pharmacologie moléculaire 2 magali waelbroeck [email protected] e1.6.207
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But du cours:But du cours:
•Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi l’expérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer.
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Moyens:Moyens:
•Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique.
•Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions…
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Outils utilisés dans ce cours:Outils utilisés dans ce cours:
• Programmes:o Graph Pad: utilisation et interprétation des données
expérimentales ou simulées. Commentaires: voir http://www.graphpad.com/index.cfm?cmd=library.index
o Spdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le “tutorial” de Gale Rhodes http://www.usm.maine.edu/~rhodes/SPVTut/index.html
o Excell: simulation de résultats attendus
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Voici quatre représentations d’une Voici quatre représentations d’une même protéine. Sur lesquelles même protéine. Sur lesquelles
peut on voir:peut on voir:
• Le tracé de la chaine polypeptidique?
• Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure?
• Le volume occupé réellement par la protéine?
• Les chaines latérales des acides aminés?
• Le type d’acide aminé (Basique, acide, hdrophobe, polaire)?
• La structure primaire? Secondaire? Tertiaire? Quaternaire?
• La position du ou des ligands?
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A B
C D
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Quelles sont les relations Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques?entre affinité et cinétiques?
•Définition du terme “affinité”o Qu’est-ce qui permet ou explique une liaison
de forte affinité?
•Définition du terme “spécificité”o Pourquoi dit-on qu’un enzyme, un récepteur,
un ligand est très spécifique de…
•Définition du terme “cinétique”o Qu’est-ce qui explique une liaison rapide ou
lente? Une dissociation rapide ou lente?
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Chemin réactionnel
R.DR+D
0G
En
erg
ie
Lib
re
Thermodynamique:Thermodynamique:
10
/0
00
1.3
ln( ) 1.3log( )D DKcal mol
GGRTK e
G RT K K
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R.DR+D
*offG
Thermodynamique:Thermodynamique:
*
*
ou .
ou .
on
off
GRT
on
GRT
off
k k Ae
k k Ae
D-
+
D-
-
=
=
*onG
Chemin réactionnel
En
erg
ie
Lib
re
0 * *
off onG G G
* * 0on off
off
on
G G GRT RT
D
Dk
k
K e e
K
D - D D
=
=
=
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Collisions:Collisions:
Phase aqueuse, T° pièce :Collisions: 1010 M-1sec-1
≈1011M-1min-1
kon typiques: petites molécules:
106-108 M-1min-1
protéine-protéine:105 M-1min-1
Protéines: peu de collisions productives:
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Relations vitesse - affinité?Relations vitesse - affinité?
Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteuroVitesse association constante,oDissociation lente haute affinité;
dissociation rapide basse affinité
oKD proportionnelle à koff
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Vérification: mesure du kVérification: mesure du konon de de différents couples ligand - différents couples ligand -
récepteursrécepteurskon récepteurs muscariniques,
adrénergiques
0
10
20
30
ligands
k on (
M-1
min
-1)
Trop petits: pas visibles. Échelle log?
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kkonon : comparaison de différents : comparaison de différents ligands, différents récepteursligands, différents récepteurs
kon récepteurs muscariniques,adrénergiques
-2
-1
0
1
2
log
ko
n (
M-1
min
-1)
3 logs: 1000 x
Conclusion: kon très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi?
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R β-adrenergique kon (108M-1min-1)
koff (min-1)
pKD t1/2 (min)
(-) pindolol 6.9 0.546 9.10 1.27
(+) pindolol 6.6 18.97 7.54 0.4
(-)CGP 12177 2.2 0.024 9.97 28.9
(+)CGP 12177 4.2 0.57 7.86 0.12
(-)ICYP 14.0 0.0025 11.75 277.3
(+)ICYP 17.0 0.488 9.54 1.4
(-)carazolol 7.4 0.0025 11.47 277
(+)carasolol 3.4 0.085 9.6 8.2
(-)IHYP 11.0 0.0021 11.72 330
(+)IHYP 5.8 0.042 10.14 16.5
Premier indice: comparaison Premier indice: comparaison de la vitesse d’association de la vitesse d’association
d’énantiomèresd’énantiomères
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Muscarinique (M2) kon (108M-1min-1)
koff (min-1)
pKD t1/2 (min)
(R)-QNB 1.0 0.0092 10.0 75
(S)-QNB 1.1 0.6 8.3 1.2
(R)-Met QNB 2.6 0.11 9.4 6.3
(S)-Met QNB 5.8 0.25 9.4 2.8
Muscarinique (M3)
(R)-QNB 0.11 <<0.0009 <<10.0 >>360
(S)-QNB 0.10 0.11 8.0 6.3
(R)-Met QNB 0.23 0.015 9.2 46
(S)-Met QNB 0.50 0.2 8.4 3.5
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Données à expliquer:Données à expliquer:
•kon dépend (un peu) du ligand,
•kon dépend (beaucoup) du récepteur,
•kon presque identique si énantiomères,
•koff détermine l’affinité relative des énantiomères…
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Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium
Steven K. Drake and Joseph J. Falke*
Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309-0215
Biochemistry, 35 (6), 1753 -1760, 1996.
Abstract:In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca2+ binding and dissociation.
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Galactose Binding Protein:Galactose Binding Protein:
Galactose
Ca2+
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Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F »)
Ca+2
Asp
Asp
Asn
Asn
Lys (groupe C=O chaine
polypeptidique)
Ca+2
« pouce »« index »
« paume »
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To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain.
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Calcium binding E-F Hand (gate closed)
Calcium binding E-F Hand (gate open)
Gln « gate keeper »
« Gate »
Gln « gate keeper »
« Gate »
Galactose binding protein: Calcium binding site
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Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb3+, used as a probe metal ion.
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1 Einstein = 1 mol de photons1 kcal = 4,1868 kJ
Fluorescence? Lumière = Fluorescence? Lumière = Énergie:Énergie:
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Rappel: orbitales liantes et Rappel: orbitales liantes et antiliantesantiliantes
“liantes” “antiliantes”( ou )
2s 2s*2
2*
1p 1p*1
1*
Energ
ie
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Fluorescence, phosphorescenceFluorescence, phosphorescence
•Fluorescence: réémission de lumière immédiate;
•Phosphorescence: isomérisation du spin des e-: réémission lente.
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FRETFRET
L’énergie dégagée par le donneur est absorbée directement par l’accepteur, puis réémise sous forme de photons de plus longue λ
λ (nm)
Excitation - - - - Emission ________
Donneur Accepteur
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3 Tryptophanes (accepteurs)(fluorescents)à 10-20 Å du Tb3+
Terbium (donneur)phosphorescent
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“GATE”: KD (µM) koff
(sec-1)
kon
(µM-1sec-1)
Glutamate: -CH2-CH2-COO-
0.06 0.0002 0.003
Aspartate:-CH2-COO-
0.13 0.0019 0.014
Glutamine-(wt)
-CH2-CH2-CONH2
2.00 0.0064 0.003
Serine: -CH2OH
0.80 0.6500 0.810
Threonine: -CHOH-CH3
2.30 0.9100 0.400
Asparagine:-CH2-CONH2
1.90 1.0200 0.540
Glycine:-H
1.40 2.0000 1.430
Alanine:-CH3
2.80 3.7900 1.350
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Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+
N,G,A
S,T
Q
Chemin réactionnel Chemin réactionnel
Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+
D
D
Liaison
association
Q
Q
dissociation
E
E
Energ
ie L
ibre
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Comment pourrait-on traduire par Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les un modèle stoechiométrique les
expressions suivantes?expressions suivantes?
• Le ligand reconnaît le récepteur.
• L’agoniste reconnaît le récepteur, qui s’active (laisse passer les ions Na+, Ca2+, ou Cl- )
• Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent l’ouverture du canal Cl-
• L’agoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité.o Pourrait-il favoriser la formation d’un complexe de basse affinité?o Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé.
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Rappel: Liaison à un site:Rappel: Liaison à un site:
* *offkL R L R
Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation:
L’association du radioligand : * *onkL R L R
* *on
off
k
kL R L R
A l’équilibre, les deux réactions se compensent exactement :
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Cinétique de dissociation:Cinétique de dissociation:
•Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée:
offkB R F
0off
off
k t
dBk B
dt
B B e
0 60 120 180 240
1
0
1
2
Time (min)
log
(B)
-koff
0 60 120 180 2400
50
100
Time (min)
% I
niti
al B
indi
ng
Sur une échelle log:Sur une échelle linéaire:
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Cinétique d’association (1):Cinétique d’association (1):
( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( ) on off
d B d R d Fk R F k B
d t d t d t=- =- = ´ -
La réaction d’association:
Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément:
0 0on off on on off
d Bk R B F k B k R F k F k B
dt
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• Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant:
• R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: kobs=konF+koff
Cinétique d’association : (2)Cinétique d’association : (2)
( )
( )
( )
( ) on off
on off
off on off
d Rk R F k B
d t
k R F k R R
k R k F k R
=- ´ +
=- ´ + -
= - + ´
0
0
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Cinétique d’association : (3)Cinétique d’association : (3)
•Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente?
Liaison du (-)carazolol
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
125 1.0 nM (-)carazolol
10 nM (-)carazolol
0.1 nM (-)carazolol
Temps (minutes)
% s
ites
occ
up
és
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ln e
e t
B
B B
ì üï ïï ïí ýï ï-ï ïî þ
0 50 100 150 200 250 3000
1
2
3
Time (min)
( )obs on offk k F k= ´ +
Cinétique d’association : (4)Cinétique d’association : (4)linéarisationlinéarisation
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Cinétique d’association : (5)Cinétique d’association : (5)évaluation de kévaluation de konon, k, koffoff
• La “constante de vitesse d’association” apparente, kobs, augmente proportionnellement à F
0 100 200 3000
0.02
0.04
F (nM)
koff
kon
obsk
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Que se passe-t-il si deux ligands Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le entrent en compétition pour le
récepteur?récepteur?1
1
2 2
k
kR A RA
L
k k
RL
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0 25 50 75 1000
25
50
75
100
125
Temps (minutes)
% s
ites
occ
up
és
Cinétique de liaison: traceur lent Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapideet compétiteur rapide
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Liaison du (-)carazolol*en présence de (+) carazolol
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
125
+ 1.0 nM (+)carazolol
+10 nM (+)carazolol
+ 0 nM (+)carazolol
Temps (minutes)
% s
ites
occ
up
és
0 100 200 300 400 500 600 70010
100
Temps (minutes)
%L
iais
on
rés
idu
elle
Cinétique de liaison: deux Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et énantiomères: traceur lent et
compétiteur très rapidecompétiteur très rapide
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Liaison du (+)carazolol*en présence de (-) carazolol
0 25 50 75 1000
10
20
30
0 (-)carazolol0.1nM (-)carazolol1.0 nM (-)carazolol
Temps (minutes)
% s
ites
occ
up
és
0 100 200 300 400 500 600 70010
100
Temps (minutes)
%L
iais
on
rés
idu
elle
Cinétique de liaison: traceur très Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lentrapide et compétiteur lent
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Liaison du (+/-)carazolol
0 25 50 75 100 125 1500
25
50
75
100
125
Temps (minutes)
% s
ites
occ
up
és
0 100 200 300 400 500 600 70010
100
Temps (minutes)
log
(%L
iais
on
rés
idu
elle
)
1.0 nM carazolol
10 nM carazolol
0.1 nM carazolol
Cinétique de liaison: traceur Cinétique de liaison: traceur racémiqueracémique
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Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute protéine G pour former un complexe de haute
affinité.affinité.
Ensuite,Ensuite, le récepteur est reconnu par le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. l’arrestine et internalisé.
1
1
2 2
k
kAgoR G AgoRG
Arrestine
k k
AgoRArrestine
Il suffit que k-2 soit <<k-1…