Protocol

VA CRYO KITO[ 卵巣組織 ガラス化法 ]

2

Vitrification

【 採卵 】・ 1~10mL シリンジ x 1・ 18~21G針 x 1・ 卵胞液回収用スピッツ又は、遠心管・ 検卵用ディッシュ・ 検卵用顕微鏡

【 卵巣凍結 】・ Ova Cryo Kit ( Ref. 82212 Code. VT301S )・ Ova Rinse ( Ref. 82215 Code. OVR-100 )・ ディッシュ( 外径60mm ) x 3：Cryo1,2,3のためのディッシュ・ ディッシュ ( 外径 60mm ～ 100mm ) x 2：Ova Rinseに卵巣を浸漬するためのディッシュ・ ハサミ ( 曲剪刀 x 1, 直剪刀 x 1 ) メモ：曲剪刀と直剪刀をの2種類を使用することで卵巣の処理作業が効率的に行えます。　・ 曲がりピンセット ( 約 12cm )・ 液体窒素用ピンセット ( 約 20cm ) x 2・ メス ( ブレード No. 10 )・ 滅菌ガーゼ・ タイマー・ 液体窒素とコンテナ ( 発泡スチロール等 )

【 Method 2 の器具 】・ スクエアメジャー ( Ref. 81212 )・ ハンドル付きマイクロトーム ( 洗浄・滅菌済 )・ メス ( ブレード No.11 )

【Open Systemの器具】・ Ova Cryo Device Type M ( Ref. 81213 Code. ODTx10 )・ ケーン ( C-2 ケーン )

【Closed System の器具】・Ova Cryo Closed Device CryoSheet ( Ref. 81214 Code. OCSx10 )・シーラー・ CryoSheet用ケーン( Ret. 81215 CryoSheet Canex10 )

卵巣組織 凍結保存の手順

卵巣切片の採取 凍結液への平衡 冷却

（ガラス化）保管

用意するもの

　　・Cryo 1: 20 mL x 1　　・Cryo 2: 20 mL x 1　　・Cryo 3: 20 mL x 1

Ova Cryo Kit ( Ref. 82212 Code. VT301S )

Ova Cryo Device Type M ( Ref. 81213 Code. ODTx10 )

使用製品

メモ : 採取した未熟卵はIVM後に凍結します。成熟卵は卵子凍結、もしくは体外受精に用います。

メモ : すくい上げるように曲剪刀を入れることで髄質の除去が容易になります。

メモ : 辺縁の髄質は細切後に除去すると作業が容易になります。

3

OVA CRYO KIT

STEP 1 準備

STEP 2 卵巣切片の採取

摘出卵巣をOva Rinseで洗浄し、余分な血液を洗い流します。1.卵胞を注射針で穿刺し、シリンジで卵胞液を吸引します。2.

※Ova Rinse ( Ref. 82215 Code. OVR-100 ) を用いて卵巣が乾燥しないように 注意しながら次の手順を行います。

Method 1

直剪刀を用いて卵巣を赤道面で半分割します。

半分割した卵巣を開き、髄質側を上にして乾燥しないようOva Rinseに浸漬し、細切作業を開始します。

切り開いた卵巣の髄質を曲剪刀で除去し、皮質のみを残します。ピンセットで卵巣をやさしく押さえ、髄質を曲剪刀で切除し、皮質が 1mm 厚になるまで作業を繰り返します。

1ｍｍ厚の皮質をメスを用いて1cm四方に細切します。

1.

2.

3.

4.

・Cryo1、Cryo2、Cryo3 を室温( 25 ～ 27℃ )に戻します。・ディッシュに「Cryo1」、「Cryo2」、「Cryo3」と識別できるよう油性ペンで記載、もしくはラベルを貼り、 各ディッシュに該当する液を全量入れます。

卵巣赤道面

メモ : 必要に応じて余分な髄質を曲剪刀で取り除いてください。

4

Vitrification

スクエアメジャー A スクエアメジャー B

Method 2

Method 1 では卵巣皮質の処理が困難な場合は、スクエアメジャー( Ref. 81212 )をご利用下さい。

スクエアメジャーは、 A と B の部品からなります。

卵巣表面の余分な水分を滅菌ガーゼで除き、スクエアメジャーが滑らないようにします。

卵巣表面の細切したい部分にスクエアメジャー A を置きます。

スクエアメジャー A の内側にある、枠に沿ってメス ( No.11 )で卵巣表面を＃型に切ります。

1.

2.

3.

スクエアメジャー B をスクエアメジャー A に取り付け、3.で切った卵巣部分に再度置きます。

スクエアメジャーを上から押さえたままマイクロトームの刃をスクエアメジャーA と B の間に挿入し、金属突起部分まで水平に滑らせ卵巣皮質部を切ります。

切り取られた卵巣切片をOva Rinseに浸漬し、全ての卵巣切片の採取が終わるまで乾燥に注意して待機させます。

4.

5.

6.

メモ : 四隅が交差し、且つ、深さ1mm以上になるように切ってください。

※Ova Rinse ( Ref. 82215 Code. OVR-100 )を用いて卵巣が乾燥しないように注意しながら行います。

STEP 2 卵巣切片の採取

※ 必ず ＃ の形に切れ目を入れてください

TIP

卵巣

スクエアメジャー A

スクエアメジャー A 卵巣

スクエアメジャー A

卵巣

スクエアメジャー A

スクエアメジャー B

5

OVA CRYO KIT

STEP 3 凍結液への平衡

.

卵巣切片の余分な水分をガーゼで拭き、Cryo1 に５分間浸漬します。

卵巣切片の余分なCryo１液をガーゼでやさしく除いてから、Cryo2 に卵巣切片を移し５分間平衡させます。

卵巣切片の余分なCryo2液をガーゼでやさしく除いてから、Cryo3 に卵巣切片を移し1５分間平衡させます。

※ 複数の卵巣切片を同時に Cryo1, Cryo2, Cryo3 で処理することが可能です。

1.

2.

3.

Cryo 1

5 分 5 分 15 分

Cryo 2 Cryo 3

メモ : 平衡の待ち時間に、ODTまたはOCS、 及び液体窒素の準備を行います。

Open System

6

Vitrification

STEP 4 ガラス化保存 (ODT)

卵巣切片数分の ODT を準備し、患者IDをODTのバイアルに記入します。

卵巣切片の表面積が最大になるよう広げ、ODT の上に乗せます。卵巣切片は ODT の金属先端部寄りに置くようにし、金属部分が埋め込まれているキャップの根本は避けます。キャップから 5mm 程度開けて卵巣を置きます。

ODT のキャップ部分をピンセットで掴み、液体窒素に素早く投入します。

1.

2.

3.メモ : 卵巣切片を乗せた面から ODT を液体窒素に投入するようにしてください。

ODT から組織がはがれてしまうのを防ぎます。

メモ : 液体窒素内で卵巣切片が ODT より剥がれてしまった場合は、卵巣切片を ODT バイアル部分にそのまま入れ、キャップをします。

メモ : 液体窒素投入後はすばやく冷却されるようOCSを液体窒素中でやさしく振って下さい。

メモ ： この時余分な Cryo3 液はガーゼ等で取り除いてください。

４. 卵巣切片が冷却されたら、液体窒素中でキャップにバイルをつけて蓋をします。

STEP 4 卵巣皮質のガラス化保存STEP 4 ガラス化保存 (OCS)

７

OVA CRYO KIT

→

No:ID:Day:

×××××-×××××××-×××

×××××-×

××/××/××

卵巣切片数分のOCSと付属のパウチに、患者情報等の記入をします。

OCSのフィルムを開き、卵巣切片の表面積が最大になるよう、OCSの枠内に乗せます。

OCSのフィルムを、卵巣切片に被せ、余分な空気を抜き密着させます。

パウチにOCSを入れ、余分な空気が入らないよう、指で軽く袋を押さえた後、パウチを黒線でシールします。

ピンセットを使用し、OCSを液体窒素に素早く投入します。

メモ：シーラーの設定温度が高すぎるとパウチが破損する恐れがあります。適切な温度でシールしてください。

メモ：液体窒素投入後はすばやく冷却されるよう、OCSを液体窒素中でやさしく振って下さい。

メモ：この時余分なCryo3液はガーゼ等で取り除いてください。

Closed System

8

Thawing

用意するもの

Ova Thawing Kit ( Ref. 82222 Code. VT302S )

卵巣組織 融解手順

卵巣切片の融解 希釈と洗浄 移植 / 培養

　　・Thaw 1: 100 mL x 1　　・Thaw 2: 20 mL x 1　　・Thaw 3: 20 mL x 1

・ Ova Cryo Kit ( Ref. 82222 Code. VT302S )・ 液体窒素とコンテナ ( 発泡スチロール等 )・ ウォーターバス・ ディッシュ ( 外径 60mm ～ 100mm ) x 2・ 滅菌カップ( 110mL / 4.5 oz. コンテナ) : Thaw1用・ ピンセット ( 約 12cm ) : 卵巣組織の希釈、洗浄用・ 液体窒素用ピンセット ( 約 20cm )・ タイマー・ Ova Culture ( Ref. 82216 Code. OVCL-100 )又は、Ova Culture with HEPES ( Ref. 82217 Code. OVCM-100 )・ 滅菌ドレープ

【Closed Systemの器具】・ ハサミ：OCSのパウチを切るため

使用製品

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OVA CRYO KIT

準備

融解 (ODT)STEP 2

STEP 1・Thaw1 全量を滅菌カップに入れ、ウォーターバスで37℃に温めておきます。・Thaw2 、Thaw3 は室温 ( 25 ～ 27℃ ) に戻します。・ディッシュに「 Thaw1 」、「 Thaw2 」と識別できるよう油性ペンで記載、もしくはラベルを貼り、各ディッシュに 該当する液を全量入れます。

ピンセットを使用し、液体窒素中で ODT のキャップを外します。ODT に卵巣切片があることを確認します。

ODT をウォーターバスで温めた Thaw1 へ素早く移動し、1分間平衡させます。Thaw1 内で ODT を振るように動かし、卵巣切片が剥がれたら、すぐに ODT を取り出します。

卵巣切片を Thaw1 から室温の Thaw2 に移し、３分間浸漬させます。

卵巣切片を Thaw2 から Thaw3 に移し、５分間浸漬させます。

1.

2.

3.

4.

Thaw3 で５分間浸漬させた後、移植等の作業に移行します。

1分, 37℃

Thaw 1

3 分 5 分

Thaw 2 Thaw 3

メモ : 融解時、卵巣切片を液体窒素から Thaw1 に素早く移動できるよう、 液体窒素は、ウォーターバスのすぐ隣に設置します。

融解直後に移植をする場合は、OVCM-100で30分間追加培養を行ってください。30分以上追加培養を行う際はOVCL-100を使用し、インキュベータ内で行ってください。

メモ : Thaw1 の温度を下げないよう、ODTの金属部分のみを Thaw1 に浸漬してください。

Open System

OVA CRYO KITOVA CRYO KITOVA CRYO KIT

10

OVA CRYO KIT

融解STEP 2 融解STEP 2 融解STEP 2STEP 2 融解 (OCS)

3.

4.

" CUT

1分, 37℃

Thaw 1

3 分 5 分

Thaw 2 Thaw 3Thaw 1 Thaw 2 Thaw 3Thaw 1 Thaw 2 Thaw 3Thaw 1 Thaw 2 Thaw 3

液体窒素中でパウチの赤線部分を切り、開封します。

卵巣切片を Thaw2 から Thaw3 に移し、5分間浸漬させます。

卵巣切片を Thaw1 から室温の Thaw2 に移し、3分間浸漬させます。

メモ：パウチの開封口は液体窒素の液面より上に出し、パウチ内に液体窒素が入らないよう、注意してください。

Closed System

メモ : Thaw1 の温度を下げないよう、OCSの卵巣切片部分のみを Thaw1 に 浸漬します。

OCSをパウチから取り出し、ウォーターバスで温めた37℃の Thaw１ へ素早く移動し、１分間平衡します。

Thaw3 で５分間浸漬させた後、移植等の作業に移行します。

融解直後に移植をする場合は、OVCM-100で30分間追加培養を行ってください。30分以上追加培養を行う際は、OVCL-100を使用し、インキュベータ内で行ってください。

Cryo 1

Cryo 2

Thaw 2

Thaw 3

5分

3分

5分

5分

Cryo 3

15分

移植 / 培養

Ova Cryo Kit

Protocol

Ovarian Tissue Vitrification

1分, 37℃

Thaw 1

Closed ( OCS )

Open ( ODT )

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