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ALK et Cancer bronchique
I Rouquette Service d’Anatomie Pathologique Rangueil
Plateforme génétique moléculaire des
cancers (génotypage cancer du poumon)
ONCOGENE ALK
RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE
KINASE
C
H
R
O
M
O
S
O
M
E
2
Translocations, mutations, amplifications
CODE
+
Inversion bras court du chromosome 2 Fusion exons 1-13 d’EML4 /exons 20-29 de ALK (région codant pour la TK ALK) GENE DE FUSION
Fusion partie N-term.EML4 /portion intra-cellulaire du récepteur ALK :
PROTEINE DE FUSION ONCOGENIQUE
Réarrangement EML4 ALK
Réarrangement EML4 ALK
Dimérisation et Phosphorylation constitutive du domaine TK ACTIVATION VOIES PI3K/AKT RAS/MAPK
Variants les + fréquents
V1 33% V3a/b 29% V2 9%
Sur la plateforme on cherche
• Quoi? Un réarrangement de l’oncogène ALK conférant
une sensibilité au crizotinib
• Chez qui?
AMM traitement des patients adultes ayant reçu au moins un
traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites
cellules anaplasic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé
• Comment? RT-PCR (reverse transcriptase PCR)
FISH (hybridation in situ en fluorescence)
IHC (immunohistochimie en paraffine)
RT-PCR (ARN)
• Mise en évidence des transcrits de fusion (le partenaire d’ALK est identifié)
• Technique multiplexe: une amorce commune pour l’exon 20 de ALK, amorces spécifiques pour le partenaire de fusion
• Très sensible, mais fragments amplifiés parfois très longs, donc mieux sur congelé
• Kits développés sur paraffine: 70% des variants détectés
• Confirmation nécessaire par une autre technique (faux négatifs)
FISH
Les sondes
• Sondes de « séparation » ( break-apart, split ): deux sondes de couleurs différentes s’hybridant de part et d’autre du point de cassure de ALK , rouge en 3’, verte en 5’. On n’identifie que la cassure d’ALK (partenaire?)
•Sondes de « fusion » une sonde rouge pour ALK, une
verte pour EML4
•Sondes combinées: sonde de séparation + une
troisième couleur pour le partenaire
From A Mc Leer Florin
“TriCheck™” (ZytoLight®
SPEC ALK/EML4
TriCheck™ Probe).
sonde Vysis® LSI® ALK
Dual Color Break Apart
Rearrangement Probe
Dako ALK FISH DNA
Probe, Split Signal Y5417
Lecture
• Région tumorale préalablement sélectionnée par le pathologiste
• Filtres en rapport avec la longueur d’onde des fluorochromes utilisés
• Au moins 100 noyaux intacts (pb petites biopsies)
• Distance split >=diamètre d’un signal
• Seuil de positivité: 15%
• Double lecture
• Problème de l’autofluorescence
• Si doute, vérifier par autre technique
- Filtre DAPI λexcitation 365±12 nm / λemission ≥397 nm
- Filtre Rhodamine-rfp λexcitation 546±12 nm / λemission ≥590 nm
- Filtre FITC-gfp λexcitation 475±40 nm / λemission 530±40 nm
Sonde split DAKO: texas red /FITC Sonde split Abbott: orange gold/FITC
Spectrum Orange Gold.
Excitation: 547 nm
Emission: 572 nm
Equivalent: Rhodamine
Impact du préanalytique
Prélèvement Délai ischémie froide
Fixation Biopsies 6/8h pièces 24/48h
Recoupe mise en cassettes
Inclusion enrobage Paraffine <60°, démarrages WE
Coloration biopsies Eosine autofluo, ADN
Stockage blocs Stabilité en paraffine
Support lames Superfrost IHC FISH
Délai conservation lames 4° +/- enrobage 8 j
Ecrasements
AFA: pas d’hybridation
Sous-fixation Os décalcification Autofluorescence éosine
Impact du préanalytique
•Formol neutre tamponné •Attention durée de fixation (protocoles week-end). •Décalcifiant = acide: si plusieurs sites métastatiques éviter de biopsier l’os Pièces osseuses: rinçage acide , vérifier pH hypercentres • Impact des colorants (éosine, autres): éviter de les utiliser
• Ne pas couper les lames trop longtemps avant la FISH et l’IHC, les conserver à 4°C, les protéger.
Pourcentage de résultats non interprétables
Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011
ADN non amplifiable
Bloc épuisé
% de cellules tumorales < seuil de détection
Les taux de résultats non interprétables ont légèrement diminué depuis le
début du programme
Taux de NI élevé pour le test ALK en FISH (14%)
0,0%
2,0%
4,0%
6,0%
8,0%
10,0%
12,0%
14,0%
16,0%
EGFR act EGFR res KRAS BRAF PI3KCA HER2 ALK (FISH)
FISH coûteuse, consommatrice de temps
IHC ALK Anticorps disponibles
3 clones: ALK1, D5F3 et 5A4 sensibilité 92 à 100%, spécificité 99 à 100% Dilutions 1/25e à 1/100e selon amplifications, clones, automates
Marquage modéré à intense (++ à +++), cytoplasmique diffus, >50% Faible et focal si AFA ou sous-fixation
X40 architecture acineuse
ALK 5A4 x40
X2,5
Scoring
• Score classique= Intensité x % CT positives
• H-score= (1 x % CT intensité à 1+) + (2x % CT 2+) + (3x %CT 3+)
• from weak and
multifocal(1+) to strong
and diffuse (2+)
J Thorac Oncol. 2013
Discordances
• IHC -/FISH + : attention interprétation IHC, compter signaux en FISH.
• IHC+/FISH- : plus rare, être exigeant sur la FISH, repérage zone tumorale, compter les noyaux, double lecture, pertinence de la limite à 15%?
• Utiliser 3e technique, contrôles hors site, EEQ
Discordances
Tumeur hétérogène: les pneumocytes ont été comptés
Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011
Données globales :
Taux de translocation en FISH : 5,4 %
Taux de translocation en IHC : 4,8 %
Plateforme: 20% 1er trimestre, 4,7% dernier trimestre
Stratégies des laboratoires :
FISH uniquement : 10
FISH + IHC en parallèle : 5
IHC + FISH de confirmation : 21
Virchows Arch (2012) Thunnissen et al
Diagnostic algorithm for ALK fusion from the Japanese Lung Cancer
Society From Front. Oncol., 2012 Murakami
Sholl J Thorac Oncol. 2013
Plateforme séquentiel
EGFR 19 20 21 +
IHC ALK
EGFR MUTE ALK IHC -
STOP
ALK FISH
Prescription ou
Profil
IHC ALK - IHC ALK +
ALK +
ALK - EGFR18
KRAS BRAF
HER2 PI3K
Résistances acquises au crizotinib
Doebele Clin Cancer Res 2012
Résistance au crizotinib
Mutations domaine Tkinase ALK (Doebele Clin Cancer Res 2012)
L1196 M Saturation site de liaison
F1174C Favorise l’activation
conformationnelle du RTK
G1279A
D1203N
Giroux 2013
39
Conclusion
• Technique de référence: FISH « time consuming »+ impact préanalytique: aide des systèmes de traitement d’images.
• Place de l’immunohistochimie dans le screening, mais quelques discordances
• Importance de l’organigramme choisi (résultats des études nationale et internationales en cours)
• RT-PCR réservée à des cas particuliers
• Intérêt de la recherche des mutations de résistance?