oms.93 parasitologie med tech base labo 9242544108

Parasitologie médicale: techniques de base pour le laboratoire

Organisation mondiale de. la Santé Genève 1993

Réimprimé 1997

Catalogage à la source : Bibliothèque de l'OMS

Parasitologie médicale : techniques de base pour le laboratoire.

1. Parasitologie- manuels de laboratoire

ISBN 92 4 254410 8 (Classification NLM: WC 25)

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©Organisation mondiale de la Santé, 1993

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IMPRIME EN FRANCE

90/8687 ·JOUVE- 2000

97/11445 ·JOUVE -1000

Table des matières

Préface vii

Liste des collaborateurs viii

Introduction 1

Sécurité au laboratoire 2

Première partie : Techniques de prélèvement, de préparation et d'examen 5

Entretien du microscope 7

Etalonnage du microscope 8

Prélèvements de selles 9

Techniques de prélèvement 9

Examen 10

Examen macroscopique des selles 1 0

Examen microscopique de préparations à l'état frais 10

Identification des parasites 13

Techniques complémentaires 16

Technique de concentration 16

Techniques de coloration permanente 17

Identification des parasites dans les étalements colorés 25

Ecouvillonnage anal à la recherche des œufs d'oxyures 25

Etalement épais de matières fécales sous cellophane pour le diagnostic des bilharzioses intestinales (technique de Kata-Katz) 26

Expédition des prélèvements à un laboratoire de référence 30

Elimination des prélèvements 30

Contrôle de la qualité des examens coprologiques 31


Préparation des réactifs 32

Techniques de préparation et d'examen des lames 32

iii

PARASITOLOGIE MÉDICALE: TECHNIQUES DE BASE POUR LE LABORATOIRE

Urines 34

Prélèvement des urines pour le diagnostic des infestations à Schistosoma 34

Examen des urines 34

Méthode de sédimentation des urines de 24 heures recueillies en fin de miction 34

Méthode de filtration à la seringue 35

Identification 37

Prélèvements vaginaux et urétraux 38


Examen direct de frottis vaginaux et urétraux 38

Prélèvements de sang et autres prélèvements 40

Frottis sanguins colorés 41

Prélèvements 41

Coloration des frottis sanguins au Giemsa 44

Coloration de Field 45

Coloration à l'hématoxyline de Delafield pour la mise en évidence des microfilaires 46

Examen 46

Contrôle de la qualité des examens de sang 47

Techniques spéciales pour les Plasmodium 48

Identification 48

Surveillance de la chloroquinorésistance dans le paludisme à fa/ciparum 49

Techniques spéciales pour les trypanosomes 50

Recherche des trypanosomes dans le sang 50

Recherche des trypanosomes dans le suc ganglionnaire 55

Recherche des trypanosomes dans le liquide céphalorachidien (LCR) 57

Techniques spéciales pour les microfilaires 59

Prélèvements de sang pour la recherche de microfilaires 59

Recherche des microfilaires dans le sang périphérique 59

Techniques spéciales pour les leishmanies 60

iv

TABLE DES MATIÈRES

Prélèvements cutanés 64


Examen des prélèvements 65

Deuxième partie : Identification des espèces parasitaires 68

Parasites intestinaux 69

Helminthes 69

Clé de détermination des œufs 69

Larves 72

Protozoaires 73

Formes végétatives d'amibes 7 4

Kystes d'amibes 75

Flagellés 79

Balantidium coli 80

lsospora belli et Cryptosporidium 80

T oxoplasma gond ii 81

Problèmes d'identification 81

Parasites sanguins 83

Paludisme 83

Identification des Plasmodium dans les frottis minces 83

Identification des Plasmodium dans les gouttes épaisses 83

Structures pouvant être confondues avec des Plasmodium 85

Trypanosomes 85

Microfilaires 92

Bibliographie 95

Annexe 1. Matériel de parasitologie diagnostique nécessaire dans les centres de santé et les laboratoires des hôpitaux de district 96

Annexe 2. Préparation des réactifs et solutions 99

Annexe 3. Préparation des milieux de culture 111

Annexe 4. Nettoyage et conservation des lames porte-objets 113

Index 115

v

Préface

Ce manuel est un guide pratique destiné aux techniciens de laboratoire des centres de santé et des hôpitaux de premier recours. Seules les méthodes diagnostiques faisant appel à la microscopie sont décrites ici.

Ce manuel a été préparé à partir d'éléments tirés de matériels de formation et de divers ouvrages publiés par le Hospital for Tropical Diseases, Londres, Angleterre, la Parasitology Training Section, Division of Labora tory Training and Consultation, Laboratory Program Office, Centers for Disease Control, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amérique, l'Organisation mondiale de la Santé, Genève, Suisse, et l'Organisation panaméricaine de la Santé, Washington, OC, Etats-Unis d'Amérique. En particulier, un certain nombre d'illustrations ont été tirées des publications suivantes: Brooke, M.M. & Melvin, D.M., Morphology of diagnostic stages of intestinal parasites of humans, 2nd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and Human Services, 1984 (HHS Publication N° (CDC) 84-8116); Melvin, D.M. & Brooke, M.M., Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites, 3rd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication N° ( CDC) 82-8282). Les noms d'espèces de parasites utilisés sont ceux de: International Nomenclature of Diseases, Volume II, Infectious Diseases, Part 4: Parasitic Diseases, CIOMS, OMS, Genève, 1987. Les règles de la nomenclature zoologique voudraient que quand le nom de genre est employé seul, il soit suivi de sp. ou sp.p. selon le cas. Dans le but de faciliter la lecture pratique de cet ouvrage, ces dernières lettres ont été supprimées. Par exemple, nous avons employé Plasmodium au lieu de Plasmodium sp.p ..

vii

Liste des collaborateurs

Les personnes suivantes ont contribué à la préparation de cette publication:

Dr P. L. Chiodini, Consultant Parasitologist, Hospital for Tropical Diseases, Londres, Angleterre;

Dr K. Engbaek, Département de Microbiologie clinique, Hôpital général de Copenhague, Herlev, Danemark;

Dr C. C. Heuck, Technologie de Laboratoire de Santé et Sécurité du Sang, OMS, Genève, Suisse;

Dr L. Houang, Annemasse, France;

Dr R. C. Mahajan, Department of Parasitology, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Chandigarh, Inde;

Dr M. A. Melvin, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amérique;

Dr L. Monjour, Parasitologie et Mycologie, Maladies tropicales et parasitaires, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, Pavillon Laveran, Paris, France;

Dr J. C. Petithory, Contrôle national de Qualité en Parasitologie, service de Biologie médicale, Centre Hospitalier, Gonesse, France;

Dr J. Vandepitte, Département de Microbiologie clinique, Hôpital universitaire St-Raphaël, Louvain, Belgique.

viii

Introduction

Les maladies parasitaires sont responsables d'une morbidité et d'une mortalité considérables dans le monde entier et se présentent souvent comme des affections à symptômes non spécifiques. La plupart d'entre elles ne peuvent être diagnostiquées à l'aide du seul examen clinique, et des examens de laboratoire sont nécessaires pour savoir si un malade est infesté ou non par un parasite et, si tel est le cas, par quelle espèce. Le laboratoire joue donc un rôle important dans l'établissement du diagnostic des maladies parasitaires et il constitue l'élément clé du choix thérapeutique. Les examens de laboratoire doivent être exacts et fiables si l'on veut aider le médecin et par là même le malade.

Ce manuel est un guide rédigé à l'intention des techniciens de laboratoire. On trouvera dans sa première partie des techniques permettant de rechercher les parasites dans les selles, le sang, les urines et autres sécrétions ou tissus. On y a signalé les pièges et erreurs possibles, ainsi que les méthodes permettant de les éviter. Les moyens de contrôle de la qualité sont également évoqués. Le technicien de laboratoire doit comprendre que seule l'application rigoureuse des techniques de mise en évidence des parasites permettra l'observation précise de ces derniers au microscope.

La deuxième partie de ce manuel s'attache aux critères morphologiques utilisés pour identifier les parasites. Artefacts et problèmes d'identification y sont également évoqués.

On trouvera le détail du matériel et des réactifs nécessaires dans les quatre annexes qui suivent. L'annexe 1 fournit une liste du matériel et des réactifs nécessaires dans les centres de santé et les laboratoires des hôpitaux de premier recours; l'annexe 2 fournit les formules et modes opératoires pour préparer les réactifs, et l'annexe 3 pour préparer les milieux de culture; enfin, l'annexe 4 décrit les méthodes de nettoyage et de conservation des lames employées pour les frottis sanguins.

Sécurité au laboratoire

Principes généraux

1. Chaque laboratoire doit disposer d'un manuel des consignes de sécurité au laboratoire, applicables en tout temps.

2. Le laboratoire doit également disposer d'une trousse de secours, et son personnel doit compter une personne capable d'apporter les premiers soins.

3. Tout personnel étranger au service doit se voir interdire l'accès aux salles de travail du laboratoire.

4. Il est interdit de manger, de boire, de fumer et de se maquiller dans l'enceinte du laboratoire.

5. Le personnel de laboratoire portera des vêtements protecteurs, qui devront être enlevés avant de quitter le laboratoire.

6. Le personnel de laboratoire doit nettoyer les paillasses au détergent (savon) et désinfecter les surfaces de travail en fin de journée, ou lorsque du matériel infectieux a été renversé. Les désinfectants les plus couramment utilisés sont les suivants:

l'éthanol à 96% ou l'isopropanol (irritants pour la peau), la solution de phénol à 1% (corrosive, caustique), la solution d'hypochlorite à 0,5-1% (caustique, corrosive) (la solution alcaline est plus agressive que la solution neutre), les solutions de formaldéhyde à 1% ou de glutaraldéhyde à 2% (toxiques et irritantes pour la peau).

Les solutions d'aldéhyde et de phénol agissent plus longtemps. Il est conseillé d'essuyer les surfaces de travail avec un chiffon imbibé de désinfectant plutôt que d'employer un vaporisateur.

7. Le personnel doit toujours se laver les mains avant de quitter le laboratoire.

Manipulation des prélèvements

La manipulation de tous les prélèvements de laboratoire exige des précautions particulières et le port de gants en caoutchouc doit être obligatoire.

Prélè'l•ements de sang. Tous les prélèvements de sang doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Comme des germes très dangereux peuvent être transmis par le sang (par exemple, virus de l'immunodéficience humaine (VIH), virus de l'hépatite B), il faut faire extrêmement attention lorsque l'on recueille et que l'on traite les échantillons. Les risques particuliers sont les suivants:

a) Piqûres ou coupures accidentelles- se débarrasser des aiguilles ou des hémostyles dans un récipient pouvant être incinéré par la suite, ou les enterrer dans un sac à déchets après les avoir fait tremper dans une solution désinfectante. Ne pas réutiliser les hémostyles. Ne pas laisser traîner des hémostyles usagés dans le laboratoire. Ne pas utiliser de verrerie ébréchée ni fêlée.

b) Contamination au niveau de lésions de la peau ou des muqueuses- recouvrir toute coupure d'un pansement occlusif. Eviter tout contact du sang avec la peau ou les muqueuses. Le pipetage à la bouche doit être absolument proscrit! Si du sang est renversé sur la peau, laver immédiatement la zone touchée au savon et à l'eau; en cas de projection dans les yeux, les rincer

2

SÉCURITÉ AU LABORATOIRE

abondamment à l'eau. Toute éclaboussure de sang dans le laboratoire doit être noyée avec une solution d'hypochlorite, puis essuyée avec un chiffon imprégné de cette même solution.

Prélèvements de selles. Eviter tout contact avec la peau. Après utilisation, les prélèvements doivent être soit a) incinérés, soit b) plongés dans une solution désinfectante puis enterrés dans des sacs à déchets.

Pre1èvements d'urine. Tout contact avec la peau doit être évité. Les prélèvements non contaminés peuvent être jetés dans les canalisations destinées aux eaux usées.

Elimination des lames porte-objets

Les lames doivent être déposées dans un récipient contenant une solution d'hypochlorite à 1% et enterrées dans des sacs à déchets, si elles ne sont pas nettoyées et réutilisées.

3

Première partie

Techniques de prélèvement, de préparation et d'examen

Entretien du microscope '

Ce que vous devez faire

1. Recouvrir le microscope d'une housse propre en tissu ou en plastique lorsqu'il n'est pas utilisé.

2. Prendre un surcroît de précautions pour protéger le microscope de la poussière pendant les périodes chaudes et sèches.

3. Prendre un surcroît de précautions pour protéger les lentilles et les prismes du microscope des moisissures pendant les périodes chaudes et humides. Pour cela:

- garder le microscope dans une pièce climatisée. ou

- le ranger dans une pièce spéciale, déshumidifiée -le prix d'un déshumidificateur électrique représente environ la moitié de celui d'un climatiseur. ou

- brancher plusieurs ampoules de 15 ou 25 watts dans une armoire dont les portes ferment bien, ou

- mettre une ampoule de 15 watts dans la boîte du microscope, qui agit alors comme une armoire chauffante, ou

- dans les régions sans électricité, installer une étagère sur laquelle on mettra la boîte du microscope à environ 30 cm au-dessus du tuyau du réfrigérateur à gaz ou à kérosène ou du congélateur ; un sac étanche à l'air et du gel de silice à l'état sec (de couleur bleue) permettront de conserver un microscope suffisamment au sec pour que les lentilles soient à l'abri des moisissures.

4. Nettoyer chaque jour l'huile des objectifs à immersion avec un chiffon doux inbibé d'éthanol/ éther (3 ml/7 ml) ou de benzène/ éthanol/ éther (2 ml/2 ml/1 ml), puis essuyer avec un chiffon propre non pelucheux.

5. Nettoyer les oculaires avec un chiffon doux non pelucheux; on peut aussi utiliser du papier optique ou des serviettes à démaquiller.

6. Utiliser la vis de blocage du microscope fixée à la base de la boîte pour éviter que l'instrument ne soit abîmé pendant le transport.

7. Donner le numéro du modèle et si possible le numéro de l'instrument et de la pièce lors des commandes de pièces détachées.

Ce que vous ne devez pas faire

1. Ne pas utiliser le papier ou le chiffon qui a servi à nettoyer l'objectif à immersion pour nettoyer les oculaires.

2. Ne pas nettoyer les surfaces peintes du microscope à l'alcool. 3. Ne pas démonter, ni essayer de nettoyer les parties du microscope diffici

les à atteindre, sauf si l'on a été formé à le faire. 4. Ne pas laisser les orifices de la tête et de la couronne vides; les reboucher

avec les obturateurs appropriés ou avec du sparadrap. 5. Ne pas échanger les objectifs ou les oculaires de microscopes de marques

différentes - même les divers modèles d'un même fabricant peuvent avoir des caractéristiques différentes.

7

Etalonnage du microscope La taille est un critère important de détermination de nombreux parasites, en particulier lorsqu'il s'agit de kystes et d'œufs. On peut la déterminer au moyen d'une cellule hématirnétrique (de Neubauer) ou d'un micromètre oculaire. Avec ce dernier, on procède de la manière suivante:

1. L'échelle oculaire est divisée en 100 petites divisions. 2. L'échelle du micromètre objectif représente 1 mm divisé en fractions de

0,1 mm, elles-mêmes divisées en fractions de 0,01 mm. 3. Insérer le micromètre oculaire (un disque de verre rond) dans l'oculaire,

en enlevant les lentilles supérieures et en posant le disque sur le diaphragme de champ.

4. Remettre l'oculaire dans le microscope. 5. Mettre le micromètre objectif sur la platine du microscope. 6. Mettre au point sur le micromètre objectif avec l'objectif le plus faible. 7. Ajuster les deux échelles (oculaire+ objectif) jusqu'à ce qu'elles soient

parallèles. 8. Noter le nombre de divisions de l'oculaire et leur dimension sur le micro

mètre objectif, par exemple, 50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm; 10 divisions de l'oculaire = 0,15 mm.

9. A partir de ce résultat, calculer la valeur d'une division de l'oculaire comme suit: 50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm 1 division de l'oculaire = 0,75/50 = 0,015 mm ou 10 divisions de l'oculaire= 0,15 mm 1 division de l'oculaire = 0,15/10 = 0,015 mm.

10. Passer des mm aux f.im (1 mm = 1000 f.im), par exemple, 0,015 mm = 15 f.im.

11. Répéter l'opération pour tous les objectifs et noter le résultat obtenu pour chacun d'eux.

12. L'étalonnage n'a besoin d'être fait qu'une fois pour chaque microscope.

8

Prélèvements de selles On examine les prélèvements de selles à la recherche de protozoaires et de larves ou d'œufs d'helminthes.

Les différentes formes de protozoaires retrouvées dans les selles sont les formes végétatives et les kystes. Pour les helminthes, les stades que l'on retrouve en général sont les œufs et les larves, bien qu'on puisse également observer des vers adultes ou des segments de vers. Les vers adultes et les segments de ténias sont en général visibles à l'œil nu, mais les œufs, les larves, les formes végétatives et les kystes ne sont visibles qu'au microscope. Pour pouvoir voir ces structures, les matières fécales doivent être correctement préparées et examinées.

Techniques de prélèvement

En raison de la fragilité de nombreux parasites intestinaux et de la nécessité de ne pas modifier leur morphologie pour pouvoir les déterminer avec certitude, on ne pourra poser un diagnostic microscopique fiable que si les selles sont correctement recueillies.

1. Donner au malade le matériel suivant:

- une boîte en carton paraffiné avec couvercle emboîté ou une boîte en plastique avec couvercle bien ajusté, et 2 bâtonnets applicateurs.

Si l'on ne dispose pas de boîte paraffinée ni de boîte en plastique, on peut utiliser des boîtes de conserve ou des pots en verre. Ne pas utiliser de feuilles de bananier ni de boîtes d'allumettes pour la collecte et la conservation des selles. Dans les programmes de lutte, il suffit souvent d'examiner un seul prélèvement, mais pour des malades, il en faut en général trois, recueillis à 3 jours d'intervalle, afin de déceler toutes les infestations parasitaires. Diverses substances peuvent gêner la recherche des parasites (par exemple, les laxatifs, les antiacides, les milieux de contraste ingérés et certains antibiotiques).

2. Demander au malade de déféquer directement dans le récipient, ou sur un morceau de papier et de mettre ensuite la selle dans le récipient au moyen des bâtonnets applicateurs. S'il ne dispose pas de papier, le malade peut déféquer sur une grande feuille propre, comme une feuille de bananier. Toutefois, la selle doit être immédiatement transvasée dans le récipient prévu à cet effet. Elle ne doit pas rester sur la feuille, ni être apportée au laboratoire ainsi.

3. Certains éléments parasitaires, en particulier les formes végétatives d'amibes, vont se décomposer ou se modifier assez rapidement après l'émission de la selle et ne seront plus reconnaissables. Les températures élevées accélèrent cette dégradation. Par conséquent, le prélèvement doit atteindre le laboratoire très rapidement, c'est-à-dire dans la demi-heure qui suit son émission. Sic' est impossible, on ajoutera des conservateurs (voir page 30).

4. Le récipient contenant la selle doit être étiqueté lisiblement et porter les mentions suivantes:

9

les nom et prénom ou le numéro du malade; la date d'émission de la selle;

- l'heure à laquelle elle a été émise (la demander au malade).

moulée

molle

très molle

liquide

TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

5. Le prélèvement doit être suffisamment important pour permettre une analyse satisfaisante. Il doit être au minimum de la taille d'un œuf de pigeon. Il ne doit être ni souillé, ni mélangé à de l'urine, car celle-ci détruit les formes végétatives d'amibes; les saletés gêneront l'examen. Si le prélèvement est trop petit ou s'il est mélangé à de l'urine ou à des saletés, il faut le refuser et demander au malade d'en apporter un autre.

6. Garder le carton contenant l'échantillon dans un réfrigérateur ou, si c'est impossible, dans l'endroit le plus frais et le plus ombragé du laboratoire. Ne pas le garder au chaud ni le laisser au soleil.

Examen

Examen macroscopique des selles

1. Dès que le prélèvement arrive au laboratoire, vérifier sa consistance (degré d'humidité) et inscrire l'une des mentions suivantes sur le récipient: moulée, molle, très molle, liquide. S'il y a du mucus, inscrire la lettre Met s'il y a du sang, inscrire la lettre S. Par exemple, une selle très molle avec du sang et du mucus portera la mention très molle, S, M. La consistance, ou le degré d'humidité, constituera une indication quant à la présence possible de formes végétatives ou de kystes de protozoaires. Les diverses catégories de selles et les techniques à utiliser figurent dans le tableau 1.

2. Si l'on reçoit plusieurs prélèvements à la fois, on examinera d'abord ceux qui contiennent du sang et du mucus, puis ceux qui sont liquides. Ces prélèvements contiennent en effet très probablement des formes végétatives d'amibes (qui meurent rapidement) et doivent être examinés dans l'heure qui suit l'émission de la selle. Les selles moulées peuvent être examinées dans la journée suivant leur émission, mais ne doivent pas attendre, le lendemain (les kystes peuvent se décomposer).

Examen microscopique de préparations à l'état frais

La préparation à l'état frais est la technique la plus simple et la plus facile à mettre en œuvre pour examiner les selles et il convient de l'employer dans tous les laboratoires périphériques. Une telle préparation se fait directement à partir de la selle ou après concentration (voir page 16). Les principaux types de préparations non fixées que l'on utilise pour les analyses de selles sont les préparations en soluté physiologique, à l'iode et au bleu de méthylène tamponné:

Consistance

Moulée

Molle

Très molle

Liquide

Tableau 1. Catégories de selles et techniques appropriées

Stades Technique à utiliser

des protozoaires Bleu de méthylène les plus Soluté

tamponné susceptibles physiologique Iode (si des formes

d'être retrouvésa végétatives sont visibles)

Kystes + + Kystes (parfois + + + formes végétatives)

Formes végétatives + + Formes végétatives + +

• On peut trouver des œufs et des larves de vers dans tous les types de selles.

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2Z.lt 10/4/84

WHO 886r3

PRÉLÈVEMENTS DE SELLES

La préparation en soluté physiologique sert à un premier examen microscopique des selles. On l'emploie surtout pour mettre en évidence les œufs et les larves de vers, ainsi que les formes végétatives et les kystes de protozoaires. Ce type de préparation peut également révéler la présence d'hématies et de leucocytes.

- La préparation à l'iode est surtout utilisée pour colorer le glycogène et les noyaux des kystes, s'il y en a. On peut en général identifier précisément les kystes dans ce type de préparation. Il faut faire un montage au bleu de méthylène tamponné chaque fois que l'on observe des formes végétatives d'amibes ou que l'on soupçonne leur présence dans une préparation en soluté physiologique. Il colore les formes végétatives d'amibes mais pas les kystes amibiens, pas plus que les formes végétatives ni les kystes de flagellés. Cette coloration ne convient qu'aux préparations à l'état frais. Elle n'est pas employée sur les prélèvements conservés dans lesquels les parasites sont morts.

Matériel et réactifs

1 Lamelles couvre-objets 2. Flacons compte-gouttes contenant: du soluté physiologique (réactif No 24)1

du lugol (solution à 1 %) (réactif No 18) du bleu de méthylène tamponné (réactif No 2)

3. Lames porte-objets 4. Crayons ou feutres pour l'étiquetage 5. Anse de platine (ou bâtonnets applicateurs, allumettes, cure-dents)

Préparations en soluté physiologique et à l'iode (examen direct)

1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date sur le côté gauche de la lame avec un crayon gras.

2. Déposer une goutte de soluté physiologique au centre de la moitié gauche de la lame et une goutte de solution iodée au centre de la moitié droite de la lame. NOTE:

Si l'on soupçonne la présence de formes végétatives d'amibes, on emploiera du soluté physiologique chaud (37°C)

0

Tout au long de ce manuel, les " numéros de réactif " renvoient aux numéros attribués aux réactifs dans l'annexe 2.

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3. A l'aide d'un bâtonnet applicateur (allumette ou cure-dents), prélever une petite portion d'échantillon (de la taille d'une tête d'allumette) et mélanger avec la goutte de soluté physiologique. NŒE:

Selle moulée: prélever un petit morceau de façon à avoir à la fois une portion externe et une portion interne de la selle.

Selle accompagnée de mucus: s'il y a du mucus, étiqueter une seconde lame au nom ou au numéro du malade. Déposer une goutte de soluté physiologique sur la lame. Prélever un peu de mucus et le mélanger au soluté. Les formes végétatives, s'il y en a, sont parfois plus faciles à retrouver dans le mucus que dans les parties solides de la selle.

Selle liquide: s'il n'y a pas de mucus, prélever un peu de liquide et mélanger avec le soluté physiologique.

4. De la même façon, prélever un peu de selle et mélanger avec la goutte d'iode pour faire une préparation à l'iode. Si l'on utilise une anse de platine, la passer à la flamme après usage. Si l'on emploie des bâtonnets applicateurs, les jeter.

5. Recouvrir la goutte de soluté physiologique et la goutte d'iode d'une lamelle. Pour cela, tenir la lamelle inclinée au contact de la lame. Toucher le bord de la goutte et abaisser doucement la lamelle. Cela permet d'éviter les bulles d'air dans la préparation.

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Préparation au bleu de méthylène tamponné (A réalisersi l'on observe des formes végétatives d'amibes dans la préparation en soluté physiologique) Procéder comme décrit de 1 à 5 pour les préparations en soluté physiologique et à l'iode, mais déposer une grosse goutte de bleu de méthylène tamponné au lieu du soluté physiologique ou de l'iode. Attendre 5 à 10 minutes avant d' examiner la préparation pour permettre au colorant de pénétrer dans les formes végétatives. Le bleu de méthylène tamponné va surcolorer celles-ci au bout d'environ 30 minutes. ll faut donc examiner la lame dans les 30 minutes qui suivent sa préparation.

Examen 1. Poser la lame montée sur la platine du microscope et mettre au point avec

l'objectif x 10 (faible grossissement). 2. Régler la lumière dans le champ à l'aide du diaphragme. On doit pouvoir

distinguer nettement les objets situés dans le champ. Il ne faut ni trop, ni trop peu de lumière.

3. Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec l'objectif x 10; mettre au point sur le coin supérieur gauche, puis déplacer la lame régulièrement d'avant en arrière ou de haut en bas.

4. Si l'on observe des parasites ou des éléments suspects, passer à l'objectif supérieur et augmenter la lumière en ouvrant le diaphragme afin d' observer leur morphologie en détaiL

Il s'agit d'un examen systématique. Si les lames sont examinées de cette façon, tout parasite présent sera en général trouvé. En revanche, si la lame n'est pas examinée attentivement, des parasites peuvent échapper à l'observation. Examiner chaque champ microscopique soigneusement, en faisant varier la mise au point en hauteur, avant de passer au champ suivant.

NE PAS OUBLIER D'EXAMINER LES PRÉPARATIONS DE MANIÈRE SYSTÉMATIQUE

La Fig. 1 indique quels sont les examens à effectuer au laboratoire, aux différents niveaux.

Identification des parasites

Œufs et larves de vers dans les préparations en soluté physiologique Les œufs sont faciles à déceler et à identifier dans le soluté physiologique. ll ne faut pas les colorer (le colorant peut gêner la détermination). La plupart des œufs sont suffisamment grands pour être reconnus au faible grossissement (x 10), mais quelques œufs plus petits nécessiteront un grossissement plus fort.

Dans les préparations en soluté physiologique, les larves de Strongyloides stercoralis peuvent être visibles. Si le prélèvement est frais, il n'y a en général pas

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de larves d'ankylostomes, mais s'il est plus ancien, on peut avoir à les distinguer des premières.

Fig. 1. Techniques d'examen des selles selon l'importance du laboratoire

Laboratoire du centre de santé

Prélèvement de selles- étalement direct de matériel frais

soluté physiologique - et

{

(si l'on a observé des formes végétatives d'amibes) - bleu de méthylène tamponné

- étalement épais sous cellophane

- solution iodée

- soluté physiologique Tous prélèvements- concentration au -L . . . formol/éther - solution 1odee

Hôpital de district

Prélèvements de selles sans conservateur

soluté physiologique- et Etalement direct à l'état frais (si les selle{ (si l'on a observé des formes végétatives d'amibes) ne sont pas moulées ou si l'on observe - bleu de méthylène tamponné la présence de sang et de mucus)

- solution iodée

-f soluté physiologique

Tous prélèvements- concentration au formol/éther - solution iodée

Prélèvements de selles avec conservateur

Fixés au formol - concentration au formol/éther

-[ soluté physiologique

solution iodée

On trouvera dans la deuxième partie, pp. 69-73, les caractéristiques permettant d'identifier les différentes sortes d'œufs et de larves avec des diagrammes et des clés d'identification.

Certains vers ont une répartition géographique restreinte et on ne trouve donc pas tous les vers partout dans le monde. Il faut établir une liste des espèces présentes dans la région où ont lieu les examens.

Protozoaires dans les préparations de matériel frais

Préparations en soluté physiologique Dans le soluté physiologique, on peut observer les formes végétatives et kystes d'amibes et de flagellés. Les kystes vont apparaître comme des structures rondes ou ovales, réfringentes; les formes végétatives d'amibes peuvent être rondes ou irrégulières, celle des flagellés sont en général piriformes (allongés, en forme de poire). Dans les selles fraîches (maximum, 1 heure), on peut observer des formes végétatives mobiles. Cette mobilité peut être très utile pour identifier l'espèce, en particulier dans le cas des flagellés. La mobilité caractéristique de chaque espèce est décrite dans la deuxième partie (pp. 74-82).

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On peut déceler les éléments parasitaires au faible grossissement (x 10), mais il faut un grossissement plus fort pour identifier de façon fiable des structures comme les kystes ou les formes végétatives. On peut alors observer la mobilité des éléments, des inclusions comme les érythrocytes et les levures dans les formes végétatives d'amibes, les cristalloïdes dans les kystes d'amibes, ainsi que la forme et les détails structuraux (par exemple, cytostomes, sillon de torsion ou filaments) des formes végétatives et kystes de flagellés. Aucun détail du noyau n'est visible dans les préparations en soluté physiologique. Toutefois, il faut régler soigneusement la lumière du microscope de façon que les objets apparaissent nettement. Trop ou trop peu de lumière gêneront l' observation. Il faut également mettre au point à différentes profondeurs de la préparation, afin de voir toutes les couches de la préparation. Se souvenir qu'il faut examiner l'ensemble de la zone recouverte par la lamelle de façon systématique, afin de diminuer le risque que des parasites échappent à l'observation.

Préparations au bleu de méthylène tamponné

Si l'on observe des formes végétatives d'amibes ou des structures qui leur ressemblent, il faut faire une préparation au bleu de méthylène et l'examiner. Au bout de 5 à 10 minutes de coloration, les formes végétatives restent parfois mobiles, mais souvent elles se mettent en boule dans ces préparations. (Ne pas confondre des formes végétatives en boule avec des kystes; les kystes ne se colorent pas au bleu de méthylène). Dans les formes végétatives, le noyau et les inclusions (érythrocytes, levures) se colorent en bleu foncé, le cytoplasme en bleu clair. Il peut arriver que certaines formes végétatives ne se colorent pas; il faut donc rechercher les éléments bien colorés. Chercher les granules périnucléaires (granules situés le long de la membrane entourant le noyau)); s'ils sont présents, le parasite appartient à une espèce d'Entamoeba qu'il faut identifier. (Les caractéristiques permettant d'identifier les formes végétatives d'amibes figurent dans la deuxième partie, pp. 74-76).

Préparations à l'iode

Les préparations à l'iode servent à repérer les kystes d'amibes et les kystes de flagellés. On peut les déceler à l'objectif x 10, mais ils ne sont pas aussi réfringents que dans le soluté physiologique. Pour observer les caractéristiques des kystes, il faut un grossissement plus fort; on mesurera les diverses structures pour être sûr d'identifier correctement ces kystes.

Dans la solution iodée, le cytoplasme des kystes se colore en jaune ou en brun clair et le noyau en brun foncé. Dans les kystes d'Entamoeba colorés à l'iode, la disposition de la chromatine périphérique et la position du caryosome sont visibles. Les granulations chromatiques périphériques se colorent en jaune clair et ne sont pas toujours faciles à voir. Parfois, les jeunes kystes contiennent du glycogène qui se colore en brun foncé avec l'iode.

Dans les kystes de flagellés colorés à l'iode, on peut observer les filaments.

Dans les préparations à l'iode, on peut en général identifier précisément les kystes d'amibes et de flagellés. Toutefois, il est parfois impossible de faire une détermination précise et il peut s'avérer nécessaire de faire une coloration permanente.

Les caractéristiques permettant d'identifier les kystes figurent dans la deuxième partie, pp. 76-82.

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----------- ' TECHNIQUES DE PRÉLÈVEMENT, DE PRÉPARATION ET D'EXAMEN

Techniques complémentaires

En plus des préparations à frais directes, on dispose de méthodes complémentaires pour le diagnostic des parasitoses intestinales. Les plus couramment employées sont les techniques de concentration pour la recherche des œufs, larves et kystes, et celles de coloration permanente pour la mise en évidence des formes végétatives et des kystes.

Technique de concentration

Si les éléments parasitaires ne sont pas présents en grand nombre dans l'échantillon des selles examinées, la préparation à l'état frais peut ne pas suffire pour déceler une infestation. Ainsi, dans la mesure du possible, on concentrera les selles. Cette concentration permettra de mettre en évidence les œufs de vers, les larves et les kystes de protozoaires, mais PAS les formes végétatives de protozoaires, car ils sont en général détruits au cours du processus de concentration. L'examen direct d'une préparation à l'état frais est donc la première étape obligatoire de tout examen microscopique.

La technique de concentration s'impose lorsque l'examen de la préparation à frais est négatif en dépit de symptômes cliniques d'une infestation parasitaire présentés par le malade; elle est également indiquée pour déceler les genres Schistosoma et Taenia.

La technique de concentration recommandée est la méthode formol-éther (ou formol-acétate d'éthyle)1. Cette méthode permet de retrouver tous les types d'œufs de vers (ascaris, ténia, schistosomes et autres œufs de douves), les larves, et les kystes de protozoaires.


1. Bâtonnets applicateurs, en bois 2. Pissettes en verre ou en plastique, de 250 ml ou 500 ml. Ces flacons sont

pratiques pour rajouter du formol dans les tubes à centrifuger. Toutefois, on peut utiliser n'importe quel petit flacon ou fiole.

3. Centrifugeuse, avec couronne et adaptateurs pour tubes coniques de 15 ml. Il faut utiliser des gaines étanches.

4. Tubes à centrifuger, 15 ml, coniques (inscrire une graduation à 7 ml et une à 10 ml au crayon gras).

5. Ecouvillons de coton 6. Lamelles couvre-objets 7. Entonnoir 8. Gaze chirurgicale 9. Lames porte-objets

10. Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc 11. Supports pour tubes 12. Formol, 10% (réactif No 10). Pour l'usage quotidien, verser une partie de

la solution dans une pissette en plastique, et l'étiqueter. 13. Ether ou acétate d' éthyle1

14. Lugol, solution à 1% - dans une pissette en verre ou un flacon comptegouttes (réactif N° 18)

15. Soluté physiologique (réactif No 24)

1 Si l'on ne dispose pas d'éther ni d'acétate d'éthyle, prendre exactement la même quantité d'essence ordinaire. L'acétate d'éthyle n'est pas aussi inflammable ni aussi explosif que l'éther, il est donc moins dangereux à manipuler au laboratoire.

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Ether Débris

Formol

Culot ê ~

Quatre couches après ~ centrifugation finale


ATTENTION

L'éther est une substance extrêmement inflammable qui s'enflamme et explose rapidement au contact d'une flamme ou d'une étincelle. Conserver les bidons ou les flacons entamés sur une étagère dans la partie la plus fraîche du laboratoire. S'assurer qu'ils sont bien bouchés. Ne PAS mettre un flacon d'éther entamé au réfrigérateur: les vapeurs s'accumulent dans celui-ci, même si le flacon est fermé, et peuvent exploser lorsqu'on ouvre la porte. Ne pas ranger des flacons déjà entamés dans une armoire. Il vaut mieux les laisser sur une étagère de façon que les vapeurs puissent se disperser facilement.

Technique

1.

2.

3.

4. 5.

6.

7.

8.

9.

Verser 10 ml de formol à 10% sur environ 1 g de selles et mélanger à l'aide d'un bâtonnet applicateur jusqu'à obtention d'une suspension légèrement trouble. Mettre une couche de gaze dans un entonnoir et tenir l'entonnoir au-dessus du tube à centrifuger. Faire passer la suspension de matière fécale à travers la gaze dans le tube à centrifuger jusqu'à obtenir 7 ml. Retirer la gaze et la jeter. Ajouter 3 ml d'éther ou d'acétate d'éthyle et mélanger pendant une minute. Centrifuger pendant une minute. Le tube doit avoir le même aspect que sur le diagramme ci-contre. Décoller le bouchon gras (débris) avec un bâtonnet applicateur et jeter le surnageant en renversant le tube d'un mouvement rapide. Remettre le tube dans son support et laisser le liquide des parois descendre vers le culot. Mélanger soigneusement et prélever une goutte de liquide avec une pipette Pasteur pour la déposer sur une lame; couvrir avec une lamelle et examiner. Faire également une préparation colorée à l'iode. Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec les objectifs x 10 et x 40 à la recherche d'œufs, de kystes et de larves.

Examen du culot

Les lames de matériel concentré doivent être examinées de la même façon que les préparations à frais (voir p. 13). Les préparations en soluté physiologique (non colorées) seront examinées de façon systématique, à la recherche d'œufs, de larves et de kystes. Si l'on observe des kystes ou des éléments qui leur ressemblent, on examinera une préparation à l'iode pour avoir plus de détails.

Les parasites ont le même aspect que dans les préparations à frais. Dans les préparations en soluté physiologique de sédiment obtenu par la méthode au formol-éther (ou à l'acétate d'éthyle), les noyaux des kystes sont fixés et peuvent être visibles. Toutefois, il faut quand même examiner des préparations à l'iode pour que l'identification soit plus fiable.

Techniques de coloration permanente

Dans la pratique courante, on ne fait pas de coloration permanente pour le diagnostic, ni pour l'identification des œufs ou des larves de vers. Toutefois, elles sont parfois nécessaires dans les cas suivants:

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identification des oocystes de Cryptosporidium; identification des formes végétatives de protozoaires, en cas de doute;' confirmation de l'identité des kystes de protozoaires, en cas de doute; conservation d'un matériel de référence; envoi à un laboratoire de référence pour avoir l'avis d'un expert.


Coloration des oocystes de Cryptosporidium

Les oocystes de Cryptosporidium qui se trouvent dans les selles sont sphériques, et mesurent 4 à 6 J.lm de diamètre. On peut les concentrer par une technique au formol-éther modifiée, mais leur identification fait appel à des techniques de coloration. La technique de Ziehl-Neelsen modifiée est celle que l'on recommande. On peut aussi employer la technique à la safranine-bleu de méthylène ..

Matériel

Bâtonnets applicateurs en bois Lamelles couvre-objets Pinces Lames porte-objets Crayon ou feutre pour l'étiquetage Agitateur en verre Support pour lames, pour les lames montées Boîtes à coloration Papier absorbant ou éponge.

Technique de Ziehi-Neelsen modifiée

Réactifs

Fuchsine phéniquée (réactif No 4) Formol (formaldéhyde) (réactif No 10) Solution d'acide chlorhydrique-éthanol (réactif No 13) Solution de glycérol-vert malachite (ou bleu de méthylène) (réactif N° 12) Solution d'acide chlorhydrique-méthanol (réactif No 14) Eau.

Préparation

1. Faire un étalement mince de matières fécales, le laisser sécher à l'air et le fixer dans le méthanol pendant 2 à 3 minutes. Dans la mesure du possible, on le fixera ensuite dans des vapeurs de formol pour diminuer son infectiosité. (Le culot d'extraction obtenu avec le formol-éther n'est pas utilisable.)

2. Colorer l'étalement à la fuchsine phéniquée froide pendant 5 à 10 minutes. 3. Procéder à une différenciation par la solution d'acide chlorhydrique-étha

nol à 1% jusqu'à ce que le colorant ne diffuse plus. 4. Rincer à l'eau du robinet. 5. Effectuer une contre-coloration au vert malachite (ou au bleu de méthy-

lène) à 0,25% pendant 30 secondes. 6. Rincer à l'eau du robinet. 7. Sécher au buvard ou égoutter. 8. Examiner à un fort grossissement et confirmer la morphologie à l'aide de

l'objectif à immersion. Mesurer les oocystes. Ceux de Cryptosporidium mesurent 4 à 6 J.lm.

Lorsqu'ils sont colorés par cette technique, les oocystes de Cryptosporidium apparaissent comme des sphérules rose vif sur fond vert pâle. On peut observer différents degrés de coloration interne, en fonction de l'âge et de l'état de l'oocyste.

Technique à la safranine-bleu de méthylène

Réactifs

Solution d'acide chlorhydrique-méthanol (réactif No 14) Solution de bleu de méthylène-phosphate (réactif No 19)

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Solution de safranine (réactif No 23) Eau.

Préparation

1. Préparer un étalement mince de matières fécales. 2. Le sécher à l'air. Le passer dans la flamme d'une lampe à alcool. 3. Fixer l'étalement dans une solution d'acide chlorhydrique-méthanol pen

dant 4 minutes. 4. Le rincer à l'eau du robinet. 5. Le colorer ensuite avec une solution aqueuse de safranine à 1% pendant

1 minute. Chauffer le colorant en tenant un écouvillon imbibé d'alcool enflammé sous la lame. Ne pas laisser le colorant sécher sur l'étalement.

6. Rincer le colorant à l'eau du robinet. 7. Effectuer une contre-coloration avec une solution de bleu de méthylène à

1% (p /v) pendant 30 secondes. 8. Rincer à l'eau du robinet et sécher la lame. 9. Balayer l'étalement avec l'objectif x 40 à la recherche d' oocystes, qui seront

ensuite identifiés à l'objectif x 100. Les oocystes de Cryptosporidium sont des corpuscules ronds à ovales, de couleur rose-orangé (4 à 6j..lm de diamètre). Les sporozoïtes situés à l'intérieur des oocystes sont un peu plus foncés.

Technique de coloration au trichrome pour les protozoaires

Cette technique est intéressante pour colorer les prélèvements de selles fraîches, ainsi que le matériel fixé à l'alcool polyvinylique (APV). Cependant, il importe de s'assurer que la durée de conservation des réactifs n'est pas dépassée et que la méthode est suivie scrupuleusement si l'on veut obtenir des résultats fiables.

Réactifs

Solution décolorante d'acide acétique dans l'alcool (réactif N° 1) Ethanol à 70% (réactif N° 7) Ethanol à 95%1

Solution de xylène phéniqué (réactif No 5) ou éthanol absolu Solution d'iode dans l'alcool (réactif No 16) Fixateur de Schaudinn (réactif No 25) Solution de trichrome (réactif No 27) Xylène1

Préparation des boîtes à coloration, et renouvellement des colorants

i) Etiqueter les boîtes à coloration nécessaires pour l'opération et les disposer en ligne dans l'ordre suivant:

1. Fixateur de Schaudinn 2. Solution d'iode dans l'alcool 3. Ethanol à 70% (1) 4. Ethanol à 70% (2) 5. Solution de trichrome 6. Solution décolorante d'acide acétique dans l'alcool 7. Ethanol à 95% (1) 8. Ethanol à 95% (2) 9. Xylène phéniqué ou éthanol absolu

10. Xylène

1 Ce réactif ne demande aucune préparation. Il est directement utilisé à partir des récipients dans lesquels il a été acheté.

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Disposer plusieurs couches de papier absorbant devant les boîtes. Si on n'en a pas, prendre des éponges ou du papier journal.

ii) Remplir chaque boîte avec la solution appropriée. S'assurer que le fixateur de Schaudinn comprenne bien de l'acide acétique.

iii) Verser un peu de milieu de montage dans un petit flacon muni d'un couvercle ou d'un bouchon. (Conserver le grand flacon de solution-mère hermétiquement fermé pour éviter toute évaporation.)

La série de boîtes à coloration est disposée dans un endroit pratique où on la laisse, pr~te à l'emploi. Si les rebords des boîtes sont en verre dépoli, enduire la surface dépolie d'une fine couche de vaseline afin qu'ils adhèrent bien aux couvercles.

On renouvellera les solutions à intervalles réguliers comme suit:

1. Fixateur de Schaudinn- à renouveler une fois par mois. Verser le reste de fixateur dans un flacon à déchets pour solutions organiques et le remplacer par une solution fraîche.

2. Solution d'iode dans l'alcool- à renouveler toutes les trois semaines. Si la couleur s'altère ou devient trop pâle, la remplacer immédiatement.

3. Ethanol à 70% (1). Cette solution va jaunir avec l'iode de la solution d'iode dans l'alcool. La renouveler toutes les 3 semaines ou après avoir coloré 30 étalements, selon le cas.

4. Ethanol à 70% (2) - à renouveler toutes les trois semaines. 5. Solution de trichrome - à ne renouveler que lorsqu'elle devient verdâtre.

Remuer doucement la boîte d'avant en arrière. Si ses parois ont l'air plus vertes que pourpres, jeter le colorant et le remplacer par du colorant frais.

6. Solution décolorante à l'alcool- acide acétique- à renouveler après avoir décoloré 20 étalements, ou une fois par semaine, selon le cas.

7. Ethanol à 95% (1) -à renouveler une fois par semaine. 8. Ethanol à 95% (2) - à renouveler toutes les deux semaines. 9. Ethanol absolu- à renouveler une fois par semaine; xylène phéniqué- à

renouveler une fois par mois. 10. Xylène- à renouveler une fois par mois.

Tenir un registre de chaque solution, avec mention de la date à laquelle elle a été versée dans la boîte, par exemple:

Solution

Schaudinn

Iode dans l'é\lcool

Première utilisation le

13 janvier 1990

7 janvier 1990

A renouveler le

12 février 1990

28 janvier 1990

Vérifier ce registre chaque semaine. Ainsi, les solutions coloreront toujours de manière satisfaisante les étalements de matières fécales. NOTE:

Laisser les boîtes à coloration couvertes en permanence, sauf pour introduire ou retirer des lames. Ne pas enlever les couvercles en cours de coloration. Si elles ne sont pas couvertes, les solutions vont absorber l'humidité de l'air et ne permettront plus une bonne coloration.

La solution de xylène phéniqué et le xylène sont des solutions déshydratantes et éclaircissantes; elles éliminent l'eau et rendent le matériel translucide ce qui permet de l'examiner. Si ces solutions captent l'humidité, elles seront moins efficaces. On observe parfois dans les boîtes des gouttelettes d'humidité dues à la condensation. Si cela se produit, il faut jeter la solution et la remplacer par une solution fraîche.

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Technique

1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date sur une lame.

2. Prélever un peu de matière fécale au moyen d'un bâtonnet applicateur et l'étaler en une couche mince en frottant ce dernier de gauche à droite au milieu de la lame. La couche de matière fécale doit être aussi uniforme et lisse que possible et doit avoir la bonne densité. Il faut agir rapidement pour éviter que l'étalement ne sèche et plonger immédiatement la lame dans le fixateur de Schaudinn. NOTE:

Si la selle est dure, on en mélangera une petite quantité avec du soluté physiologique pour la ramollir et pouvoir faire l'étalement.

ENTRE LE MOMENT OÙ IL EST PRÉPARÉ ET LE MOMENT OÙ IL EST MONTÉ,

L'ÉTALEMENT NE DOIT PAS SÉCHER

3. Fixer dans le fixateur de Schaudinn pendant 1 heure à température ambiante. (S'ille faut, on peut le laisser dans le fixateur pendant 2 jours). Disposer la lame dans la boîte à coloration de façon que l'extrémité portant le nom du malade soit dirigée vers le haut.

4. Saisir la lame avec une pince. L'égoutter en mettant le bord de la lame sur du papier absorbant ou une éponge. La plonger ensuite dans la boîte à coloration suivante.

5. La laisser dans la solution d'iode dans l'alcool pendant 1 minute (ni plus, ni moins). L'en sortir et l'égoutter comme en 4. La plonger dans la boîte suivante.

6. La laisser dans l'éthanol à 70% (1) pendant 1 minute. La retirer et l'égoutter.

7. La laisser dans l'éthanol à 70% (2)1 pendant 1 minute. La retirer et l'égoutter.

8. La colorer avec la solution de trichrome pendant 8 minutes. La retirer et l'égoutter.

1 Si la coloration doit être interrompue, on peut laisser la lame dans de l'éthanol à 70% (2). C'est la seule étape au cours de laquelle on peut interrompre le processus. Si la coloration a dépassé cette étape (point 7), il faut la terminer: elle ne doit pas être interrompue au-delà de ce point.

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9. Décolorer avec la solution d'alcool-acide acétique- prendre la lame avec des pinces et la plonger deux fois dans la solution (5 secondes au total). La solution d'alcool-acide continuera à décolorer l'échantillon aussi longtemps qu'elle restera en contact avec l'étalement et 5 secondes suffisent donc. (NE PAS plonger la lame dans la boîte et compter jusqu'à 5.) Egoutter la lame sur du papier absorbant ou une éponge. Rincer immédiatement l'étalement à l'éthanol à 95% (1) pour éliminer l'acide.

10. Plonger la lame une seule fois dans l'éthanol à 95% (1) pendant 1 à 2 secondes. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante.

11. Plonger la lame deux fois dans l'éthanol à 95% (2) pendant 2 à 3 secondes. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante.

12. Plonger la lame dans le xylène phéniqué ou l'éthanol absolu pendant 1 minute. L'égoutter avant de la mettre dans la boîte suivante.

13. La laisser dans le xylène pendant 2 à 3 minutes. 14. La retirer et l'égoutter. NE PAS LAISSER LA LAME SÉCHER A V ANT DE

LA RECOUVRIR AVEC LA LAMELLE. Si elle commence à sécher, la retremper dans le xylène- mais égoutter le xylène en excès avant de mettre le milieu de montage sur l'étalement.

15. Poser la lame à plat sur du papier absorbant, ou sur un morceau de papier journal, et à l'aide d'un agitateur en verre verser 3 ou 4 gouttes de milieu de montage sur l'étalement. Tenir la lamelle inclinée, le bord touchant le bord de l'étalement. L'abaisser doucement sur ce dernier, de façon que le milieu s'étale sous la lamelle sans former de bulles d'air. NOTE:

Si l'on colore plusieurs étalements à la fois, les décolorer chacun séparément. Prendre un étalement dans la boîte à coloration, l'égoutter, le décolorer, le rincer à l'éthanol à 95%, l'égoutter et le mettre dans le xylène phéniqué ou l'éthanol absolu (points 9 à 12). Retirer ensuite une autre lame du colorant et lui faire subir le même traitement. Continuer jusqu'à ce que tous les étalements aient été décolorés.

Si l'on colore plusieurs lames, en retirer une seule à la fois du xylène, l'égoutter et la monter. Si certains étalements restent dans le xylène 4 à 5 minutes, ils ne seront pas abîmés. Laisser la préparation montée bien à plat sur du papier absorbant ou sur un morceau de papier journal, sur une table ou une surface plane; elle doit rester ainsi jusqu'à ce qu'elle soit sèche, ce qui peut prendre la nuit ou davantage. Toutefois, on peut examiner les préparations au bout de 30 minutes, mêmes si elles ne sont pas tout à fait sèches. Après examen, ne pas essayer d'enlever l'huile d'immersion jusqu'à ce que le montage soit tout à fait sec (environ 24 heures), car en essuyant l'huile on risque d'enlever la lamelle. Si cela se produit, rincer immédiatement l'étalement au xylène pendant 5 secondes et refaire le montage.

Technique pour les prélèvements de selles fixés dans l' APV

1. Remuer le prélèvement de selle fixé dans l' APV doucement mais complètement (voir p. 30), de façon à bien mélanger la selle et le fixateur.

2. Etiqueter une lame comme indiqué au point 1 de la technique utilisée pour les selles fraîches.

3. Plonger un bâtonnet applicateur dans le prélèvement fixé dans l' APV afin d'en retirer un peu de suspension de selle. Etaler cette dernière en faisant rouler le bâtonnet sur la lame. On peut également étaler la selle en tapotant le bâtonnet sur la lame et en le frottant de bas en haut au fur et à mesure qu'on l'étale.

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La couche de matière fécale doit être aussi uniforme et lisse que possible. On doit pouvoir tout juste distinguer des caractères d'imprimerie fins au travers, mais sans pouvoir les lire. Les préparations trop épaisses ne se colorent pas bien et sont difficiles à examiner. Si la préparation est trop mince, il n'y a pas suffisamment de matériel pour que l'examen soit fiable.


matière fécale étalée en tapotant le bâtonnet

~

4. Les étalements DOIVENT SÉCHER avant de pouvoir être colorés. Les laisser sécher sur une surface plane ou dans un support pour lames. On peut les laisser à température ambiante ou dans une étuve à 37°C. Il faut en généraiS à 10 heures de séchage, généralement pendant la nuit. Il est préférable de préparer les étalements dans la journée, de les laisser sécher la nuit et de les colorer le lendemain. En cas de besoin, on peut conserver les étalements secs 3 à 4 semaines avant de les colorer.

5. Plonger l'étalement séché fixé à l' APV dans une solution d'iode dans l'alcool.

i) Solution d'iode dans l'alcool- 15 minutes. Egoutter comme indiqué précédemment pour les étalements préparés à partir de selles fraîches.

ii) Ethanol à 70% (1)- 5 minutes. Egoutter. iii) Ethanol à 70% (2)- 5 minutes. Egoutter. iv) Solution de trichrome- 8 minutes. Si l'on colore plusieurs lames à la

fois, n'en retirer qu'une du colorant et l'égoutter (laisser les autres dans le colorant). Ne décolorer qu'une lame à la fois.

v) Solution décolorante à l'alcool-acide acétique- tenir la lame avec des pinces et la plonger rapidement dans la solution décolorante à 2 ou 3 reprises (5 secondes au total). L'égoutter 1 à 2 secondes. (Voir point 9 page 22).

vi) Ethanol à 95% (1) -Plonger la lame à deux reprises dans la solution pour éliminer l'acide. L'égoutter 2 secondes.

vii) Ethanol à 95% (2)- 5 minutes. Egoutter. viii) Solution de xylène phéniqué ou alcool absolu - 7 minutes. Egoutter.

ix) Xylène- 10 minutes. x) Retirer une lame du xylène, l'égoutter pendant 2 secondes, puis la

poser à plat ·sur du papier absorbant ou un morceau de papier. Pour le montage, procéder comme indiqué pour les échantillons de selles fraîches (page 22).

Aspect de l'étalement coloré au microscope

L'aspect des étalements préparés à partir de selles fixées dans l' APV est le même que celui des selles fraîches, mais on peut observer des variations d'un étalement à l'autre en raison:

- de l'épaisseur des étalements qui ne sera jamais exactement la même, - de la durée de la décoloration qui peut être légèrement différente, et - du fait que les selles varient d'une personne à l'autre.

En générat le substrat est coloré en vert ou en bleu-vert. Il peut arriver qu'un échantillon se colore en rouge, mais cela n'empêche pas de repérer ni d'identifier les éléments parasitaires. Les différentes inclusions présentes dans les selles se colorent de la manière suivante:

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VERT (ou bleu-vert)

- cytoplasme des formes végétatives et des kystes (bien fixés et bien colo-rés),

- cytoplasme des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire, - levures et moisissures (généralement), - protozoaires dégénérés, - parasites ayant été trop ou trop peu décolorés, - Blastocystis hominis (un protozoaire souvent retrouvé dans les selles),

qui contient des granules rouges situés tout autour de la bordure externe de la cellule.

VIOLET (ou bleu-violet ou rouge-violet)

- cytoplasme des formes végétatives et des kystes (parfois), - kystes d'Entamoeba coli (parfois),

hématies ingérées et bactéries situées à l'intérieur des formes végétatives.

ROUGE (ou rouge-violet)

- hématies ingérées et bactéries situées à l'intérieur des formes végéta-tives,

- levures et moisissures (parfois), - kystes n'ayant pas été correctement fixés, - noyaux des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire, - chromatine nucléaire des formes végétatives et des kystes,

cristalloïdes des kystes d'amibes.

Examen des étalements colorés

1. Poser l'étalement monté et tout à fait sec sur la platine du microscope et mettre au point avec l'objectif le plus faible (x 10). Choisir un endroit qui ne soit ni trop mince ni trop épais. Si l'étalement est uniforme (tous les endroits ont à peu près la même épaisseur), mettre au point au hasard avec l'objectif x 10. Certaines zones de l'étalement peuvent être trop épaisses pour qu'on puisse voir facilement au travers; d'autres peuvent être trop minces. Si l'ensemble de l'étalement est trop épais, rechercher l'endroit le plus mince. Les éléments parasitaires les mieux colorés seront en général retrouvés dans les zones les plus minces. Si l'ensemble de l'étalement semble trop mince, rechercher l'endroit le plus épais. Les éléments parasitaires seront probablement mieux colorés dans ces zones épaisses.

2. Déposer une goutte d'huile à immersion sur l'endroit choisi et passer à l'objectif à immersion. Les étalements colorés de matière fécale doivent être examinés à l'immersion. Ne pas employer le fort grossissement à sec.

3. Mettre soigneusement au point avec l'objectif à immersion. Régler l' éclairage du microscope à l'aide du diaphragme pour avoir suffisamment de lumière et pour pouvoir voir distinctement les cellules, bactéries et autres éléments présents dans le champ. Déplacer la lame sur la platine, en mettant au point soigneusement sur chaque nouveau champ, afin d'observer les éléments présents dans les divers plans de l'étalement. Il faut examiner environ la moitié de l'étalement; il n'est pas nécessaire d'examiner toute la partie recouverte par la lamelle comme cela s'impose avec les préparations en soluté physiologique.

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4. Il s'agit de rechercher principalement les formes végétatives et les kystes d'Entamoeba histolytica et de Giardia. S'il y a beaucoup de parasites dans l'échantillon, ils seront identifiés en quelques minutes. Si ce n'est pas le cas, continuer à examiner l'étalement.

Identification des parasites dans les étalements colorés

Dans les étalements colorés, on observera à la fois les formes végétatives et les kystes d'amibes et de flagellés. Leur cytoplasme sera coloré en bleu-vert ou en vert; les noyaux, inclusions de type hématies et bactéries, les cristalloïdes des kystes d'amibes et les filaments des flagellés se coloreront généralement en rouge ou en violet. Le glycogène est dissous au cours de la coloration et n'est pas visible dans les préparations colorées. Là où il a été éliminé, on observera des zones transparentes ou blanches.

Les caractéristiques employées pour identifier les protozoaires dans les étalements colorés sont présentées dans la deuxième partie, pp. 73-82.

Ecouvillonnage anal à la recherche des œufs d'oxyures

On utilise l' écouvillonnage anal pour déceler la présence des oxyures (Enterabi us vermicularis). Ceux-ci sont plus courants chez l'enfant que chez l'adulte. Toutefois, si dans une famille un enfant a des oxyures il arrive souvent que d'autres membres de la famille soient infestés. Par conséquent, si l'on en trouve chez un enfant, il est souhaitable d'examiner des prélèvements effectués chez tous les membres de la famille, en particulier chez les autres enfants. On retrouve en général les œufs d'oxyures dans les plis cutanés de la marge anale. Ils apparaissent rarement dans les selles.

Prélèvement

Matériel nécessaire pour la méthode A

Centrifugeuse Ecouvillons (coton) Lames porte-objets Pipettes Pasteur avec poires en caoutchouc Soluté physiologique pour humidifier les écouvillons Tubes à essais, 100 x 13 mm

Technique - Méthode A

Ecarter les fesses du malade, et frotter le pourtour de l'anus avec l'écouvillon, mais sans l'introduire dans l'anus. Mettre l'écouvillon dans un tube.

Matériel nécessaire pour la méthode 8

Cellophane adhésive transparente Abaisse-langue ou cuillère en plastique ayant un manche de 10 cm de long Lame porte-objet

Technique- Méthode 8

1. Plier une bande de cellophane adhésive transparente autour de l'extrémité d'un manche de cuillère ou d'un abaisse-langue, le côté adhésif vers l' extérieur.

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2. De l'autre main, écarter les fesses du malade. Appuyer l'extrémité de la cuillère portant la cellophane adhésive en différents endroits de la marge anale.

3. Coller ensuite le morceau de cellophane adhésive sur une lame. Avant de l'examiner, le soulever et déposer une goutte d'huile à immersion en son milieu et le recoller. Cela permettra d'améliorer la transparence de la cellophane.

Se laver les mains; autrement, les œufs qui ont pu les contaminer peuvent provoquer une infestation s'ils arrivent jusqu'à la bouche de l'opérateur.

Pour augmenter les chances de recueillir des œufs,le prélèvement doit être fait entre 22 heures et minuit, ou tôt le matin, avant que le malade n'ait uriné, déféqué ou fait sa toilette. Il est parfois nécessaire de procéder à plusieurs examens avant d'obtenir un résultat positif.

Méthode d'examen

Le prélèvement sur cellophane adhésive permet un examen direct. Pour les écouvillons, procéder comme suit :

1. Verser dans le tube contenant l'écouvillon suffisamment de soluté physiologique pour recouvrir le coton- soit environ 5 ml.

2. Laisser reposer pendant 4 à 5 minutes. 3. Retirer l'écouvillon du soluté. Le rouler contre les parois du tube pour éli-

miner le liquide. 4. Jeter l'écouvillon. 5. Concentrer l'échantillon en le centrifugeant pendant 1 minute. 6. A l'aide d'une pipette, éliminer soigneusement le surnageant sans troubler

le peu de culot présent. 7. Toujours à l'aide d'une pipette, transférer le culot sur une lame pour exa

men. Diminuer l'éclairage du microscope et mettre au point de la surface vers le fond de la préparation pour observer les œufs d'Enterobius (pour leur description, voir deuxième partie, pp. 69-71).

Etalement épais de matière fécale sous cellophane pour le diagnostic des bilharzioses intestinales (technique de Kata-Katz)

Cette technique d' exarpen des étalements épais s'est avérée un moyen efficace pour diagnostiquer les bilharzioses et les helminthiases intestinales. Ces étalements peuvent être préparés sur le terrain, conservés dans des boîtes de lames et expédiés au loin pour examen dans un laboratoire central, le cas échéant. En revanche, elle ne convient pas pour rechercher les larves, kystes ou œufs de certains parasites intestinaux.


Bâtonnets applicateurs, en bois Tamis, en acier inoxydable, nylon ou plastique, avec mailles de 60-105 Plaque perforée en acier inoxydable, plastique ou carton Lames porte-objets Cellophane, de 40 à 50 11rn d'épaisseur, en rectangles de 25 x 30 ou 25 x 35 mm Bocal à fond plat Pinces Papier hygiénique ou papier absorbant Papier journal Solution de glycérol-vert malachite (ou bleu de méthylène) (réactif N°12)

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Technique

Il faut être prudent lorsque l'on recueille des selles et toujours porter des gants pour éviter toute contamination des doigts.

1. Tremper les rectangles de cellophane dans la solution de glycérol-vert malachite ou de bleu de méthylène à 50% pendant au moins 24 heures avant usage.

2. Déposer une petite quantité de matière fécale sur un morceau de papier (le papier journal convient parfaitement).

3. Appuyer le tamis sur l'échantillon. 4. Au moyen d'un bâtonnet applicateur à bord plat, racler la surface supé

rieure du tamis pour recueillir la matière fécale qui sort des mailles. 5. Disposer une plaque perforée sur une lame propre. 6. Déposer un peu de matière fécale tamisée dans la partie évidée et la rem

plir soigneusement. Lisser avec le bâtonnet applicateur. 7. Enlever soigneusement la plaque de façon que toute la matière fécale reste

sur la lame et que rien ne reste accroché à la plaque. 8. Recouvrir avec un rectangle de cellophane ayant trempé dans le glycérol. 9. S'il y a trop de glycérol sur la face supérieure de la cellophane, l'essuyer

avec un morceau de papier hygiénique ou de papier absorbant. 10. Retourner la lame et appuyer l'échantillon contre la cellophane sur une

surface lisse (un morceau de tuile ou de pierre plate fait parfaitement l'affaire) pour l'étaler de manière uniforme.

11. Ne pas retourner la lame d'un coup. La cellophane pourrait se détacher. La soulever doucement sur le côté en maintenant la cellophane.

La préparation de la lame est maintenant terminée. Il peut être nécessaire d'essuyer l'excès de glycérol avec un morceau de papier hygiénique pour que la cellophane reste bien fixée. Avec de la pratique, on peut obtenir des préparations parfaites. La figure 2 montre les différentes étapes de la préparation de Y étalement épais.

Selles dures Le principal problème rencontré avec cette technique d'étalement épais est l'impossibilité d'observer des œufs d'helminthes dans certains échantillons de selles trop dures (constipation). En pareil cas:

après préparation par la méthode classique, attendre 24 à 48 heures avant de compter les œufs sur ces lames. Il se peut qu'elles s'éclaircissent lentement; préparer deux autres échantillons sur une grande lame (5 x 7,6 cm) et utiliser un morceau c~e cellophane légèrement plus grand (35 x 35 mm), puis appuyer très fort pour aplatir l'échantillon au maximum;

- lorsque l'on emploie une grande lame, on peut ramollir les selles avec du soluté physiologique ou du glycérol avant de tamiser.

Observation correcte des lames A température ambiante, on conservera la lame pendant au moins 24 heures avant de l'examiner (voir plus bas pour ce qui concerne les œufs d'ankylostomes). Si l'on met la lame dans un incubateur (40°C) ou sous une lampe à fluorescence ou à incandescence au laboratoire, ou encore au soleil sur le terrain, on peut l'examiner au bout de quelques minutes.

Pour faciliter Y examen microscopique, on peut déposer une ou deux gouttes d'éosine dans le soluté physiologique (1: lOO) sur la face supérieure de la cellophane, que Y on laisse agir 3 à 5 minutes, puis que l'on essuie avec du papier hygiénique ou du papier absorbant. Cela facilite l'observation des œufs de Schistosoma.

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Fig. 2. Technique d'examen des étalements épais de matière fécale sous cellophane (Kato) pour le diagnostic de la bilharziose intestinale et des helminthiases digestives

1. On peut utiliser différents types de matériels. On voit ici la spatule et la plaque perforée en plastique, ainsi que le tamis en nylon d'un nécessaire de KataKatz que l'on trouve dans le commerce. Les deux premiers ustensiles et les lames porte-objets sont réutilisables. Le tamis en nylon est jetable. Il existe quelques nécessaires contenant des plaques perforées normalisées réutilisables, que l'on peut obtenir sur commande.

3. La méthode utilisée pour cette technique est la même quel que soit le matériel employé. Le prélèvement de matière fécale est passé à travers le tamis au moyen d'une spatule afin de séparer la matière fécale des gros débris.

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2. Le tamis en nylon et la cellophane nécessaires pour la technique de l'étalement épais peuvent être achetés en vrac. La cellophane en rouleau est coupée en morceaux de 25-30 mm et déposée dans un flacon à fond plat et à large ouverture contenant une solution de glycérol à 50% (ou davantage) et de vert malachite ou de bleu de méthylène (lOO ml d'eau, 100 ml de glycérol, 1 ml de vert malachite ou de bleu de méthylène en solution aqueuse à 3%).

4. Cette matière fécale tamisée est ensuite mise dans la plaque perforée qui est posée à plat au milieu d'une lame. La partie évidée est entièrement remplie de matière jusqu'à hauteur de la surface de la plaque. La plaque de Kato-Katz que l'on voit ici donne 41,7 mg de matière fécale. Pour obtenir le nombre d'œufs par gramme de matière fécale, on multiplie le nombre d'œufs observés par 24.


Fig. 2. (Suite)

S. Le rectangle de cellophane ayant trempé dans le glycérol pendant au moins 24 heures est posé sur le prélèvement.

7. Les œufs d'Ascaris (gauche) et de Trichuris (droite) sont visibles à tout moment. Les œufs d'ankylostomes (absents ici) ne sont visibles que dans les 30 minutes qui suivent le montage.

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6. La lame est retournée sur un morceau de verre ou sur une autre lame et la matière fécale est étalée sous la cellophane par pression uniforme, comme il est montré ici. Une fois qu'elle est prête, on dépose une autre goutte de glycérol sur la cellophane et on lisse les bords de la cellophane pour que la lame se conserve bien. Si des bulles d'air se forment sous la cellophane en cours de conservation, une ou deux gouttes de glycérol déposées sur la cellophane et que l'on laisse reposer une nuit permettront de les éliminer. Ces étnlements épais sous cellophane peuvent être préparé, ::;:rr le terrain, conservés dans des boîtes de lames et expédiés au loin, ce qui permet de les examiner dans un laboratoire central le cas échéant, quelques jours ou quelques semaines plus tard .

•

,

8. Le moment idéal pour observer les œufs de S. mansoni, S. intercalatum ou S. japonicum se situe 24 heures après le montage. Au soleil, les lames s'éclaircissent rapidement et il n'est pas forcément nécessaire d'attendre 24 heures.


Expédition des prélèvements à un laboratoire de référence

S'il faut envoyer les prélèvements à un autre laboratoire pour examen, il faut les conserver de manière à ce que les parasites ne se modifient pas. On emploie pour cela deux conservateurs:

- le formol à 10%- pour la conservation des œufs, larves et kystes dans les préparations à l'état frais;

- l' APV, un fixateur- pour la conservation des formes végétatives et des kystes, de manière à pouvoir faire une coloration permanente des étalements.


Ruban adhésif Bâtonnets applicateurs en bois Flacons, 1 000 ml Etiquettes Crayon ou feutre pour l'étiquetage Flacons, 20 ml, avec bouchons vissés bien ajustés Formol (formaldéhyde) à 10% (réactif N° 10) APV1 (fixateur) (réactif No 22).

Conservation des prélèvements

1. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade sur deux flacons de 20 ml. Inscrire la lettre F sur le coin supérieur droit de l'étiquette de l'un d'eux, et l'abréviation APV dans le coin supérieur droit de l'étiquette de l'autre.

2. Remplir à peu près à moitié le flacon «F» avec du formol à 10%. Remplir à peu près à moitié le flacon «APV »avec de l' APV.

3. A l'aide d'un bâtonnet applicateur, prélever un peu de matière fécale, de manière à avoir à la fois un peu de l'intérieur et du bord de l'échantillon et mélanger avec le formol à 10%. S'assurer que le tout est très soigneusement mélangé; écraser les morceaux. Prendre suffisamment de selle, mais pas trop, de façon que le mélange occupe environ les 2/3 ou les 3/4 du flacon.

4. A l'aide d'un bâtonnet applicateur, prélever un peu de la partie la plus molle de la selle et la mélanger avec l' APV comme décrit pour le formol. L'ensemble du mélange selle-APV ne doit pas occuper pl us des 314 du flacon. S'assurer que le mélange est très soigneusement fait. Ecraser les morceaux contre les parois du flacon.

5. Bien visser les bouchons des flacons. Entourer de ruban adhésif le haut de chaque flacon pour éviter toute fuite.

6. Emballer soigneusement les flacons dans une boîte ou un récipient d' expédition et les envoyer au laboratoire de référence. S'assurer que les flacons sont entourés d'un matériau absorbant (par exemple, coton, papier journal) et qu'ils sont bien protégés des chocs.

7. S'assurer que les informations nécessaires les accompagnent: nom et prénom ou numéro du malade, date d'expédition, parasites trouvés.

Elimination des prélèvements

1. Si les selles sont recueillies dans des boîtes en carton, la meilleure façon de s'en débarrasser est de brûler le tout. Sic' est impossible, ou si les selles ont

1 La préparation de I'APV est complexe, et fait appel à des solutions toxiques et corrosives. La technique figure dans l'annexe 2 (réactif W 22), mais il est peut-être préférable de préparer ce fixateur dans un laboratoire de niveau supérieur. Autrement, on en trouve dans le commerce, prêt à l'emploi.

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été recueillies dans un récipient métallique ou en verre, recouvrir de formol à 10% ce qui reste dans le récipient. Cela tuera tous les parasites présents. Laisser reposer pendant au moins 1 heure avant de jeter le tout ou de laver le récipient (s'il est en verre).

2. Les lames employées pour les préparations à l'état frais doivent tremper dans un bac de désinfectant (par exemple, de l'hypochlorite de sodium) pendant au moins 1 heure avant lavage. Utiliser un bâtonnet applicateur pour pousser la lamelle dans un bêcher ou un petit bac de désinfectant, puis mettre la lame dans un autre bac. Les lamelles se cassent facilement; si on les met avec les lames, elles peuvent se briser et la personne qui les lave risque de se couper.

3. Entonnoirs, bouchons et tubes à centrifuger doivent également tremper dans du désinfectant pendant 1 heure avant lavage.

4. Les bâtonnets applicateurs et les compresses de gaze doivent être brûlés. Si c'est impossible, on peut les jeter après les avoir fait tremper dans du désinfectant.

Contrôle de la qualité des examens coprologiques

Pour obtenir des résultats exacts et fiables, il faut appliquer un système de contrôle de la qualité des méthodes de laboratoire employées pour le diagnostic des infestations parasitaires. Ce contrôle doit être appliqué à la technique de prélèvement, à la préparation des réactifs, et aux techniques de préparation et d'examen des préparations finales.

Techniques de prélèvement Si les prélèvements de matières fécales ne sont pas correctement réalisés et traités avant examen, ils présenteront peu ou pas d'intérêt pour un diagnostic précis. Cela vaut particulièrement pour les protozoaires. Les formes végétatives d'amibes vont commencer à dégénérer 1 à 2 heures après émission de la selle et les modifications de leur aspect peuvent donner lieu à des erreurs d'identifications. Les formes végétatives de flagellés peuvent également subir des modifications rendant leur détermination difficile. Si les selles attendent plusieurs heures ou toute la nuit, les kystes se détérioreront, surtout si la température est élevée.

La fraîcheur de la selle est moins importante pour les œufs et les larves d'helminthes que pour les protozoaires. Néanmoins, il peut se produire des modifications qui gêneront leur identification. Par exemple, les œufs d'ankylostomes peuvent être embryonnés et donner naissance à des larves. Même les œufs d'Ascaris peuvent se développer jusqu'aux stades multicellulaires. En outre, les larves peuvent dégénérer dans des selles trop anciennes empêchant toute identification de l'espèce.

Pour faire en sorte que les prélèvements fournis pour l'examen soient bons, il faut être attentif aux points suivants:

1. Employer des récipients propres et secs pour recueillir les selles. (Les saletés gêneront l'examen et peuvent introduire des micro-organismes vivant à l'état libre dans le sol, qui poseront des problèmes d'identification d'espèce. Les urines et l'eau détruiront les formes végétatives s'il y en a.)

2. Porter l'échantillon au laboratoire dès qu'il est recueilli pour éviter toute détérioration des protozoaires et toute altération de la morphologie de ces derniers et de celle des helminthes. Inscrire le nom du malade et la date et l'heure à laquelle la selle a été émise.

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3. N'accepter pour l'examen que les selles fraîches. Ne pas essayer d'examiner des selles qui ont attendue ou qui sont contaminées par des saletés, de l'eau ou de l'urine. Demander plutôt au malade d'en apporter d'autres.

4. Si les selles ne peuvent être examinées dès leur arrivée, les mettre au réfrigérateur (4-5°C) ou dans l'endroit le plus frais et le plus ombragé du laboratoire. Ne pas les laisser au soleil.

5. Examiner les selles diarrhéiques et celles contenant du sang et du mucus dès leur arrivée au laboratoire.

Préparation des réactifs

Pour préparer les réactifs, suivre scrupuleusement les formules et directives données. Ne pas modifier les ingrédients, ni leur quantité, ni la méthode de préparation, de quelque manière que ce soit. Conserver les réactifs comme indiqué dans la méthode de préparation.

Certains réactifs se conservent indéfiniment s'ils sont correctement bouchés et à l'abri de la lumière solaire directe. C'est le cas par exemple des solutions de formol, du soluté physiologique, des fixateurs et des solutions dans l'alcool (sauf s'il y a évaporation). Les autres réactifs ne se conservent que peu de temps et sont inefficaces s'ils sont trop vieux. La durée d'utilisation de chaque solution est indiquée dans les instructions relatives à sa préparation.

1. Inscrire sur tous les réactifs la date à laquelle ils ont été préparés. Tenir un registre des solutions. Le passer en revue une fois par semaine et jeter les solutions périmées.

2. Bon nombre des solutions employées dans la coloration au trichrome doivent être renouvelées à intervalles réguliers. Ceux-ci figurent dans les instructions accompagnant cette technique et doivent être observés. Si ce n'est pas le cas, on obtiendra de mauvaises préparations, sans intérêt sur le plan diagnostique.

Techniques de préparation et d'examen des lames

Aucune méthode d'examen co pro logique n'est efficace à 100% - ce qui signifie que ces méthodes ne permettront pas toujours de retrouver toutes les espèces présentes et, si les individus d'une espèce donnée ne sont présents qu'en très petit nombre, qu'ils peuvent échapper à l'observation si l'on n'examine qu'un seul échantillon. Parce que ces techniques ne sont pas parfaites, il faut les appliquer aussi soigneusement que possible pour obtenir les meilleurs résultats. De plus, il faut s'assurer qu'on utilise bien les techniques appropriées au matériel examiné.

Examen direct à l'état frais

1. S'assurer que la préparation a une bonne densité. On doit pouvoir lire de petits caractères d'imprimerie au travers (mais pas trop nettement). S'il est trop épais ou trop mince, l'observation des éléments parasitaires peut être difficile.

2. Renouveler les solutions d'iode tous les 10 à 14 jours. Une solution trop ancienne ne colorera pas correctement les kystes. Elle ne doit pas non plus être trop forte, sinon la matière fécale peut s'agglutiner en une masse compacte, piégeant des parasites qui seront dès lors invisibles. Si elle est trop faible, les kystes ne seront pas correctement colorés.

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Méthode de concentration

1. Choisir un échantillon bien représentatif de la selle pour la concentration. 2. Préparer des suspensions soigneusement mélangées de matières fécales

dans Y eau ou le soluté physiologique. 3. Prendre les quantités de matériel appropriées. 4. Centrifuger à la bonne vitesse pendant le temps recommandé. 5. Préparer et examiner soigneusement les lames montées comme décrit pour

les préparations à l'état frais. 6. Ne pas jeter le tube contenant le matériel concentré jusqu'à ce que l'exa

men soit terminé. On peut avoir besoin de faire une autre préparation.

Méthodes de coloration

1. Choisir des portions de selles molles et contenant du mucus, s'il y en a, pour faire les étalements à colorer.

2. S'assurer que les solutions sont encore bonnes. Les renouveler conformément aux instructions figurant dans les méthodes de coloration. Conserver les flacons des solutions-mères hermétiquement fermés à l'abri de la lumière solaire directe.

3. S'assurer que les boîtes à coloration sont bien fermées. Laisser les couvercles fermés, sauf pour introduire ou retirer des lames. Si on laisse les boîtes à coloration ouvertes, les solutions peuvent s'évaporer ou des débris peuvent tomber dedans et adhérer à la préparation.

4. Employer la quantité requise de milieu de montage. S'il y en a trop, on aura une couche épaisse à travers laquelle il sera difficile de mettre au point et l'étalement ne sera pas bien visible. S'il y en a trop peu, il y aura des vides sous la lamelle. Si l'étalement a été préparé à partir de selles fraîches, les zones de vide peuvent gêner le diagnostic. Elles rendent également la préparation difficile à examiner.

5. Toujours examiner les étalements colorés avec l'objectif à immersion.

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Employer l'objectif x 10 pour mettre au point sur l'étalement. S'il n'est pas uniforme, choisir une zone où l'étalement n'est ni trop mince ni trop épais et qui est bien colorée. Passer alors à l'objectif à immersion et rechercher les formes végétatives et/ ou les kystes de protozoaires.

NE PAS OUBLIER QU'UNE IDENTIFICATION FIABLE

ET PRÉCISE DES PARASITES REPOSE SUR:

• DES PRÉLÈVEMENTS SATISFAISANTS • UNE BONNE PRÉPARATION ET UNE BONNE

CONSERVATION DES RÉACTIFS • LA MISE EN ŒUVRE SOIGNEUSE DES TECHNIQUES

APPROPRIÉES ET L'EXAMEN MINUTIEUX DES PRÉPARATIONS FINIES

Urines On examine en général les urines à la recherche d'œufs de Schistosoma haematobium. On peut également y voir des formes végétatives de Trichomonas vaginalis. Dans les pays où la filariose est endémique, on peut trouver dans le culot de centrifugation des urines parfois laiteuses de certains malades des microfilaires appartenant aux espèces Wuchereria bancrofti et Onchocerca volvulus.

Dans les régions d'endémie bilharzienne, le premier signe de l'infestation est une hématurie et/ ou une protéinurie décelable à l'aide de bandelettes réactives. Une hématurie importante indique une forte infestation.

Prélèvement des urines pour le diagnostic des infestations à Schistosoma

Dans les urines, le nombre d'œufs varie au cours de la journée, et montre un pic entre 10 heures et 14 heures. On recueillera donc un échantillon de 10 ml au moins à ce moment-là, en fin de miction. On peut également recueillir de la même manière les urines de 24 heures. On examinera l'ensemble du prélèvement car les œufs peuvent être très rares. Demander au malade d'uriner dans une bouteille ou un flacon propre et examiner immédiatement les urines.

Si elles doivent attendre plus d'une heure, ajouter 1 ml de formol (solution de formaldéhyde à 37%) non dilué pour 100 ml d'urine. Cela permettra de conserver tous les œufs présents.

NOTE:

Si l'on ne dispose pas de formol, on peut ajouter 2 ml d'eau de Javel ordinaire pour 100 ml d'urine.

AlTENTION

Le formol et l'eau de Javel sont corrosifs et sont dangereux en cas d'ingestion.

Examen des urines

La sédimentation et la filtration sont les deux méthodes employées pour déceler les œufs de Schistosoma haematobium. La première est moins sensible mais meilleur marché et plus simple à mettre en œuvre que la seconde. La technique de filtration est surtout utilisée en santé publique lorsqu'on a besoin de données quantitatives.

Méthode de sédimentation des urines de 24 heures recueillies en fin de miction

Matériel

Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 15 ml Tubes à centrifuger, coniques, 15 ml Lamelles couvre-objets Verre à pied conique pour urines Lame porte-objets Crayon ou feutre pour l'étiquetage Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc.

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URINES

Techniques

1. Agiter soigneusement l'échantillon et le verser dans un verre à pied conique. 2. Laisser reposer pendant une heure. Retirer le surnageant, transvaser le dépôt

formé dans un tube à centrifuger et centrifuger à 2000 g pendant 2 minutes. 3. Examiner le culot de centrifugation à la recherche d'œufs avec l'objectif

x 10, afin de balayer l'ensemble de la préparation.

Ne pas centrifuger plus longtemps ni plus vite, car cela peut provoquer la rupture des œufs et la libération des miracidiums.

• TRAITER L'ÉCHANTILLON AUSSITÔT QUE POSSIBLE • AGITER LE FLACON AVANT DE VERSER L'URINE • ÉTIQUETER SOIGNEUSEMENT LAMES/TUBES/PAPIERS

FILTRES

Méthode de filtration à la seringue Matériel et réactifs

Lamelles couvre-objets Porte-filtres, 13 mm ou 16 mm de diamètre Pinces Seringue plastique, 10 ml Filtre à membrane1, 12 ~ou 20 ~rn (polycarbonate), filtre en nylon ou papier filtre Lames porte-objets Lugol (solution-mère à 5%) (réactif no 17).

Technique

1. Disposer un filtre de polycarbonate ou de nylon (porosité, 12 à 20 J..Lm) dans le porte-filtre. On peut également utiliser du papier filtre (Whatman No 541 ou N° 1). Agiter l'échantillon d'urine en le secouant doucement ou en remplissant et en vidant la seringue à deux reprises.

2. Aspirer 10 ml d'urine dans la seringue et fixer le porte-filtre sur la seringue. (Si l'échantillon fait moins de 10 ml, le mentionner dans le cahier de laboratoire.)

3. En maintenant le tout vertical, faire passer l'urine de la seringue dans le porte-filtre au-dessus d'une cuvette ou d'un évier.

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; Pour obtenir les tmres de polycarbonate et le porte-filtre, s'adresser à: Sartorius GmbH, PO Box, D-3400 Gôttingen, Allemagne; Millipore lntertech lnc., Ashby Road, PO Box 225, Bedford, Massachusetts 31730, Etats-Unis d'Amérique. On peU1 se procurer les filtres en nylon (Ny1rel Tl HO 20), en rouleaux ou en paquets de 500, auprès de l'Union Gazes à Bluter, BP. 2, F-42360 Panissières, France.

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4. Dévisser soigneusement le porte-filtre, remplir la seringue d'air, la refixer ensuite au porte-filtre et expulser l'air. (Cette manipulation est importante, car elle permet d'éliminer l'excès d'urine et de bien plaquer les œufs, s'il y en a, sur le filtre.)

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5. Dévisser le porte-filtre, retirer le filtre avec une pince et le déposer (face filtrante vers le haut) sur une lame. Ajouter une goutte de Lugol et attendre 15 secondes que le colorant pénètre dans les œufs.

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6. Examiner immédiatement toute la surface du filtre au microscope (objectif x 40). On voit nettement les œufs de schistosomes colorés en orange. On définit la charge parasitaire comme étant le nombre d:œufs pour 10 ml d'urine. Il est donc important de noter la quantité d'urine examinée, si elle est inférieure à 10 ml. Pour faire une estimation de l'intensité de l'infestation, diviser le nombre d'œufs obtenu par 10. Si l'on a examiné moins de 10 ml d'urine, appliquer l'équation suivante:

Nombre d'œufs pour 10 ml= Nombre d'oeufs comptés x 10 x

dans laquelle x= nombre de ml d'urine filtrée examinés.

Réutilisation des filtres

Enlever le filtre immédiatement après usage et le laisser tremper toute la nuit dans une solution d'hypochlorite à 1% (eau de Javel domestique). Le laver ensuite soigneusement dans une solution détergente et le rincer plusieurs fois à l'eau propre. Vérifier au microscope qu'il est débarrassé de tout parasite avant de le réutiliser.

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URINES

Identification

Les œufs de Schistosoma haematobium sont grands; ils mesurent environ 120 à 150 j.lm de long, et possèdent un éperon terminal à l'une de leurs extrémités. On peut voir à l'intérieur de l'œuf un embryon (le miracidium).

Il est parfois nécessaire de déterminer si les œufs sont viables. C'est possible si l'échantillon est frais et qu'aucun conservateur ne lui a été ajouté.

Observer attentivement les œufs pour voir si les embryons bougent. C'est la meilleure indication de leur viabilité. Si aucun mouvement n'est visible, rechercher les «cellules à flammes vibratiles>>. Il y en a quatre, situées aux quatre coins de l'embryon. Travailler à fort grossissement, diminuer légèrement la lumière et rechercher le mouvement rapide des cils (petits poils) de ces cellules.

Examen quantitatif Les résultats des examens d'urine, effectués par filtration à la seringue pour déceler les infestations à S. haematobium, peuvent être rangés dans les catégories suivantes:

Infestation légère: 1 à 49 œufs pour 10 ml d'urine Forte infestation:> 50 œufs pour 10 ml d'urine

Une troisième catégorie pour les échantillons renfermant plus de 500 ou plus de 1000 œufs de S. haematobium pour 10 ml d'urine est parfois nécessaire dans les régions où l'intensité de l'infestation atteint fréquemment ce niveau (c'està-dire dans plus de 10% des cas).

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Prélèvements vaginaux et urétraux On examine les prélèvements vaginaux et urétraux à la recherche de Trichomonas vaginalis, un flagellé parasite du système génito-urinaire. Il parasite aussi bien l'homme que la femme, mais l'homme est habituellement asymptomatique. Trichomonas vaginalis est en général identifié dans des préparations non fixées de prélèvements vaginaux ou urétraux. (Dans les préparations colorées ces parasites sont très déformés, et peuvent ne pas être identifiables.)


Matériel

Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 100 x 13 mm (les mêmes adaptateurs porteront les tubes coniques de 15 ml et les tubes de 100 x 13 mm) Lamelles couvre-objets Ecouvillons, stériles (coton) Lames porte-objets Pipettes Pasteur, avec poire de caoutchouc Crayon ou feutre pour l'étiquetage Tubes à essais, petits, 100 x 13 mm, avec bouchons de coton ou bouchons vissés, et contenant chacun 3 ml de soluté physiologique stérile.

Technique

1. Avec un écouvillon stérile, effectuer le prélèvement vaginal ou urétral. 2. Mettre immédiatement l'écouvillon dans un tube stérile contenant environ

3 ml de soluté physiologique stérile. Briser l'extrémité du bâtonnet s'il est trop long pour le tube.

3. Si on le souhaite, on peut préparer des frottis àcolorer. Pour cela recueillir davantage de matériel au moyen d'un second écouvillon stérile et faire le frottis sur une lame. Laisser sécher.

4. Inscrire les nom et prénom ou le numéro du malade et la date du prélèvement sur le tube et sur la lame.

NOTE:

Si le malade peut se rendre au laboratoire, on procède à un examen direct de préparations à l'état frais. Les tubes sont alors inutiles.

Examen direct de frottis vaginaux et urétraux

1. Si le malade peut se rendre au laboratoire, recueillir un peu d'écoulement vaginal ou urétral à l'aide d'un écouvillon stérile et le déposer sur une lame dans une goutte de soluté physiologique.

2. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 à la recherche de flagellés mobiles.

Matériel centrifugé ou sédimenté

1. Si l'on reçoit un écouvillon dans du soluté physiologique, récupérer le liquide en pressant le coton contre les parois du tube. Jeter ensuite l'écouvillon.

2. Centrifuger le tube pendant 2 minutes. S'il n'y a pas de centrifugeuse, laisser reposer le tube pendant 10 minutes afin de laisser les particules éventuelles se déposer au fond.

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PRÉLÈVEMENTS VAGINAUX ET URÉTRAUX

3. A l'aide d'une pipette, éliminer le surnageant sans toucher au culot. 4. Prélever une goutte de culot et la déposer sur une lame. 5. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 à la recherche

de flagellés mobiles.

Dans les préparations à l'état frais, on peut identifier les flagellés grâce à leurs mouvements caractéristiques. Les formes végétatives de Trichomonas ont un mouvement nerveux et saccadé. Comme T. vaginalis est la seule espèce de Trichomonas parasitant le système génito-urinaire, il est inutile d'étudier les caractères morphologiques qui permettent de la différencier de T. hominis, qui vit dans l'intestin. Il arrive parfois, mais c'est rare, que l'on prenne les corps ciliés des cellules épithéliales du tractus génital pour des parasites.

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Prélèvements de sang et autres prélèvements

On recherche dans le sang les parasites suivants:

- Plasmodium - Microfilaires - Trypanosoma - Leishmania

Les frottis colorés restent la technique d'examen du sang la plus couramment employée. On emploie en général le Giemsa (l'un des colorants de Romanowsky) pour ces frottis. Lorsqu'on a besoin d'un diagnostic rapide, on peut également employer la coloration de Field. L'hématoxyline de Delafield est utilisée pour les microfilaires. Selon les circonstances, on emploiera des gouttes épaisses ou des frottis minces. Les premières permettent une meilleure détection des parasites et font gagner du temps lors de l'examen. Toutefois, la technique du frottis mince déforme très peu le parasite et permet une identification de l'espèce lorsque c'est impossible avec les gouttes épaisses; son seul inconvénient est qu'il faut examiner de nombreux champs pour déceler la présence des parasites lorsqu'il y en a peu. Par conséquent, on réalisera toujours les deux types de préparations lorsqu'on recherche Plasmodium et trypanosomes; s'il est impossible d'identifier précisément le parasite sur la goutte épaisse, on examinera alors le frottis mince. Pour rechercher les microfilaires, on fera des gouttes épaisses.

Le plus économique consiste à associer goutte épaisse et frottis mince sur la même lame. Toutefois, ils doivent être complètement secs (8 à 10 heures ou toute la nuit) avant de pouvoir être correctement colorés. Pour le paludisme, les lames seront colorées le jour même. Parfois, le médecin peut avoir besoin d'un diagnostic rapide. En pareil cas, faire le frottis mince et la goutte épaisse sur des lames séparées.

Les frottis minces sèchent rapidement et peuvent être immédiatement colorés. Utiliser la coloration de Field rapide et examiner la lame tandis que le Giemsa est en cours. Rechercher les Plasmodium. S'ils sont visibles, un diagnostic de paludisme peut être posé et l'espèce de Plasmodium identifiée par le Giemsa.

Si les parasites sont invisibles dans le frottis mince, colorer la goutte épaisse au colorant de Field. Rechercher les Plasmodium.

Il est parfois difficile d'identifier l'espèce dans les gouttes épaisses et il arrive que l'on doive les envoyer à un autre laboratoire pour avoir l'avis d'un spécialiste.

Les préparations directes de sang total frais (ou de sang centrifugé) sont en général utilisés pour déceler microfilaires et trypanosomes. Ils ne font que permettre le diagnostic d'infestation, et il faut faire des frottis colorés pour savoir en présence de quelle espèce on se trouve.

Dans les régions où il est possible de trouver à la fois Plasmodium, trypanosomes et/ ou microfilaires, on fera des préparations à l'état frais et des frottis colorés. S'il n'y a ni trypanosomes, ni microfilaires dans la région, il suffit de faire des frottis colorés pour rechercher les Plasmodium.

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Frottis sanguins colorés

Prélèvements Il convient d'appliquer des techniques rigoureuses de prélèvement du sang et de préparation des frottis. Ne jamais oublier qu'il existe un risque de transmission d'un certain nombre de maladies virales, bactériennes et parasitaires par le sang.


Bloc de bois rainuré (support pour lames) Flacon, petit (30 à 100 ml) avec compte-gouttes et bouchon vissé, ou petit flacon de verre (30 à 100 ml) avec bouchon vissé et compte-gouttes séparé (avec tétine en caoutchouc) Eprouvettes graduées, 10 mt 25 ml et 50 ml Pinces Compresses de gaze Baguette de verre Hémostyles stériles Crayon ou feutre pour Y étiquetage Lames porte-objets Registre ou fiche d'enregistrement Boîtes à coloration Papier buvard Alcoot éthanol à 70% ou isopropanol Tampon phosphate (réactif N° 3) Méthanol dans un flacon compte-gouttes. Colorant dilué (voir «Coloration des frottis sanguins au Giemsa», p. 44-45). Les directives relatives à la préparation de la dilution nécessaire pour chaque type de frottis y figurent, accompagnées de détails relatifs à l'aspect technique de la coloration 1. Les solutions diluées de Giemsa ne se conservent que 8 heures. Elles doivent donc être préparées extemporanément et non à l'avance. On les jettera en fin de journée.

Préparation d'une goutte épaisse et d'un frottis mince sur la même lame

En microscopie paludéenne courante, on prépare sur la même lame un frottis mince et une goutte épaisse. Le frottis sert d'une part à l'étiquetage, mais s'il est bien préparé, il peut également servir à la confirmation de l'espèce. L'examen portera sur la goutte épaisse.

Technique

Après avoir consigné les données relatives au malade sur la fiche ou le registre approprié, on prépare les frottis sanguins de la manière suivante:

1. En tenant la main gauche du malade, paume tournée vers le haut, choisir le troisième doigt après le pouce (pour les nourrissons, on peut employer le gros orteil. Mais on ne prendra jamais le pouce, ni chez l'adulte, ni chez l'enfant). Nettoyer le doigt avec un coton inbibé d' alcoot en appuyant fermement pour éliminer la saleté et la graisse du bout du doigt. Essuyer le doigt avec un chiffon de coton propre, en appuyant fermement pour stimuler la circulation sanguine.

1 La solution-mère de Giemsa s'achète généralement sous forme de solution toute prête.

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PRÉLÈVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRÉLÈVEMENTS

2. A l'aide d'un hémostyle stérile, piquer le bout du doigt d'un mouvement de rotation rapide. En appuyant légèrement sur le doigt, exprimer la première goutte de sang et l'essuyer avec un tampon de coton sec. S'assurer qu'il ne reste aucun brin de coton sur le doigt.

3. En procédant rapidement et en manipulant les lames propres par leurs bords, recueillir le sang comme suit:

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Appuyer doucement sur le doigt et recueillir une petite goutte de sang de cette taille à peu prèse au milieu de la lame: elle servira à faire le frottis mince. Appuyer de nouveau pour recueillir deux ou trois gouttes plus grosses, ayant à peu près cette taille • , sur la lame à environ 1 cm de la goutte destinée au frottis mince, comme indiqué sur la figure. Essuyer le sang restant sur le doigt avec du coton.


4. Frottis mince. En prenant une autre lame propre pour étaler, et en maintenant la lame sur laquelle se trouvent les gouttes de sang sur une surface plane et dure, toucher la petite goutte et laisser le sang se répartir le long du bord.

Pousser fermement la lame utilisée pour étaler sur la lame porte-objet dans le sens opposé aux grosses gouttes, en le tenant incliné à 45°. S'assurer que le bord de la lame utilisée pour étaler soit bien en contact avec la surface de la lame porte-objet pendant qu'on procède à l'étalement. Le frottis ne doit pas aller jusqu'au bord de la lame portant les gouttes, afin d'éviter que la personne qui la manipule ne s'infecte.

5. Goutte épaisse. Toujours tenir les lames par leurs bords, ou par un coin, pour réaliser la goutte épaisse comme suit: En prenant le coin de la lame utilisée pour étaler, rassembler rapidement les grosses gouttes et les étaler de manière à obtenir un frottis épais et uniforme. Ne pas trop mélanger le sang, mais l'étaler en cercle ou en rectangle en 3 à 6 mouvements.

6. Laisser la goutte épaisse sécher à plat, à l'abri des mouches, de la poussière et d'une chaleur excessive. Une fois que le frottis mince est sec, y inscrire au crayon ou au feutre les nom et prénom ou le numéro du malade et la date en travers de la partie la plus épaisse (comme montré ci-dessous). Ne pas employer de stylo à bille.

7. Envelopper la lame sèche dans du papier propre et l'envoyer au plus vite, au laboratoire accompagnée de la fiche du malade.

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8. La lame utilisée pour étaler le frottis doit être désinfectée et peut ensuite être réutilisée pour le malade suivant, une autre lame propre du paquet servant alors pour étaler.

Coloration des frottis sanguins au Giemsa

Méthode classique de coloration de la goutte épaisse et du frottis mince sur la même lame

Pour obtenir la meilleure coloration possible, ces deux types d'étalements doivent être préparés sur des lames séparées et la coloration est alors réalisée avec des concentrations et des temps de coloration différents. Il est souvent impossible de procéder ainsi, et on fait en général les deux sur la même lame. En pareil cas, il importe surtout de bien colorer la goutte épaisse. On obtient de meilleurs résultats si les étalements ont séché toute la nuit.

1. Fixer le frottis mince en y ajoutant trois gouttes de méthanol, ou en le trempant quelques secondes dans un récipient de méthanol. Une fixation prolongée peut rendre difficile la mise en évidence des granulations de Schüffner et des taches de Maurer. Pour que la déshémoglobinisation puisse avoir lieu, la goutte épaisse ne doit pas être fixée; on évitera donc tout contact de celle-ci avec le méthanol ou des vapeurs de méthanol.

2. Disposer les lames dos à dos dans une boîte à coloration. 3. Préparer une solution de Giemsa à 3% dans de l'eau distillée ou désionisée

tamponnée à pH 7,2 (réactif N° 3), en quantité suffisante pour remplir les boîtes utilisées. Mélanger soigneusement le colorant.

4. Verser doucement le colorant dans la boîte, jusqu'à ce que les lames soient entièrement recouvertes.

5. Laisser colorer pendant 30 à 45 minutes à l'abri de la lumière du soleil. 6. Verser doucement de l'eau propre dans la boîte pour faire déborder la

mousse irisée qui s'est fm::rnée à la surface du colorant. Ou bien, plonger doucement toute la boîte dans un récipient rempli d'eau propre.

7. Vider doucement lé resté de colorant et rincer de nouveau à l'eau propre pendant quelques secondes. Vider l'eau.

8. Retirer les lames une à une et les mettre à égoutter sur un support, le côté portant les étalements vers le bas, en s'assurant que ces derniers ne touchent pas le support.

Méthode rapide de coloration de la goutte épaisse et du frottis mince sur la même lame

Cette méthode convient à la coloration rapide de la goutte épaisse dans un laboratoire très actif lorsqu'on a besoin de résultats urgents, mais elle nécessite beaucoup plus de colorant.

1. Laisser la goutte épaisse sécher complètement; si l'on a besoin de résultats rapides, on peut accélérer le séchage avec un ventilateur, ou en exposant brièvement la lame à une chaleur douce, comme par exemple celle de la lampe du microscope. On prendra soin d'éviter toute surchauffe, pour éviter que la goutte épaisse ne soit fixée par la chaleur.

2. Fixer le frottis mince en le tamponnant doucement avec un coton imbibé de méthanol, ou en le trempant quelques secondes dans un récipient de méthanol. Pour que la déshémoglobinisation puisse avoir lieu, la goutte épaisse ne doit pas être fixée; par conséquent, éviter de l'exposer au méthanol ou à des vapeurs de méthanol.

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3. Préparer une solution de Giemsa à 10% dans de l'eau distillée ou désionisée tamponnée à pH 7,2; s'il n'en faut qu'une petite quantité, 3 gouttes de colorant par ml d'eau tamponnée permettront d'obtenir une solution de Giemsa à la bonne concentration. Il faut environ 3 ml de solution par lame.

4. Verser doucement le colorant sur la lame, par exemple à l'aide d'une pipette. On peut également disposer les lames face vers le bas sur une plaque à coloration concave et introduire le colorant sous la lame.

5. Laisser colorer pendant 5 à 10 minutes. 6. Rincer doucement le colorant en ajoutant quelques gouttes d'eau propre;

ne pas renverser le colorant puis rincer, car cela laisserait un dépôt d'écume sur le frottis.

7. Mettre la lame sur le support, étalements vers le bas, pour qu'elle s'égoutte et sèche, en s'assurant que les étalements ne touchent pas le support.

Coloration de Field

La coloration de Field permet une détection rapide des Plasmodium (mais elle ne colore pas toujours les granulations de Schüffner).

Méthode de coloration des gouttes épaisses

Matériel

Une boîte à coloration remplie de colorant de Field A Une boîte à coloration remplie de colorant de Field B Deux récipients remplis d'eau propre.

Technique

1. Plonger la lame dans le colorant de Field A pendant 3 secondes. 2. Rincer doucement en la trempant une fois dans l'eau propre. 3. Plonger dans le colorant de Field B pendant 3 secondes. 4. Rincer doucement comme en 2. 5. Mettre la lame en position verticale dans un égouttoir et la laisser sécher à

l'air.

Méthode de coloration des frottis minces

Réactifs

Colorant de Field A Colorant de Field B dilué - 1 volume de colorant plus 4 volumes d'eau tamponnée (pH 7,2) Eau tamponnée pH 7,2.

Technique

1. Fixer le frottis dans le méthanol pendant une minute. 2. Rincer le méthanol avec de l'eau. 3. A l'aide d'une pipette, recouvrir le frottis de colorant de Field B dilué. 4. Ajouter immédiatement un volume égal de colorant de Field A et mélan-

ger soigneusement en inclinant la lame à plusieurs reprises. 5. Laisser colorer pendant 1 minute. 6. Rincer le colorant à l'eau propre. 7. Mettre la lame en position verticale dans un égouttoir et la laisser sécher à

l'air.

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Coloration à l'hématoxyline de Delafield pour la mise en évidence des microfilaires


Cinq boîtes à coloration Ether-éthanol (fixateur) (réactif N° 8) Solution décolorante d'acide chlorhydrique-eau (réactif No 15) Hématoxyline de Delafield (réactif No 6). Ce colorant peut être acheté tout prêt.

Technique

1. Préparer des gouttes épaisses1 obtenues par piqûre au doigt. Laisser sécher 8 à 10 heures ou toute la nuit.

2. Préparer les boîtes à coloration de la manière suivante: Boîte N° 1 -Eau du robinet Boîte N° 2 - Ether-éthanol Boîte No 3 - Hématoxyline de Delafield Boîte No 4 -Acide chlorhydrique-eau (0,05% d'Hel) Boîte No 5 -Eau du robinet

3. Plonger la goutte épaisse sèche dans l'eau du robinet (boîte No 1) pendant 5 à 10 minutes. Les hématies se lysent et la préparation s'éclaircit ou blanchit lorsque la lyse est complète.

4. La laisser sécher. 5. La plonger dans l'éther-éthanol pendant 10 minutes (boîte No 2). 6. La laisser sécher. 7. La plonger dans l'hématoxyline de Delafield pendant 15 minutes (boîte

N° 3). 8. La décolorer dans l'acide chlorhydrique-eau (boîte No 4).

La plonger à deux reprises dans la solution. Agir RAPIDEMENT. La préparation vire au rouge.

9. Plonger immédiatement la lame dans l'eau du robinet (boîte No 5) pour éliminer l'acide. Mettre la boîte sous l'eau du robinet jusqu'à ce que la préparation vire au bleu. Fixer au robinet un embout de caoutchouc suffisamment long pour atteindre le haut de la boîte et laisser l'eau couler doucement; si elle coule trop fort, la goutte épaisse se décollera. Si l'on ne dispose pas d'eau courante, changer l'eau du récipient à plusieurs reprises, jusqu'à ce que l'étalement vire au bleu. Mettre le doigt en travers de la boîte pour éviter que la lame ne tombe, vider l'eau et remplir à nouveau.

10. Laisser la préparation sécher et l'examiner à l'objectif x 10 et à l'objectif à immersion, à la recherche des microfilaires.

Examen

Gouttes épaisses

1. Mettre au point avec l'objectif x 10 et rechercher les microfilaires. Elle sont faciles à trouver à ce grossissement.

2. S'il y a des microfilaires, passer à l'objectif à immersion et identifier l'espèce. Rechercher également la présence de Plasmodium avec ce même objectif. On examinera au moins 100 champs microscopiques.

L'examen microscopique de la goutte épaisse doit révéler les éléments suivants:

- Le fond doit être propre, débarrassé de tout débris et de couleur gris pâle moucheté par suite de la lyse des hématies.

1 Si l'on colore des frottis préparés à partir de culot de sang concentré, commencer à l'étape 5.

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- Les noyaux des leucocytes sont colorés en violet foncé. - Les Plasmodium sont bien distincts avec une chromatine rouge foncé et

un cytoplasme bleu-violet clair. Dans les infestations à P. vivax et P. ovale, la présence de granulations de Schüffner dans le «fantôme» de l'hématie hôte peut parfois s'observer sur les bords de la préparation.

Frottis minces 1. Mettre au point avec l'objectif x 10 sur l'extrémité la plus mince du frottis,

dans laquelle les hématies ne forment qu'une couche. 2. Mettre une goutte d'huile à immersion sur la lame et passer à l'objectif à

immersion.

Lorsque l'on recherche des Plasmodium et des trypanosomes, il faut examiner au moins 200 champs microscopiques. L'examen microscopique doit révéler les éléments suivants:

Le fond doit être propre et débarrassé de tout débris; les hématies sont de couleur rose-grisâtre pâle. Les granulocytes neutrophiles ont un noyau violet foncé et des granules bien distincts.

- La chromatine des Plasmodium est colorée en rouge-violet foncé et leur cytoplasme en bleu-violet clair.

- Les granulations de Schüffner doivent apparaître comme des pointillés dans les érythrocytes contenant P. vivax ou P. ovale, de même que les taches de Maurer dans les érythrocytes contenant les formes annulaires plus grandes de P. falciparum.

Contrôle de la qualité des examens de sang Pour faire en sorte que les examens qu'il effectue soient fiables, le technicien de laboratoire doit être attentif aux points suivants:

1. Le matériel doit être propre. Les lames doivent être débarrassées de tout ce qui peut les souiller (poussière, graisse, savon, empreintes digitales et débris), sinon le sang peut ne pas bien adhérer à la lame ou ne pas se colorer correctement. On emploiera des hémostyles stériles pour piquer le doigt (ou l'oreille ou le gros orteil), afin d'éviter toute transmission de maladie d'un sujet à l'autre. La piqûre sera suffisamment profonde pour qu'il y ait assez de sang pour préparer les frottis. On nettoiera soigneusement le doigt avant de le piquer pour éliminer les saletés, moisissures et autres contaminants. On peut utiliser du sang prélevé par ponction veineuse, à condition de préparer les frottis immédiatement, car les anticoagulants modifient les propriétés adhésives du sang et la coloration.

2. Les frottis doivent avoir une densité satisfaisante. Le frottis mince doit avoir une extrémité plus fine dans laquelle les hématies sont en une seule couche, ce qui permet de bien observer leur morphologie. Si le frottis est trop épais, les hématies vont «s'empiler>> et l'on distinguera mal leur morphologie. S'il est trop mince, elles risquent d'être grossièrement déformées et seront souvent mal colorées. En outre, dans les zones trop minces, les parasites sont en général déformés. Il doit être possible de lire de petits caractères d'imprimerie à travers une goutte épaisse. Si l'étalement est trop épais, le sang peut s'écailler ou se détacher en cours de coloration et l'on peut perdre ainsi des fragments de préparation. S'il est trop mince, l'avantage de la goutte épaisse qui est de contenir un échantillon plus important, est perdu.

3. Pour obtenir de bons résultats, il faut laisser sécher les frottis en position horizontale pendant la durée indiquée. Si l'on incline ou si l'on renverse les gouttes épaisses, le sang peut couler d'un côté de la lame et la préparation sera irrégulière. La partie épaisse peut s'écailler. De plus, s'ils ne sèchent pas complètement, les frottis ne se coloreront pas correctement.

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En cours de séchage, il faut mettre les frottis à l'abri de la poussière, des moisissures et de tout autre débris qui pourrait tomber dessus et entraîner par la suite des problèmes de diagnostic. n faut également les protéger contre les mouches et tous les autres insectes susceptibles de les endommager. Les frottis minces doivent être fixés au méthanol avant coloration, pour éviter que les hématies ne se lysent. On prendra du méthanol absolu anhydre. Sinon, les hématies seront abîmées et la coloration mauvaise. Ne jamais fixer les gouttes épaisses. Faire en sorte que le méthanol ne les touche pas.

4. Les colorants dilués et l'eau tamponnée utilisés pour la coloration doivent être préparés soigneusement, et la solution-mère de colorant doit être de bonne qualité. On conservera le flacon de solution-mère de Giemsa hermétiquement fermé et à l'abri de la lumière du soleil. La moindre humidité qui pénètrerait dedans le rendrait inutilisable. En général, on recommande de verser une partie de la solution-mère dans un flacon propre et sec; c'est cette portion qu'on utilisera. On protège ainsi le reste de la solution-mère contre toute contamination accidentelle par de l'humidité ou des débris. Ne jamais introduire une pipette mouillée dans le flacon de solution-mère. Le Giemsa dilué est utilisable pendant environ 8 heures. Par conséquent, on préparera les dilutions le jour même où elles seront utilisées. Le pH du colorant est un facteur très important pour obtenir des frottis bien colorés. On le contrôle au moyen d'une eau tamponnée à pH 7,2, qui donne les meilleurs résultats. Cette eau tamponnée peut se conserver un certain temps si le flacon est hermétiquement fermé. Cependant, on vérifiera de temps en temps son pH, pour s'assurer qu'il est bien neutre.

5. Il faut suivre scrupuleusement le mode opératoire de la coloration. Bien s'assurer qu'on utilise la méthode mise au point pour le type de frottis que l'on colore. Rincer le colorant exactement de la manière indiquée dans le mode opératoire. Si les frottis minces sont trop rincés, le colorant va être éliminé; si les gouttes épaisses ne le sont pas suffisamment, des résidus cellulaires et du colorant vont rester sur la lame et gêner par la suite l'examen microscopique. S'assurer que les lames contenant les deux types d'étalements sèchent en position verticale, la goutte épaisse vers le bas. Autrement, l'eau coulera sur le frottis mince et entraînera le colorant.

Techniques spéciales pour les Plasmodium

Identification

On peut observer trois structures à l'intérieur des parasites. Ce sont: le cytoplasme coloré en bleu, la chromatine en rouge ou en violet et les grains ou les bâtonnets de pigment brun ou noir. A l'exception des stades annulaires précoces (jeunes), ces trois structures doivent pouvoir être visibles. (Les anneaux précoces ne possèdent en général pas de pigment). n est important d'observer ces trois structures pour pouvoir distinguer les Plasmodium des cellules de l'hôte (leucocytes) et des artéfacts qui peuvent apparaître en cours de préparation.

Dans les frottis minces, regarder l'aspect des parasites et celui des hématies qui les contiennent. Observer:

1. L'aspect des hématies contenant le parasite.

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- Dimensions. L'hématie parasitée est-elle de la même taille que celles qui ne le sont pas (c'est-à-dire, de taille normale) ou est-elle plus grande?

- Taches. L'hématie est-elle remplie de granulations roses ou rouges? Ce sont les granulations de Schüffner que l'on ne rencontre que dans les infestations à P. vivax et P. ovale. (Elles sont absentes dans les hématies non parasitées). Les cellules contenant les stades tardifs des trophozoïtes de P. falciparum contiennent souvent des granulations rouge-mauve irrégulières. Ce sont les taches de Maurer.


2. Aspect du parasite

- Les stades de croissance du trophozoïte ont-ils un contour irrégulier? Sont-ils réguliers ou lisses? De quelle couleur est le pigment des trophozoïtes âgés, des schizontes et des gamétocytes?

- Combien y a-t-il de mérozoïtes (s'il y en a) dans le schizonte mûr? - Quelle est la forme des gamétocytes, s'il y en a? - Quels sont les stades présents (annulaires, trophozoïtes âgés, schizon-

tes, gamétocytes)?

Laisser sécher complètement les frottis avant de les examiner. Si l'on est dans une région où la filariose existe, on balaiera la goutte épaisse à l'objectif x 10, à la recherche de microfilaires (voir pp. 59-60). Il est nécessaire d'employer l'objectif à immersion pour observer la morphologie des parasites.

Examiner d'abord la portion centrale de la goutte épaisse. Les parasites sont plus faciles à déceler dans cette zone plus épaisse. Si leur morphologie n'est pas assez distincte, examiner les bords extérieurs plus fins, pour rechercher des parasites ayant un aspect plus caractéristique.

Dans les gouttes épaisses, les hématies sont lysées et ont donc disparu. La couche de sang est plus épaisse que dans les frottis minces et les Plasmodium peuvent donc être situés à différentes profondeurs. Mettre au point soigneusement dans les différents plans pour observer les parasites. Dans les gouttes épaisses, ils apparaissent souvent plus petits que dans les frottis minces, mais on emploie les mêmes caractéristiques pour distinguer les espèces. Ceux qui se trouvent sur les bords extérieurs de la goutte épaisse ressemblent parfois plus à ceux des frottis minces qu'à ceux situés au centre de la goutte épaisse. De temps en temps, on peut voir les contours des hématies sur ces bords minces.

Les caractéristiques précises utilisées pour identifier les espèces de Plasmodium dans les gouttes épaisses et les frottis minces sont exposées dans la deuxième partie, pp. 83-91, où sont également évoqués les problèmes de diagnostic.

Surveillance de la chloroquinorésistance dans le paludisme à falciparum Un Plasmodium pharmacorésistant survivra et continuera à se multiplier chez un malade en dépit d'un traitement médicamenteux à une posologie qui suffit normalement à guérir l'infestatüm. L'épreuve de terrain classique couramment utilisée nécessite l'examen d'une goutte épaisse par jour pendant les 7 premiers jours de traitement. Si les formes asexuées ont disparu du sang périphérique au 7e jour, on poursuivra l'examen jusqu'au vingt-huitième jour pour éliminer tous les risques de résistance RI avec recrudescence tardive. Il est plus simple d'examiner une goutte épaisse au 2e jour chez les malades gravement atteints, ou au 4e jour chez ceux qui le sont moins. Si la numération parasitaire est dans les deux cas de 20 à 25% plus élevée qu'avant le traitement, cela indique que l'on a affaire à une souche résistante et qu'il faut modifier le traitement.

Technique - L'épreuve de terrain classique

1. Faire une numération leucocytaire et calculer le nombre de leucocytes par Jll de sang (L).

2. Préparer une goutte épaisse (parasitémie avant traitement) et compter le nombre d·e Plasmodium (P) et de leucocytes jusqu'à avoir dénombré 300 leucocytes. Le nombre de Plasmodium par Jll de sang est donné par la formule: Lx P /300.

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3. Administrer au malade 10 mg de chloroquine (base) par kg de poids corporel, par voie orale, une fois par jour, pendant les 2premiers jours, puis 5 mg par kg de poids corporel au troisième jour (soit au total 25 mg de chloroquine base par kg de poids corporel en 3 jours).

4. Faire une goutte épaisse par jour pendant les 7 premiers jours, puis au 14e et au 28e jours, si aucun signe de rémission n'est apparu pendant les deux premières semaines.

Interprétation de l'épreuve de terrain classique

1. Si l'on ne retrouve aucune forme asexuée au 6e jour et aucun parasite (formes annulaires et gamétocytes) au 7e jour, la souche est soit sensible (S) soit résistante (résistance de type RI). Pour savoir dans quel cas l'on se trouve, l'observation sera poursuivie jusqu'au 28e jour. Si les formes annulaires ne sont pas réapparues au 28e jour, la souche est sensible; si elles réapparaissent, la souche présente une résistance RI.

2. Si les formes annulaires disparaissent pendant au moins 2 jours de suite, mais réapparaissent et sont présentes au 7e jour, on est en présence d'une résistance de type RI.

3. Si les formes annulaires ne disparaissent pas, mais si leur nombre passe à moins de 25% de ce qu'il était avant le traitement pendant les premières quarante-huit heures de traitement, il y a résistance de type RII.

4. Si le nombre des formes annulaires diminue de moins de 75% au cours des premières 48 heures, ou s'il ne bouge pas, ou s'il continue à augmenter, les parasites sont résistants à la dose normale de médicament et l'on est en présence d'une résistance de type RIII.

Techniques spéciales pour les trypanosomes1

On peut identifier les trypanosomes dans:

- les frottis sanguins - le liquide céphalorachidien (LCR) - le suc ganglionnaire

Recherche des trypanosomes dans le sang Parmi les espèces de trypanosomes rencontrées en Afrique, il est impossible de distinguer Trypanosoma brucei gambiense de Trypanosoma brucei rhodesiense sur le plan morphologique. On peut les identifier dans des étalements épais ou minces. Toutefois, dans les gouttes épaisses ils peuvent être déformés et difficiles à différencier des débris cellulaires. Trypanosoma cruzi, rencontré dans les Amériques, est très déformé dans les gouttes épaisses, mais plus facile à identifier dans les zones épaisses des frottis minces.

Tout comme pour les Plasmodium, le cytoplasme des trypanosomes se colore en bleu. Le noyau et le kinétoplaste sont colorés en rouge ou en violet. Rechercher un organisme allongé ayant un noyau proéminent situé près de son centre et une tache plus petite, le kinétoplaste, située près d'une extrémité. Le flagelle est issu de la partie postérieure du trypanosome, proche du kinétoplaste. Il est attaché à la paroi cellulaire, sauf à son extrémité antérieure, où il se termine par un bout libre. Comme le flagelle remue constamment, il provoque des extensions irrégulières de la paroi cellulaire, connues sous le nom de membrane ondulante. Le trypanosome peut être ondulé (deux ou trois courbes) ou être en forme de Cou de U. La forme, la position du noyau et la dimension et la situation du kinétoplaste sont des caractéristiques qui permettent de

1 Inspirées du Manuel pour la lutte contre la trypanosomiase, 1983, document OMS non publié.

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différencier les espèces. On trouvera davantage de détails sur cette question dans la deuxième partie, pp. 91-92

Le frottis de sang frais

Cette méthode est la plus facile à mettre en œuvre et la moins onéreuse des techniques de mise en évidence des parasites dans le sang, mais c'est aussi la moins sensible.

Matériel

Hémostyle Tampons de coton Lamelles couvre-objets Lames porte-objets Soluté physiologique (réactif No 24) Ethanol

Méthode

1. Prendre l'annulaire (troisième doigt à partir du pouce). Le nettoyer avec un tampon de coton légèrement imbibé d'éthanol. Sécher correctement. Piquer avec l'hémostyle.

2. Recueillir la première goutte de sang qui apparaît, directement au centre de la lame.

3. Ajouter une goutte de soluté physiologique. Mélanger le sang et le soluté avec le coin de la lamelle. Couvrir la préparation avec la lamelle.

4. Préparer deux gouttes épaisses sur une autre lame en prenant 2 autres gouttes de sang. Examiner le frottis frais de manière systématique au

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microscope (objectif x 10 avec ouverture réduite du condenseur). Le premier signe de la présence de trypanosomes ou de microfilaires vivants est un mouvement rapide au sein des hématies.

L'illustration de droite montre une vue (x 40) d'un trypanosome au milieu d'hématies: celle de gauche, des microfilaires (x 10).

5. Balayer de manière systématique toute la préparation. Les trypanosomes sont réfringents et difficiles à voir. On les voit mieux en diminuant un peu l'éclairage.

La goutte épaisse

C'est une technique plus sensible que le frottis de sang frais car on examine davantage de sang dans chaque champ microscopique. 1. Déposer une goutte de sang sur une lame propre et sèche. 2. Préparer et colorer une goutte épaisse de la même façon que pour les

hématozoaires (voir pp. 41-45). 3. Examiner l'ensemble de la préparation avec l'objectif à immersion. 4. Les trypanosomes sont visibles au sein de la masse d'hématies lysées et on

peut les reconnaître à leur forme typique et à leur couleur bleuâtre clair, ainsi qu'à leur noyau et à leur kinétoplaste foncés.

Méthode au microhématocrite


Ruban adhésif Tube capillaire Centrifugeuse pour microhématocrite Pâte à obturer Solution de citrate de sodium (réactif N° 26)

Cette épreuve ne nécessite qu'une petite quantité de sang; on peut donc employer du sang obtenu par piqûre au doigt si la ponction veineuse est impossible. Cependant, on a besoin d'une centrifugeuse spéciale pour les tubes à microhématocrite.

Méthode

1. Piquer le doigt de façon à obtenir 2 gouttes de sang sur une lame. Ajouter 1 goutte de solution de citrate de sodium à 2% et mélanger. Remplir le tube capillaire aux trois quarts. Si l'on a recueilli du sang veineux, remplir le tube capillaire au trois quarts avec du sang prélevé.

2. Sceller l'extrémité ouverte du tube en la chauffant ou à la pâte à obturer. 3. Centrifuger dans une centrifugeuse pour microhématocrite pendant

2 minutes pour les microfilaires, ou 4 minutes pour les trypanosomes. 4. Poser le tube capillaire sur une lame et en fixer les extrémités avec du

ruban adhésif pour éviter qu'il ne roule.

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5. Examiner la limite séparant les hématies du plasma, à l'objectif x 10. On peut y voir des microfilaires ou des trypanosomes mobiles. Passer à un grossissement plus fort pour une meilleure observation.

Micro-technique de centrifugation 1 échange d'anions (m-AECT)

Cette méthode est l'épreuve la plus sensible développée jusqu'ici pour déceler les trypanosomes dans le sang humain. Les colonnes préparées au laboratoire et fournies dans les trousses avec des réactifs stériles ne nécessitent aucune réfrigération. Une fois ouverts, la colonne et le tampon doivent être utilisés immédiatement. On prendra soin de passer chaque ustensile dans une solution désinfectante (par exemple, eau additionnée d'eau de Javel à 2 %).


Le nécessaire d'épreuve doit comprendre le matériel et les réactifs pour une épreuve, à savoir:

Colonne stérile dans un tube, dans du soluté physiologique tamponné au phosphate Tube contenant du glucose ou une solution de glucose prépesés Tube capillaire hépariné (tube de Caraway) pour prélèvements de sang Hémostyle Réservoir et tube à centrifuger Pipette en plastique pour manipuler le tampon.

Par ailleurs, on aura également besoin du matériel suivant:

Centrifugeuse manuelle Support pour colonne Bon microscope, permettant un grossissement jusqu'à x 150 Lames porte-objets Lamelles couvre-objets Ruban adhésif Pâte à modeler pour fabriquer la cellule d'observation.

Technique

1. Retirer la colonne de son tube et la mettre au premier rang du support; la laisser s'égoutter.

~------------~--~----r-~

2. Ajouter le glucose ou la solution de glucose prépesés au tampon restant dans le tube et mélanger soigneusement. Mettre le tube de côté, derrière la colonne, sur le support. A l'aide d'une pipette, ajouter un peu de solution

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de glucose-soluté physiologique tamponné à la colonne et la laisser s'égoutter. Répéter l'opération. Le reste du tampon sera utilisé ultérieurement.

3. Après avoir piqué le doigt, remplir le tube capillaire (tube de Caraway) de sang jusqu'à la marque rouge et le vider immédiatement dans la colonne. Laisser imbiber le filtre supérieur jusqu'à ce que la colonne arrête de couler. Ajouter à la pipette quelques gouttes de tampon, et disposer immédiatement le réservoir sur la colonne; le remplir avec du tampon.

La colonne va commencer à couler goutte à goutte. Compter 6 ou 7 gouttes et mettre le tube à centrifuger sous la colonne, en s'assurant qu'aucune bulle d'air ne se forme. Seule l'extrémité de la colonne doit pénétrer dans le tube (la hauteur de la colonne peut être ajustée), ce qui permet d'éviter la formation d'une bulle d'air et toute perte de l'éluat hors du tube. Remplir le réservoir de tampon et laisser la colonne fonctionner toute seule, lentement.

4. Lorsque le tube à centrifuger est plein, le retirer et le mettre dans la gaine de la centrifugeuse manuelle. Equilibrer la centrifugeuse en mettant un poids équivalent dans la gaine opposée. Centrifuger pendant 5 minutes.

0

~--~~------._------------~~

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5. Retirer le tube de la centrifugeuse et enlever la protection de plastique. Mettre l'extrémité du tube dans une cellule d'observation et ajouter de l'eau entre lame et lamelle. L'examiner ensuite au microscope, au grossissement x 10.

6. On repère facilement les trypanosomes: ce sont des petits organismes qui ondulent au fond du tube. Il arrive que des particules de cellulose aient traversé le filtre de la colonne et viennent compliquer l'examen. Dans ce cas, tourner le tube.

7. Croquis d'une cellule d'observation.

0

~------------------------~~

ATTENTION NE PAS OUBLIER D'IDENTIFIER le tube à centrifuger au moyen

d'une étiquette ou d'un crayon feutre spécial NE PAS OUBLIER D'ÉQUILIBRER le rotor de la centrifugeuse

si l'on centrifuge un nombre impair de tubes NE PAS OUBLIER DE JETER tous les ustensiles contaminés

dans une bassine de solution désinfectante.

Recherche des trypanosomes dans le suc ganglionnaire

La méthode classique de diagnostic de la maladie du sommeil dans ses stades précoces consiste à rechercher les trypanosomes dans le suc des ganglions lymphatiques cervicaux hypertrophiés. Le prélèvement est examiné entre lame et lamelle et les trypanosomes identifiés grâce à leurs mouvements.

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Matériel

Tampons de coton hydrophile Ouate Lamelles couvre-objets Lames porte-objets Aiguille (pour injection sous-cutanée), 25 G, 0,5 x 16 mm Seringue, 5 ou 10 ml Ethanol à 70%

Technique

1. Préparer la seringue; tirer le piston en arrière au maximum. 2. Se laver les mains au savon. 3. Demander au sujet de s'asseoir. Désinfecter l'endroit du cou choisi à

l'éthanol à 70%. 4. De la main gauche, saisir le ganglion entre le pouce et l'index et le faire

ressortir sous la peau. Tenir fermement.

5. De la main droite, tenir l'aiguille entre le pouce et l'index, l'introduire à angle droit au centre du ganglion. Percer d'abord la peau, puis pénétrer au centre du ganglion. S'assurer qu'on a évité les veines jugulaires et les artères.

6. De la main gauche, masser légèrement le ganglion. De la main droite faire pivoter l'aiguille.

7. Le suc ganglionnaire va pénéter dans l'aiguille. L'opération doit durer environ une minute.

8. Retirer l'aiguille d'un mouvement rapide, l'index sur la garde. Appliquer un tampon imbibé de désinfectant au point d'injection. Ne jamais appliquer de désinfectant avant d'avoir retiré l'aiguille, car il pourrait venir au contact de l'extrémité de l'aiguille et immobiliser les trypanosomes.

9. Fixer l'aiguille à la seringue, piston tiré en arrière. Pousser le piston doucement à mi-hauteur de la seringue pour faire couler le suc ganglionnaire sur une lame.

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10. Recouvrir la préparation d'une lamelle. Examiner immédiatement au microscope en grossissant environ 400 fois, avec l'objectif x 40.

11. Attendre jusqu'à ce que les courants de convection cessent. Il est impossible de repérer le mouvement des trypanosomes dans des cellules en mouvement. Commencer l'examen par la périphérie de la préparation, le long des bords de la lamelle, car les trypanosomes ont tendance à se diriger vers eux. Examiner ensuite le reste de la préparation .

.A a

~------------------------~~ 12. La préparation contiendra des hématies et des leucocytes. Les trypanoso

mes ont environ 20 Jlm de long et sont souvent cachés par les globules qu'ils font bouger avec le mouvement de leur flagelle. Tout mouvement dans la préparation est donc suspect. Les trypanosomes disparaissent parfois, se cachant derrière des amas de globules. Observer très attentivement!

Recherche des trypanosomes dans lè liquide céphalorachidien (LCR) Lorsque les trypanosomes ont traversé la barrière hémato-encéphalique et envahissent le système nerveux centrat le malade est au second stade de la maladie: La seule façon de diagnostiquer les trypanosomes dans le système nerveux consiste à examiner le liquide céphalorachidien. Trois examens sont couramment pratiqués:

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Numération leucocytaire; Mesure de la protéinorachie; Détection des trypanosomes.


Les leucocytes et les trypanosomes sont rapidement lysés. La numération doit donc être effectuée rapidement après la ponction. Les trypanosomes sont recherchés après concentration du LCR par centrifugation simple ou double. On décrira ici la technique de centrifugation simple, qui est la plus pratique. Le nombre de parasites trouvés dans le LCR du malade à un stade avancé montre des variations considérables.

Technique de centrifugation simple

1. Après avoir procédé à la numération leucocytaire, centrifuger le LCR recueilli par ponction lombaire pendant 10 minutes à 900 g. Transvaser le surnageant et le conserver pour d'autres examens.

0

~---------------------------~~ 2. Remettre le culot en suspension dans le peu de LCR qui reste au fond du

tube en tapotant avec le doigt.

3. Déposer une goutte de cette suspension sur une lame propre et sèche. Recouvrir immédiatement d'une lamelle. Attendre quelques minutes, jusqu'à ce que la convection cesse.

4. Poser la lame sur la platine du microscope et l'examiner à l'objectif x 10. Employer l'objectif x 40 pour confirmer la présence des trypanosomes. Balayer l'ensemble de la préparation en commençant par les bords, car on retrouve souvent les trypanosomes sur l'extrême bord de la préparation.

Si l'on observe des trypanosomes mobiles dans le LCR, cela signifie que le malade a atteint le dernier stade de la maladie et que le système nerveux central est touché.

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Détection indirecte On utilise l'inoculation de matériel biologique provenant de l'homme, d'animaux hôtes, ou de vecteurs, à des animaux réceptifs pour déceler les trypanosomes. C'est une méthode qui est plus sensible pour T. b. rhodesiense que pour T. b. gambiense.

Plusieurs systèmes de culture ont été mis au point pour les trypanosomes, mais ces systèmes in vitro ne sont pas d'un usage courant pour l'isolement des trypanosomes chez les sujets atteints de maladie du sommeil.

Techniques spéciales pour les microfilaires

Prélèvements de sang pour la recherche de microfilaires En cas de filariose présumée, le moment de la journée auquel on effectuera le prélèvement de sang est important. Certaines espèces ont une «périodicité»c'est-à-dire que .les microfilaires ne sont présentes dans le sang qu'à certains moments de la journée, et que pour les déceler il faut recueillir le sang au bon moment (voir tableau 2).

Tableau 2. Moments auxquels il faut prélever le sang des sujets présumés atteints de filariose

Espèce

Wuchereria bancrofti

Wuchereria bancrofti (var. pacifica)

Brugia malayi

Laa loa

Filaires dont la pathogénie est douteuse :

- Mansonella perstans

- Mansonella ozzardi

a Ces périodes ne sont pas immuables.

Moment auquel le prélèvement doit être fait 2

La nuit (entre 22 h et 0 h)

A tout moment

Surtout la nuit (entre 22 h et 0 h)

Pendant la journée (entre 1 0 h et 12 h)

A tout moment

A tout moment

Répartition géographique

Afrique tropicale, Asie, Amérique centrale et du Sud, Océan Indien

Océan PacifiqUe

Chine du Sud, Inde du Sud, Asie du Sud-Est

Afrique centrale et de l'Ouest

Afrique tropicale

Amérique intertropicale, Antilles

Recherche des microfilaires dans le sang périphérique En microscopie, trois méthodes sont couramment utilisées pour la recherche des microfilaires dans le sang périphérique:

- la goutte épaisse - l'examen du sang capillaire - l'examen du sang veineux hémolysé.

Pour que l'on puisse confirmer l'espèce en cause les micro filaires doivent être colorées.

La goutte épaisse

La préparer et la colorer comme décrit pp. 41-45.

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Examen du sang capillaire

Faire une préparation en mélangeant du sang capillaire frais prélevé au doigt avec du soluté physiologique, mettre entre lame et lamelle, et examiner au microscope à la recherche de microfilaires mobiles. On peut également concentrer les microfilaires dans du sang veineux. L'examen se fera comme pour les trypanosomes (voir p. 51-52), en choisissant bien le moment du prélèvement.

Examen du sang veineux hémolysé


Flacon, 10 ml Centrifugeuse Tubes à centrifuger, coniques, 15 ml Lames porte-objets Aiguilles pour ponction veineuse Support pour tubes à centrifuger Seringue, 5 ml Anticoagulant- solution de citrate de sodium à 2% (réactif No 26) Solution de formol à 2% (réactif No 10) Giemsa (réactif No 11) Ether Ethanol

Méthode

1. Verser 1 ml de sang veineux dans 9 ml de formol à 2%; attendre 5 minutes que les hématies soient lysées, puis centrifuger à grande vitesse.

2. Vider le surnageant. Tapoter le tube pour mélanger le culot. 3. Déposer 1 goutte de culot sur une lame. L'étaler pour former un frottis

mince. Laisser sécher à l'air. Fixer le frottis avec un mélange à parts égales d'éther et d'éthanol. Laisser sécher pendant 2 minutes. Colorer immédiatement au Giemsa. Les microfilaires se colorent bien.

D'autres techniques de filtration ont été mises au point pour isoler les microfilaires, mais elles ne concernent que les laboratoires spécialisés et leur description n'entre pas dans le cadre de ce manuel. On trouvera le détail de ces techniques dans le travail de Melvin & Brooke.l

Techniques spéciales pour les leishmanies

La leishmaniose est une parasitose provoquée par des protozoaires flagellés du genre Leishmania. Selon l'espèce en cause, on distinguera les leshmanioses cutanées, cutanéo-muqueuses et-viscérales. Ce sont les formes promastigotes du parasite qui sont transmises pqr la piqûre des phlébotomes. Elles pénètrent dans les cellules du système moponucléé phagocytaire de la peau ou des viscères, où elles se développent pour donner des formes amastigotes. Bien que ces dernières puissent être occasionnellement décelées dans les mononucléaires du sang périphérique, l'examen microscopique d'échantillons prélevés par aspiration ou par ponction-biopsie de moelle osseuse, des ganglions lymphatiques et de la rate, est plus sensible. Pour l'examen, on peut concentrer les leucocytes en une couche leucocytaire ( « buffy coat») par le microhématocrite décrit pour la détection des trypanosomes (voir p. 52).

1 MELVIN, D. M. & BROOKE, M. M., ed. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites. Atlanta, US

Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication N. (CDC) 82-8282).

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La symptomatologie clinique ne permet pas de différencier la leishmaniose viscérale des autres causes de splénomégalie fébrile. On peut mettre en évidence les leishmanies dans des échantillons prélevés par ponction-biopsie de la rate (98% de positivité), de la moelle osseuse (54 à 86%), ou de ganglions lymphatiques hypertrophiés (64%). La ponction de la rate peut être une technique à haut risque et il n'existe aucun consensus concernant son utilisation, bien que certains la préfèrent en raison de sa sensibilité élevée. Elle ne nécessite aucun matériel spéciat est moins douloureuse que la ponction de moelle osseuse et relativement facile à réaliser lorsque le médecin est expérimenté et que les précautions correctes sont prises. Dans la leishmaniose viscérale aiguë, lorsque la rate est petite et molle ou difficile à palper, on recommande la ponction de moelle osseuse ou de suc ganglionnaire.

La ponction de la rate ne sera réalisée chez un malade qu'après mesure du temps de Quick et numération plaquettaire. Elle ne doit pas être tentée si le temps de Quick dépasse de plus de 5 secondes le témoin, ou si la numération plaquettaire est inférieure à 40 x 109 par litre (40000/mm3).

Les deux précautions importantes à prendre si l'on veut opérer en toute sécurité sont les suivantes:

- Agir rapidement, de manière que l'aiguille reste moins d'une seconde dans la rate; et

- s'assurer que les axes de pénétration et de sortie de l'aiguille soient identiques, pour éviter de déchirer le péritoine splénique.

Matériel

Tampons de coton hydrophile Lames porte-objets Aiguille, 21 G (32 x 0,8 mm) Crayon ou feutre Seringue, 5 ml Tubes pour milieux de culture Milieu de Novy, McNeal et Nicolle (NNN)1

Milieu enrichi de Schneiderl

Technique

1. Nettoyer 3lames de verre et y inscrire le nom du malade, la date et «ponction de rate». Les milieux de culture doivent être prêts (un tube de NNN et un tube de Schneider) et étiquetés de la même manière. Les laisser atteindre latempérature ambiante. Fixer une aiguille de 21G (32 x 0,8 mm) à une seringue de 5 ml. Disposer tout le matériel sur une table, au chevet du malade.

2. Recueillir le consentement éclairé du malade. Palper la rate et en dessiner les contours sur l'abdomen du malade avec un stylo. Pour des raisons de sécurité, la rate doit être palpable à au moins 3 cm sous le rebord costal à l'expiration. Nettoyer la peau avec un coton imbibé d'alcool à l'endroit de la ponction et laisser sécher.

3. Avec l'aiguille fixée à la seringue, pénétrer juste sous la peau, à égale distance des bords de la rate, 2 à 4 cm sous le rebord costal. Incliner l'aiguille vers le haut sous un angle de 45° avec la paroi abdominale. La ponction est réalisée de la manière suivante: tirer le piston de la seringue en arrière vers la graduation d'1 ml pour obtenir une force d'aspiration et d'un mouvement rapide enfoncer totalement l'aiguille dans la rate puis la retirer rapidement, en maintenant l'aspiration.

4. Pour les jeunes enfants qui sont agités, s'assurer de l'aide de deux assistants qui maintiendront l'enfant (bras croisés sur la poitrine, chemise relevée pour empêcher toute vision et bassin tenu fermement). Effectuer la

1 Pour la préparation des milieux de cu~ure, voir l'annexe 3.

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ponction en une fois, en prenant les mêmes repères, les mêmes angles, les mêmes techniques que dans le point 3, en un mouvement rapide. L'insertion de l'aiguille doit être en phase avec la respiration du malade, de manière à éviter tout mouvement du diaphragme; si l'enfant crie, on piquera au moment de l'expiration bloquée. On n'obtient ainsi qu'une quantité très faible de matériel splénique, mais qui est suffisante pour la mise en culture et la préparation d'un frottis.

5. Tirer doucement le piston de la seringue vers les graduations de 2 et 3 ml et, aseptiquement, insérer l'aiguille dans un tube de milieu de culture et appuyer brusquement sur le piston pour expulser le contenu de l'aiguille sur les parois du tube. Si nécessaire, répéter une ou deux fois l'opération jusqu'à ce que le matériel de ponction soit visible dans le tube. Refermer le tube et le retourner pour récupérer le matériel restant sur les parois. Répéter cette l'opération pour le second tube de milieu de culture. Il est indispensable d'employer des techniques aseptiques.

6. Déposer doucement le reste du matériel de ponction sur des lames de verre en appuyant l'extrémité de l'aiguille sur la surface de la lame. Etaler immédiatement et uniformément avec l'aiguille d'un mouvement linéaire (et non circulaire). Le frottis ne doit pas être aussi épais qu'une goutte épaisse pour le paludisme. Retirer l'aiguille et utiliser son extrémité pour récupérer le matériel resté au fond de la seringue et l'étaler sur une lame. On peut encore trouver du matériel de ponction à l'extrémité du piston : le mettre directement sur une lame et l'étaler. Laisser les lames sécher.

7. Inscrire l'heure de la ponction sur la carte du malade, suivie des instructions suivantes: « noter le pouls et la pression sanguine toutes les 30 minutes pendant 4 heures, puis toutes les heures pendant 6 heures. Le malade doit rester alité pendant 12 heures». S'assurer que le malade comprend les instructions. Inscrire l'opération dans le dossier et signer.

8. Envoyer les lames et les milieux de culture au laboratoire. Les cultures sont incubées à 25°C et examinées régulièrement pendant deux semaines. Les lames sont colorées au Giernsa ou au colorant de Field et examinées à l'immersion (voir illustration ci-dessous). Le pH du soluté physiologique tamponné employé dans la coloration de Giemsa doit être de 6,8 pour Leishmania (et non de 7,2 comme pour les Plasmodium). On distingue différents degrés de densité parasitaire, comme indiqué dans le tableau 3.

A. Leishmania_: Formes amastigotes. B. Leishmania: Formes promastigotes

Pour les leishmanioses viscérales, les méthodes sérologiques apportent une aide certaine au diagnostic. Le sérodiagnostic est moins intéressant pour les leishmanioses cutanéo-muqueuses et ne présente aucun intérêt pour les leish-manioses cutanées.

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Tableau 3. Degrés de densité parasitaire (Leishmania)

Degré

+6

+5

+4

+3

+2

+1

0

a En prenant l'oculaire x1 0 et l'objectif à immersion x1 00.

Densité parasitaire moyenne

>100 parasites/champa

10-100 parasites/champ

1- 10 parasites/champ

1- .1 0 parasites/10 champs

1- 10 parasites/1 00 champs

1- 1 0 parasites/1 000 champs

0 parasite/1 000 champs

La description détaillée des nombreuses techniques immunologiques dont on dispose n'entre pas dans le cadre de ce manuel. Le titrage immunoenzymatique (ELISA) et l'épreuve d' immunofluorescence indirecte (IFI) sont les plus utiles. L'épreuve peut être pratiquée sur du sérum ou sur un volume déterminé de sang prélevé par ponction digitale sur des bandes de papier absorbant que l'on laisse sécher. L'échantillon est élué au laboratoire et testé à une dilution unique, déterminée auparavant comme étant celle qui donne une sensibilité et une spécificité acceptables dans la région en question. Des réactions croisées peuvent se produire avec les infestations à Trypanosoma cruzi. On peut en général les éliminer par dilution, ou les identifier en testant les échantillons en parallèle en présence d'antigènes de T. cruzi.

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Prélèvements cutanés Dans l'onchocercose (cécité des rivières), une filariose humaine que l'on retrouve en Afrique, en Amérique centrale et du Sud et dans certaines parties de la Région de la Méditerranée orientale, on examine de petits fragments de peau. En effet, les vers vivent dans des nodules situés dans les tissus souscutanés. On prélève des fragments cutanés de taille et d'épaisseur uniforme par biopsie cutanée exsangue à l'aide d'une pince à sclérotomie.


Lamelles couvre-objets Compresses de gaze Lames porte-objets, ou plaques de microtitrage Aiguilles, 22 G Scalpel, lame de rasoir, ou pince à sclérotomie1 de 2mm Ethanol à 95% Soluté physiologique (réactif No 24) ou eau distillée.


Malades présentant des nodules

Rechercher les nodules:

- sur la poitrine (sur les côtes) - sur les hanches, - sur les jambes (mollets), - dans le dos (omoplates).

Les nodules sont arrondis et durs, ont un diamètre de 1 à 5 cm; lorsqu'on les pousse du bout des doigts, ils roulent sous la peau. Prélever l'échantillon au centre du nodule.

Malades sans nodules

Prélever les biopsies cutanées exsangues:

- en haut de la fesse (partie supérieure externe, où l'on pratique les injections intramusculaires),

- au niveau des mollets (partie supérieure externe), - dans le dos (milieu de l'omoplate).

Il est recommandé d'examiner 6 prélèvements (2 des fesses, 2 des mollets et 2 des omoplates).

1. Si l'on ne dispose pas d'une pince à sclérotomie, employer un scalpel stérile jetable et des aiguilles ou des vaccinostyles. Si l'on ne dispose pas de matériel jetable, l'instrument devra être stérilisé avant usage pour chaque malade. Pour cela onmet le scalpel, la lame de rasoir, le vaccinostyle ou l'aiguille dans un peu d'alcool que l'on flambe.

1 La pince à sclérotomie est fournie par : Karl Storz, Tuttlingen, Allemagne.

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PRÉLÈVEMENTS CUTANÉS

2. Désinfecter l'endroit choisi avec une compresse de gaze trempée dans l'alcool. 3. Enfoncer la pointe de l'aiguille de 2 à 3 millimètres dans la peau et la rele

ver.

4. Poser la lame du scalpel ou la lame de rasoir sur la peau tendue au-dessus de la pointe de l'aiguille. Couper d'un coup sec le morceau de peau relevé par la pointe de l'aiguille, aussi près de l'aiguille que possible. Le prélèvement doit avoir 2 à 3 mm de large. Il doit rester accroché à la pointe de l'aiguille.

L'échantillon ne doit pas être taché de sang. La biopsie doit être exsangue pour éviter toute contamination par des parasites sanguins.

Examen des prélèvements

1. Déposer une goutte d'eau distillée ou de soluté physiologique sur une lame. 2. Déposer le petit morceau de peau dedans et recouvrir d'une lamelle. Ne pas

appuyer sur le prélèvement ni sur la lamelle. S'il n'y a pas assez de soluté physiologique pour recouvrir le morceau de peau, en rajouter au bord de la lamelle, de manière qu'il pénètre par-dessous.

3. Laisser la lame montée reposer 30 minutes, puis l'examiner à l'objectif x 10. S'il y a des microfilaires, on peut en général les voir se tortiller dans le soluté physiologique. S'il n'y en a pas, on laisse reposer les prélèvements de peau dans du soluté physiologique pendant 4 heures à température ambiante, puis on les réexamine.

L'examen quantitatif peut être effectué comme suit:

1. Peser le fragment cutané avec une balance (1-10 mg). 2. Le transvaser dans un godet de plaque de microtitrage. 3. Ajouter 0,1 ml de soluté physiologique. 4. Recouvrir la plaque pour éviter toute évaporation et laisser incuber à tem

pérature ambiante pendant 24 heures. 5. Compter le nombre de microfilaires présentes dans le soluté physiologique

à l'aide de l'objectif x 10, et exprimer le résultat par rapport au poids du prélèvement.

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Une digestion par la collagénase du fragment cutané pendant plus de 24 heures peut augmenter la sensibilité de l'examen pour les prélèvements provenant de malades ayant une faible charge parasitaire. Cette digestion peut également être pratiquée sur du matériel fixé à l'éthanol et conservé à température ambiante.

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Deuxième partie

Identification des espèces parasitaires

Parasites intestinaux Helminthes

Il existe trois groupes d'helminthes importants sur le plan médical-les nématodes (vers ronds), les cestodes (ténias) et les trématodes (douves). En général, les stades servant au diagnostic sont les œufs et les larves. Plus rarement, on peut observer des vers adultes comme Ascaris et Enterobius et diagnostiquer certaines téEniasis à l'aide de segments ou de proglottis. Toutefois, dans la majorité des helminthiases, ce sont les œufs qui servent à l'identification.

Clé de détermination des œufs

Les caractéristiques utilisées pour identifier les espèces d'œufs sont les suivantes:

1. Dimensions. On mesure la longueur et la largeur, qui sont en général situées dans un intervalle précis.

2. Forme. Chaque espèce a une forme particulière. 3. Stade de développement au moment de l'émission des selles. Dans certaines espè

ces, les œufs consistent en une cellule unique; dans d'autres, ils peuvent être pluricellulaires; enfin, une troisième catégorie d'espèces possède des œufs généralement embryonnés (c'est-à-dire contenant une larve) lorsqu'ils sont émis dans les selles. De temps en temps, si le prélèvement de selles est vieux de plusieurs heures ou d'un jour ou deux, les œufs peuvent se développer jusqu'à des stades plus avancés. Par exemple, les œufs d'Ascaris sont en général monocellulaires lorsqu'ils sont émis; mais cette cellule unique peut se diviser et dans les échantillons qui ont attendu, on peut observer des œufs à 2 ou 4 cellules. Dans les prélèvements vieux de plusieurs heures, les œufs d'ankylostomes peuvent contenir 16 cellules ou 32, voire davantage. En 12 à 24 heures, l'œuf peut être embryonné; par la suite il peut éclore, donnant naissance à une larve. Par conséquent, lorsqu'on observe les stades de développement des œufs d'helminthes, s'assurer que les prélèvements de selles sont frais. S'ils ont plusieurs heures ou même un jour, s'attendre à des modifications dans les stades de développement de certaines espèces. L'idéal serait de n'accepter pour le diagnostic que des selles fraîches.

4. Epaisseur de la coque de l'œuf. Certaines espèces, comme Ascaris, ont des coques épaisses; d'autres, comme les ankylostomes, ont des coques minces.

5. Couleur. Certains œufs sont incolores (par exemple, les œufs d'ankylostomes et d'Enterobius), d'autres sor.t jaunes ou bruns (Ascaris, Trichuris).

6. La présence d'éléments caractéristiques comme: opercules, éperons, protubérances, petits crochets, ou parois externes mamelonnées.

Si l'on trouve un œuf ou un objet qui ressemble à un œuf, on observera attentivement ses divers traits distinctifs, de manière à déterminer l'espèce. On se trouvera parfois en présence d'œufs atypiques ou déformés. En pareil cas, il faudra rechercher des formes plus typiques de manière à poser un diagnostic fiable. Ne pas oublier que plusieurs espèces d'helminthes peuvent cohabiter chez un même malade.

La clé de détermination (Fig. 3) et les diagrammes d'œufs d'helminthes de la figure 4 seront utiles pour la détermination des espèces.

Observer attentivement la taille, la forme, le stade de développement, l'épaisseur de la paroi, sa couleur et la présence de structures particulières comme: opercule, éperon, protubérances, crochets et paroi externe bosselée, pour identifier les espèces auxquelles les œufs appartiennent.

69

-...J 0

Fig. 3. Clé de détermination des œufs d'helminthes

Œufs

1 1 Non encapsulés, Protubérance à chaque extrémité ?

1 1 1

Protubérance à chaque extrémité

Pas de protubérance

1

Encapsulés L Dipylidium caninum (30-50 ~mx 27-50 ~m) ou

lnermicapsifer sp.

Longueur de l'œuf < 1 00 ~m ---- Petit éperon latéral Schistosoma japonicum (souvent invisible). Dans les selles.

Œufs de Schistosoma

1

Avec éperon

(68-100 ~mx 45-80 ~m) ou

Schistosoma mekongi (rare)

Eperon latéral proéminent, Schistosoma mansoni paro1 transparente

Avec ou sans opercule ? -- Sans opercule -- Avec ou sans éperon ?------------------1 Longueur de l'œuf > 110 ~m l

(114-180~mx45-73~m)

1 Avec opercule Extension de la paroi avec rebord-- Clonorchis sinensis Longueur maximale de l'œuf ?

Longueur de l'œuf< 35 ~m

(=épaulement marqué) (extrémité postérieure (25-35 ~mx 11-22 ~m) large et arrondie)

Allongé, pas d'épaulement ---- Opisthorchis fe/ineus (25-35 ~mx 8-12 ~m) (extrémité postérieure avec

bouton terminal pointu)

Epaulement moins distinct, Heterophyes heteraphyes opercule large (petit bouton à l'extrémité (28-30 ~mx 15-17 ~m) postérieure)

Pas d'épaulement, paroi mince

------- Metagonimus yokogawai

(26-30 ~mx 15-20 ~m)

Longueur de l'œuf entre 35 et 118 ~m -{

Ovoïde, jaune d'or Paroi épaisse, non embryonné (58-76 ~mx 40-51 ~)

Brun doré, non embryonné

Diphyllobothrium fatum

Paroi épaisse, ovoïde, avec opercule aplati ? Oui -- Paragonimus westermani

(68-118 ~mx 40-51 ~m)

L_ ___ Non -- Echinostoma sp. (83-120 ~mx 58-90 ~m)

Fascia/a hepatica

[

(130-145 ~mx 70-90 ~m) Longueur de l'œuf> 120 J.lm ------------------j ou ovoïde, paroi mince, brun Jaunâtre Fasciolopsis buski

(125-140 ~mx 70-90 ~m)

Extrémités faisant nettement saillie Trichuris trichiura (49-65 ~mx 20-30 ~m)

En forme de citron, les extrémités ne faisant pas une saillie nette -----(36-45 ~m x 21 ~m)

c_ ______ En forme de citron mais légèrement rétréci au milieu (36-45 ~mx 20-30 ~m)

Capillaria hepatica

Capillaria philippinensis

en général dans les urines ou (rare dans les selles) . les biopsies vésicales

Eperon termmal (112-170 ~mx 40-70 ~m) {

Extrémité anténeure arrondie, -Sch1stosoma haematobwm

Sarns ~~~~nou épaisse ? Extré!"1té antén~u!e effilée, -- S,chistosoma mtercalatum pa

01 · long eperon effile a (eperon plus long que

extrémité courbe chez S. haem.) (140-240 ~mx 50-85 ~m) Uniquement dans les selles

Strongy/oides stercoralis

CSans blastomères, Lou larves partiellement développées

P . . (50-76 ~m x 35-47 ~) Strongyloides ful/eborm

aro1 mmce et lisse, avec ou Necator americanus sans blastomère i- Ovoïde avec 2 à 8 blastomères -f Ancy/ostoma duodenale

Paroi épaisse, grossière ou lisse?

Avec blastomeres, (64-80 ~m x 35-40 ~m) Temidens diminutus

ovoïde ou

ellipse allongée ? Paroi à une membrane,---- Trichostrongylus sp. ellipse allongée symétrique (75-115 ~mx 40-50 ~m)

1 Paroi épaisse grossière, l'œuf contient une cellule non segmentée possédant des granules grossiers (45-70 ~mx 35-45 ~m)

Ascaris lumbricoides

Paroi épaisse lisse, œuf symétrique ou

(un côté convexe,

Dicracoelium /anceatum (contient un miracidium)

asymétrique? ri Oeuf brun foncé r _ . (38-45 J.lm x 22-30 ~m) Asymetnque

un côté aplati) Oeuf incolore -------- Enterobius vermicularis Paroi à 4 couches (contient une larve) (50-60 ~m x 20-32 ~m)

Symétrique

1 Œuf arrondi ou presque rond, paroi à 2 membranes, avec ou sans embryophore ? lr

Avec embryophore -------1[~~nia solium jaune pâle à brun, . . paroi à 2 membranes Taema sagmata (diam. = 44-77 ~m) (se d1stmgue par l'examen

des proglottis)

J Avec filaments ------- Hymenolepis nana polaires (40-60 ~mx 30-50 ~m)

Sans embryophore, avec ou ~ans filamen Sans filaments Hymeno/epis diminuta polaires . polaires

(70-86 ~m x 60-80 ~m)

~ :u l> Ill =i rn ~ m ~ z l> c: ><

---1 ......

Fig 4. Identification des helminthes intestinaux

60

30 '"'"',_____-~m;

MetagonimusHeterophyesOpisthorchis Clonorcllis yokogawai heterophyes felinous s/nensis

DIMENSIONS RELATIVES DES ŒUFS D'HELMINTHES*

Taenia Hymeno/epis Enterobius nana verrnicu/aris

Trichuris trichiura

Ascaris lumbricoides Ankylostome fécondé

Diphyllobothrium fatum

Hymenolepis diminuta

90

60

30

E 15o 15o :i ___________ , --------

120 ~--~--~- 120 ----~---·------···--···

--·---·- -·---

90 ~~-~---.rx:x ~--

60

Paragonimus westermani

Trichostrongy/us Ascaris lumbricoides non fécondé

Schlstosoma japonicum

Schistosoma haematobium

Schistosoma manson/

Fascia/a hepatica

Fasciolopsis bus ki

WHO 91106

90

60

30

6 m ~ 'ii 0 ~ 0 z c m rJl m rJl "tl m· (") m rJl "tl )> :u ln ~ :u m rJl

PARASITES INTESTINAUX

Larves

Dans les selles fraîches, les larves observées sont en général des larves rhabditoïdes (=premier stade larvaire) de Strongyloides stercoralis. Cependant, si les selles ont plus de 12 heures, ces larves peuvent muer en larves strongyloïdes (stade infestant): il faut alors les différencier des larves d'ankylostomes qui peuvent également éclore dans les selles au bout de 12 à 24 heures. La présence de larves strongyloïdes de Strongyloides stercoralis peut être l'indication d'une hyperinfestation généralisée.

La figure 5 et le tableau 4 montrent quels sont les caractères employés pour différencier les espèces.

Fig. 5. Larves d'helminthes

Ankylostome

strongy/oïde rhabdi~oip_e_

~trongyl()id_~s st~rcoralis

, rhabtfiJ_q_ïde strf!nJJx!oïde

- cavité buccale -

- Ebauche génitale

WHO 91705

Tableau 4. Caractéristiques des larves d'helminthes

Ankylostome

Larves strongyloïdes

Dimension 500 x 14-20 l!m

Gaine

Extrémité postérieure effilée

Œsophage représentant le tiers du corps sans renflement

Larves rhabditoiaes

Dimension 100-150 x 15-171-!m

Cavité buccale longue (15 l!m)

Œsophage représentant le tiers de la longueur du corps et à deux renflements

Ebauche génitale petite (7 l!m)

Pore anal situé à 80 !!ffi de l'extrémité postérieure

Strongyloides

Larves strongyloïdes

Dimension 500 x 14-20 l!m

Pas de gaine

Extrémité postérieure bifide ou tronquée

Œsophage représentant la moitié du corps sans renflement

Larves rhabditoiaes

Dimension 200-300 x 15-18 l!m

Cavité buccale courte (4 l!m)

Œsophage représentant le tiers de la longueur du cqrps et à deux renflements

Ebauche gé~itale grande (22 !!ffi)

Pore anal sih.Jé à 50 l!m de l'extrémité postérieure

C'est dans les préparations à l'iode que l'on voit le mteux l'ébauche génitale. L'iode va tuer les larves, ce qui permettra de mieux observer leurs caractéristiques. Pour voir ces structures, il faut un fort grossiss~ment, sans immersion.

- si l'on observe une larve ayant une cavité buccale courte et une ébauche génitale nettement visible, il s'agit de Strongyloides.

72

IDENTIFICATION DES ESPÈCES PARASITAIRES

-si Yon observe une larve ayant une cavité buccale longue sans que l'ébauche génitale soit visible, il s'agit d'un ankylostome.

Protozoaires

Les protozoaires intestinaux comprennent les amibes et les flagellés. Deux stades permettent le diagnostic, ce sont: la forme végétative ou trophozoïte et le stade quiescen tou kyste. Ces deux stades peuvent être présents dans les selles. On trouve en général les formes végétatives dans les diarrhées ou les selles très molles, et les kystes dans les selles moulées. Toutefois, on peut retrouver la présence de ces deux stades dans un même échantillon.

Formes végétatives et kystes peuvent être observés dans des préparations de selles fraîches en soluté physiologique. L'identification des espèces nécessite parfois une coloration. On trouvera dans le tableau 5 les différents types de montages généralement employés pour déceler et identifier les protozoaires, ainsi que les caractéristiques que l'on peut observer dans chacun d'eux.

Tableau 5. Caractéristiques des protozoaires visibles dans différents types de préparations

Amibes

Formes végétatives

Mobilité

Cytoplasme

Inclusions

Noyaux

Kystes

Noyaux

Cristalloïdes8

Glycogène

Flagellés

Formes végétatives

Mobilité

Forme

Noyau

Kystes

Forme

Noyaux

Filaments

Soluté physiologique

+

+

+

+

+

+

+

Colorations temporaires

Bleu de méthylène tamponnéa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Coloration permanente

(Trichrome)c

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ a On n'utilise la coloration au bleu de méthylène tamponné que pour les trophozo·~es amibiens vivants.

bOn !lmploie l'iode pour colorer les kystes, bien que les trophozoïtes de flagellés puissent également être colores par cette methode.

c Les techniques de coloration permanente ne sont pas employées couramment dans les laboratoires de diagnostjc, rr'ais sont réseryé!'S à des circonstances particulières, comme indiqué dans le texte (par exemple, diagnostic dune cryptospond1ose).

d Les cristalloïdes des kystes d'amibes s'obseJVent mieux dans les préparations en soluté phy:siologique que dans celles à l'iode. C'est dans les étalements colorés de façon permanente qu'on les voit le mieux.

• Le gJycogène est dissous pendant la coloration et dans les étalements colorés de façon permanente on ne verra a sa place que des espaces vides (vacuoles). 1 On obseJVe parfois des fibrilles (filaments) dans les préparations en soluté physiologique.

73


Formes végétatives d'amibes

Préparations à l'état frais en soluté physiologique

On peut observer des formes végétatives d'amibes mobiles dans des préparations de selles fraîches en soluté physiologique. Elles vont apparaître légèrement verdâtres et réfringentes (brillantes). A fort grossissement, on peut observer leur mobilité et des inclusions telles qu'hématies et levures. Il est impossible de distinguer le noyau. (Les macrophages peuvent également contenir des hématies et bouger.)

Lorsqu'une forme végétative se déplace rapidement dans une direction et forme des pseudopodes également rapidement, il peut s'agir d'Entamoeba histolytica. Les autres espèces d'amibes ne se déplacent en général pas de cette manière. Si la forme végétative se déplace comme décrit plus haut et si l'on observe la présence d'hématies dans son cytoplasme, on peut considérer qu'il s'agit d'E. histolytica. Il est parfois nécessaire de colorer le noyau au bleu de méthylène tamponné pour confirmation.

Préparation en soluté physiologique:

MOBILITÉ DIRECTIONNELLE PRÉCISE +

HÉMATIES INGÉRÉES = E. histolytica

Préparation à l'état frais dans le bleu de méthylène tamponné Si l'on soupçonne la présence de formes végétatives d'amibes, examiner une préparation dans le bleu de méthylène tamponné (voir tableau 5). Les formes végétatives peuvent s'arrondir et demeurer immobiles, mais leur noyau et les inclusions qu'ils contiennent se coloreront en bleu foncé, alors que le cytoplasme sera bleu clair. Rechercher les grains de chromatine nucléaire périphérique (situés le long de la membrane autour du noyau); s'ils sont présents, il s'agit d'une espèce d'Entamoeba. S'il n'y a pas de chromatine périphérique, ce n'est pas un Entamoeba. Lorsque la chromatine nucléaire périphérique est visible, il faut identifier l'espèce. Pour cela, utiliser la «clé de détermination des formes végétatives d'amibes dans les étalem~nts colorés» (Fig. 6).

Les formes végétatives d'E. histolytica ont environ 12 à 40 Jlm de long. Le noyau se présente comme un cercle bleu foncé portant un point foncé (le caryosome) en son centre. Si les grains de chromatine nucléaire périphérique sont fins et réguliers, et si le caryosome central est petit, il s'agit probablement d'E. histolytica, mais il faut observer plusieurs spécimens pour s'en assurer. Si l'on voit des hématies dans le cytoplasme, cela permettra de confirmer le diagnostic. Ces hématies vont apparaître en bleu foncé dans les préparations colorées au bleu de méthylène tamponné.

Entamoeba coli a à peu près la même taille qu'E. histolytica et possède également un noyau avec chromatine périphérique. En revanche, il a un cytoplasme grossier contenant souvent des bactéries ou des champignons. La chromatine nucléaire périphérique est irrégulière et le caryosome n'est pas au centre du noyau.

74


Etalements colorés au trichrome Dans les étalements colorés, les formes végétatives peuvent avoir une forme ronde, allongée ou irrégulière. Les formes végétatives d'amibes se colorent généralement en vert ou en bleu-vert avec un noyau violet ou rouge. Les noyaux des espèces d'Entamoeba ont des grains de chromatine périphérique (comme dans les préparations au bleu de méthylène tamponné), qui peuvent former un cercle ou un «collier de perles». Le caryosome peut apparaître comme une tache rouge ou violette à l'intérieur du noyau. ChezE. histolytica, le caryosome est en général au centre du noyau mais peut parfois être excentré et seule l'observation de plusieurs spécimens permet de faire la distinction entreE. histolytica etE. coli.

On peut observer, en plus des formes végétatives d'amibes, d'autres cellules qui leur ressemblent et qu'il faut bien différencier des amibes. Comparer les structures observées dans les étalements colorés avec les figures de la clé de détermination et de la p. 82. «Problèmes d'identification», pour savoir s'il s'agit de formes végétatives d'amibes, de cellules d'origine tissulaire, ou d'autres éléments.

Les formes végétatives appartiennent à l'espèce E. histolytica si les structures suivantes sont visibles:

- Chromatine nucléaire périphérique et présence d'hématies dans le cytoplasme

ou

- chromatine nucléaire périphérique uniforme et

- petit caryosome central dans le noyau et cytoplasme lisse, finement granuleux et

- longueur de la forme végétative= 2 à 6 fois le diamètre

Kystes d'amibes

Il est indispensable de mesurer exactement les kystes pour pouvoir les identifier correctement.

Préparation à l'état frais en soluté physiologique

Si l'on travaille à l'objectif x 40, mettre au point à différentes profondeurs de la préparation et rechercher des objets ronds et brillants ayant un diamètre à peu près égal à une à trois fois le diamètre d'une hématie. Rechercher également les cristalloïdes (structures en bâtonnets), que l'on voit mieux à fort grossissement. Ils sont plus distincts dans les préparations en soluté physiologique que dans celles à l'iode. Ces éléments ont un aspect caractéristique et on les trouve chez E. histolytica et E. coli. Dans la première espèce, les cristalloïdes ont des extrémités arrondies tronquées, alors que chez E. coli elles sont pointues. On les observe moins souvent dans les kystes d'E. coli que dans ceux de E. histolytica.

Les noyaux ne sont pas faciles à voir en soluté physiologique, mais sont bien visibles dans les préparations à l'iode. L'aspect du noyau est important pour différencier les espèces d'amibes. Par conséquent, si l'on observe des kystes

75


Fig. 6. Clé de détermination des formes végétatives d'amibes

Forme végétative avec ou sans chromatine nucléaire périphérique

Avec chromatine nucléaire périphérique

Sans chromatine nucléaire périphérique

1 1

Cytoplasme grossièrement Cytoplasme finement Un noyau dans toutes las formes végétatives

Deux noyaux dans plus de 50% des

formes végétatives granuleux, granuleux avec ou sans

bactéries et levures, hématies, pas de

1 pas d'hématies bactéries

1

Entamoeba coli Taille >15 ~m

Taille 8 à 15 ~m

Entamoeba hartmanni

Petit endosome, granules périphériques dans le noyau disposés

régulièrement

Taille 15 à 30 ~m

Entamoeba histolytica

Noyau avec granules

périphériques

Grand endosome irrégulier

1

Endolimax nana

Noyau sans granules périphériques, grand

endosome

/odamoeba bütschlii

Grande masse de chromatine dans un espace transparent

1

r~. ,f-c.· ) 0 :;f

.

.

Dientamoeba fragilis*

Taille 5 à 15 ~m

WHO 91082

* Dientamoeba fragi/is, bien que classé parmis les flagellés, a été inclus dans ce tableau pour des raisons pratiques.

(ou des éléments qui leur ressemblent) dans la préparation en soluté physiologique, examiner une préparation à l'iode.

Tout kyste observé doit être mesuré.

Préparations à l'état frais dans l'iode

Mettre au point avec l'objectif x 40 et rechercher des kystes. Dès qu'on en a trouvé, ou que l'on voit des objets qui leur ressemblent, passer au fort grossissement afin de distinguer les détails permettant d'identifier l'espèce. Mesurer les kystes.

76

--.1 --.1

Fig. 7. Clé de détermination des kystes d'amibes et de flagellés

Kyste

1 1

Avec filaments internes Sans filaments, Kyste de flagellé Kyste amibien

1 1 1 1 .

1

1 En forme de poire, En forme de citron, Kyste ovale Absence de chromatine Présence de chromatine

1 noyau, 1 noyau Coque épaisse nucléaire pénphénque nucléaire périphérique

Taille4à711m Taille5à9flm 1 1 1 1 1 1 1 4 noyaux, masses Gros noyau Taille <1 0 11m Taille 10 à 15 11m Taille 15 à 30 ~tm

de chromatine excentré 1 1 1 vacuole colorée 1 1

à l'iode -' 2 ou 4 noyaux 5 noyaux 1 , 2 ou 4 noyaux masse de glycogène masse de glycogène ou davantage

Retortamonas Ch/lomastix ln test/na lis

Taille 4 à1 0 ~tm, 1 à 4 noyaux (en général 2 noyaux)

• . '

' Enteromonas homlnls

Taille 10 à 14flm, corps parabasaux,

2 à 4 noyaux rassemblés à une

des extrémités

Giardia

Endolimax nana

lodamoeba bOtschlii

(kyste immature)

Entamoeba hartmann/

4 noyaux avec chromatine périphérique régulière

(kyste immature ) (kyste mûr)

Entamoeba histolytica WH091083

6 m ~ l!

~ 0 z c m Ill m Ill "tl mo m Ill "tl ,. :D

~ ~ jj m Ill


Pour identifier l'espèce à laquelle appartiennent les kystes trouvés, employer la «clé de détermination des kystes d'amibes et de flagellés» dans les préparations à l'iode et les étalements colorés (Fig. 7), ainsi que la description ci-avant.

Les kystes d'E. histolytica ont un diamètre de 10 à 15 J.Lm. A maturité, ils possèdent quatre noyaux ayant chacun un caryosome central et de la chromatine nucléaire périphérique uniforme. Les noyaux ne sont en général pas dans le même plan, il faut donc les rechercher en faisant varier la mise au point. Pour cela, relever soigneusement l'objectif jusqu'à ce que le kyste cesse d'être net. Mettre au point soigneusement, puis descendre l'objectif lentement pour pouvoir examiner les différents plans du kyste. Compter les noyaux au fur et à mesure qu'ils apparaissent.

On voit parfois des kystes immatures d'E. histolytica, qui peuvent avoir 1 ou 2 noyaux. S'il n'y a qu'un noyau, il est en général assez grand. Souvent, les kystes à un noyau possèdent de grosses masses de glycogène et plusieurs petits cristalloïdes qui ne se sont pas encore transformés en corps en bâtonnets typiques. Mesurer le kyste.

Les kystes d'E. coli sont en généralement plus grands que ceux d'E. histolytica (15-30 J.Lm). Les premiers possèdent huit noyaux ayant une chromatine périphérique irrégulière et grossière avec un caryosome qui n'est pas central. Ils sont en général situés dans différents plans et il faut donc étudier soigneusement ces différents plans pour les apercevoir et les compter.

On peut observer des kystes immatures d'E. coli, qu'il ne faut pas confondre avec ceux d'E. histolytica. La forme immature la plus couramment rencontrée est le kyste à deux noyaux (les kystes d'E. coli à un noyau sont rares), possédant une masse de glycogène importante et plusieurs petits cristalloïdes. Comme pour E. histolytica, ces éléments ne sont pas encore constitués en cristalloïdes typiques. Une mesure exacte permettra de distinguer les kystes d'E. coli de ceux d'E. histolytica.

Les kystes d'E. hartmanni sont semblables à ceux d'E. histolytica, mais ils sont plus petits (7 à 9 J.Lm).

Dans les préparations à l'iode, les kystes d'Iodamoeba bütschlii montrent une masse compacte de glycogène, qui les différencie de ceux d'E. histolytica. Ils ne possèdent pas de cristalloïdes et contiennent un seul noyau.

Si l'on trouve d'abord des kystes immatures, rechercher des formes arrivées à maturité. On peut en général en trouv~r et identifier l'espèce. Si les kystes possèdent cinq noyaux ou davantage, ils appartiennent à l'espèce E. coli.

Ces dernières années, plusieurs cas de méningo-encéphalite amibienne primitive provoqués par des amibes vivant à l'état libre, Acanthamoeba sp. et Naegleria sp., ont été rapportés dans le monde. La plupart des infections ont été liées à de l'eau polluée. Le diagnostic de laboratoire fait appel à l'examen microscopique du liquide céphalorachidien purulent contenant des polynucléaires mais pas de bactéries. Les amibes sont visibles sur frottis coloré au Giemsa.

Blastocystis hominis, un protozoaire également retrouvé dans les selles, se distingue des kystes amibiens du fait que son centre se colore en vert (ou parfois reste incolore), avec des granules réfringents sur le bord.

00 .......... , ..

·.:· · ...

. .. . :; . . -. . . .. ~ --~ . ::; ' :

Blastocystis hominis Î

78


Flagellés

a) Préparations à l'état frais en soluté physiologique pour la détection et l'identification des formes végétatives Le meilleur critère d'identification des formes végétatives de flagellés (Fig. 8) est la façon dont ils se déplacent dans les préparations en soluté physiologique. Les flagelles sont en général invisibles, tout comme les noyaux.

- Les formes végétatives de Giardia intestinalis (pathogènes) ont un mouvement «en chute de feuille>>; elles basculent d'avant en arrière.

- Celles de Chilomastix mesnili (non pathogènes) se déplacent en effectuant des rotations.

- Celles de Trichomonas hominis (rarement pathogènes) ont un mouvement désordonné.

NOTE:

Le bleu de méthylène tamponné ne colore pas les formes végétatives de flagellés; ce type de préparation ne présente donc aucun intérêt pour leur mise en évidence.

b) Préparations à l'état frais dans l'iode pour la détection et l'identification des kystes On emploie surtout les solutions d'iode pour colorer les kystes et rendre visible la structure des noyaux. Pour l'identification, employer la« clé d'identification des kystes d'amibes et de flagellés» (Fig. 7).

Fig. 8. Clé d'identification des formes végétatives de flagellés dans les étalements colorés

211agelles, 1 noyau

taille4- 9 ~m

'~ . ~~:1 . G:'c-\

·~ ~

.

Retortamonas intestinalis

NOTE:

Forme végétative avec a~ moins 2 flagelles

411agelles

~ Taille 4-8 ~m.

1 noyau

Enteromonas hominis

Taille 6- 20 ~m. 1 noyau,

1 cytostome

Chilomastix mesnili

au moins 5 flagelles

5 flagelles, Forme végétative en 1 noyau, lorme de poire,

membrane ondulante 4 paires de flagelles, (rarement visible), 2 noyaux, corps parabasaux, ·taille 8-20 ~m taille 10-20 ~m

Trichomonas hominis

Giardia intestinalis

Trichomonas hominis ne possède pas de stade kystique.

79


c) Formes végétatives et kystes de Giardia intestinalis dans les étalements colorés

Les Giardia sont caractéristiques et correspondent en général aux illustrations que l'on trouve dans les manuels et les ouvrages de parasitologie. Ils sont faciles à identifier dans les étalements colorés.

Les autres espèces de flagellés intestinaux sont rarement pathogènes.

Balantidium coli

C'est le seul cilié à parasiter l'être humain et ces infestations sont rares. Il n'a pas été évoqué ailleurs dans ce manuel en raison de cette rareté des cas (c'est surtout un parasite du porc et du singe). Toutefois, comme on le rencontre parfois dans les échantillons de selles humaines, il sera brièvement décrit ici.

Balantidium coli possède des formes végétatives et des kystes. Les formes végétatives sont grandes (50 à 200 11m de long sur 40 à 70 11m de large) et très actives et sont facilement identifiables dans les préparations en soluté physiologique, à faible grossissement (voir plus bas). Elles sont recouvertes de petits poils courts (cils), qui battent rapidement et permettent à ces éléments parasitaires de se déplacer à grande vitesse. Elles meurent très rapidement une fois sorties de l'organisme et les selles doivent donc être examinées dans l'heure qui suit leur émission.

Les kystes ont un diamètre de 45 à 75 11m. Ni les formes végétatives, ni les kystes ne se colorent bien à l'iode ni aux colorants permanents. La meilleure technique reste donc l'examen à l'état frais en soluté physiologique.

0 20 40 J!m

Forme végétative de Balantidium coli Kyste de Balantidium coli

lsospora belli et Cryptosporidium sp. Isospora belli et Cryptosporidium, des coccidies, sont des parasites intestinaux. L'homme est rarement infesté par Isospora belli et lorsque cela se produit, l'infestation est rarement grave et souvent asymptomatique. L'infestation par Cryptosporidium est une cause importante de diarrhée chez l'enfant de moins de 5 ans, et peut être particulièrement grave chez les immunodéprimés.

Diagnostic de laboratoire On peut déceler les oocystes d'Isospora belli dans les étalements frais de matières fécales montés directement. Le cas échéant, on peut les concentrer par la technique au formol-éther (voir première partie, pp. 16-17).

Mélanger une petite quantité de matière fécale dans du soluté physiologique à l'extrémité d'une lame et dans un peu de solution iodée à l'autre extrémité.

80


Les oocystes d'Isospora belli sont ovales (environ 32 x 16 )lm) et contiennent une masse centrale de protoplasme bien individualisée (voir diagramme ci-dessous).

Oocyste immature d'lsospora belli Oocyste mûr d'/sospora belli

NOTE:

Préparer une solution d'iode en mélangeant 10 ml de Lugol (réactif No 16) à 10 ml d'acide acétique à 25% v/ v. Cette solution permet une bonne coloration des noyaux.

Les oocystes de Cryptosporidium s'observent dans les étalements de matière fécale colorés (voir première partie, pp. 18-19).

Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii est un parasite des animaux qui provoque la toxoplasmose. Chez l'homme, la toxoplasmose est souvent asymptomatique. Elle peut provoquer de la fièvre, des éruptions, une adénopathie et une lymphocytose. Sa forme la plus grave est la toxoplasmose congénitale qui provoque souvent des lésions cérébrales importantes chez le fœtus. Si elle est contractée au début de la grossesse, l'infestation peut provoquer l'avortement, alors qu'en fin de grossesse, elle sera à l'origine de symptômes d'infestation chez le nourrisson 2 à 3 mois après la naissance. Des manifestations cliniques graves, en particulier cérébrales, de la toxoplasmose se rencontrent souvent chez les malades atteints du sida.

Le diagnostic de laboratoire de la toxoplasmose fait appel à:

1. Des épreuves sérologiques, parmi lesquelles le test de lyse («Dye test» de Sabin et Feldman), l'immunofluorescence indirecte (IFl), l'hémagglutination indirecte (IHA), la réaction de fixation du complément (FC), et le titrage immunoenzymatique (ELISA), plus récent. La description de ces techniques n'entre pas dans le cadre de ce manuel.

2. Des examens microscopiques, qui sont parfois utiles pour le diagnostic d'une infestation aiguë, et qui sont pratiqués sur des préparations de suc ganglionnaire, de moelle osseuse, de liquide céphalorachidien, de liquide péritonéal, pleurale ou d'expectorations, colorées au Giemsa ou au colorant de Field. Cette recherche est surtout pratiquée en cas de sida.

Les toxoplasmes sont des organismes en croissant de petite taille (3 x 7 )lm). Ils ont une extrémité arrondie, l'autre pointue. Leur cytoplasme se colore en bleu, et leur noyau, qui est situé dans l'extrémité arrondie, en rouge foncé. Dans les coupes tissulaires, ils peuvent parfois être arrondis et ressembler aux formes amastigotes de Leishmania.

Problèmes d'identification

Dans les échantillons de selles, de nombreuses structures ressemblent à des parasites sans en être.

Les cellules épithéliales et les macrophages peuvent être confondus avec des formes végétatives d'amibes, en particulier les seconds, qui montrent de légers

81


mouvements amiboïdes et peuvent contenir des hématies. Leurs noyaux, que l'on peut observer dans les préparations colorées au bleu de méthylène tamponné, sont plus grands que les noyaux des amibes et contiennent en général plusieurs grains ou particules de chromatine (voir ci-dessous).

Cellule épithéliale Macrophage

On peut également confondre des cellules de pus avec des kystes d'amibes. Leurs noyaux forment 3 ou 4 expansions et se colorent en général très fortement. Leur cytoplasme montre un contour irrégulier et la membrane cellulaire est souvent invisible. Les kystes d'amibes ont une paroi cellulaire nette.

On peut confondre les poils et les fibres avec des larves. Toutefois, les premiers n'ont pas la même structure interne que les secondes.

Les cellules végétales (pollens, cellules de féculents, spores de champignons) peuvent être prises pour des kystes ou des œufs. Elles ont en général une paroi épaisse; les kystes ont une paroi mince. Les levures et les moisissures sont beaucoup plus petites que les kystes d'amibes et ne possèdent pas des noyaux comparables à ceux que l'on observe dans ces kystes.

NOTE:

Les formes végétatives et les kystes d'E. histolytica ne sont souvent pas très typiques et il faut en examiner plusieurs avant d'être certain de l'espèce à laquelle on a affaire.

82

L'IDENTIFICATION PEUT NÉCESSITER L'ÉTUDE SOIGNEUSE DE PLUSIEURS KYSTES

OU FORMES VÉGÉTATIVES. IL EST IMPÉRATIF DE LES MESURER.

Parasites sanguins Paludisme

Identification des Plasmodium dans les frottis minces Lorsque l'on examine des frottis minces à la recherche de Plasmodium, il faut rechercher les hématies infestées et les parasites (hématozoaires) qu'elles contiennent.

Hématies infestées - Observer les dimensions des hématies infestées. - Les granulations de Schüffner sont-elles présentes?

Hématies infestées

Agrandies: Granulations de Schüffner présentes1

P. vivax ou P. ovale. Observer les hématozoaires.

i_ Normales (P. falciparum): ---. P. malariae ou P. falciparum Granulations de Schüffner absentes. Cellules infestées pouvant avoir une taille inférieure à la normale dans les infestations à P. malariae

Hématozoaires Les stades annulaires des quatre espèces principales peuvent se ressembler. Si l'on observe des anneaux, rechercher les stades plus développés. Chez les malades atteints de paludisme à P. falciparum, en général on ne voit que les stades annulaires; les autres stades ne sont présents que dans les infestations graves.

NOTE:

Si l'on observe Plasmodium falciparum, il est impératif d'enregistrer la parasitémie en pourcentage (sur cent hématies observées, combien sont infestées).

Concernant les caractéristiques qu'il faut rechercher dans les frottis minces et les gouttes épaisses pour le diagnostic, voir les tableaux 6 et 7 et les figures 9, 10, 11 et 12.2

Identification des Plasmodium dans les gouttes épaisses Dans les gouttes épaisses colorées, les hématies sont lysées; le diagnostic est donc fondé sur la seule morphologie des hématozoaires. Ces derniers ont tendance à être plus compacts et plus denses dans les gouttes épaisses que dans les frottis minces.

Méthodes de numération des hématozoaires dans les gouttes épaisses

Nombre de Plasmodium par microlitre

La méthode que l'on va décrire est une méthode pratique suffisamment exacte. Elle est basée sur le nombre de parasites par ).11 de sang dans une goutte 1 Dans les lames mal colorées. les granulations de Schüffner peuvent ne pas être visibles: il est donc indispensable d'employer de bennes méthodes de coloration. et surtout un pH de 7,2·7,3. Les granulations de Schüffner absentes dans les premiers stades annulaires de P. vivax. 2 Le tableau 7 et les figures 9 à 13 ont été tirés des Planches pour le diagnostic du paludisme, W 1 à 8, Genève, Organisation mor.diale de la Santé, 1985.

83

PARASITES SANGUINS

Tableau 6. Caractéristiques morphologiques des hématozoaires dans les frottis minces

Stade

Hématie infestée

Stade annulaire (trophozoïte jeune)

Trophozoïte âgé

Schizonte à maturité

Gamétocytes

P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum

Taille augmentée, Taille augmentée; peut Taille normale ou Taille normale; les granulations de être ovale et frangée; diminuée; coloration taches de Maurer Schüffner présentes granulations de foncée peuvent être visibles ·

Schüffner présentes

Assez gros; une ou deux Petit; polyparasitisme Petit Petit et délicat; présente taches de chromatine ; il assez fréquent souvent deux taches de peut y avoir deux chromatine en haltère; anneaux par hématie polyparasitisme fréquent;

formes marginées.

Grand; amiboïde ; Petit; non amiboïde; Petit; compact; souvent Taille moyenne; en pigment sous forme de pigment grossier en bande équatoriale; général compact; bâtonnets fins pigment grossier pigment granulaire

parfois présent

Grand; mérozoïtes Plus petit que P. vivax, 6 Petit, mais avec grands Rare dans le sang grands (12 à 24); à 12 mérozoïtes; mérozones (6 à 12) ; périphérique; mérozoïtes pigment en amas; corps pigment plus foncé que aspect caractéristique en (Bà 26) petits; masse en rosace chez P. vivax "marguerite, ; pigment pigmentaire unique

grossier

Sphériques; compacts; Semblables à ceux de P. Ressemblent à ceux de En forme de croissant; noyau unique; pigment vivax mais plus petits P. vivax mais plus petits, noyau unique grossier moins nombreux et sans

granulations de Schüffner

épaisse, ces derniers étant comptés par rapport à un nombre prédéterminé de leucocytes. On prend comme référence une moyenne de 8000 leucocytes par 111. Malgré des inexactitudes dues aux variations du nombre de leucocytes d'un individu en bonne santé à l'autre, et des variations encore plus grandes en cas de maladie, cette valeur de référence permet d'effectuer des comparaisons valables. Avant de commencer la numération, on examinera l'équivalent de 0,25!11 de sang (environ 100 champs microscopiques à l'aide d'un oculaire x 7 et d'un objectif à immersion x lOO) sur la goutte épaisse, afin de déterminer l'espèce en cause et les stades présents. Une fois cette opération terminée, la méthode de comptage suivante devra être employée pour les étalements positifs:

1. Il faut deux compteurs à main, l'un pour les Plasmodium, et l'autre pour les leucocytes.

2. a) Si, après avoir compté 200 leucocytes, 10 Plasmodium au moins ont été identifiés, enregistrer les résultats sur le formulaire, en indiquant le nombre de parasites pour 200 leucocytes. b) Si, après avoir compté 200 leucocytes, on n'a compté que 9 Plasmodium au plus, continuer à compter jusqu'à avoir enregistré 500 leucocytes et noter le nombre de parasites pour 500 leucocytes.

3. Dans chaque cas, le rapport de la numération parasitaire à la numération leucocytaire peut être converti en nombre de Plasmodium par 111 de sang, au moyen de la formule mathématique simple suivante:

Nombre de Plasmodium x 8 000 N b d Pl d · 1 N b d 1

= om re e asmo zum par Il om re e eucocytes

Cela signifie que si l'on compte 200 leucocytes, le nombre de Plasmodium comptés est multiplié par 40 et que si l'on en compte 500, il est multiplié par 16.

4. D'ordinaire, on compte tous les stades présents, qu'il s'agisse de formes sexuées ou asexuées. Parfois, on fait une numération séparée pour les gamétocytes de Plasmodium falciparum, mais lorsque c'est le cas, ils sont tout de même compris dans la numération parasitaire générale. Il est rarement possible de distinguer les gamétocytes de P. vivax ou de P. malariae des formes asexuées avec suffisamment d'exactitude pour justifier un comptage séparé.

84


Le système des plus

Il existe une méthode plus simple pour estimer les parasites dans les gouttes épaisses; il s'agit du système des plus. Il donne des indications sur la numération parasitaire relative et nécessite l'emploi d'un code comprenant 1 à 4 signes plus; ainsi:

+ = 1 à 10 Plasmodium pour 100 champs de la goutte épaisse ++ = 11 à 100 Plasmodium pour 100 champs de la goutte épaisse

+++ = 1 à 10 Plasmodium par champ de la goutte épaisse

++++ =plus de 10 Plasmodium par champ de la goutte épaisse

Ce système ne doit être employé que lorsqu'il est impossible d'effectuer une numération parasitaire par ~l de sang.

Structures pouvant être confondues avec des Plasmodium

Dans les frottis sanguins, les structures qui peuvent ressembler à des Plasmodium sont les suivantes (voir également Fig. 13):

- plaquettes sur les hématies dans les frottis minces, - agrégats plaquettaires, - fragments de leucocytes dans les gouttes épaisses, - colorant précipité sur les hématies, - cellules cutanées du. malade, poussières, bactéries, levures, spores et

autres éléments ayant pu se déposer sur le frottis pendant qu'il séchait, - algues et autres micro-organismes provenant de solutions colorantes

contaminées.

Tous ces éléments peuvent ressembler aux hématozoaires dans les frottis colorés et peuvent être pris pour eux. Cependant, ils ne présentent en général pas les trois caractéristiques des Plasmodium: cytoplasme coloré en bleu, chromatine colorée en rouge ou en violet et pigment brun ou noir. Ces trois caractères doivent être visibles pour pouvoir affirmer qu'on est en présence d'un Plasmodium, sauf pour les formes annulaires (qui ne sont pas pigmentées). En cas de doute, rechercher des spécimens plus typiques. Si aucun élément ne permet d'affirmer la présence d'hématozoaires, enregistrer le frottis comme «sans Plasmodium visibles», de préférence après avoir préparé, coloré et examiné un second frottis. La figure 13 montre certaines des structures pouvant être prises pour des hématozoaires.

Il faut mettre les frottis à l'abri pendant qu'ils .sèchent pour éviter que des poussières ou des micro-organismes, tels que spores ou bactéries, ne viennent les contaminer. En outre, on s'assurera que les flacons de colorant (solutionmère et eau tamponnée) sont bien bouchés, de façon que les poussières et les micro-organismes présents dans l'air ne les contaminent pas, risquant ainsi de contaminer le frottis au moment de la coloration.

Trypanosomes

Les trypanosomes peuvent être déformés dans les gouttes épaisses. S'il est impossible de les reconnaître dans ces dernières, les rechercher dans les zones les plus épaisses du frottis mince. On les trouve entre les hématies. Observer quelle est la longueur, la forme et les dimensions du kinétoplaste des trypano-sames. (suite page 92)

85

PARASITES SANGUINS

Tableau 7 Détermination des espèces de Plasmodium dans des frottis épais colorés au Giemsa

Stades du parasite dans le sang périphérique Espèce

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Trophozo'lles

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Taille : petits à moyens ; nombre : souvent nombreux ; forme : couramment formes annulaires en virgule ; chromatine : souvent deux taches ; cytoplasme: régulier, fin à charnu ; formes matures: quelquefois présentes dans le paludisme grave, compactes, avec pigment en masse ou sous forme de quelques gros grains.

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Taille : petits à grands ; nombre: faible à moyen; forme: couramment, anneaux ouverts ou forme irrégulière ; chromatine: une tache, parfois deux ; cytoplame: irrégulier ou fragmenté; formes matures : compactes, denses ; pigment: dispersé, fin.

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_. ··· ':· --·-·.: · . ····.· :: --.· .. . . _ _._

Taille : peuvent être plus petits que ceux de P. vivax; nombre: habituellement peu nombreux; forme : forme annulaire à arrondie et compacte ; chromatine : une seule tache nettement visible ; cytoplasme: assez régulier, charnu; pigment: dispersé, en gros grains.

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Taille : petits, nombre: généralement peu nombreux; forme : annulaire à arrondie et compacte ; chromatine : une seule grosse tache ; cytoplasme : régulier, dense ; pigment: dispersé, abondant, de nuance jaunâtre chez les formes âgées.

86

Schizontes

•• -c.:"Jf:· . ::··· Habituellement associés à de nombreuses formes annulaires jeunes. Taille : petits, compacts; nombre ; peu nombreux, peu courants, en général dans le paludisme grave ; formes matures : 12-30 mérozo·~es ou plus, en amas compacts ; pigment: une seule masse sombre.

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Taille: grands; nombre : faible à moyen ; formes matures: 12-24 mérozo"~es, généralement 16, en amas irréguliers ; pigment: masse diffuse.

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..... :. ... ··

· .. ···: ... :···:

Taille : voisine de P. malariae ; nombre : peu nombreux ; formes matures : 4·12 mérozo·~es, généralement 8, en amas diffus; pigment: masse concentrée.

• .. .. • • • ...

Taille : petits, compacts; nombre: généralement peu nombreux ; formes matures : 6-12 mérozo"~es, généralement 8, en amas diffus ; certaines formes apparemment sans cytoplasme; pigment: concentré.

Gamétocytes

Formes immatures à extrémité en pointe peu courantes ; formes matures: en forme de banane ou arrondies; chromatine; une seule tache bien définie ; pigment: dispersé, en gros grains en forme de grains de riz, avec quelquefois une excroissance rose. Présence fréquente en formes usées ne contenant que la chromatine et le pigment.

..... ·:1

-::.···

... .:'<' . •

Formes immatures difficiles à distinguer des trophozo·~es matures. Formes matures : rondes, grandes; chromatine : une seule tache bien définie; pigment: dispersé, fin . Présence de formes usées avec un cytoplasme rare ou absent et ne contenant que la chromatine et le pigment.

Formes immatures difficiles à distinguer des trophozo·~es matures. Formes matures: rondes, peuvent être plus petites que celles de P. vivax; chromatine : une seule tache bien définie ; pigment: dispersé, en gros grains. Présence de formes usées ne contenant que la chromatine et le pigment.

-~ .··· ~ ...

Formes immatures et certaines formes matures difficiles à distinguer des trophozo·~es matures. Formes matures : rondes, compactes; chromatine : une seule tache bien définie; pigment: dispersé, en gros grains, peut être réparti à la périphérie. Présence de formes usées ne contenant que la chromatine et le pigment.


Fig. 9. Plasmodium falciparum

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Ç) 1 • • ... - ,., f " •

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SCHIZONTES

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GAMÉfOCYTES

Frottis mince Frottis épais

87

PARASITES SANGUINS

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Frottis mince

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Fig. 1 O. Plasmodium vivax

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TROPHOZOÏTES

SCHIZONTES

GAMÉTOCYTES

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Frottis épais

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Fig. 11. Plasmodium malariae

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TROPHOZOÏTES

SCHIZONTES

GAMÉTOCYTES

Frottis mince

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Frottis épais

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PARASITES SANGUINS

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Frottis mince

90

Fig. 12. Plasmodium ovale

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TROPHOZOÏTES

SCHIZONTES

GAMÉTOCYTES

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•

Frottis épais


Fig. 13. Aspect des éléments cellulaires dans les frottis sanguins minces et épais colorés au Giemsa : effet du pH sur la coloration des Plasmodium au Giemsa

. .

N

L

Frottis mince LEUCOCYTES Frottis épais

N = Neutrophile, E = Eosinophile, M = Monocyte, L = Lymphocyte, P = Plaquettes

' . . • MP • • •• . .

CJ

PC

Frottis mince ÉRYTHROCYTES

. . . . "• . · ~ . : " ,r;: ,

f • •• ,. . . • • • ...... NR

• ..

Frottis épais

.. * p

•

NC = Normocyte, MC = Microcyte, MP = Macrocyte polychromatophile, PC = Po'1kilocyte, GB = Granulocyte basophile, AC =Anneau de Cabot, CJ = Corps de Jolly, NR = "Nuages" réticulés et corps chromatoïdes dans l'anémie sévère.

pH 6·4

91

6·8

.. . . . .

7·2

.... "' ~ . . .

pH ET COLORATION

7·6

~· ...... -~ · . ... . . ... .. ..... ·· ~ . . . .

PARASITES SANGUINS

Grand kiMtoplaste

Noyau Membrane Flagelle ondulante

Flagelle antérieur

Membrane ondulante

Trypanosoma cruzi Trypanosoma brucei

Attention

1. En Afrique, les deux sous-espèces de Trypanosoma qui infestent l'homme sont identiques. Il est impossible de les différencier dans les frottis colorés.

2. En Amérique centrale et du Sud, T. cruzi et T. rangeli doivent être distingués l'un de l'autre.

3. T. rangeli est plus long que T. cruzi. 4. T. cruzi possède un kinétoplaste très grand, bien visible et a souvent une

forme de C, de U ou de S dans les frottis colorés.

Micro filaires

Pour identifier les microfilaires on utilise les caractéristiques suivantes (voir Fig. 14):

- présence ou absence de gaine, - présence ou absence de noyaux terminaux,

corps interne - visible ou non, - dimensions de la microfilaire.

On est parfois obligé d'utiliser d'autres caractéristiques pour identifier les espèces. Malheureusement, elles ne sont pas toutes visibles dans les préparations colorées au Giemsa et il faut quelquefois procéder à des colorations spéciales, comme la coloration à l'hématoxyline de Delafield, pour les mettre en évidence, en particulier pour la gainè.

Attention

1. Localiser les microfilaires avec l'objectif x lü. 2. Balayer le frottis de façon systématique. 3. Identifier les espèces de microfilaires à fort grossissement (x 40), ou à l'aide

d'un objectif à immersion.

A. Wuchereria bancrofti (Asie, Afrique, Amérique centrale et du Sud, Antilles).

La gaine est colorée ou non au Giemsa; se colore à l'hématoxyline. Noyaux distincts. Espace libre entre les noyaux et la cuticule. Absence de noyaux à l'extrémité caudale. Corps interne souvent visible au Giemsa. Ne se colore pas à l'hématoxyline. L'espace céphalique est aussi long que large. L'extrémité caudale peut être recourbée en arrière sous le corps. Visible dans le sang.

92

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Fig. 14. Microfilaires retrouvées chez l'homme

Cellule A,

Gainées Non gainées

~ Anneau nerveux Pore excréteur Cellule excrétrice

a_ .-----· ---

Dans le sang

1 r -- ---- - - ' Dans r peau

Avec gaine Sans gaine Sans gaine

1 1

1 li 1 1 r -·----.

Noyaux allant jusqu'à Noyaux n'allant pas jusqu'à Noyaux allant l'extrémité caudale l'extrémité caudale jusqu'à l'extrémité

1 Espace céphalique aussi long caudale 1 1 que large Queue arrondie

Queue renflée possédant Queue de largeur uniforme deux noyaux distincts Espace céphalique aussi

Espace céphalique deux long qua large fois plus long que large

(( Brugia mafayi

! -Loal~a J Mansonefla perstans

Noyaux n'allant pas jusqu'à l'extrémité

caudale Filaire pet~e et fine

Manso nef/a ozzardi

Noyaux allant jusqu'à l'extrémité caudale Filaire petite et fine

Queue en "crosse d'évêque"

Noyaux n'allant pas jusqu'à l'extrémité caudale

Grosse filaire Espace céphalique plus long que large

Mansoneffa streptocerca

WHOIIOIU

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PARASITES SANGUINS

B. Brugia malayi (Asie du Sud-Est, Inde)

Microfilaire tortillée, Gaine se colorant en rose foncé au Giemsa. Noyaux nombreux, serrés, remplissant l'ensemble du corps. Espace vide entre les noyaux et la paroi du corps. Espace céphalique deux fois plus long que large. Corps interne se colorant souvent; lorsqu'il se colore, il est proéminent. Visible dans le sang.

C. Laa laa (uniquement en Afrique)

Microfilaire à gaine. La gaine ne se colore pas au Giemsa; se colore à l'hématoxyline. Noyaux nombreux et serrés allant jusqu'à l'extrémité caudale; extrémité caudale effilée. Espace céphalique aussi long que large. Corps interne difficile à voir. Visible dans le sang.

D. Mansonella perstans (Afrique et Amérique du Sud)

Microfilaire petite et fine. Ne possède pas de gaine. Noyaux allant jusqu'à l'extrémité caudale, le dernier étant plus gros; extrémité caudale arrondie. Noyaux se colorant fortement et chevauchants. Visible dans le sang.

E. Mansonella ozzardi (Amérique centrale et du Sud)

Microfilaire petite et fine. Ne possède pas de gaine. Les noyaux ne vont pas jusqu'à l'extrémité caudale; extrémité caudale effilée. Se colore très légèrement; extrémité caudale difficile à voir. Visible dans le sang et la peau.

F. Mansonella streptocerca (Afrique centrale et de l'Ouest)

Microfilaire petite et fine. Ne possède pas de gaine. Noyaux allant jusqu'à l'extrémité caudale. Queue en «crosse d'évêque»; extrémité caudale arrondie ou bifide; visible uniquement dans la peau.

G. Onchocerca volvulus

Grosse microfilaire non gainée. Tête souvent spatulée. Espace céphalique long, de 1,5 à 2 fois la largeur du corps Noyaux n'allant pas jusqu'à l'extrémité caudale pointue. Visible uniquement dans la peau.

94

Bibliographie

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10. Manuel pour l'étude au laboratoire des infections intestinales aiguës. Genève, Organisation mondiale de la Santé, 1987 (document non publié WHO/ CDD/83.3 Rev.1)2.

11. Manuel des techniques de base pour le laboratoire médical. Genève, Organisation mondiale de la Santé, 1982.

12. MELVIN, D. M. & BROOKE, M. M., ed. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites. Atlanta, US Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication No (CDC) 82-8282).

13. SuzuKI, N. Hu man helminth eggs: col or atlas. 3e éd. Tokyo, Japanese Association of Parasite Con trot and Japanese Organization of International Cooperation in Family Planning, 1981,95 pp.

14. THIENPONT, D., ET AL., Diagnosing helminthiasis by coprological examina tian, 2e éd. Beerse, Belgique, Janssen Research Foundation, 1986.

15. Manuel pour la lutte contre la trypanosomiase (édition expérimentale). Genève, Organisation mondiale de la Santé, 1983.

16. OMS, Série de Rapports techniques, No 793, 1990. (Lutte contre les leishmanioses: rapport d'un comité OMS d'experts).

17. OMS, Série de Rapports techniques, No 739, 1986. (La trypanosomiase africaine: épidémiologie et lutte: rapport d'un comité d'experts de l'OMS).

18. OMS, Série de Rapports techniques No 752, 1987 (Comité OMS d'experts de l'Onchocercose: troisième rapport).

1 Disponible sur demande auprès de la Division de la Lutte contre les Maladies tropicales, Organisation mondiale de la Santé, 1211 Genève 27, Suisse. 2 Disponible sur demande auprès du Service de la Lutte contre les Maladies diarrhéiques, Organisation mondiale de la Santé. 1211 Genève 27. Suisse.

95

ANNEXE 1

Matériel de parasitologie diagnostique nécessaire dans les centres de santé et les laboratoires des hôpitaux de district

Instruments

Microscopes munis d'un éclairage suffisant, de préférence avec source lumineuse incorporée.

On aura besoin de microscopes munis de miroirs ajustables si la source lumineuse est séparée, par exemple s'il s'agit de la lumière du soleil ou d'une lampe. Les microscopes devront être munis d'un diaphragme ajustable et d'un condenseur, d'oculaires x 10, et d'objectifs x 10, x 40, et à immersion.

Centrifugeuse - de table ou sur pied - avec couronne et adaptateurs pour tubes à centrifuger de 15 ml. On choisira de préférence des gaines à couvercle.

Centrifugeuse pour microhématocrite.

Réfrigérateur, 4-5°C.

Petit matériel

Abaisse-langue (ou cuillères en plastique) Agitateur en verre Aiguilles, 25 G, 0,5 x 16 mm, pour injection sous-cutanée Aiguilles à biopsie (rate) Aiguilles pour ponction veineuse Bandes de cellophane mouillables de 25 x 30-35 mm et de 40 à 50 11m d'épaisseur Bâtonnets applicateurs en bois Boîtes à coloration Bouchons en caoutchouc pour tubes à centrifuger de 15 ml (en général, de taille 0 ou 1) Cellophane adhésive transparente, de 2 cm de large, pour écouvillonage anal Chiffon de coton non pelucheux Compresses de gaze stérile pour nettoyage des doigts Crayons et feutres pour l'étiquetage Ecouvillons de coton Entonnoir Eprouvettes graduées, 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml et 1000 ml Etiquettes · Filtre à membrane, 12 !lill ou 15 11m et support pour filtre Filtre, laiton, de 7,5 cm de diamètre, maille 40 (425 !lm) Fioles, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml et 5000 ml Flacons, 1000 ml Flacons à vis, 20 ml, avec capsule ajustée très serrée Flacons compte-gouttes ou pissettes en polyéthylène, 100 ml, 250 ml et 500 ml Flacons compte-gouttes pour soluté physiologique, iode, bleu de méthylène tamponné et méthanol (coloration du sang) Flacons en verre, avec bouchons de verre, 250 ml et 1000 ml

96

MATÉRIEL

Flacons, petits, 25 ml, 30 ml, 50 ml et 100 ml, avec bouchons de caoutchouc ou bouchons compte-gouttes avec capsule vissée Hémostyles jetables sous emballage individuel Huile à immersion, viscosité faible Lamelles couvre-objets, 20 à 22 mm de côté Lames porte-objets - 25 mx 75 mm, 50 x 75 mm (facultatif) Micropipettes capillaires, d'environ 14 cm de long avec poires en caoutchouc (pour la méthode de concentration et l'usage général) Minuterie Papier absorbant ou éponges Papier hygiénique, serviettes à démaquiller ou papier optique Pinces Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc Pipettes Sahli Pipettes sérologiques, 1 ml, 5 ml, 10 ml avec poires en caoutchouc Plaque chauffante (plaque métallique avec lampe à alcool) Plaque perforée en acier inoxydable, plastique ou carton, de 20 à 50 mm Râ te lier à lames en bois Registre ou formulaires d'enregistrement Scalpel ou lames de rasoir Seringue 5 ou 10 ml Support en bois pour sécher les frottis Support pour agitateurs en verre ou petits flacons Support pour tubes à centrifuger Tamis en acier inoxydable, nylon, ou plastique, avec ouverture de maille de 60 à 105 Tubes à centrifuger, coniques, gradués, 15 ml Tubes à essais, grands, 150 x 13 mm, pour ébullition. Tubes à essais, petits, 100 x 13 mm, avec bouchons de coton ou bouchons vissés Tubes capillaires Tubes pour réactifs Vaseline Verres à pied coniques pour urines

Produits chimiques et solutions nécessaires pour la préparation des réactifs (préparation décrite dans l'annexe 2).

Acide acétique glacial Acide chlorhydrique concentré (HCl) Alcool polyvinylique (APV) Chlorure de sodium (NaCl) Chlorure mercurique cristallisé (HgCh) Colorants:

- Bleu de méthylène tamponné - Colorant de Field A - Colorant de Field B - Giemsa, solution-mère - Glycérol-vert malachite. - Hématoxyline de Delafield, solution-mère. - Solution de safranine. - Trichrome, solution-mère.

Colorants (en poudre) : - Bleu Azur I - pour le colorant de Field A - Chromotrope 2R - pour le trichrome - Eosine - pour le colorant de Field B

97

ANNEXE1

- Vert lumière SF - pour le trichrome - Vert solide FCF - pour le trichrome - Vert malachite - Bleu de méthylène

Cristaux d'acide phosphotungstique (fu[P04(W12Ü36)]. 5Hz0) Cristaux d'iodure de potassium (KI) Cristaux de citrate de sodium (C6Hs07NA3.2Hz0) Cristaux de phénol (acide phénique) Dihydrogénophosphate de potassium (KHzP04) (pour l'eau tamponnée) Eau distillée Ethanol (alcool éthylique) à 70 %, 95 %, 100% (absolu) Ether, anesthésique ou technique, ou acétate d'éthyle Formol (formaldéhyde) Glycérol Hydrogénophosphate de disodium (Naz HP04) (pour eau tamponnée) Iode en paillettes (lz) Isopropanol (alcool isopropylique) Méthanol (alcool méthylique) Poudre d'acétate de sodium (CH3COONa) ou cristaux d'acétate de sodium (CH3COONa.3Hz0) Xylène

Si l'hématoxyline de Delafield est préparée au laboratoire, les produits suivants seront nécessaires :

- sulfate d'aluminium-ammonium pour préparer une solution saturée. - poudre ou cristaux d'hématoxyline.

98

ANNEXE 2

Préparation des réactifs et solutions

Alcool acide acétique, solution décolorante {N° 1}

Ethanol à 95% ............................................................................................. 600 ml Acide acétique glacial (CH3COOH) ............................................................ 4 ml Eau distillée ................................................................................................. 350 ml

Verser l'éthanol à 95% dans une éprouvette graduée de 1000 ml. Compléter à 950 ml avec de l'eau distillée. Verser dans un flacon de 1000 ml. Ajouter l'acide acétique glacial et mélanger.

Etiqueter le flacon : DÉCOLORANT ALCOOL ACIDE et inscrire la date. Conserver sur une étagère ou dans une armoire. Cette solution se conservera au moins un an.

ATTENTION :L'acide acétique glacial est extrêmement corrosif. L'éthanol est inflammable.

Bleu de méthylène tamponné (No 2)

Solution A (solution d'acide acétique)

Acide acétique glacial (CH3COOH) ......................................................... 1,2 ml Eau distillée ................................................................................................ 98,8 ml

Verser 98,8 ml d'eau distillée dans une fiole ou un flacon propre, ajouter 1,2 ml d'acide acétique glacial et mélanger soigneusement. Conserver dans un flacon propre.

ATTENTION: L'acide acétique glacial est extrêmement corrosif.

Solution B (solution d'acétate de sodium) Acétate de sodium (CH3COONa) ............................................................... .1,6 g (acétate de sodium cristallisé (CThCOONa 3H20)) ................................. 2,6 g Eau distillée ................................................................................................. .1 00 ml

Verser les 100 ml d'eau distillée dans une petite fiole. Peser 1,6 g d'acétate de sodium (ou 2,6 g de la forme cristallisée) et dissoudre dans l'eau ; mélanger soigneusement. Conserver dans un flacon propre.

Solution de travail (pour la coloration) Solution A (solution d'acide acétique) ................................................. .46,3 ml Solution B (solution d'acétate de sodium) .............................................. 3,7 ml Bleu de méthylène ......................................................................................... 0,5 g Eau distillée ................................................................................................... 50 ml

Verser les 50 ml d'eau distillée dans une fiole ou un bêcher de 150 ou 200 ml. Ajouter les solutions A et B et mélanger soigneusement. Ajouter ensuite envi-

99

ANNEXE2

ron 0,5 g de bleu de méthylène et remuer jusqu'à ce que le colorant se soit dissous. S'il n'est pas entièrement dissous au bout de 15 minutes, filtrer la solution. Verser ou filtrer dans un flacon propre muni d'un bouchon et inscrire sur l'étiquette : SOLUTION DE BLEU DE MÉTHYLÈNE TAMPONNÉ. Inscrire la date. Cette solution se gardera indéfiniment. Si des particules de colorant se déposent au fond du flacon, on filtrera la solution. En verser une petite quantité (20 mD dans un flacon compte-gouttes pour l'utilisation immédiate. Le flacon compte-gouttes doit être muni d'une pipette avec poire en caoutchouc.

NOTE: Les tampons d'acétate ayant un pH de 3,6 donnent les meilleurs résultats pour ce type de coloration.

Tampons pour la coloration des Plasmodium {N° 3)

Un tampon phosphate, ajusté à pH 7,2 est indispensable pour le Giemsa (coloration des Plasmodium).

Préparation d'une solution de travail 1. Dissoudre 1 g d'hydrogénophosphate de disodium anhydre (Na2HP04)

et 0,7 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH2P04) dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée. On peut utiliser de l'eau de pluie filtrée, ou même de l'eau du robinet, si l'on ne dispose de rien d'autre.

2. Vérifiet le pH à l'aide d'un pH-mètre ou d'un indicateur coloré, tel que le comparateur Lovibond.

3. Si le pH est inférieur à 7,2, ajouter un peu de solution de Na2HP04 à 2%; s'il estsupérieur à 7,2 ajouter un peu de solution de KH2P04 à 2%.

4. Lorsque le pH est ajusté à 7,2, conserver dans un flacon hermétiquement bouché, de préférence en verre brun, dans un endroit frais à l'abri du rayonnement solaire direct.

Cette solution se conservera quelques semaines, mais doit être régulièrement vérifiée pour s'assurer qu'aucune prolifération microbienne ni moisissure ne s'est installée. Pour cela, on agitera la solution; si elle est trouble, la jeter.

Préparation d'une solution-mère concentrée (utile pour les voyages sur le terrain ou pour l'envoi à des laboratoires éloignés) 1. Dissoudre 30 g de Na2HP04 anhydre et 2,1 g de KH2P04 dans 25 ml d'eau

distillée ou déminéralisée. 2. Ajuster le pH à 7,2 de la façon décrite au point 3 ci-dessus. 3. Conserver dans un flacon en verre brun à l'abri de la lumière du soleil ; la

solution se conservera plusieurs semaines. 4. Pour obtenir une solution de travail, diluer 1 ml du concentré dans 20 ml

d'eau distillée ou déminéralisée.

Préparation de produits prépesés

Les deux phosphates peuvent être pesés à l'avance et déposés ensemble dans un tube, un flacon ou un sac de plastique hermétiquement fermé et clairement étiqueté, lui-même conservé dans un bocal muni d'un bouchon vissé.

Pour obtenir la solution, verser le contenu de ce conditionnement dans 1 litre d'eau et ajuster le pH à 7,2.

100

RÉACTIFS ET SOLUTIONS

Fuchsine phéniquée, solution de (No 4)

Fuchsine basique ............................................................................................. 10 g Ethanol absolu, produit technique .......................................................... 100 ml Phénol .............................................................................................................. 50 g Eau distillée ......................................................................................................... 1 1

Préparation 1. Peser la poudre de fuchsine basique et la verser dans un flacon de 1,5litre. 2. Ajouter 100 ml d'éthanol absolu et dissoudre complètement le colorant. 3. Peser le phénol dans un bécher et le dissoudre dans un peu d'eau distillée. 4. Ajouter la solution aqueuse de phénol à la solution de colorant et mélan

ger soigneusement. 5. Ajouter le reste de l'eau, mélanger soigneusement et étiqueter le flacon. La

solution de colorant restera stable indéfiniment. NOTE: L'éthanol est inflammable. Le phénol est toxique et corrosif.

Xylène phéniqué, solution de (No 5)

NOTE : Cette solution doit être préparée dans des laboratoires de niveau intermédiaire en raison du danger présenté par les réactifs auxquels elle fait appel. Ouvrir le bouchon d'un flacon de cristaux de phénoP (acide phénique) et mettre le flacon au bain-marie. Chauffer l'eau afin de liquéfier les cristaux. NE PAS CHAUFFER LES CRISTAUX DE PHÉNOL DIRECTEMENT SUR UNE FLAMME. TOUJOURS METTRE LE FLACON AU BAIN-MARlE.

Phénol liquide ............................................................................................. 200 ml Xylène ........................................................................................................... 600 ml

Verser le phénol liquide dans un flacon de 1000 ml bouché à l'émeri. Ajouter le xylène. Dans la mesure du possible, prendre un flacon de xylène non entamé. Mélanger en agitant le flacon.

Etiqueter le flacon : XYLÈNE PHÉNIQUÉ et inscrire la date. Conserver dans une armoire ou sur une étagère, à l'abri de la lumière. La solution se conserve au moins un an, mais le flacon doit être hermétiquement fermé. On peut entourer le bouchon de ruban adhésif afin d'éviter toute humidité. Si de l'humidité pénètre dans la solution, celle-ci devient inutilisable.

ATIENTION: Le phénol est extrêmement toxique et corrosif.

Hématoxyline de Delafield (No 6)

Cristaux d'hématoxyline ................................................................................. .1 g Ethanol absolu .............................................................................................. .10 ml Solution saturée de sulfate d'aluminium- ammonium (NH4Al(S04h) dans l'eau distillée ............................................................ lOO ml Glycérol (C3Hs(OH3) ..................................................................................... 25 ml Méthanol absolu ............................................................................................ 25 ml

Dissoudre les cristaux d'hématoxyline dans l'éthanol absolu. Ajouter goutte à goutte la solution obtenue à la solution saturée de sulfate d'aluminium -

1 Ne pas utiliser le phénol liquide que l'on trouve dans le commerce. Il contient de l'eau, ce qui le rend impropre à la coloration.

101

ANNEXE2

ammonium. Laisser le flacon contenant cette solution ouvert, à la lumière directe du soleil, ou dans une étuve à 37° C pendant 3 à 4 mois pour que l'hématoxyline s'oxyde et donne de l'hématéine.I

Boucher, puis étiqueter le flacon : HÉMA TOXYLINE DE DELAFIELD et inscrire la date. Au moment de sa réouverture filtrer la solution, y ajouter le glycérol et l'alcool méthylique ; le colorant est alors prêt à l'emploi. Reboucher le flacon pour éviter toute évaporation. Ce colorant se conservera au moins 18 mois.

Ethanol à 70% (N° 7)

Ethanol à 95% ............................................................................................. 726 ml Eau distillée ................................................................................................. 274 ml

Verser l'éthanol dans une éprouvette graduée de 1000 ml. Compléter à 1000 ml avec de l'eau distillée. Verser dans un flacon de 1000 ml bouché à l'émeri

Etiqueter le flacon : ÉTHANOL à 70% et inscrire la date. Cette solution se conservera indéfiniment à condition que le flacon soit hermétiquement fermé. Entreposer sur une étagère ou dans une armoire.

ATTENTION :L'éthanol est inflammable.

Ether-alcool, fixateur (No 8)

Ether ............................................................................................................... 20 ml Ethanol à 95% ............................................................................................... 20 ml

Ajouter l'éther à l'alcool dans une éprouvette graduée et mélanger. Verser dans un bocal à bouchon vissé ou à bouchon de verre rodé.

ATTENTION :L'éther est très inflammable et potentiellement explosif.

Field, colorant de (N° 9)

Colorant de Field A

Préparation à partir de poudre toute prête :

Poudre de colorant de Field A .................................................................... 5,9 g Eau distillée chaude ................................................................................... 600 ml

Mélanger jusqu'à dissolution. Laisser refroidir et filtrer.

Préparation à partir de colorants et produits chimiques :

Bleu de méthylène (médicinal) ................................................................... .1,6 g Bleu Azur 1 ...................................................................................................... 1,0 g Hydrogénophosphate de disodium (Na2HP04), Anhydre .................. 10,0 g Dihydrogénophosphate de potassium (KH2P04) ................................... 12,5 g Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

1 Ne pas confondre hématéine et hématine.

102


Dissoudre les deux phosphates dans l'eau. Verser environ la moitié de la solution de phosphate dans un flacon d'un litre contenant quelques billes de verre. Ajouter les poudres de colorants et mélanger soigneusement. Ajouter le reste de la solution de phosphate. Mélanger soigneusement et filtrer.

Colorant de Field B

Préparation à partir de poudre toute prête :

Poudre de colorant de Field B ..................................................................... A,8 g Eau distillée chaude ................................................................................... 600 ml

Mélanger jusqu'à dissolution. Laisser refroidir, puis filtrer.

Préparation à partir de colorant et produits chimiques :

Eosine (jaune, soluble dans l'eau) .............................................................. 2,0 g Hydrogénophosphate de disodium (Na2HP04), anhydre .................... 10,0 g Dihydrogénophosphate de potassium (Kl-hP04) ................................... 12,5 g Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

Dissoudre les deux phosphates dans l'eau. Verser dans un flacon d'un litre. Ajouter l'éosine. Mélanger jusqu'à dissolution. Filtrer.

Formol, solutions de (No 10)

Solution de formol à 1 0°/o pour la conservation des selles

Formol du commerce (formaldéhyde neutre, à au moins 37%) ........ .100 ml Eau distillée ................................................................................................. 900 ml

Mesurer la solution aqueuse de formol dans une éprouvette graduée et la verser dans un flacon de 1000 ml, bouché à l'émeri ou muni d'un bouchon vissé. Ajouter l'eau distillée et mélanger.

Etiqueter le flacon :FORMOL à 10% et inscrire la date. Entreposer sur une étagère ou dans une armoire. La solution se conservera pendant au moins deux ans.

Formol à 2°/o (méthode de concentration pour les microfilaires)

Formol (formaldéhyde neutre, à au moins 37%) .................................... 20 ml Eau distillée ................................................................................................. 980 ml

Mesurer la solution aqueuse de formol dans une éprouvette graduée et la verser dans un flacon de 1000 ml, bouché à l'émeri ou muni d'un bouchon vissé. Ajouter l'eau distillée et mélanger.

Etiqueter le flacon :FORMOL à 2% et inscrire la date. Entreposer sur une étagère ou dans une armoire. La solution se conservera pendant au moins deux ans.

ATIENTION :Le formol est corrosif et toxique.

103

ANNEXE2

Giemsa (solution-mère) (No 11)

Le Giemsa est le colorant classique le plus sûr pour la coloration de routine des frottis sanguins (diagnostic du paludisme). Toutefois, la qualité de ce colorant, dans les solutions prêtes à l'emploi ou sous forme de poudre, varie selon les sources d'approvisionnement et il est conseillé de se le procurer auprès d'un fabricant de bonne réputation. Même dans ce cas, il faut s'assurer de la qualité du colorant en testant chaque lot dès qu'il a été reconstitué et avant de colorer un grand nombre de frottis.

Poudre de Giemsa ......................................................................................... 3,8 g Méthanol ...................................................................................................... 250 ml Glycérol ........................................................................................................ 250 ml

On utilisera de préférence un flacon en verre brun mais, si on n'en a pas, on prendra un flacon en verre blanc épais ou en polyéthylène, chimiquement propre et sec, de la taille convenable. Il faut également environ 50 billes de verre de 5 mm de diamètre.

1. Introduire les billes de verre dans le flacon ; verser la quantité de méthanol nécessaire et ajouter le colorant en poudre.

2. Fermer hermétiquement le flacon. Laisser la poudre s'enfoncer lentement à travers le méthanol et se déposer au fond du flacon. Agiter le flacon d'un mouvement circulaire pendant 2 à 3 minutes.

3. Ajouter le glycérol et agiter de nouveau. Continuer à agiter 2 à 3 minutes toutes les demi-heures, au moins à 6 reprises.

4. Pendant 2 à 3 jours, agiter le flacon 3 à 4 fois par jour jusqu'à ce que le colorant soit entièrement mélangé. Conserver une partie de cette solutionmère dans un petit flacon pour l'usage courant, afin d'éviter toute contamination de la solution-mère.

Chaque nouveau lot de colorant préparé doit être correctement étiqueté, sa date de préparation figurant sur l'étiquette, et doit être testé afin de déterminer la dilution la meilleure et le temps de coloration optimal. Toujours conserver le flacon hermétiquement fermé, dans un endroit frais, à l'abri de la lumière solaire directe. On peut recouvrir les flacons en verre blanc d'une épaisse couche de papier foncé pour éviter qu'ils ne soient exposés à la lumière.

Glycérol-vert malachite ou glycérol-bleu de méthylène, solution de (N° 12)

Glycérol ........................................................................................................ 100 ml Vert malachite en solution aqueuse à 3%, ou bleu de méthylène en solution aqueuse à 3% .................................... .1 ml Eau distillée ................................................................................................. .100 ml

Piler de la poudre de vert malachite ou de bleu de méthylène dans un mortier propre et sec. Peser 3 g de poudre, les verser dans un flacon et compléter à 100 ml avec de l'eau distillée. Boucher le flacon et l'étiqueter : VERT MALACHITE à 3% ou BLEU DE MÉTHYLÈNE à 3%. Entreposer dans une armoire à l'abri de la lumière.

Pour préparer la solution : verser 1 ml de solution à 3% dans un flacon de 250 ml. Ajouter 100 ml de glycérol et 100 ml d'eau distillée et boucher le flacon; mélanger soigneusement avant usage.

104


Acide chlorhydrique-éthanol, solution d' (No 13)

Acide chlorhydrique (concentré) ................................................................. 1 ml Ethanol à 95% ............................................................................................. .100 ml

Verser 100 ml d'éthanol à 95% dans un flacon propre de 250 ml bouché à l'émeri. Ajouter 1 ml d'acide chlorhydrique concentré et mélanger.

AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrêmement corrosif. L'éthanol est inflammable.

Acide chlorhydrique-méthanol, solution (No 14)

Acide chlorhydrique (concentré) ................................................................. 3 ml Méthanol absolu ......................................................................................... .100 ml

Verser 100 ml de méthanol absolu dans un flacon propre de 250 ml bouché à l'émeri. Ajouter 3 ml d'acide chlorhydrique concentré et mélanger.

AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrêmement corrosif. Le méthanol est inflammable.

Acide chlorhydrique-eau, solution décolorante {N° 15}

Acide chlorhydrique (HCl), concentré .................................................... 0,5 ml Eau distillée ................................................................................................. .100 ml

Verser l'eau distillée dans un flacon de 1000 ml bouché à l'émeri. Ajouter l'acide chlorhydrique : mélanger soigneusement.

Etiqueter le flacon : HCl à 0,5% et inscrire la date.

AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrêmement corrosif.

Iode dans l'alcool, solution d' (No 16)

Ethanol à 70%, ................................................................................................ 40 ml Cristaux d'iode ............................................................................... .quelques-uns

Verser l'alcool à 70% dans une petite fiole. Au moyen de deux bâtonnets applicateurs prendre quelques cristaux d'iode et les plonger dans l'alcool. Agiter ou remuer le mélange et rajouter de l'iode le cas échéant, jusqu'à ce que la solution prenne la couleur d'un thé fort. Cette couleur est importante.

Cette solution d'iode dans l'alcool a pour but d'éliminer les restes de chlorure mercurique laissés par le fixateur et elle doit donc être suffisamment forte pour pouvoir le faire. Si la solution n'est pas assez forte, elle n'éliminera pas ces résidus qui vont gêner l'examen de la préparation. Si elle est trop forte, l'iode va pénétrer dans les protozoaires et empêchera la coloration par le trichrome.

Etiqueter le flacon : IODE dans l'ALCOOL et inscrire la date. Cette solution doit être renouvelée toutes les trois semaines.

105

ANNEXE2

Lugo/ (solution-mère à 5%) (N° 17)

Iode ..................................................................................................................... .5 g Iodure de potassium (KI) .............................................................................. 10 g Eau distillée ....................................................................................... q.s.p. 100 ml

Peser l'iode dans un creuset en porcelaine ou un verre de montre. Piler l'iode et l'iodure de potassium secs dans un mortier. Ajouter de l'eau, à raison de quelques millilitres à la fois, et piler soigneusement après chaque addition jusqu'à ce que l'iode et l'iodure se dissolvent. Verser la solution obtenue dans une bouteille de verre graduée et compléter à 100 ml avec de l'eau.

Ou bien: Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dans environ 30 ml d'eau. Ajouter l'iode et mélanger jusqu'à dissolution. Compléter à 100 ml avec de l'eau et mélanger soigneusement. Conserver dans un flacon en verre brun.

Lugo/ (solution à 1% pour préparations à l'état frais) (N° 18)

La solution-mère de Lugol est trop forte pour le montage des selles fraîches. Elle provoque l'agrégation des matières fécales, piégeant ainsi les parasites qui deviennent alors invisibles. Par conséquent, il faut la diluer.

Lugol (solution-mère à 5%) (N° 17) ............................................................ 5 ml Soluté physiologique (N° 24) ...................................................................... 20 ml

Verser le soluté physiologique dans un flacon compte-gouttes. Ajouter la solution-mère de Lugol à 5%. Mélanger soigneusement. On obtient ainsi une solution d'iode à 1% qui permettra de colorer les kystes de façon satisfaisante.

Etiqueter le flacon : LUGOL à 1% et inscrire la date. La solution à 1% doit être renouvelée tous les 15 jours.

Bleu de méthylène-phosphate, solution de {N° 19}

Poudre de bleu de méthylène1 ....................................................................... .1 g Hydrogénophosphate de disodium (Naz HP04) ......................................... 3 g Dihydrogénophosphate de potassium (KHz P04) ...................................... 1 g Eau distillée ................................................................................................. 300 ml

Verser la poudre de bleu de méthylène dans un mortier propre et sec. Ajouter l'hydrogénophosphate de disodium et le dihydrogénophosphate de potassium. Avec un pilon, piler les poudres de colorant et de phosphate ensemble et les mélanger soigneusement. Répartir le mélange en fractions d'1 g que l'on déposera dans des petits flacons bien bouchés.

Etiqueter les flacons : BLEU DE MÉTHYLÈNE-PHOSPHATE et inscrire la date. Le mélange sec se gardera longtemps si les flacons sont hermétiquement fermés. Entourer le bouchon de ruban adhésif afin d'éviter toute humidification.

1 On prendra de préférence de la poudre de bleu de méthylène médicinal, mais tout bleu de méthylène de bonne qualité peut convenir.

106


Pour préparer la solution

Verser 1 g du mélange dans une fiole de 500 ml. Ajouter l'eau distillée et agiter la fiole ou remuer avec une baguette de verre pour dissoudre le mélange colorant. Filtrer à travers un papier-filtre dans un flacon de 500 ml propre, sec et bouché à l'émeri.

Etiqueter le flacon : SOLUTION DE BLEU DE MÉTHYLÈNE-PHOSPHATE et inscrire la date. Entreposer dans une armoire, à l'abri de la lumière. Cette solution se conservera au moins deux ans.

Bleu de méthylène-soluté physiologique {N° 20)

Bleu de méthylène ......................................................................................... 0,1 g Soluté physiologique ................................................................................. .100 ml

Verser le bleu de méthylène dans un flacon propre. Ajouter le soluté physiologique et mélanger jusqu'à ce que les cristaux de colorant soient complètement dissous.

Pour l'utiliser :Filtrer une petite quantité de solution colorante dans un flacon compte-gouttes.

Iodure de potassium à 10%, solution d' (~ 21)

Iodure de potassium (KI) ........................................................................ .100 mg Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

Peser l'iodure de potassium. Verser l'eau distillée dans un flacon propre bouché à l'émeri. Dissoudre l'iodure de potassium dans l'eau.

Étiqueter le flacon : IODURE DE POTASSIUM à 10% et inscrire la date. (Entourer le bouchon d'un morceau de papier ou d'une ficelle pour éviter qu'il ne colle.) Conserver dans une armoire ou sur une étagère, à l'abri de la lumière. Après avoir reposé, la solution peut légèrement jaunir, ce qui n'a aucune incidence sur la qualité.

APV, mélange fixateur à l' (No 22)

NOTE : Cette préparation doit être effectuée dans un laboratoire de niveau intermédiaire en raison du danger que présentent les réactifs.

Fixateur de Schaudinn modifié

Cristaux de chlorure mercurique (HgCh) .................................................. 1,5 g Ethanol à 95% ............................................................................................ 31,0 ml Acide acétique glacial ................................................................................ .5,0 ml

Dissoudre le chlorure mercurique dans l'éthanol dans une fiole bouchée (50 ou 125 ml) en remuant de temps en temps d'un mouvement circulaire. Ajouter l'acide acétique, reboucher et mélanger d'un mouvement circulaire.

ATTENTION: Le chlorure mercurique est extrêmement toxique. L'acide acétique glacial est extrêmement corrosif.

107

ANNEXE2

Mélange à l' APV Glycérol ......................................................................................................... .1,5 ml Poudre d'alcool polyvinylique (APV) (de faible viscosité) .................... 5,0 g Eau distillée ................................................................................................ .62,5 ml

Dans un petit bécher, verser le glycérol sur la poudre d' APV et mélanger soigneusement à l'aide d'une baguette de verre, jusqu'à ce que toutes les particules paraissent recouvertes de glycérol. Transvaser le mélange dans une fiole de 125 ml. Ajouter l'eau distillée, boucher et laisser à température ambiante pendant 3 heures ou toute la nuit. Agiter de temps en temps pour mélanger.

La poudre d' APV et les solutions fixatrices à l' APV existent dans le commerce. On trouve sur le marché des poudres d' APV de qualités diverses, mais les plus satisfaisantes pour préparer le mélange fixateur pour les protozoaires sont celles qui sont fortement hydrolysées et qui ont une viscosité faible ou moyenne.

Solution de travail de mélange fixateur à I'APV

1. Chauffer un bain-marie (ou un grand bécher rempli d'eau) jusqu'à 70-75° C. Ajuster la chaleur de manière à maintenir cette température.

2. Couvrir (sans la boucher complètement) la fiole contenant le mélange à l' APV et la mettre au bain-marie pendant environ 10 minutes en la remuant fréquemment d'un mouvement circulaire.

3. Lorsque la poudre d' APV semble presqu~ entièrement dissoute, verser dessus la solution de Schaudinn modifiée, reboucher et remuer pour mélanger.

4. Continuer à remuer le mélange au bain-marie pendant 2 à 3 minutes afin de dissoudre le reste d' APV, de permettre aux bulles de s'échapper et à la solution de devenir limpide.

5. Enlever la fiole du bain-marie et la laisser refroidir. Conserver le mélange fixateur à l' APV dans un flacon à bouchon vissé ou bouché à l'émeri. Inscrire sur l'étiquette: FIXATEUR à l'APV et la date. Le fixateur se conservera 6 à 12 mois.

Pour le mélange, il est souhaitable de disposer d'un agitateur à haute vitesse qui provoquera un tourbillon dans la solution.

Safranine, solution de (N° 23)

Solution-mère

Safrartine 0 ...................................................................................................... .2,5 g Ethanol à 95% ............................................................................................. .100 ml

Peser la poudre de safranine et la dissoudre dans les 100 ml d'éthanol. Conserver dans un flacon étiqueté.

Solution de travail Solution-mère ............................................................................................... .10 ml Eau distillée ................................................................................................... 90 ml

Soluté physiologique (No 24)

Chlorure de sodium (NaCl) ......................................................................... 8,5 g

108


Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

Peser le chlorure de sodium. Verser l'eau distillée dans un flacon propre bouché à l'émeri. Dissoudre le chlorure de sodium dans l'eau et mélanger soigneusement. Entourer le bouchon d'une ficelle ou d'une bande de papier pour éviter qu'il ne colle au flacon.

Etiqueter le flacon: SOLUTÉ PHYSIOLOGIQUE et inscrire la date. Conserver sur une étagère ou dans une armoire. En verser dans un flacon compte-gouttes pour l'usage courant. Inscrire la date sur l'étiquette. Ce flacon compte-gouttes doit être muni d'une pipette avec poire en caoutchouc.

Schaudinn, fixateur de (No 25)

NOTE : Ce fixateur doit être préparé dans des laboratoires de niveau intermédiaire en raison du danger présenté par les réactifs.

Solution-mère Chlorure mercurique, solution aqueuse saturée (HgCh)1 .................... 600 ml Ethanol à 95% ............................................................................................. 300 ml

Verser la solution aqueuse saturée de chlorure mercurique dans un flacon d'un litre bouché à l'émeri. Ajouter l'éthanol à 95% et mélanger en agitant le flacon.

Etiqueter le flacon: FIXATEUR DE SCHAUDINN- SOLUTION-MÈRE et inscrire la date. La solution-mère se conserve indéfiniment (au moins un an).

Solution de travail pour la coloration Solution-mère de fixateur de Schaudinn ................................................ 100 ml Acide acétique glacial (CH3COOH) ............................................................ 5 ml

Verser la solution-mère dans un flacon de 250 ml bouché à l'émeri. Ajouter l'acide acétique glacial et mélanger en agitant le flacon.

Etiqueter le flacon: FIXATEUR DE SCHAUDINN +ACIDE ACÉTIQUE, et inscrire la date. Cette solution se conserve 2 à 3 mois.

ATTENTION :Le chlorure mercurique est extrêmement toxique. L'acide acétique glacial est extrêmement corrosif et l'alcool éthylique est inflammable.

Citrate de sodium à 2%, solution de (No 26)

Cristaux de citrate de sodium (C6HsNa3. 2H20) ........................................ 20 g Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

Verser l'eau distillée dans un flacon propre (bouché à l'émeri ou à bouchon vissé). Peser les cristaux de citrate de sodium et les verser dans l'eau. Mélanger jusqu'à dissolution.

1 Verser environ 80 g de chlorure mercurique cristallisé dans 1 000 ml d'eau distillée et chauffer pour dissoudre les cristaux. Laisser refroidir. La solution est saturée lorsque des cristaux se forment au fond de la fiole.

109

ANNEXE2

Etiqueter le flacon: CITRATE DE SODIUM à 2% et inscrire la date. Conserver sur une étagère ou dans une armoire. La solution se conserve au moins un an.

Trichrome, solution de (IJO 27)

Chromotrope 2R ............................................................................................. 6,0 g Vert lumière SF ............................................................................................... 1,5 g Vert solide FCF ............................................................................................... 1,5 g Cristaux d'acide phosphotungstique (H3[P04(W12036)]. 5H20 ................ 7 g Acide acétique glacial (CH3COOH) .......................................................... 10 ml Eau distillée ............................................................................................... .1000 ml

Peser chaque colorant séparément et les verser dans une fiole d'l litre.

Peser les cristaux d'acide phosphotungstique, et les ajouter aux colorants. Mesurer l'acide acétique glacial et le verser dans le flacon. Agiter la fiole de manière que l'acide acétique mouille bien tous les colorants. Laisser reposer 30 minutes. Ajouter l'eau distillée et mélanger. Verser le colorant dans un flacon propre d'un litre bouché à l'émeri.

Etiqueter le flacon: TRICHROME et inscrire la date. Conserver sur une étagère ou dans une armoire, à l'abri de la lumière. Une bonne solution de trichrome possède une couleur violet-foncé noir. Ce colorant se conserve au moins un an.

ATTENTION: L'acide acétique glacial est extrêmement corrosif.

110

ANNEXE 3

Préparation des milieux de culture

Milieu de Schneider enrichi pour la culture in vitro de Leishmania

Matériel

Milieu de Schneider pour Drosophila1 ....................................................... 80 ml Sérum de fœtus de veau1 ............................................................................ 20 ml Solution antibiotique-antifongique1 ........................................................ 1,2 ml

La solution antibiotique-antifongique contient de la pénicilline, de la streptomycine et de l' amphotéricine.

Préparation

1. Inactiver le sérum de fœtus de veau pendant 30 minutes à 56°C et laisser refroidir.

2. Mélanger 20 ml de ce sérum inactivé à 80 ml de milieu de Schneider. 3. Ajouter 1,2 ml de la solution antibiotique-antifongique, mélanger, répartir

aseptiquement ce milieu en fractions de 3 ml dans des tubes stériles de 16 x 100 mm et boucher.

4. Etiqueter et congeler à- 20°C. Ce milieu peut se conserver jusqu'à un an à - 20°C, mais seulement 6 semaines à 4- 6°C.

NOTE : La préparation du milieu doit se faire dans des conditions rigoureuses d'asepsie.

Utilisation 1. Réchauffer 2 tubes de milieu à température ambiante. 2. Inoculer chaque tube avec 0,1 ml de prélèvement. 3. Laisser incuber les cultures à 24°C (± 2°C), dans l'obscurité, pendant

14 jours. La température ambiante convient en général. 4. Examiner 1 lame par jour à la recherche de formes promastigotes. Pour

cela, prélever une goutte de culture à l'aide d'une anse de platine et la déposer sur une lame. Recouvrir d'une lamelle et rechercher les promastigotes mobiles flagellés.

NOTE : Les cultures négatives doivent être repiquées au bout de 4 jours dans du milieu frais, et à nouveau examinées tous les jours pendant encore 10 jours.

Milieu de Novy, McNeal et Nicolle (NNN) pour la culture in vitro de Leishmania

Matériel Blood agar base Difco2 .....•..•....................•..••.....•..•..................................•...... 8 g

1 Tous les ingrédients peuvent être commandés à Pasteur Diagnostic Sanofi, 3, boulevard Raymond Poincaré, BP 3, F-92430 Marnes-la-Coquette, France. 2 On peut se la procurer auprès de Difco Laboratories, PO Box 10587, Detroit, Michigan 48233, Etats-Unis d'Amérique.

111

ANNEXE3

Eau distillée ................................................................................................. 200 ml Sang de lapin défibriné .......................................... 0,6 ml pour 5 ml de milieu

Préparation du sang de lapin défibriné Recueillir 20 ml de sang de lapin dans une fiole stérile contenant environ 100 billes de verre de 4 mm de diamètre. Défibriner le sang à l'aide d'un agitateur rotatif pendant 5 minutes. Ajouter 200 UI de pénicilline, 200 mg de gentamicine et 2 mg de streptomycine par ml de sang défibriné.

Préparation 1. Verser 200 ml d'eau dans une fiole, ajouter la gélose, mélanger et chauffer

la fiole dans de l'eau bouillante jusqu'à ce que la gélose soit complètement dissoute.

2. Répartir le milieu en fractions de 5 ml dans des tubes à essais à bouchon vissé (contenance 20 ml). Stériliser à l'autoclave (bouchons dévissés légèrement) à 121 oc pendant 15 minutes et laisser la gélose refroidir jusqu'à 45- 50°C.

3. · Ajouter 0,6 ml de sang de lapin défibriné stérile dans chaque tube et mélanger doucement. Laisser le milieu se solidifier dans les tubes en inclinant ces derniers.

4. Laisser les tubes debout à température ambiante pendant 24 heures, pour que la condensation puisse se faire. Les tubes doivent être ensuite conservés à 4- 6° C jusqu'à ce qu'ils soient utilisés.

NOTE: Ce milieu doit être préparé dans des conditions rigoureuses d'asepsie.

Utilisation 1. Inoculer aseptiquement environ 0,1 ml d'échantillon dans le liquide de

condensation de deux flacons à température ambiante. 2. Incuber les cultures à 24° (± 2°C) à l'obscurité. 3. Examiner tous les 4 jours. Pour cela, prélever une goutte de culture au

moyen d'une anse de platine stérile et la déposer sur une lame pour rechercher les promastigotes.

NOTE : Les cultures négatives doivent être repiquées au bout de 8 jours sur un milieu frais, puis examinées tous les 4 jours pendant encore 20 jours.

112

ANNEXE 4

Nettoyage et conservation des lames porte-objets

Nettoyage

Il convient d'insister sur la nécessité de disposer de lames de verre propres et de bonne qualité pour préparer les étalements de sang destinés à un examen microscopique. Toutes les lames doivent être parfaitement propres et débarrassées de toute graisse ou humidité. Cela permettra d'éviter la plupart des artéfacts qui gênent le diagnostic du paludisme, et empêchera que les gouttes épaisses ne se détachent et soient perdues en cours de coloration. Il faut rejeter toutes les lames défectueuses, c'est-à-dire:

celles qui présentent des parties irisées ou un aspect dépoli; - les lames mal nettoyées, qu'elles soient neuves ou anciennes;

les vieilles lames rayées ou ébréchées.

Lames neuves Il est plus prudent de nettoyer toutes les lames neuves (y compris les lames prénettoyées que l'on trouve dans le commerce) en les trempant dans de Y eau additionnée d'un bon détergent1, puis en les rinçant à l'eau courante, ou en les changeant plusieurs fois d'eau en quelques heures. Chaque lame doit être essuyée avec un chiffon sec et propre, non pelucheux. Toujours manipuler les lames propres par leurs bords pour éviter les empreintes digitales.

Lames usagées Avant de les laver on fera tremper les lames usagées dans une solution d'hypochlorite pendant au moins 60 minutes. On les lavera ensuite à l'eau chaude savonneuse, en brossant bien leurs deux faces. N'en laver que quelques unes à la fois pour éviter de les rayer ou de les ébrécher. Les frotter une par une avec de la gaze ou du coton. Puis les tremper dans une solution fraîche de détergent, les rincer à l'eau courante, ou les changer plusieurs fois d'eau, avant de les sécher avec un chiffon de coton propre. Les lames légèrement rayées qui ne sont pas utilisables pour les frottis sanguins peuvent être transmises à la section d'entomologie pour l'usage courant.

Conservation des lames

En climat tropical humide, les lames de verre ne doivent pas être conservées dans les conditions ambiantes pendant plus de quelques semaines. Autrement, elles vont se coller les unes aux autres en raison de l'humidité et elles perdront de leur transparence à cause du phénomène de «dépolissage». Après les avoir nettoyées, le mieux est de les conserver dans un endroit sec ou dans une armoire chauffante.

Il est recommandé de conserver les lames propres par paquets de 10, enveloppés dans du papier fin et attachés avec du ruban ou avec un élastique, prêtes à l'emploi. Les paquets de lames peuvent être rangés dans les boîtes en carton d'origine, ou dans toute autre boîte servant à Y expédition ou au transport, mais il faut les protéger avec du carton ondulé, du polystyrène expansé ou du coton.

1 Il est déconseillé d'employer du bichromate-acide comme solution de nettoyage.

113

Index

APV (voir aussi alcool polyvinylique) mélange fixateur à l' 107-108

Acmztlumzoeba 78 Acide, chlorhydrique-eau, solution décolo

rante 103 chlorhydrique-éthanol, solution d' 105

Alcool, acide acétique, solution décolorante 99 polyvinylique (APV), matériel fixé à l' 19,22-23,30 pour fixer les prélèvements de selles 19, 22-23,30

Ascaris œufs 29, 69, 71

Balantidium coli, forme végétatives 80, 81 kystes 80-81

Bilharzioses diagnostic 16,26---29,34 intestinales 71, 72

dimensions relatives des oeufs 71 étalement épais de matière fécale sous

cellophane pour le diagnostic, technique de Kato-Katz 26---29

larves, caractéristiques 72 en soluté physiologique 13-14 identification 72

œufs, en soluté physiologique 13-14 identification 69-71 stade de développement 69

recherche, dans les prélèvements d'urines 34-37 dans les prélèvements de selles 16,

26---29 Blastocystis hominis 24, 78 Bleu de méthylène tamponné 99

préparation, à l'état frais 11, 13, 15,74 Bleu de méthylène-phosphate, solution de

106---107 Bleu de méthylène-soluté physiologique 107 Bru gia malayi

caractéristiques 93, 94 moments auxquels le prélèvement de sang doit être fait sei

Cellules à flammes vibratiles 37 de pus dans les prélèvements de selles

82 épithéliales dans les prélèvements de

selles 81-82 Cécité des rivières (voir Onchocerca volvulus) Chilomastix, kystes, identification 77 Chilomastix mesnili, formes végétatives, identi-

fication 77, 79 Chloroquinorésistance 49-30 Chromatine, dans Entamoeba 15, 74, 76

dans les Plasmodium 47, 48 Citrate de sodium à 2 %, solution de 109-110 Clonorchis sinensis, œufs 71 Colorant

de Field A 102 de Field B 103

Colorants 97-98 préparations (voir les colorants individuels)

115

Coloration, à l'hématoxyline de Delafield, pour la mise en évidence des microfilaires 46, 47, 92,94

au Giemsa 41, 44--45, 48 pH 48,62 préparation 41, 48

au trichrome 19-25,73 caractéristiques des protozoaires 73 réactifs nécessaires 98

deField 40 frottis minces 45 gouttes épaisses 45

Conservation, des lames porte-objets 113 des prélèvements de selles 30--31 des réactifs (voir les réactifs individuels)

Contrôle de la qualité, des examens coprologiques 31-32 des prélèvements de selles 31-32

Cristalloïdes 25, 75 Cryptosporidium 80-81

oocystes, techniques de coloration permanente 17-18

Cytoplasme de Trypanosoma 50, 85,92

Désinfectants pour le nettoyage des surfaces de travail 2

Détermination de la taille des parasites 8 Dientamoeba fragilis, formes végétatives 76 Digestion par la collagénase 66 Diphyllobothrium latum, œufs 71

Ecouvillonnage anal, à la recherche des œufs d'oxyures 25-26

Elimination, des lames porte-objets 3 des prélèvements 2-3

Endolimax nana formes végétatives 76 kystes 77

Entamoeba hart1nanni formes végétatives 76 kystes 77,78

Entamoeba coli formes végétatives 74

identification 76 kystes

cristalloïdes 75 dans les étalements colorés au trichrome

24 identification 75, 77,78

Entamoeba histolytica formes végétatives 73, 74

identification 73-75, 76, 77 kystes, cristalloïdes 75

identification 75-78 Enteromonas hominis

formes végétatives 79 kystes 77

Enterobius vennicularis écouvillonnage anal 25-26 œufs, identification 70

Epreuve d'immunofluorescence indirecte, (IFl) 63

Etalement épais de matières fécales sous cel-lophane, technique de Kata-Katz 26---29

Ethanol à 70% 102 Ether-alcool, fixateur 102 Ether, précautions 17

INDEX

Field, colorant de 102-103 Fascia/a hepatica

œufs 71 Fascialapsis buski

œufs 71 Filtres, examen d'urines 35 Fixateur de Schaudinn modifié 107 Fixer les frottis sanguins 44, 48 Formes végétatives

d'amibes (voir aussi les différentes espèces) 73-75 dégénérescence 31 caractéristiques dans différents colorants

73 dans les prélèvements de selles 9, 10,

14--15 identification 73-75, 76

problèmes 81 mobilité 14, 73-74

de flagellés, caractéristiques dans différents types de préparations 73 dans le système génito-urinaire 39 identification 78, 79 motilité 14, 78

Formol, solutions de 103 à 2 %, méthode de concentration pour les

microfilaires 103 -éther, technique de concentration 16

Fragments cutanés 64 Frottis de sang frais

pour la recherche des microfilaires 59 pour la recherche des trypanosomes 51-52

Frottis sanguins 41-52 coloration, au Giemsa 44-45

à l'hématoxyline de Delafield 46-47 deField 45

contrôle de la qualité 47-48 examen 46-47, 52 préparation 41-43,51

Fuchsine phéniquée, solution de 101

Giardia intestinalis 77, 79, 80 Giardia

kystes 77 Giemsa (solution-mère) 104 Glycérol-vert malachite ou glycérol-bleu de

méthylène, solution de 104 Glycogène 24, 73 Granulation, chromatique 15

de Schüffner 44, 47, 48, 83

Helminthes, larves, identification 72 œufs, identification 69-71

Heterophyes heteraphyes œufs 71

Hématies, dans les étalements colorés 24--25, 74

Hématoxyline de Delafield 101-102 Hématurie 34 Hymenalepis diminuta

œufs 71 Hymenalepis nana

œufs 71

Iadamaeba bütschlii formes végétatives, identification 76 kystes, identification 76

Iode dans l'alcool, solution d' 105 Iodure de potassium à 10 %, solution d' 107 Isaspora belli

oocystes 80--81

116

Kato-Katz, nécessaire 28 technique, étalement épais de matières

fécales sous cellophane 26-29 Kystes

d'amibes, (voir aussi les différentes espèces) 73, 75-78

caractéristiques dans différents colorants 73

danslesprelèvementsdeselles 9-10,14--17 identification 75-78 problèmes 81

flagellés, (voiraussilesdifférentesespèces) caractéristiques dans différents types

de préparations 73 identification 77, 78, 79

Lames porte-objets, conservation 113 élimination 3 nettoyage 113

Leishmania amastigotes 60, 62 degré de densité 63 promastigotes 60,62 recherche dans la rate 60--62 tests ilnmunologiques pour 63

Liquide céphalo-rachidien (LCR), recherche des trypanosomes 57-59

Laa laa, identification 93, 94 moments auxquels le prélèvement de

sang doit être fait 59 Lugol, solution à 1 % pour préparations à

l'état frais 106 solution-mère à 5 % 106

Macrophages dans les prélèvements de selles 81-82

Mansanella azzardi identification 93, 94 moments auxquels le prélèvement de

sang doit être fait 59 Mansanella perstans

identification 93, 94 moments auxquels le prélèvement de

sang doit être fait 59 Mansanella streptacerca

identification 93, 94 Matériel de parasitologie diagnostique 96-97 Mélange à l' APV 108 Membrane ondulante, des trypanosomes 50, 92 Metaganimus yakogawai

œufs 71 Méthanol, fixation du frottis mince 44, 48 Méthode, de filtration à la seringue, pour les

examen d'urines 35-37 de sédimentation des urines 34-35

Méthodes de coloration, contrôle de la qualité 32-33,47-48 frottis sanguins 41-48 prélèvements de selles 17-24

Micro-technique de centrifugation/ échange d'anions (rn-AECT) 53-55

Microfilaires, identification 92-94 prélèvements de sang à la recherche de 59 recherche 40

dans le sang capillaire 60 dans le sang veineux hémolysé 60 dans les frottis sanguins 45-46,59

Microhématocrite 52-53 Micromètre oculaire 8 Microscope, entretien 7

étalonnage 8 prévention des moisissures 7

Milieu, de Novy, McNeal et Nicolle (NNN)

INDEX

pour la culture in vitro de Leishmania 111-112

de Sclmeider enrichi pour la culture in vitro de Leishmania 111

Miracidiwn, dans les œufs de S. haematobium 37

Naegleria 78 Nettoyage, lames porte-objets 113

surfaces de travail 2 Nodules sous-cutanés, onchocercose 64

Onchocerca volvulus identification 93, 94 recherche dans les prélèvements cuta

nés 64-65 Oocystes, Cryptosporidium 17-18, 80-S1

Isospora belli 80--81 Opistlrorchis felin eus

œufs 71

Paragonimus westennani, œufs 71

Parasites (voir aussi les différentes espèces) intestinaux 69--82 sanguins 83-94

comptage 84, 85 Parasitologie diagnostique, matériel de 96-98 pH du colorant au Giemsa 48, 62, 92, 94,97 Plasmodium, (voir aussi les différentes espèces)

caractéristiques morphologiques 84, 85 comptage 84, 85 identification 48-49,83-91 recherche dans les frottis sanguins 40,

48--50,83-84 stade annulaire 84 structures 48-49

Plasmodium falcipantm caractéristiques morphologiques 84, 85, 87 chloroquinorésistance 49-50 parasitémie 84 stade annulaire 84

Plasmodium malariae caractéristiques morphologiques 84, 89

Plasmodium ovale caractéristiques morphologiques 84, 90

Plasmodium vivax caractéristiques morphologiques 84, 88

Ponction, de la rate, teclmique spéciale pour la recherche des Leishmmzia 61-62

veineuse 47 Ponction-biopsie, de moelle osseuse, à la

recherche de Leishmania 60-61 des ganglions lymphatiques, à la recher

che de Leishmania 61 à la recherche de trypanosomes 55-57

Prélèvements

117

cutanés 64-65 examen 65

de sang 2, 40-63 contrôle de la qualité 47-48 précaution pour la manipulation 2

de selles 9-10,30 coloration 17-25 conditions de conservation 10, 32 conservation 27-30, 103 consignes de sécurité pour la manipula-

tion 2 consistance 10, 12 différentes sortes de parasites trouvés 9 élimination 29-30 emballage pour le transport 30

étiquetage 9, 31 examen 1G-15, 32

macroscopique 10 microscopique 1G-13

mucus dans les 10, 12 récipients 9, 30 teclmique de concentration 16--17,33

des urines 34 consignes de sécurité pour la manipula

tion 3 examen 34-37

manipulation des 2-3 sur cellophane 25-26 urétraux 38

examen 38--39 vaginaux 38

centrifugation/ sédimentation 38--39 examen 38--39

Préparation, à l'état frais, contrôle de la qualité 31 élimination des lames porte-objets uti

lisées 29 examen 13 identification des protozoaires 14-15

à l'iode 10, 11-12 caractéristiques des protozoaires 73 indications 11-12 kystes, d'amibes 15,75-76,78

flagellés 15, 77, 78 du sang de lapin défibriné 112

Protozoaires, dans les préparations à l'état frais 14-15 identification, (voir aussi les différentes

espèces) 73--82 problèmes 81-82

teclmique de coloration au trichrome 19-24

Retortamonas intestinalis formes végétatives, identification 79 kystes, identification 77

Réactifs 97-98 contrôle de la qualité 31-32 préparation des 32

Schaudinn, fixateur de 109 Safranine, solution de 108 Schistosoma haematobium

identification 37, 71 intensité de l'infestation 36, 37 œufs,

recherche dans les prélèvements d'urines 34-37

Schistosoma intercalatum œufs 29

Schistosama japonicum œufs 29,71

Schistosama mansoni œufs 29,71

Sécurité au laboratoire 2-3 Soluté physiologique 108--109

préparation à l'état frais 10-12 formes végétatives, d'amibes 73-74,76

de flagellés 73, 77 identification des parasites 13-15 kystes d'amibes 73,75-76 préparation 11

Solution, d'acétate de sodium 99 d'acide acétique 99 de formol à 10% pour la conservation des

selles 103 de travail de mélange fixateur à l' APV 108 de travail pour la coloration 99-100

Strongyloides stercoralis larves 72

INDEX

dans les préparations en soluté physiologique 13

identification 72

Taches de Maurer 44, 47, 48 Taenia,

décelé dans les prélèvements de selles 16 œufs 71

Tampons pour la coloration des Plasmodium 100

Technique, à la safranine-bleu de méthylène 18-19 de concentration, contrôle de la qualité 33

prélèvements de selles 16-17 de Kato-Katz 26-29 de Ziehl-Neelsen modifiée 18

Techniques immunologiques, pour Toxoplasma gondii 81-82 pour Leishmania 63

Titrage immunoenzymatique (ELISA) pour Leishmania 63

Toxoplasma gondii diagnostic de laboratoire 81-82

Toxoplasmose 81 Trichomonas vaginalis 38, 39 Trichomonas hominis

formes végétatives identification 79 préparations à l'état frais en soluté phy

siologique 79 Trichostrongylus

œufs 71

118

Trichrome, solution de 110 Trichuris

œufs, dimensions 71 étalement épais sous cellophane 29

Trypanosoma brucei structure morphologique 50-51, 92

Trypanosoma cruzi structure morphologique 50-51, 92

Trypanosoma rangeli 92 Trypanosomes, identification 85--92

recherche, dans le liquide céphalorachidien (LCR) 50,57-59 dans le sang 40, 50-55 dans le suc ganglionnaire 55--57

Urines contaminant les prélèvements de selles 10

Wuchereria bancrofti identification 92, 93 moments auxquels le prélèvement de

sang doit être fait 59

Xylène phéniqué, solution de 101

Ziehl-Neelsen, technique de, modifiée 18

Imprimé en France. -JOUVE, 18, rue Saint-Denis, 75001 PARIS No 247782V.- Dépôt légal :Juin 1997

oms.93 parasitologie med tech base labo 9242544108

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