optimisation de la méthode de détection fish
TRANSCRIPT
Optimisation de la méthode de détection FISH
Cédric Longin, Claudine Degueurce, Frédérique Juillat,
Sandrine Rousseaux, Michèle Guilloux-Bénatier, Hervé Alexandre
Institut Universitaire de la Vigne et du Vin (Dijon)
SITEVI, Montpellier, 2017
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Projet National GNBrett
Axe 1
Biodiversité et
métabolisme
- Résistance au SO2
- Etude de l’état Viable Non
Cultivable (VNC)
Axe 2
Confrontation et amélioration
des méthodes de détection en
laboratoire
- Comparaison de kits qPCR
- Optimisation FISH-CMF
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OBJECTIFS
Cellules en suspension Brettanomyces bruxellensis En vin rouge
Sonde couplée à un fluorochrome
Oligonucléotides : Spécifiques des régions variables
de l’ARN ribosomal 26S de Brettanomyces
Cellules fluorescentes
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Perméabilisation Fixation
Hybridation
Principe de la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH)
6
- Teneur en ribosome cellulaire - Accessibilité du site cible de la sonde - Température d’hybridation (Röder et al., 2007)
- Perméabilité de la paroi cellulaire
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Comment optimiser la méthode ?
Principe de la technique FISH
Perméabilisation au PBS-Triton dans le protocole actuel Vin rouge : polyphénols adsorbés au niveau de la paroi cellulaire.
Test éthanol comme désorbant
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
PBS 20% 30% 40%
Ab
sorb
ance
à 2
80
nm
Concentration en éthanol (%)
Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
0
1
2
3
4
5
6
PBS 20% 30% 40%
Log
cellu
les/
mL
Concentration en éthanol (%)
Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3
*
Meilleure désorption avec la concentration [C3] (v/v)
Aucun impact sur la perte cellulaire
Désorption des polyphénols et impact sur la population levurienne
[C1] [C2] [C3]
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Ancien protocole FISH-CMF (Serpaggi et al., 2010)
Perméabilisation Fixation (24h)
Hybridation (16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 48 h)
Réduction du temps d’analyse
Nouveau protocole FISH-CMF Perméabilisation/fixation (30 min)
Hybridation ( 16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 18 h)
S. cerevisiae (Sc) non marquées
Sc marquées
B. bruxellensis (Bb) non marquées
Bb marquées
Discrimination spécifique des cellules de B. bruxellensis (>95%)
Marquage aspécifique de cellules de S. cerevisiae inférieur à 5%
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité
¾ Sc + ¼ Bb ½ Sc + ½ Bb ¼ Sc + ¾ Bb
En mélange les cellules de B. bruxellensis sont marquées spécifiquement
Présence de S. cerevisiae n’influence pas le marquage spécifique
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
y = 0,9896x + 0,1209 R² = 0,9895
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5 6 7
Mili
eu
ITV
lo
g U
FC/m
L
CMF (log cellules/mL)
Protocole optimisé FISH-CMF : limite de quantification
Limite de quantification : 102 cellules/mL
Amplification des cellules mortes par qPCR (Willenburg et Divol, 2012)
Cible = ADN
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Quantification des cellules mortes par FISH-CMF : Stabilité des ARNr ?
Culture B.b
SO2 actif (2 mg.L-1)
= dose létale
+
FDA : Pas de viabilité Milieu sélectif : pas de cultivabilité
16 h après traitement SO2 6 j après traitement SO2
Stabilité des ARNr dans le temps ?
Réalisation du protocole FISH optimisé
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Confirmation de la stabilité des ARN :
Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé
Culture B.b
+ RNAse Réalisation du protocole FISH optimisé
- RT-PCR (McKillip et al., 1998, Hierro et al., 2006)
- Northern blot (McKillip et al., 1998,
- FISH (Rathnayaka et Rakshit, 2010)
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé + RNAse
+ SO2 actif (2 mg.L-1)
= dose létale
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Spécifique
Rapide : 48h 18h
Sensible (de 102 à 107 cellules/mL)
Méthode compétitive (peu coûteuse ≈ 6€)
Mais surestimation…
Double marquage FISH/viabilité des cellules de Brettanomyces
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Merci de votre attention
Pr Hervé ALEXANDRE Directeur de l’équipe VAlMiS
Dr Michèle GUILLOUX-BENATIER
Clément PETITGONNET Frédérique JULLIAT
Dr Cédric LONGIN