Méthodes de diagnostic pour l’épidémio-surveillance des

pathogènes dans l’océan Indien

Isabelle ROBENE (CIRAD) / Emmanuel JOUEN (CIRAD) – 21.11.2013

Outils de détection et diagnostic

ANSES (LSV)

• validation interne

• ring tests

Valorisation

• inscription OEPP

• Brevets

• publications

ANSES Europe

Méthodes réglementaires pour

Organismes de Quarantaine

Contexte local et régional +

Utilisateurs

• Services régionaux de protection des végétaux

• Laboratoires agréés

• Laboratoires de certification…

Connaissance des populations associées aux épidémies

L’hôte, facteur de

structuration

Taxonomie Phylogénie

Diversité infra-

spécifique

Une collaboration régionale autour du diagnostic

• PRPV 2005-2007 Mise au point de méthodes de diagnostic des organismes de quarantaine de la pomme de terre et de la tomate, en collaboration avec le MSIRI (Maurice)

• e-PRPV 2011-2012 Renforcement et coordination des pôles de compétences en diagnostic dans la zone OI:

Madagascar, Seychelles, Maurice et Comores

• Au cours de ces 2 périodes, plusieurs formations sur le diagnostic dispensées aux agents de la zone.

• Production d’outils pour l’épidémio-surveillance dans la zone: – Diagnostic et typage de Xanthomonas citri pv. citri aux Comores (INRAPE/CIRAD)

– Typage et exploration de la diversité génétique de Ralstonia solanacearum à Madagascar (FIFAMANOR/ FOFIFA/CIRAD)

– Diversité et diagnostic des Xanthomonas spp. associées à la gale bactérienne de la tomate, piment et poivron dans l’OI (INRAPE/CIRAD)

Renforcement et coordination des pôles de compétences en diagnostic

• Objectifs : établir un réseau fiable dans la zone OI dédié à la surveillance du territoire et à la certification du matériel végétal.

• Missions en 2011-2012 dans les 4 laboratoires ciblés en 2008 visant à:

√ installer et mettre en route le matériel livré en 2008

√ former les personnels à la PCR (Xaa / semences)

√ réaliser un essai interlaboratoire d’aptitude à la réalisation d’une analyse PCR (begomovirus SWIO)

•

• Bilan: √ laboratoires opérationnels (quelques pannes)

√ compétences PCR acquises mais à entretenir

√ problème du coût du diagnostic PCR (consommables)

√ problèmes d’accès à la littérature scientifique et en particulier aux publications relatives aux méthodes de diagnostic

Quelques exemples de méthodes développées

Détection de Xad, reponsable de la bactériose de l’anthurium par Nested–PCR

spécifique sensible

Méthode moléculaire = Nested-PCR

103

Xad/ml

Prélèvements feuilles + pétioles

Broyage

Extraction ADN total

Deux tests de diagnostic mis au point pour détecter la bactérie Xaa dans les semences

d’oignon

441 pb

401 pb

Duplex nested PCR Triplex PCR quantitative

Tests sensibles et spécifiques pour de la certification de

semences d’oignon

4

Adaptation en

un outil plus

portable

3

3P Evaluation puce

Plateforme 3P

2

Fabrication puce plateforme Biopuce

genopole Toulouse

Oligonucléotides

déposés par

micropipettes

robotisées

Cy3

Extraction des ADN

Marquage

Hybridation

Ech. 1

3P Sélection

marqueurs

ADN

diagnostic

Un Microarray (puce) pour le diagnostic de Ralstonia solanacearum

Une validation des méthodes à différentes échelles

• Essai interlaboratoire régional sur une PCR de détection de begomovirus de la zone OI dans les différents pays de la zone OI lors de l’installation de pôles de diagnostic

• Essai interlaboratoire national en cours pour valider la N-PCR et la qPCR bactériose de l’oignon (LDA Martinique, LDA Mâcon, Anses Réunion, Geves Angers)

• Essai interlaboratoire européen pour valider la méthode N-PCR bactériose de l’anthurium: 15 laboratoires impliqués

A. Chabirand, E. Jouen, O. Pruvost, F. Chiroleu, B. Hostachy, M. Bergsma-Vlami, G. Bianchi, L. Cozzolino, J. Elphinstone, M. Holeva, F. Manole, P. Martini, H. Matoušková, J. Minatchy, G. Op de Beeck, F. Poliakoff, L. Sigillo, F. Siverio, J. Van Vaerenbergh, M. Laurentie and I. Robène-Soustrade. Comparative and collaborative studies for the validation of a Nested PCR for the detection of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae from anthurium samples. Plant pathology. Accepté, publié on line le 17 juin 2013.

Perspectives

• Identification des bioagresseurs dans la zone

nécessitant la mise en place de méthodes de diagnostic

• Développement de méthodes portables , utilisables au champ

Ex : LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

• Participation plus importante aux tests interlaboratoires des pays de la zone OI

Répartition mondiale de la maladie

Hawaii

Cuba

Brésil Réunion

Afrique du Sud

Taiwan

Venezuela

Floride

Tahiti

Australie

Italie

Hollande

Allemagne

Costa Rica

Antilles

Californie Turquie

•présent dans la plupart des aires de culture de cette aracée

•organisme de quarantaine UE

•A la Réunion depuis 97

Symptômes de la maladie

La bactériose de l’anthurium provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae

Le dépérissement bactérien de l’oignon provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. allii

Oignon Hawaii Barbade

Cuba

Brésil Mascareignes

Afrique du Sud

Japon

Venezuela

USA

• Lésions foliaires, pas de mort de la plante

• Diminution du calibre des bulbes-> baisse du rendement

• Transmission par semences

Bactérie du sol très polyphage

Flétrissement bactérien chez + de 250 espèces végétales et 50 familles botaniques

Fort impact économique : Réunion, Madagascar, Mayotte, Afrique du Sud (perte mondiale estimée à 1 milliard par an pour l’industrie de la pomme de terre

Un phytopathogène d’intérêt majeur pour la Réunion et pour le reste du monde

Distribution mondiale

- Organisme de quarantaine aux Etats-Unis et en Europe

- Intérêt des méthodes de diagnostic pour prévenir l’introduction (germe de pomme terre, bouture de géranium...) et la dissémination