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Cahier techniqueO OSSIER NANOPHOTONIQUE

Nanopuits métalliques pour exalter les contrastes en microscopie optiquePercer des trous de quelques nanomètres dans un film métallique est une manière conceptuellement simple de réaliser des nouveauxcomposants photoniques. Malgré son apparente simplicité, un trou percé dans un écran opaque n’a toujours pas fini de livrer ses secrets et d’inspirer de nouvelles perspectives d’applications. Ces structures permettent en particulier d’augmenter l’émission de molécules individuelles fluorescenteset peuvent également être exploitées dans le cadre de la nanobiophotonique.

premier résultat surprenant : des moléculesfluorescentes placées dans un trou nanomé-trique émettent plus de lumière que dans unegoutte de solution, avec une exaltation signi-ficative supérieure à 6. Cette propriété ouvredes perspectives d’applications intéres-santes en biophotonique, dont nous donnonsquelques aspects après avoir décrit nosrécents résultats.

Procédure et résultatsexpérimentaux

Conditions expérimentalesLes nanostructures étudiées sont des trouscirculaires isolés percés dans un film d’alu-minium sur un substrat de verre. Les nano-trous ont des diamètres compris entre 100 et400 nm, l’épaisseur du film métallique est de250 nm et celle du substrat de verre de150 µm (figure 1).Pour sonder le champ électromagnétiquedans le nanotrou, nous déposons une gouttede molécules fluorescentes et suivons lesignal de fluorescence collecté par un mon-tage de microscopie présenté sur la figure 2.Notre choix de reporters fluorescents s’estporté sur des molécules de Rhodamine 6Gdans une solution aqueuse, en raison de leurstabilité et de leur rendement quantique élevé.Le signal de fluorescence est ensuite exploité

Mise en contexteSed etiam quodam Quarto modo, Diffracte.C’est par ce néologisme qu’en 1665 l’ItalienFrancesco Grimaldi donne la première des-cription scientifique de la diffraction lumi-neuse. Il identifie un quatrième “mode” depropagation de la lumière, après le trajet(géométrique) direct, la réfraction et laréflexion. Depuis, la transmission lumineuseau travers de trous dans un écran opaque n’acessé d’interpeller les scientifiques. Bien quele sujet soit en apparence simple, les obser-vations expérimentales réservent encoreaujourd’hui des surprises. Suivant la théoriecommunément admise de l’électromagné-tisme, la transmission par unité de surfaced’un trou nanométrique percé dans un métalinfiniment conducteur varie comme (d/l)

4, où

d est le diamètre du trou et l la longueurd’onde lumineuse. Cette loi prédit donc unetransmission extrêmement faible pour l > d.Cependant, le cas d’un trou dans un métal réeld’épaisseur et de conductivité finies est unsujet très différent. Les résultats de l’équipe deThomas Ebbesen sur le phénomène de trans-mission exaltée en témoignent, comme l’indi-quent les pics de transmission obtenus alorsque la longueur d’onde est nettement plusgrande que le diamètre des trous. Initialementobservés pour des réseaux périodiques denanotrous, ces phénomènes sont aussi pré-sents pour des trous individuels isolés. Ils met-tent en jeu des couplages avec des résonan-ces électromagnétiques appelées plasmonsde surface.Les études actuelles sur les trous nanomé-triques dans un métal portent essentiellementsur leurs propriétés de transmission optiqueen champ lointain. Nous proposons une autreapproche : étudier ces structures avec desmolécules luminescentes pour sonder locale-ment le champ lumineux. Nous obtenons un

Figure 1. Image au microscope électronique d’un nanotroude diamètre 200 nm et schéma des nanostructures étudiées.Les molécules fluorescentes sont en solution et diffusentau-dessus et dans le nanopuits.

Figure 2. Principe du montage expérimental de microscopieconfocale pour sonder un nanotrou isolé.

J. Wenger, P.-F. Lenne, E. Popov, J. Capoulade, H. Rigneault Institut Fresnel, Université Paul-CézanneAix-Marseille III, CNRS UMR 6133, 13397Marseille Cedex 20J. Dintinger, T. W. EbbesenISIS, Université Louis Pasteur, CNRS UMR7006, 8 allée G. Monge, 67000 StrasbourgN. BonodCEA, Centre d’études scientifiques et techniques d’Aquitaine, BP2, 33114 Le Barpjerome.wenger@fresnel.frlenne@fresnel.frherve.rigneault@fresnel.fr

Volume d’observation

excitationFluorescence

Aluminium 250 nm

Verre 100 nm - 400 nm

Rh6GNanotrou

Objectif40x /1,2

Laser 488 nm Miroirdichoïque

Fluo. 550 nm

Trouconfocal

Photodiodeà avalanche

Autocorrélateur

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Cahier techniqueDOSSIER NANOPHOTONIQUECahier technique

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InterprétationPour comprendre l’origine de l’exaltation dela fluorescence, nous avons modélisé la pro-pagation du champ excitateur dans la nano-structure, en utilisant une résolution numé-rique rigoureuse des équations de Maxwell. Ilapparaît que l’intensité locale d’excitationdans le nanotrou est exaltée par rapport àl’intensité incidente d’un facteur 5 (pour uneintégration sur l’ensemble du volume d’ob-servation). L’exaltation de la fluorescences’explique donc essentiellement par une aug-mentation locale de l’intensité d’excitation,qui apparaît lors de la transition entre unmode propagatif et un mode évanescent duchamp excitateur dans la structure.

Applications à la nanobiophotoniqueLorsqu’une limite se présente, il est toujoursexcitant de chercher à la contourner. C’est lecas en microscopie optique, où différentestechniques ont été développées pour obser-ver un volume plus petit que celui fixé par leslois de la diffraction (microscopie 4, déplétionstimulée STED, sonde de champ procheNSOM…). L’utilisation des trous nanomé-triques dans des films métalliques apparaîtcomme une méthode alternative, qui pré-sente l’avantage d’être simple et robuste, etqui correspond à la première proposition his-torique de microscopie optique en champproche, formulée en 1928 par E.H. Synge.Grâce au phénomène d’exaltation que nousavons décrit précédemment, les nanotrous

peuvent être utilisés pour détecter le faibleflux lumineux émis par des molécules indivi-duelles. Nous détaillons ici quelques applica-tions dans le domaine de la nanobiophoto-nique.

Analyse de moléculesindividuelles dans une solution de forte concentration

Grâce au trou nanométrique, le volume d’ana-lyse en microscopie optique est rendu pluspetit que la limite de diffraction. Cela donne lavision intuitive d’une nano-chambre de réac-tions chimiques, où il est possible d’étudierdes associations de molécules individuellesdans des solutions de forte concentration(typiquement la dizaine de micromolaire). Unpremier avantage est d’accéder à des infor-mations à l’échelle de la molécule individuellequi ne sont pas accessibles par des mesuresd’ensemble comme la dynamique temporelleet la répartition statistique des réactions. Unsecond avantage est de pouvoir travailleravec des concentrations suffisamment éle-vées pour observer certaines réactions bio-chimiques, les enzymatiques en particulier.De plus, l’usage du nanopuits diminue letemps nécessaire à une molécule pour tra-verser le volume d’observation, ce qui permetde suivre plus rapidement des cinétiques chi-miques et améliore la résolution temporelledu système.Tous ces avantages s’appliquent aussi àl’étude des interactions de deux marqueursfluorescents s’excitant à des longueursd’onde différentes. Un apport supplémentaire

Figure 5. Exemple d’utilisation d’un nanopuits pour suivre l’association de deux espèces moléculaires : une sonde fixée au fond du puits et une cible diffusant librement.

grâce à la technique de spectroscopie parcorrélation de fluorescence (voir encadré).Cette méthode permet de déterminer préci-sément le nombre moyen de moléculesobservées. Connaissant la concentration enfluorophores dans la solution acqueuse, nouspouvons en déduire le volume observé dansnos expériences. Ce volume correspond sen-siblement au volume géométrique du puits.Pour les plus petits diamètres, le volumeobservé est plus faible que le volume géomé-trique du trou, car le champ excitateur estalors évanescent et ne permet pas de sondertoute la structure.

Premières observationsLa connaissance du nombre moyen d’émet-teurs nous permet de quantifier directementle nombre de photons détectés par moléculeet par seconde. Ce nombre est comparé autaux de comptage de photons obtenu pourune molécule identique placée en solutionlibre, avec la même intensité d’excitation,convenablement choisie pour éviter tout phé-nomène de photoblanchiment ou de satura-tion de l’émetteur. De manière surprenante, letaux de fluorescence par molécule est aug-menté par la présence de la nanostructure,avec des exaltations significatives allant jus-qu’à 6,5, comme le montre la figure 3.En parallèle, nous avons également observéune réduction importante du temps de vie dela molécule (supérieure à 20), ainsi qu’unretard dans l’instauration de la saturation dela fluorescence, ce qui traduit une altérationde l’environnement électromagnétique del’émetteur par la nanostructure.

Apport de la nanostructureD’un point de vue pratique, pour obtenir unplus fort signal de fluorescence par molé-cule en solution, il suffirait d’augmenter lapuissance d’excitation, sans avoir recours àune nanostructure. Mais comme le montrela figure 4, cette approche possède des limi-tes : pour des puissances d’excitation supé-rieures à 400 µW, le taux d’émission parmolécule en solution sature, avec un maxi-mum d’émission par molécule en solutionlibre d’environ 40 000 photons détectés parseconde. En comparaison, avec un nano-trou, la saturation retardée permet d’obtenirdes taux de comptage de plusieurs cen-taines de milliers de coups par seconde, unrégime inaccessible en l’absence de nano-structure, ce qui constitue l’un de sesatouts.

Figure 3. Exaltation expérimentalede la fluorescence détectée par molécule

en fonction du diamètre de l’ouverture, pourune puissance d’excitation fixée à 300 µW (carrés)

et calcul théorique de l’intensité d’excitationnormalisée par unité de volume

dans le nanotrou (disques).

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Figure 4. Taux de comptagepar molécule et par secondeen fonction de la puissance

d’excitation pour un nanotroude 150 nm de diamètre et pour la

solution ouverte.Sans la nanostructure, il serait

impossible d’obtenir des tauxde comptage par molécule

supérieurs à quelques dizainesde milliers de coups par seconde.

Microscopie par corrélation de fluorescence

La corrélation de fluorescence (FCS,Fluorescence correlation spectroscopy)permet d’étudier la diffusion dynamiqued’émetteurs fluorescents individuels. Cette technique repose sur l’analysetemporelle des fluctuations de l’intensité de fluorescence, qui sont directementreliées au passage des fluorophores au travers du volume d’observation.D’un point de vue pratique, cela revient à calculer la fonction d’autocorrélation de l’intensité détectée. Aux temps courts, cette fonction donneaccès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu’au nombre moyende molécules détectées. Aux temps longs, elle renseigne sur letemps de séjour moyen des molécules (temps de diffusion) et sur leur mode de diffusion au travers du volumed’observation.Pour que cette technique puisse s’appliqueravec un bon rapport signal à bruit, le nombre d’éléments diffusant ne doit pasêtre trop élevé, d’où la nécessité d’observer un faible volume. Cette condition est biensûr immédiatement remplie dans le cas des trous nanométriques. Pour l’usage de molécules en solution libre, nous limitons le volume d’observation grâceà un filtrage spatial de la lumière de fluorescence (montage de microscopieconfocale présenté sur la figure 2).

nanotrou 150 nm

solution libre

Flu

op

arm

olé

cule

(kH

z)

Puissance d’excitation (mW)

350300

250

200

150

100

50

00,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Fact

eur

d’e

xalt

atio

n

Diamètre du trou (nm)

8

7

6

5

4

3

2

1

100 150 200 250 300

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des nanotrous dans ce cadre est de fixer phy-siquement le volume d’excitation correspon-dant à chaque marqueur, ce qui simplifie leproblème critique du recouvrement des fais-ceaux d’excitation.Plusieurs modes d’étude seront possibles enanalysant les fluctuations du signal de fluo-rescence : oligomérisation de molécules àhaute concentration ; association de deuxespèces moléculaires, l’une étant fixée dansle puits et l’autre pouvant diffuser et s’asso-cier avec la première ; association de deuxespèces diffusantes (figure 5).

Développement de biopuces à ADN à haute efficacité optique

En exploitant l’exaltation du signal optique, lesnanotrous peuvent servir de nanosourcesoptiques ou de nanopuits pour des détectionsrapides et hautement parallèles d’associa-tions moléculaires, en particulier dans desapplications de type puces à ADN. L’exal-tation optique peut encore être augmentée enexploitant des nanotrous structurés, où unréseau périodique circulaire a été gravéautour des trous. Ce réseau permet d’exciterefficacement des plasmons de surface quiexaltent la transmission du champ optiqueincident et améliorent la directivité du fais-ceau de fluorescence. Outre l’augmentationdu signal optique lié à l’exaltation, les nano-puits permettent également une diminutiondu bruit en isolant les sites actifs contenantles sondes.La possibilité de détecter des événementsd’hybridation individuels n’apporte pas seu-lement une amélioration de la sensibilité ; ellepermet également de rapporter des informa-tions statistiques sur la variété des hybrida-tions et sur leur dynamique temporelle.Toutes ces informations supplémentairespourront être utilisées pour le diagnostic.

Étude de l’architecture finede membranes cellulaires

En agissant comme un trou de filtrage placédirectement dans le plan objet, le nanopuitsautorise une observation confocale d’une zoneplus petite que la limite de diffraction optique.Cette ultra-résolution peut être mise à profit pourétudier la diffusion latérale de marqueurs indivi-duels dans des membranes biologiques de cel-lules vivantes. On peut ainsi accéder à l’organisation fonction-nelle et à la dynamique temporelle des mem-branes cellulaires avec une résolution spatialesubmicrométrique, comme le montre le schémade la figure 6.Comme premier exemple d’application, nousavons étudié la diffusion latérale de lipides indivi-duels dans une membrane modèle à des échellessub-longueur d’onde. Actuellement, nous appli-quons la technique de corrélation de fluores-cence dans des membranes de cellules vivantes.Notre objectif est de mettre en évidence desmicrodomaines lipidiques, dont la taille, plus petiteque la limite de diffraction, est encore mal connue.

En quelques mots…Les trous nanométriques percés dans desfilms métalliques sont des composantsoptiques simples et robustes, qui permettentd’exalter le signal optique tout en réduisant levolume d’observation sous la limite de dif-fraction. Ces propriétés optiques remar-quables offrent des perspectives d’applica-tions innovantes en nanophotonique et enbiophotonique.

Figure 6. Montage d’un nanopuits comme masquephysique pour observer la diffusion d’émetteursfluorescents dans la membrane de cellules vivantes.

Développements instrumentaux pour la nano- et la biophotonique, publications récentes : voir notre site web www.fresnel.fr/mosaicRéférences :• W.L. Barnes, A. Dereux et T. W. Ebbesen, Nature 424, 824-830 (1998).• H. Rigneault, et al, Phys. Rev. Lett. 95, 117401-117404 (2005).• M.J. Levene, et al., Science 299, 682-686 (2003).

Informations complémentaires

NoyauCellule Membrane

plasmiqueMarqueur fluorescent