące Sensititre ® (do zastosowania z urządzeniem AutoInoculator®) Urządzenie Sensititre AutoInoculator® [V3010] /AIM® [V3020] AIM Sensititre ® [V3020] Nefelometr Sensititre® [V3011] Przeglądarka manualna Polimerowy standard mętności 0,5 McFarland Pipetor 50 µl lub 100 µl oraz końcówki jednorazowego użytku Szczepy do kontroli jakości Płytki agarowe Cieplarka 30-35°C, bez CO2 Wstrząsarka Woda demineralizowana z koralikami szklanymi Obowiązujące wydania dokumentów CLSI i EUCAST

POBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK Aby uzyskać dobrze odizolowane kolonie, próbki należy zbierać, transportować, przechowywać, a następnie umieszczać na pierwotnej pożywce izolacyjnej, korzystając ze standardowych procedur (1, 8).

WYBÓR POŻYWKI DO BADANIA WRAŻLIWOŚCI Należy stosować wyłącznie pożywkę Sensititre®

CAMHBT dla szybko rosnących mykobakterii, Nocardia i innych tlenowych Actinomycetes lub pożywkę Sensititre® Mueller Hinton z OADC dla wolno rosnących mykobakterii. Wszystkie pożywki akceptowane przez system Sensititre® są badane w zakresie skuteczności działania z produktami Sensititre® do badania wrażliwości.

INOKULACJA I INKUBACJA Szybko rosnące Mycobacteria, Nocardia spp i inne tlenowe promieniowce Przed użyciem należy doprowadzić wszystkie pożywki do temperatury pokojowej.

1. Zabrać zlewającą się cześć wzrostu z płytki agarowej, używając w tym celu wacika. Emulgować w jałowej wodzie i wzrokowo lub stosując nefelometr Sensititre® doprowadzić do standardu 0,5 McFarland. Jeśli widoczne są cząstki, dobrze wymieszać. Promieniowce tworzą zwykle bardzo twarde, tworzące skorupę kolonie. Dla uzyskania jednorodnej zawiesiny konieczne może być mieszanie z koralikami szklanymi. Jeśli po wymieszaniu pozostają duże grudki, należy odstawić zawiesinę do wyklarowania i zebrać płyn nadosadowy do przygotowania inokulum.

Zwilżenie wacika jałową wodą może ułatwić uzyskanie bardziej jednorodnej zawiesiny...

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Ostrzeżenie - użycie wody z dodatkiem Tween może wpływać na odczyt wartości MIC

2. Przenieść 50 µl zawiesiny do probówki z pożywką Mueller-Hinton o znanej zawartości kationów z buforem TES, aby uzyskać inokulum o gęstości 5x105 cfu/ml (zakres 1x105 do 1x106 cfu/ml). Dobrze wymieszać.

Kroki 1 i 2 powinny zostać wykonane w ciągu 30 minut. 3. Płytki zawierające ≥ 32 µg/ml doksycykliny lub minocykliny mogą wykazywać wytrącanie po inkubacji. Można temu zapobiec dodając do tych studzienek 5 µl jałowej wody destylowanej przed dodaniem pożywki. 4. Przenieść po 100 µl do każdej studzienki, jedną z poniższych metod: a. Sensititre® AutoInoculator® /AIM®. W miejscu korka probówki umieścić jednorazową głowicę dozującą Sensititre®, a następnie inokulować płytkę zgodnie z instrukcją urządzenia AutoInoculator®/AIM®. Zdjąć połączony zestaw probówki z głowicą dozującą z urządzenia AutoInoculator w czasie 30 sekund od wykonania dozowania na płytkę i odstawić w pozycji odwróconej na stojak lub usunąć. b. Pipeta ręczna. Wlać pożywkę do sterylnej rynienki do posiewu, a następnie inokulować płytkę za pomocą odpowiedniej pipety. Dozować do panelu Sensititre® zwróconego etykietą ku użytkownikowi. Pipety należy regularnie serwisować i kontrolować ich kalibrację Inokulację pożywki na płytce należy wykonać w ciągu 30 minut. 5. Przeprowadzać okresowe sprawdzenie liczebności kolonii w studzience kontroli dodatniej. (patrz Załącznik 1). Izolaty powinny zawierać inokulum w gęstości 5x105 CFU/ml, (zakres 1x105 – 1x106) 6. Okryć wszystkie studzienki samoprzylepną folią uszczelniająca. Dokładnie docisnąć wszystkie studzienki zapewniając odpowiednie uszczelnienie. Należy unikać fałd, ponieważ mogą one prowadzić do pominięć. 7. Inkubować szybko rosnące mykobakterie w warunkach tlenowych, w temperaturze 300C w cieplarce bez CO2 przez okres 72 godzin. Sprawdzić obecność wzrostu. Jeśli wzrost jest słaby, powtórnie inkubować przez kolejnych 48 godzin. Inkubować Nocardia i inne promieniowce tlenowe w temperaturze 350C w cieplarce bez CO2 przez 2-3 dni. Płytki można ustawiać w stosy po nie więcej niż trzy. Inkubacja trwająca 4-5 dni może być konieczna w przypadku izolatów M. chelonae i M. abscessus (1) Wolno rosnące mykobakterie nie gruźlicze (NTM, włącznie z MAC) Stosuje się taką samą procedurę, jak powyżej, z wyjątkiem przeniesienia 50 µl zawiesiny organizmów do 11 ml pożywki Sensititre® Mueller-Hinton z 5% obj./obj. dodatkiem suplementu OADC. Odwrócić probówkę 8-10 razy. Inkubować w temperaturze 350C w cieplarce bez CO2 i odczytywać po upływie 7 dni. Jeśli obecny jest dobry wzrost w kontroli dodatniej, odczytywać wyniki. W przeciwnym razie, inkubować ponownie przez okres do 14 dni. Dokument CLSI M24-A (1) zapewnia wytyczne dotyczące odczytów i ilustracje różnorodnych wzorców wzrostu. Dłuższa inkubacja może wymagać podjęcia kroków w celu zapobieżenia ubytkowi zawartości studzienki w drodze

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parowania. Płytki należy umieścić w otwartym od góry plastikowym pojemniku, umożliwiającym wymianę gazową. ODCZYT WYNIKÓW BADAŃ Wyniki można odczytać korzystając z ręcznej przeglądarki Sensititre® lub urządzenia Vizion®. Patrz: instrukcja obsługi Vizion®. Nie jest konieczne usuwanie folii uszczelniającej. Płytkę należy umieścić etykietą w stronę użytkownika. Oznaką wzrostu jest zmętnienie lub odkładanie się komórek na dnie studzienki. MIC jest rejestrowane jako najmniejsze stężenie antybiotyku hamujące widoczny wzrost. Wytyczne dotyczące odczytu punktów końcowych zawarte są w dokumencie CLSI M24-A (1). Odczyt słabego wzrostu w urządzeniu Vizion® można poprawić stosując jasne, pośrednie oświetlenie na ciemnym tle. Studzienki do kontroli dodatniego wzrostu powinny być odczytywane jako pierwsze. Jeśli którakolwiek nie wykazuje wzrostu, wyniki nie są poprawne. Punkty końcowe mykobakterii mogą być trudne do interpretacji. Dokument CLSI M24-A (1) zapewnia wytyczne dotyczące odczytów i ilustracje różnorodnych wzorców wzrostu. Studzienki ujemne mogą wykazywać niewielkie wytrącanie związane z inokulum. Należy przeprowadzić szkolenia w zakresie odczytów szczepów kontrolnych o znanych wartościach MIC. Wzrost może wahać się od kilku kolonii bez zmętnienia do silnego wzrostu, w porównaniu ze wzrostem obserwowanym w kontroli dodatniej. Wartością MIC jest najniższe stężenie powodujące całkowite zahamowanie wzrostu, z wyjątkiem sulfonamidów, dla których wartość MIC odczytuje się jako najniższe stężenie hamujące wzrost w 80% w porównaniu z kontrolą dodatnią. Należy zwrócić uwagę na następujące kwestie: a. Kontaminacja Kontaminacja może spowodować wzrost w danej studzience, podczas gdy w sąsiednich studzienkach wzrostu nie będzie. Skażenie pojedynczej studzienki można zignorować, natomiast w przypadku podejrzenia skażenia wielu studzienek badanie powinno być powtórzone. b. Pominięcia Czasami można zaobserwować „pominięcie” (skip) — występuje ono jako brak wzrostu w danej studzience, podczas gdy sąsiednie studzienki wykazują wzrost. Istnieje wiele wyjaśnień tego zjawiska włącznie z kontaminacją, mutacjami, sfałdowanym uszczelnieniem oraz pomyleniem dawek. Pojedyncze pominięcie można zignorować. Jednakże, aby zapewnić skuteczność terapii antybiotykiem / chemioterapeutykiem NIGDY nie wolno przyjmować pominięcia jako wartości MIC. Zawsze należy odczytywać najniższe stężenie w studzience powyżej której w sposób ciągły nie ma wzrostu. c. Kultury mieszane Poza sytuacją opisaną w punkcie (a) powyżej, jeśli dwa punkty końcowe mają postać wyróżniającego się miejsca — „guzika” komórek, za którym znajduje się kilka studzienek bez takiego „guzika” (lub widoczne są mniejsze guziki), to może świadczyć o mieszanej populacji bakteryjnej. Czystość powinna być sprawdzana za pomocą wzrostu subkultur na odpowiednim agarze. Wyniki nie są prawidłowe, jeśli wykryto kulturę mieszaną.

WSKAZÓWKI DOTYCZĄCE INTERPRETACJI Należy odwołać się do wytycznych interpretacji MIC zapewnionych przez CLSI (1), EUCAST lub lokalną, narodową grupę referencyjną.

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WSKAZANIA

Środek przeciwdrobnoustrojowy

RGM NOC. SGM 1 SGM

2 MAC

Amikacyna X X XX X

Amoksycylina/ kwas klawulanowy

XX X

Kapreomycyna

Cefepim XX

Cefoksytyna X

Cefotaksym XX

Ceftriakson X

Ciprofloksacyna X X XX X

Klarytromycyna7

X X XX3 X X

Klofazymina4

X X X

Doksycyklina X XX

Etambutol XX X

Etionamid

Gentamycyna XX

Imipenem X X

Isoniazyd5

XX XX

Kanamycyna

Lewofloksacyna X

Linezolid X X XX X

Meropenem XX XX

Minocyklina X X XX X

Moksifloksacyna X X XX X

Ofloksacyna6

Ryfabutyna XX X

Rifampin X X

Streptomycyna XX XX

Sulfametoksazol X X XX XX

Tygecyklina X

Tobramycyna X X

Trimetoprim/ Sulfametoksazol

X X XX X

Klucz RGM szybko rosnące mykobakterie NOC Nocardia spp. SGM wolno rosnące mykobakterie MAC Kompleks M.avium

X: Pierwsza linia XX: Druga linia

1 Informacja dotycząca M.kansasii 2 Wolno rosnące inne niż MAC lub M.kansasii 3 Klarytromycyna jest jedynym środkiem antybakteryjnym podawanym dla kompleksu M.avium. Z tego względu jest to lek pierwszej linii dla tego organizmu 4 Uzyskanie klofazyminy w USA wymaga indywidualnego wskazania dla każdego pacjenta (IND). Metody badania wrażliwości i progi wrażliwości nie zostały ustalone ani wystandardyzowane przez CLSI. 5 Problematyczne do badania NTM; nie ustalono jeszcze progów wrażliwości dla NTM. 6 Może nie być dostępny w USA.

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7 CLSI rekomenduje inkubację szybko rosnących, bezpigmentowych Mycobacteria przez 14 dni, by zapewnić wykrycie indukowanej oporności na makrolidy, pod warunkiem że izolat nie wykazywał oporności już przy wczesniejszym odczycie. KONTROLA JAKOŚCI Częstotliwość testów kontroli jakości powinna być zgodna z obowiązującymi lokalnie wytycznymi. Inokula należy hodować na odpowiednim podłożu, aby sprawdzić czystość i/lub skład morfologiczny kolonii a. Wyniki nie są prawidłowe, jeśli wykryto kulturę mieszaną. Wszystkie płytki Sensititre® zawierają studzienki do kontroli dodatniej. Badania nie są poprawne, jeśli brak wyraźnego wzrostu we wszystkich studzienkach kontroli dodatniej. Na wartość MIC mają wpływ takie czynniki jak: stan organizmu, gęstość inokulum, temperatura i pożywka. W praktyce, powtarzane oznaczenia MIC przyjmują rozkład normalny z większością wyników leżących w odległości jednego rzędu rozcieńczenia od wartości modalnej. Procedurę testową można uznać za satysfakcjonującą, jeśli wartości MIC organizmów kontrolnych mieszczą się w tym zakresie. Jeśli wyniki kontroli jakości znajdują się poza określonym zakresem, wyniki badań nie powinny być podawane. Tabela 1 przedstawia wstępne zakresy kontroli jakości uzyskane z zastosowaniem szczepów mykobakterii. Do czasu, gdy nie będą dostępne inne dane, S.aureus ATCC 29213 oraz inne nie będące mykobakteriami szczepy kontrolne oraz odpowiednie dla nich zakresy podane w dokumencie CLSI M100 (2) można wykorzystywać w ramach panelu kontroli jakości (Tabela 2). Do szczepów kontrolnych CLSI M100 należy zastosować tę samą metodę inokulacji, jak dla szybko rosnących mykobakterii, z tym wyjątkiem, że należy dodać 50 µl inokulum do pożywki Sensititre® Mueller Hinton z TES. Nie należy używać pożywki z dodatkiem OADC. panele należy odczytywać po 18 do 24 godzinach inkubacji w temperaturze 35°C. Szczep kontrolny M. avium 700898 należy inkubować w temperaturze 350C w cieplarce bez CO2 i odczytywać po upływie 7 dni. Jeśli obecny jest dobry wzrost w kontroli dodatniej, odczytywać wyniki. W przeciwnym razie, inkubować ponownie przez okres do 10 dni. Dokument CLSI M24-A (1) zapewnia wytyczne dotyczące odczytów i ilustracje różnorodnych wzorców wzrostu. a Obserwowano zmienność morfologiczną M. avium 700898. Zidentyfikowano do trzech typów kolonii (1. gładka kopuła, 2. nieprzezroczysta kopuła z przezroczystą, nierówną krawędzią, 3. płaska i przezroczysta z nierówną krawędzią). Wartość MIC może ulegać wpływowi ze strony typu kolonii użytego do przygotowania inokulum. Wartości MIC izoniazydu, moksifloksacyny i rifampiny dla hodowli M. avium 700898 mogą być zmienne.

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Tabela 1: Wstępne zakresy kontroli jakości dla szczepów kontrolnych mykobakterii1 i S.aureus ATCC 29213 Środek antybakteryjny S.aureus

ATCC 29213 M.peregrinum ATCC 700686

M.smegmatis ATCC 19420

M.avium ATCC 700898

Amikacyna ≤1 – 4* 0.12 - 0.5 2-16

Amoksycylina/klawulanian 2:1

0.12/0.06- 0.5/0.25

Kapreomycyna - 1.25 – 10 1.25 – 5 5 – 40

Cefotaksym 1-4

Cefepim 1-4

Cefoksytyna 1-4* 4-32*

Ceftriakson 1-8

Ciprofloksacyna 0.12-0.5* ≤ 0.12 – 0.5* 0.25-1 ** 2-163

Klarytromycyna 0.12-0.5* ≤ 0.06 – 0.5* 0.25-43

Klofazymina - 0.25 – 1 0.12 - 0.5 –

Doksycyklina 0.12-0.5* 0.12 – 0.5* ≥23

Etambutol - 2-16 2-16

Etionamid - >20 20-80****

0,6 – 5 (7 dni inkubacji)

1,25 – 10 (10-11 dni inkubacji)

Gatifloksacyna 0.03-0.12 ≤ 0.12** ≤ 0.12**

Imipenem 0.015-0.06* 2 – 16*

Izoniazyd - 1-4 ≥13

Kanamycyna 1-4 1.25 – 10 ≤ 0.06 1.25 – 10

Lewofloksacyna 0.06-0.5 0.12 – 0.5*** 0.12 – 0.5***

Linezolid 1-4* 1-8* 8-323

Meropenem 0.03-0.12* 2-16*

Minocyklina 0.06-0.54

0.12-0.5*

Moksifloksacyna 0.015-0.12 ≤ 0.06 – 0.25*

0.25 – 43

Ofloksacyna 0.12-1 ≤ 0.25 – 0.5 0.25 – 1

Ryfabutyna (Ansamycyna)

- 1-8 1 – 4 ≤0.25-13

Rifampicyna

0.004-0.015 8-64 >16 ≥13

Streptomycyna - 16 – 64 0.5 – 2 4-32

Sulfametoksazol 32-128*2

≤ 1 – 4*

Tetracyklina 0.12-1

Tygecyklina 0.03-0.25

Tobramycyna 0.12-1* 2-8*

Trimetoprim/sulfametoksazol

≤ 0.5/9.5* ≤ 0.25/4.8–2/38* 0.25/4.8-2/38

Uwagi 1 Zakres kontroli jakości CLSI M100-A (2)

2 Zakres wartości MIC podany dla sulfizoksazolu wobec S.aureus 3 Zakresy oparte na wewnętrznych testach Sensititre®; Na wartość MIC M. avium 700898 może wpływać typ morfologiczny kolonii.

* Zakres kontroli jakości CLSI M24-A (1) ** Zakres oparty na danych z pozycji literaturowej 3 *** Zakres oparty na danych z pozycji literaturowej 4

**** Zależny od czasu inkubacji. Zakres oparty wyłącznie na 72-godzinnej inkubacji.

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Tabela 2: Dodatkowe zakresy kontroli jakości1

Środek antybakteryjny E.faecalis ATCC 29212

E.coli ATCC 25922

P.aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

Amikacyna 0.5-4 1-4

Amoksycylina/klawulanian 2:1

0.25/0.12-1/0.5

2/1-8/4 4/2-16/8

Cefotaksym 0.03-0.12 8-32

Cefepim 0.015-0.12 1-8

Cefoksytyna 2-8

Ceftriakson 0.03-0.12 8-64

Ciprofloksacyna 0.25-2 0.004-0.015 0.25-1

Doksycyklina 2-8 0.5-2 4-322

Gatifloksacyna 0.12-1 0.008-0.03 0.5-2

Imipenem 0.5-2 0.06-0.25 1-4

Kanamycyna 16-64 1-4

Lewofloksacyna 0.25-2 0.008-0.06 0.5-4

Linezolid 1-4

Meropenem 2-8 0.008-0.06 0.25-1

Minocyklina 1-4 0.25-1

Moksifloksacyna 0.06-0.05 0.008-0.06 1-8

Ofloksacyna 1-4 0.015-0.12 1-8

Ryfabutyna (Ansamycyna)

4-162

Rifampicyna 0.5-4 4-16 16-64

Streptomycyna 4-162

Tetracyklina 8-32 0.5-2 8-32

Tygecyklina 0.03-0.12 0.03-0.25

Tobramycyna 8-32 0.25-1 0.25-1

Trimetoprim/sulfametoksazol

≤ 0.5/9.5 ≤ 0.5/9.5 8/152-32/608

1 Zakres kontroli jakości CLSI M100-A (2), chyba że podano inaczej 2 Zakres oparty na wewnętrznych badaniach Sensititre® W przypadku niemożności wyjaśnienia rozbieżności podczas kontroli jakości należy kontaktować się z dystrybutorem systemu Sensititre® lub firmą TREK Diagnostic Systems. SKUTECZNOŚĆ Panele opracowano tak, aby zapewniały skuteczność porównywalną z referencyjnymi procedurami mikro-pożywkowymi podanymi przez CLSI (1). Skuteczność badano w sposób niezależny (pozycje literaturowe 5-7) Dalsze informacje można uzyskać kontaktując się z firmą TREK Diagnostic Systems lub lokalnym dystrybutorem. OGRANICZENIA 1. Wyników dla imipenemu w odniesieniu do M.chelonae i M.abscessus nie należy podawać 2. Tobramycyna jest aminoglikozydem z wyboru w odniesieniu do M. chelonae i należy podawać wyniki dla niej wyłącznie w odniesieniu do tego organizmu (1)

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ZAŁĄCZNIK 1: Procedura zliczania kolonii 1. Natychmiast po inokulacji płytki za pomocą ezy 1µl pobrać próbkę ze studzienki kontroli dodatniej, a następnie inokulować odpowiedni agar. 2. Za pomocą innej ezy (1 µl) pobrać próbkę z tej samej studzienki wzrostu i zmieszać z 50 µl jałowej, dejonizowanej wody. W celu uzyskania policzalnych kolonii inokulować płytkę agaru 1 µl tego rozcieńczenia. 3. Inkubować obie płytki w temperaturze 30 lub 35 0C (zależnie od typu organizmu) przez dobę. 4. Odczytać zgodnie z poniższymi danymi:

Liczba kolonii na płytce

Liczebność kolonii Płytka 0,001 0,001 z rozcieńczenia 1/50 <5 x 10 4 = <50 0 5 x 10 4 –1X105 = 50 – 100 0 –2 1 x10 5 – 5 x 10 5 = 100 – 500 <10 > 5 x 10 5 = >500 >10 LITERATURA 1. CLSI M24-A. Susceptibility Testing of Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard- Second Edition (2003). The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2.CLSI M100 (M7). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. .The Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA 3.Brown-Elliott, B; Wallace, R; Crist, C; Mann, L; and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Galtifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 3283-3285 4.Wallace. R; Brown-Elliott, B; Crist, C; Mann, L;and Wilson, R. (2002). Comparison of In Vitro Activities of Gatifloxacin and Ciprofloxacin against Four Taxa of Rapidly Growing Mycobacteria. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy Abstract E-541 5.Woods. G; et.al. (2003). Multisite Reproducibility of Results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium avium Complex. Journal of Clinical Microbiology 41: 627-631 6.Woods, G; et.al (1999). Multisite Reproducibility of results Obtained by Two Broth Dilution Methods for Susceptibility Testing of Mycobacterium abscessus, M. chelonae and Mycobacterium fortuitum. Journal of Clinical Microbiology 37: 1676-1682 7.Brown, B; Wallace, R; and Onyi, G. (1996). Activities of the Glycylcyclines N,N-Dimethylglycylamido-Minocycline and N,N-Dimethylglycylamido-6-Demethyl-6-Deoxytetracycline against Nocardia spp. And Tetracycline- Resistant Isolates of Rapidly Growing Mycobacteria. Antimicrobialial Agents and Chemotherapy 40: 874-878 8. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd Edition. 2004. Editor H.D. Isenberg. ASM Press.

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Temperature limitation Zulässiger Temperaturbereich Límite de temperatura Limiti di temperatura Limites de température Οριο θερμοκρασίας Temperatura reba Teplota Limit Ograniczenie Temperatur Temperatură limitation Limitação de temperatura

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Use By Verwendbar bis Fecha de caducidad Utilizzare entro Date de péremption Ημερομηνία λήξης Baigtis Data Užití Za Użyć Do Folos By Uso perto

YYYYMMDD/YYYYMM (MM=end of month) JJJJMMTT/JJJJmm (MM=Monatsende) aaaammdd/aaaamm (mm=fin del mes) AAAAMMGG/AAAAMM (MM=fine mese) AAAAMMJJ/AAAAMM (MM=fin de mois) ΕΕΕΕ-ΜΜ-ΗΗ / ΕΕΕΕ-ΜΜ (ΜΜ = τέλος του μήνα) KKKKMMDD RRRRMMDD RRRR/MM/DD AAAA/LL/ZZ YYYYMMDD/YYYYMM (MM= fim do mês)

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In Vitro Diagnostic Medical Device In Vitro Diagnostikum Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositif médical de diagnostic in vitro In vitro διαγνωστικό ιατρικό βοήθημα In vitro diagnostikai In vitro diagnostic Urządzenie Diagnostyczne in vitro Pentru diagnosticare in vitro In Vitro Dispositivo Médico Diagnóstico

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Contains sufficient for <n> tests Ausreichend für <n> Ansätze Contenido suficiente para <n> ensayos Contenuto sufficiente per <n> saggi Contenu suffisant pour <n> tests Περίεχει επαρκή ποσατητα για <n> εξετάσεις Skaičius bandymas <n> Obsahuje vhodnỳ <n> testy Wystarczający dla <n> próbek contact sufficient pentru <n> tests Contem suficiente para <n> testes

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Plates with fluorescence substrates in wells Platten mit Fluoreszenzsubstraten in den Mulden Placa con substratos fluorescentes en los pocillos Pannelli con substrati fluorescenti nei pozzetti Plaquette avec substrats fluorescents dans les cuves Πλάκα με υποστρώματα φθορισμού σε υποδοχές substrato plokštelės Fluorescenčy substráty Płytki z substratami fluorescencyjnymi w studzienkach Fluorescenţă Substratul Placas com as carcaças da fluorescência nos poços

SYMBOLS_V2.0

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