physique et rhéologie des agrégats cellulaires...

Année 2009

THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON

Délivrée par

L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

ECOLE DOCTORALE

Physique et Astrophysique

DIPLOME DE DOCTORAT

(arrêté du 7 août 2006)

soutenue publiquement le

par

M. MGHARBEL Abbas

Physique et rhéologie des agrégats cellulaires

embryonnaires

Directeurs de thèse : Jean Paul Rieu

Hélène Delanoë-Ayari

JURY : M. Gillet Germain

M. Joanny Jean-François

M. Lenne Pierre-François M.Verdier Claude

Physique des agrégats cellulaires embryonnaires

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CHAPITRE 1 10

Physique de la cellule au tissu 10 I.1. La cellule 11

I.1.1. Description générale de la cellule. 11 I.1.2. Description du cytosquelette. 13 I.1.3. Généralités sur l’adhésion cellulaire 16 I.1.4. Physique du cytosquelette et de l’adhésion. 20

I.2. Les tissus 22 I.2.1. Les tissus in vivo : l’embryogenèse 23 I.2.2. Les tissus in vitro : l’affinité cellulaire 27 I.2.3. L’hypothèse d’adhésion différentielle (HAD). 30 I.2.4 Rhéologie 42

CHAPITRE 2 47

Materials and Methods 47 II.1.Strategy, Cell lines and Aggregate preparation method 48

II.1.1. CHOVE / CHOVEtr cells 48 II.1.2. Mouse embryonic carcinoma F9 cell 49 II.1.3. Nocodazole Effect 51 II.1.4. Cell aggregates formation protocol 52 II.1.5. Storage 53

II.2. Dissected embryonic cells 54 II.2.1. Embryonic zebrafish cells 54 II.2.2. Embryonic chicken cell retina 55

II.3. Imaging cells through aggregates 55 II.3.1. Sections through fixed aggregates 55 II.3.2. Two-photon confocal microscopy 3D imaging 56

II.4. Segregation assays 59 II.4.1. Cell-sorting assay 59 II.4.2. Tissue-envelopment assay 59

II.5. Fusion and rounding up assay 59 II.5.1. Fusion of two symmetric cell aggregates 60 II.5.2. Rounding up of a free elliptical aggregate 60

II.6. Liquid interfacial tension and apparent tissue surface tension 61 II.6.1. Description of the final system: 62 II.6.2. Resolution 64

CHAPITRE 3 65

Measuring accurately tissue surface tension 65 III. 1. Introduction: TST measurements, for which purpose? 66 III. 2. The different methods to measure TST 67

III. 2.1. A few lines on capillarity 67 III. 2.2. The CA (Circular Arc) method 69 III. 2.3. The ELP (Exact Laplace Profile) method 70 III. 2.4. The LPF (Local Polynomial Fit) method 71


3

III.3. Critical comparison of existing methods using experimental data and numerical tests 72

III. 3.1. Experiments with pure liquid droplets or bubbles 72 III. 3.2. Experiments with embryonic cell aggregates 74 III. 3.3. Numerical tests 76

III. 4. Discussion 77 III. 4.1. Examination of literature data 78 III. 4.2. Recommendations for correct measurements 79

CHAPITRE 4 80

Physical properties of F9 tissues Role of adhesion and Cytoskeleton 80 IV.1. Surface tensions driven phenomena 81

IV.1.1. Aggregate rounding up 81 IV.1.2. Aggregate fusion 82 IV.1.3. Behaviours of F9/ F9(α-/-) pairs (spreading, sorting) 85

IV.2. Measurements of tissue surface tension 87 IV.2.1. Surface tension of F9 cell aggregates 87 IV.2.2. Surface tension of F9(α-/-) cell aggregates 88 IV.2.3. Effect of nocodazole on tissue surface tensions 89

IV.3. Discussion 91 IV.3.1. Surface tension depends on cytoskeleton contractility: DAH is contradicted 91 IV.3.2. Tissue viscosity does not depend directly on cell cohesion: an adhesion-protrusion competition hypothesis 92

CHAPITRE 5 95

Cell-cell rearrangements within aggregates: Experiments & Modelling 95 V.1. Elastic and/or viscous behaviours: previews studies 96 V.2. Experimental evidence of cell rearrangements 101

V.2.1. Direct visualization of stress induced cell rearrangements 101 V.2.2. Shape and stress relaxation experiments 103

V.3. Cell rearrangement: fluctuations and stress 106 V.3.1. Global Description of the Aggregate. 106 V.3.2. Local Description at the Cell Level. 106 V.3.3. Mechanical Behavior of the Aggregate. 107 V.3.4. Two Regimes 108 V.3.5. Compressions: Predictions. 109 V.3.6. Decompressions: Predictions. 110

V.4. Discussion 111 V.4.1. Energy Barriers and Non-released Elasticity. 111 V.4.2. Time Scales. 111 V.4.3. Validity of the plasticity measurement 112 V.4.4. Link between compression-decompression experiment and fusion? 113 V.4.5. Effect on Measured Surface Tension 114

Conclusions et Perspectives 115


4


5

Préface

Le développement embryonnaire, c’est à dire la croissance d’un organisme

multicellulaire complexe à partir d’un œuf fertilisé, est un processus qui a fasciné les

hommes et a toujours constitué un domaine actif de recherche. Il semble que ce sont

les anciens grecs qui aient lancé le premier débat autour de ce thème [1]. Aristote,

dès le quatrième siècle avant J.C., a proposé que le développement d’un embryon

comporte plusieurs stades, durant lesquels les différentes parties d’un embryon se

développent et prennent leurs places (Epigenèse), au contraire des idées du courant

préformationniste qui voulaient que l’embryon soit préformé dans l’œuf ou dans le

spermatozoïde (Figure A ci dessous) [1]. Ce n’est qu’après l’émergence de la théorie

cellulaire au 19ème siècle que le débat fut tranché en faveur de l’Epigenèse :

L’embryon n’était pas préformé ; il était développé à partir d’un ovule fertilisé (Figure

B).

Figure : Le développement embryonnaire (A) tel qu’il était imaginé par les préformationnistes [Essai de dioptrique (Paris, 1694, page 230), et téléchargé depuis wikipedia], et (B) tel qu’il était décrit par les théories cellulaires du 19ème siècle. Cette image montre un ovule fécondé (cellule initiale) à gauche ainsi que la première division cellulaire à l’intérieur de l’ovule à droite.

Les questions en biologie de développement ne se sont pas arrêtées suite à

cette découverte au 19ème siècle. Au contraire, elles se sont multipliées grâce au


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progrès des connaissances scientifiques et des technologies innovantes permettant

maintenant de répondre aux nouvelles interrogations sur la morphogénèse, la

migration, la différentiation, la croissance et la mort cellulaire. Ces derniers mots clés

de la biologie constituent des thèmes de recherches fascinants, à notre époque, pour

les biologistes aussi bien que pour les physiciens.

La recherche menée sur ces thèmes a conduit, ces dernières années, au

développement d’une interface entre la biologie et les autres sciences dures :

physique, chimie, mécanique, mathématiques. L’interface physique-biologie qui met

les lois et les techniques de mesure Physique au profit des Biologistes et vice-versa,

permet de mieux investir une question d'intérêt biologique par de nouvelles

approches expérimentales. Pendant que la biologie du développement cherche à

identifier le ou les acteur(s) impliqué(s) dans l’évolution des tissus et leurs mise en

place sous forme d’organes, à investir comment le codage de l’ADN intervient dans

ces processus afin d’expliquer les mécanismes du développement, la physique

présente une vision différente de ces processus tout en complétant les observations

qualitatives par des mesures quantitatives physiquement pertinentes afin de tracer

les chemins du développement cellulaire et tissulaire par des lois universelles.

Comment les cellules, bien qu’issues d’une seule et même cellule initiale,

peuvent élaborer des structures complexes variées et hyper spécialisées tels que les

muscles, les yeux, la peau ou le cerveau ?

Cette question reste en tête de la liste des interrogations qu’on retrouve dans la

plupart des ouvrages de biophysique. Après l’identification d’un comportement

propre aux cellules ou aux tissus, les biologistes s’intéressent à déterminer les

composants clés (protéines d’adhésion cellule/cellule et cellule/ECM1, cytosquelette,

etc...) et à trouver leur mécanisme d’interaction permettant d’influer sur le système

en question voir sur l’organisme entier. Les physiciens s’intéressent à ces mêmes

composants et leurs interactions en essayant de les quantifier et de leur attribuer

une observable physique tels que (force, énergie, tension de surface, viscosité,

plasticité,…) afin d’arriver à modéliser les comportements par des lois physiques. Par

la suite, le changement d’une telle observable devrait refléter soit une évolution des

composants sous-jacents, soit un changement de mode d’interaction.

Cette caractérisation physique des comportements cellulaires et tissulaires

nous donne des informations très importantes pour la compréhension des processus

d’organisation des tissus dans les domaines de l’embryologie, de la cancérologie, et

de l’ingénierie tissulaire.

1 Extra cellular Matrix


7

Par exemple, l’embryogenèse fait intervenir des processus morphogénétiques

qu’on peut résumer ici par la prolifération et les mouvements des cellules

embryonnaires, contrôlées par l’expression des gènes du développement, afin de

déterminer la forme de l’embryon. Il a été montré que ces mouvements

morphogénétiques sont intimement liés aux forces mécaniques ressenties par les

cellules impliquées dans la formation des tissues [2]. Des études récentes montrent

que les forces mécaniques dans l’embryon en cours de morphogenèse peuvent

moduler l’expression de certains gènes du développement mécaniquement sensibles

[2]. Le génome est capable, grâce à ces rétroactions mécaniques, de détecter si la

forme qu'il est en charge de développer est atteinte et peut donc déclencher les

gènes suivants de la cascade qui orchestre la formation du tissu [2].

D’autre part, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la

formation des organes du vivant, accompagnée de technologies de

micromanipulations, ont permis des avancées significatives dans le domaine de

l’ingénierie tissulaire. Des techniques innovantes cherchent à reproduire en

laboratoire les processus morphogénétiques afin de fabriquer des organes de

remplacement pour la médecine régénérative [4]. Ce but deviendra peut être un jour

accessible maintenant qu’il est possible d’obtenir de structures mimant celles

d’organes à partir de cellules embryonnaires dissociés-réaggrégées et en particulier

grâce à la physique de l’auto-assemblage des cellules et agrégats biologiques. Ainsi

les propriétés liquides de certains tissus ont pu être mises à profit dans la maîtrise de

l’auto-assemblage des structures tridimensionnelles cellulaires vivantes [5,6, 7,8].

Ce travail de thèse s’inscrit en amont de ces applications. L’objectif de ce travail

a été, en premier temps, de développer des outils de mesure physique pour arriver à

quantifier la dynamique cellulaire à l’intérieur des tissus, et pour essayer d’identifier

les lois physiques régissant les comportements de la matière cellulaire à différentes

échelles du temps. Ensuite nous avons cherché à identifier quels étaient les

composants biologiques qui pourraient être à l’origine de cette dynamique et leur

influence sur les comportements collectifs des cellules.

Ce manuscrit se décompose en cinq chapitres :

Le premier présente un résumé sur les comportements liquides de certains

tissus biologiques modèles, les acteurs à l’échelle subcellulaire responsables de

cette dynamique, ainsi que leur rôle dans le fonctionnement d’une cellule et d’un

tissu. De plus, une brève présentation des différentes théories ou hypothèses

mettant en évidence les caractères liquides de la matière cellulaire et ses propriétés

viscoélastiques, situera le contexte biophysique et biomécanique dans lequel s’inscrit

notre étude. Les notions de tension de surface et de viscosité y sont rappelées.


8

Dans le deuxième chapitre nous présentons les dispositifs et méthodes

expérimentaux que nous avons mis en œuvre pour cette étude. Nous détaillons

aussi les protocoles biologiques utilisés sur les cellules, ainsi que la méthode de

fabrication de nos tissus modèles : les agrégats cellulaires.

Le troisième chapitre est consacré entièrement à la mesure de la tension de

surface avec le tensiomètre des tissus développé durant la thèse. Nous insisterons

sur les lois de la capillarité, l’analyse du profil des agrégats comprimés et le rôle des

paramètres géométriques dans la mesure, en particulier l’angle de contact des

agrégats avec les plaques de compression.

Dans le quatrième chapitre, nous exposons les résultats de mesure de la

viscosité et de la tension de surface tissulaire que nous avons obtenus sur différents

types cellulaires testés. L’influence de la liaison entre l’actine et les cadhérines (via

les caténines) sur ces grandeurs physiques était l’une des questions centrales de

cette thèse. Nos résultats montrent que cette liaison influence très significativement

la tension de surface tissulaire remettant en cause l’un des postulats de l’hypothèse

d’adhésion différentielle de M. S. Steinberg, mais par contre elle ne semble pas

affecter outre mesure la viscosité tissulaire.

Enfin, dans le cinquième chapitre, nous présentons les résultats des relaxations

de forme des agrégats cellulaires. Ces mesures ajoutent une nouvelle dimension (le

temps) à la discussion sur la nature complexe de cette matière cellulaire. Nous

avons couplé ces résultats avec des observations de la forme et des réarrangements

des cellules, prises au « microscope deux photons » à l’intérieur d’un agrégat

comprimé. Cette étude a permis de valider un modèle visco-élasto-plastique basé

sur des ingrédients microscopiques bien identifiés et réalisé en collaboration avec P.

Marmottant (LSP Grenoble). Ce modèle en retour nous a lancé de multiples pistes

de travail pour des expériences futures qui sont détaillées dans les conclusions et

perspectives.

Quatre annexes viennent compléter ce manuscrit.


9

[1] L. Wolpert, R. Beddington, T. Jessell, P. Lawrence, E. Meyerowitz, and J. Smith. Principles of Development. Oxford University Press, 2002.

[2] Nicolas Desprat, Willy Supatto, Philippe-Alexandre Pouille, Emmanuel Beaurepaire, and Emmanuel Farge. Tissue Deformation Modulates Twist Expression to Determine Anterior Midgut Differentiation in Drosophila Embryos. Developmental Cell, 15:470 (2008).

[3] Joanne Whitehead, Danijela Vignjevic, Claus Fütterer, Emmanuel Beaurepaire, Sylvie Robine, Emmanuel Farge. Mechanical factors activate b-catenin-dependent oncogene expression in APC1638N/+mouse colon. Human Science Frontier Journal, 1er octobre 2008

[4] Cyrille norotte, From developmental biology to tissue-engineering: printing blood vessels. Thèse (2009)

[5] Jakab. K, Neagu. A, Mironov. V, Markwald. RR, and Forgacs. G. Engineering biological structures of prescribed shape using selfassembling multicellular systems. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 2864–2869 (2004)

[6] Jakab. K, Damon. B, Marga. F, Doaga. O, Mironov. V, Kosztin. I, Markwald. R, and Forgacs. G. Relating cell and tissue mechanics: implications and applications. Dev. Dyn., 237, 2438–2449 (2008a).

[7] Jakab. K, Norotte. C, Damon. B, Marga. F, Neagu. A, Besch-Williford. CL, Kachurin. A, Church. KH, Park. H, Mironov. V, Markwald. RR, Vunjak-Novakovic. G, and Forgacs. G. Tissue engineering by self-assembly of cells printed into topologically defined structures. Tissue Eng., 14, 413–421 (2008b).

[8] Marga. F, Neagu. A, Kosztin. I, and Forgacs. G. Developmental biology and tissue engineering. Birth Defects Res. C 81,320–328 (2007).


10

Chapitre 1 Physique de la cellule au tissu

Dans ce premier chapitre, nous présenterons d’abord un aperçu rapide de

l’architecture et des fonctions biologiques de la matière vivante depuis l’échelle

cellulaire jusqu’à l’échelle des tissus. Nous espérons qu’il pourra constituer une

introduction utile au lecteur qui n’est pas du domaine de la biologie mais aussi aux

biologistes qui pourront y trouver une revue non exhaustive des travaux de

biophysiciens travaillant dans les domaines de la biomécanique cellulaire, de

l’adhésion, de la motilité cellulaire et ou de la biologie du développement. Comme

cette thèse s’intéresse tout particulièrement aux mouvements cellulaires à l’intérieur

de tissus embryonnaires modèles (agrégats cellulaires), lors de notre description de

la cellule, nous insisterons tout particulièrement sur la description du cytosquelette,

de l’adhésion cellulaire, de leur rôle respectif dans les mouvements et de leur

couplage éventuel. En passant à l’échelle tissulaire, nous essayerons de présenter

notamment à travers l’exemple du poisson zèbre l’enjeu et les apports éventuels de

la physique à l’embryogénèse. Nous suivrons la chronologie depuis le début du 20ème

siècle des travaux sur le tri et les réorganisations cellulaires en systèmes in vitro

ayant conduit à l’utilisation des agrégats cellulaires et aux prédictions de l’hypothèse

d’adhésion différentielle de Malcom Steinberg. Enfin, nous présenterons une brève

introduction générale sur la rhéologie.


11

I.1. La cellule

I.1.1. Description générale de la cellule.

La cellule constitue, à la manière de l’atome pour la matière, la brique

élémentaire de la vie d’un organisme, il s’agit de la plus petite entité de matière

vivante qui puisse vivre, et elle contient toutes les informations nécessaires à sa

reproduction. Tout d’abord, il faut faire la distinction entre les cellules procaryotes,

sans noyau (algues, bactéries, etc.), et les cellules eucaryotes, qui disposent d’un

véritable noyau (Fig.1.1) qui contient l’information génétique de la cellule, codée

dans les filaments d’ADN, présents sous forme de chromosomes ou de chromatine.

C’est ce dernier type de cellules qui nous intéresse dans notre étude.

Fig. 1.1: Schéma de cellule animale [D’après http://www.astrosurf.com/luxorion/Bio/cellule-legende.png ]

L’intérieur de la cellule est extrêmement complexe et remarquablement

organisé. Il est difficile d’imaginer et de modéliser le comportement global de

l’ensemble des organites intracellulaires (Réticulum endoplasmique, mitochondrie,

appareil de golgi, etc.,Fig. 1.1). L’organisation spatiale ainsi que le mouvement de

ces organites sont assurés grâce à un réseau complexe et dense de bio-polymères,


12

le cytosquelette. Ce réseau, qui accomplit des fonctions essentielles tout au long de

la vie d’une cellule, joue un rôle capital dans la régulation du trafic intracellulaire.

La cellule est active, elle produit, stocke, et consomme de l’énergie. L’énergie

produite par les mitochondries sera accumulée sous forme de liaisons chimiques

fortes. La monnaie courante d’échange du travail cellulaire est l’ATP (adénosine

triphosphate). Elle est consommée dans les réactions enzymatiques ayant lieu à tous

les niveaux de la vie cellulaire. Ainsi la réaction de base ayant lieu pour fournir de

l’énergie nécessaire à un processus biochimique est :

ATP → ADP + P (1.1)

avec libération de 30,5 kJ/mol. Bien qu’il existe d’autres moyens de transférer

de l’énergie (GTP : guanosine triphosphate, …), l’hydrolyse de l’ATP reste la

carburant principal de la cellule. L’inhibition de la formation d’ATP apparaît comme

un outil standard pour examiner le rôle des processus actifs à l’intérieur de la cellule.

Fig. 1.2: Schéma de membrane cellulaire, avec ses composants lipidiques et les protéines

qui y sont enchâssées. La bicouche a une épaisseur de l’ordre de 5 nm. [D’après G. Geibel,

http://sun.menloschool.org].

La cellule est entourée d’une bicouche lipidique : la membrane plasmique (Fig.

1.2. Cette membrane est globalement imperméable, et permet donc de maintenir de

forts gradients de concentration de différents types de molécules entre le liquide

extracellulaire et le liquide intracellulaire, ou cytosol. La concentration intracellulaire

en ions Ca2+ par exemple, est 10−4 fois moins élevée que celle du milieu

extracellulaire. Des protéines sont enchâssées dans la membrane et assurent des

fonctions de reconnaissance de signaux biochimiques, et d’activation d’autres


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molécules en réponse à ces signaux. Certaines d’entre elles, les protéines

transmembranaires, traversent la membrane de part en part. Elles peuvent donc, sur

leur domaine extracellulaire, lier certaines molécules spécifiques, ce qui active en

général leur domaine cytoplasmique pour agir sur des protéines intracellulaires

cibles. Cette « transduction du signal » permet aux cellules de répondre à divers

types de sollicitations de leur environnement.

Les cellules présentent des caractéristiques mécaniques qui semblent

cohérentes avec leur structure aussi bien qu’avec leur rôle à l’intérieur de

l’organisme. Les caractéristiques mécaniques des cellules uniques ont été beaucoup

étudiées [1-8]. Ces études ont mis en évidence l’importance de l’adhésion et du

cytosquelette dans l’établissement des propriétés mécaniques des cellules. Les rôles

de l’adhésion [9-13] et du cytosquelette [14-17] ont été les sujets de nombreuses

études biomécaniques détaillées. Ces deux paramètres interviennent dans la

mécano-transduction intercellulaire (c.f.[18] pour une revue). Nous allons maintenant

nous intéresser plus particulièrement au cytosquelette et à l’adhésion.

I.1.2. Description du cytosquelette.

Les cellules animales ont leur forme fixée par l’analogue d’un squelette qui

parcourt le cytoplasme, le cytosquelette. Ce dernier est une structure

tridimensionnelle complexe issue de l’assemblage de bio-polymères filamenteux

interconnectés. Il est constitué de trois grandes familles de filaments protéiques: les

microtubules, les filaments intermédiaires et les micro-filaments (Fig. 1.3).

Fig. 1.3: À gauche, cellule dont les polymères du cytosquelette sont rendus fluorescents

grâce aux techniques de l’ingénierie moléculaire. Les microtubules entourant le noyau en

bleu sont colorées en vert (marquées au Bodipy) alors que l’actine apparaît en rouge

(marquée à la X-Phalloïdine). [D’après le catalogue Invitrogen - Molecular Probes]. À

droite schéma de la répartition des 3 types de filaments du cytosquelette dans une cellule

épithéliale [19].


14

Les microtubules sont les polymères les plus rigides du cytosquelette. Ils sont

formés à partir des dimères de tubuline qui s’associent sous forme de tube creux.

Ces tubes ont un diamètre de 25 nm. Leur longueur de persistance vaut lp~1 mm et

leur module d’Young E∼1 GPa, grandeurs déterminées dans des expériences in vitro

en observant les fluctuations de courbure des filaments [20].

Le réseau de microtubules est une structure hautement dynamique en

constante réorganisation. D’une part, il est lié au centrosome près du noyau [21;22],

d’autre part il exerce des pressions aux extrémités de la cellule [23;24]. Le réseau

rayonne donc en aster (Fig. 1.3) autour du centrosome, tant que les cellules n’entrent

pas en division tandis qu’il s’organise sous forme de fuseau mitotique lors d’une

division cellulaire, de façon à positionner et séparer les chromosomes.

De nombreuses protéines peuvent se lier aux microtubules (les Microtubule

Associated Proteins ou MAP) ou aux monomères de tubuline, et modifier la stabilité

des filaments [25]. Certaines de ces molécules sont présentes dans les cellules et

sont activées ou non, selon les signaux reçus par la cellule ou selon les phases du

cycle cellulaire. D’autres sont utilisées comme drogues, afin de contrôler l’état du

squelette de microtubules : par exemple, le nocodazole a un effet dépolymérisant,

contrairement au taxol qui stabilise les microtubules.

Ensuite, on trouve les micro-filaments ou F-actine qui sont les filaments les plus

fins : ce sont des doubles hélices de diamètre 5 à 9 nm. On rencontre encore dans

les cellules des monomères d’actine, la G-actine. La longueur de persistance des

micro-filaments vaut environ 10-15µm [26], et leur module d’Young 0,5 GPa, est du

même ordre que celui des microtubules. Cependant, contrairement aux microtubules,

l’actine n’est pas présente dans la cellule sous forme de filaments isolés, mais sous

forme de réseaux (Fig. 1.3). La description d’un tel réseau de filaments enchevêtrés,

réticulés et pouvant même coulisser les uns par rapport aux autres n’est évidemment

pas simple. Des modèles théoriques [27;28] ainsi que des expériences d’assemblage

de gels d’actine in vitro [29-32], visant à comprendre les propriétés mécaniques de

tels gels sont en plein développement.

La dernière grande classe de polymères du cytosquelette, les filaments

intermédiaires, est plus hétérogène. Ils sont formés à partir de molécules allongées

qui s’enroulent d’abord sous forme de dimères, qui eux-mêmes s’assemblent de

façon anti-parallèle en tétramères, et finalement donnent des fibres de 8 à 12 nm de

diamètre. Ces fibres sont donc apolaires, contrairement aux filaments d’actine et aux

microtubules, et on en distingue quatre types principaux : les lamines, les kératines,

la vimentine, et les neurofilaments. Les différents types sont présents à différents


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endroits de la cellule selon le type cellulaire. Par exemple les kératines, de divers

types, sont plus abondantes dans les cellules épithéliales.

Ces fibres sont très résistantes, ce qui leur donne un rôle essentiel dans le

maintien de l’intégrité mécanique des cellules. Les filaments de kératine, eux, sont

densément engagés dans des jonctions entre cellules épithéliales (desmosomes), et

assurent donc la résistance globale du tissu.

Contrairement à un squelette osseux, le cytosquelette est un échafaudage

relativement rigide mais dynamique qui constitue l’un des éléments clefs intervenant

au niveau du remodelage permanent d’une cellule. La dynamique de

polymérisation/dépolymérisation s’effectue à des vitesses de 1 à 10 µm/min [33], elle

est régulée de façon biochimique et mécanique et permet à la cellule de se déformer,

d’adapter sa forme en fonction des forces mécaniques environnementales ou de se

déplacer. Une fonction du cytosquelette qui nous intéressera particulièrement ici est

son aptitude à exercer des forces : le cytosquelette est à la fois le squelette et le

muscle de la cellule.

Comment ces fibres exercent-elles des forces?

En premier lieu, grâce à la polymérisation. Si un filament est attaché à une

extrémité, l’ajout d’un monomère à son autre extrémité se traduit par une force de

poussée pouvant atteindre 10 pN [34].

Fig. 1.4: Cytosquelette d’une cellule fibroblastique (goldfish). (A) cellule migratrice

transfectée avec de l’actine-GFP afin de rendre son cytosquelette fluorescent en vert ; de la

rhodamine qui marque la vinculine et par conséquent, les sites d’adhésion en rouge a été

injectée [35] (B) schéma de la même cellule répertoriant les différents types de forces

développées par le cytosquelette durant la migration d’une cellule adhérente sur un

substrat. Modifié à partir de [36].


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En second lieu, des protéines qui agissent comme des moteurs moléculaires,

les myosines, sont capables de faire coulisser une fibre par rapport à l’autre, comme

dans un muscle. Ce mécanisme permet de développer des forces de l’ordre de 1.5

pN par moteur [34].

L’exemple d’une cellule fibroblastique en migration sur un substrat, (Fig. 1.4) montre

que la polymérisation de l’actine à l’avant de la cellule (dans le lamellipode),

s’accompagne de la formation de faisceaux radials (bundles) de fibres d’actine qui

poussent sur la membrane formant ainsi des pointes (filopodes). De plus, à l’intérieur

de la cellule, les fibres d’acto-myosine contribuent au développement des forces de

rétraction de la partie postérieure.

Le cytosquelette d’actine joue un rôle-clé dans l’adhésion cellulaire. Les

adhésions focales, qui sont des adhésions stables observées lorsque la cellule est

déposée sur un substrat rigide (sites rouges sur la Fig. 1.4), y sont connectées. Par

le biais de moteurs moléculaires, le cytosquelette peut exercer des forces de traction

sur les sites adhésifs, comme schématisé sur la Fig. 1.4. Cette force de traction

semble être assimilable à une contrainte constante, de l’ordre de 5 kPa : plus l’aire

d’adhésion est grande, plus la force totale exercée par la cellule est élevée. Chaque

site adhésif exerce ainsi une force comprise entre 10 et 30 nN sur le substrat [37].

C’est cette capacité à tirer sur le substrat, qui permet aux cellules de sonder les

propriétés mécaniques de leur environnement. En effet, les cellules dont l’activité de

moteurs moléculaires ciblés est inhibée (et qui donc n’exercent plus de forces sur

leurs adhésions) ne sont plus capables de former des adhésions focales [38]. Il ne

reste plus que des adhésions extrêmement transitoires, ce qui proscrit la mise en

marche de la machinerie de la division cellulaire ou de la différentiation.

Il existe d’autres types d’adhésion cellule/substrat ou cellule/cellule qui

permettent au cytosquelette d’accomplir un rôle dynamique et de développer des

forces. La partie suivante offre une présentation non exhaustive de différentes

structures d’adhésion cellulaire.

I.1.3. Généralités sur l’adhésion cellulaire

In vivo, mis à part quelques catégories de cellules pouvant "vivre" en

suspension (cellules circulantes du sang, macrophages), la plupart des cellules sont

adhérentes. Les mécanismes de l’adhésion jouent un rôle crucial pour la cellule. Ce

n’est que lorsqu’elles adhèrent qu’elles peuvent ensuite répliquer leur ADN, se

diviser, ou bien se différencier. Une cellule saine (non cancéreuse) qui se trouve

dans l’impossibilité d’adhérer se donne la mort dans de brefs délais. Ce mécanisme

d’auto-régulation évite que des cellules défaillantes ne se répandent et dégradent le


17

fonctionnement de l’organisme entier. L’adhésion est ainsi une étape-clé dans le

contrôle de la prolifération et de la différenciation.

Nombre de cellules adhèrent à un substrat de filaments protéiques enchevêtrés

(la matrice extracellulaire : extracellular matrix ou ecm), via des protéines

enchâssées dans leur membrane, les intégrines [39]. In vivo, on rencontre cette

adhésion cellule-ecm pour les cellules dans ou au contact du tissu conjonctif. In

vitro, on la rencontre lorsqu’on met des cellules en contact avec un substrat couvert

de filaments protéiques soit déposés par l’expérimentateur soit synthétisés par les

cellules elle mêmes. L’importance de cette adhésion dans la vie d’une cellule vient

du fait qu’elle assure le lien avec le milieu extérieur; adhésion et signalisation étant

étroitement couplées, les cellules sondent leur environnement par le biais de leurs

adhésions et adaptent en réponse leur activité chimique. L’adhésion implique la

formation de liaisons entre des protéines membranaires et leurs récepteurs

extracellulaires. Les protéines membranaires se répartissent en « cluster » (amas), si

bien que l’adhésion se fait par des points discrets, ainsi que la montre la figure Fig.

1.5. Si la formation de ces liaisons transmembranaires nécessite une compatibilité

chimique entre la cellule et son environnement, une compatibilité « mécanique » est

aussi requise : suivant les propriétés mécaniques de l’environnement de la cellule, et

en particulier de sa souplesse ou sa rigidité, des adhésions transitoires ou des

jonctions adhésives se forment avec une architecture protéique particulière, qui

donne lieu à un comportement cellulaire précis. On rencontre aussi ce type

d’adhésion cellule-ecm dans les agrégats de cellules fibroblastiques et dans ce cas,

l’ecm envahit probablement l’espace intercellulaire [40].

Nous n’avons pas travaillé véritablement sur ce type d’adhésion dans le cadre

de cette étude même si il est possible que la cohésion de certains de nos agrégats

(formés à partir de cellules d’Ovaire de Hamster Chinois modifiées génétiquement

(CHO VE voir chap2)) soit au moins en partie causée par leurs intégrines.

Néanmoins, une connaissance des interactions cellule-substrat reste indispensable

ne serait-ce que pour des raisons expérimentales : cela permet d’optimiser la

manipulation des cellules en culture ou en tissus (formation des agrégats), ou

d’éliminer des interactions nuisibles avec les surfaces pendant certaines expériences

(passivation).

Les cellules à l’intérieur des tissus présentent différents types d’adhésion

mutuelle. Via ces liaisons, elles sondent les propriétés mécaniques de leur

environnement cellulaire et adaptent leur activité mécanique et chimique en

conséquence. Les macromolécules qui appartiennent à la famille des cadhérines

assurent en grande partie les liaisons cellule/cellule (voir les principaux types de

contact cellulaire ci-dessous). Ces liaisons d'adhésion dépendent du calcium [41;42]


18

Ad

hé

sio

ns

Ce

llu

le/C

ell

ule

Ce

llu

le/E

CM

ADHESIONS JONCTIONNELLES ADHESIONS NON-JONCTIONNELLES

Jonctions serrées

Ceinture d’adhérence

Desmosome

Jonctions communicantes

Adhésion focal

Cadhérines

IgG-like CAMs

SélectinesIntégrines

Hémi-Desmosome Integral membrane

proteoglycan

Ad

hé

sio

ns

Ce

llu

le/C

ell

ule

Ce

llu

le/E

CM

ADHESIONS JONCTIONNELLES ADHESIONS NON-JONCTIONNELLES

Jonctions serrées

Ceinture d’adhérence

Desmosome

Jonctions communicantes

Adhésion focal

Cadhérines

IgG-like CAMs

SélectinesIntégrines

Hémi-Desmosome Integral membrane

proteoglycan

Fig. 1.5: Schéma de différents types de complexes adhésifs cellule/matrice extracellulaire

ou cellule/cellule. 1. jonctions serrées ("tight junction"), établissant une barrière étanche

entre les cellules du feuillet épithélial et empêchant la présence de molécules entre celles-ci;

2. Ceinture d’adhérence : joint un faisceau d’actine (Vert) d’une cellule à un autre similaire

de la cellule voisine par le biais des cadhérines et assure la cohésion entre cellules

adjacentes; 3. Desmosome : joint les filaments intermédiaires (Bleu) d’une cellule à ceux de

la cellule adjacente via les cadhérines et autres protéines adaptatrices. 4. Jonctions

communicantes (Gap et synapses), permettant le passage de petites molécules-signal entre

deux cellules ; 5. Hémi-desmosome : relie les filaments intermédiaires de la surface basale

de la cellule à la basale laminaire. 6. Adhésion focale : relie les filaments d’actine de la

cellule à la matrice extracellulaire via les intégrines et leurs protéines cytoplasmiques

adaptatrices. 7. Il existe d’autres types de complexes adhésifs qui se trouvent moins

matures chez les cellules de l’embryon ou chez les lymphocytes et qui sont des complexes

non-jonctionnels utilisant les cadhérines, les intégrines et les IgG-like CAMs. D’après [43]

et sont considérées comme étant homophiles (i.e., liaisons entre deux molécules du

même type). Pourtant, Steinberg et col. [44;45] montrent que deux types de cellules

ayant différentes cadhérines peuvent aussi se mélanger à long termes (quatre

Jours). Shi et col. [46] n’ont pas pu voir de différence significative entre les


19

interactions homophiles et hétérophiles à l’échelle d’un seul pont adhésif.

Récemment, Cavey et col. [47] ont montré qu’il existe deux types différents de

mécanisme de stabilisation et d’immobilisation des cadhérines. En outre, il existe

plusieurs classes de cadhérines (voir [48;49] pour une revue).

Selon la structure de la liaison ou de la nature de son association avec le

cytosquelette derrière, on peut distinguer plusieurs types de contacts cellule/cellule

(Fig. 1.5)

- Les jonctions serrées (tight junctions) sont des jonctions très étanches qui

définissent une barrière physiologique entre les compartiments extérieur et intérieur

de l'organisme.

- Les jonctions communicantes (gap junctions) permettent une communication

directe entre les cytoplasmes des cellules adjacentes. Au niveau des jonctions

communicantes, les cellules adjacentes sont unies entre elles par des petits canaux

intercellulaires tubulaires. Chaque canal intercellulaire est formé de l'aboutement de

2 hémi-canaux (ou connexions), chacun faisant partie de la membrane de chacune

des 2 cellules adjacentes.

- Les desmosomes sont des structures en forme de disque d'environ 0.1 à 0.5 µm

de diamètre et 100 nm d'épaisseur. Les desmosomes, sur lesquels s’ancrent les

filaments intermédiaires via des protéines cytoplasmiques, assurent les liaisons

intercellulaires par des molécules transmembranaires de la superfamille des

cadhérines (desmogléines et desmocollines). Ces molécules sont en relation avec la

plaque desmosomale qui contient en particulier de la plakoglobine et des

desmoplakines.

- Les jonctions adhérentes (adhesion belt) : Ces jonctions d'ancrage se forment par

l'intermédiaire des cadhérines. Bien que l'adhérence de ces molécules dépende de

leur domaine extra-cellulaire, celle-ci est modulée par des molécules

cytoplasmiques, les caténines (α-caténine, β-caténine et γ-caténine) qui se lient

d'une part au domaine cytoplasmique des cadhérines et d'autre part - par

l'intermédiaire de nombreuses protéines cytoplasmiques telle l’Eplin - aux filaments

d'actine (Fig. 1.6). La formation des jonctions adhérentes commence par l'adhésion

entre les molécules de cadhérines, puis viennent s’associer les caténines (α-

caténine, β-caténine) pour permettre de lier le domaine intracellulaire de la cadhérine

au cytosquelette. La liaison cadhérine-caténine ne semble pas être une simple

liaison physique direct [50]. Ainsi, les schémas simplificateurs tels que ceux

présentés en Fig. 1.6. peuvent donner une idée assez fausse et beaucoup trop

simplificatrice des caténines, les présentant comme de simples briques dans la


20

formation de la liaison cadhérine-cytosquelette. Néanmoins, les caténines sont

souvent nécessaires pour une adhésion effective [51]. En effet la mobilité d’un amas

dense de cadhérines est régulée par la liaison actine-cadhérine via l’α-caténine. Les

caténines ont d’autres fonctions allant de la régulation de la dynamique de l’actine

[52], jusqu’à l’interaction avec plusieurs voies de signalisation [48]. Enfin, il faut

mentionner qu’il existe d’autre types de liaisons entre les cadhérines et le

cytosquelette [53;54].

Me

mb

ran

e p

lasm

iqu

e

Ep

linE

plin

Me

mb

ran

e p

lasm

iqu

e

Ep

linE

plin

Fig. 1.6: Schéma de liaison entre le domaine cytoplasmique des cadhérines et le

cytosquelette. Cette liaison fait appel à des protéines cytoplasmiques adaptatrices tel que

les α-caténines, les β-caténines, p120, et d’autres protéines récemment identifiées sous le

nom d’EPLIN.

I.1.4. Physique du cytosquelette et de l’adhésion.

De par le large nombre de molécules en interaction, comprendre la contribution

du cytosquelette et de ses mécanismes moléculaires sur les propriétés physiques

des cellules reste encore un immense challenge expérimental et théorique. Janmey

et col. [17] ont étudié en détails les propriétés de gels de microtubules, de filaments

d’actine, et de filaments intermédiaires de vimentine in vitro. Selon les résultats de

cette étude, les réseaux de filaments d’actines sont les plus rigides (i.e., un gel de

filaments d’actine est moins déformable pour le même taux de stress appliqué qu’un

gel de microtubules ou de filaments intermédiaires). Les microtubules se

déstabilisent plus facilement que les filaments d’actine, ils contribuent aux propriétés

mécaniques des cellules d’autant qu’ils sont liés aux autres filaments du


21

cytosquelette. Les filaments intermédiaires sont faciles à déformer à des petits taux

de stress, mais sous une grande déformation ils deviennent plus rigides.

Depuis, une large variété de techniques et de mesures biophysiques ont été

appliquées afin d’étudier les propriétés du cytosquelette, in vitro et in vivo : pinces

optiques et magnétiques, microscopie à force atomique, méthodes rhéologiques

(cisaillement, oscillation), micro-rhéologie passive (diffusion des molécules). En

particulier, les effets d’organisation spatiale et la régulation d’interaction ont pu être

élucidés par des études in vivo [55-57]. D’ailleurs, le cytosquelette influence la

rigidité ainsi que l’organisation spatiale des jonctions adhérentes, et vice versa, les

jonctions adhérentes influencent la composition et l’organisation du cytosquelette,

d’une manière qui commence à être élucidée [54].

De même, l’adhésion est une propriété incontournable quant on parle de la

physique à l’échelle de la cellule vivante. Physiquement, l’adhésion est

l’établissement d’un pont entre les molécules, il pourra être facilement décrit par une

force attractive, ou une énergie potentielle qui diminue avec un contact. Bell. et al.

[58;59] ont montré que l’action physique des molécules adhésives dépend de leurs

dynamique chimique et que les sites d’adhésion mobiles peuvent se concentrer dans

des régions adhésives. Evans [60;61] a montré qu’il existe une transition entre une

forme continue et une forme discrète de l’adhésion le long de la membrane

cytoplasmique. L’adhésion continue n’est correcte que lorsque les molécules

d’adhésion sont suffisamment concentrées sur la membrane. Plus tard, la

spectroscopie de la molécule unique a permis de montrer que l’établissement et la

rupture d’un pont d’adhésion entre les macromolécules, ainsi que la force associé à

ces événements dépendent de la vitesse d’approche ou de séparation [10;11;62].

Dans le cas d’une cellule unique, modéliser l’adhésion par une attraction

continue [8;63], ou le cytosquelette par un gel d’actine ou par des fils et des cordes

interconnectés [64] ont amenés des avancés importantes sur notre compréhension

de la biomécanique cellulaire. Mais comment les propriétés physiques et chimiques

de l’adhésion et/ou du cytosquelette agissent sur les propriétés mécaniques aux

échelles tissulaires reste encore une question très ouverte. Des mécanismes

complexes et collectifs d'adhésion et de mouvements cellulaires interviennent lors de

la formation, de la cohésion et de l’organisation des tissus [65;66]. Cependant, établir

des relations ou des formules mathématiques reliant les comportements ou la forme

des tissus à des paramètres physiques mesurables d’une part, et à la mécanique

des cellules et leurs propriétés d’adhésion d’autre part, n’est toujours pas évident.

À l’intérieur des tissus, les cellules sont entourées par d’autres cellules

mutuellement adhérentes, et les molécules d’adhésion intercellulaires sont recrutées


22

dans des jonctions qui interagissent avec le cytosquelette. C’est une structure

tellement complexe et difficile à étudier expérimentalement ou théoriquement, qu’à

notre connaissance, une étude complète et cohérente qui prend en compte les

différentes échelles temporelles ou spatiales allant des cellules aux tissus n’existe

pas encore. Néanmoins, il est bien admis qu’il existe une relation directe entre les

comportements tissulaires et la mécanique des cellules qui les constituent. Et bien

sûr, les propriétés mécaniques du cytosquelette des cellules, ainsi que l’adhésion

cellulaire ont une influence primordiale sur la mécanique tissulaire, sur la forme et la

structure des tissus [67-70].

Dans cette thèse, nous avons essayé de mieux comprendre les

comportements collectifs des cellules dans des tissus modèles (agrégats cellulaires).

Nous avons développé des méthodes expérimentales originales issues de la

physique pour les caractériser. En particulier, nous souhaitions étudier les

écoulements et la réponse mécanique des cellules soumises à une force extérieure,

mesurer les quantités « liquides » associées (tension de surface, viscosité,

plasticité…) et essayer de les relier aux propriétés du cytosquelette et de l’adhésion.

I.2. Les tissus

Un tissu est un groupement plus ou moins homogène de cellules qui ont la

même origine et la même fonction. Les tissus constituent un niveau d'organisation

intermédiaire entre les cellules et les organes. Souvent, différents types de tissus

coexistent pour construire un organe. Par exemple, l’œil composé de l’iris, de la

rétine ganglionnaire juxtaposée à la rétine pigmenté, et des couches plus externes,

la sclérotique, etc … constitue l’organe de la vision chez l’être vivant. Tous ces tissus

accomplissent leurs missions spécifiques et transforment les vibrations

électromagnétiques de la lumière en un flux nerveux qui sera transmis au cerveau.

Un tissu apparaît dans le corps d’un organisme dès le stade précoce de son

développement embryonnaire, il se développe et se manifeste sous différentes

formes jusqu’à finir par prendre une place précise sous une conformation définie. La

mise en place d’un tissu qui est le domaine d’étude central de la biologie du

développement, fait intervenir toute une cascade de processus aussi bien

biologiques, chimiques que physiques et mécaniques. En partant d’une cellule, la

formation d’un tissu commence par la division cellulaire, qui donne lieu à un amas de

cellules ayant les mêmes informations génétiques. Ensuite, cet amas subit de

nombreuses étapes de réorganisation tissulaires qui font appel aux interactions

biochimiques, aux forces mécaniques et à des mouvements cellulaires collectifs

actifs (écoulements).


23

Dans la suite de cette partie, nous allons détailler les comportements des tissus

à partir de leur formation ainsi que leur mise en place tout en essayant d’expliquer

l’impact des forces mécaniques sur leur organisation. Dans une deuxième partie,

nous nous intéresserons aux processus de réorganisation cellulaire in vitro dans des

agrégats de cellules réagrégées puis à la caractérisation physique de ces matériaux

cellulaires modèles et enfin à leur description rhéologique.

I.2.1. Les tissus in vivo : l’embryogenèse

Le développement embryonnaire démarre généralement après la fécondation

d’un ovule par un spermatozoïde. Ensuite, la cellule fécondée se divise rapidement.

Ce stade de division cellulaire intense est suivi par une phase de réarrangement

massif au niveau cellulaire et tissulaire, la gastrulation [71]. Ces réarrangements

conduisent à la formation des trois feuillets primordiaux de l’embryon : l’ectoderme,

l’endoderme, et le mésoderme.

L’origine de tous les tissus de l’embryon peut être associée à l’un de ces

feuillets. Ces trois feuillets se rencontrent chez tous les animaux à l’exclusion de

quelques classes d’organismes très primitifs tels que les diblastiques (coraux,

méduses, anémones de mer) ou les spongiaires. Le feuillet le plus superficiel,

l’ectoderme, est à l’origine de l’épiderme, des structures tégumentaires et du

système nerveux. Le feuillet le plus interne, l’endoderme, fournit le tube digestif et les

glandes associées telles les poumons, le foie ou le pancréas. Du feuillet

intermédiaire, le mésoderme, dérive la charpente de l’organisme constitué du

squelette et des muscles.

La morphogenèse est la phase durant laquelle les tissus et les organes seront

mis en place afin de donner à l’organisme sa forme finale. Afin de mieux illustrer les

différentes phases du développement embryonnaire, on va considérer l’exemple du

développement du poisson zèbre. De plus, il s’agit de l’un des modèles cellulaires

que nous avons étudié pendant cette thèse en collaboration avec C.P. Heisenberg et

G. Krens de l’institut MaxPlanck de Dresden.

Le poisson zèbre ou Danio (Danio rerio) est une espèce de poisson ayant une

taille moyenne de 3-4 cm (Fig. 1.7). Son habitat naturel est en Asie [72]. Le poisson

zèbre est l'un des organismes modèles les plus courants en biologie du

développement. En plus de sa petite taille, de la facilité de son entretien, de sa

reproduction rapide, il présente un certain nombre d’avantages : il permet une

analyse génétique (grande collection de mutants, stratégies d’analyse du génome en

plein essor) ainsi qu'une approche embryologique classique facilitée par la

transparence des embryons et leur développement très rapide (gastrulation après 5h


24

de développement). Son développement à l’extérieur de la mère permet un suivi

détaillé de ses mouvements morphogénétiques durant les différents stades de

développement.

Fig. 1.7: image d’un poisson zèbre adulte de longueur de 3-4cm.

[http://fr.wikipedia.org/wiki/Poisson_z%C3%A8bre]

Le développement embryonnaire commence à partir d’un œuf fertilisé. Après

fécondation, la première cellule, située au sommet d'une grande réserve vitelline, va

subir une succession de divisions synchrones, tout en diminuant leurs tailles,

conduisant à un ensemble de cellules identiques et totipotentes. Jusqu'au stade de

transition miblastuléenne (1024 cellules), le développement s'effectue sous contrôle

de l'information maternelle [73]. Ce n'est qu'à partir de ce stade que le génome

zygotique commence à être transcrit et que les cellules deviennent mobiles. Les

cellules, situées au pôle animal2, vont commencer à se diviser de manière

asynchrone puis vont progressivement recouvrir la réserve vitelline3 (Fig. 1.8) au

cours du phénomène d’épibolie4. Lorsque 50 % du vitellus est recouvert par les

cellules embryonnaires, la gastrulation commence afin de transformer le blastula non

structuré en un embryon ayant 3 feuillets définis : l’ectoderme, l’endoderme et le

mésoderme.

Durant la gastrulation, trois mouvements, nécessaires à l’établissement de ces

trois feuillets primordiaux, sont à considérer : le mouvement d'épibolie qui se poursuit

jusqu'à ce que toute la réserve vitelline soit recouverte par les cellules

embryonnaires, le mouvement d'invagination des cellules de la marge (Fig. 1.9) qui

va permettre la formation des deux feuillets embryonnaires profonds, l’endoderme et

le mésoderme, et le mouvement de convergence qui conduit les cellules ventrales

2 Partie la plus antérieure de l’embryon (tête). 3 Jaune d’œuf. 4 Mouvement conduisant au recouvrement de la réserve vitelline par les cellules embryonnaires situées au pôle

animal.


25

vers la face dorsale de l’embryon où s'allonge l'axe embryonnaire [74]. C'est

immédiatement après la transition mi-blastuléenne qu'une cascade d’événements

moléculaires va progressivement conduire les cellules de l'embryon à adopter un

devenir particulier tel qu'on peut le définir sur la carte des territoires présomptifs

établie à la fin du stade blastula (Fig. 1.9.B). À ce stade, les cellules embryonnaires

forment une couche unique recouvrant l'hémisphère animal du vitellus. Par analogie

Fig. 1.8: (A-B): Deux vues d’un œuf fertilisé. (A) avec chorion protecteur, et (B) après

retrait du chorion, sur le pôle animal on repère la première cellule en haut de l’image. Au

milieu: Exemple d’une image d’embryon après les premières divisions cellulaires. (C) au

stade de 2 cellules –(D) au stade de 16 cellules. La taille d’une cellule diminue à chaque

division avec l’augmentation du nombre de cellules embryonnaires. À droite, embryons au

stade de Blastula (E) entre “high and oblong stage” et (F) entre “oblong and sphere stage”.

Barre 250 μm. Image modifiée à partir de [75].

avec le système de coordonnées utilisé pour définir une position sur le globe

terrestre on peut caractériser le devenir d'une cellule donnée en fin de stade blastula

en fonction de deux coordonnées : sa longitude, qui correspond à la position de cette

cellule de long de l’axe dorso-ventral (D/V, avec pour méridien d'origine l'axe

embryonnaire qui se forme dorsalement) et sa latitude qui correspond à la position

de cette même cellule le long de l’axe margino-animal (Fig. 1.9.B).


26

Biologiquement, en utilisant les méthodologies de perturbation de la formation

des axes embryonnaires (par la perte de fonction d’éléments requis pour la formation

de ces axes, [76;77] ou bien en inhibant la fonction des gènes d’intérêt par la

technique de morpholino knock-down [78], ou au contraire en réalisant des

expériences de surexpression d’un facteur par injection d’ARN dans des embryons à

des stades très précoces de développement), de nombreuses études (voir [73] pour

une revue) ont montré que la coordonnée «longitude» d'une cellule, est définie par

l’action morphogénique des gènes BMP5 (voir [79] pour une revue).

Outre l'information D/V, pour définir son identité spatiale au sein de la blastula,

une cellule donnée requiert une coordonnée de latitude, c'est-à-dire une information

moléculaire sur sa position le long de l'axe margino-animal. Cette coordonnée

permet de définir sa position le long de l'axe antéro-postérieur (A/P) en fin

5 bone morphogenetic proteins

Fig. 1.9 : Carte des territoires présomptifs d’un embryon de poisson zèbre au stade de

blastula tardive. A. Les cellules embryonnaires sont disposées sur l'hémisphère animal de la

réserve vitelline. Le mouvement d’épibolie conduit les cellules de la marge jusqu'au niveau

de l’équateur. PA : pôle animal ; PV : pôle végétal ; D : dorsal ; V : ventral. B. Carte des

territoires présomptifs de l’embryon au même stade qu'en A (5h de développement, d’après

[54, 55]). La région marginale comprend des cellules endodermiques, les cellules

mésodermiques incluant la plaque préchordale (pp), la notochorde (Not), les muscles et le

territoire sanguin. Au niveau de l’ectoderme, on distingue la moelle épinière ou corde

spinale (C. sp), le rhombencéphale (Rhomb), le mésencéphale (Més), le diencéphale (Di), le

télencéphale (Tél) et l’épiderme (Épi). Le devenir de chaque cellule peut être défini selon

ses coordonnées (flèches rouges) : sa longitude (le long de l’ave D/V) et sa latitude (le long

de l’axe marge/pôle animal ou antéro-postérieur, A/P). C. Structures dérivant des

territoires présomptifs décrits en B. Même code couleur. La glande d'éclosion (Gl) dérive de

la plaque préchordale [74]


27

d’embryogenèse. En effet, l'observation de la carte des territoires présomptifs (Fig.

1.9.B) à comparer avec (Fig. 1.9.C) montre que les territoires situés au pôle animal

vont conduire à la formation des yeux et du cerveau antérieur (télencéphale et

diencéphale) alors que des territoires situés dans des régions progressivement plus

végétales se différencient en structures neurales plus postérieures telles que le

cerveau moyen (mésencéphale) puis le cerveau postérieur (rhombencéphale) et

enfin la moelle épinière. En revanche, dans la région marginale, les cellules vont

ensuite migrer sous l’ectoderme en direction du pôle animal en formant les feuillets

internes (mésoderme et endoderme). Selon des études biochimiques, l’organisation

établie selon l’axe A/P est le résultat des activités de différents facteurs moléculaires

(voir [80-83] pour détails).

Ainsi, durant la morphogenèse, le mouvement cellulaire est gouverné par des

informations génétiques sécrétant des facteurs moléculaires, et implique

l’intervention de signaux mécaniques [84] et biochimiques. Ces signaux permettent

aux cellules d’investir leur environnement et de répondre aux ordres afin de

« s’écouler » vers leur destination à l’intérieur de l’organisme. Si les biologistes du

développement ont fourni des efforts énormes afin d’identifier les facteurs qui dirigent

l’organisation des tissus, les effets de chaque gène durant la cascade du

développement, l’intervention de scientifiques de différents domaines (physiciens,

mathématiciens, et chimistes, etc.) a laissé des contributions marquantes pour la

biologie du développement. Aujourd’hui encore, leur intervention est nécessaire pour

caractériser les tissus par des techniques originales ou expliquer les mécanismes

complexes de la morphogenèse [85] et plus généralement de la migration cellulaire.

Les parties suivantes décrivent les réponses et les hypothèses issues de la physique

depuis un peu plus d’un siècle vis-à-vis des questions du développement.

I.2.2. Les tissus in vitro : l’affinité cellulaire

Dès le début du 20ème siècle, de nombreux chercheurs ont essayé de percer

les mystères de l’organisation tissulaire. Parmi eux, Edmund B. Wilson, en 1907, a

découvert que les cellules ou tissus dissociés à partir d’une éponge marine peuvent

se réunir à nouveau dans un seul corps cellulaire, l’agrégat. De plus cet agrégat

évolue jusqu’à la reconstruction d’une éponge fonctionnelle [86].

Ces travaux furent ensuite poursuivis plus systématiquement par Johannes

Holtfreter, qui mélangea in vitro des cellules embryonnaires d’amphibiens provenant

d’espèces et de tissus distincts. Une deuxième découverte d’importance majeure a

lieu en 1936 : Townes et Holtfreter établissent que les cellules ainsi recombinées

subissent une ségrégation spatiale (Fig. 1.9), en ce sens qu’au lieu d’adopter une


28

disposition aléatoire à l’intérieur d’un amas, les cellules s’associent par types. « Qui

se ressemble s’assemble », dit le proverbe : les cellules épidermiques migrent

ensemble vers la périphérie de l’amas, et les cellules mésenchymateuses vers

l’intérieur, les deuxièmes étant le plus souvent complètement entourées par les

premières.

Fig. 1.9: Réassociation des cellules de neurulas de batraciens. Deux suspensions de cellules,

ont été mélangées, l’une provenant de l’ectoderme présomptif d’un embryon fortement

pigmenté, et l’autre de la future plaque neurale d’un embryon non pigmenté. Ces cellules se

rassemblent et se trient de manière telle que l’épiderme présomptif recouvre l’autre tissu.

(D’après Townes & Holtfreter [87])

En 1955, Townes et Holtfreter complètent ces résultats et publient une

impressionnante série d’expériences de tri cellulaire [87]. Ils notent que la position

finale des cellules dans les amas recombinés reflète leurs positions normales dans

l’embryon, c'est-à-dire que le mésoderme est plus central que l’ectoderme, à la

surface interne duquel il adhère fermement (Fig. 1.10). Le mésoderme adopte

également une position centrale par rapport à l’endoderme (Fig. 1.10). Toutefois

lorsqu’on mélange des suspensions cellulaires préparées à partir des trois feuillets,

l’endoderme se place au centre de l’amas ; il est alors recouvert par le mésoderme,

lui-même situé sous l’ectoderme qui finalement occupe la périphérie (Fig. 1.10). Des

agrégats provenant de la recombinaison de cellules de l’épiderme et de la plaque

neurale sont également capables de reproduire la situation normale dans l’embryon

(Fig. 1.10D et Fig. 1.10E). Enfin, lorsque la suspension de cellules comporte des

cellules présomptives axiales (notochrode) en plus des cellules présomptives

épidermiques et neurales, l’amas recombiné présente une couche épidermique

superficielle, du tissu nerveux au centre, et du tissu mésodermique entre les deux


29

(Fig. 1.10E). D’une certaine façon, les cellules ont connaissance de leur position

normale dans l’embryon. Townes et Holtfreter interprètent cette découverte en

termes d’affinité cellulaire sélective permettant à la cellule de reconnaître de

manière sélective les cellules d’un même tissu, ce qui confère au tissu une affinité

tissulaire différentielle [87]. Par exemple, ils commentent que la surface interne de

l’ectoderme a une affinité positive pour le mésoderme et une affinité négative pour

l’endoderme, alors que le mésoderme a une affinité positive pour les cellules

provenant des deux autres feuillets. Plus tard, Holtfreter et ses collègues ajouteront

que les affinités sélectives changent au cours du développement [87]. Ces

modifications des affinités cellulaires sont évidemment de la plus grande importance

pour la morphogenèse.

Fig. 1.10: Agrégats de cellules embryonnaires d’amphibiens mélangées et recombinées

avec diverses combinaisons. Les cellules se trient et reconstituent des structures spatiales

similaires à celles rencontrées dans l’embryon (D’après Townes & Holtfreter [87])

Même si certaines de ces idées seront par la suite reformulées plus

rigoureusement par M. S. Steinberg (voir ci-dessous), les découvertes de Wilson,

Holtfreter ou d’autres (Townes, Weiss, Moscona…) restent fascinantes car elles

montrent que notre corps n’est pas un amoncellement de toutes sortes de cellules


30

assemblées au hasard, que les agrégats de cellules dissociées-réagrégées sont un

système modèle pertinent de tissus. La biologie moléculaire va pouvoir s’en servir

avec ses nouveaux outils extrêmement puissants [44;85;88;89].

On peut pour finir cette partie résumer ci-dessous les découvertes majeures

réalisées durant la première moitié du 20ème siècle sur la reconstruction in vitro des

tissus à partir de cellules dissociées :

(i) Quand les cellules des différents tissus embryonnaires sont dissociées puis

mélangées ensemble, elles sont capables de rétablir des liaisons de contact entre

elles afin de former un agrégat commun.

(ii) Lorsqu’un agrégat est formé de plusieurs types des cellules, chacun de ces

types se regroupe et se trie comme dans les différents tissus d’origines.

(iii) Les tissus se reconstruisent dans des positions définies à l’intérieur de l’agrégat.

(iv) Dans le cas où les tissus proviennent d’un même complexe chez l’embryon, la

structure de ce complexe sera bien reflétée par leur reconstruction in vitro.

I.2.3. L’hypothèse d’adhésion différentielle (HAD).

Les cellules ne s’associent donc pas au hasard, mais sont capables de se

déplacer et de se reconnaître pour s’organiser en tissus complexes. Plusieurs

théories ou hypothèses ont été proposés afin d’expliquer ces « écoulements actifs »

et d’identifier les forces mises en jeu durant la morphogenèse. L’Hypothèse

d’Adhésion Différentielle (HAD) développée par Steinberg dans les années 60,

postule une analogie intéressante entre les liquides et les tissus et en particulier

comme on le verra, l’existence d’une tension de surface tissulaire. Cette hypothèse

permet d’attribuer un sens physique à l’affinité cellulaire puis de quantifier à partir

des lois de la thermodynamique et de l’hydrodynamique le comportement des

agrégats cellulaires comme l’arrondissement ou le tri-cellulaire.

I.2.3.1 Le contexte de l’HAD et l’analogie liquides/tissus.

Durant le développement normal, on rencontre fréquemment la situation où un

tissu A s’écoule de sa position initiale afin de couvrir la surface d’un autre tissu B

(voir par exemple le phénomène d’épibolie du poisson zèbre, Fig. 1.9). D’autre part,

dans un mélange de ces mêmes deux types de cellules dissociées et réagrégées

dans un agrégat cellulaire in vitro, on peut aboutir à une configuration finale mimant

celle du développement embryonnaire. Tirant parti de cette découverte, Steinberg

postule que les fonctions responsables de cette organisation sont en liaison directe

avec les propriétés des cellules. Dans le but d’identifier ces propriétés, il réalisa lui


31

aussi au début des années 60 des expériences sur le tri (ségrégation) in vitro de

différents types de tissus dissociés d’embryons de poulet (rétine ganglionnaire et

pigmenté, cœur, etc.) [65;90]. Suite à ces expériences, il postule : (i) que les cellules

durant le tri ont un mouvement actif dirigé ainsi qu’une adhésion mutuelle sélective,

(ii) que le tri entre deux tissus mélangés ne peut avoir lieu que si les deux tissus

présentent une adhésion différentielle entre leurs cellules motiles. Une combinaison

de ces deux propriétés a été proposée par plusieurs auteurs à l’époque (voir [65]

pour une revue) même avant que Steinberg développe son hypothèse HAD en 1963.

Cependant, le mérite de Steinberg est de repérer puis de formaliser les

comportements liquides chez de tel matériaux cellulaires. Examinons d’où provient

cette idée de similarité entre tissus et liquides.

Les gaz sont constitués d’unités (atomes ou molécules) de très grande mobilité

avec des interactions négligeables. Les solides ont des forces de cohésion énormes

qui empêchent le mouvement à distance de leurs unités. Entre ces deux états de la

matière, se trouvent les liquides où les unités présentent à la fois une grande mobilité

et des forces de cohésion.

Fig. 1.11 : L’agrégat comme une goutte de cellules. (A) Image de deux gouttes d’eau

sphériques posées sur une feuille d’arbre. (B) Image d’agrégats de cellules F9 prise sous un

microscope optique, deux jours après le début de leur agrégation.

L’analogie entre certains types de tissus et liquides est assez évidente si l’on

examine la forme et le comportement des agrégats cellulaires. L’exemple le plus

simple d’une telle similarité est représenté sur la Fig. 1.11. Une goutte liquide, dans

un champ de forces uniforme et isotrope, prend une forme sphérique (Fig. 1.11.A).

Ceci est dû aux interactions entre unités mobiles qui la constituent : les molécules.

Ces molécules s’attirent et cherchent à optimiser le nombre de contacts possibles

entre eux en réduisant la surface externe. Comme on le verra dans les rappels de

thermodynamique du paragraphe suivant, une surface coûte toujours de l’énergie de

surface. A des échelles de temps beaucoup plus longues (~10h), les agrégats


32

cellulaires profitent de la motilité de leurs unités (cellules) afin d’évoluer vers une

situation similaire de contact maximum entre cellules : l’agrégat prend une forme

sphérique (Fig. 1.11.B). Steinberg sera le premier à postuler que ces agrégats

cellulaires possèdent aussi une tension de surface tissulaire apparente.

Les autres exemples, qui ont mis en évidence cette analogie liquides/tissus,

sont les phénomènes de tri-cellulaire (Fig. 1.12.A) similaires à la démixtion de deux

liquides immiscibles, ou encore la fusion entre deux agrégats simulant la

coalescence entre deux gouttes de liquide (Fig. 1.12.B).

Fig. 1.12 : Comportements liquides des agrégats cellulaires. (A) tri cellulaire et

arrondissement des agrégats formés, en haut, d’un mélange de cellules neurales et

pigmentés de rétine de poulet [91], et en bas de cellules d’ectoderme et d’endoderme de

l’hydre [92]. (B) Coalescence de deux agrégats identiques de cellules embryonnaires de

souris (F9), voir chapitre 4.

Au-delà de l’aspect qualitatif, l’intérêt de cette analogie est de fournir un point

de départ vers une interprétation thermodynamique et hydrodynamique de l’évolution

des tissus. Avant de décrire le modèle thermodynamique original de Steinberg

décrivant le tri cellulaire, il est utile de rappeler quelques notions élémentaires de

physique des liquides et des surfaces.

I.2.3.2 Notions de physique des liquides et des surfaces.

Un des principes fondamentaux de la thermodynamique prédit qu’un système

tend toujours vers l’état le plus stable, ce qui se mesure par une décroissance de son

potentiel thermodynamique. Ce principe thermodynamique peut être appliqué à une

goutte mais aussi à des agrégats de certains types de cellules. L’état d’équilibre

d’une goutte de liquide pur correspond au minimum de son énergie libre qui est, à

volume constant, la potentielle thermodynamique à minimiser. À température T,

nombre de molécules N et volume V constants, ce potentiel n’a qu’une contribution

surfacique. L’énergie libre de surface est le résultat des liaisons pendantes à la

surface de la goutte. Alors que les molécules à l’intérieur de la goutte ont un certain

nombre de molécules voisines qui les entourent de façon isotrope, les molécules de

surface présentent une anisotropie qui se reflète par un déficit de molécules vers

l’extérieur ou thermodynamiquement, par un excès d’énergie de surface. Cette


33

énergie est proportionnelle à l’aire de la surface et les variations infinitésimales de

l’énergie libre par unité de surface seront donné par :

.dF dAσ=

avec σ la tension de surface (ou tension superficielle) définie comme étant

l’énergie libre par unité de surface (à T, V, N constants), et A l’aire de la surface. Par

conséquent l’énergie libre F atteint un minimum pour dA=0. L’état d’équilibre

correspond donc à une surface minimale, par exemple une goutte sphérique si celle-

ci est libre en suspension. Dans les cas où deux phases liquides a et b immiscibles

sont en contact, la tension résultante est appelée tension interfaciale notée σab [93].

Fig. 1.13 : Expérience démontrant que la tension de surface est une force par unité de

longueur (A) la surface tire sur la barrière mobile d’une cuve de Langmuir (A), ou sur le fil

de laine souple refermant un film de savon sur un cadre (B).

Le travail qu’il faut dépenser pour accroître la surface d’un liquide de largeur

constante L à T, V, N constants est ∆W=σ∆A=σL∆x=F∆x (Fig. 1.13). Donc

σ s'interprète aussi comme une force par unité de longueur (F=σ L) d’où le nom de tension de surface.

La différence de pression entre l’intérieur et l’extérieur d’une interface fluide

courbe dépend des deux rayons de courbure et de la tension de surface selon la loi

de Laplace [93]:

int

1 2

1 1( )extP P PR R

σ∆ = − = +

Cette équation montre que des petites gouttes de liquide ont des pressions

internes plus grandes que des grandes. Nous le verrons dans le chapitre 3, lorsque

l’on comprime une goutte entre deux plaques, deux termes de force de surface sont

transmis aux plaques : l’un dû à la surpression de Laplace, l’autre dû à la force le

long de la ligne de contact (goutte/plaque/milieu extérieur comme sur la Fig. 1.14) .


34

Fig. 1.14 : Goutte de liquide (A) posée sur un autre liquide et (B) contre un solide. Il existe

une relation d’équilibre (somme vectorielle) entre les tensions de surface et les angles

(relation d’Young-Dupré).

Quand une goutte de liquide est déposée contre un solide ou un autre liquide,

soit elle s’étale et mouille complètement la surface, soit elle ne s’étale pas

complètement. Dans ce cas du mouillage partiel, la géométrie atteinte résulte de

l’équilibre entre les tensions interfaciales et superficielles aux lignes solide-liquide-

gaz avec un angle de contact π−θ bien défini (nous avons ici utilisé la notation

généralement rencontrée dans les articles de tensiométrie des tissus où θ est le

complémentaire de l’angle de contact). Pour la goutte « a » sur la surface solide

« s » (Fig. 1.14B), cette relation de Yong-Dupré est la suivante :

( )coss as aσ σ σ π= + − Θ

où σa, σa, σas sont respectivement les tension de surface du solide avec la phase

gazeuse, du liquide avec la phase gazeuse et de l’interface a/s. Quelques autres

quantités sont intéressantes à définir comme le travail de cohésion Wa qui est le

travail nécessaire pour séparer une unité d’aire du milieu a, du contact à l’infini (Fig.

1.15A) , ou le travail d’adhésion Wab qui est le travail nécessaire pour séparer une

unité d’aire d’une interface entre un milieu a et un milieu b, du contact à l’infini (Fig.

1.14B) :

( )( )2 et + - = 1+cos - a a ab a b ab aW Wσ σ σ σ σ π θ= =

où la dernière égalité à droite a été obtenu en utilisant la loi d’Young (cas du

mouillage partiel).

Toutes ces considérations sont vraies pour deux liquides a et b immiscibles c'est-à-

dire pour lesquels σab>0. [94]. La miscibilité de deux liquides (σab≤0) n’est pas

prédictible à partir des valeurs des tensions de surface σa et σb. Les molécules d’eau

par exemple sont tenues ensemble par de fortes liaisons hydrogène (liaison H

résultant d’interactions entre charges des dipôles de l’eau) qui lui confèrent une forte


35

Fig. 1.15 : (A) Travail de cohésion et (B) Travail d’adhésion

tension de surface de 72mN/m à 25°C [93;95]. L’éthanol CH3CH2OH est aussi un

liquide polaire ayant une tension de surface de 22,3 mN/m [95]. Il est miscible dans

l’eau. L’huile d’olive est un liquide non polaire (lipophile) ayant une tension de

surface de 33 mN/m à 25°C [96] donc proche de l’éthanol. Mais, elle ne se mélange

pas à l’eau : l’huile et l’eau démixent en deux phases séparées, l’huile formant par

exemple un film à la surface de l’eau. La raison est que l’huile contrairement à

l’éthanol n’est pas polaire et ne peut ainsi former de liaisons H avec l’eau. Il faut

retenir de cet exemple simple que la prédiction de l’état final d’un mélange de deux

liquides nécessite la connaissance de leurs interactions, c'est-à-dire de σab.

L’autre propriété importante d’un liquide qui nous intéresse ici est sa viscosité

dynamiqueη qui représente la résistance du liquide à l’écoulement. Lorsque deux

couches d'un fluide séparées d’une distance dz sont animées d’une vitesse relative

dv l’une par rapport à l’autre et dirigée suivant x, sous l'effet de la viscosité, une force

F sera transmise d’une couche (de surface S) à l’autre. La viscosité η est alors

définie par la relation suivante :

dz

dSF

νη ..= (1.3)

La viscosité dynamique η se mesure en pascal-seconde (Pa.s). On trouve

encore parfois l’unité du système CGS, le poise (Po) : 1 Pa.s = 10 Po.

I.2.3.3 Modèle thermodynamique de la démixtion et du tri-cellulaire

Considérons le cas d’un mélange de deux types cellulaires différents a et b

sans interaction avec d’autres surfaces. Comme pour les liquides, les différents

niveaux d’adhésion et de cohésion pourront être quantifiés par les travaux


36

nécessaires à établir une liaison cohésive ou adhésive par unité de surface Wa, Wb,

et W ab. Ce raisonnement emprunté à la physique des surfaces a été d’abord

employé dans le contexte des agrégats cellulaires par Steinberg [65] puis complété

par Graner [97].

Comme dans l’exemple de la goutte, les cellules se réarrangent dans le but de

minimiser l’énergie libre du système entier. Cette énergie est minimale quand la

somme totale des travaux accomplis à l’intérieur du système (travaux de cohésion et

d’adhésion) est maximale. Selon les valeurs de ces travaux, il y a plusieurs cas à

distinguer :

(i) Le travail d’adhésion Wab est supérieur ou égal à la moyenne des travaux de

cohésion : 2

baab

WWW

+≥ soit σab < 0.

Dans un tel cas, le travail maximum que peut accomplir le système, correspond à un

mélange des unités a et b d’une façon alternée, les deux phases sont combinées

(motif en échiquier ou « checkerboard »). C’est le cas 1 de la Fig. 1.16.

(ii) Au contraire si Wab est inférieure à la moyenne des travaux de cohésion,

2

baab

WWW

+< , soit σab > 0

le travail est maximum quand les deux types d’unités sont complètement ségrégées.

Cependant, il y a différents cas de ségrégations thermodynamiquement possibles.

Pour simplifier les cas symétriques, supposons que le travail de cohésion Wa est

supérieur au travail de cohésion Wb.

(ii-1) Si les unités b sont plus adhésives aux unités a que cohésives entre elles,

on résume alors la situation par l’inégalité suivante :

2

baabb

WWWW

+<≤ , soit σa > σab + σb

Ces conditions ne sont respectées que lorsque aba WW > . Sachant que

l’énergie libre du système est proportionnelle à la surface, sa minimisation doit

se manifester par la formation d’une sphère composite contenant à sa

périphérie le type cellulaire le moins cohésif (b) et en son centre le plus cohésif

(a). De plus l’anisotropie à l’interface entre les deux types a et b fait que cette

interface contribue à l’énergie libre du système entier. Une condition requise

afin de minimiser l’énergie libre est de minimiser l’interface a/b. En conclusion

la phase a assumera aussi une forme sphérique, entouré d’une couronne

concentrique contenant la phase b. C’est le deuxième cas du schéma de la Fig.

1.16.


37

(ii-2) Si l’adhésion a/b est légèrement inférieure à la cohésion entre une

paire d’unité de la phase b, mais si aucune tension de surface n’est supérieure

à la somme des deux autres, c’est à dire :

abab WWW ≤< soit σa < σab + σb, et σab < σa + σb

la phase b recouvre partiellement la surface de la phase a. C’est le troisième

cas schématisé sur la figure (Fig. 1.16).

(ii-3) Enfin si abab WWW ≤< (σa < σab + σb), mais σab > σa + σb

La condition de Young ne peut être vérifiée car σab est supérieur à la somme

des deux autres tensions de surface. Deux phases isolées se forment. À

l’équilibre, chaque phase forme un sphéroïde et l’interface a/b disparaît. C’est

l’autre troisième cas (du bas) schématisé sur la figure (Fig. 1.16).

Après avoir développé cette description thermodynamique cohérente et validée

par ses expériences, Steinberg pousse naturellement un peu plus loin l’analogie

entre liquides simples et tissus biologiques en postulant que ces derniers ont aussi

une tension de surface résultant de l’énergie de cohésion entre leurs cellules due

Fig. 1.16 : Types de distribution de phase, à l’équilibre thermodyna-mique, d’une population constituée de deux types d’unités mobiles cohésives entre elles et adhésives les unes aux autres. Le travail de cohésion Wb est arbitrairement choisi égal à 1. En fonction du rapport des travaux de cohésion, et d’adhésion, ce schéma, basé sur un modèle thermodyna-mique, peut prédire la configuration finale adoptée par les phases mobiles constituant le système (d’après [65]).


38

aux molécules d’adhésion. La preuve expérimentale et la mesure de cette tension

de surface tissulaire devient dès la fin des années 1960 pour Steinberg et ses

collaborateurs un important défi scientifique qui nécessitera une vingtaine d’année

encore pour aboutir.

I.2.3.4 Preuves expérimentales de l’HAD : expériences de tri cellulaire et

mesures de tension de surface tissulaire

On a vu que l’arrondissement d’un fragment de tissu peut donner un agrégat

sphérique (Fig. 1.11B), que deux agrégats d’un même tissu, mis en contact,

fusionnent vers un gros agrégat sphérique (Fig. 1.12B), qu’un mélange de cellules

dissociées de plusieurs types de tissus redonne après une période de tri cellulaire

des domaines homotypiques (Fig. 1.12A). Bien que les cellules qui constituent ces

agrégats ne soient pas à l’équilibre thermodynamique, tous ces comportements sont

analogues au retour à l’équilibre d’un liquide simple piloté par sa tension de surface.

Le bilan d’équilibre des forces existe pour un système hors d’équilibre. La tension de

surface étant une force par unité de longueur tout au long de la surface peut donc

être introduite pour les agrégats cellulaires. Le terme tension de surface tissulaire

sera utilisé pour décrire les forces agissantes tout au long de l’interface entre un tissu

et un milieu de culture, et tension tissulaire interfaciale pour caractériser les

mêmes forces agissant à l’interface de deux tissus différents en contact.

La première méthode à laquelle on peut penser pour déterminer

expérimentalement la cohésion d’un tissu est de mesurer les forces d’adhésion entre

paires de cellules le constituant [9;58]. Mais ceci s’avère vite une expérience très

délicate dépendant de multiples paramètres expérimentaux comme la vitesse de

rétraction lors du détachement des deux cellules [59]. La tension de surface tissulaire

par contre est une mesure macroscopique sur un ensemble de cellules, elle apporte

une quantification directe de la cohésion tissulaire sans aucune hypothèse sur les

interactions microscopiques entre cellules.

Avant de devenir quantitative et absolue, la mesure de tension de surface est

longtemps restée qualitative et relative. Phillips et Steinberg comparent la forme

d’agrégats cellulaires de même volume et soumis à des forces de centrifugation de

même amplitude afin de classer les différentes types de tissus embryonnaires de

poulets vis-à-vis de leur tension de surface. Ils ont démontré que les fragments de

tissus ainsi que les agrégats déjà arrondis aboutissent à la même configuration finale

[98;99]. Pendant ces expériences la force centrifuge qui tend à aplatir les agrégats

est équilibrée par la tension de surface tissulaire qui tend à arrondir l’agrégat et ces

deux paramètres déterminent la forme de l’agrégat. Les différences relatives de

tension de surface évaluées prédisent précisément la hiérarchie de leurs


39

enveloppements mutuels [99;100] (comme dans le cas de la Fig. 1.17 issue d’une

étude ultérieure). En mettant en contact par paire les tissus, celui de plus grande

tension de surface se trouve toujours enveloppé par celui de plus basse tension de

surface. Notons, que très récemment la méthode par centrifugation est devenue

quantitative. Il est en effet possible d’extraire du contour d’un liquide ou d’un agrégat

comprimé sa tension de surface [101;102].

Fig. 1.17 : Valeurs de la

tension de surface de cinq

types différents de tissus

embryonnaires de poulet est

mesurés par tensiométrie des

tissus La hiérarchie

d’enveloppement des paires

de tissus correspond à la

prédiction de l’HAD. (Figure

issue de [103]).

La première mesure absolue de la tension de surface (par compression) a été

obtenue par Davis en 1984 [104] pour le mésoderme, l’ectoderme et l’endoderme de

cellules embryonnaires d’amphibien. Puis, en 1994, G. Forgacs, R. Foty et M. S.

Steinberg ont développé leur propre tensiomètre de compression des tissus [105].

Cet appareil est basé comme celui monté durant cette thèse sur l’analyse du contour

d’agrégats comprimés entre deux plateaux. Avec cet appareil, il a pu être confirmé

que les valeurs des tensions de surface respectent la hiérarchie des enveloppements

mutuels comme le prédit l’HAD [88;103;105;106]. La figure (Fig. 1.17) montre la

validité de la prédiction dans le cas d’agrégats embryonnaires de poulet [103].


40

Enfin, signalons que les ingrédients de base de l’HAD conduisant au tri

cellulaire, à savoir l’adhésion différentielle et la mobilité des cellules, ont été validés

par des simulations numériques de Potts [107].

I.2.3.5 Origines moléculaires de la tension de surface tissulaire : postulats

de l’HAD et hypothèses concurrentes

Steinberg a proposé que la tension de surface d’un tissu résulte des niveaux

d’expression6 de molécules d’adhésion entre les cellules constituant le tissu et ce

dès 1963, c’est à dire avant que ne soient découvertes les protéines d’adhésion

telles que les cadhérines [100;108;109] Nous pouvons appeler cette affirmation le

second postulat de l’HAD (le premier étant le principe de minimisation des énergies

de surface). Les cellules sont donc considérées comme des analogues des

molécules de liquide et les liens adhésifs des analogues des interactions attractives

entre molécules [110]. Plusieurs séries d’expériences ont été réalisées par le groupe

de Steinberg dans le but d’avoir une évaluation directe de la proposition évoquée

[44;45;88]. Leur démarche consiste à partir de cellules identiques qui ne présentent

pas de cadhérines à leurs surfaces puis d’exprimer différents niveaux de E-cadhérine

et de P-cadhérine. Trois scénarios possibles de ségrégation ont été illustrés :

Fig. 1.18 : Le tri-cellulaire d’un même type des cellules pourra avoir lieu si et seulement si

les cellules présentent à leurs surfaces deux niveaux différents d’expression de cadhérines

(A) et (C). L’égalité de l’expression (B) rend les deux types de cellules «miscibles» [111].

- Les cellules exprimant la E-cadhérine occupent la position centrale quand le

niveau de E-cadhérine est plus élevé que celui de P-cadhérine exprimé par les

autres cellules.

- Quand le niveau d’expression en E-cadhérine ou en P-cadhérine est égal, on

n’observe pas de tri cellulaire.

6 Quantité de molécules d’adhésion exprimées à la surface d’une cellule


41

- L’augmentation du niveau d’expression de la P-cadhérine au delà de celui de

cellules exprimant la E-cadhérine aboutit à l’inversion de la configuration finale des

cellules.

La figureFig. 1.18 illustre les trois cas présentés ci-dessus. Cette expérience

montre clairement que le tri-cellulaire n’est pas forcément causé par la différence

dans la nature des molécules d’adhésion de différents types de tissus. Seule la

différence du niveau exprimé de la molécule est suffisant pour le tri-cellulaire. La Fig.

1.18B montre aussi que cette dernière différence est nécessaire pour que le tri

cellulaire puisse avoir lieu.

Finalement en 2005, Foty et Steinberg ont montré que la tension de surface

d’agrégats de L-cells transfectées avec des cadhérines est quasi-directement

proportionnelle au nombre de molécules d’adhésion exprimées par ces cellules

[112]. Les cellules étaient transfectées de façon à exprimer différents niveaux de

cadhérines. Le graphe de la Fig. 1.19 montre la dépendance linéaire de la tension de

surface en fonction du nombre de cadhérines exprimées par chaque cellule à

l’intérieur de l’agrégat.

Ces résultats ont été interprétés par le groupe de Steinberg comme une

indication définitive sur la dépendance exclusive de la tension de surface en fonction

de l’expression des molécules d’adhésion. La contractilité des cellules (tension

corticale) n’aurait aucun rôle sur le tri-cellulaire. Cependant, un changement des

propriétés mécaniques des cellules transfectées avec les cadhérines comparées aux

cellules originales est très probable étant donné que ces molécules d’adhésions sont

en interaction continue avec le cytosquelette. Dans le cas du poisson zèbre, il a été

montré que la différence quantitative de la tension de surface dirige la ségrégation

des tissus [113] mais que la tension corticale joue un rôle dans ce tri-cellulaire et

dans la gastrulation [85]. Ces mesures ont été obtenues en combinant des mesures

de résistance mécanique et d’adhésion par AFM sur cellules uniques, ainsi que des

expériences de tri in vitro et in vivo des trois feuillets primordiaux (ectoderme,

endoderme, mésoderme), en régulant la tension corticale par le facteur de

croissance « Nodal/ TGFβ-signalling ». De plus, des expériences avec des drogues

affectant le cytosquelette ont montré des variations de tension de surface

mesurables [114;115]. Il nous parait donc très difficile de séparer complètement

comme le fait le second postulat de l’HAD la mécanique cellulaire de l’adhésion

cellule-cellule. On peut raisonnablement penser que ces deux facteurs contribuent

au devenir des cellules dans les tissus.


42

Fig. 1.19 : Tension de surface des

agrégats cellulaires de « L-cells »

en fonction du nombre de

cadhérines à la surface de chaque

cellule. Le graphe montre une loi

linéaire de l’évolution de la

tension de surface (d’après Foty et

Steinberg, 2005, [112]).

Certaines théories prédisent d’ailleurs que le réseau contractile de la cellule qui

est à l’origine de la tension corticale cellulaire peut expliquer le comportement

«liquide» des tissus et l’existence d’une tension tissulaire [116;117]. Dans ce

contexte, deux questions principales ont été fixées au début de ce travail :

- Quelles sont les lois ou les paramètres physiques qui pourront décrire la

cinétique d’organisation dans les tissus ?

- Quelles sont les structures ou processus biologiques qui pourront être à la base

de ces comportements, et éventuellement à l’origine des paramètres mesurés?

Enfin, quelques autres questions concernant la dynamique et la rhéologie de ces

matériaux cellulaires complexe ont été étudiées.

I.2.4 Rhéologie

Les tissus modèles ont été souvent présentés en tant que fluide viscoélastique

complexe [106]. Effectivement, depuis les premiers essais de mesure de la tension

de surface tissulaire relative par la méthode de centrifugation, Phillips et Steinberg

ont pu remarquer et décrire qualitativement les propriétés mécaniques et

rhéologiques des agrégats. Ainsi, la nature viscoélastique des tissus a été identifiée

et documentée dans deux de leurs publications en 1977 et 1978 [118;119]. Aux


43

échelles de temps long (heures), ils présentent des comportements similaires à ceux

d’un liquide visqueux. Aux temps courts, ils répondent plus comme des solides

viscoélastiques. Les comportements sont donc intimement dépendants de l’échelle

de temps considérée. Cependant, ces comportements sont susceptibles d’être

modifiés dès qu’on applique une force extérieure [120]. Ainsi, une étude physique

des tissus embryonnaires ne pourra être complète et pertinente que si elle prend en

compte toute la richesse de ces comportements en ayant recours à la rhéologie des

tissus. Le « challenge » est donc d’établir un modèle rhéologique des tissus basé sur

des paramètres physiques qui reflètent la structure ainsi que les processus ayant

place à l’intérieur de ce matériau vivant.

Aujourd’hui, l’étude rhéologique est une branche active de la physique des

tissus. Les premières mesures de rhéologie datent de plus de 10 ans [121]. Elles ont

été réalisées sur des tissus de taille macroscopique placés dans un rhéomètre. Dans

la suite de cette sous-partie, nous allons présenter une introduction générale à la

rhéologie ainsi que les modèles mécaniques les plus répandus. Dans l’introduction

du chapitre 5, nous détaillerons les modèles viscoélastiques plus complexes des

tissus vivants et les expériences qui ont permis de les établir.

I.2.4.1 Comportement viscoélastique

Un fluide newtonien a une viscosité η bien définie. Cette viscosité reste intacte

et indépendante des contraintes que subit ce fluide de la vitesse d’écoulement, de la

déformation, ainsi que de la vitesse à laquelle on le déforme. Toute déviation de ces

règles est le signe d’un comportement non-newtonien.

Sous une déformation, un matériau viscoélastique présente un comportement

complexe. Sa réponse à une déformation présente à la fois un aspect élastique

(contrainte proportionnelle à la déformation) et un aspect visqueux (contrainte

proportionnelle à la vitesse de déformation).

Un exemple particulièrement spectaculaire de fluide viscoélastique est la pâte

de silicone connue sous le nom commercial de ”silly-putty”. Une boule de cette pâte

rebondit sur le sol comme une balle élastique; pourtant, si on pose cette boule sur

une surface horizontale et si on attend quelques minutes, on voit la pâte s’étaler

comme un fluide visqueux.

Le même matériau réagit donc d’une manière très différente lorsqu’il est

soumis à une sollicitation très rapide (en le faisant rebondir sur le sol) ou lorsque la

contrainte est appliquée pendant un temps très long. Dans le premier cas, le temps

de sollicitation est inférieur à un temps caractéristique du matériau, les composants

élémentaires n’ont pas le temps de se déformer de manière importante et on observe


44

une réponse élastique. En revanche, lorsque le temps de sollicitation est plus grand

que le temps caractéristique, on observe une réponse de type visqueux.

Cette réponse complexe d’un matériau soumis aux contraintes peut être

reconstruite sous forme d’un système mécanique modèle, composé des éléments

élastiques et visqueux. La réponse élastique du matériau est modélisée par des

ressorts et celle visqueuse par des amortisseurs ou pistons [122;123]. Le ressort

réagit instantanément en encaissant une déformation proportionnelle au stress

appliqué. À l’échelle des petites déformations, une relation linéaire force-déformation

s’applique en accord avec la loi de Hooke :

σélastique(t) = E ε(t) (1.4)

où σ et ε représentent respectivement le stress appliqué et la déformation encaissée

[122] Le facteur de proportionnalité E est le module d'élasticité ou le module de

Young du matériau. Il est mesuré en Pascal (Pa) (1Pa = 1N.m-2). Le piston se

comporte comme un liquide newtonien, i.e. la viscosité modélisée est indépendante

de la vitesse de déformation ε’. Le piston présente une réponse en retard par

rapport à l’application du stress. Il se déforme à vitesse constante pour répondre au

stress qu’il subit, et sa relation stress-déformation est donnée par :

σvisqueux(t)=η ε’(t) (1.5)

où η est la viscosité mesurée en poise (P) ou en Pa.s. Avec 1Pa.s = 10 P.

I.2.4.2 Modèles mécaniques.

Le modèle le plus simple de matériau viscoélastique consiste à additionner les

contraintes d’origine élastique et les contraintes d’origine visqueuse :

σ(t)=σélastique(t)+σvisqueux(t)=E ε(t)+η ε’ (t) (1.6)

Une représentation graphique de ce modèle, dit solide de Kelvin-Voigt (Fig.

1.20), est l’association en parallèle d’un ressort et d’un piston. On peut également

associer en série un ressort et un piston (modèle du liquide de Maxwell) (Fig. 1.20),

dans ce cas, les déformations élastique et visqueuse s’additionnent et les contraintes

sont identiques, soit :

ε’(t)=η

σ

dt

dσ

Edt

dε

dt

dε+=+ 1visqueuxélastique

(1.7)


45

Fig. 1.20 : (À gauche) Modèle mécanique d’un solide simple dit de Kelvin Voigt représenté

par une association en parallèle d’un ressort élastique et d’un piston dissipatif. (À droite)

modèle de Maxwell pour un fluide viscoélastique simple.

I.2.4.3 Loi de comportement sous stress : Fluage.

Dans une expérience de fluage, le matériau est soumis, à partir d’un instant

donné, à une contrainte constante σσσσ0. La déformation εεεε(t) est reliée à la contrainte

par la fonction fluage f(t) :

εεεε (t) = f(t) σσσσ0 (1.8)

La fonction fluage a la dimension de l’inverse d’une contrainte. Pour le solide

de Kelvin-Voigt, la fonction fluage a pour expression :

(1.9)

où J = 1/E est la complaisance élastique et ττττ est le temps de relaxation défini ci-

dessus. Le solide de Kelvin-Voigt a un comportement élastique aux temps longs

(t>>ττττ), après un régime transitoire dont la durée est définie par ττττ. Il s’agit d’une

élasticité retardée par la présence de l’élément visqueux et inversement

proportionnelle au module élastique E (Fig. 1.21).

Pour le liquide de Maxwell, la fonction de fluage est :

(1.10)

Aux temps longs, le comportement est celui d’un fluide newtonien avec une

viscosité ηηηη : la déformation augmente linéairement avec le temps. La différence avec

un fluide newtonien correspond à la présence d’une élasticité instantanée aux temps

courts (t <<ττττ) (Fig. 1.21).


46

Fig. 1.21 : (à gauche) Fonction fluage d’un solide de Kelvin-

Voigt (à droite) Fonction fluage d’un liquide de Maxwell.

Ces deux modèles constituent une description assez simple de la mécanique

de la matière dans ses deux états, solide et liquide. Par rapport à cette échelle de

classification, les tissus présentent des comportements combinés. Ces modèles

simples ne pourront donc pas être à même d’expliquer et de décrire complètement la

complexité des tissus. Ainsi, certains tissus se comportent comme des solides

viscoélastiques aux courtes échelles de temps et comme des liquides visqueux aux

longues échelles de temps. Les comportements liquides aux temps longs ont permis

la mesure de certains paramètres physiques tels que la tension de surface (Chapitre

3) et la viscosité (Chapitre 4) et ensuite de prédire les comportements individuels et

d’enveloppement mutuel des tissus ou des mélanges de cellules. Le chapitre 5 sera

l’occasion de s’intéresser à l’énergie élastique de ces « solides » aux temps courts,

et à la façon dont cette énergie sera dissipée et mènera à des écoulements aux

temps longs.


47

Chapitre 2

Materials and Methods

When embryonic tissue fragments or cell lines from near confluent plates are

dissociated into single cells using trypsin treatment and subsequently reaggregated,

they form cell aggregates or spheroids. These cell aggregates constitute an

interesting model system of tissues for different studies in embryology, cancer

research or tissue engineering. The aim of this PhD thesis was to quantify the

physical properties of cell aggregates and to study the role of cytoskeleton/cadherin

link in these properties. For that purpose, we needed various experimental

developments summarized in this chapter:

- The installation of a culture room well equipped to ensure the handling of cells

in good physiological conditions necessary for their survival

- The establishment of experimental protocols for the formation and manipulation

of aggregates, adapted to each cell type and each type of experiments (fusion

rounding up, shape relaxation…).

- The development of a compression plate apparatus (tensiometer) recording the

shape of a compressed aggregate and the forces acting on it in order to measure its

surface tension.


48

II.1.Strategy, Cell lines and Aggregate preparation method

As we wanted to test the DAH hypothesis, and especially wanted to see if the

cytoskeleton was able to affect tissue cohesiveness, we searched in the literature for

a cell line which has been modified by biomolecular engineering so as to express the

same cadherin level as the original cell line but whose cadherin-cytoskeleton link has

been impaired. Our first try was with Chinese Hamster Ovary cell lines CHO,

transfected to express cadherin or truncated cadherin (i.e., cadherin, with no

intracellular domain). As we have encountered problems with this cell line, we have

used another type of cells which will appear to have the same interest as the CHO

cells (i.e., same cadherin level of expression and for one of the derivative clones the

link between the cadherin and the cytoskeleton impaired). These were F9 cells line.

II.1.1. CHOVE / CHOVEtr cells

Chinese Hamster Ovary (CHO-K1) cells have been transfected to express

Vascular Endothelium-cadherin GFP or a truncated form of this cadherin (whose

cytoplasmic part had been completely deleted) [66]. They were grown at 37°C with

5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (41965-039, GIBCO) supplemented

with 10% Foetal Bovine Serum (2902 P-241021, Biotech GmbH), 1% antibiotics

(penicillin streptomycin, GIBCO Invitrogen corporation, Cat. no. 15140-122) and

400µg/ml geneticin (GIBCO Invitrogen corporation, Cat. no. 10131-027).

In order to check the stability of the transfections, we have performed (thanks

to karine Ferri and G. Gillet, IBCP Lyon) a western blot analysis which showed that

the mother CHO-K1 clone doesn’t express VE cadherin in contrast to CHOVE and

CHOVEtr which expressed the same amount of cadherin. However, this global level

of expression reflect a much more diverse reality. The level of expression was really

inhomogeneous among cells on a petri culture dish, especially after several days in

culture, as if cells were progressively losing their capacity to express cadherin, even

if some selective medium has always been used. However this progressive loss did

not change enormously their cohesiveness properties they always were able to form

aggregates. In the same way, non transfected CHO-K1 cells were as well able to

aggregate. Consequently, we thought that the cohesiveness of the different CHO

tissues was at least partially maintained by integrins/extra cellular matrix adhesion

between cells. Indeed, CHO-K1 cells natively express α5β1 integrin, which was

showed to be able to mediate strong adhesion in a cell aggregate [40]. Our suspicion

was reinforced by some other experimental facts; formed aggregates present a rapid


49

and enormous adhesion to untreated glass substrates; aggregate time of formation

was much longer than for some other cell types: more than 4 days in hanging drop.

In addition, we suspect that CHO aggregates presented some deviation from liquid

behaviours, even at very long time scale, making it impossible to seriously test DAH

using this cell line (see some preliminary results in annex 2).

II.1.2. Mouse embryonic carcinoma F9 cell

Mouse embryonic carcinoma F9 cell line and their derivatives were a generous

gift from A. Nagafuchi (Institute of molecular embryology and genetics, Kumamoto

univ., Japan) [109]. Cells were maintained in DMEM (41965-039, GIBCO),

supplemented with 10% foetal bovine serum (2902 P-241021, Biotech GmbH) and

1% antibiotics (penicillin streptomycin, GIBCO Invitrogen corporation, Cat. no. 15140-

122), in plastic tissue culture dishes pre-coated for 15 min with gelatin (2%, Sigma

G1393) diluted to 0.2% in PBS.

II.1.2.1 F9 cell vs F9(αααα−/−−/−−/−−/−)

As was shown in the introduction, the link between cadherin and actin is

mediated mainly through catenins [124;125]. α-catenin, associates with the carboxy-

terminal region of the cadherin cytoplasmic domain via β-catenin to form a functional

cadherin-catenin cell adhesion complex [126] (see chapter1, Fig. 1.6). This Cadherin-

cytoskeleton interaction via catenins is essential for cadherin to act as cell adhesion

receptors [125;127;128]. Nagafuchi’s lab who was interested in the biological role of

this catenin in cell adhesion and differentiation produced F9 knocked out cells on the

two alleles of the alpha catenin genes. We will note this cell line F9(α−/−). Interestingly,

the loss of α-catenin does not change the level of cadherin expressed by F9 cells

[129] as shown by the western blotting and Immunoprecipitation analysis of Fig.

2.1A. Not only was the total expression of cadherin in these two cells lines the same,

but also their level of expression at the plasma membrane [129]; it is almost

impossible from the staining images presented in Fig. 2.1E-F to distinguish one cell

line from the other.

The F9(α-/-) mutation does not prevent in particular the same organisation of

cadherins at cell-cell junction.

This was completely different from what happened in the case of the CHOVEtr

cell line where the total cytoplasmic part of the cadherin has been deleted. In this cell

line, cadherins are present at cell-cell junction but are not uniformly distributed, and

form large clusters on the cell membrane [66]. To prevent such a huge aggregation,

a link to the cytoskeleton has to be maintained in a minimal way, as it seems to be


50

the case for F9(α-/-) cells. Despite, the fact that F9 and F9(α-/-) aggregates present the

same morphological appearance, the measurement of their cohesiveness will reveal

that this catenin modification however plays a crucial role. Moreover F9 cells

aggregate faster than CHO ones and the resulting aggregates displayed a perfect

liquid behaviours at long time scales.

All this made of F9 and F9(αααα-/-) aggregates the perfect experimental system to test the DAH predictions.

Fig. 2.1 : Immunological and morphological differences between F9 and F9(α-/-) cells. (A),

western blotting analysis of each cell clone with anti-E-cadherin, anti-α-catenin and anti-

β-catenin mAbs. (B), immunoprecipitation analysis of each cell clone with anti-E-cadherin

mAb. E, E-cadherin; α, α-catenin; β, β-catenin [129]. (C) and (D), phase contrast image of

F9 (C) and F9(α-/-)(D) adherent cells showing different morphologies: parental F9 cells form

small and compact colonies while F9(α-/-) present a scattered morphology, suggesting

dysfunction of their cadherin-catenin adhesion. Bar, 50µm. (E) and (F), immunostaining

with the anti-E-cadherin mAb ECCD-2 of α-catenin positive control cells (similar to F9

cells) (E) and F9(α-/-) cells (F): the antigens are concentrated in the boundary between cells

in both case. Bar, 25µm [130].

II.1.2.2 GFP Hist F9 cell line

In order to observe cell sorting and cell engulfment in between these two cell

lines, we wanted to have one of them expressing a fluorescent protein so as to be

able to distinguish them from one another very easily under a regular fluorescence


51

microscope. Histone GFP DNA was again a generous gift from A. Nagafuchi.

Detailed on this vector can be found in [131].

For the transfection step, we followed the same protocol as described in [131];

expression vectors were transfected using the lipofectamine 2000 system (GIBCO).

We used a 24-well culture plate for transfection. One day after transfection, the

transfected cells were transferred to two 10-cm culture dishes: one dish contained

1/2 of the transfected cells and another 1/20. As transfection was successful, we

found many colonies even on the 1/20 dish. Two days after transfection, culture

medium was exchanged for one which contained antibiotics for selection. In this

case, 400 microgram/milliliter G418 was used. Culture medium was changed

everyday for a week. And then, medium change was done every two or three days.

Two or three weeks after transfection, we were able to isolate colonies (Fig. 2.2).

In Culture

F9aggregate

50 µm

100 µm

In Culture

F9aggregate

50 µm

100 µm

Fig. 2.2 : Phase contrast

(left) and fluorescence

images (right) of

transfected F9 cells (F9).

(Top) an isolated clone of

adherent F9 cells in

culture dish. (Bottom) an

aggregate of F9 cells.

The cell line obtained from one of the Hist-GFP F9 clone which was mainly

used for our experiments will be further denoted as F9.

II.1.3. Nocodazole Effect

Another way of testing the hypothesis according to which the cytoskeleton may

have a role to play in cell cohesiveness as measured by surface tension was to play

on cell contractility using drugs. This work is still under progress, and we will present

in the context of this thesis only preliminary results obtained using nocodazole. This


52

drug is well known as a microtubule disrupting agent, which indirectly increase cell

contractility by activating the rho kinase pathway.

Rho-kinase acts downstream of the small GTPase Rho; it is well-known to

activate Myosin II and leads to an increase in cell contractility [132].

Depolymerisation of microtubules activates Rho [133] and therefore increases

actomyosin contractility [134;135], and, in turn, enhances cell adhesion [136]. This

enhancement in contractility can be as strong as to result in a reduction of the cell

volume and therefore of the cell aggregate one as illustrated in Fig. 2.3.

Fig. 2.3 Cell aggregate contraction under nocodazole effect. 24 aggregates were prepared with rigorously the same condition, and then 8 aggregates were transferred to wells with culture medium (Control), 8 to wells with 100nM and 8 to 1µM of Nocodazole respectively. We measured their radius two hours after.

However the action of this drug is not so easy to interpret as microtubules are

also involved in actin-based protrusion. Microtubules growth has been proposed to

activate small GTPase Rac that induce actin polymerization [137] and then, as a

result, favours membrane protrusion against cortical contractility [138;139]. So as a

result, cell-cell reorganization inside a tissue is expected to be much less important.

These two points, cell contractility and membrane protrusion will be discussed in

details in chapter 4.

II.1.4. Cell aggregates formation protocol

Cell culture Petri dishes were washed twice with phosphate buffered saline

solution (PBS, Gibco/Invitrogen) and treated with trypsin (Gibco/Invitrogen) 0.1%, for

2 min in the case of F9 and their derivatives and for 5min for CHO cells and their

derivatives. Cell solutions were subsequently centrifuged at 611g for 5 min. Then the

resulting pellet is dissociated into fresh medium and diluted at 105 cells/ml. Using this

solution of dissociated cells, we made 15 µl hanging drops [40] (Fig. 2.4). After 2

days the newly formed aggregates were transferred to 24 well plates containing fresh


53

Fig. 2.4 : Hanging drops used for the preparation of cell aggregates. Inset, scheme of the

hanging drop with cells (in white) aggregating under gravity at the bottom of the red

drops. Left, top view of the petri-dish with drops on the cover. Right, side view with the

drop and its image on the cover in dark and light pink respectively.

medium and then incubated on a gyratory shaker at 120 RPM (yellow line 4mm

diameter) or on an agar bed (see section II.4) with 5% CO2 at 37°C for 24 to 36h in

the case of F9 and their derivatives and for 3 to 4 days in the case of CHO cells and

their derivatives. This protocol reproducibly resulted in three-dimensional multicellular

spheroids of similar sizes. For experiments outside the incubator, the cell aggregates

were transferred to CO2 independent medium (18045-054, GIBCO) at 37°C.

II.1.5. Storage

All cells were cryopreserved at early passages and were stored until needed for

experimental procedures. Following trypsinization, cells were pelleted via

centrifugation and resuspended in a freezing medium containing 10% dimethyl

sulfoxide (SIGMA, D8779), 10% DMEM (41965-039, GIBCO) and 90% FBS serum

(2902 P-241021, Biotech GmbH). Cells were transferred to cryogenic screw cap vials

(Fischer Scientific, PA) and incubated in at -20°C freezer for 24 hours. After 24

hours, vials were transferred to a -80°C freezer or to a liquid nitrogen tank for long

term storage.

For studies on the role of surface tension in development, dissected embryonic

cells were used. As we only had time for preliminaries studies, all the results

concerning these primary cells will be presented in Annexe1.


54

II.2. Dissected embryonic cells

II.2.1. Embryonic zebrafish cells

The experiments were conducted in collaboration with G. Krens from C.P.

Heisenberg Lab (Max-Planck-Institute for Molecular Cell Biology and Genetics,

Dresden) and V. Laudet (IGFL, ENS Lyon).

II.2.1.1. Fish stocks

Wild-type embryos were obtained from TL, and AB zebrafish lines. Maternal-

zygotic one-eyed-pinhead (Mzoep) mutant fish were used to obtain embryos

consisting almost exclusively of ectodermal cells [140]. Embryos were grown at 31 °

C in Danieaus medium and staged according to [75].

II.2.1.2. Injections of mRNA and morpholino oligonuclotides

To generate mesoderm progenitors, one-cell-stage wild-type zebrafish embryos

were injected with cyclops (cyc) mRNA (100 pg) to induce mesendodermal cell faith

and 2 ng casanova (cas)antisence morpholino oligonucleotides (MO) (GeneTools) to

inhibit endodermal cell faith [141;142]. For ectoderm progenitors, embryos were

injected with 100pg lefty1 (lft1) mRNA or Materna Zygotic (MZ) one eye pinhead

(oep) mutant zebrafish [143]. The specific identity of germ-layer progenitors was

previously confirmed by in situ staining of the injected embryos [85]. These injections

allowed efficient induction of mesoderm and ectoderm progenitor types.

II.2.1.3. Aggregates formation

For all experiments embryos were manually dechorionated during cleavage

stages (0,5-2,5 hours post fertilization (hpf)) and kept in 1x Danieaus medium buffer

at 31°C. At high to oblong stage (3-3,5 hpf), the animal poles of the embryos were

dissected manually from the yolk sac, using watchmaker’s forceps and the resulting

tissue fragments were transferred into 2%-agarose-coated petridishes with fresh 1x

Daniaus buffer to round up. Rounding of the tissue fragments (explants / aggregates)

usually took 30 minutes, where they were transferred to 2% agar coated 96 well

plates containing 150 ml CO2-independent DMEM/F-12 1:1 buffered in 15 mM Hepes

and supplemented antibiotics (Penicillin (100 U ml-1) and Streptomycin (0.1 mg ml-1)).

One explant/aggregate was placed per well. Fetal Calf Serum (FCS) was added to

the DMEM/F12 medium in concentrations varying between 1- 10%, as indicated in

the text. The explants ranged in diameter between 0.25 - 0.35 mm and were kept at

31 degrees until used for compression analysis.


55

II.2.2. Embryonic chicken cell retina

Fertile White Leghorn chicken eggs were incubated at 37°C and 95% humidity

for 6 to 9 days. Dissections and dissociations were performed according to previously

published method in [144] Briefly, dissociations of dissected tissue fragments were

conducted in PBS at pH=7.2 containing trypsin (0.25%-1mM EDTA) for 10 minutes at

37°C. After dissection and trypsinization, cell solutions were subsequently

centrifuged at 611g for 5 min then the resulting pellets were mechanically dispersed

by gentle pipetting in a fresh BME medium (41010, Gibco). Cells were reaggregated

by shaking them slowly in 12-well plates 160 RPM containing culture medium with

10% fetal calf serum FCS (3302—P281501, biotech GmbH) [145] at 37°C. Small

aggregates start to appear 10 to 16 hours later. The obtained aggregates, using this

protocol, suffer from a great dispersion in shape (elliptical, spheroid and irregular

shape) and size (50 µm to 400 µm of diameter).

II.3. Imaging cells through aggregates

II.3.1. Sections through fixed aggregates

Fig. 2.5 : (A)-(B) Section through two adjacent F9 cell aggregates after fixation with

paraformaldehyde 4%. (A) β-catenin staining (B) The same couple of aggregates imaged

in phase contrast. (C) F9 and (D) F9α(-/-) aggregates stained with β-catenin.


56

Making sections through aggregates allows to investigate internal

morphogenetic of cell structures and to prepare fixed cell monolayers for histological

staining. These sections were realized by S. Bodennec (postdoc at LPMCN) in

collaboration with H. Mertani (Centre Léon Bérard, Lyon). The detailed protocol

(fixation, paraffin embedding and subsequent removal, immunofluorescence) is

presented in annex 3. Fig. 2.5A-B shows a section through two adjacent aggregates.

Cells are densely packed with only a few holes. In the aggregate periphery, cells

seems more flattened than inside where they have polyhedral shapes and are

sometimes organized with a foam structure. Fig. 2.5A,C-D illustrate the kind of

staining we could obtain in order to identify and localize the proteins implicated in

adhesion between cells. We checked here for instance, that the expression of β-

catenin was identical at the plasma membrane in F9 and F9(α−/−).

II.3.2. Two-photon confocal microscopy 3D imaging

Two-photon laser scanning microscopy was performed in collaboration with J.

C. Vial and B. van der Sanden (LSP, Grenoble). We used an Olympus BX50WI

upright microscope coupled to a Biorad MRC 1024 confocal scanhead with a

nondescanned detector to increase the observation depth. A 800-nm excitation beam

from a Tsunami femtosecond Ti:Saphire laser (Millenia V, Spectra-Physics) was

focused on the surface of the spheroids using a 20× water-immersion objective (0.95

NA, Xlum Plan Fl Olympus). The beam scanned the xy plane to acquire 512×512

pixel images in 0.9 s. Variation of the observation depth (z-scan) was realized by

moving the motorized objective vertically.

Our objective with these experiments was to visualize cell contours deeply

inside live aggregates. For that, cells possessing a homogeneous internal

fluorescence as our F9 fluorescent cell line are not suitable. On the other hand, we

demonstrated that the soluble dye sulforhodamine B (SRB) injected at a

concentration of 8 µg/ml in the culture medium quickly diffuses inside aggregates and

stains the inter-cellular space with intensity comparable to the SRB present outside of

the aggregates (sides of Fig. 2.6, Fig. 2.7). In addition, the cell membrane of dead

cells becomes permeable to SRB [146], as confirmed by experiments showing that

photodamaged cells submitted to a high laser power (700 mW) are completely filled

with the dye (central zone of Fig. 2.6). This demonstrates that SRB provides in the

same time a cell viability assay.

In order to evaluate the damage due to compression of aggregates between

two plates, we have developed a small compression apparatus, designed to be


57

mounted on the stage of the two-photon microscope with a thermostated circulating

water bath to control temperature at 37°C (Fig. 2.7A-B, Fig. 2.8).

Fig. 2.6 : The contrast between alive cells and photo-damaged cells by application of a

high laser power (700w) on a restricted zone of a compressed aggregate. Bar 25µm.

Fig. 2.7 : Two-photon microscopy assay. (A) and (B) shows the different components of

the compression apparatus mounted on the stage of a two-photon microscope. (C), (D)

and (E) Two-photon microscopic images of the middle plane of a F9 aggregate

compressed between parallel plates at successive compression rates of 0% (A), 27% (B)

and 57% (C) respectively. Images were acquired 2 min after each compression. The

extracellular space is stained with the freely diffusible sulforhodamine B dye. Bar 100μm.


58

Fig. 2.7 shows the middle plane of a F9 aggregate before (C) and during

successive compressions of 27% (D) and 57% (E). At start, the aggregate presents a

few very bright dots often smaller than intact cells. We believe these bright spots are

fragments of cells, dead before the beginning of the experiment. Their number does

not increase after successive compressions. We therefore conclude that up to at

least a 57% compression rate, compression does not lead to the destruction of cells

within the aggregate.

Fig. 2.8 : Compression apparatus for two-photon microscopy assay (realized by H. Ferret,

LPMCN). During an experience, the aggregate is compressed between two glass

compression plates immersed in a culture medium reservoir containing 50 ml of CO2

independent medium and in contact with the heated water circulation. The upper plate is

attached to and lowered by a z-directional actuator of 1µm resolution. The lower plate is

glued to a plexiglass disk.


59

II.4. Segregation assays

II.4.1. Cell-sorting assay

The sorting pattern of mixed F9 cell types was assessed within a unique

multicellular spheroid containing two different clones of dissociated cells. Briefly,

300µm spheroids were prepared from mixtures of F9/ F9(α−/−) and F9/F9 (as a control

to assess that the transfection did not change the physical properties (surface

tension, viscosity) of the aggregate. They were then incubated at 37°C with 5% CO2

for 24 to 36 hours on a gyratory shaker (120 RPM) or in static conditions (i.e., on an

agar bed, SIGMA-A12967, to prevent aggregate/surface adhesion) . Cell-sorting was

evaluated every 12 hours by observing the cells at the surface of the aggregate on a

Nikon Eclipse 2000 fluorescence microscope.

II.4.2. Tissue-envelopment assay

The ability of F9 and their mutant F9(α-/-) cell types to spread upon one another

was assessed by bringing into contact two different types of aggregates: one only

composed of F9, the other one made uniquely of F9(α−/−). The two spheroids were

placed side-by-side on an agar bed (in 96-well plates). Spreading of one spheroid

over the other was evaluated using the Nikon Eclipse 2000 fluorescence microscope

every several hours.

II.5. Fusion and rounding up assay

For viscous liquids, various simple geometries are available to estimate from

the analysis of aggregate shape relaxation kinetics the ratio of the surface tension σ

to the viscosity η. Fusion and rounding up assay are two methods we used for this

purpose. Using a motorized microscope (Nikon Eclipse TE 2000 E), we recorded,

with a period of 10min, the fusion of several couples of symmetric aggregate

prepared under the same physiological and experimental conditions. We also used

the same imaging method for recording the shape relaxation of an elliptical

aggregate towards a spherical one with a period of 30 min between two recorded

loops.

For these experiments, aggregates were transferred into 48 well plates,

precoated with 1% of agar to prevent adhesion, and filled with a CO2 independent

medium (Gibco/invitrongen). In order to assure the required temperature during

7 The protocol of SIGMA was respected in the preparation and deposition of a 1% agar gel.


60

experiments, the microscope was enclosed in a home-made polystyrene chamber,

heated thanks to a radiator controlled by a circulating water bath thermostated at

37°C. We waited several hours for the thermal equilibrium to be achieved before

starting the experiment.

II.5.1. Fusion of two symmetric cell aggregates

When two identical viscous drops of radius R0 are placed in contact they slowly

fuse together (Fig. 2.9). The initial evolution of the radius X of the disc of contact

between drops may be described by the following equation as a function of time t:

ησ

0

2 tRX = (2.1)

where σ is the surface tension of the drop with the external medium and η the drop

viscosity. This equation is based on the balance of the work of surface tension and

the viscous dissipation. All other forces, including gravity, are neglected. In the

original work by Frenkel [34], there was a mistake about incompressibility, detected

by Eshelby (page 806 of the discussion of ref. [35]) who removed the extra prefactor

2/3 on the right hand side. We also found a calculus error on the line above his

equation 7 and removed an extra pre-factor 1/π. Our corrected formula therefore

does not contain any numerical pre-factor. This is consistent with a more extensive

calculation of the fusion process at large times [36].

Fig. 2.9 : Schematic view of the initial regime of fusion of two identical cell aggregates.

II.5.2. Rounding up of a free elliptical aggregate

As predicted from hydrodynamics and capillary laws of viscous liquids, the

elliptical deformation d (Fig. 2.10) during the rounding up of an elliptical droplet

follows a decreasing exponential law with a characteristic liquid time TLiq [144;147]

given by the following equation:

−=

LiqT

tdd exp0 and FLiq RT

σηβ= (2.2)


61

where RF is the final radius of a spherical aggregate, and β is a constant assimilated

to 0.95~1 in case of 3D cell aggregates [147].

Fig. 2.10 : Schematic view of shape relaxation of an elliptical cell aggregate towards a

spherical one. The decreased ellipticity was quantified by the parameter d= (M/m – 1).

Fig. 2.11 : Rounding of 3D chicken embryonic neural retina cell aggregates. Left: Images of

a small 9-day old neural retina aggregate initially elliptical that becomes rounded in 24h.

Right: Exponential relaxation of the deformation parameter d (ellipticity) as a function of

time for three different aggregate sizes.

A recent study [144] has shown that the shape relaxation kinetics of 2D and 3D

cell aggregates presented an exponential shape relaxation (Fig. 2.11) and that the

relaxation time was increasing with the size of aggregates enabling an estimate of

the ratio of tissue viscosity over tissue surface tension.

II.6. Liquid interfacial tension and apparent tissue surface tension

We designed and built our own compression tissue tensiometer (Fig. 2.12A).

This apparatus is often referred as a compression plate apparatus (CPA) [105]. It

records simultaneously the force resulting from the compression of liquid droplets or

tissue spheroids between two parallel plates and the side profile of these

compressed samples. Surface tension is measured by using capillary laws.


62

It was one of the main achievements of this thesis and I had to overcome

several technical problems to achieve with reliability surface tension measurements.

Some of these problems are summarized in annex 4. Here, I will present only the

final setup that we used to obtain most of the results presented in chapters 4 with F9

aggregates and annex 1 with zebrafish aggregates.

II.6.1. Description of the final system:

The lower compression plate (LCP) consisting of a 2 mm thick borosilicate

glass, is located at the bottom of a medium chamber. The upper compression plate

(UCP), made of a cover glass, is connected through an inox wire (diameter 0.8 mm)

to a copper-beryllium cantilever (spring constant k~0.35-0.45 N/m calibrated by

putting droplets of water of known volume on the cantilever). By pushing on the lower

Fig. 2.12 : (A) Schematic view of our compression tissue tensiometer. (B) Force signal as

measured by the copper-beryllium cantilever and an eddy current position sensor: the

peaks of force just after a compression are followed by a force relaxation period of about

10 min. We measured the force and shape parameters for the surface tension evaluation at

least 30 min after the compression step. (C) Deposited aggregate on the LCP before

compression (D) then during compression between the two plates for measuring surface

tension.

thin cylindrical rod, an electronic micromanipulator (MP285, Sutter Instrument) moves

the LCP in the z direction with respect to the chamber and to the UCP to compress


63

aggregates. The cantilever deflection is measured with a noncontact eddy current

position measurement apparatus (DT 3701-U1-A-C3, micro-epsilon). The medium

chamber is made in Teflon-inox with a pair of slide glasses glued on the sides to

enable optical visualization. It is filled with liquid (i.e., culture medium for aggregates)

and it has a hole that fits perfectly to the lower thin cylindrical rod supporting the

UCP. It can be moved in the x,y,z directions to center the sample on the optical axis

by the same micromanipulator. The complete setup is mounted in a thermally

isolated external chamber to maintain the desired temperature (37°C for aggregates)

using a thermal resistance, which is controlled by a Lakeshore 331 apparatus.

Aggregate profile is recorded using a binocular (MZ16, Leica) and a digital

camera (A 686M, Pixelink) (Fig. 2.12C-D). The lightning is adjusted by a KL 1500

LCD cold light source (Schott) through “flexible tubes.” The whole setup is controlled

with Labview and image analysis is performed with Matlab. The medium and external

chambers in which samples are deposited contain openings to facilitate

manipulations. In order to determine the interfacial tension between two liquids, the

inner chamber containing the LCP was first filled with the liquid of lower density (e.g.,

oil) before deposition of one liquid droplets (sizes ranged from 500 µm to 1000 µm in

diameter) of higher density (e.g., water) on the LCP.

For cell aggregates (300µm to 600µm in diameter), the medium chamber was

filled with CO2 independent medium (Gibco/Invitrogen), the free surface is covered

with a thick mineral oil layer to prevent evaporation. Glasses surfaces are carefully

cleaned with soap and pure water (sonicated 30 min with 2% Microson detergent,

Fisher Bioblock, France). They are first made hydrophobic by silanization with

perfluorosilane (ABCR, F06179) then incubated in 10 mg/ml Pluronic F-127 (Sigma)

for 5 min and finally rinsed briefly with water and dried. This treatment ensures a

minimum of aggregates adhesiveness.

The experiment starts by raising the LCP and compressing the droplet between

the two plates (Fig. 2.12D). Each droplet or aggregate was subjected to at least four

compressions. For tissues, we waited 30 min between two compression steps in

order for the aggregate to reach force and shape equilibrium. In (Fig. 2.12B), we

present the force signal as measured by our cantilever and position sensor: the peak

of force just after a compression is followed by a force relaxation period of about

10min. Chapter 3 is devoted to a detailed description of the capillary laws used to

analyze experiments and of the imaging analysis methods.


64

II.6.2. Resolution

The displacement sensor combined to the deflector has a resolution on the

relative detected force change better than 0.1µN (half of the peak-to-peak noise on

the obtained signal). On an F9 aggregate, we record typically a 1µN force plateau

during the first compression Fig. 2.12. But on very low tensile ectodermal zebrafish

cell aggregates, such a resolution was necessary.

Fig. 2.13 : Ectodermal zebrafish cell aggregate force signal during 3 successive

compressions of 50µm separated by 3min. The red line is a gliding mean over 100 points.

Finally, we noted small but remarkable decrease in noise on the recorded

signal while the force acting on the deflector was increasing. A part of this noise has

a mechanical origin and could be related to the continuously vibration of the medium-

air interface. Another part of the noise recorded could be due to active cell

fluctuations, the cells are more compressed, and one could thought, that the more

compressed the less fluctuations there will be. This of course would be a very

interesting point to investigate further.

Compared to similar apparatus already existing, our tensiometer displays some

advantages. In contrast to other setups which require several hours for changing

from one aggregate to the other, thanks to the large range of displacements of our

manipulator, our system offers much more easy and convenient manipulations. In

addition, its resolution and optics enable very accurate measurements of

surface tensions.


65

Chapitre 3

Measuring accurately tissue surface tension

Tissue surface tension allows the quantification of cell-cell cohesion and was

reported to be a powerful indicator for the cellular rearrangements that take place

during embryonic development or for cancer progression. The measurement is

realized with a parallel compression plate tensiometer using the capillary laws.

Although it was introduced more than a decade ago, it is based on various

geometrical or physical approximations. Surprisingly, these approximations have

never been tested. Using our own tissue tensiometer, we compare the two currently

used methods to measure tissue surface tension and propose a third one, based on

a local polynomial fit (LPF) of the profile of compressed droplets or cell aggregates.

Several compression experiments of water drops in mineral oil (W-O), air bubbles in

culture medium (A-M) and embryonic cell aggregates in culture medium (C-M) are

presented. We show the importance of measuring the contact angle between the

plate and the drop/aggregate to obtain real accurate measurement of surface tension

when applying existing methods. We can suspect that many reported values of

surface tension are greatly affected because of not handling this parameter properly.

We show then the benefit of using the newly introduced LPF method, which is not

dependent on this parameter. These findings are confirmed by generating

numerically compressed droplet profiles and testing the robustness and the

sensitivity to errors of the different methods.


66

III. 1. Introduction: TST measurements, for which purpose?

As discussed in chapter 1, at long time scales (hours or days depending on the

cell type), certain embryonic tissues mimic the behavior of highly viscous liquid

droplets [110]. They can round up into spherical shapes, fuse when they are brought

into mutual contact [147], sort out … All these processes are driven by surface

tension σ and resisted by viscosity η [147]. Interestingly enough, these two

quantities are accessible experimentally. Tissue surface tension (TST) can be

measured using a compression plate tensiometer [105] while the apparent viscosity

follows from the analysis of aggregate shape relaxation kinetics [92;144;147] (see

chapter 4).

For biological applications, tissue surface tensiometry is a new technology to

explore fundamental issues regarding cell-cell and cell-substratum interaction in (i)

morphogenesis, (ii) cancer progression and (iii) tissue engineering. Foty and

Steinberg [148], Marga et al. [149] have recently reviewed these issues, which we

briefly summarize here.

(i) The analysis and sorting/envelopment behaviour of germ layer progenitor

cells in amphibians [150] and zebrafish [113] suggests that TST (measured in these

studies) is involved in guiding germ layer morphogenesis during gastrulation.

Downregulation of E-cadherin levels in the later study leads to a decrease in the

measured surface tension and a corresponding reversal of germ layer positioning in

cell sorting experiments.

(ii) It is generally assumed that the invasiveness of cancer cells largely

depends on a loss of cell cohesion. Cadherins have been linked with transition to

malignancy for a variety of tumors. In particular, the expression of E-cadherin often,

but not always, inversely correlates with tumor aggressiveness [148]. However, for

brain tumors, it was shown that dexamethasone mediated decreased invasiveness

correlates with increased TST (i.e., cohesivity) but not with N-cadherin expression

[151]. Surface tension represents a global property of a tissue that may depend from

other interactions than the only cadherin-cadherin interactions. αααα5ββββ1 integrin-

fibronectin interactions can indeed mediate strong cohesion [40]. The interactions of

a cell with the surrounding matrix are also, of course very important to control the

invasive properties of tumors [152].

(iii) Tissue engineering aims at reproducing morphogenesis in the laboratory,

i.e., to fabricate replacement organs for regenerative medicine. It has been shown

that the liquid properties of some tissues, in particular the capability to fuse or


67

reaggregate, may be used to self-assemble cellular aggregates into 3D living

structures [149;153;154]. TST and viscosity are parameters that can be used both

experimentally and theoretically to control and predict this self- or re-assembly. In

addition, surface tension can also strongly influence the ability of tissues to interact

with other biomaterials [155].

III. 2. The different methods to measure TST

III. 2.1. A few lines on capillarity

Although a new method based on centrifugation followed by axisymmetric drop

shape analysis has been recently described [101], the most widely used quantitative

method to measure TST (σ) is by compression plate tensiometry [105;152]. At long

time scales, once elastic forces are relaxed, σ is measured assuming that cell

aggregates verify the same physical laws of capillarity as liquid droplets.

When a droplet is compressed between two identical plates (i.e., with identical

surface properties), it has a rotational symmetry around the z-axis and a reflection

symmetry with respect to its equatorial plane, in which it has the two principal radii of

curvatures R1 and R2 shown in Fig. 3.1. R3 is the radius of the droplet’s circular area

of contact with the compression plates. The compression force F applied to the upper

(or lower) plate is balanced by two capillary forces each proportional to σ. The first

one is due to the excess pressure inside the drop due to curvature given by the

Laplace formula:

∆p =σ(1/ R1 +1/ R2).

When the radii of curvature are positive as it is generally the case with cellular

aggregates, this first term is always positive (i.e., repulsion between the two plates).

The second term is proportional to the drop perimeter and is always negative (i.e.,

attraction between the two plates). For an arbitrary horizontal plane, at mechanical

equilibrium, the equilibrium condition when evaluated along the vertical axis, implies

F =∆p.A− σ.P.sinφ. Here A and P represent the cross-sectional area and the

perimeter of the liquid drop in this plane respectively, and φ is the angle between the

horizontal and the tangent to the profile of liquid drop at the plane.


68

Fig. 3.1 : (A) Diagram of a liquid droplet compressed between two parallel plates to which

it adheres with a contact angle θ. At equilibrium, R1 and R2 are the two primary radii of

curvature, at the droplet’s equator and in a plane through its axis of symmetry,

respectively. R3 is the radius of the droplet’s circular area of contact with either ot the

compression plate. H is the distance between upper and lower compression plates. (B)-(D)

Snapshots of compressed droplets: (B) Air bubble (R1 =282 µm) in culture medium; (C)

water droplet (R1 =207µm) in mineral oil and (D) mouse embryonic cell aggregate (R1

=297 µm) in culture medium. Red curves corresponds to the calculated profile with a


69

second order polynomial fit (LPF method), dotted lines correspond to the calculated

profiles with the exact Laplace profile method (ELP, green) and the circular arc

approximation (blue). The latter is not represented in order to appreciate the embryonic

aggregate roughness in (D). (E) Force signal as measured by our cantilever and eddy

current position sensor: the peaks of force just after a compression are followed by a force

relaxation period of about 10 min. After [156]

For the horizontal boundary plane located just underneath the upper plate, A= πR3

2,

P=2πR3 and φ =θθθθ8. Thus, by using the Laplace formula for ∆p, one obtains:

2

3 3

1 2

1 1 -2 sin PF R R L

R Rπ π θ σ σ

= + =

(3.1)

where LP is therefore just a geometrical parameter depending on R1, R2, R3 and θθθθ. Similarly, for the median plane of the compressed drop at H/2, where H is the

compressed drop height, one has A= π R12, P=2π R1 and φ =π/2. The force depends

on the geometrical parameter LM:

11

2

1 M

RF R L

Rπ σ σ

= − =

(3.2)

These two equations (3.1) and (3.2) are of course equivalent as the force in

each droplet horizontal plane is conserved along the vertical axis. Let us examine

how to use them efficiently to get the more accurate and reliable TST measurements.

III. 2.2. The CA (Circular Arc) method

While R1 and F can be accurately measured, the determination of σ from either

one of these two equations requires also the measured values for R2 and/or θθθθ and R3

that can only be obtained with large errors. In earlier published studies this problem

has been circumvented by making the approximation that the lateral profile of the

drop is a portion of circular arc [103;113]:

2 2

3 1 2 2 - - ( /2)R R R R H= + (3.3)

In order to even simplify the analysis, plates are generally treated to prevent

aggregate/plate adhesion and it is assumed that θ=0°, R2=H/2 and R3 = R1 −R2 [150].

8 Note that the angle θ defined here is the complementary of the contact angle in capillarity. We use here the

convention used in previous TST papers.


70

In all the previous reported studies except for Norotte et al. [157] and our recent work

[156], this CA method was used probably by matching manually on the screen the

complete contour of the aggregate by a printed “abacus” as no details were given on

the numerical method. We have also tested this approximation but R2 was obtained

by a fit of the recorded profile (see LPF method section below) using the function

fitellipse.m under matlab (http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/15125). We

have calculated the surface tension using this circular arc approximation in three

different ways: (i) using Equation (3.2), where the force is expressed at median plane

(CAcm method), (ii) by combining equations (3.1) and (3.3), where force is

expressed on plates, with θ=0° (original CA method), and (iii) by combining equations

(3.1) and (3.3) using the measured θ (CAcp). R1 is obtained in the same way than for

ELP, LPF and CA methods (see description in the LPF section). When it is needed,

i.e., for the CA and CAcp methods, H is obtained as explained in the ELP method

section.

III. 2.3. The ELP (Exact Laplace Profile) method

Norotte et al. [157] have used another method based on the exact solution of

Laplace equation and on the only measurements of θθθθ, H and R1. When gravity is

neglected, a dimensionless parameter α is calculated by solving numerically the

following equation:

( )( )

1/ 21

2

2

1 ,

= ( ) 12 1

H xf dx

R xθ

β α θ

αα α

− = − + −

∫ (3.4)

where ( ) ( ) ( )( )2, sin( ) sin 4 1 2β α θ θ θ α α α= + + −

and σ is then given by

( )12 1 EF R Lπ α σ σ= − = (3.5)

They claim their method is weakly sensitive on the angle, as long as θθθθ≤20°.

They also claim that the previously existing method, based on the circular arc

approximation (CA method), fails to give consistent results in a certain range of the

compressive force or contact angle. But they did not present any quantitative

analysis on the geometrical parameter sensibility of the different methods.

We have tested these two reported methods and performed a complete

quantitative and comparative analysis. Concerning this ELP method, we have found


71

(see results) that it is not so insensitive to θθθθ which is difficult to measure accurately.

Impose θθθθ ≈0° may be sometimes difficult because cell aggregates may adhere to the

plates after prolonged compression despite the fact that a coating minimizing

adhesion is used. In our experience, θθθθ was not zero and varied during a compression

experiment. It is a difficult parameter to measure optically with high accuracy

because of a number of interfering factors, such as; the large field of focus, the

imperfect parallelism between plates, light multi-reflections or optical aberrations.

For the determination of H, it is important to use the deflection signal to

evaluate precisely the position at which the upper plate contacts the aggregate. We

found that this position can be hidden on the image due to slight inclination of upper

compression plate, or of optical axis or of illumination. With our tissue tensiometer, H

is determined with a typical resolution of about 2 µm. Finally R1 is measured

accurately on the images of compressed aggregates as explained in next section.

III. 2.4. The LPF (Local Polynomial Fit) method

Our motivation was to establish a more direct and robust method to measure

the absolute values of TST accurately and reliably independently of the contact

angle. For that purpose, we use Eq. (3.2) to calculate surface tension from the

measurement of the two radii of curvature R1 and R2 (Fig. 3.1A). This requires the

analysis of the aggregate profile r(z) along vertical axis z. It is drawn by hand on the

right and left side of the aggregate. We did not make any automated contour analysis

because of inhomogeneities and varying lightning conditions during subsequent

compression steps.

A curve can always be approximated locally by a second order polynomial

r=az2+bz+c, the local radius of curvature is then given by R2=1/2a. The narrower the

window on which the profile will be fitted, the lower the residual dr=rpredicted-rdata on the

fitted profile and the better the evaluation on the curvature will be (see Fig. 3.3). Of

course, we are limited by the image resolution on the contour and, in the case of

aggregates, by the surface roughness. This prevents us from using two small

windows. In practice, this window is adjusted between one fourth and one half of the

whole side contour. R1 is then taken to be half of the distance between points having

the highest r-coordinates on both right and left fitted contours.

For each side, the error of R1 is set to the maximum value of the residual dr

and the error on R2 is given by the 95% confidence interval given on the polynomial

fit using the curve fitting toolbox of matlab. The error on both sides is averaged and

divided by 21/2. It is about 3 µm and 10 µm for R1 and R2 respectively.


72

III.3. Critical comparison of existing methods using experimental data and numerical tests

III. 3.1. Experiments with pure liquid droplets or bubbles

We first compressed air bubbles in culture medium (CO2 independent medium,

37°C). These bubbles are easily nucleated by pouring cold medium on the

tensiometer plates already at 37°C and waiting 2 hours for temperature stabilization.

The complementary contact angle θ is small when glass is clean and hydrophilic. But

because glass surfaces are frequently re-used, θ may change from one experiment

to the other, or after successive compressions. Only for half of the compressions

investigated (n=20 compression steps corresponding to 3 different bubbles), we

could really obtained an angle 5θ ≤ ° for all four recorded glass/air/medium contact

lines (Fig. 3.1B). The angle was comprised between 10° and 25° otherwise. Fig. 3.2A

shows the plot of geometrical parameters LP, LM or LE defined in Eqs. (3.1), (3.2) and

(3.5) for each method as a function of the deflection transmitted to the upper plate

(δ=F/k where F is the force). The points in the graph correspond to three different

bubbles. This plot displays a linear relationship between δ and L for each method as

expected from capillary laws. The slope k/σ gives the surface tension σ. However,

with ELP and CA methods, points are much more dispersed and the surface tension

values (σ=56±2.6 and 39±3.1 mN/m respectively9) are significantly different from a

direct measurement using the wilhelmy plate pressure sensor of a Langmuir trough

(NIMA, England): σ=51±2 mN/m. In contrast, the LPF method provides the correct

value, with the lower error: σ=51.2±1.2 mN/m. When it is calculated at the median

plane, the circular arc approximation (CAcm) gives also a reasonable agreement

although the value is slightly lower (σ=48±1.4 mN/m). These differences are due to

the fact that some methods are independent of θ which is measured with errors but

others not.

9 Errors ∆σ are calculated from the 95% confidence interval on fitted slopes by the curve fitting toolbox of

matlab (relative errors on slopes are the same as relative error on σ as the relative error on k is negligible).


73

Fig. 3.2 : Plots of the geometrical parameters LP, LM and LE as a function of cantilever

deflection δ (A-D) or force F (E,F). Surface tension values (displayed in the legend in


74

mN/m) are obtained by taking the slope of the obtained linear fits, with LP, LM and LE

obtained as defined in Eqs. 3.1, 3.3, 3.5, and δ = F/k (with k~0.36 N/m for all experiments).

Air bubble in CO2 independent culture medium at 37°C (A), water droplet in mineral oil at

room temperature (B-C), F9 embryonic cell aggregate in CO2 independent culture medium

at 37°C (D-E) and chicken embryonic neural retina aggregate in CO2 independent culture

medium at 37°C (F). In the inset of (E), we show that the difference between the mean

measured values with each method is statistically significant. In the inset of (F), we show a

snapshot of compressed neural aggregate (bar, 200 µm). Abbreviations of the different

methods tested are as follows: ELP, Exact Laplace Profile; LPF, Local Polynomial Fit; CA:

Circular Arc; CAcm, Circular Arc with force calculated at median plane; CAcp, Circular Arc

with force calculated on plates. After [156]

We followed up our studied by compression analysis of water droplet,

immerged in mineral oil (Sigma) at room temperature. The complementary contact

angle was approximately θ=28±5 ° for the five investigated droplets, with minimal

changes from one compressions to the other. The original CA method that ignores

such a large angle (i.e., it uses Eqs. (3.1) and (3.3) with θ=0°!) gives clearly an

underestimated surface tension. The curve LP versus the deflection is not linear. But

if we use only one or two compression points as done in most reported papers

except for Norotte et al. (2008), the estimated surface tension can be more than two

times smaller than the expected one. It is for instance the case, if we use the point at

deflection 30 µm corresponding to nearly a 50% deformation (see dotted line in Fig.

3.2B). When the ELP and the CAcp (calculated on plates) are used with the angle

measured on images, they give similar results to the angle independent LPF method.

Values of surface tension are σ=18.5±1.5, 17.4±1 and 17.3±1 mN/m for ELP, CAcp

and LPF methods respectively. This is in agreement with reported values for water/oil

interfacial tension [157;158]. Fig. 3.2C shows the angle sensibility of ELP method

when angle is not properly chosen. In this case, the surface tension varies a lot,

σ=12.7±0.8, 13.0±0.8, 14.0±0.7, 16.2±0.7 and 20.8±2 mN/m for θ=0°, 10°, 20°, 30°

and 40° respectively. Note that the points are still linearly aligned even if the slopes

are very different! The error is not increasing particularly, and therefore one has to

keep in mind that a low error or a linear alignment as predicted by Laplace law is not

an insurance of correct surface tension measurement, using ELP method.

III. 3.2. Experiments with embryonic cell aggregates

Tissues display elastic behaviour at short timescales [119], which contribute to

the force signal shortly after a compression step. This elasticity is usually rapidly

dissipated and a force plateau is reached (see Fig. 3.1E). We have assumed here as


75

it was done in previous studies [106], that when this plateau is reached, the system is

at equilibrium, which enables the surface tension measurement (see a discussion

about the validity of this assumption in chapter 5)

When compressed, F9 aggregates show a complementary contact angle

between 20° and 30° on glass plates treated with Pluronic F-127 (Fig. 3.1D). We

present in Fig. 3.2D the results for one aggregate (n=4 steps of compression). With

such angle values, the non angle corrected CA method gives a much lower surface

tension value (σ=3.3±0.7 mN/m) than the angle independent methods: σ=5.3±0.7 and

5.6±0.8 mN/m for LPF and CAcm respectively (Fig. 3.2D). When the angle-

measurements from the image profiles are properly taken into account, ELP and

CAcp methods give similar values but with higher errors: σ=5.3±1.0 and 5.0±1.0

mN/m respectively. Alternatively, the choice of the correct angle may be done by an

adjustment of the compressions points of angle dependent and independent

methods. This provides a way to evaluate the complementary angle when image

profile is not clear because of very small (θ <10°) or because image is partially hidden

by for instance the upper plate, as in Fig. 3.1D.

To further show the statistical difference between the results obtained with the

usual CA method and the newly proposed LPF method we analyzed seven different

F9 aggregates, 23 compression steps (Fig. 3.2E). The mean surface value obtained

with the CA method is 3.5±0.3 mN/m compared to 4.9 ±0.3 mN/m for the LPF

method. The p-value obtained comparing the two results is inferior to 0.00110. This

indicates a very good reproducibility in the finite contact angle of these aggregates.

The seven investigated aggregates have diameters before compression in the range

of 372 to 585 µm. Their volumes are therefore comprised between 27.106 and

105.106 µm3 (i.e., a four fold increase). We can conclude that the surface tension of

these F9 aggregates is volume independent.

We finally confirmed our results on a different cell line: chicken embryonic

neural retina cells (Fig. 3.2F). The value of the contact angle was estimated to be

around 30 °. The results obtained are similar to the F9 ones. The surface tension

value with the CA method is 2.1±0.3 mN/m as previously measured [103] which is

again lower than for the ELP end LPF method (2.7±0.3 mN/m).

10 The comparison between surface tension values obtained with CA methods and the one obtained with angle

independent methods was done with a Kruskal-Wallis non parametric test. As the Kruskal-Wallis test was found

significant (P < 0.05), a Wilcoxon non parametric test was performed (R 2.6.0, R foundation for statistical

computing, Vienna, Austria). P values <0.001 were considered as significant and noted with three stars.


76

III. 3.3. Numerical tests In order to validate these findings, we have generated exact droplet profiles

following the study of [157]. For a given volume V, a given separation H between

plates, a given contact angle and surface tension (we used here σ=5mN/m), the

shape of the droplet and the force F exerted on the plates can be determined. We

have recalculated the surface tension using the different methods by

Fig. 3.3 : Tests of robustness of the different methods from a numerically generated exact droplet profile following Norotte et al. (2008) with a designated surface tension 5mN/m. (A) Residual and radius (inset) of the profile estimated by the different methods for here θ=0°, a deformation

parameter ε=Ho-H/Ho=0.32 (green, ELP method which gives the exact profile when contact angle is properly set; blue, CA methods showing a deviation near the plate; Red, profile from a polynomial fit in a central window). Surface tension evaluation as a function of the deformation parameter (B,C) for θ=0° (B), and θ=20° (C). In the later case we simulated compression and determined the surface tension with a deliberately incorrectly chosen θ, using the ELP method. After [156]


77

eventually introducing small errors in the input geometrical parameters (θ, see below,

and H, not shown) in order to simulate the ‘measurement inaccuracies’ of a real

experiment. Of course, the ELP method gives always the exact value when the

correct angle is introduced (black curves in Fig. 3.3B-C).

For a null complementary contact angle, one can appreciate in Fig. 3.3A the

deviation of the real profile (green curve) to the circular arc (blue curve). The

deviation is only localised in the vicinity of the plate but it results in a 15% error in the

determination of R3 used in Eq. (3.1) and thus in σ. This explains why the CA method

based on this equation has the largest error on the surface tension even when the

complementary contact angle is 0° (Fig. 3.3). When Eq. (3.2) is used, the error in σ

by using the CAcm or LPF method is introduced by the measurement of R2 itself.

Both methods underestimate σ because R2 is slightly overestimated. The deviation to

the real value (σ=5 mN/m) decreases for large compressions (i.e., large deformation

parameter ε=Ho-H/Ho where Ho is the uncompressed aggregate height). The LPF

method gives the best results when the proportion H/f of the profile around the

median plane used for the local second order polynomial fit is not too large: σ=4.88

and 4.58 mN/m for f=4 and 2 respectively for a large compression (ε=0.5). The CAcm

method gives an intermediate value 4.66 mN/m when using the full profile (f=1).

When the complementary contact angle is larger (i.e., θ=20°, Fig. 3.3C), again

the LPF method provides the best results for a narrow fitting window (f=4) followed by

the CAcm method (Fig. 3.3C). The error is even lower compared to the analysis

where θ=0°: σ=4.90 and 4.78 mN/m for the LPF (f=4) and CAcm methods

respectively for ε=0.5. Error is much larger with the ELP method when an error of

only 5° is introduced on θ: for θ=25°, σ =5.5 mN/m (i.e., 10% error). The CA methods

using θ=0° gives completely wrong results.

III. 4. Discussion

In this chapter, we have shown that when capillary laws are properly employed,

the three methods to analyze surface tension from compressed droplet (ELP, LPF

and CA) give similar results with slightly different errors. Nevertheless, each method

has a different sensibility to geometrical parameters making some of them more

robust than others.


78

III. 4.1. Examination of literature data

To date, except in the study of Norotte el al. [157], the circular arc

approximation method is the only one used to measure tissue surface tension. A

large but non-exhaustive list of papers is given in the introduction of this chapter.

Even when the deviation to the circular arc profile is evident near the plates (Fig.

3.3A), the radius of curvature R2 at median plane is correctly calculated. As a result,

the CAcm method which consists in a circular arc fit combined with the force Eq.

(3.2) at median plane provides very acceptable results (5-10% error on simulated

drops depending on contact angle and compression rate, Fig. 3.3B-C). The

simultaneous use of Eq. (3.1) with θ=0 and of Eq. (3.3) leads to some

inconsistencies when the complementary contact angle actually deviates from zero

The result is that the measured surface tension is systematically lower than the

actual tissue surface tension value, and can lead to an underestimation of more than

100% (Fig. 3.2B,D and Fig. 3.3C). One can therefore postulate that some of the

reported surface tension values are incorrect because of a finite contact angle.

Specifically, we have identified two studies where contact angles are visibly large

[106;113]. In a third one with CHO aggregates [40], there is no images of

compressed aggregates as most of the other reported studies. However, from our

own experiences, CHO aggregates are sticking and even “wetting” any surface due

to integrin-ecm interactions. A finite contact angle may explain why the authors

observed systematically a larger surface tension for the second compression than for

the first one. Indeed, in Fig. 3.2B, the slope of the dotted line intercepting the origin

(which is inversely proportional to σ) decreases when deflexion (i.e., compression)

increases. In most of these studies, polyHEMA was used to prevent cell/substrate

adhesion. We have tested this protocol and formed thick (i.e., several tenth of µm)

films of polyHEMA on glass surfaces. Aggregates indeed poorly adhere to it but they

also penetrate partially into the film making difficult a real evaluation of θ or H. For

that reason, we used Pluronic F-127 which adsorbs as a monolayer and also prevent

rather well adhesion11 but show a small but finite (complementary) contact angle.

Finally, it is important to stress that even if the errors on the surface tension appear

to be as low for the CA method as for the other angle independent methods, this

does not mean that the value obtained is correct as the capillary laws are not

properly used.

11 Aggregates do not stick to the surfaces when they are decompressed after a prolonged compression


79

III. 4.2. Recommendations for correct measurements

Inserting the correct angle in Eq. (3.1) allows a correct estimate of σ, when

using the CAcp method. However, there is no need to use Eq. (3.1) at the plane of

the plate, because this requires the input of four geometrical parameters R1, R2, θ and H, of which especially R2 and θ are usually measured with large errors. In contrast,

the ELP method, based on the exact solution of Laplace equation, is more robust

from a computational point of view. The resolution of Eqs. (3.4) and (3.5) is

numerically easy and does not necessitate a least squared fit of the radius of

curvature R2 as in case of LPF or CA methods. However, we found that an error of 5°

on θ introduces non negligible relative errors on the surface tension σ (about 10%).

Such an error is not particularly exaggerated for cell aggregates when θ is small

because cell aggregates are rough, not as regular as fluid droplets. The contact

angle may also change after several subsequent compressions. The ELP method

also requires the input of the aggregate compressed height H which may suffer

errors for instance due to optical aberrations, hidden part of the droplets. On the

other hand, if θ is well controlled or if some error on σ is acceptable, one can build a

tissue tensiometer under an inverted or upright microscope and record only H and R1

from the top view (not R2 from the side view) and use Eqs. (3.4) and (3.5). This may

enable to follow the cell reorganizations and motion during compression and to

measure σ at the equilibrium.

As a conclusion, when performing compression experiments, we strongly

recommend the use of an angle independent method that requires only the two

parameters R1 and R2. The CAcm method may have the lowest error when

aggregate is symmetric but rough. Otherwise, the proposed LPF method is robust

and provides the lowest error when the profile is smooth as the fitting window can be

narrowed. This method is a straightforward application of Laplace equation. R2 is

measured by a second order polynomial fit at median plane. While other methods

assume reflection symmetry with respect to equatorial plane, the LPF method deals

naturally with up-down asymmetries in the aggregate profile. Such asymmetries may

arise either because of a slightly titled field of view, non-perfectly parallel-aligned

compression plates, effect of gravity or because of differences in adhesion affinities

and contact angles with the top and bottom compression plates.


80

Chapitre 4 Physical properties of F9 tissues

Role of adhesion and Cytoskeleton

Several studies on embryonic tissues have attempted to characterize the

material properties of cell aggregates by a few physical parameters (surface tension

and viscoelasticity) [106;159;160]. We focus in this chapter on the comparative

physical properties of F9 cell aggregates and their α-catenin double knocked out

derivative (F9(α-/-)) in order to evaluate the effect of the cytoskeleton-cadherin bond to

the measured quantities. In the absence of external forces, F9 aggregates fuse and

round up to form spheres (see the supplementary movie M4). These processes are

classic examples of surface minimization processes, which as in ordinary liquids, are

driven by tissue surface tension (TST) [147;161]. F9(α-/-) cell aggregates have a lower

TST than F9 aggregates as measured with our compression plate apparatus

(tensiometer). The kinetics of the fusion of two symmetric aggregates is used to

evaluate the tissue viscosity. This quantity is similar for each cell line. In parallel, we

performed cell sorting and engulfment assays and showed that whatever the initial

condition F9 aggregates (with the higher TST) are enveloped by F9(α-/-).

We therefore confirm that TST is measurable and is a crucial quantity to predict

tissue mutual behaviours and organisation. However, our results contradict the

“second postulate” of the differential adhesion hypothesis (i.e., TST depends only on

the level of expression of adhesion molecules) as TST depends explicitely on the

cadherin-actin bond or on the presence of nocodazole (a contractile drug). We

believe that a differential contractility hypothesis (cytoskeleton mechanics or

actomyosin contractility) is likely to be the origin of TST.


81

IV.1. Surface tensions driven phenomena

When two aggregates are placed in contact, they can fuse, form an elongated

common aggregate that will then round up, and relaxes its shape toward a spherical

one. By analogy with the physics of liquids, these phenomena are driven by tissue

surface tension and opposed by tissue viscosity. When different cell types are mixed,

they can form one common aggregate and sort out (cell segregation phenomena).

According to the DAH, the equilibrium configurations can be predicted on the basis of

tissue surface tension (TST), measured by tissue tensiometry (Fig. 1.17) [103]. The

more cohesive cells occupy a central position rejecting the lower cohesive cells to the

external position. Let us now quantify these different phenomena in more details for

F9 and F9(α-/-) aggregates.

IV.1.1. Aggregate rounding up

It was shown that the ratio of surface tension to viscosity (σ/η) could be

estimated from the analysis of the kinetics of the shape relaxation toward a sphere of

an initially elongated aggregate [144]. Fig. 4.1 shows the slow rounding up of two

initially elongated aggregates of F9 wild type and F9(α-/-) knock-out cells respectively.

Fig. 4.1 : Rounding up of elongated cell aggregates. First line: a F9 cell aggregate of final

radius RF=190µm recorded for 600min. Second line: similar relaxation of a F9(α-/-) cell

aggregate, RF=195µm, bars 200µm


82

According to the hydrocapillary laws, during rounding up, the deformation

parameter d=(Major /minor)-1 is expected to decrease exponentially toward d=0

(perfectly spherical aggregate of radius RF) with a characteristic time τ∼ηRF/σ (see

material and methods). Experimentally, each cell type shows this exponential

behaviour but the F9 cell aggregate reaches d=0.1 in about 500 min while the F9(α-/-)

cell aggregate relaxation is slower (d> 0,2 at 500 min, Fig.4.2).

Fig.4.2 : Mono-exponential shape

relaxation of cell aggregates; Gray

circles: F9(α-/-) cell aggregate; Black

squares: F9 cell aggregate: Solid

lines represent fitted exponential

laws d=a*e-t/τ

for each data type.

Inset: (σ/η) calculated as equal to

the ratio (τ/RF) expected from

hydro-capillarity laws [147].

The values of characteristic times obtained were about 360 min and 770 min,

the ratios σ/η were about 0.5 µm/min and 0.25 µm/min for F9 and F9(α-/-) cell

aggregates respectively. Errors are not reported because we have not performed

many rounding up experiments (more experimental results with chicken neural retina

cell aggregate are presented in the annex 1).

IV.1.2. Aggregate fusion

Initially, our motivation to perform fusion experiments was to investigate

whether one can get with two different geometries (i.e., fusion and rounding up) the

same σ/η ratio. If this ratio is different, it indicates that aggregates behave not as

Newtonian fluids. However, we realized that the fusion assay gives more reliable

values of (σ/η) than the rounding up assay. First because we fit only one parameter

(i.e., the slope of the squared of the radius of contact between two aggregates versus

time, see Materials and Methods) instead of two for the non linear law for rounding

up. Second, because aggregates are not perfect fluids and the deformation

parameter is very sensitive to small deviations and asymmetries with respect to the

shape of perfect liquid droplets. Third, because the total time to complete rounding


83

up is about 10 hours, while fusion is completed in only a couple of hours for the same

F9 cell line (Fig. 4.3A).

The ratios σ/η in the fusion experiments were calculated according to modified

Frenkel’s model [161-163] as described in chapter 2. Briefly, the squared of the

contact radius X in the neck region is expected to be linear as a function of time, the

slope allows an evaluation of σ/η (Fig. 4.3C). We limited our measurement to

XLimit=(2/3)R0, the expected boundary for application of capillary law in case of two

liquid droplets [162], where R0 is the mean initial radius of two symmetric aggregates.

Fig. 4.3 : Fusion of two pairs of cell aggregates. A (first line): pair of F9 cell aggregates; B

(second line): pair of F9(α-/-) cell aggregates; Bars 100µm. Note that F9(α-/-) cell aggregates

appear to be rougher on surface than F9 cell aggregates. C: Linear evolution of the squared

of the contact radius as a function of time x R0 for three different pairs of F9 aggregates.

IV.1.2.1 Fusion of F9 and F9(αααα-/-) in culture medium

Figures Fig. 4.3A-B show images at different times of the fusion process for

pairs of F9 and F9(α-/-) aggregates in culture medium. The fusion of F9 cell

aggregates is obviously faster than the fusion of F9(α-/-). This result is confirmed by

Fig. 4.4 that summarizes the mean values of σ/η obtained for different experiments.

The ratio 0,48±0.10 µm/min for F9 cell aggregates is more than twice larger than the

ratio 0.22±0.02 µm/min for F9(α-/-) ones. These values are fully consistent with the

values obtained from the rounding up experiments. Therefore these aggregates do

not display a non Newtonian behaviour at least from the presented experiments.

Tissue viscosity values will be calculated independently and discussed together with

TST measurements at the end of this chapter.


84

Fig. 4.4 : Ratios σ/η evaluated

from the aggregate fusion assay.

The ratios are 0.48±0.10 (N=40),

0.22±0.02 (N=7) and 0.11±0.03

µm/min (N=6) for F9, F9(α-/-)

and F9(α-/-) treated with 1µM

nocodazole respectively. Error

bars are standard deviations, N

is the number of experiments.

IV.1.2.2 Fusion of F9(αααα-/-) in 1 µµµµM nocodazole

Many biological processes are coordinated by cytoskeletal elements such as

microtubules and filaments that can be strongly disrupted by several drugs [164].

Nocodazole is a cell-permeable drug that has been used in clinical cancer

chemotherapy for a long time. It has been reported as a microtubule disturbing agent

[165] as it completely blocks the self-assembly of tubulin containing or lacking

associated proteins. At concentrations comparable to 1µM, nocodazole also

depolymerises preformed microtubules in vitro [166]. Nocodazole has been used as

well to increase cell contractility [167;168]. The increase of cell contractility can be

monitored by measuring the deformation that cells exert on their substratum at focal

adhesions [169] or on neighbouring cells at adherens junctions (AJ) [170]. Such a

disruption of the proper functioning of cytoskeleton dynamics may help in the general

understanding of related cell functions.

Here, we used nocodazole in order to enhance cell contractillity in a cadherin

independent manner in order to evaluate whether it can affect the physical properties

of aggregates. For instance, we were interested in measuring whether this

enhancement could hold over the kinetics of fusion of F9(α-/-) aggregates in order to

be comparable to F9 aggregates and to compensate for the absence of α-catenin.

Due to lack of time and due to some difficulties in the preparation and the

measurement of TST with nocodazole, the results presented in this chapter are

incomplete and preliminar but promising.


85

As far as we are concerned with the fusion experiments in the presence of 1µM

nocodazole, the results went in an opposite way to our predictions (Fig. 4.4): F9(α-/-)

treated with nocodazole displayed a lower ratio than untreated F9(α-/-) aggregates

(see the discussion at the end of this chapter).

IV.1.3. Behaviours of F9/ F9(α-/-) pairs (spreading, sorting)

We have performed cell sorting and envelopment (engulfment) assays with F9

cells labelled with Histon-GFP (referred as F9 see Materials and Methods) and non

fluorescent F9(α-/-). The cell-sorting assay tests the ability of mutually but yet

differentially adhesive cell populations mixed together to sort out in distinct

anatomical domains, while the envelopment assay tests the ability of apposed

multicellular spheroids composed of distinct cell populations to spread upon one

another.

IV.1.3.1 Cell sorting assay

For sorting experiments, after trypsinization, fluorescently labelled F9 cells

were mixed at equal proportion with non fluorescent F9 or F9(α-/-). Mixed spheroids

(~300 µm in diameter) were prepared as explained in the Materials and Methods

section and incubated either in static conditions (agar bed) or on a gyratory shaker.

They were controlled from time to time under a fluorescence microscope for 72

hours. In case of the F9/F9 combination, we did not observe any sorting (Fig. 4.5B).

Fig. 4.5 : Final configuration 72 hours after mixing two types of dissociated cells in hanging drops. A and B display phase contrast and fluorescence images for a F9/F9 experiment. C and D display phase contrast and fluorescence images for a F9(α-/-)/F9 experiment. F9 is the GFP labeled F9 cell type. Bars 100µm.


86

In contrast for a F9/ F9(α-/-) combination, we could identify clearly two continuous

zones (Fig. 4.5C and D). The F9 cells form an inner mass with a “star” shape

enveloped by F9(α-/-) cells. This “star” shape was observed in most of the experiments

(N=10). We have no clear explanation for this shape but the experiment has to be

repeated with smaller aggregates in order to be sure there is no necrotic core in the

final aggregate.

IV.1.3.2 Envelopment assay

For envelopment assays, ~300 µm spheroids composed of either F9,

fluorescent F9 or F9(α-/-) were prepared first. They were then apposed in pairs (F9/F9

and F9/ F9(α-/-)) in hanging drops or on an agarose bed. The full engulfment process

until complete fusion took several days inside the incubator (37°C, 5% CO2). From

time to time, we controlled the pairs under the fluorescence microscope. When two

aggregates F9 and F9 were fused, they formed a larger aggregate that maintained

their boundaries (a “half and half” aggregate, Fig. 4.6B). In contrast, when a F9(α-/-)

aggregate was fused to a F9 aggregate, the former surrounded the latter and formed

a partial “sphere within a sphere” (Fig. 4.6D and E).

Fig. 4.6 : Final configuration

72 hours after two aggregate

were allowed to fuse. A-B

correspond to a F9/F9 pair of

aggregates, C-E to a F9(α-/-)/F9

pair of aggregates. A, C are

phase contrast images and

B,D,E fluorescence images. C, D

is the top view and E the side

vew of the same pair. F9 is the

GFP labeled F9 cell type. Bars

100µm.

Our results show therefore that both for sorting and envelopment assays the F9

wild type cells tend to the central position and are surrounded by the F9(α-/-) cells.

According to Steinberg’s DAH, TST reflects intercellular cohesion mediated by

adhesion molecules [45]. It guides in-vitro fusion, rounding up or sorting out into

segregated domains, the more cohesive tissue (of higher TST) being surrounded by

the less cohesive ones [103]. If we follow the DAH, the logical conclusion one can

draw from our sorting and envelopment assays is that F9 cell aggregates have a


87

higher TST than F9(α-/-) cell aggregates. We are now going to confirm this conclusion

by a direct measurement.

IV.2. Measurements of tissue surface tension

Tissue surface tension results are evaluated from compression experiments

using our tissue tensiometer (see Section II.6 of chapter 2) and the LPF method for

aggregate profile calculation (see Section III.2 of chapter 3).

IV.2.1. Surface tension of F9 cell aggregates

When spherical F9 cell aggregates are compressed at a (roughly) constant

compression height, we observe first a peak of force, and then the force quickly goes

down and finally reaches an equilibrium value within about 10 min. It is generally

assumed that during this period, cell rearrangements within the aggregates relax the

internal stresses and that the aggregates approach a new equilibrium configuration

[106]. We will discuss the validity of this assumption in details in the next chapter.

Here we will assume that TST is a true surface tension from a thermodynamical point

of view. Fig. 4.7 shows an example of force relaxation curve for a F9 cell aggregate

submitted to successive compression with a period of 30min.

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200 250 300

Time (min)

Force( µN)

force µN

Fig. 4.7 : F9 cell aggregate force signal during 6 successive compressions of 50µm

separated by 30min. At the end of the experimental period (i.e., near 250 min), the

compression was resumed. After each compression, the force relaxes in 10 to 15 min

toward a new apparent equilibrium (plateau).


88

0

1

2

3

4

5

6

7

150 200 250 300 350

Aggregate Radius (µm)

Surface Tension (mN/m

)

Fig. 4.8 : F9 cell aggregate TST measurements as a function of aggregate radius. Each

data point is the result of several compressions done on the same aggregate, and the value

of the surface tension is the slope of the curve Force Vs LM (see Section III.3 of chapter 3).

TST values are independent of the aggregate size (Radius). The error bars is given by the

95% confidence interval given on the linear fit of Force Vs LM data.

As described in chapter 3, the value of the force plateau and the associated

profile of the compressed aggregates enable the TST measurement. This

measurement was shown to be independent of the total compression rate up to 50%.

Here, we show that the TST of 6 different aggregates are clearly independent of the

aggregate size (Fig. 4.8). The mean value is σ=4,9±0,5 mN/m for F9 cell aggregates.

IV.2.2. Surface tension of F9(α-/-) cell aggregates

Similar measurements were performed with the double knocked F9(α-/-) cell

aggregates. Fig. 4.9 presents the force relaxation signal for a F9(α-/-) cell aggregate

compressed three times every 30 min with a fixed compression step of 100 µm. The

force plateau is reached in a timescale comparable to that of F9 cells (i.e., 10 to 15

min). The TST the F9(α-/-) cell aggregate is also independent of aggregate size with

an average value of 1,5±0,7mN/m lower than that of F9 cells (Fig. 4.10). We have

also verified that surface tension is independent of compression force exerted upon

it.


89

-5

0

5

10

15

0 50 100 150

Time (min)

Force (µN)

Force µN

Fig. 4.9 : F9(α-/-) cell aggregate force signal during 3 successive compressions of 100µm

separated by 30min. At the end of the experimental period (i.e., near 120 min), the

compression was resumed. After each compression, the force relaxes in 10 to 15 min

toward a newly apparent equilibrium (plateau).

0

1

2

3

4

5

150 170 190 210 230 250 270 290 310 330

Aggregate Radius (µm)

Surface Tension (mN/m

)

Fig. 4.10 : F9(α-/-) cell aggregate TST measurements as a function of aggregate radius. Each

data point is the result of several compressions done on the same aggregate, and the value

of the surface tension is the slope of the curve Force Vs LM (see Section III.3 of chapter 3).

Surface tension values are independent of the aggregate size. The error bars is given by the

95% confidence interval given on the linear fit of Force Vs LM data

IV.2.3. Effect of nocodazole on tissue surface tensions

Figure 4.11 shows the force signal obtained for a compressed F9 cell

aggregate in a culture medium containing 1µM nocodazole. Nocodazole was added


90

30 min before the beginning of the measurement. After each compression step, force

decreases but more slowly than untreated aggregates (Figs. 4.7 and 4.9).

-5

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Time min

Force (µN)

Force µN

Fig. 4.11 : F9 cell aggregate treated with 1 µm nocodazole compressed 3 times by a fixed

compression step of 50µm. Despite the plateau reached in about 10 min after compression

in last two presented cases, a continuously decreasing force was recorded.

Fig. 4.12 : Tissue surface tension values of F9 cell aggregates in its derivative. These values are 10±3, 4,9±0,5 and 1,5±0,7 mN/m for respectively F9 treated with 1µM nocodazole, F9 and F9(α-/-)

cell aggregates. Error bars represent standard deviations estimated on a series of compressions for each cell aggregate type.

Furthermore, the apparent equilibrium seen, 10 to 15 min after each

compression step for an untreated aggregate is not reached 30 min after the

compression. The continuous decrease of the force indicates a huge change in the

viscoelastic properties of cell aggregates in presence of nocodazole. This questions

the validity of the application of Laplace’s law if mechanical equilibrium is not

reached. Supplementary experiments with longer resting times between two

compressions are clearly needed to conclude on this point. We have nevertheless


91

estimated an apparent tissue surface tension value of about 10mN/m for F9 cell

aggregates in 1µM nocodazole by taking the force value 30 min after each

compression. This value is twice larger than that of the same F9 cell aggregates in

culture medium and more than four times larger than F9(α-/-) cell aggregates (Fig.

4.12).

IV.3. Discussion

IV.3.1. Surface tension depends on cytoskeleton contractility: DAH is contradicted

Among its goals, developmental biology aims to understand the mechanisms or

factors that direct tissue organisation during development. It is now well admitted that

some morphogenetic tissue organisation and the sorting out of embryonic cells have

a common explanation [44;65;103;148;171]. The differential adhesion hypothesis

(DAH) proposed that segregation phenomena of differentially adhesive cells should

lead to an equilibrium configuration of minimal surface energy (equivalent to a

maximal binding energy) where the most cohesive cells (of higher surface tension)

are surrounded by the less cohesive cells (of lower surface tension) like do two

immiscible liquids when mixed together. If energetically favoured, this equilibrium

configuration should eventually be reached from any initial starting configuration and

reveal the operation of a strict rule of transitivity [160].

Our own TST measurements (summarized in Fig. 4.12) reinforce this surface

energy minimisation principle (that we can call the “first postulate of DAH”) for an

embryonic cell line never investigated to date. The cell-sorting and envelopment

assays (Fig. 4.5 and Fig. 4.6) show that F9 with the higher surface tension are

always surrounded by F9(α-/-) cells. However, this segregation and this difference in

value of TST occur at constant level of expression of E-cadherin. According to the

“second postulate of DAH”, TST depends only on the expression of adhesion

molecules [45;148]. As as a consequence, our two cell lines should possess the

same TST and the resulting final aggregate after an envelopment assay should be

“half-and-half” as in Fig. 4.6B. Another experimental evidende that TST depends on

cytoskeleton contractility is the fact that in presence of 1 µm nocodazole (a

cytoskeleton contractile drug), the TST of F9 aggregates seems to increase as

compared to control aggregates in culture medium.

The “second postulate of DAH” is therefore strictly wrong. Our results show that

a differential cytoskeleton’s mechanics, or cytoskeleton contractility, affect directly the

value of TST and can predict the mutual envelopment behaviour of cell aggregates


92

(Figs.Fig. 4.5, Fig. 4.6, Fig. 4.12). That means that aggregate cohesivity is a

cytoskeleton dependent property.

It should be emphasised that we are not the first to claim that conclusion or to

report experimental data supporting it. Harris or Brodland have already postulated

that TST derives not from the strengths of cell-cell adhesions but rather from

contractile forces [85;116;117]. Jakab et al. [115] have measured a direct relationship

between TST and cell contractility with CHO cells. They have shown that TST

decreases linearly with the concentration of Latrunculin A (a drug that is known to

reduce cell contractility by F-actin destruction, [164]). The presence of this drug has a

second noticeable effect: it shortens the relaxation time of force curves during

compression (i.e., aggregates with a lower contractility become more fluid).

Curiously, the authors do not comment about the second postulate of DAH. They just

aknowledge that “latrunculin renders cells less adhesive (presumably by both

destabilizing the cytoskeletal attachment of CAMs12 and the cytoskeleton itself)”. But

the logical conclusion of this sentence is that cell cytoskeleton itself controls the TST

whatever the initial expression of CAMs.

Finally, one can briefly comment the argumentation of Steinberg’s group about

this second postulate of DAH. First they showed in sorting out assays using L cell

aggregates transfected to express N-cadherins in various amounts, that the cells with

the higher N-cad expression segregate internally to cells with a lower expression

[44]. Latter, they measured the TST of L cell aggregates transfected with not only E-

but also, P- or E-cadherin in varied, measured amounts A direct, linear correlation

was observed between TST and cadherin expression level [45;112;152]. But, it

could be that modifying cadherin expression modifies the mechanics of cytoskeleton

by recruitment of actin into adhesion sites as described in [127;172]. And one can

anticipate that modifying cadherin expression will also modify cell contractility as

myosin is a well known component of cell-cell junction [173]. So this experiment can

not be taken alone as a direct test of the DAH.

IV.3.2. Tissue viscosity does not depend directly on cell cohesion: an adhesion-protrusion competition hypothesis

TST measurements have been performed as a function of the age and tissue

type for dissected embryos [103;113;150], of the level of cadherin expression [45] or

more recently as function of drug concentration [115]. Other physical properties like

tissue viscosity were not so systematically investigated. Here, we combined TST

measurements and tissue surface tension driven phenomena (fusion, rounding up) to

evaluate an effective tissue viscosity for each clone of the F9 cell line. The calculated

12 Cell adhesion molecules


93

viscosity were respectively about (6,1±2)×105Pa.s and (4±2)×105Pa.s for F9 and

F9(α−/−) tissues. Despite the clear difference in TST, the effective viscosity of F9(α−/−)

aggregates is only slightly lower than that of F9 tissues. The difference is not

significant due to the large error resulting from two independent measurements of σ

and σ/η.

In the literature, two studies at 24 years interval reported independent

measurements of the fusion kinetics and of TST for the same chicken embryo tissues

[103;147]. We have therefore evaluated the following set of tissue viscosity

values: 1.47×106, 1.3×106 and 1.43×106Pa.s for 6-day heart, 6-day liver, and 7-day

neural retinal13 tissues respectively. Again, these values lie almost in the same

range while the corresponding values of surface tensions were respectively 8.5, 4.6

and 1.6mN/m (i.e., a factor of 5 between the two extreme values). Another recent

study measured both a TST of 16 mN/m (tensiometer) and a tissue viscosity of 2×106

Pa.s for cardiac cushion tissue from 6-day chick embryos [115]. Of course, tissue

viscosity of F9 cells, is about three times smaller than the one of chicken embryo

tissues, it may depend on the age of the embryos as we measured a significant

dependence of σ/η as a function of this parameter for neural retina14. But it seems

very unlikely that the tissue independent viscosity of chick embryos is fortuitous.

Perhaps the age at which all these chick embryos were used was a compromise

between large dissected tissues and still fluid aggregates. By aging, cells may form

more irreversible adhesive bonds or simply be less healthy in the aggregates.

Whatever this issue, the independence of tissue viscosity on the actin-cadherin

attachment for F9 and F9(α−/−) tissues is rather a surprising result. First because, in a

monolayer assay, it was shown that F9(α−/−) are much less motile than F9 cells [129].

For the less motile F9(α−/−) cells, one could therefore expect a larger viscosity (which

is the inverse of the mobility in colloidal physics). From another point of view, our

result shows that tissue viscosity is not proportional to cell cohesion (TST). In Potts

model simulations, Käfer measured a TST of 2D aggregates proportional to cell-cell

adhesion energy [174], and tissue viscosity was recently simulated by Mombach et

al. using the fusion geometry. Viscosity is well proportional to surface tension (J.C.

Mombach, personal communication).

However, we can propose the following explanation. It is reasonable to assume

that tissue viscosity has two main origins: (i) cell cohesivity and (ii) cell protrusion

13 We used, for the neural retina tissue, our own measurement of (σ/η) evaluated from the rounding up assay. 14 Unfortunately we could not properly measure TST for different ages of neural retina aggregates but in the

literature TST values are relatively constant or increasing by less than a factor of two after 3 to 4 days in culture

(Foty et al., 1996) (see annex 1)


94

activity. The larger is the cell cohesion, the more difficult it is for cells to break

adhesive bonds, to change neighbours and past over each other during the large

reorganization events that occur for instance during fusion: viscosity is therefore

proportional to cell cohesion. On the other hand, the larger is the protrusion activity

the easier and faster the cells can move relative to each other: viscosity is therefore

inversely proportional to cell protrusion activity.

Let us now examine what happens in our experiments. Impairment of

cytoplasmic domain of cadherin linked to cytoskeleton was reported to reduce

dramatically cell movement [14;125;175] and we have measured here that it

decreases cohesivity. Consequently, we think there is a kind of compensation

between the losses in cell protrusion activity and the weakness of the cohesivity for

F9(α−/−) cells which leads to keep the effective viscosity unchanged.

Interestingly, this hypothesis appears to explain also the twice lower value of

σ/η for F9(α−/−) aggregates in presence of 1µM nocodazole than in culture medium

(Fig. 4.4). Although, we have not yet measured σ for such an aggregate, we expect

a larger value than in culture medium as observed for F9 aggregates in the presence

or not of nocodazole (Fig. 4.12). Therefore, the viscosity of F9(α−/−) aggregates in

presence of 1 µm nocodazole in much larger than in culture medium. To explain this

fact, we briefly review the assumed role of microtubule and its polymerisation

inhibition by nocodazole.

We have shown that aggregate cohesivity depends on actin-cadherin

attachment and actomyosin cell contractility (F9 Vs. F9 with nocodazole TST

measurement), and probably as well on other intracellular biochemical signalling

pathways. As was discussed in chapter 2, it seems that in case of F9(α−/−)

aggregates the second effect is not compensated by the first. Preliminary tests done

using two photons microscopy showed that the dynamics of shape relaxation in a

compressed aggregate treated with nocodazole is slower than the relaxation of

untreated one arguing in favour of a lower protrusion activity in treated aggregates.

Notice that the two origins of tissue viscosity (cell cohesiveness and cell

protrusion activity) appear in the model of complex cellular fluid developed in the next

chapter (Eq. 5.11). Cell cohesiveness is related to an energy barriers ∆εT1, and cell

protrusion activity has two different features: an attempt frequency f and a fluctuation

energy ξ respectively. This double effect compensation hypothesis will be the subject

of next experimental work in the future.


95

Chapitre 5 Cell-cell rearrangements within

aggregates: Experiments & Modelling

We have seen that embryonic tissues do behave as viscous liquids at long

timescales (chap. 4) and that surface tension was a measurable parameter and a

relevant one to explain cell sorting (chaps. 1, 3 and 4).

However, even if differences in surface tension contribute to the driving force

for movement during morphogenesis, by themselves they reveal little about the time

course of such processes. The kinetics of cell sorting and tissue envelopment

depends upon the dynamical properties of cell populations that flow as complex

(probably non-Newtonian) fluids [106;120]. Their behaviour depends on the time

scale and duration of the measurements.

Existing models usually involve a phenomenological viscoelastic description

[106;118;119;176]. This is not surprising considering that major components of

individual cells themselves display viscoelastic properties [177-181]. However,

aggregates of cells might have richer behaviours than single cells. Under stress, they

could be deformed like single cells but they will as well be able to rearrange like liquid

foam [182]. Therefore, cell aggregates belong to the class of cellular materials [183].

As such, they can display viscous, elastic and plastic behaviours [184].

This chapter is reserved to present and discuss the complex fluid aspect of cell

aggregates. We start by a review of previous studies on viscous and elastic

behaviours, and then we suggest an experimental method to quantify plasticity of cell

aggregates. An analytical model based on the cellular structure of cell aggregates

has been developed in collaboration with P. Marmottant (LSP Grenoble) [185] This

model captures the complexity of their triple mechanical behaviour. Combined to our

experiments, it allows evaluating several relevant rheological parameters of cell

aggregates such as elasticity, characteristic stress, characteristic time and effective

viscosity under stress.


96

V.1. Elastic and/or viscous behaviours: previews studies

Viscoelastic characteristics of tissues have been observed in early

experiments performed by Phillips and Steinberg [118;119].They have mechanically

deformed cell aggregates obtained from several embryonic chick tissues by

centrifuging them against solid substrata. Elastic-solid and viscous-liquid properties

of cell aggregates have been characterized at different time scales.

For example, Leghorn embryo cell aggregates subjected to brief centrifugation

periods (8–16 min) flatten quickly (cell shapes flatten too), and round up quickly (in

<2 min) once centrifugal forces are removed, reaching a shape very similar to the

initial one [119]. Such brief centrifugation experiments provide some support for a

simple elastic-solid model in which aggregate shape changes are accompanied by

cell deformations rather than cell redistributions. In particular, since cell migration

tends to occur quite slowly, the very rapid aggregate flattening in response to

external force presumably requires cell stretching, these aggregates exhibit

considerable elasticity that presumably reflects the swift relaxation of cell stretching

as the centrifugal force is removed (Fig. 5.1).

In contrast, during prolonged centrifugation (1 day), Leghorn embryo cell

aggregates continue to flatten more slowly (while cells gradually regain their original

shapes) [118;186]; once centrifugal forces are removed, these aggregates round up

slowly (in ~1 day), like a viscous liquid (Fig. 5.1B). Furthermore, by applying

prolonged centrifugation, it was shown that an initially very flat aggregate (freshly cut

from an embryo) and an initially round aggregate (obtained after incubating and

shaking overnight the flat piece of embryo) adopted the same final intermediate

shape [119]. In this long term experiments, aggregate behaviour is difficult to explain

on the basis of purely viscoelastic-solid models (as the one of Fig. 5.2A) but can be

readily explained by viscous-liquid models where cells are able to flow and change

neighbours at long time scales (Fig. 5.2B).

Following their centrifugation experiments, Phillips and Steinberg showed that

embryonic cell aggregates behave like deformable solids during brief experimental

manipulations, but like viscous liquids in long-term organ cultures. Then, they

suggest explaining these material properties by modelling solid and liquid behaviours

separately using simple mechanical elements (See Fig. 5.2, symbols used: spring15

15 The spring has an immediat and linear response to stress. It tends to return to its not deformed initial configuration.


97

for elasticity, dashpot16 to describe a viscosity and slide wire17 to account for surface

tension.

Fig. 5.1 : Schematic of deformed aggregates and their corresponding cellular structure (A)

in case of viscoelastic solid (B) and elastic-viscous liquid. Modified from [119]. 16 The dashpot is a chamber containing a viscous material. It creates a viscous drag on the piston when it moves. The size of

the piston inside the chamber reflects the amount of resistance to movement. Thus, large and small pistons symbolize relative

high and low viscosity. 17 The movable slide wire models a perfect fluid liquid film. The sole result of withdrawing the slide wire is to create new

liquid surface area, a process which is opposed by the surface tension of the liquid. Therefore, the slide wire tends to return to

a minimum surface-free-energy position.


98

Fig. 5.2 : Models for cell aggregates using simple mechanical elements [119].

A simple viscoelastic solid (modelled by a spring in parallel with a dashpot,

Kelvin Voigt model, Fig. 1.20) does not take into account the bimodal (rapid, then

slow) shape changes of cell aggregates following the initiation and termination of

centrifugation. A simple viscous-liquid (modelled by a dashpot associated in parallel

with a slide wire to account for the surface tension, right part of Fig. 5.2B) can not

explain as well the bimodal shape changes of centrifuged aggregates. Moreover,


99

surface tension could hardly be expected to govern the abrupt aggregate shape

changes after sudden changes in applied force. At this time scale, the response is

dominated by elasticity.

Phillips and Steinberg thought about compound models. They associated the

fast-responding (low viscosity) viscoelastic solid in series with a slow-responding

(high viscosity) viscoelastic solid (Fig. 5.2A) or with a viscous liquid (Fig. 5.2B),

diagrammed in the right half of each model.

The compound viscoelastic solid model describes the bimodal character of

centrifuged aggregate shape changes by assuming that cells are compound

viscoelastic solids, possessing both quickly stretchable (less viscous) and slowly

stretchable (more viscous) elastic components (Fig. 5.2A). However, the tissue flows

- e.g. during the rounding-up of initially flat aggregates - must be accompanied by

rearrangements of component cells. Then an elasticoviscous liquid model was

established by replacing the slowly stretchable elastic-solid components postulated in

that compound solid model by slowly rearranging, viscous-liquid components.

The utility of these mechanical models is that they dissect the complex

behavior of cell aggregates into separable components with a minimal number of

mechanical elements. Here, the elasticoviscous-liquid model is favored to describe

tissues.

Other rheological studies were conducted by Steinberg and his collaborators

[106] in order to analyze the behaviors of living tissues in terms of standard models

of viscoelasticity and then get some quantitative details about tissue rheology. In a

first experiment, cell aggregates subjected to a very brief compression spring back

almost to their original shapes when released, whereas aggregates compressed for a

longer time do not [103], they display viscoelastic characters similar to that shown by

[119]. Then the authors suggest a method to separate viscous from elastic

contribution and obtain the purely viscous effect by recording the force relaxation of a

compressed aggregate, whose elasticity would have been completely dissipated by a

number of previous compression-decompression cycle. On the other hand,

aggregates subjected to uninterrupted force show combined viscous liquid and

elastic effects. The relaxation process is analyzed in terms of a generalized Kelvin-

body model of viscoelasticity including surface tension as shown in Fig. 5.3.

The system presents two distinct relaxation times. The force or stress

relaxation can be summarized as follows: the initial sudden compression produces

an instantaneous deformation of the slide wire element, u0, and of the two springs, u1

and u2, whereas the initial displacement of the dashpots (s1(0) and s2(0)) is zero.


100

Fig. 5.3 : Illustration of the

generalized Kelvin body used to

model the relaxation process [106].

µ1 and µ2 are the friction constant of

dashpots, k1 and k2 are the spring

constants. σ is the surface tension

implemented as a slide wire.

Considering the forces acting on the individual mechanical elements and

tanking in account that the overall shape of the aggregate is practically unchanged

during the force relaxation; therefore ut = u0 = const., whereas the deformations of

the springs decay while the dashpots gradually shrink. Finally, the equation

governing the relaxation of Ft takes the form

(5.1)

The solution of Eq. (5.1) is then

(5.2)

Here the two relaxation times are given by

(5.3)

As mentioned, at equilibrium all the stress is concentrated in the interfacial region.

The solution of Eq. 5.1 leads to

(5.4)

which implies that in the limit of large t, the only force which differs from zero is Fw.

In order to relate the model parameters derived from the measurements to

specific possible biological origin of relaxation process, they interpreted τ1 (~2 sec)

as the time scale characterizing the relaxation of the more or less elastic deformation


101

of each individual cell in the aggregate, together with whatever extracellular matrix

molecules might be present. This elastic stress is quickly dissipated and is followed

by a longer viscous response (relaxation time τ2~30-40 sec) in the course of which

individual cells move and the interior of the aggregate is reorganized. This motion

requires that cells break and reform their adhesive contacts with their neighbors. It is

interesting to notice that in this interpretation all the rearrangements occur in the τ2

timescale which is order of magnitudes smaller than the one obtained for the

characteristic timescales obtained for the rearrangement of cells during fusion

(chapter 4). We will discuss this point below.

Some other models have been introduced to explain typical results of

compression experiments without taking into account surface tension, and making

the assumption that cell aggregates are behaving as visco-elastic solid or as complex

fluid. [176;187].

In summary, there have been several hypotheses or theories built to explain

embryonic tissues behaviors sometimes in term of liquid and other in term of solid.

The mechanical models remain qualitative and the parameters used, could not be

easily linked to the mentioned true physical properties (cell elasticity, viscosity,

relaxation time, which could be measured independently). So no real test of the

models could be achieved. The challenge is to establish a model which account for

solid and liquid behaviors of cell aggregates and could link biological properties of

cellular materials, cell structure, geometrical tissues organization and its associated

processes with macroscopic significant and measurable physical properties. We will

describe a model that fill some of these criteria in section V.3 but before that let

present some new original and quantitative data on cell rheology within aggregates.

V.2. Experimental evidence of cell rearrangements

V.2.1. Direct visualization of stress induced cell rearrangements

Until now the only direct experimental evidence that cells could relax their

stress by changing neighbors was made by Phillips and Steinberg [118]. They

showed by electron microscopy that cells submitted to a brief centrifugation are

flattened while cells regain their original polyhedral shapes after more than one day

centrifugation (Fig. 5.4). But this experiment was done on fixed aggregates at these

only two extreme time points. No direct observation of cell displacements and

rearrangements is therefore available at intermediate time scales.


102

Fig. 5.4 : Cell perimeters traced from electron micrographs of cross-sectioned fixed

aggregates before (a), after five minutes (b) and after 35 hours (c) of centrifugation. The

width of each drawing corresponds to 15 to 20 µm. From [118]

Fig. 5.5 : Sketch of cell rearrangements into an inner zone of the middle plane of a

compressed cell aggregate. From (A) to (C) we indicate the cells by numbers to guide the

eye and aid to track the cells during rearrangement. 3min after the beginning of the

compression,cell 1 starts to go away into another plane(A). At the same time we could

identify stretching (B-C) of cells 4, 5, 6, 7 and 8 inside the imaging plane. 6 min after, 5

enter into contact with 4, when the interface 3/1 was broken down and gives place to the

establishment and growth of the contact between 2 and 4. (See supporting Movie M1)

Two-photon microscopy provides a means to visualize the shape of fluorescent

cells deeply inside aggregates. We have stained the intercellular space between cells

by the soluble dye sulforhodamine B (SRB) injected in the culture medium and

quickly diffusing inside aggregates. In addition, the cell membrane of dead cells

becomes permeable to SRB and these cells are completely filled with the dye (Fig.

5.5). Movie M1 shows a time series of two-photon microscopy images at the middle


103

plane of the same aggregate just after a 27% compression. Images are taken every

minute during 15 min, which is larger than the usual force relaxation period (Fig. 4.7,

Fig. 4.9 or Fig. 5.9). Although the aggregate’s external boundary is mostly fixed

during this relaxation period, cells inside it are clearly actively moving, changing

neighbors either in the same plane or from one plane to the other (i.e., some cells are

disappearing, others are appearing during that sequence, Fig. 5.5). These qualitative

experiments clearly validate the assumption that cells are relaxing some of their

stress by changing neighbors. A more quantitative analysis of the “amount of

rearrangements” in the course of time is needed (this is a complex task as optical

contrast is weak and rearrangements occur in 3D), but it is clear that rearrangements

start as soon as aggregates are compressed and continue during at least 15 min.

The fusion of a pair of aggregates was also recorded by confocal microscopy

and constitutes a spectacular example of cell rearrangements in the contact area

(see supplementary Movie M2).

V.2.2. Shape and stress relaxation experiments

It is possible to use the compression apparatus has a simple rheometer by

recording the shape relaxation of aggregates initially compressed to a given height

hcomp (corresponding to a deformation εcomp) during a time tcomp. To maintain a fixed

height during the compression, the elastic copper-beryllium cantilever bringing the

upper plate is replaced by a rigid pipe (See chapter 2 for more details on the set-up).

Experimentally, we quantify the aggregate deformation by its relative height

change, εtot= (hag-h)/hag. Here, hag is the aggregate’s initial height (i.e., diameter),

corresponding to the plate separation at the time of first contact; h is its current height

(h<hag). During compression, h is equal to the current plate separation hcomp; during

free decompression h increases.

For F9 mouse embryonic cell aggregates, Fig. 5.6 shows the height relaxation

after a prolonged compression (duration tcomp), followed by a sudden free

decompression (at time taken as t =0). All curves show an initial fast relaxation

(in~102s) but the aggregate does not recover completely its initial shape during a

recording time of about 30 min to 1 h (Fig. 5.6C). The compression has thus

promoted irreversible, plastic-like deformations. To recover the initial shape, it is

necessary to wait a much longer time, corresponding to the surface tension driven

rounding time (TLiq=6 h, see Section IV.1.2 of chapter 4). We will call apparent

plasticity this irreversible changes in the aggregate shape occurring at intermediate

times.


104

Fig. 5.6 : Aggregate height versus time for F9 cells during free shape relaxation after

compression. (A) Absolute deformation εabs(t) = (hag – h(i,t))/hag, where h(i,t) is the height

of the aggregate during relaxation after i compressions. For each of eight successive

compressions, the compression (tcomp=1 min, relative deformation εrel(0)=0.15) is

followed by a sudden decompression at t =0 during tdecomp =1,600 s. Each curve shows a fast

initial relaxation (~102 s) and then a slower regime. Plasticity is progressively stored

during successive compressions. (B) Same data, plotted as relative deformation

εrel(t)=(h0(i)–h(i,t))/h0(i), where h0(i) is the height of aggregate just before the ith

compression: h0(1)=hag, h0(i)=h(i–1, t=1600 s). For a given relative deformation, the

height relaxation mechanism seems the same for all compressions. (C) Absolute

deformation for a single larger and longer compression: εabs (0) =0.47, tcomp=10min. [185]

When successive compressions with the same compression time and the same

initial relative deformation are applied to an aggregate, plasticity progressively

accumulates (Fig. 5.6A). The relaxation kinetics appear very similar when plotted by


105

using, as a reference height for each compressed aggregate, the final height of the

previous step (i.e., relative deformation, Fig. 5.6B) rather than the initial aggregate

height. Cells store therefore the same relative plasticity during each compression and

release the same relative amount of deformation between two compressions. The

viscoelastic response depends only on the relative deformation rate not on the

history of the aggregate.

V.2.3. Results: plasticity as a function of compression time

and compression rate

Fig. 5.7 : Apparent plasticity. An aggregate is compressed at a fixed height hcomp during a

time tcomp and then the upper plate is removed and the aggregate is left free to relax (Movie

M3). Symbols indicate tcomp: black+, 1 min; gray ×, 5 min; black *, 10 min; gray open

squares, 30 min; filled squares, 60 min. Lines: prediction of Eqs. 5.14 and 5.15 plotted with

tc =5 h and τ*/E = 0.13; thin straight dotted line: prediction with tcomp =∞, i.e., εplastic =εcomp.

(Inset) Images of aggregates before compression (hag), during compression (hcomp), and

after decompression (hp); εcomp =(hag – hcomp)/hag, εplastic = (hag – hp)/hag. We define and

measure hp as the height h measured by convention after 440 s (Fig. 5.6). Each error bar is

estimated on only one aggregate decompression experiment with the uncertainty on the

optical measurement of hag, hp and hcomp; it depends on image resolution and aggregate

roughness as well as the possible slight aggregate rotation and translation after

decompression.

We choose conventionally to quantify the plasticity 440s after decompression

(Fig. 5.6C). Then the plastic deformation is given by εplastic=(hag – hp)/hag, where hp =


106

h (440s). Fig. 5.7 summarizes our experimental plasticity measurements as a

function of compression time as well as initial deformation of aggregates. One can

obviously notice that the higher or the longer the compression step, the larger the

remaining plasticity. We tried next to model this characteristic feature of cell

aggregate, by taking into account its visco-elastic-plastic behavior.

V.3. Cell rearrangement: fluctuations and stress

V.3.1. Global Description of the Aggregate.

At a scale much larger than the cell size, the aggregate can be characterized

by its state of deformation and stress (‘‘continuous medium’’ description). In a

parallel-plate compression experiment, we quantify the aggregate deformation by its

relative height change, εtot= (hag-h)/hag. The force exerted by the aggregate on the

plates is the cross-section area S of the aggregate through its midplane times the

internal stress of the compressed aggregate:

Fplate = (p+τ) S (5.5)

Here, p is the hydrostatic pressure and τ the elastic contribution to the stress,

which we study here. In the case of a drop made of a simple liquid (τ =0) with surface

tension σ, at equilibrium, p would be balanced by the drop mean curvature κ

[Laplace law: p = σ κ [157]].

V.3.2. Local Description at the Cell Level.

We assume the cell deformation (monitored by the relative cell size change,

εcell) and the stress are small enough to be proportional:

τ = E εcell (5.6)

where E is a stiffness (elastic modulus).

Within aggregates of inert objects such as drops (emulsions) or bubbles

(foams), a ‘‘T1’’ [182] occurs when the local stress is high enough to overcome the

energy barrier, ∆εT1 (Fig. 5.8), which depends on the interfaces tension and length. It


107

Fig. 5.8 : A neighbor swapping (‘‘T1’’ topological rearrangement [182]). (A) Sketch of

initially relaxed cells. (B) Flattened cells, with a deformation εcell due to stress. (Inset)

(Upper) Energy barrier ∆εT1 to overcome for a T1 to occur. (Inset) (Lower) Membrane

fluctuations with amplitude proportional to ξ. (C) after a T1: the cell arrangement has

changed, and the cell shapes relax, dissipating energy. [185]

marks the transition from a reversible (elastic) object shape change to an irreversible

(plastic) rearrangement, after which energy is dissipated [184] The energy barriers

are biased and easier to overcome in the direction of the stress [184]:

Rearrangements accumulate and result in a continuously increasing material

deformation, noted εrea, analogous to a flow. Because εrea does not correlate with

each object’s individual deformation, it has no direct elastic contribution to stress

(and we neglect the contribution to the stress arising from each object’s internal

viscosity).

Unlike inert objects, living cells overcome some energy barriers, with large

membrane shape fluctuations. These fluctuations are active and associated with

cytoskeleton dynamics (see movies 1 and 2), as is evidenced by studies on cells

treated with cytochalasin-B (an actin depolymerizing drug) [91;110]. An effective

temperature or, equivalently, a thermal energy scale ξ (also noted kT in the literature)

[110], describes not only the amplitude of these interface fluctuations [110;188] but

also the diffusion of a cell throughout an aggregate [189].

V.3.3. Mechanical Behavior of the Aggregate.

To capture the main physical ingredients that determine the aggregate’s liquid

behavior, we simplify its description. We consider here that all energy barriers have

the same height, that of a T1. We take the total deformation to be:

(5.7)


108

In the absence of stress, fluctuation-induced rearrangements switch back and forth,

with no flow on average. According to the Eyring model (26), the probability of

rearrangement in the direction of stress (i.e., a T1 that reduces stress) is favorable:

(5.8)

Here, f is the inverse of a time (‘‘attempt frequency’’): It is a phenomenological

quantity that characterizes how often fluctuations occur, only a fraction of which are

actually able to jump over energy barriers; τV is the work gained during a

rearrangement in the direction favored by the stress (V is of the order of a cell

volume) and δε the deformation associated with a rearrangement. In the direction

opposing stress, the probability of a rearrangement is less favorable:

(5.9)

The flow rate rea results from the difference between favored and unfavored rearrangement probabilities:

(5.10)

Here, both τ* and η* are continuous medium parameters (related to cell properties,

see Discussion). The characteristic stress τ* =ξ/V.δε is determined by the fluctuation

amplitude and cell size. The characteristic viscosity:

(5.11)

depends on τ* and energy barriers (but not on the internal viscoelasticity of cells).

V.3.4. Two Regimes

Eq. 5.10 relates the aggregate’s deformation and the applied stress; together

with Eqs. 5.6 and 5.7, it fully describes the aggregate’s mechanical response, i.e., the

time evolution of the flow for any given configuration (‘‘constitutive equation’’). The

characteristic stress τ* separates two regimes: that of fluctuation- and stress-induced

flows. If the stress τ is much smaller than τ*, the flow is due to fluctuations. The

viscous stress and the flow rate are proportional to each other, τ ≈ η*. rea (Eq.5.10).

The associated time scale over which stress disappears is:

(5.12)

If tC is smaller than or comparable with the duration of the measurement, at

large scale, the aggregate relaxes the stress like a simple (Newtonian) fluid of


109

viscosity η* (Fig. 4.3). Conversely, if tC is much larger than the duration of the

measurement, the flow is not measurable, and the aggregate seems to display a

solid (plastic) behavior.

In contrast, if the stress τ is larger than τ*, it overcomes energy barriers.

According to Eq. 5.10, the ratio of the viscous stress to the flow rate defines an

effective viscosity ηeff that is smaller than η*, by a factor:

(5.13)

The aggregate thus behaves like a ‘‘shear-thinning’’ fluid in which viscosity

decreases at higher τ.

V.3.5. Compressions: Predictions.

Eq. 5.10 applies to compressions or decompressions. We tried first to fit the

compression experiments. In this case, the distance h between plates is decreased

in a stepwise manner, then is kept constant to h = hcomp, so that εtot =εcomp, and tot=0.

This creates an initial elastic stress τ0=E.εcomp (Eqs. 5.6–5.10) then yield a first-order

differential equation. Its solution is the relaxation of stress with time t (Fig. 5.8):

(5.14)

Initially, the flow is in the stress-induced regime: The stress decreases faster

than exp(–t/tc). When the stress reaches τ*, the flow enters the fluctuation-induced

regime, where the stress decreases like exp(–t/tc).

In principle, after a sufficiently long compression time (tcomp = tc) all elastic

stresses ultimately disappear (Eq. 5.14). At this stage, the plates would only measure

the constant contribution arising from the hydrostatic pressure generated by the

aggregate surface tension. On the contrary, if tcomp is smaller (or not much larger)

than tc, the aggregate still stores some residual stress, like a plastic solid.

The shape of the relaxation curve is well fitted by presented model. The error

bar on fitted parameters is the 95% confidence interval of the nonlinear curve fit: All

fitted parameters have errors <10% of the estimated value and smaller than the data

dispersion.

During successive compressions the characteristic stress remains

approximately constant, τ* =2.4 Pa (Fig. 5.9Inset). In the curve of Fig. 5.9, the initial


110

Fig. 5.9 : Stress relaxation while the

compression plate is quickly displaced then

kept fixed (constant distance h: ‘‘step-

strain’’). Experiments showing the

immediate force relaxation of an aggregate

(initial diameter 500 µm) for the first

compression. Gray circles, measured stress;

solid line, fit from Eqs. 5.5 and 5.14 after

subtraction of the asymptotic plateau value

p(3). (Inset) Characteristic stress τ* and

stress relaxation time tc fitted to five (n= 1–

5) successive compressions.

stress is 9 Pa above the asymptotic plateau value: τ0/ τ*=3.8; hence, we estimate

that initially ηeff/ η* = 0.2. The characteristic time tc is of the order of a few hundred of

seconds. To understand the small value of this time scale (which might be associated

with cytoskeletal dynamics, see Discussion), in what follows we distinguish the

contributions from subcellular and cell levels to the dynamics.

V.3.6. Decompressions: Predictions.

In our model, during the compression time tcomp, rearrangements contribute to

the aggregate flow, and a rearrangement deformation εrea builds up (Eq. 5.10). At the

end of the compression, these rearrangements have relaxed the stress down to the

value τ(tcomp), predicted by Eq. 5.14. The stored elastic deformation therefore

decreases from εcomp to εcell = τ (tcomp)/E. Because the total deformation is kept

constant, we have (Eq. 5.7) εtot = εcomp = εcell(tcomp) + εrea: The decrease in elastic

deformation is exactly compensated by the rearrangement deformation. The

arrangement of cells has been modified irreversibly. Upon removal of the

compression plate, the aggregate surface tension drives rounding. At time scales

shorter than hours h does not come back to its original value hag. The residual

deformation, equivalent to an apparent plasticity with εplastic = εrea given by::


111

(5.15)

For several values of εcomp and tcomp, the model agrees (Fig. 5.7) with the

experimental residual deformation with only two parameters. The relaxation time is

tC=5h. The characteristic deformation is ε*=τ*/E=0.13. It means that the characteristic

stress τ* is reached if the aggregate is quickly compressed with a deformation of at

least 0.13.

V.4. Discussion

V.4.1. Energy Barriers and Non-released Elasticity.

Elasticity and plasticity arise from contributions of cell bulk (cytoskeleton and

organelles) and surface (actomyosin-rich cortex). Adhesion and cortical contraction

contribute to create a cell–cell interfacial tension [not to be confused with the

aggregate surface tension [85;183] and, thus, energy barriers.

We study the combined effect of stress and active fluctuations to overcome

energy barriers. The model captures the main features of compression experiments,

as well as free relaxations, and distinguishes two flow regimes. Fits to the data

determine τ*, E, tC.

To interpret the values of these parameters, it is necessary to take explicitly

into account not only cell rearrangements, but also the subcellular (cytoskeleton)

dynamics. If the model were also developed for cell internal reorganization, Eq. 5.14

would be well suited to fit both types of relaxations. A future extension of our single

energy barrier model might include a more realistic distribution of energy barriers,

some of which can be passed by fluctuations, whereas others are not passed within

the experiment duration.

V.4.2. Time Scales.

The slow time scales tC =5 h obtained from the fit of our shape relaxation

experiments with the model (Fig. 5.7) can be interpreted as the relaxation time due to

cell rearrangements. Rearrangements-induced flow starts when aggregates are out

of mechanical equilibrium, e.g., compressed. Rearrangements continue over hours

until the complete equilibration of the aggregate. This interpretation agrees with the

cell shape relaxation observed after 24 h in a centrifuged aggregate [119]. It also

agrees with orders of magnitude extracted from the fusion of two F9 aggregates and


112

the rounding of the resulting aggregate, driven by surface tension, which takes 6

hours ( Fig. 4.3, Movie M4).

We observe a much shorter time scale (~102 s) in stress relaxation experiments

(Fig. 5.9), confirmed by height recovery after compression (Fig. 5.6). We believe that

it is due to internal release of cell elasticity by active cytoskeleton polymerization-

depolymerization processes, not included in the model. It is compatible with the

internal cell viscosity, probably hundreds of times smaller [190] than the tissue

viscosity η* or equivalently by lower energy barriers. Interestingly, the characteristic

stress τ* which according to the model is determined by the fluctuation amplitude and

the cell size (not the energy barrier) measured from stress relaxation curves (Fig.

5.9) is the same than the one deduced from apparent plasticity data (Fig. 5.7). To

obtain this last value, we combined the measured viscosity from fusion experiments

η*=4.4×105 Pa.s18 with the above relations τ*=0.13E and E=η*/tC. This yields

E=25Pa, then τ*=3.2 Pa. Notice that the elastic modulus is extremely low but

consistent with the measurements realized at low applied stress and the predictions

of the tensegrity model that states that the cytoskeleton prestress and architecture is

the primary determinant of the cell elastic response [191].

Aggregates are not always able to fuse and round up within the time of

experiments (CHO cell aggregates barely fuse even after 1 week [115] ). In addition,

even after relaxation, their shape sometimes displays a strong deviation from that of

a liquid drop [91;110]. This suggests that the energy barriers are too high: Both the

aggregate’s surface tension and the fluctuations are insufficient to relax the elastic

stress over the duration of the experiment. Simulations at high cell–cell tension [174]

confirm that a plateau is sometimes reached before full stress relaxation.

V.4.3. Validity of the plasticity measurement

One can question our choice of this 440s arbitrary time for plasticity

measurement. Indeed, several phenomena are occurring simultaneously during the

shape relaxation. If we want to extract one parameter characteristic of one of them,

we need a clear distinction of timescales. Let’s list the different physical origin of the

shape relaxation: (1) Individual cells may relax a stored elasticity when they are

decompressed (0-1 min). (2) They can also reorganize their cytoskeleton actively at

rather short timescales (1-5 min as explained above). At the tissue level, cell-cell

rearrangements occur induced (3) or not (4) by the stress.

18 η*=η measured by the fusion assay (see chapter 4)


113

Again our aim here was to quantify, cell rearrangement induced by the

preceding compression experiment. If during the 440s, a lot of these rearrangements

also occur due to the surface tension stress, our measurement can only be made

with a very large error.

Two arguments can be presented here to argue that this error, of course exist,

but is still very reasonable. During compression experiments under the two-photons

microscope, we could visualize these rearrangements, and even if our theory predict

a shear thinning effect we did not see a tremendous difference in terms of numbers

of rearrangement between the first 440s and for example the following ten minutes

(of course this remain to be quantify).

We can also estimate the proportion of rearrangements occurring during the

first 440 sec as a maximum value of 12%, by assuming an exponential decay in

height recovery (1-exp(-t/teff)). The effective relaxation time is lower than the

characteristic time due to shear-thinning effect 19:

c

eff

effc t

Et

t

E≤=≤= )()

55

*(

ηη

So the relative error on apparent plasticity is not too exaggerated as compared to

error bars (Fig. 5.7) and justifies a posteriori our hypothesis.

Moreover, in decompression experiment, the starting stress is of course smaller

than in the compression phase (it corresponds to the plateau value obtained during

compression), so the number of rearrangement at short timescales will of course be

smaller and so will be the error.

V.4.4. Link between compression-decompression experiment and fusion?

We have just noticed that the timescale tc obtained from compression-

decompression experiment is the same than the one obtained from fusion

experiment. However, these two timescales were derived from very different

modelling. In compression-decompression experiment, we analysed the experiment

in term of a viscous-elatic-plastic behaviour of aggregate. The surface tension does

not play a significant role it just gives the value of the plateau in force relaxation

experiment. Whereas fusion experiments were analyzed only taking into account the

fluid behaviour. Of course, the flow during fusion will necessitate the same type of

19 The ratio ηeff=η*/5 was obtained for deformations higher than 50%


114

rearrangements. We indeed visualized them under two-photon microscopy and also

observed shape deformation (see movie M2).

Is it pure coincidence that these two interpretations give the same timescales of

the same type of phenomenon (rearrangements) or is there a clear correspondence

between the two models which will then lead to the relation:

E ≈ σ /R.

This would mean that cells are able to adapt their mechanical properties to their

environmental conditions, and then to tune their elasticity in function of the pressure

they undergo. This could be an interesting point to elucidate in future work.

V.4.5. Effect on Measured Surface Tension

In compression–decompression cycle experiments, at a given relaxation time,

the longer or the stronger the compression, the larger the number of rearrangements,

and thus the stronger the apparent irreversibility, in good agreement with Eqs. 5.14

and 5.15. For the assessment of surface tension, the time between two successive

compressions is usually between 30 min and 2 h [115]. An equilibrium force seems to

be attained 2–10 min after compression. We believe that this time is large enough to

relax internal contributions; but, unlike what is assumed by [106], only a limited

number of rearrangements have taken place. Residual elastic contributions could

lead to an overestimation of surface tension. This questions the validity of the

application of Laplace’s law in past and present surface tension measurement

experiments. A likely hypothesis would explain the remaining stored elasticity in our

experiments by an active response of the cell. When compressed, cells could actively

release a part of the elasticity stored in the compressed cytoskeleton; when

decompressed, the surface tension drives the relaxation of the global aggregate

shape, and cells could actively regain part of the elasticity. This hypothesis is

compatible with the rate, 1–10 µm/min, at which single cells reorganize their

cytoskeleton [33]. It could be tested by modifying the dynamics of actin, microtubules,

or intermediate filaments using drugs (latrunculin and jasplakinolide). Two-photon

imaging of cell contours combined to simultaneous force measurements could be an

excellent assay for that investigation. If this hypothesis is correct, the elastic energy

stored in deformed cells will be less than we assume in our model, and the

overestimation of the surface tension in compression experiments will be smaller.

This will explain why published measurements of surface tension are usually robust

and do not depend on compression magnitude and duration, nor on aggregate size

[103;105;156].


115

Conclusions et Perspectives

Nous avons réalisé une caractérisation physique et rhéologique des agrégats

cellulaires embryonnaires. Ces agrégats formés à partir d’auto-assemblages de

cellules dissociées constituent un système modèle des tissus. Ils permettent

d’étudier les réorganisations cellulaires qui interviennent dans les domaines de

l’embryologie, la cancérologie et l’ingénierie tissulaire. C’est grâce à ces

réorganisations que les cellules peuvent, se reconnaitre, se trier, s’adapter à leur

environnement afin de générer une structure complexe, possédant une forme définie,

le tissu. Nous avons utilisé plusieurs moyens physique, cohérents entre eux, afin

d’apporter des réponses sur l’origine, la cinétique et la dynamique des

réorganisations des cellules dans les tissus.

La tension de surface influe sur la forme d’un liquide. Qu’il soit en suspension,

posé sur une surface, ou mélangé avec un autre liquide, le liquide doit définir ses

interfaces de façon à obéir à la contrainte de sa tension de surface et donc de

manière à minimiser son énergie totale. L’établissement d’un tel équilibre engendre

toujours des écoulements dans les liquides, la viscosité, quant à elle, va s’opposer

aux déplacements relatifs des unités du liquide. Chez certains agrégats cellulaires

embryonnaires, des phénomènes qui semblent guidés par la tension de surface

apparente et freinés par une viscosité effective ont été bien identifiés. Ceux-ci sont,

en effet, capables de s’arrondir, de fusionner ou de se trier à des échelles de temps

très longues comparées à celles des liquides visqueux usuels.

La compréhension des comportements cellulaires en tissus fait partie des

questions ouvertes de la biologie de développement. Il a été montré que la tension

de surface permettait de prédire les comportements mutuels d’enveloppement des

tissus. C’est pourquoi, mesurer proprement la tension de surface dans un premier

temps puis identifier son origine structurale à l’intérieur des tissus ont été les idées

directrices de notre travail. Un tensiomètre des tissus ainsi qu’une méthode

d’analyse adéquate (indépendante de l’angle de contact) ont été développés à cet

effet. En parallèle, le rôle du cytosquelette dans la cohésion du tissu a été étudié en

quantifiant sa contribution à la tension de surface. La suppression de l’expression de

l’α-caténine indispensable pour la liaison cytosquelette/ cadhérine, dans des cellules

exprimant un même niveau de cadhérine, fait baisser la tension de surface alors

qu’elle est toujours capable de prédire les comportements d’enveloppement mutuels

et de tri cellulaire dans les expériences de ségrégations. Ce nouveau résultat remet

en cause l’origine proposée pour la tension de surface par l’hypothèse d’adhésion

différentielle HAD (i.e., le niveau d’expression des molécules d’adhésion seul


116

conditionne la tension de surface tissulaire), tout en renforçant son idée de base : le

tri cellulaire et la morphogenèse sont gouvernés par la tension de surface des tissus.

Tirant parti de l’analogie entre tissus et liquides, nous avons pu quantifier

d’autres propriétés physiques de plusieurs lignées de cellules telles que la viscosité.

Nous avons mesurés une viscosité similaire pour deux types cellulaires n’ayant pas

la même cohésion. Des résultats similaires ont été trouvés dans la littérature. Des

mesures préliminaires en présence de nocodazole révèlent une augmentation de la

viscosité des tissus. Suite à ces résultats, nous proposons que la viscosité tissulaire

est fixée par une compétition entre les phénomènes protrusifs d’une part et la

cohésion d’autre part.

En parallèle, nous avons réalisé des expériences rhéologiques de relaxation de

force ou de relaxation de forme d’un agrégat initialement compressé. Des

comportements visco-élasto-plastiques ont été rencontrés. Afin de capturer la

complexité de la réponse des agrégats sous stress, une modélisation analytique des

réarrangements cellulaires à l’intérieur de l’agrégat a été menée. La combinaison

expériences-modèle nous a permis d’évaluer certains paramètres rhéologiques

significatifs des tissus embryonnaires (E=25 Pa, τ*=2.4 Pa, ηeff=0,2.η∗, tc=5h) et de

classer les comportements des agrégats sous stress τ selon deux régimes : régime

dominé par les fluctuations τ < τ* ou régime rhéofluidifiant τ > τ*.

Ce travail offre de multiples perspectives.

Dans un avenir proche, grâce en particulier à l’imagerie deux photons, on

pourra espérer quantifier les réarrangements et déformations car ce type d’imagerie

permet d’avoir accès aux champs de vitesse et de déformation à l’intérieur de

l’agrégat. Outre la géométrie de compression, il parait intéressant de travailler avec

des agrégats que l’on force à s’écouler dans des microcanaux de diamètre inférieur à

celui des agrégats par aspiration afin possiblement d’obtenir une estimation de la

viscosité tissulaire indépendante de la tension de surface. Ces données pourront être

confrontées à des simulations numériques par éléments finis de modèles purement

visqueux ou visco-élasto-plastiques de ces agrégats. Le rôle de l’élasticité pourra

ainsi être quantifié puis mesuré indépendamment sur le tensiomètre en y

implémentant un mode dynamique (rhéomètre en compression) . Il parait également

très prometteur de mettre en évidence les composants du cytosquelette à l’origine de

l’élasticité en jouant sur différentes drogues contractiles car ce travail a été tout juste

commencé durant cette thèse. Les mesures effectuées au chapitre 5 sur les cellules

F9 pourront aussi être effectuées sur des cellules F9(α-/-) afin de déterminer le rôle du

cytosquelette sur les différents paramètres mesurés.


117

Enfin, de nombreuses expériences en collaboration avec des biologistes,

pourront être effectuées afin de mettre en évidence les différents chemins de

signalisation jouant un rôle sur les paramètres physiques que nous sommes

maintenant facilement capable de mesurer.


118

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