monoxyde d’azote dans les voies aériennes...
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UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER U.F.R sciences
THESE
pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
discipline : PHYSIOPATHOLOGIE
présentée et soutenue par
Bruno DEGANO
le 17 décembre 2007
Monoxyde d’azote dans les voies aériennes supérieures
Étude des mises en jeu dans trois situations cliniques __________
Directeur de thèse : Mr le Professeur Jean-François ARNAL
__________
JURY Mr le Professeur Hervé GUENARD Rapporteur
Mr le Docteur Christophe DELCLAUX Rapporteur
Mr le Professeur Elie SERRANO Examinateur
Mr le Professeur Pierre BROUSSET Examinateur
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REMERCIEMENTS
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A mes Maîtres et Juges A Monsieur le Professeur Jean-François ARNAL Tu as eu la gentillesse de me confier un sujet qui te tenait à cœur. Tu as eu la patience et l’indulgence d’encadrer ce travail. J’apprécie ta vision élitiste de la recherche scientifique, car elle est un gage de succès pour la médecine de demain. A Monsieur le Professeur Hervé GUENARD Lors de chacune de nos rencontres, j’ai pu admirer l’originalité perspicace de ta pensée scientifique. Ton intérêt pour la physiologie respiratoire et pour son application en clinique humaine est pour moi un modèle. C’est avec une vraie jubilation que je t’écoute exposer clairement et simplement l’Etat de l’Art. Un grand merci d’avoir accepté de juger ce travail. A Monsieur le Docteur Christophe DELCLAUX Tes recherches sur le monoxyde d’azote dans les voies respiratoires continuent à faire évoluer nos connaissances sur ce sujet. C’est un honneur pour moi que tu aies accepté de juger ce travail. A Monsieur le Professeur Elie SERRANO Sans vous, rien de ce qui constitue ce travail n’aurait été possible. C’est avec gentillesse et efficacité que vous avez, à chaque fois, répondu à mes requêtes lorsqu’il s’est agit de mettre en place les trois projets qui composent ce mémoire. Je vous en remercie sincèrement, comme je vous remercie d’avoir accepté de compter parmi mes juges. A Monsieur le Professeur Pierre BROUSSET Tu me fais l’amitié de juger ce travail, et je t’en remercie. C’est à la fois un honneur et une chance, car je sais combien la finesse de ton jugement peut apporter d’éclairage constructif. Tu m’as ouvert les portes de ton laboratoire, où j’ai pu profiter du savoir-faire, de la disponibilité et de la gentillesse de techniciens, de médecins et de chercheurs dignes de leur patron. Puissent ces échanges perdurer.
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A Marie-Claude PREVOST Comment oublier que c’est toi qui m’as tenu la main lors de mes premiers pas au laboratoire ? Comment oublier que tu t’es levée bien des fois avant le lever du soleil pour venir travailler avec moi à l’animalerie ? Ma reconnaissance est grande. A ceux, techniciens, Chercheurs et Médecins qui m’ont accompagné dans ce (modeste) travail de recherche. A mes Collègues et Amis, A mes Maîtres
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A Séverine, A Gaspare, A Paola, A mes parents, A ma grand-mère.
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INTRODUCTION GENERALE .....................................................15
CHAPITRE I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ...........................19 1 ASPECTS CHIMIQUES DU NO ............................................................................................. 21
1.1 Généralités................................................................................................................ 21
1.2 Réactions avec l’oxygène moléculaire ..................................................................... 22
1.3 Réaction avec les métaux de transition .................................................................... 23
1.4 Réaction avec le radical superoxyde ........................................................................ 25
2 ASPECTS BIOCHIMIQUES DE LA SYNTHESE DE NO ............................................................. 26
2.1 Les NO-synthases..................................................................................................... 26
2.1.1 NOS-1............................................................................................................... 27
2.1.2 NOS-2............................................................................................................... 27
2.1.2.1 Données biochimiques ................................................................................. 27
2.1.2.2 Effet des glucocorticoïdes sur la NOS-2 ...................................................... 28
2.1.3 NOS-3............................................................................................................... 29
2.1.3.1 Effet des glucocorticoïdes sur la NOS-3 ...................................................... 30
2.2 Synthèse du NO par les NO-synthases..................................................................... 31
2.3 Rôle des NO synthases comme source d’anions superoxydes................................. 32
2.4 Métabolisme du substrat, la L-arginine.................................................................... 33
2.4.1 Le transport transmembranaire de l’arginine ................................................... 34
2.4.2 Les arginases .................................................................................................... 35
2.4.2.1 Données physico-chimiques......................................................................... 35
2.4.2.2 Inhibiteurs des arginases .............................................................................. 36
2.4.2.3 Arginase 1 .................................................................................................... 37
2.4.2.4 Arginase 2 .................................................................................................... 38
2.4.2.5 Effet des glucocorticoïdes sur les arginases ................................................. 39
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2.4.3 Les inhibiteurs endogènes des NOS................................................................. 40
3 NO ET DEFENSE ANTI-INFECTIEUSE................................................................................... 42
3.1 NO et bactéricidie..................................................................................................... 42
3.2 NO et défense anti-virale.......................................................................................... 43
3.3 Rôle du NO dans la clairance mucociliaire .............................................................. 44
4 ROLE DU NO PROVENANT DES VAS DANS LE CONTROLE DU TONUS VASCULAIRE ET
BRONCHIQUE ............................................................................................................................. 46
5 MESURE DU NO DANS LES VOIES AERIENNES SUPERIEURES .............................................. 46
5.1 Aspects technologiques de la mesure du NO ........................................................... 47
5.2 Techniques de mesure du NO dans les VAS............................................................ 47
5.2.1 Mesure du NO nasal ......................................................................................... 48
5.2.1.1 Technique en ventilation libre...................................................................... 48
5.2.1.2 Technique avec fermeture du voile du palais............................................... 49
5.2.1.3 Technique du « humming ».......................................................................... 49
5.2.1.4 Mesure du NO dans les sinus ....................................................................... 50
6 NO ET PATHOLOGIES DES VOIES AERIENNES SUPERIEURES................................................ 50
6.1 Rhinite allergique ..................................................................................................... 50
6.2 Polypose naso-sinusienne......................................................................................... 51
6.3 Sinusite ..................................................................................................................... 52
6.4 Le cas particulier de la sinusite aiguë nosocomiale en réanimation ........................ 53
6.4.1 Généralités........................................................................................................ 53
6.4.2 Place du NO dans la sinusite nosocomiale....................................................... 55
6.5 Dyskinésie ciliaire primitive (DCP)......................................................................... 57
6.6 Pan-bronchiolite diffuse ........................................................................................... 59
CHAPITRE II : OBJECTIFS ET CONDUITE DU TRAVAIL ..............61 1 OBJECTIFS ......................................................................................................................... 63
2 CONDUITE DU TRAVAIL ..................................................................................................... 63
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CHAPITRE III : RESULTATS EXPERIMENTAUX .........................65 1 PREMIER MEMOIRE ............................................................................................................ 67
2 DEUXIEME MEMOIRE ......................................................................................................... 69
3 TROISIEME MEMOIRE......................................................................................................... 70
CHAPITRE IV : DISCUSSION....................................................73 1 MESURE DU NO NASAL : QUELLE EST LA TECHNIQUE IDEALE ?......................................... 75
1.1 Mesure du NO dans les cavités sinusiennes............................................................. 75
1.2 Mesure du NO dans les cavités nasales.................................................................... 76
2 APPROCHE PHYSIOLOGIQUE DE LA PRODUCTION DE NO DANS LES VOIES AERIENNES
SUPERIEURES ............................................................................................................................. 77
2.1 Pourquoi le NO est-il élevé dans les sinus ? ............................................................ 77
2.2 Comment la concentration de NO s’élève-t-elle dans les sinus ? ............................ 78
2.3 Que se passe-t-il si le NO sinusien diminue ? .......................................................... 79
2.4 Le NO sinusien s’échappe-t-il des sinus ? ............................................................... 79
3 CONTROLE DE LA CONCENTRATION NASALE DE NO PAR LES GLUCOCORTICOÏDES............ 80
4 FACTEURS SUSCEPTIBLES DE MODIFIER LA CONCENTRATION NASALE DE NO CHEZ
L’HOMME.................................................................................................................................. 82
4.1 Présence de NO dans les cavités sinusiennes........................................................... 82
4.2 Rôle des enzymes et des substrats............................................................................ 83
4.2.1 Anomalie d’expression des NOS ..................................................................... 83
4.2.2 Anomalie de biodisponibilité du substrat......................................................... 85
4.3 Destruction du NO après sa synthèse....................................................................... 86
4.4 Anomalie de localisation subcellulaire de la NOS2................................................. 87
CHAPITRE V : CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .....89
BIBLIOGRAPHIE.......................................................................93
ANNEXES ..............................................................................109
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INTRODUCTION GENERALE
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17
Le monoxyde d'azote (NO) est un gaz radicalaire qui n’a longtemps été considéré que comme
un polluant atmosphérique. Chez les mammifères, le NO est produit par des enzymes
spécifiques. Il intervient dans de multiples circonstances telles le contrôle du débit sanguin
régional, la fonction plaquettaire, la défense immunitaire ou la transmission nerveuse.
Toutefois, le fait que le NO soit un gaz radicalaire hautement réactif rend sa mesure directe
fort improbable dans des tissus ; une approche indirecte doit dans ce cas être utilisée pour en
évaluer la production. A l’inverse, NO est stable à faible concentration en phase gazeuse. De
ce fait, le NO produit par des cellules tapissant la surface d’un organe creux pourra être
mesuré directement pour peu que l’on puisse prélever l’air se trouvant dans cet organe.
Ainsi en est-il des voies aériennes chez l’homme, où la présence de NO a été identifiée dès
1991. À ce niveau, le NO intervient dans la motilité ciliaire, l’inflammation, la défense anti-
infectieuse non spécifique, voire le contrôle du tonus bronchique et vasculaire pulmonaire.
Dans des conditions normales, la majorité du NO contenu dans l’air exhalé provient des voies
aériennes supérieures. C’est alors la NO-synthase de type 2 (NOS2) contenue dans les cellules
épithéliales ciliées qui produit le NO. Cet enzyme, habituellement « inductible » en réponse à
des stimuli inflammatoires, est là exprimée en permanence, sous l’influence de stimuli
incomplètement compris.
Les travaux présentés dans ce mémoire explorent trois situations particulières où la
production de NO dans les voies aériennes supérieures est susceptible d’être modifiée. Le
premier travail étudie l’effet des corticostéroïdes administrés par voie générale sur la
concentration nasale de NO ; cette question est justifiée par le fait que la transcription de la
NOS-2 « inductible » est habituellement inhibée par les corticostéroïdes. Un deuxième travail
a consisté à explorer l’effet d’une sinusite nosocomiale sur la concentration de NO dans les
sinus. Dans un troisième volet, on s’intéressera aux causes possibles de l’effondrement de la
concentration nasale de NO chez les patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive.
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CHAPITRE I
DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
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21
Le monoxyde d'azote (NO) est un gaz radicalaire. Il est généré dans l’organisme grâce à des
enzymes (les NO-synthases) à partir d’un substrat (la L-arginine) en présence de cofacteurs.
Une partie des effets physiologiques du NO passe par l’activation de la guanylate-cyclase
soluble qui génère un second messager, le GMP cyclique.
Le NO semble impliqué dans une multitude de fonctions au sein des voies aériennes : il joue
un rôle dans le contrôle du tonus des bronches et des vaisseaux pulmonaires, dans la sécrétion
du mucus et les mouvements des cils vibratiles, ainsi que dans la défense anti-infectieuse non
spécifique. Néanmoins, il persiste de nombreuses questions sur le contrôle de sa synthèse, tant
dans des conditions physiologiques que pathologiques.
L'objet des chapitres suivants est de faire le point sur les données actuelles concernant le
contrôle de la synthèse du NO dans les voies aériennes, son rôle physiologique et
pathologique, et la mesure de sa concentration au niveau des voies aériennes supérieures.
1 ASPECTS CHIMIQUES DU NO
1.1 Généralités
Le monoxyde d’azote est un gaz incolore à température et à pression ambiantes (point
d’ébullition à -157°C à une pression de 1 atm). C’est un radical neutre dont la structure
possède un électron non apparié. Dans la littérature, le NO est souvent écrit avec un point
(NO•) afin de souligner sa nature radicalaire. Dans la suite de cet exposé, le monoxyde
d’azote sera indifféremment noté « NO » ou « NO•».
La concentration de NO dans une solution exposée à une pression partielle de 1 atm (101.3
kPa) de NO gaz est 1.93 mM à 25°C et 1.63 mM à 37°C. Le radical NO• ne réagit pas avec
l’eau. En raison de sa nature assez peu soluble, sa solubilité est diminuée par l’augmentation
de la force ionique de la solution avec laquelle il est en contact ; on admet que la solubilité du
NO (pour une pression partielle de 1 atm) est de 1.55 mM dans des conditions physiologiques
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de force ionique et de température. Le coefficient de partage dans le système 1-octanol/eau est
de 6,5 ; cela suggère que la solubilité du radical NO est 6 à 7 fois plus élevée dans les
membranes que dans la phase aqueuse. Cette propriété hydrophobe lui permet d’être stocké
dans les membranes mais également de diffuser à travers celles-ci afin d’exercer ses fonctions
physiologiques [Malinski, Taha et coll. 1993]. Son coefficient de diffusion en phase aqueuse
est de 4,8 10-5 cm2 s-1 à 37°C ; cette valeur est comparable à celle d’autres gaz di-atomiques
de masse moléculaire comparable.
1.2 Réactions avec l’oxygène moléculaire
En solution aqueuse, en présence d’oxygène moléculaire, le radical NO peut générer plusieurs
espèces chimiques (NO2, N2O3, N2O4). Toutefois, le NO est essentiellement dégradé en
nitrites (NO2−) avec une proportion de nitrates (NO3
−) d’environ 2%. Dans ces conditions, la
demi-vie du NO est inversement proportionnelle à sa concentration [Ignarro, Fukuto et coll.
1993].
Aux concentrations physiologiques de 1µM et 10 nM, dans une solution saturée en oxygène à
température ambiante, sa demi-vie calculée serait respectivement de 9.3 minutes et 15 heures
33 minutes. Cependant, la demi-vie du NO n’est pas aussi élevée in vivo. En effet, le NO
réagit également avec des métaux de transition (fer des protéines héminiques en particulier) et
avec d’autres espèces radicalaires. Pour agir comme second messager, le NO doit se fixer à la
guanylate cyclase, ce qui est le cas pour une concentration d’ordre nanomolaire. A ce niveau
de concentration, la réaction du NO avec l’O2 pour former l’anion nitrite (NO2−) est lente : on
peut estimer que la demi-vie du NO (à une concentration de 10nM) en présence d’O2 (à une
concentration de 10µM) est de 106 s, et que le NO peut diffuser jusqu’à 26 cm de son point
d’origine. Toutefois, en raison de son interaction avec l’oxyhémoglobine (voir plus bas), on
estime que la demi-vie biologique du NO n’est plus que d’environ 5 s. Même durant ce laps
23
de temps, le NO peut diffuser suffisamment pour agir en tant que messager [Kharitonov,
Sundquist et coll. 1994 ; Beckman et Koppenol 1996].
1.3 Réaction avec les métaux de transition
Le NO peut se lier à des sites de coordination libre dans des complexes métalliques comme le
manganèse, le cuivre ou le fer, et former des complexes métalliques nitrosés, par oxydation ou
réduction directe des centres métalliques. Les cibles privilégiées du NO sont les
métalloprotéines, qu’elles renferment ou non un noyau héminique. Le NO présente une
grande affinité avec le fer ferreux avec lequel il se lie de façon réversible selon le schéma
suivant :
NO + Fe2+ ↔ Fe2+- NO
Cette interaction peut conduire à l’activation ou à l’inhibition de l’activité enzymatique de la
métalloprotéine. Le NO active spécifiquement la guanylate cyclase en entraînant la formation
d’un complexe de fer nitrosylé qui catalyse la formation de GMPc à partir de GTP [Tomita,
Ogura et coll. 1997]. Le NO se fixe de façon réversible sur l’hème de l’enzyme avec une
constante d’association de 7x108 M-1 s-1 et une constante de dissociation de 0.05 s-1. A
l’inverse de l’action sur la guanylate cyclase, l’interaction entre le NO et la partie héminique
des protéines appartenant à la famille des cytochromes P-450, NO-synthases, lipooxygénases
ou cytochrome oxydases conduit à une inhibition de l’activité enzymatique [Brown 1995 ;
Kharitonov, Russwurm et coll. 1997 ; Cooper 1999].
Le radical NO peut réagir avec des protéines non héminiques pour former des complexes
protéiques de fer dinitrosylés stables. Ces complexes pourraient contribuer à l’action
cytotoxique du NO à travers l’inhibition d’enzymes à cluster [Fe-S] mitochondriales ou
cytosoliques telles que les aconitases, la NADH-ubiquinone oxydoréductase, la succinate
ubiquinone oxydoréductase [Muller, Kleschyov et coll. 1996].
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L’interaction du NO avec des centres métalliques peut se traduire par des réactions
d’oxydation, comme dans le cas de l’oxyhémoglobine (Hb-O2) [Lancaster 1994]. Le
complexe Hb-O2 peut être représenté sous deux formes résonantes, Fe2+-O2 et Fe3+-O2-, cette
dernière étant prédominante. Le radical NO, en réagissant avec l’oxyhémoglobine, conduit à
la formation de methémoglobine (Fe3+- Hb) et de nitrates, selon la réaction :
[Fe2+-O2 ↔ Fe3+-O2-] + NO• → Fe3+ + NO3
−
La concentration élevée d’hémoglobine dans le sang et la diffusion rapide du radical NO font
que les nitrates sont les produits terminaux du métabolisme du radical NO in vivo.
Contrairement au monoxyde de carbone et à l’oxygène moléculaire, le NO est capable de se
lier de façon réversible au fer ferrique des protéines héminiques (avec une moindre affinité
que pour le fer ferreux) selon le schéma suivant :
Fe3++ NO• ↔ [Fe3+ - NO ↔ Fe2+ - NO+]
Le complexe résultant est très instable car deux formes mésomères peuvent exister. Le radical
NO peut agir en tant que réducteur du fer ferrique et acquiert un caractère NO+. Le complexe
peut être attaqué par des agents nucléophiles (B-) selon le schéma suivant :
[Fe3+ - NO → Fe2+ - NO+] + B- → Fe2++ B-NO
Ces agents nucléophiles peuvent être des thiols [Stamler, Simon et coll. 1992]. Cependant, le
NO ne réagit pas directement avec les thiols. La réaction nécessite un accepteur d’électron qui
est en général un métal de transition ou le radical NO2• :
NO + RSH → RSNO + H++ e-
Les nitrosothiols (RSNO) ainsi formés ont une demi-vie biologique plus longue (près de 40
minutes) que le radical NO (quelques secondes) : ils pourraient ainsi constituer des
« réservoirs » de NO et par conséquent augmenter la durée de son action.
25
1.4 Réaction avec le radical superoxyde
In vivo, la réaction entre le radical NO• et le radical O2−• conduit à la formation de
peroxynitrite. Certains composants nés de l’interaction de NO• avec O2−• ont des propriétés
oxydantes, mutagéniques et cytotoxiques contrastant avec les propriétés antioxydantes, anti-
inflammatoires et cyto-protectrices du NO. La vitesse d'interaction entre le NO• et l’ O2−• est
très grande, et cette réaction est 3 fois supérieure à celle de dismutation d’O2−• par la
superoxyde dismutase (SOD). Outre l'inactivation réciproque des 2 molécules, l'interaction
entre NO• et O2−• génère, sous réserve que les conditions stœchiométriques soient favorables
(rapport [NO] / [O2−•] =1), du peroxynitrite (ONOO−) qui peut se décomposer à son tour et
générer le radical hydroxyle (OH•) [van der Vliet, Eiserich et coll. 1999]. Ces composants
peuvent interagir avec les tissus, aboutissant à des liaisons covalentes avec toutes les classes
de molécules biologiques, ce qui peut en modifier la structure et/ou la fonction. De plus, le
peroxynitrite est capable de diffuser à travers les membranes (durée de vie d’environ 1
seconde) et d’induire des dommages oxydants éloignés du site de sa synthèse. Il peut initier la
peroxydation lipidique en arrachant un proton à un acide gras polyinsaturé et former des
lipides nitrés. Il peut encore inactiver des protéines fer-soufre (aconitases) participant au
métabolisme énergétique de la cellule. Le peroxynitrite pourrait ainsi pérenniser un processus
inflammatoire. L’interaction du peroxynitrite avec les résidus tyrosine des protéines aboutit à
la formation de résidus 3-nitrotyrosine, dont le dosage est couramment utilisé pour quantifier
les dérivés ONOO− dans différents états inflammatoires [Koppenol 1998].
26
2 ASPECTS BIOCHIMIQUES DE LA SYNTHESE DE NO
2.1 Les NO-synthases
Dans l’organisme, le NO est synthétisé par la voie enzymatique des NO-synthases (NOS)
[Andrew et Mayer 1999]. Les NO-synthases constituent une famille multigénique d'enzymes
qui sont traditionnellement considérées soit comme « constitutives » soit comme
« inductible » [Nathan et Xie 1994]. Les formes actives de NOS sont des homodimères. Les
NOS constitutives sont exprimées en permanence dans certaines cellules mais ne sont actives
que lorsque la concentration cytoplasmique de calcium augmente. Sont « constitutives » la
NO-synthase de type 1 (NOS-1 ou nNOS pour « NOS neuronale », les neurones étant les
premières cellules dans lesquelles l'enzyme a été isolée) et la NO-synthase de type 3 (NOS-3
ou eNOS pour « NOS endothéliale », car l'endothélium est le premier site dans lequel
l'enzyme a été isolée). Contrairement aux premières descriptions, la NOS-1 est présente
ailleurs que dans les neurones, tout comme la NOS-3 est présente ailleurs que dans les
cellules endothéliales.
Le macrophage mais aussi beaucoup de cellules de l'organisme, en réponse à des toxines
bactériennes (endotoxine des bacilles gram négatifs, acide lipoteichoïque et peptidoglycane
des cocci gram positifs) et à des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α, IFN-γ)
expriment une troisième isoforme qui est alors dite "inductible" (NOS-2 ou iNOS) ; son
activité est indépendante du calcium (voir plus bas).
Les trois isoformes de NOS sont caractérisées par des régions de forte homologie (les
domaines oxygénase et reductase), mais également par des caractéristiques reflétant la
spécificité de leur fonction in vivo.
27
2.1.1 NOS-1
La NOS-1 est exprimée de manière constitutive dans certains neurones [Boissel, Schwarz et
coll. 1998]. Son activité, mesurée dans la fraction cytosolique des neurones, dépend du
calcium et de la calmoduline [Griffith et Stuehr 1995]. La NOS-1 fut d’abord caractérisée
sous forme soluble mais peut aussi s’accrocher aux membranes, par l’intermédiaire d’un
fragment PDZ N-terminal, à des protéines telles que PSD-95, PSD-93 [Hecker, Mulsch et
coll. 1994] ou la syntrophine. La NOS-1 est très puissamment inhibée par la Protein Inhibitor
of NOS (PIN) qui est capable de déstabiliser les homodimères de NOS-1 et donc de rendre
l’enzyme inactive [Jaffrey et Snyder 1996].
Dans certaines régions du cerveau (dont la protubérance annulaire), de nombreux neurones
cholinergiques contiennent une activité NADPH-diaphorase caractéristique de l’activité des
NOS [Dawson, Bredt et coll. 1991]. Certaines données indiquent que la très grande quantité
de NOS-1 présente dans le pont pourrait être un élément de signalisation paracrine [Leonard,
Michaelis et coll. 2001].
La NOS-1 a également été mise en évidence au niveau de multiples tissus dans l’organisme.
Dans les voies respiratoires, le polymorphisme de la région promotrice du gène codant pour la
NOS-1 est associé à la concentration de NO dans l’air exhalé et a la colonisation bactérienne
chez les patients atteints de mucoviscidose [Grasemann, Knauer et coll. 2000 ; Grasemann,
Storm van's Gravesande et coll. 2002].
2.1.2 NOS-2
2.1.2.1 Données biochimiques
La NO-synthase de type 2 (NOS-2), encore appelée NOS inductible (iNOS) a été trouvée
initialement dans les macrophages murins, ainsi que dans les hépatocytes et les chondrocytes
humains [Nathan 1997]. On sait aujourd’hui que la NOS-2 est très largement distribuée dans
les cellules et les tissus de l’organisme. Chez l’Homme, son gène est localisé sur le
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chromosome 17. Son activité enzymatique ne dépend pas du calcium. Son expression dépend
de la fixation d’un facteur de transcription (NFκB) au niveau de l’ADN. Le NFκB est activé
après exposition à des composants bactériens (lipopolysaccharide, acide lipotechoïque) ou des
cytokines proinflamatoires (IL1, IL2, IL6 , TNFα et INFγ) [Kleinert, Wallerath et coll. 1998 ;
Ganster, Taylor et coll. 2001]. L’expression de la NOS-2 peut donc être induite par une
réaction inflammatoire [Bogdan 2001]. L’expression de la NOS-2 peut être bloquée par le NO
(provenant des NOS constitutives dans les conditions physiologiques ou par la NOS-2) qui
inactive le NFκB [Katsuyama, Shichiri et coll. 1998].
2.1.2.2 Effet des glucocorticoïdes sur la NOS-2
Dans les macrophages murins, l’expression de la NOS-2 est clairement activée par des
composants bactériens (lipopolysaccharide, acide lipotechoïque) ou des cytokines pro-
inflamatoires (IL1, IL2, IL6, TNFα, INFγ). Dans ces cellules murines, les glucocorticoïdes
(GCs) s’opposent à l’activation de la NOS-2. Les GCs entraînent une diminution de la
protéine NOS2 qui s’accompagne d’une diminution de la quantité d’ARNm dans les cellules,
en raison à la fois d’une diminution de la transcription du gène codant pour la NOS2 et d’une
plus grande dégradation de ces ARNm. De plus, les GCs agissent également en aval sur la
protéine NOS2 en diminuant la traduction des ARNm et en augmentant la dégradation de la
protéine NOS2 [Walker, Pfeilschifter et coll. 1997].
Le contrôle de l’expression de la NOS-2 par les cytokines (IFN-γ, IL-1β, TNF-α) dans les
macrophages humains semble différente de chez la souris. Ces différences sont attribuables au
moins en partie à des différences entre les régions promotrices. Alors que le facteur de
transcription NF-κB (nuclear factor κB) est d’une importance majeure dans l’induction de la
NOS2 murine, ce facteur semble d’une importance bien plus modeste chez l’homme [Zhang,
Laubach et coll. 1996 ; Chu, Marks-Konczalik et coll. 1998 ; Jeon, Han et coll. 1998].
L’expression de la NOS2 humaine semble surtout dépendre d’IFN-γ et de l’activation du
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facteur de transcription STAT-1 (signal transducers and activators of transcription-1) [Guo,
Uetani et coll. 1997].
L’effet des glucocorticoïdes (GCs) sur la NOS2 des cellules épithéliales respiratoires semble
également différent chez l’homme et chez la souris. Dans des cellules épithéliales ciliées
murines, la NOS2 est exprimée de façon « constitutive », et son expression est augmentée par
de multiples cytokines pro-inflammatoires, aboutissant à l’augmentation de la production de
NO. Les GCs diminuent cette production de NO, principalement en diminuant la quantité de
NOS2 dans les cellules [Robbins, Springall et coll. 1994]. Dans les cellules épithéliales ciliées
humaines, la NOS2 est également exprimée de façon « constitutive » et son expression est
augmentée par des cytokines pro-inflammatoires. Les cellules humaines normales perdent en
environ 24 heures la propriété d’exprimer « spontanément » la NOS2, suggérant l’existence
de facteurs locaux et/ou systémiques entretenant l’expression de la NOS2 [Guo, De Raeve et
coll. 1995]. De plus, à l’inverse des cellules murines, l’expression de la NOS2 par les cellules
épithéliales respiratoires humaines est insensible à l’action des GCs. Cette insensibilité aux
GCs est également observée dans d’autres situation chez l’homme, en particulier dans les
cellules épithéliales intestinales, tant dans des maladies inflammatoires [Leonard, Bishop et
coll. 1998] que sur des lignées cellulaires [Salzman, Denenberg et coll. 1996]. Même si
certaines cellules (fibroblastes synoviaux, chondrocytes, osteoblastes) cultivées en présence
d’IFN-γ, d’IL-1β et TNF-α voient leur expression de NOS2 baisser d’environ 30% sous
l’effet des GCs [Grabowski, Macpherson et coll. 1996], le degré d’inhibition de l’expression
de la NOS2 par les GCs reste en règle générale très inférieure chez l’homme par rapport à ce
qui est observé chez la souris [Donnelly et Barnes 2002].
2.1.3 NOS-3
L’activité enzymatique de la NOS 3 peut être modulée [Forstermann, Boissel et coll. 1998 ;
Li, Wallerath et coll. 2002]. Au niveau des vaisseaux, les forces de cisaillement modulent la
30
NOS3 en renforçant son activité [Arnal, Dinh-Xuan et coll. 1999]. Des médiateurs circulants
sont des facteurs majeurs pour contrôler non seulement l’activité de cette enzyme, mais
également la quantité de protéine et d’ARN messager correspondant. En effet, la stimulation
de récepteurs spécifiques d’agonistes variés (bradykinine, sérotonine, adénosine, ADP/ATP,
histamine, thrombine) peut augmenter l’activité de la NOS3 [Schini, Boulanger et coll. 1990 ;
Castro, Amorena et coll. 1998]. La phosphorylation des résidus sérine de la NOS3 est
essentielle pour contrôler son activité. Les conséquences de cette phosphorylation sont soit
une augmentation soit une réduction de son activité en fonction du type de kinase (Protéine
kinase A, Protéine kinase B encore appelée sérine/thréonine kinase Akt, de même que la
Protéine Kinase C) et du résidu sérine impliqués [Hirata, Kuroda et coll. 1995 ; Chen,
Mitchelhill et coll. 1999 ; Fulton, Gratton et coll. 1999 ; Gallis, Corthals et coll. 1999]. En
outre, plusieurs facteurs peuvent augmenter l’expression et/ou l’activité de la NOS 3, incluant
le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) [Kroll etWaltenberger 1998 ; Bouloumie,
Schini-Kerth et coll. 1999], l’insuline [Fleming, Schulz et coll. 2003], le Transforming
Growth Factor (TGF-β), l’Epidermal Growth Factor (EGF), ou encore de faibles
concentrations de LDL oxydées ou de son facteur athérogénique majeur le
lysophosphatidylcholine (lysoPC). D’autres facteurs sont connus pour réduire l’expression de
la NOS3, en particulier le TNF-α, l’érythropoïétine, l’hypoxie et des concentrations fortes de
LDL oxydées [Fleming etBusse 1999 ; Govers etRabelink 2001].
2.1.3.1 Effet des glucocorticoïdes sur la NOS-3
De façon plus anecdotique que pour la NOS2, il a été rapporté dans le cas particulier du
Syndrome de Détresse Respiratoire Aigu (SDRA) que les glucocorticoïdes (GCs) pouvaient
diminuer l’expression et l’activité de la NOS3 [Middelveld, Wanecek et coll. 1999 ;
Muzaffar, Shukla et coll. 2005].
31
2.2 Synthèse du NO par les NO-synthases
Les NO-synthases catalysent la formation du radical NO à partir d’un atome d’azote du
groupement guanidium de l’acide aminé (L)-arginine en consommant de l’oxygène
moléculaire et du NADPH selon la réaction suivante [Knowles et Moncada 1994] :
Notons que la molécule intermédiaire entre la L-arginine et la L-citrulline, la N-hydroxy-L-
arginine, a également une action inhibitrice sur les arginases (voir plus bas).
L’activité des NOS nécessite, outre les substrats, de nombreux cofacteurs
(tétrahydrobioptérine (BH4), flavine adénine dinucléotide (FAD), flavine mononucléotide
(FMN)) [Stuehr, Cho et coll. 1991]. L’activité des NOS « constitutives » (NOS-1 et NOS-3)
est subordonnée à la présence de calcium et de calmoduline. Dès qu’elle est synthétisée, la
NOS-2 est par contre active, et ce indépendamment des variations de calcium
intracytosolique : en effet, la calmoduline est très fortement liée à l’enzyme même en
l’absence de calcium [Bredt et Snyder 1990].
Les formes actives de NOS sont des homodimères [Crane, Arvai et coll. 1998]. Chaque
monomère comprend un domaine réductase en C-terminal liant NADPH et flavines et un
domaine oxygénase en N-terminal comportant le site catalytique, le site de fixation pour la
BH4 et l’hème. Ce dernier joue un rôle important pour la dimérisation de l’enzyme, tandis que
la liaison du BH4 stabiliserait la forme dimère [Rusche, Spiering et coll. 1998]. Le complexe
calcium/calmoduline (ou la calmoduline seule dans le cas de la NOS-2) se fixe entre le
32
domaine oxygénase et domaine réductase et contrôle le transfert d’électrons du domaine
réductase vers le domaine oxygénase pour permettre la réaction enzymatique [Albrecht,
Stegeman et coll. 2003].
Pour ce qui concerne la production de NO, on a longtemps opposé les NOS « constitutives »,
associées à la formation de faibles concentrations du radical NO• (de l’ordre du nanomolaire)
sur de courtes périodes, à la NOS « inductible » des macrophages, réputée conduire à des
concentrations 100 à 1000 fois plus importantes (de l’ordre du micromolaire) sur des périodes
de temps prolongées [Wink et Mitchell 1998]. Il est désormais établi que les 3 isoformes de
NOS ont une activité spécifique très voisine [Alderton, Cooper et coll. 2001], et que les
différences de NO produit sont en réalité liées à des phénomènes de contrôle post-
transcriptionnel (localisation subcellulaire, phosphorylation, …) [Kone, Kuncewicz et coll.
2003].
2.3 Rôle des NO synthases comme source d’anions superoxydes
Les NO-synthases sont également considérées comme une source potentielle d’ERO,
lorsqu’elles fonctionnent en mode appelé « découplé ». En effet, les études réalisées à l’aide
d’enzymes purifiées ou recombinantes ont montré que les NO-synthases sont capables de
générer des anions superoxydes dans des situations de déficit de son substrat, la L-arginine,
ou de ces cofacteurs d’activation, en particulier la tétrahydrobioptérine (BH4). Inversement,
dans des systèmes déplétés en BH4, la supplémentation en BH4 augmente la production de
NO et diminue celle d’anions superoxydes [Wever, van Dam et coll. 1997 ; Vasquez-Vivar,
Kalyanaraman et coll. 1998]. Il semble que lors d’un déficit en BH4 les électrons ne soient
pas correctement transférés du domaine réductase vers le site catalytique du domaine
oxygénase, et réagissent avec l’oxygène pour former des anions superoxydes. Lorsque les
NO-synthases fonctionnent en mode partiellement découplé, la production locale d’anions
33
superoxydes et de NO pourrait conduire à une production significative de peroxynitrites
[Goligorsky, Brodsky et coll. 2002 ; Kawashima etYokoyama 2004].
2.4 Métabolisme du substrat, la L-arginine
La L-arginine (aussi notée « arginine ») provient de trois sources : sa synthèse dans
l’organisme à partir de la citrulline, (principalement au niveau du tubule rénal proximal), la
dégradation des protéines absorbées dans l’alimentation et le turn over des protéines de
l’organisme. Pour sa synthèse à partir de la citrulline, deux enzymes du cycle de l’urée
(arginosuccinate lyase et arginosuccinate synthétase) sont impliquées.
Environ 40% de l’arginine absorbée dans l’alimentation est dégradée dans le tube digestif
avant de pouvoir être absorbée [Wu et Morris 1998]. En période de jeûne, environ 85% de
l’arginine qui pénètre dans la circulation sanguine provient de la dégradation de protéines
endogènes, les 15% restant provenant de la synthèse de novo. A l’échelle de l’organisme, la
majorité de l’arginine synthétisée de novo est le fruit d’une « collaboration métabolique »
entre l’intestin grêle et le rein. Cette synthèse de novo peut atteindre des niveaux tels que
l’arginine n’est pas considérée comme un acide aminé essentiel chez un adulte sain. En
revanche, cette synthèse peut s’avérer insuffisante chez des nourrissons, des enfants en
période de croissance, des adultes en phase de catabolisme important, ou lorsqu’il existe une
dysfonction des reins et/ou de l’intestin grêle. Cela explique que l’arginine soit considérée
comme un acide aminé semi-essentiel.
La synthèse de novo de l’arginine semble indépendante de son apport exogène et/ou de sa
synthèse via le catabolisme endogène [Castillo, Chapman et coll. 1993]. Cela signifie que
l’homéostasie de l’arginine se fait par le biais de sa dégradation, principalement via les
arginases. A titre d’exemple, on peut rapporter qu’un modèle de souris invalidée pour le gène
34
de l’arginase II voit sa concentration circulante d’arginine augmenter, sans que ces animaux
ne présentent de phénotype anormal par ailleurs [Shi, Morris et coll. 2001].
La synthèse de novo d’arginine peut également avoir lieu dans d’autres cellules que le rein, et
cette synthèse est alors majorée par diverses cytokines, en général en même temps qu’est
induite l’expression de NOS2 [Pastor, Morris et coll. 1995]. Dans ce cas, une partie de la
citrulline produite par la NOS est « recyclée » en arginine [Wu et Morris 1998].
La L-arginine est l’unique substrat des NOS ; sa biodisponibilité est donc indispensable à la
synthèse du NO. La concentration intracellulaire de L-arginine excède son Km pour les NOS
d’au moins 2 ou 3 fois. Cela signifie au moins deux choses : d’une part, que la concentration
de L-arginine ne devrait pas être un facteur qui limite l’activité des NOS et donc la production
de NO ; d’autre part, que l’administration exogène de L-arginine ne devrait pas influer sur
l’activité des NOS et la production de NO. Néanmoins, dans certaines conditions in vitro
(cellules endothéliales de patients diabétiques ou hypertendus) et in vivo (patients atteints de
dyskinésie ciliaire primitive), l’addition/administration de L-arginine augmente la production
de NO. Ce « paradoxe de l’arginine » suggère que des facteurs autres que la concentration
extra-cellulaire/circulante de L-arginine influencent la biodisponibilité de L-arginine pour les
NOS [Boger 2004]. Parmi ces possibles facteurs figurent le transport de la L-arginine de
l’extérieur vers l’intérieur des cellules, l’action des arginases (enzymes dégradant la L-
arginine), et l’action des inhibiteurs endogènes des NOS.
2.4.1 Le transport transmembranaire de l’arginine
Le transport transmembranaire de l’arginine est assuré par des transporteurs cationiques
d’acides aminés, notés CAT pour « cationic amino-acid transporter ». Ce sont des protéines
transmembranaires (CAT2A, CAT2B, CAT3 et CAT4) qui transportent la L-arginine, L-lysine
et la L-ornithine [Kim, Closs et coll. 1991]. Elles sont contrôlées à différents niveaux (mais
sont indépendantes du pH), et sont saturables [Mann, Yudilevich et coll. 2003]. Les CAT
35
assurent un transport actif de la L-arginine depuis le compartiment extracellulaire vers le
compartiment intracellulaire afin de compenser sa dégradation, cette dernière étant le fait soit
des arginases, soit des NOS. Dans des situations d’inflammation, on observe une induction
parallèle de la CAT2 et de la NOS2 dans des cellules inflammatoires, les deux protéines étant
indispensables à la synthèse de NO. De plus, dans les mêmes situations d’inflammation, on
assiste à une augmentation de l’expression des arginases (ARG). Le couple ARG–CAT,
lorsqu’il est actif (situation inflammatoire par exemple) est à l’origine de la majorité de la
consommation de l’arginine circulante (et/ou extracellulaire) [Bronte et Zanovello 2005]. Des
macrophages de souris stimulés par IL-4 ou IL-13 connaissent une stimulation
contemporaine de l’expression d’ARG1 et de CAT2B, ce qui entraîne une diminution de la
concentration sérique d’arginine en dessous du niveau présumé normal de 50–150 µM. Cette
consommation d’arginine semble influencer la fonction lymphocytaire T [Rodriguez, Zea et
coll. 2003 ; Bronte et Zanovello 2005].
2.4.2 Les arginases
2.4.2.1 Données physico-chimiques
Les arginases sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse de l’arginine en ornithine et en
urée. Deux isoformes d’arginases ont été identifiées chez les mammifères. Les deux isoformes
d’arginase ont une distribution tissulaire, cellulaire et sub-cellulaires distincte. Leur
homologie, en terme d’acides aminés, est de 60%. Leur structure tridimentionnelle, attestée
par leur structure cristallographique, est toutefois extrêmement superposable [Cama,
Colleluori et coll. 2003]. Elles sont actives sous forme d’homotrimères. Leur activité dépend
de la présence de deux atomes de manganèse (Mn) au site catalytique de l’enzyme. Ces
atomes de manganèse vont permettre la fixation du substrat (l’arginine) puis son hydrolyse.
L’activité des arginases est fortement diminuée dans des milieux déplétés en Mn [Wu
etMorris 1998 ; Cederbaum, Yu et coll. 2004].
36
En terme de cinétique enzymatique, les arginases ont une constante de dissociation (KD)
environ 100 fois plus grande pour leur substrat (l’arginine) que les NO-synthases. Elles ont
cependant une activité (Vmax) également 1000 fois plus importante [Boucher, Custot et coll.
1994].
Dans la mesure où Vmax et KD sont reliés par l’équation de Michaelis :
v = Vmax . [S] / ([S] + KD)
où [S] est la concentration de substrat et v la vitesse de la réaction enzymatique, on peut
considérer que les arginases et les NO-synthases ont environ la même vitesse de réaction avec
l’arginine [Wu et Morris 1998].
2.4.2.2 Inhibiteurs des arginases
Le fait que le produit intermédiaire de l’interaction entre les NO-synthases et la L-arginine, la
Nω-hydroxy-L-arginine (NOHA), soit également un inhibiteur compétitif des arginases
souligne les liens physiologiques qui existent entre arginases et NO-synthases [Suschek,
Schnorr et coll. 2003].
Plusieurs produits de synthèse ont été testés quant à leur activité inhibitrice sur les arginases
[Boucher, Custot et coll. 1994]. Leur structure se base sur celle de l’hydroxy-arginine. Le
produit qui aujourd’hui se révèle le plus efficace est la nor-Nω-hydroxy-L-arginine (nor-
NOHA). La nor-NOHA a Ki un environ 40 fois plus faible que la NOHA [Tenu, Lepoivre et
coll. 1999].
En plus de son activité inhibitrice sur les arginases, la nor-NOHA peut augmenter la
production de NO. Pour des concentrations de nor-NOHA allant de 5 à 20 µM environ, le NO
est produit par les NO-synthases. On estime alors que la nor-NOHA augmente la
biodisponibilité de la L-arginine pour les NO-synthases (la nor-NOHA n’est pas un substrat
des NOS) [Mansuy et Boucher 2004]. Pour des concentrations supérieures, le NO est produit
par une voie indépendante des NOS [Beranova, Chalupsky et coll. 2005]. En effet, plusieurs
37
auteurs ont démontré, sur des anneaux aortiques isolés, une vasodilatation dépendante du NO
(activation de la guanylate-cyclase, détection de NO par résonance paramagnétique
électronique) sans mise en jeu des NO-synthases (absence d’effet des inhibiteurs compétitifs
des NOS). Même si les mécanismes aboutissant à la formation de NO à partir de nor-NOHA
restent incomplètement élucidés, il semble que la production de NO passe par l’intermédiaire
de celle d’hydroxylamine [Vetrovsky, Boucher et coll. 2002].
2.4.2.3 Arginase 1
L’arginase de type 1 (arginase I ou « ARG1 ») est une enzyme cystoplasmique,
principalement exprimée dans le foie où elle participe au cycle de l’urée. Le gène codant pour
ARG1 (aussi appelée « arginase hépatique ») est situé sur le bras q23 du chromosome 6. C’est
un homotrimère de 105kDa, chacune des 3 sous-unités de 35 kDa contenant deux atomes de
manganèse (Mn) nécessaires à l’activité de l’enzyme. L’expression de l’arginase I est induite
dans les cellules myeloïdes de souris par l’exposition aux cytokines TH2 IL-4 et/ou IL-13,
ainsi que par le transforming growth factor-β (TGF-β), le macrophage-stimulating protein (par
l’intermédiaire du « récepteur d’origine nantais », RON) ou le GM-CSF [Morrison et Correll
2002]. La région 5’ du gène murin codant pour ARG1 contient des éléments qui contrôlent la
transcription en réponse à l’IL-4, l’AMPc, le TGF-β, la dexamethasone et le
lipopolysaccharide (LPS) [Morris 2002]. Le facteur de transcription le plus important pour
ARG1 est STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6), bien qu’il semble
exister des voies indépendantes de STAT6 [Sinha, Clements et coll. 2005]. Ainsi, STAT1
serait indispensable pour induire l’expression à la fois de ARG1 et de NOS2 [Wang,
Jenkinson et coll. 1995]. Il est également possible que le contrôle de l’expression d’ARG1
soit spécifique d’espèce. En effet, il a récemment été montré chez l’homme qu’ARG1 est
exprimée de façon constitutive par les granulocytes, mais que cette expression n’était pas
majorée par les stimuli qui induisent ARG1 chez la souris [Munder, Mollinedo et coll. 2005].
38
L’induction de l’expression d’ARG1 dans différents systèmes biologiques est strictement liée
à l’induction de transporteurs membranaires de L-arginine, indiquant que ces deux enzymes
font partie d’une même unité de fonction (voir plus haut).
Comme le foie est le seul tissu possédant l’ensemble des enzymes du cycle de l’urée, la raison
de la présence d’arginase extrahépatique reste source de débats. Une raison invoquée est la
production de L-ornithine, qui est un précurseur de polyamines et de proline impliquées dans
la croissance cellulaire et la réparation tissulaire. Un déficit constitutionnel en arginase I
entraîne une hyperargininémie, maladie caractérisée par un retard mental, un retard staturo-
pondéral, une spasticité musculaire et, parfois, une hyperammoniémie pouvant être fatale [Wu
et Morris 1998].
2.4.2.4 Arginase 2
L’arginase de type 2 (arginase II ou « ARG2 ») est une enzyme mitochondriale exprimée dans
les tissus autres que le foie. Le gène codant pour l’arginase II est situé sur le bras q24 du
chromosome 14. ARG2 (aussi appelée « arginase rénale ») est localisée dans la membrane
externe (cytosolique) des mitochondries de multiples cellules dont les cellules du tube
contourné rénal, la prostate, les neurones, les macrophages et les entérocytes. ARG2 est
exprimée de façon constitutive. L’ornithine produite par AGR2 est présumée être orientée
vers la synthèse de L-proline dans la mesure où ARG2 co-existe, dans la mitochondrie, avec
l'ornithine aminotransferase. La proline et/ou de polyamines (putrescine, spermidine,
spermine) ainsi produits contrôlent la prolifération cellulaire et la production de collagène.
Aucune maladie humaine causée par un déficit en arginase 2 n’a pas été décrite à ce jour [Wu
et Morris 1998].
Dans certaines conditions, l’arginase II intervient pour contrôler l’activité des NOS en
modulant la biodisponibilité intracellulaire de la L-arginine. Dans un modèle de macrophages
de souris (RAW 264.7) stimulés par du LPS et de l’interferon γ, l’induction de NOS2 conduit
39
à une élévation de la production de NO et à l’apoptose. L’ajout de dexamethasone et d’AMPC
permet une stimulation de la synthèse d’ARG2 qui conduit à une diminution de la production
de NO via une baisse du substrat [Morris 2002].
2.4.2.5 Effet des glucocorticoïdes sur les arginases
Dès 1982, Haggerty et al. ont rapporté une augmentation de l’expressoin d’arginase I par les
glucocorticoïdes (GCs) sur des cellules hépatiques immortalise en culture [Haggerty, Spector
et coll. 1982]. Plus récemment, Klasen et al. ont montré que dans des macrophages murins
préalablement stimulés par des lipopolyssacharides (LPS) afin d’augmenter l’expression
d’arginase I et d’arginase II, ces deux isoformes voyaient leur expression diminuée par les
GCs [Klasen, Hammermann et coll. 2001]. De plus, dans ce même modèle, l’activité arginase
induite par les LPS est diminuée par la dexamethasone. De même, sur des cellules
musculaires lisses vasculaires, l’expression d’arginase I induite par IL-4 and IL-13 est
diminuée par les GCs [Wei, Jacobs et coll. 2000].
Pour approcher les raisons pour lesquelles les GCs ont un effet opposé sur l’expression
d’arginase selon les modèles et/ou les cellules, plusieurs points méritent d’être rappelés.
Premièrement, il n’existe pas d’élément de réponse aux GRs (GRE, pour « glucocorticoid
responsive element ») dans la région promotrice des genes codant pour les arginases.
L’augmentation de l’arginase I par les GCs dans les hépatocytes est donc indirecte, médiée
par l’induction de CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) [Gotoh, Chowdhury et coll.
1997], dont l’induction, médiée par les GCs, augmente l’expression de plusieurs autres gènes
[van Ooij, Snyder et coll. 1992]. Deuxièmement, les GCs exercent leurs effets non seulement
en induisant l’expression de gènes (trans-activation) mais également en réprimant l’action de
facteurs de transcription tels AP-1 or NF-B (trans-répression) [Adcock etIto 2000]. C’est ce
dernier mécanisme qui est avancé pour expliquer la diminution d’arginase I induite par les
LPS.
40
Le mécanisme par lequel les GCs inhibent l’arginase II a été moins étudié. Il semble que,
comme c’est le cas pour la NOS2, les GCs puissent diminuer la stabilité des ARNm codant
pour l’arginase II et donc l’expression de l’enzyme [Kunz, Walker et coll. 1996 ; Walker,
Pfeilschifter et coll. 1997 ; Klasen, Hammermann et coll. 2001].
2.4.3 Les inhibiteurs endogènes des NOS
La synthèse du NO est sélectivement inhibée par des analogues « guanidino-substitutés » de
la L-arginine, dont la NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) et la diméthylarginine
« asymétrique » (ADMA, pour « asymmetric dimethylarginine »). La diméthylarginine
« symétrique » (SDMA, pour « symmetric dimethylarginine »), le stéréoisomère inactif de
l’ADMA, n’inhibe pas directement les NOS mais est capable d’interférer avec la synthèse du
NO en entrant en compétition avec l’arginine, la MMA et l’ADMA quant au transport
transmembranaire via les CAT (cationic amino acid transporters), protéines
transmembranaires du système y+ (voir plus haut). Dans la mesure où la concentration
d’ADMA est environ 10 fois plus élevée que la concentration de MMA, l’ADMA est
considérée comme le principal inhibiteur endogène de la synthèse du NO [Vallance et Leiper
2004].
ADMA et L-NMMA sont des produits de la dégradation de protéines cellulaires contenant des
résidus arginines méthylés. En effet, à une étape post-traductionnelle de la maturation des
protéines intracellulaires, les atomes d’azote des résidus arginine peuvent subir (à partir d’un
donneur de groupement méthyle comme la méthionine) une mono- ou une di-méthylation
suite à l’action d’une protéine arginine méthyltransferase (PRMT). Ces protéines méthylées
sont principalement retrouvées au niveau nucléaire où elles jouent un rôle dans la maturation
de l’ARN et dans le contrôle transcriptionnel [Najbauer, Johnson et coll. 1993]. ADMA est
produite par la PRMT de type 1 et SDMA par la PRMT de type 2. Les deux types de
méthyltransferase sont capables de former le L-NMMA [Vallance et Leiper 2004]. Les
41
méthylarginines sont libérées dans le cytosol lorsque les proteins sont hydrolysées ; leur
existence est donc intiment liée au turn over protéique. La quantité d’ADMA produite
dépend donc de la quantité de résidus arginine ayant subi une méthylation au sein des
protéines, ainsi que du turn over de ces protéines. De plus, il est vraisemblable que la
concentration plasmatique d’ADMA ne soit que le reflet du « déversement » dans la
circulation et ne soit qu’un mauvais reflet de la concentration cytosolique.
Les reins jouent un rôle important dans l’élimination des diméthylarginines par le biais de
l’excrétion urinaire d’ADMA et de SDMA. Une autre voie d’élimination de l’ADMA est sa
conversion par la diméthylarginine diméthylaminohydrolase (DDAH) en citrulline et
dimethylamine. L’enzyme DDAH est largement représentée dans l’organisme humain, plus
particulièrement dans le pancreas, la rate, les reins et les cellules endothéliales. Chez
l’Homme, on peut estimer qu’environ 300 µmol d’ADMA sont produites chaque jour, et
qu’environ 80% sont métabolisées par la DDAH [Achan, Broadhead et coll. 2003].
L’inhibition de la DDAH entraîne une vasoconstriction d’anneaux artériels, celle-ci étant
annulée par l’adjonction d’arginine, ce qui indique que la regulation intracellulaire de
l’ADMA par la DDAH joue sur l’activité des NOS [MacAllister, Parry et coll. 1996]. Un
autre argument vient de ce que des souris surexprimant la DDAH humaine ont une
concentration plasmatique d’ADMA qui est basse ainsi qu’une activité NOS qui s’élève,
confirmant le rôle important de l’ADMA endogène dans le contrôle de l’activité des NOS
[Dayoub, Achan et coll. 2003].
Il existe 2 types de DDAH ; le type 1 est retrouvé dans les tissus exprimant la NOS1, et le
type 2 dans les tissus exprimant la NOS3 [Tran, Fox et coll. 2000]. Le contrôle de
l’expression et de l’activité de ces deux types de DDAH est incomplètement élucidée. Il
semble toutefois que l’expression et de l’activité DDAH soit fonction des organes examinés,
42
et ce afin de contrôler le tonus vasculaire via la synthèse du NO dans différentes situations
physiopathologiques.
3 NO ET DEFENSE ANTI-INFECTIEUSE
3.1 NO et bactéricidie
Le NO intervient dans les mécanismes de défense « innés », non spécifiques, mis en jeu par
l’organisme en réponse à une agression bactérienne, virale ou fongique [Bang, Speck et coll.
1996 ; Nathan et Shiloh 2000]. Ces défenses consistent en l’afflux de cellules (polynucléaires,
monocytes/macrophages) produisant des dérivés toxiques hautement réactifs impliquant trois
voies enzymatiques : la voie des NO-synthases ; la voie de la NADPH-oxydase (oxydase
phagocytaire) permettant la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), dont le
radical superoxyde O2−• ; la voie de la myéloperoxydase qui génère HOCl aboutissant, après
interaction avec l’anion nitrite, à ClNO2 [Bang, Speck et coll. 1996].
La présence de ces différents composants a plusieurs conséquences. Pour ce qui concerne la
défense contre les bactéries, il semble que le NO et les ERO agissent de façon
complémentaire. Dans des modèles de souris invalidées soit pour la production
macrophagique d’ERO (gp91(phox-/-)), soit pour la NOS-2, il a été montré que chaque déficit
isolé entraîne une susceptibilité accrue à certaines infections, alors que les deux déficits
combinés sont incompatibles avec la survie [Shiloh, MacMicking et coll. 1999]. In vitro,
certaines bactéries à développement intra-macrophagique sont insensibles à NO ou aux ERO
isolément, mais sont tuées par l’administration conjointe de NO et d’ERO dès lors que se
forme du peroxynitrite [Xia et Zweier 1997]. De plus, les ERO, le NO et le peroxynitrite
semblent dans certaines circonstances intervenir successivement dans un processus
dynamique permettant au macrophage de tuer la bactérie.
43
Le NO intervient également dans la défense anti-infectieuse indépendamment de la
phagocytose. In vitro, le NO inhibe de façon concentration-dépendante la croissance d'un
certain nombre de bactéries [Mancinelli et McKay 1983]. In vivo, dans un modèle de
pneumopathie à P. aeruginosa chez le rat, l'inhalation de NO permet de diminuer la charge
bactérienne pulmonaire associée à une diminution de l’afflux de polynucléaires neutrophiles
(PNN) pulmonaires [Webert, Vanderzwan et coll. 2000]. Sur un modèle identique, Jean et
coll. observaient, en réponse à l’inhalation de NO, un recrutement de PNN dans le
compartiment alvéolaire (ces PNN ayant conservé leur fonction) ainsi qu’un effet bactéricide
direct du NO. Les auteurs évoquaient l’augmentation de l’activité ciliaire pour expliquer une
partie de la clairance bactérienne. Malgré ces effets antibactériens, l’inhalation de NO
n’améliorait toutefois pas la survie des animaux [Jean, Maitre et coll. 2002].
3.2 NO et défense anti-virale
Plusieurs arguments figurent le rôle du NO dans la défense antivirale.
Parmi les arguments indirects, on rapporte l’infection expérimentale par un virus (influenzae
ou rhinovirus 16) chez l’Homme entraîne une augmentation de la concentration de NO dans
l’air exhalé. De façon plus directe, le fait d’infecter des souris in vivo ou des cellules
épithéliales respiratoires humaines ex vivo par le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus
Hong Kong influenza A (H3N2) virus ou l’Adenovirus augmente l’expression de NOS2
(ARNm et protéine) ainsi que l’activité NOS dans les cellules ciliées [Kao, Piedra et coll.
2001 ; Zsengeller, Ross et coll. 2001].
Le NO produit par la NOS2 a une action antivirale directe, que ce soit sur des virus à ADN ou
à ARN. Des donneurs de NO inhibent la replication et la latence sur les virus coxsackie,
influenza A and B, rhinovirus, cytomegalovirus, vaccinia virus, ectromelia virus, human
herpesvirus-1. Inversement, une diminution de l’activité NOS entraîne une augmentation de la
44
replication virale, ainsi qu’une plus grande gravité de l’infection [Lepoivre, Fieschi et coll.
1991]. Comparées à des souris sauvages, des souris dont le gène codant pour la NOS2 a été
invalidé présentent une plus forte mortalité ainsi qu’une baise de la clairance virale en cas
d’infection par le CMV ou le coxsackie B4 [Noda, Tanaka et coll. 2001]. De même, des
souris traitées par un inhibiteur compétitif de la NOS2 connaissent une augmentation de la
réplication et de la latence virale [Kosugi, Kawasaki et coll. 2002].
À haute concentration, le NO inhibe directement ou indirectement (par le biais de son
interaction avec les radicaux libres oxygénés) une inhibition dans la transcription et de la
traduction des protéines virales en agissant sur des cibles nésessaires à ces deux étapes. Les
cibles en question sont principalement la ribonucléotide réductase (enzyme critique dans la
synthèse d’AND viral) et la protease virale (impliquée dans la réplication) [Akerstrom,
Mousavi-Jazi et coll. 2005].
3.3 Rôle du NO dans la clairance mucociliaire
Les voies aériennes sont tapissées par un épithélium cilié pseudo stratifié recouvert par une
couche de mucus. Dans des conditions normales, les cils vibratiles sont animés de
mouvements permanents coordonnés qui permettent de faire converger le mucus vers les
voies aériennes supérieures. Cela constitue la clairance mucociliaire. L’évacuation du mucus
permet d’éliminer des particules étrangères et/ou des micro-organismes qui auraient pu
pénétrer dans les voies respiratoires. La diminution de la clairance mucociliaire peut être due
à une anomalie de composition du mucus (trop "visqueux" par absence de la couche liquide
périciliaire, comme dans la mucoviscidose), à une anomalie de la structure et/ou de fonction
des cils vibratiles (dyskinésie ciliaire, primitive ou secondaire à des infections chroniques)
et/ou à une obstruction des ostia dans le cas des sinus paranasaux (présence d’un corps
étranger intra-nasal, inflammation de la muqueuse) [Randell et Boucher 2006].
45
Ces mouvements ciliaires sont simulés par plusieurs voies métaboliques. Parmi les seconds
messagers impliqués, on retient le NO, l’AMPc et le GMPc. Ces deux derniers activent des
protéines kinases, respectivement des PKA (protéines kinases dépendant de l’AMPc) et des
PKG (protéines kinases dépendant du GMPc). L’activation des battement ciliaires par le NO
implique l’activation d’une guanylate cyclase. En effet, les inhibiteurs de la synthèse de NO
diminuent profondément la fréquence des battements ciliaires.
La production de NO dans les cellules ciliées permet de moduler la fréquence des battements
ciliaires par une action directe sur les bras de dynéine contenus dans les cils. Le NO permet
l’activation d’une guanylate cyclase produisant de la guanosine monophosphate cyclique
(GMPc), qui à son tour active une protéine kinase G permettant une phosphorylation.
L’activation de cette protéine G induit deux types de réponses. D’une part, elle induit un
influx de calcium entraînant une activation de l’adenosine triphosphatase de la dynéine.
D’autre part, elle active des protéines associées à la dynéine axonale des cils vibratiles,
augmentant ainsi indirectement l’activité de l’adenosine triphosphatase de la dynéine [Blum,
Hayes et coll. 1980 ; Uzlaner et Priel 1999].
La fréquence des battements ciliaires semble influencée par la concentration de NO. En effet,
cette fréquence est de 17 Hz dans les cellules épithéliales de sinus paranasal humaines (où la
concentration de NO et l’expression de NOS2 sont élevées) et de 11 Hz dans des cellules
humaines prélevées dans les cavités nasales (où la concentration de NO et l’expression de
NOS2 sont plutôt faibles). De plus, l’adjonction de L-arginine dans le milieu de culture
augmente la fréquence des battements sur des cellules ciliées prélevées dans le sinus
sphénoïde de patients. Enfin, un donneur de NO (le nitroprussiate de sodium) augmente la
fréquence des battements ciliaires dans le sinus maxillaire chez le lapin [Chilvers et
O'Callaghan 2000 ; Alberty, Stoll et coll. 2006].
46
4 ROLE DU NO PROVENANT DES VAS DANS LE CONTROLE DU
TONUS VASCULAIRE ET BRONCHIQUE
Le NO est un puissant vasodilatateur. Il intervient dans le contrôle du tonus artériolaire et
veinulaire pulmonaires. En physiologie, il semble que le NO impliqué dans le contrôle du
tonus vasculaire soit principalement produit par la NOS-3 de l'endothélium vasculaire
pulmonaire. Toutefois, des auteurs ont suggéré que le NO inhalé à partir des voies aériennes
supérieures pourrait également avoir une action vasodilatatrice pulmonaire chez l'Homme
[Lundberg 1996].
Le NO peut également moduler la réponse contractile du muscle lisse bronchique. Ces
données son principalement le résultat d'études animales. Chez la souris, les 3 isoformes de
NOS sont exprimées en permanence, mais seule la NOS-3 semble significativement moduler
(inhiber) la réponse contractile à la métacholine in vivo [Nathan et Xie 1994].
5 MESURE DU NO DANS LES VOIES AERIENNES SUPERIEURES
Le NO n'a longtemps été considéré que comme un polluant atmosphérique, présent dans les
gaz d’échappement des automobiles et dans la fumée de cigarette. Pour surveiller sa
concentration dans l'air ambiant de nos villes, des appareils de mesure robustes et sensibles
ont été depuis longtemps développés. Bien que l’on sache depuis le début des années 1980
que l’endothélium produit un facteur vasodilatateur (appelé EDRF pour « endothelial-derived
relaxing factor »), ce n’est qu’en 1987 que cet EDRF fut identifié comme étant du NO. Il a
fallu attendre 1991 pour que la présence de NO dans les voies respiratoires sous-glottiques
soit rapportée [Gustafsson, Leone et coll. 1991]. En 1995, Lundberg et coll. montrent que la
concentration de NO dans les sinus paranasaux est de l'ordre de 10 ppm, c'est à dire très
47
supérieure aux concentration considérées comme toxiques dans l'air ambiant [Lundberg,
Farkas-Szallasi et coll. 1995].
5.1 Aspects technologiques de la mesure du NO
Des techniques de référence (spectrométrie de masse et chromatographie en phase gazeuse)
ont servi à mettre en évidence la présence de NO dans les voies respiratoires.
Le plus souvent, le NO est mesuré par une technique de chemiluminescence [Zafiriou,
McFarland et coll. 1980]. Le détection du NO est alors basée sur la réaction photochimique
entre le NO et l’ozone généré par le « four » de l’analyseur. Le NO contenu dans un
échantillon d’air réagit avec l’ozone (produit en excès) pour générer du NO2 avec un électron
excité (noté NO2*). NO2
* retourne à son état d’équilibre en émettant un rayonnement
photonique d’une longueur d’onde comprise entre 600 et 3000 nm. La quantité de photons
produite est proportionnelle à la concentration de NO dans l’échantillon. La
chemiluminescence est détectée par un tube photomultiplicateur qui convertit l’intensité de la
luminescence en un signal électrique qui, après étalonnage de l’appareil, donne la
concentration de NO [Archer 1993].
Des techniques électrochimiques, plus faciles et moins onéreuses, sont en train de voir le jour
en pratique clinique. Leur principe est basé sur l’oxydation électrochimique de NO sur des
électrodes solides, le courant produit étant proportionnel à la concentration de NO
[Ricciardolo 2003].
5.2 Techniques de mesure du NO dans les VAS
Dans des conditions normales, la fraction de NO dans les fosses nasales reflète à la fois le NO
produit par les fosses nasales et le NO produit par les sinus. En effet, les sinus frontaux,
maxillaires et ethmoïdaux sont des cavités qui communiquent entre elles et s’ouvrent dans les
48
fosses nasales par un orifice étroit appelé « ostium ». Chez les sujets dont les sinus paranasaux
sont présents et dont les ostia sont perméables, la fraction nasale de NO est proportionnelle à
la fraction de NO retrouvée dans les sinus [Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995]. Certains
auteurs considèrent que du NO en provenance de la cavité buccale et des voies aériennes
inférieures peuvent fausser la mesure en « contaminant » l’air des fosses nasales. On peut
s’affranchir de cette « contamination » en provoquant la fermeture du voile du palais au
moment de la mesure du NO nasal, ce qui isole la cavité nasale de la cavité buccale.
5.2.1 Mesure du NO nasal
Plusieurs techniques sont utilisées pour mesurer la concentration de NO dans les fosses
nasales. Pour toutes les méthodes, une aspiration d’air nasal crée un flux trans-nasal constant
[Palm, Graf et coll. 2000]. La courbe de concentration de NO dans l’air aspiré en fonction du
temps inscrit une première phase d’augmentation (correspondant au « washout ») suivie d’un
plateau. On considère en général que la fraction de NO dans l’air aspiré est proportionnelle à
la fraction de NO dans les fosses nasales et inversement proportionnelle au débit d’aspiration.
5.2.1.1 Technique en ventilation libre
La mesure s’effectue en aspirant de l'air à débit constant connu dans une narine. Un petit
tuyau est introduit dans une fosse nasale. Il est entouré de mousse plastique permettant
l'occlusion de la narine est introduit d’un côté alors que la narine controlatérale reste
perméable. Pendant l'aspiration, on demande au patient de ventiler la bouche ouverte sans
déglutir et sans parler. Par conséquent, l’air aspiré provient principalement de la narine laissée
perméable et minoritairement de la bouche. De l’air ambiant (exempt de NO) pénètre dans la
narine laissée perméable et se « charge » en NO au fur et à mesure qu’il est aspiré vers la
narine occluse. La fraction de NO dans l’air aspiré est donc proportionnelle à la fraction de
NO dans les fosses nasales et inversement proportionnelle au débit d’aspiration.
49
La mesure est réalisée, dans chaque fosse nasale, avant et après l'administration d'un
vasoconstricteur nasal. En effet, l’existence d’une congestion de la muqueuse nasale peut
contrarier le passage de l'air depuis les sinus vers le nez ; dans ce cas, la fraction nasale de NO
sous-estime la « participation » sinusienne au NO mesuré [Arnal, Flores et coll. 1999].
5.2.1.2 Technique avec fermeture du voile du palais
La technique d’aspiration nasale est la même que ci-dessus. Pendant l’aspiration d’air nasal, le
patient réalise une des 4 manœuvres suivantes visant à fermer le voile du palais : expiration
lente contre une résistance ; expiration lente lèvres pincées ; apnée volontaire avec fermeture
du voile (manœuvre de Valsalva) ; fermeture volontaire du voile. Durant l’aspiration, on
mesure la concentration de CO2 dans l’air recueilli, qui doit être proche de zéro si l’occlusion
du voile est efficace [Kimberly, Nejadnik et coll. 1996 ; Silkoff, McClean et coll. 1997].
5.2.1.3 Technique du « humming »
En 2003, Lundberg et coll. décrive le fait que le « humming » nasal (qui consiste à émettre un
son en expirant par le nez sans desserrer les lèvres ni prononcer de mot) entraîne une
augmentation importante et rapide de la concentration nasale de NO. Dans ces conditions, la
courbe de concentration de NO en fonction du temps inscrit trois phases : une courte période
de « washout » (rinçage) ; une augmentation rapide jusqu’à un pic ; une décroissance lente
jusqu’à un plateau. Le plateau serait le reflet de la production continue de NO par la
muqueuse nasale et par la muqueuse sinusienne. Pour expliquer le pic, on admet que le
« humming » entraîne un passage rapide de l’air contenu dans les sinus (qui renferment des
concentrations élevées de NO) vers les fosses nasales, ce qui explique le pic initial. En effet,
quand plusieurs manœuvres de humming consécutives sont effectuées à 5 secondes
d’intervalle, la quantité de NO recueillie baisse à chaque manœuvre ; au bout de 4
manœuvres, le pic totalement disparu ; une période de 3 minutes est nécessaire pour observer
de nouveau le pic de NO. On considère que les sinus paranasaux « stockent » de l’air
50
contenant de fortes concentrations de NO, que les manœuvres de humming « rincent » les
sinus, et qu’il faut quelques minutes pur que les sinus « reconstituent » leur stock de NO
[Lundberg, Maniscalco et coll. 2003].
5.2.1.4 Mesure du NO dans les sinus
La mesure directe de la fraction de NO dans les sinus nécessite un examen invasif (ponction
sinusienne) [Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995]. En pratique, cela ne s’envisage que
chez des patients devant subir une ponction sinusienne pour une raison thérapeutique, et chez
qui il est possible d’effectuer une ponction de l’air contenu dans les sinus.
6 NO ET PATHOLOGIES DES VOIES AERIENNES SUPERIEURES
6.1 Rhinite allergique
Dans les cellules épithéliales ciliées recouvrant les fosses nasales normales, les isoformes
NOS-2 et NOS-3 semblent co-exister chez le sujet sain, bien que la NOS-3 semble majoritaire
tant sur le plan transcriptionnel que fonctionnel. Toutefois, l'activité NO-synthase de la
muqueuse nasale normale semble beaucoup plus faible que l'activité de la muqueuse
recouvrant les polypes (activité mesurée par conversion de L-[U-C14]arginine en L-[U-
C14]citrulline) [Ramis, Lorente et coll. 1996].
La muqueuse nasale des patients atteints de rhinite allergique est caractérisée par une
importante expression de la NOS-2, rappelant ce qui est décrit dans les voies aériennes
inférieures des patients asthmatiques. Chez les sujets atteints de rhinite allergique, la NOS-2
est détectée dans les cellules épithéliales, dans les cellules glandulaires, et dans les cellules
endothéliales des sinusoïdes. Kang et coll. suggèrent que le NO produit par la NOS-2 agit en
augmentant la sécrétion de mucus [Kang, Huang et coll. 2004]. Il est également possible que
51
le NO joue un rôle dans le contrôle de la résistance nasale et de la perméabilité
microvasculaire induite par la simulation allergénique.
Les mesures de NO nasal chez les patients atteints de rhinite allergique donne des résultats
variables. Certains auteurs (dont notre groupe) rapportent des augmentations variables du NO
nasal en réponse à une exposition à des allergènes. Chez ces patients, on décrit une
augmentation de l’expression de la NOS-2 ainsi qu’une augmentation des métabolites du NO
(nitrites et nitrates) dans le liquide de lavage nasal. Martin et coll. ont mesuré des
concentrations élevées de NO dans le nez et la bouche de patients atteints de rhinite allergique
[Martin, Bryden et coll. 1996]. Par contre, Kharitonov et coll. rapportent une augmentation du
NO nasal mais pas du NO oral chez des patients allergiques durant la saison pollinique
[Kharitonov, Rajakulasingam et coll. 1997]. Ces auteurs rapportent de plus qu’une heure
après l’exposition à un allergène par voie nasale, le NO nasal diminue, et cette diminution est
corrélée avec le degré de sévérité de la rhinite allergique. Enfin, Palm et coll. rapportent une
augmentation du NO dans la cavité buccale mais pas dans la cavité nasale de patients porteurs
de rhinite allergique [Palm, Graf et coll. 2000].
6.2 Polypose naso-sinusienne
Les polypes sinusiens sont des pseudo-tumeurs inflammatoires développées aux dépens du
revêtement épithélial des sinus paranasaux. La croissance de ces polypes peut aboutir à leur
« accouchement » dans les fosses nasales, faisant alors parler de polypes naso-sinusiens. La
gêne fonctionnelle alors occasionnée peut nécessiter une exérèse chirurgicale, le plus souvent
par ethmoïdectomie endonasale.
Plusieurs études montrent une « expression élevée » de la NOS-2 dans l'épithélium recouvrant
les polypes naso-sinusiens (expression évaluée par RT-PCR et immunohistochimie). Parikh et
coll. ont montré que l’activité NOS était augmentée également dans des polypes de patients
52
allergiques à l’aspirine [Parikh, Scadding et coll. 2002]. Les auteurs postulent que la
production élevée de cytokines chez les patients allergiques à l’aspirine stimulerait
l’expression de la NOS-2 ; la forte production de NO inhiberait l’apoptose des éosinophiles,
ce qui contribuerait à perpétuer la sécrétion de cytokines et donc du cercle vicieux de
l’inflammation.
De nombreuses études montrent que le NO nasal peut être abaissé chez des patients porteurs
de polypes par comparaison à des patients témoins ou des patients atteints de rhinite
allergique mais exempts de polypes [Arnal, Flores et coll. 1999]. Ces résultats, apparemment
paradoxaux compte tenu de l’expression de NOS-2 par les polypes, s’expliqueraient par
l’obstruction du méat sinusien empêchant le passage d’air en provenance des sinus
(concentration élevée) vers la cavité nasale. Une publication de notre équipe va dans ce sens
en montrant une corrélation inverse entre le nombre de sinus atteints par la polypose et la
concentration nasale de NO [Arnal, Flores et coll. 1999].
6.3 Sinusite
Une diminution du NO nasal a été rapportée que ce soit en situation de sinusite aigue ou de
sinusite chronique. Chez des enfants porteurs de sinusite aigue, Baraldi et coll. démontrent
que la concentration nasale de NO augmente sous l’effet d’une antibiothérapie lorsque celle-ci
est efficace. L’hypothèse invoquée par les auteurs pour expliquer la baisse initiale de NO
nasal était celle d’une obstruction méatale par de l’œdème des muqueuses nasales et
sinusiennes et un « blocage » de l’ostium par du mucus ; le traitement de l’infection ferait
disparaître l’obstruction méatale et donc ré augmenter le NO nasal [Baraldi, Azzolin et coll.
1997].
53
6.4 Le cas particulier de la sinusite aiguë nosocomiale en réanimation
6.4.1 Généralités
La sinusite maxillaire aiguë nosocomiale (SMAN) en réanimation est une entité qui n’est
reconnue que depuis les années 80, bien que les premières publications datent de 1974
[Caplan et Hoyt 1982]. L’intérêt porté à cette pathologie s’explique par la nécessité de juguler
au mieux les infections nosocomiales et d’adapter les traitements antibiotiques des patients
hospitalisés en réanimation. Une étude randomisée récente portant sur 400 patients montre
que le fait de rechercher une sinusite radiologique dès que les critères cliniques sont réunis, et
de traiter les SMAN chez les patients de réanimation (drainage, lavages et antibiothérapie par
voie générale) permet de diminuer à la fois la mortalité et l’incidence des pneumopathies
nosocomiales [Holzapfel, Chastang et coll. 1999].
Les SMAN surviennent chez environ 20% des patients de réanimation [Holzapfel, Chevret et
coll. 1993]. Les facteurs de risque de survenue d’une SMAN sont la ventilation mécanique
prolongée, la colonisation nasale par des bacilles Gram-, la présence d’un corps étranger nasal
(sonde naso-trachéale ou naso-gastrique), la profondeur de la sédation [George, Falk et coll.
1998]. Selon que la culture du liquide sinusien est positive ou non, on distingue des
sinusites « infectieuses » et des sinusites « non infectieuses » (dites aussi « inflammatoires »).
Toutefois, la proportion respective de ces deux entités varie considérablement selon les
études, de 10 à 80% pour les sinusites « infectieuses » et de 90 à 20% pour les sinusites « non
infectieuses » [Talmor, Li et coll. 1997 ; Le Moal, Lemerre et coll. 1999 ; Westergren 1999].
La plupart des études prospectives rapportent toutefois une proportion de 60 à 80% de
sinusites « infectieuses » parmi les sinusites diagnostiquées par TDM. Cette variabilité
s’explique par des différences de techniques de prélèvement et de culture bactériologique, en
particulier anaérobie.
54
Les principaux germes retrouvés sont des cocci gram positif (Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus aureus, Streptococcus species), des bacilles gram négatif (Pseudomonas
aeruginosa). La proportion habituelle des germes anaérobies dans les SMAN est d’environ
10% [Bert et Lambert-Zechovsky 1995]. Une seule étude rétrospective retrouve des germes
anaérobies dans 60% des SMAN. Dans ce cas, les méthodes de culture des germes anaérobies
étaient hautement éprouvées [Le Moal, Lemerre et coll. 1999].
Le diagnostic de SMAN est suspecté devant une fièvre d’origine inexpliquée, une hyper
leucocytose, un écoulement nasal purulent [Talmor, Li et coll. 1997]. Ces signes cliniques
conduisent à réaliser une échographie et/ou une tomodensitométrie (TDM) [Westergren, Berg
et coll. 1997]. L’échographie des sinus permet de dépister l’existence d’une anomalie, sans
préciser s’il s’agit d’un simple épaississement de la muqueuse, d’un comblement complet, ou
d’un niveau liquidien. Il s’agit toutefois d’un examen simple, peu onéreux, disponible au lit
du malade. La pratique du dépistage échographique permet de réserver le transport en salle de
radiologie des seuls malades porteurs d’une anomalie sinusienne fortement évocatrice de
SMAN. Toutefois, seule la TDM permet de porter avec certitude un diagnostic de sinusite
maxillaire, devant une image soit de niveau liquide, soit d’opacification complète
[Westergren, Berg et coll. 1997]. Cependant, aucun examen d’imagerie n’est discriminant
pour différencier une sinusite « infectieuse » d’une sinusite « inflammatoire ». Il est donc
nécessaire de procéder à une analyse bactériologique à partir d’un prélèvement de liquide
sinusien.
La technique de prélèvement habituellement utilisée est la ponction de sinus par voie trans-
nasale. Compte tenu de la colonisation bactérienne des fosses nasales, il est primordial de
réaliser une désinfection extrêmement soignée du point de ponction [Rouby, Laurent et coll.
1994]. Le chiffre de bactéries en culture habituellement retenu pour parler de sinusite
55
infectieuse est de 103 unité formant des colonies (UFC) [Rouby, Laurent et coll. 1994 ; Bert et
Lambert-Zechovsky 1995].
Le traitement des SMAN comprend un drainage, des lavages et antibiothérapie par voie
générale [Talmor, Li et coll. 1997]. Lors de la ponction de sinus visant à évacuer le contenu
du sinus et à réaliser un prélèvement pour analyse, un drain est mis en place. C’est à travers ce
drain que sont réalisés des lavages, toutes les 12 heures pendant au moins 48 heures, et si
possible pendant que le patient reste sous sédation et sous ventilation mécanique. Une
antibiothérapie est mise en route de façon empirique. Une étude rétrospective a toutefois
souligné l’intérêt de l’analyse bactérienne du liquide sinusien pour ajuster l’antibiothérapie,
cette dernière étant modifiée dans 35% des cas après identification de l’antibiogramme des
germes en cause [Ramadan, Owens et coll. 1998].
6.4.2 Place du NO dans la sinusite nosocomiale
Comme il est souligné plus haut, un certain nombre de sinusites nosocomiales sont dites
« inflammatoires » dans la mesure où aucun germe n’est mis en évidence dans le liquide de
ponction. Une explication « mécanique » a été proposée par Rouby et coll. Pour ces auteurs,
la présence d’une obstruction ostiale secondaire à la présence d’un corps étranger (sonde
nasotrachéale et/ou nasogastrique) pourrait suffire à expliquer une rétention liquidienne
intrasinusienne sans que celle-ci ne soit (encore) surinfectée au moment du prélèvement. Les
mêmes auteurs soulignent toutefois que, chez les malades en réanimation, le fait de ne pas
introduire de corps étranger intranasal ne suffit pas toujours à éviter la survenue d’une sinusite
[Rouby, Laurent et coll. 1994]. Inversement, la présence d’un corps étranger intranasal
n’entraîne pas obligatoirement la genèse d’une sinusite (observations personnelles).
Une observation clé a été rapportée récemment par Deja et coll. Ces auteurs ont en effet
montré que le premier élément qui conduit à une sinusite en réanimation est une diminution
massive de la synthèse de NO par diminution de la présence de NOS-2 dans l’épithélium
56
sinusien, et que cette diminution est une conséquence directe du sepsis [Deja, Busch et coll.
2003].
Le comportement de la NOS-2 en cas de sepsis semble donc différent dans les sinus et dans le
reste de l’organisme. En effet, l’induction de la NOS-2 est considérée comme un évènement
majeur en cas de sepsis et un déterminant de la survenue d’un choc septique, tant sur des
modèles animaux qu’en clinique humaine [Levy, Prince et coll. 2005]. Des cytokines pro-
inflammatoires associées au sepsis (interleukin [IL]-1, IL-6, tumor necrosis factor [TNF],
interferon-γ) et l’endotoxine (lipopolysaccharide) augmentent l’expression de NOS-2 et la
production de NO [Nathan et Xie 1994]. Dans le sepsis chez l’Homme, il existe une
augmentation significative, indépendante d’une éventuelle insuffisance rénale, des
métabolites sanguins du NO (nitrites et nitrates) [Groeneveld, Hartemink et coll. 1999].
Plusieurs arguments suggèrent qu’un excès de NO produit par la NOS-2 contribue à la chute
des résistances vasculaires systémiques et à la perméabilité vasculaires qui caractérisent le
sepsis sévère et le choc septique. Un argument fort vient de ce que les souris dont le gène
codant pour la NOS-2 a été invalidé ne présentent ni hypotension artérielle ni augmentation
de leur mortalité en réponse à l’injection d’endotoxine [MacMicking, Nathan et coll. 1995].
Toutefois, l’inhibition compétitive non spécifique des NOS dans le choc septique chez
l’Homme s’est soldée par un surcroît de mortalité, probablement par perte de la protection
vasculaire physiologique conférée par le NO produit par la NOS-3 vasculaire [Cobb 1999].
Dans les sinus, la NOS-2 est exprimée de façon physiologique dans les cellules épithéliales
ciliées [Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995 ; Deja, Busch et coll. 2003]. Chez l’Homme et
chez d’autres mammifères exempt d’infection des sinus, du NO est produit de façon continue
par la NOS-2 de ces cellules, aboutissant à une très forte concentration de NO dans les sinus
(de l’ordre d’une dizaine de ppm) et à un passage de NO dans les reste des voies aériennes.
Deja et coll. montrent que la NOS-2 et le NO ont quasiment disparu des sinus en cas de
57
comblement sinusien (par un liquide infecté ou pas) chez les patients présentant un sepsis.
Des études tant in vitro qu’expérimentales in vivo montrent que certaines cytokines comme
l’interleukine-4, l’interleukine-6, l’iinterleukin-10, l’interleukin-11, l’interleukin-13, et plus
encore le transforming growth factor (TGF)-ß1 diminuent l’expression de la NOS-2 [Zamora,
Vodovotz et coll. 2000]. Dans un modèle animal de choc septique, l’administration de TGF-ß1
exogène diminue significativement la quantité d’ARNm de NOS-2 dans plusieurs organes.
Autant la présence de NO à de hautes concentrations physiologiques plaide pour son rôle de
« gardien » garant de la première ligne de défense anti-infectieuse non spécifique, autant la
disparition du NO en cas d’inflammation suppose le recrutement d’un autre mode de défense
anti-infectieuse de deuxième ligne. Dans la muqueuse sinusienne des patients atteints de
sinusite nosocomiale « inflammatoire » liée au sepsis, on observe effectivement une
infiltration par des polynucléaires neutrophiles et par des lymphocytes. A l’état physiologique,
il est suggéré que les fortes concentrations de NO puissent inhiber le chimiotactisme pour les
polynucléaires neutrophiles [Wanikiat, Woodward et coll. 1997] ainsi que la prolifération
lymphocytaire [Kosonen, Kankaanranta et coll. 1997]. Tout se passe donc comme si la baisse
du NO dans les sinus, en même temps qu’elle prive ceux-ci d’un moyen de défense non
spécifique, favorisait la possibilité d’une réaction inflammatoire cellulaire.
6.5 Dyskinésie ciliaire primitive (DCP)
La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique autosomique, transmise sur
le mode récessif [Narayan, Krishnan et coll. 1994]. Les mutations géniques décrites sont
nombreuses et concernent principalement les dynéines, protéines associées aux microtubules
[Zariwala, Leigh et coll. 2006]. Sur le plan fonctionnel, il existe une immobilité ou une
mobilité anormale des cils vibratiles des cellules épithéliales, ce qui entraîne une diminution
de la clairance mucociliaire. Elle se caractérise sur le plan clinique par des sinusites et des
58
bronchites à répétition, et par une stérilité masculine [Bush, Cole et coll. 1998]. Les patients
atteints de DCP ont environ 50% de risque de présenter un situs inversus (malposition
symétrique par rapport au plan sagittal d’un ou plusieurs organes. La DCP prend alors le nom
de syndrome de Kartagener. La raison évoquée pour expliquer la prévalence de 50% de la
forme Kartagener parmi les patients atteints de DCP est la perte du déterminisme
embryonnaire de la migration orientée des feuillets à partir desquels se développeront les
organes. La dynéine, ou plutôt les dynéines, sont en effet impliquées non seulement dans les
mouvements ciliaires des cellules respiratoires, mais également dans le trafic intracellulaire et
la mobilité cellulaire [Noone, Bali et coll. 1999 ; Olbrich, Haffner et coll. 2002].
La prévalence de la DCP est estimée à environ 1/15000 ; ces données ne sont toutefois le fruit
que d’extrapolations faites à partir du diagnostic radiologique thoracique de situs inversus
chez des patients par ailleurs porteurs de bronchectasies [Noone, Leigh et coll. 2004].
Le diagnostic présomptif de DCP repose sur des arguments cliniques, alors que le diagnostic
de certitude nécessite un examen de cellules ciliées en microscopie électronique. Lorsqu’il
existe un retard au diagnostic, le pronostic des patients est significativement plus sombre dans
la mesure où s’installent des lésions destructives irréversibles (dilatations des bronches,
choléstéatome, …) [Bush 2000].
Chez les patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive, la FNNO est de 15 ppb environ
lorsque le débit d’aspiration de l’air est de 0,7l/min [Arnal, Flores et coll. 1999]. Chez les
sujets exempts de DCP dont les sinus paranasaux sont présents et dont les ostia sont
perméables, la fraction nasale de NO (FNNO) est de l’ordre de 200 ppb lorsque le débit
d’aspiration de l’air est de 0,7l/min [Arnal, Flores et coll. 1999 ; Narang, Ersu et coll. 2002].
La concentration très basse de NO chez les patients atteints de DCP est mesurée chez des
patients dont la perméabilité des ostia entre sinus et fosses nasales ainsi que l'absence de
comblement sinusien ont été vérifiés par une tomodensitométrie. La fraction de NO dans l’air
59
aspiré par le nez étant inversement proportionnelle au débit d’aspiration, la FNNO est de 55
ppb environ (soit 3,5 fois supérieure) lorsque le débit d’aspiration de l’air est de 0,2 l.min-1
(soit 3,5 fois inférieur) [Loukides, Kharitonov et coll. 1998]. Ces observations suggèrent
fortement que la fraction sinusienne de NO est très diminuée dans la DCP. Toutefois, aucune
hypothèse expliquant cette diminution n’a à ce jour été confirmée.
Une étude récente montre que la mesure du NO nasal a une bonne valeur prédictive positive
pour différencier des patients atteints de DCP de patients atteints de bronchectasies ou de
mucoviscidose (sensibilité de 97% et spécificité de 90% lorsque le seuil de FNNO est de 250
ppb, pour un débit d'aspiration hélas non précisé) [Narang, Ersu et coll. 2002]. On considère
désormais que la mesure du NO nasal peut être utilisée pour le « screening » de patients
suspects de DCP [Wodehouse, Kharitonov et coll. 2003].
6.6 Pan-bronchiolite diffuse
La FNNO est également effondrée dans la pan-bronchiolite diffuse. Il s'agit d'une maladie rare
atteignant très majoritairement les sujets originaires de Chine, de Corée et du Japon ; elle
associe sur le plan clinique en une bronchorrhée chronique, des bronchectasies et des sinusites
à répétition [Nakano, Ide et coll. 2000]. Une étude clinique rapporte une concentration nasale
de NO environ 10 fois inférieure à celle de sujets témoins [Krishnan, Thachil et coll. 2002].
60
61
CHAPITRE II : OBJECTIFS ET CONDUITE
DU TRAVAIL
62
63
1 OBJECTIFS
L’objectif général de ce travail de thèse est d’étudier les mécanismes contrôlant la synthèse de
NO dans les voies aériennes supérieures chez l’homme dans une situation de contrainte
pharmacologique (traitement par des glucocorticoïdes) et dans deux situations pathologiques
(sinusite aiguë nosocomiale et dyskinésie ciliaire primitive).
Dans un premier article, nous avons étudié l’effet de fortes doses de glucocorticoïdes
administrés par voie intraveineuse sur la concentration nasale de NO.
Dans un deuxième article, nous avons mesuré le NO et ses métabolites dans les sinus de
patients atteints de sinusite nosocomiale, et ce à différents moments durant le traitement de la
sinusite (drainage sinusien et suivi de lavages). L’objectif était de mesurer la concentration de
NO dans les sinus en cas d’infection, et d’étudier l’effet du traitement sur cette concentration.
Dans un troisième travail (manuscrit en préparation), nous avons étudié les voies de synthèse
du NO dans la situation bien particulière des patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive
dans la mesure où, chez ces patients, la concentration nasale de NO est effondrée.
2 CONDUITE DU TRAVAIL
Les trois problématiques ont été abordées du point de vue de la pathologie humaine.
Le premier travail a consisté à « recruter » des patients indemnes de toute pathologie
allergique et de toute atteinte respiratoire haute ou basse, vierges de tout traitement par
glucocorticoïdes, mais devant bénéficier d’un traitement glucocorticoïde par voie générale.
Les patients devant être traités pour une poussée de sclérose en plaques ont constitué notre
population cible. La concentration nasale de NO était mesurée avant traitement. Ces valeurs
n’étaient pas différentes de celles de patients témoins, indemnes de sclérose en plaques. La
64
mesure de NO nasal était répétée après 3 jours de traitement par glucocorticoïdes (1000
mg/jour).
Le deuxième travail a concerné des patients hospitalisés en réanimation et présentant une
sinusite maxillaire aiguë nosocomiale. Dès lors qu’un drainage était mis en place dans le sinus
maxillaire atteint, le sinus était vidé de ses sécrétions (et celles-ci analysées sur le plan
microbiologique) puis lavé ; le liquide de lavage était recueilli pour l’analyse des métabolites
du NO (NOx). La concentration nasale de NO était ensuite mesurée. La même procédure
(lavage, recueil du liquide, mesure du NO nasal et sinusien) était répétée de façon
biquotidienne, tout au long du traitement (3 à 5 jours).
Le troisième travail a inclus des patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive, porteurs de
polypes naso-sinusiens, et devant bénéficier d’une ethmoïdectomie endonasale. En raison de
la rareté de la pathologie, le recrutement était multicentrique. Les patients ont subit une
mesure de la concentration nasale de NO avant la chirurgie, afin de vérifier que celle-ci était
basse. Sur les tissus recueillis (polypes naso-sinusiens), des marquages étaient réalisés afin
d’étudier l’expression d’enzymes (NO-synthases et arginases), leur fonction (NADPH-
diaphorase) et la production de radicaux libres oxygénés (susceptibles de dégrader le NO).
65
CHAPITRE III : RESULTATS
EXPERIMENTAUX
Les principaux résultats obtenus au cours de ce
travail sont présentés sous la forme de deux
articles publiés et d’un manuscrit en
préparation.
66
67
1 PREMIER MEMOIRE
Article publié : Degano B, Têtu L, Serrano E, Didier A, Arnal JF. Nasal nitric oxide, the
guardian of paranasal sinuses, is paradoxically increased by high doses of intravenous
glucocorticoids. Allergy 2005; 60:1323-1326
Texte en ANNEXE 1
Les glucocorticoïdes (GCs) sont largement prescrits pour le traitement de maladies
inflammatoires touchant les voies aériennes supérieures. Les GCs sont réputés diminuer
l’expression de la NO-synthase de type 2 (NOS2). De fortes concentrations de monoxyde
d’azote (NO) sont générées dans les sinus paranasaux par la NOS2 localisée dans les cellules
épithéliales ciliées sinusiennes. Dans les sinus, le NO est présumé jouer un rôle crucial dans la
défense anti-infectieuse non spécifique. Une partie du NO sinusien s’échappe des sinus et
peut être mesuré dans l’air des fosses nasales.
Dans cette étude, l’objectif était d’évaluer l’effet de très fortes doses de GCs administrées par
voie intraveineuse sur la concentration nasale de NO.
Le NO nasal a été mesuré chez 15 patients indemnes de tout antécédent allergique, de toute
pathologie touchant les voies aériennes supérieures, et de tout traitement par GCs depuis au
moins 2 mois. Ces patients étaient recrutés par le biais des services de Neurologie de notre
institution, où ils devaient bénéficier d’une perfusion quotidienne de 1000 mg de
méthylprednisolone pendant 3 jours consécutifs en raison d’une poussée de sclérose en
68
plaques (SEP). Le NO nasal était mesuré avant et après 3 jours de traitement par GCs. les
valeurs des patients étaient comparées à celles de 30 sujets témoins appariés.
Chez les sujets témoins, le NO nasal [moyenne (écart à la moyenne)] était de 233 (8) parties
par billion (ppb). Cette valeur était équivalente à la valeur mesurée chez les patients avant la
première administration de GCs. [219 (13) ppb]. Après 3 jours de traitement par GCs, le NO
nasal des patients augmentait de façon significative [250 (13) ppb (p < 0,0001)].
69
2 DEUXIEME MEMOIRE
Article publié : Degano B, Génestal M, Serrano E, Rami J, Arnal JF. Effect of treatment on
maxillary sinus and nasal nitric oxide concentrations in patients with nosocomial maxillary
sinusitis. Chest 2005; 128:1699-1705.
Texte en ANNEXE 2
Dans les sinusites maxillaires aiguës nosocomiales (SMAN) associées au sepsis sévère, la
concentration sinusienne de NO est effondrée du fait d’une quasi-abolition de l’expression de
la NO-synthase de type 2 (NOS2) normalement présente dans les cellules épithéliales ciliées.
L’objectif de cette étude était de mesurer la concentration intrasinusienne de NO et de ses
métabolites (NOx) au fur et à mesure du traitement de la sinusite.
Neuf patients porteurs d’une SMAN ont été étudiés pendant les 4 premiers jours du
traitement de leur sinusite. La concentration intrasinusienne de NO (médiane [25 au 75
percentile]) augmentait de 70 parties par billion (ppb) [40 à 100 ppb] jusqu’à 2050 ppb [1700
à 3000 ppb] après 4 jours (p < 0,0001). Dans le même temps, la concentration nasale de NO
augmentait d’une valeur médiane de 100 ppb [98 à 148 ppb] jusqu’à 180 ppb [180 à 188 ppb]
(p < 0,001). En mesurant simultanément le NO sinusien et le NO nasal, on retrouvait une
corrélation entre ces deux paramètres (r2 = 0,57 ; p < 0,0001). Les NOx mesurés dans le
liquide de lavage sinusien ne variaient pas durant les 4 jours de traitement.
70
3 TROISIEME MEMOIRE
Manuscrit en préparation : Degano B, Valmary S, Serrano E,Arnal JF. Exploration of nitric
oxide synthases in nasal polyps from patients with primary ciliary dyskinesia.
Texte en ANNEXE 3
La concentration nasale de NO est effondrée chez les patients atteints de dyskinésie ciliaire
primitive (DCP). La mesure du NO nasal est désormais recommandée dans le dépistage d’une
DCP. Toutefois, les raisons de la baisse du NO restent inconnues.
5 patients atteints de DCP et 10 témoins appariés non allergiques, devant bénéficier de la
résection par voie endonasale de polypes nasosinusiens, ont fait l’objet de l’étude. La
présence de sinus paranasaux a été vérifiée par tomodensitométrie. Le NO nasal a été mesuré
par chimiluminescence. Sur les polypes réséqués, des marquages en immunohistochimie
(avec des anticorps reconnaissant les trois isoformes de NO-synthase et les deux isoformes
d’arginase), des marquages enzymatiques témoignant de l’activité NO-synthase (NADPH-
diaphorase) et des marquages évaluant la production d’anion superoxyde (dont l’interaction
avec le NO peut dégrader celui-ci) ont été réalisés. Les résultats étaient comparés entre les
deux groupes (tests non paramétriques).
Le NO nasal était nettement plus bas chez les patients atteints de DCP par rapport aux
témoins (10 ± 7 ppb vs. 205 ± 48 ppb, p<0.0001). Les marquages étaient strictement
superposables entre les deux groupes pour les NO-synthases (absence de marquage pour la
NOS1, marquage endothélial strict pour la NOS3, marquage intéressant le pôle apical des
71
cellules épithéliales ciliées pour la NOS2). Les marquages en NADPH-diaphorase étaient
semblables dans les deux groupes (cellules endothéliales et pôle apical des cellules
épithéliales ciliées) tout comme les marquages évaluant la présence d’anion superoxyde (di-
hydro éthydine). Seuls les marquages intéressant l’arginase II étaient significativement plus
intenses dans le groupe DCP que dans le groupe témoin (p < 0,001).
72
73
CHAPITRE IV : DISCUSSION
74
75
S’il est désormais bien établi que des concentrations de NO de l’ordre de 100 ppb et de la
dizaine de ppm sont mesurées respectivement dans les fosses nasales et les sinus, de
nombreuses questions demeurent quant à la technique de mesure idéale, la raison de la
présence de NO à de telles concentrations, les mécanismes contrôlant cette concentration de
NO, ainsi que l’effet d’agents pharmacologiques et de pathologies sur la production et/ou la
concentration de NO.
1 MESURE DU NO NASAL : QUELLE EST LA TECHNIQUE
IDEALE ?
Lorsqu’on s’adresse à la mesure du NO dans un mélange gazeux in vivo, de nombreux
facteurs vont pouvoir influencer la valeur trouvée. A l’échelle des cellules produisant le NO
une multitude de paramètres sont en jeu, parmi lesquels l’expression des NO-synthases
[Deja, Busch et coll. 2003], la biodisponibilité du substrat et des cofacteurs des NO-
synthases [Crane, Arvai et coll. 1998], la présence éventuelle d’inhibiteurs endogènes de ces
NO-synthases [Vallance etLeiper 2004], la production de radicaux libres oxygénés dégradant
le NO [Ignarro, Fukuto et coll. 1993]. A l’échelle d’une cavité (nasale, sinusienne), la
concentration de NO va refléter un état d’équilibre entre le NO produit par les cellules
(épithéliales ciliées pour la plupart) et le NO dégradé et/ou s’échappant de la cavité. Ainsi, on
peut postuler qu’une cavité dont l’air est faiblement renouvelé (sinus) laisse moins
s’échapper le NO qu’elle produit qu’une cavité dont l’air est fortement renouvelé (fosses
nasales) [Lundberg, Maniscalo et coll. 2003].
1.1 Mesure du NO dans les cavités sinusiennes
La mesure du NO dans les cavités sinusiennes a été rapportée de façon exceptionnelle chez
l’Homme. La technique utilisée dans notre travail a été calquée sur la technique décrite dans
76
l’article princeps de Lundberg et coll [Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995]. Le caractère
extrêmement invasif de la mesure directe du NO dans les cavités sinusiennes nécessite le
recours à une approche indirecte de la concentration sinusienne de NO via la mesure de la
concentration nasale.
1.2 Mesure du NO dans les cavités nasales
Plusieurs techniques de recueil de l’air dans les fosses nasales sont décrites. La conférence de
consensus de l’ATS recommande d’aspirer l’air dans une fosse nasale alors que la narine
controlatérale est laissée libre et que le voile du palais est fermé ["ATS/ERS
recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of
exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005"]. Cette dernière
précaution a pour but d’éviter que l’aspiration d’air provenant de la cavité buccale et/ou des
voies aériennes inférieures ne vienne se mélanger avec l’air des fosses nasales. Dans le souci
de ne pas rendre trop complexe la technique de mesure, en particulier lorsque celle-ci
s’adresse à des enfants (manuscrit 3), nous n’avons pas cherché à fermer le voile du palais
lors de la mesure du NO nasal. Dans un précédent travail émanant de notre équipe [Arnal,
Flores et coll. 1999], nous avions pu montrer que l’air provenant de la bouche modifiait de
moins de 5% le résultat de la mesure du NO nasal. Cette variation est inférieure à la variation
inhérente à la reproductibilité individuelle de la mesure après 15 minutes ou après 24 heures,
qui sont respectivement de 7% et de 10%.
Le débit d’aspiration de l’air est inversement proportionnel à la concentration nasale de NO
[Silkoff, Chatkin et coll. 1999]. Toutefois, la littérature médicale ne nous renseigne pas sur le
caractère linéaire ou non de cette relation. Malheureusement, les nombreux débits
d’aspiration utilisés par les différents auteurs rendent les résultats difficiles à comparer d’une
équipe à l’autre. Le débit que nous avons utilisé (700 mL/min) est relativement bas en regard
77
de débits utilisés par d’autres. La principale justification a été de ne pas occasionner de
traumatisme tympanique.
Si on admet qu’une part importante du NO mesuré dans les fosses nasales provient des
cavités sinusiennes, et si on souhaite que le NO nasal soit le reflet le plus fidèle possible de la
concentration de NO dans les sinus, il est probablement important de mesurer le NO nasal
pendant une manœuvre dite de « humming » : lorsqu’un sujet expire en émettant un son, les
vibrations produites provoquent un « rinçage » de l’air contenus dans les sinus, et on peut
recueillir dans les fosses nasales de l’air enrichi en NO sinusien [Lundberg, Maniscalo et
coll. 2003]. Dans notre travail portant sur l’effet des glucocorticoïdes sur le NO produit dans
les cavités naso-sinusiennes, nous n’avons malheureusement pas utilisé cette technique. En
effet, au moment où notre travail a été conçu, la technique du « humming » n’avait pas fait
l’objet de publication. Les conclusions que nous tirons quant à l’effet des glucocorticoïdes
sur le NO sinusien mériteraient de ce fait d’être confirmées par des mesures avec humming.
2 APPROCHE PHYSIOLOGIQUE DE LA PRODUCTION DE NO
DANS LES VOIES AERIENNES SUPERIEURES
2.1 Pourquoi le NO est-il élevé dans les sinus ?
Le rôle physiologique des sinus paranasaux reste inconnu chez les mammifères
[Lewandowski, Busch et coll. 1998]. On a pu proposer que les sinus participent à l’olfaction,
l’humidification et le réchauffement de l’air inspiré, l’allègement du massif facial, la
résonance de la voix… Quoiqu’il en soit, les sinus restent une cavité potentiellement
dangereuse car située anatomiquement à l’interface entre l’environnement extérieur et le
cerveau. Cette proximité rend critique une éventuelle infection purulente, celle-ci pouvant
s’étendre aux organes cérébraux. Cependant, au regard de l’énorme quantité d’air qui circule
78
et est filtré dans les voies aériennes supérieures (VAS), la prévalence d’infection sinusiennes
graves par leurs conséquences loco-régionales est faible. Cela suppose que le mécanisme de
défense anti-infectieuse des sinus ne mette pas en jeu de façon immédiate des mécanismes
risquant d’aboutir à la formation d’une collection purulente. Un moyen d’éviter la formation
de pus est d’éviter la mise en jeu de l’immunité cellulaire. A cet égard, le NO est un bon
candidat pouvant jouer le rôle de première ligne de défense non spécifique. En effet, la
concentration de NO est très élevée dans les sinus paranasaux. Comme rappelé plus haut, le
NO active la clairance mucociliaire et possède une action anti-microbienne directe, tant sur
les bactéries que sur les virus ou les parasites. Dans le cas particulier du sepsis sévère et du
choc septique, la baisse de la concentration sinusienne de NO est considérée comme le
premier évènement aboutissant à la survenue d’une sinusite [Jean, Maitre et coll. 2002 ; Deja,
Busch et coll. 2003].
2.2 Comment la concentration de NO s’élève-t-elle dans les sinus ?
Vraisemblablement, le fait que les sinus soient une cavité au sein de laquelle l’air est peu
renouvelé contribue à créer cette concentration élevée. La meilleure démonstration vient de ce
que le « rinçage » répété des cavités sinusiennes par des expirations selon la technique de
« humming » aboutit à la baisse importante du NO nasal, ce dernier retrouvant sa valeur
initiale après quelques dizaines de minutes nécessaires à la reconstitution des « stocks »
sinusiens [Maniscalco, Weitzberg et coll. 2003]. Si on considère (i) que la concentration
sinusienne de NO doit être suffisamment élevée pour assurer son rôle de défense non
spécifique et (ii) que certaines interventions chirurgicales (méatotomie) consistent à créer une
large communication entre les sinus et les fosses nasales, on peut questionner le bien fondé de
ce type de chirurgie quant au risque de récidive d’une sinusite.
79
2.3 Que se passe-t-il si le NO sinusien diminue ?
Notre travail a confirmé que la concentration intra-sinusienne de NO était effondrée en cas de
sinusite nosocomiale, et a permis de montrer que le traitement de la sinusite permettait une ré-
augmentation rapide du NO dans les sinus. Notre travail n’a toutefois pas permis de
déterminer si la baisse du NO favorisait la sinusite ni si son augmentation participait à la
guérison. Le travail de Deja et coll. suggère que dans le cas particulier du sepsis sévère et du
choc septique, c’est l’état septique qui détermine la baisse du NO sinusien. Les auteurs basent
leur assertion sur le fait que des patients en sepsis sévère ou en choc septique ayant des
épanchements sinusiens non infectieux (culture négative) avaient une quasi-absence
d’expression de NOS2 au sein de leur épithélium sinusien. La séquence sepsis – disparition de
l’expression de NOS2 – baisse de la concentration sinusienne de NO – apparition d’un
épanchement sinusien – surinfection de l’épanchement a été proposée [Deja, Busch et coll.
2003].
Un autre argument dans ce sens vient d’une observation originale. Un chercheur s’est
administré un inhibiteur compétitif des NOS (L-NMMA) dans une narine ; ce sujet était
indemne de toute pathologie respiratoire ; au moment de cette expérience, il souffrait d’un
rhume banal. Le sujet a développé en quelques jours une sinusite purulente unilatérale, du
côté où le L-NMMA avait été administré. De façon contemporaine, le NO nasal avait diminué
de façon unilatérale [Lundberg 2005].
2.4 Le NO sinusien s’échappe-t-il des sinus ?
Une part importante du NO retrouvé dans les fosses nasales provient des sinus. Plusieurs
observations vont dans ce sens. Dans notre travail, nous avons observé, en mesurant de façon
contemporaine le concentration de NO dans les sinus (à travers un drain intra-sinusien) et
dans les fosses nasales, une corrélation entre NO sinusien et NO nasal. Plus originale est
80
l’observation que des babouins dépourvus de façon constitutive de sinus paranasaux ont des
concentrations de NO extrêmement faibles dans les fosses nasales (de l’ordre du ppb), alors
que des singes rhésus, pourvus de sinus, ont des concentrations nasales de NO de l’ordre de la
centaine de ppb [Lewandowski, Busch et coll. 1998].
Parmi les différents rôles qui ont été disputés pour le NO en provenance des VAS, un effet
vasodilatateur pulmonaire et « modulateur » du tonus bronchique a été évoqué [Lundberg
1996]. En effet, il a été rapporté que l’effet bénéfique du NO inhalé sur l’oxygénation et sur la
pression artérielle pulmonaire en pathologie (syndrome de détresse respiratoire aigu) était
obtenu pour une concentration de NO de 150ppb [Mourgeon, Puybasset et coll. 1997]. Cette
concentration est supposée être atteinte au niveau des alvéoles pulmonaires lorsqu’un sujet
respire par le nez [Tornberg, Marteus et coll. 2002]. Toutefois, aucune preuve définitive
n’existe quant à une pertinence du rôle du NO d’origine rhino-sinusienne chez le sujet normal.
3 CONTROLE DE LA CONCENTRATION NASALE DE NO PAR LES
GLUCOCORTICOÏDES
Les rhinosinusites chroniques sont des affections à forte prévalence. Aux Etats-Unis, on
estime qu’elles touchent environ 20 millions de patients, soit un peu plus de 5% de la
population. Une des pierres angulaires du traitement des rhinosinusites chroniques est
constituée par les glucocorticoïdes (GCs), qu’ils soient donnés par voie locale (nasale) ou
systémique. Un des effets régulièrement rapporté des GCs est la baisse de la production de
NO, cette baisse étant le plus souvent rapportée à une diminution de l’expression de la NO-
synthase de type 2. On rapporte généralement une baisse de la production de NO par les NOS
sous l’effet des glucocorticoïdes (GCs) [Walker, Pfeilschifter et coll. 1997]. Si on garde à
l’esprit que le NO est, dans les voies aériennes supérieures, le premier rempart contre les
81
infections, il peut sembler paradoxal qu’un produit (les GCs) réputé diminuer le NO soit
efficace dans le traitement des affection rhinosinusiennes chroniques.
L’effet des GCs administrés par voie systémique sur le NO des voies aériennes supérieures
n’avait jusqu’ici été étudié que de manière très indirecte : Lundberg et coll. n’observaient pas
de différence de NO nasal entre patients ne recevant pas de GCs et patients traités au long
cours par des GCs [Lundberg, Weitzberg et coll. 1996]. Nous avons souhaité vérifier cette
observation en étudiant de façon prospective l’effet des GCs par voie systémique sur le NO
nasal, chez des patients indemnes de pathologie rhinosinusienne. Le fait que les GCs
entraînent une augmentation de la concentration nasale de NO est compatible avec plusieurs
hypothèses. L’hypothèse d’une simple augmentation de la taille de l’ostium séparant les sinus
des fosses nasales sous l’effet des GCs semble peu vraisemblable chez des patients indemnes
de pathologie rhinosinusienne dont l’ostium a été considéré comme étant « déjà normal »
avant traitement. Une diminution de la synthèse de radicaux libres oxygénés permettant une
augmentation de la disponibilité du NO semble plausible. En effet, même si à l’état
physiologique les cellules susceptibles de produire ces radicaux (macrophages,
polynucléaires) sont absentes de la muqueuse sinusienne, elles sont présentes – bien que peu
abondantes – dans la muqueuse nasale [Ramis, Lorente et coll. 1996]. Une augmentation de
l’expression et/ou de l’activité de la NOS2 de la muqueuse sinusienne pourrait être envisagée.
En effet, la mise en jeu de la NOS2 de l’épithélium sinusien obéit à un contrôle opposé à la
NOS2 d’autres sites de l’organisme dans le cas particulier du sepsis et du choc septique
[Deja, Busch et coll. 2003]; il faudrait donc vérifier que, dans l’épithélium sinusien, les GCs
n’induisent pas (au lieu de la réprimer dans d’autres sites, macrophages par exemple)
l’expression de NOS2.
Une dernière hypothèse pourrait être celle d’une diminution de l’expression d’arginase par les
GCs. En effet, les arginases I et II sont exprimées dans l’épithélium cilié des sinus, des fosses
82
nasales et des bronches de sujets normaux (observations personnelles). Il a été rappelé plus
haut que les GCs ont pour effet, dans certaines conditions expérimentales, de diminuer
l’expression des deux isoformes d’arginase [Wei, Jacobs et coll. 2000 ; Klasen, Hammermann
et coll. 2001]. Il est donc plausible que, chez nos sujets, les GCs entraînent une augmentation
de la biodisponibilité de la L-arginine pour la NOS2 via une diminution de l’arginase.
4 FACTEURS SUSCEPTIBLES DE MODIFIER LA
CONCENTRATION NASALE DE NO CHEZ L’HOMME
Comme rappelé plus haut, les mécanismes contrôlant la concentration nasale de NO sont
connus de façon parcellaire. On a cependant pu constater que certaines conditions et/ou
pathologies étaient associées avec une hausse du NO nasal (rhinite allergique, polypose naso-
sinusienne allergique) alors que d’autres, plus nombreuses, étaient associées à une baisse du
NO nasal (pan-bronchiolite diffuse, dyskinésie ciliaire primitive, tabagisme, mucoviscidose,
sinusite aiguë ou chronique).
4.1 Présence de NO dans les cavités sinusiennes
Pour que du NO soit retrouvé en quantité « normale » dans les fosses nasales, il faut qu’il soit
également présent en quantité normale dans les sinus, et que la communication entre les sinus
et les fosses nasales soit idoine.
Une première condition est la pneumatisation des sinus. Comme mentionné plus haut, des
singes constitutivement dépourvus de sinus paranasaux ont des concentrations de NO
extrêmement faibles dans les fosses nasales, alors que des primates de taille équivalente
pourvus de sinus ont des concentrations nasales de NO équivalentes à celles retrouvées chez
l’Homme [Lewandowski, Busch et coll. 1998]. Cette observation oblige à vérifier la
pneumatisation des sinus chez des individus et/ou dans une pathologie où le NO nasal est
83
effondré. Dans notre travail portant sur les patients atteints de DCP, nous avons pris la
précaution de vérifier par TDM l’existence des sinus.
Nous avons montré dans notre travail, en mesurant de façon contemporaine le concentration
de NO dans les sinus (à travers un drain intra-sinusien) et dans les fosses nasales, une
corrélation entre NO sinusien et NO nasal. Ceci est un argument indirect en faveur de
l’origine sinusienne (au moins partielle) du NO nasal. Un autre argument indirect avait été
apporté par le fait que des enfants présentant une sinusite aiguë avaient une concentration
nasale de NO diminuée par rapport à des enfants sains, et qu’une concentration normale de
NO nasal était restaurée sous l’effet d’une antibiothérapie, cette dernière étant supposée guérir
la sinusite et par conséquent rendre aux sinus la possibilité de produire du NO [Baraldi,
Azzolin et coll. 1997].
4.2 Rôle des enzymes et des substrats
Une anomalie de concentration de NO peut être secondaire à une anomalie d’expression d’une
ou plusieurs isoformes de NOS et/ou d’une anomale de biodisponibilité du substrat ou des
cofacteurs des NOS.
4.2.1 Anomalie d’expression des NOS
Chez l’Homme, on a pu montrer l’absence d’expression de NOS2 dans l’épithélium sinusien
des patients atteints de sinusite nosocomiale comme étant à l’origine de l’effondrement de la
concentration sinusienne de NO [Deja, Busch et coll. 2003]. L’observation faite dans notre
travail est compatible avec ce résultat.
Dans la dyskinésie ciliaire primitive, la concentration nasale de NO est effondrée, et nous
avons vérifié l’expression des NOS dans l’épithélium des voies aériennes supérieures.
D’autres auteurs ont déjà rapporté que les métabolites du NO (Nox, S-nitrosothiols) dans les
condensats d’air exhalé sont présents en quantité équivalente chez les patients atteints de DCP
84
et chez les sujets normaux. Chez les patients, le NO nasal était par contre effondré par rapport
aux sujets normaux. Cette observation suggère que les NOS sont non seulement présentes
dans les voies respiratoires des patients atteints de DCP, mais encore que les enzymes sont
actives [Csoma, Bush et coll. 2003]. L’observation faite dans notre travail va dans ce sens. En
effet, dans les polypes nasosinusiens extraits de patients atteints de DCP, l’expression de la
NOS2 (attestée par plusieurs techniques immunohistochimiques et plusieurs anticorps
monoclonaux) est équivalente à l’expression retrouvée chez des patients témoins.
On observe également, dans les deux groupes, que la NOS1 et la NOS3 sont absentes de
l’épithélium. L’absence de NOS3 dans les cellules épithéliales ciliées contraste avec certaines
données de la littérature. En effet, chez le rat, il a été observé un marquage positif pour la
NOS3 (technique de microscopie électronique) dans la région sub-cellulaire située à la base
des cils vibratiles des cellules épithéliales ciliées de la muqueuse nasale [Xue, Botkin et coll.
1996]. Selon certains auteurs, la présence de cette NOS3 est indispensable à la fonction des
cils vibratiles et à la synthèse du NO [Mahut, Escudier et coll. 2006]. Toutefois, d’autres
auteurs n’ont pas réussi à mettre en évidence la présence de NOS3 dans les cellules
épithéliales ciliées respiratoires humaines [Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995 ; Guo,
Comhair et coll. 2000]. Nos résultats vont très largement dans ce sens. En effet, nous
retrouvons sur toutes les coupes tissulaires des marquages positifs pour la NOS3 au sein des
structures vasculaires (artérioles et veinules) alors qu’aucun marquage pour la NOS3 n’est
identifiable au sein des cellules épithéliales ciliées. De plus, nous retrouvons ce type de
marquages tant sur des coupes de tissus fixés (formol) que de tissu congelé, chez les patients
témoins comme chez les patients atteints de DCP.
85
4.2.2 Anomalie de biodisponibilité du substrat
Pour que la L-arginine, unique substrat des NOS, soit disponible pour l’enzyme, il faut que ce
substrat soit présent au site catalytique de l’enzyme et que le site catalytique ne soit pas
occupé par un inhibiteur.
Dans notre travail, nous avons utilisé la technique de NADPH-diaphorase pour évaluer
l’activité ex vivo des NOS [Ramis, Lorente et coll. 1996]. Avec cette technique, l’activité est
évaluée en présence de substrat et de cofacteurs amenés de façon exogène, ce qui ne permet
pas de conclure quant à la présence optimale de ces éléments in vivo.
Pour estimer indirectement la disponibilité de substrat des NOS, nous nous sommes intéressés
aux arginases, enzymes dont la L-arginine est également le substrat, et dont l’expression dans
un cellules est présumée diminuer la L-arginine disponible pour les NOS [Morris 2002]. Nous
avons observé une expression d’arginase II plus élevée sur les polypes de patients atteints de
DCP par rapport à des polypes de patients témoins comparables par ailleurs (patients non
allergiques, polypes comparables quant à la présence et la proportion des cellules
inflammatoires). Cette augmentation d’expression peut expliquer au moins en partie la
diminution de la concentration nasale de NO observée chez les patients atteints de DCP. Les
raisons de cette expression augmentée n’ont toutefois pas été explorées dans notre travail.
Enfin, tout un pan de la biochimie des NOS n’a pas été abordé dans notre travail, qu’il
s’agisse de l’évaluation des protéines transportant le substrat dans la cellule (CAT-1 et CAT-
2), la recherche d’inhibiteurs compétitifs endogènes des NOS (ADMA), ou de la
concentration des cofacteurs. Les conditions de recueil des échantillons biologiques de notre
étude n’avaient en effet pas prévu de telles recherches.
86
4.3 Destruction du NO après sa synthèse
Le radical NO a la possibilité d’interagir rapidement, dès sa production, avec de multiples
composés (voir plus haut). Parmi ceux-ci, les radicaux libres oxygénés (RLO) sont
susceptibles d’être produits sur le même site que le NO, et ce par des cellules inflammatoires
possédant les enzymes de la voie de la NADPH-oxydase. L’interaction de NO avec le radical
superoxyde aboutit à la génération de peroxynitrites et de NOx [Pasto, Serrano et coll. 2001].
Dans notre travail portant sur les sinusites nosocomiales, nous avons évalué indirectement la
dégradation du NO dans les cavités sinusiennes en dosant les NOx dans le liquide de lavage
sinusien. Nous avons observé que les NOx ne variaient pas au fur et à mesure du traitement de
la sinusite alors que le NO (gaz) augmentait très sensiblement. Cette observation était
homogène pour l’ensemble des cas étudiés. Il est plausible qu’à la phase de sinusite non
traitée, la faible quantité de NO produite (cf. diminution drastique de l’expression de la
NOS2) soit « transformée » en NOx et de ce fait absente de l’air sinusien. Pendant la phase de
traitement, on peut postuler que l’expression de la NOS2 et la production de NO augmentent
et que la loi d’action de masse régissant la dégradation du NO en NOx aboutisse à une
stabilité de ce dernier composé alors même que la production de RLO a diminué. Pour obtenir
des informations plus directes sur la production de RLO et leur interaction avec NO, deux
techniques auraient pu être utilisées. La première aurait pu consister à doser l’anion
peroxynitrite dans le liquide de lavage sinusien, technique que nous n’avons pu mettre au
point. Une deuxième technique aurait pu consister à obtenir par marquages tissulaires une
quantification des protéines nitrosylées sur leur résidus tyrosine (nitrotyrosine), l’intensité de
ces marquages étant considérée comme proportionnelle à la quantité d’anion peroxynitrite
présent au contact des tissus [van der Vliet, Eiserich et coll. 1999]. Cette technique aurait
toutefois supposé un prélèvement tissulaire (muqueuse sinusienne) que notre travail ne
prévoyait pas.
87
Dans notre travail portant sur les polypes naso-sinusiens, nous avons exploré plus directement
la production de RLO à l’aide d’un marqueur fluorescent [Miller, Gutterman et coll. 1998 ;
Pritchard, Ackerman et coll. 2001]. Nous n’avons pas mis en évidence de différence
d’intensité de marquage entre les polypes de patients atteints de DCP et les patients témoins,
suggérant que la baisse du NO nasal n’est pas due à un piégeage du NO par l’anion
superoxyde.
4.4 Anomalie de localisation subcellulaire de la NOS2
Même si plusieurs hypothèses plausibles peuvent aboutir à la baisse spectaculaire du NO
nasal dans la DCP, le lien entre le substratum génétique de la maladie (mutation touchant une
dynéine) et la baisse de la concentration de NO dans l’air nasal pose question.
La localisation de la NOS2 au versant apical des cellules épithéliales ciliées est consensuelle
[Guo, De Raeve et coll. 1995 ; Lundberg, Farkas-Szallasi et coll. 1995]. Les cellules
épithéliales ciliées, à l’instar de l’ensemble des cellules allant des bactéries aux cellules
nerveuses en passant par la drosophile, sont polarisées [Harris et Peifer 2005]. Les cellules
épithéliales sont le prototype des cellules polarisées, une face étant orientée vars la lumière
d’un organe (organe respiratoire, digestif, urinaire, etc…) ou vers l’extérieur (peau, …). Cette
polarisation est essentielle pour la structure et la fonction d’un épithélium, permettant par
exemple l’absorption intestinale des nutriments ou la clairance respiratoire du mucus
[Navarro-Lerida, Martinez-Moreno et coll. 2007].
Les dynéines font partie des protéines participant à la polarisation des cellules épithéliales. On
peut rappeler que c’est à cause d’un défaut de polarisation au stade embryologique que 50 %
des patients atteints de DCP sont porteurs d’un situs inversus, l’anomalie d’une dynéine
aboutissant à une « randomisation » de la latéralisation des organes [Olbrich, Haffner et coll.
2002]. Au sein de certaines cellules épithéliales, on a pu montrer que des chaînes lourdes de
88
dynéine ont un rôle dans la polarisation cellulaire, cette polarisation incluant l’adressage
apicale de protéines cytoplasmiques [Tai, Chuang et coll. 2001].
La localisation subcellulaire de la NOS2 influence sa fonction. Il a été montré que la NOS2
des epithelia (respiratoire cilié, renal) est localisée dans la région apicale et dirige le NO
produit vers la surface de la cellule [Glynne, Darling et coll. 2002]. Pour que cela se réalise, il
faut que la NOS2 soit associée à l’actine, et interagisse via un domaine C-terminal « PDZ-
binding » à une protéine apicale sous-membranaire appelée EBP50. Il a été suggéré que
l’absence de cet adressage de la NOS2 pouvait avoir au moins deux conséquences : d’une
part, la perte de l’excrétion de NO en dehors de la cellule ; d’autre part la mise en contact du
NO produit avec la cellule elle-même. Ainsi, une anomalie de localisation de NOS2 sans perte
de la fonction de l’enzyme pourrait, compte tenu du caractère potentiellement pro-
inflammatoire de NO, contribuer à l’inflammation de la cellule plutôt qu’à sa défense.
Nous n’avons pas exploré l’hypothèse d’un défaut d’adressage subcellulaire de NOS2 dans la
DCP. Ceci devra constituer l’objectif d’un travail ultérieur. Si cette hypothèse était vérifiée,
elle ne serait pas en contradiction avec l’augmentation de l’arginase II que nous avons
constatée, cette dernière pouvant être induite par des stimuli inflammatoires. Une telle
hypothèse aurait, sur le plan pratique, l’intérêt d’éviter de développer une voie thérapeutique
visant à augmenter la production de NO par les cellules épithéliales ciliées, mais plutôt de
tenter d’en limiter la production afin de diminuer l’inflammation.
89
CHAPITRE V : CONCLUSION GENERALE
ET PERSPECTIVES
90
91
L’objectif de ce travail était d’explorer trois situations particulières dans lesquelles la
production de NO dans les voies aériennes supérieures est susceptible d’être modifiée.
Nous avons obtenu un certain nombre d’informations.
Un premier travail nous a permis de montrer que les corticostéroïdes administrés par voie
générale non seulement ne font pas baisser mais au contraire augmentent la concentration
nasale de NO.
Un deuxième travail a confirmé l’effondrement de la concentration de NO dans les sinus en
cas de sinusite nosocomiale, et a permis de montrer que le traitement de la sinusite permettait
la récupération rapide d’une concentration sinusienne de NO de l’ordre du ppm.
Un troisième travail a permis de montrer que l’effondrement de la concentration nasale de NO
rencontré chez les patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (DCP) n’était pas dû à une
absence d’expression de la NO-synthase de type 2. Nos résultats montrent qu’une
augmentation de l’expression de l’arginase 2 peut participer à la baisse du NO nasal. La suite
que nous souhaitons donner à ce travail concerne la recherche d’un défaut de localisation sub-
cellulaire pouvant être à l’origine d’un défaut « d’externalisation » du NO hors de la cellule
épithéliale ciliée. En effet, sur des cellules épithéliales en cultures, la perte de la co-
localisation entre la NOS2 et l’actine du cytosquelette conduit à une production de NO qui
demeure dans la cellule (où il peut avoir un rôle délétère) plutôt que d’être dirigé hors de la
cellule [Glynne, Darling et coll. 2002]. En nous basant sur ces données, nous allons
rechercher en microscopie confocale si cette co-localisation est ou non perdue chez les
patients atteints de DCP.
92
93
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109
ANNEXES
110
111
ANNEXE 1
112
Short communication
Nasal nitric oxide, the guardian of paranasal sinuses, is
paradoxically increased by high doses of intravenous
glucocorticoids
Glucocorticoids (GCs) are commonly given for a widerange of respiratory diseases including nasal and para-nasal sinuses diseases (1). Very high doses of GCs are alsogiven to patients with multiple sclerosis who present withan exacerbation (2). GCs are employed as anti-inflam-matory and immunosuppressive drugs, because of theirmultiple inhibitory effects on the immune system. In mostcases, GCs also strongly and rapidly inhibit the expres-sion of the type 2 nitric oxide synthase (NOS2) (3). Nitricoxide (NO) generated by NOS2 has a major but complexrole in nonspecific host defense in humans. In mostorgans, basal expression of NOS2 and thereby basal NOconcentrations are very low, while in case of inflamma-tion or infection, NOS2 expression is induced and NOacts as a second line of defense (4). The scenario in theparanasal sinuses appears to be the reverse: the epithe-lium constitutively expresses NOS2, leading to NOconcentrations greater than 20.000 part per billion(ppb) (5), whereas inflammation or infection of the sinusalmost completely suppress paranasal NO production bydown regulation of NOS2 (6).As GCs are believed to downregulate NOS2 in
humans, we aimed to investigate the effect of very highintravenous doses of GCs on the production of NO
within the paranasal sinuses. NOS2 located in theparanasal sinuses is the major source of the NO foundin the nasal cavity in mammals (7) and healthy adults(5, 8). Contrarily to the direct measurement of sinusalNO, measurement of nasal NO is a noninvasive andrepeatable technique. We therefore prospectively meas-ured nasal NO in patients without any respiratory diseasewho received intravenous GCs for an exacerbation ofmultiple sclerosis.
Material and methods
The study protocol was approved by the local ethics committee(CCPPRB Toulouse 2). We included fifteen consecutive nonsmok-ing patients admitted for an exacerbation of multiple sclerosis [fivemen and 10 women, mean (SE) age 34 (2) years], and 30 non-smoking matched control subjects. Control subjects [13 men and17 women, mean (SE) age 31 (3) years] were members of the medicalstaff of the Rangueil–Larrey Hospital. Patients and control subjectsdid not have any history of allergy or chronic airway disorder. Theywere verified to have bilateral ostium patency with a bilateralendoscopy performed by an otorhinolaryngologist. In patients,nasal NO was measured just before they receive methylprednisolone(1000 mg/day for at least 3 days) prescribed for the exacerbation of
Background: High concentrations of nitric oxide (NO) originating from a type-2nitric oxide synthase (NOS2) located within the paranasal sinuses are measuredin nasal air in man. NO is believed to play a central role in nonspecific defense ofparanasal sinuses. Glucocorticoids (GCs), a therapeutic often used for a widerange of diseases, is known to strongly downregulate NOS2.Aims of the study: To investigate the effect of very high intravenous doses of GCson nasal NO in man.Methods: Nasal NO was measured in 15 patients without any history of allergyor chronic airway disorder who were treated for 3 days with a daily dose of1000 mg methylprednisolone for an exacerbation of multiple sclerosis. Nasal NOwas also measured in 30 matched control subjects.Results: In control subjects, the maximal value of nasal NO [mean (SE)] was 233(8) part per billion (ppb), and did not differ from patients with multiple sclerosis[maximum value: 219 (13) ppb; left nostril: 214 (12) ppb; right nostril: 215 (12)ppb]. After GCs treatment, nasal NO increased in patients [maximum value: 250(13) ppb (P < 0.0001); left nostril: 249 (12) ppb (P < 0.0001); right nostril: 244(13) ppb (P < 0.0001)].Conclusions: We conclude that GCs do not decrease but even increase nasal NO.
B. Degano1,2, L. TÞtu1,3, E. Serrano3,4,A. Didier1,3, J. -F. Arnal21Service de Pneumologie, CHU Larrey; 2INSERMU589, CHU Rangueil; 3Groupe de recherche enphysiopathologie de l�inflammation des voiesa�riennes de la Clinique des Voies Respiratoires,CHU Larrey; 4Service d'Otorhinolaryngologie, CHULarrey, Toulouse, France
Key words: epithelium; nitric oxide.
Bruno DeganoCHU LarreyTSA 30030, 31059Toulouse Cedex 4France
Accepted for publication 20 March 2005
Allergy 2005: 60: 1323–1326 Copyright � Blackwell Munksgaard 2005
ALLERGY
DOI: 10.1111/j.1398-9995.2005.00880.x
1323
multiple sclerosis, and 72–80 h after the onset of treatment. Ten of15 patients were treated with interferon-beta-1b (Betaferon�,Schering AG, Berlin, Germany) for more than 2 months. Controlsand patients did not take GCs any route for at least 2 monthsbefore entering the study. To measure nasal NO, we used achemiluminescence NO analyzer (Cosma, Igny, France) samplingwith a constant flow of 0.7 l/min. The probe was connected to anasal olive and gently introduced into the vestibulum of one nostril.The contralateral nostril was left open. Patients were asked tobreathe through the mouth, without speaking or swallowing.Measurements were performed in both nostrils. The atmosphericNO in the room was controlled to be inferior to 5 ppb. Thereproducibility of the measure had been assessed in the controlsubjects by repeating it after 15 min on the same day and byrepeating it every morning from Monday to Friday (day-to-day).The 15-min and day-to-day coefficients of variation were 4 and 6%,respectively (data not shown). Comparisons of data among patientswere made by paired student’s t-test, and comparisons betweenpatients and controls were made by unpaired student’s t-test.Comparisons of data between patients receiving (n ¼ 10) or notreceiving (n ¼ 5) interferon-beta-1b were made by the nonpara-metric U-test of Mann and Whitney. Statistical significance wasaccepted for values of P < 0.05.
Results
In normal subjects (control group), the maximal value ofnasal NO [mean (SE)] was 228 (15) ppb, and did notdiffer from patients with multiple sclerosis [max value:219 (13) ppb; left nostril: 214 (12) ppb; right nostril: 215(12) ppb]. There was no difference in nasal NO betweenpatients receiving or not interferon-beta-1b either beforeor after GCs (Table 1). After GCs treatment, nasal NOincreased in patients [maximum value: 250 (13) ppb,P < 0.0001; left nostril: 249 (12) ppb, P < 0.0001; right
nostril: 244 (13) ppb, P < 0.0001] (Figs 1 and 2). NasalNO in patients after GCs (maximum value, left nostriland right nostril) did not differ from nasal NO in controls(maximum value).
Discussion
This result is the first demonstration that GCs, given atvery high doses for a short time in subjects without upperairway disease, do not decrease but even increase nasalNO. To the best of our knowledge, the effect of GCs onnasal NO was not previously studied prospectively. Lund-berg et al. retrospectively compared nasal NO of fivepatients taking a chronic treatment with oral GCs becauseof solid brain tumors (betamethasone, 4–16 mg/day) with
Table 1. Nasal NO in patients treated (n ¼ 10) or not (n ¼ 5) with interferon-beta-1b, before and after treatment with glucocorticoids (GCs)*
Treatmentwith
interferon-beta-1b
Nasal NO (ppb)
Before GCs After GCs
Left nostril Right nostril Left nostril Right nosril
Patient 1 No 200 180 230 205Patient 2 Yes 340 320 355 360Patient 3 Yes 160 160 180 180Patient 4 Yes 165 175 195 195Patient 5 Yes 200 215 240 235Patient 6 Yes 190 190 210 210Patient 7 No 220 235 295 290Patient 8 Yes 195 190 240 230Patient 9 Yes 205 205 225 225Patient 10 Yes 190 195 235 240Patient 11 No 300 315 330 340Patient 12 Yes 225 220 265 240Patient 13 Yes 185 195 220 210Patient 14 No 200 200 255 255Patient 15 No 240 230 260 250
*There was no significant difference in nasal NO at any time according to thetreatment with interferon-beta-1b (U test of Mann–Whitney).
Controls(maximal value)
400
350
300
250
200
150
50
0
100
Nas
al N
O c
once
ntra
tion
(ppb
)
Patientsbefore GCs
Patientsafter GCs
*
Maximal value
Figure 1. Nasal nitric oxide (NO) concentration [parts per billion(ppb)] in control subjects and inpatients. Thehigher value of nasalNO obtained after measurements in both nostrils was recorded(maximal nasal NO). Maximal nasal NO increased in patientsafter treatment with glucocorticoids (GCs) (*P < 0.0001 vspatients before GCs).
400
350
300
250
200
150
50
0
100Nas
al N
O c
once
ntra
tion
(ppb
)
Before GCs
Left side Right side
After GCs
* *
Before GCs After GCs
Figure 2. The concentration of nasal NO [parts per billion(ppb)] increased in both nostrils in patients after treatment withGCs (*P < 0.0001 vs patients before GCs).
Degano et al.
1324
nasal NO of nine controls (9). The authors concluded thatGCs had no influence on nasal NO, although the patientnumber was very small and the study had retrospectivedesign. In accordance with Lundberg et al., we did not findany significant difference in nasalNObetween controls andpatients after GCs. Only a paired comparison amongpatients showed an effect of GCs on nasal NO.Glucocorticoids are a class of steroid hormones with
pleiotropic effects. At pharmacological concentrations,GCs are used to prevent and suppress inflammation (10).Glucocorticoids exert their anti-inflammatory actionsmainly by modulation of the transcription of a varietyof genes involved in the control of inflammatory proces-ses (10). In phagocytes, GCs inhibit the nicotinamideadenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase thatproduces superoxide anion. Phagocyte-derived superox-ide anion can interact with NO and then contribute todecrease nasal NO (11). GCs may at least partly decreasethe interaction of NO with superoxide anion (and in thatway increase NO availability) via the inhibition ofNADPH-oxidase. This mechanism must, however, be oflittle importance in subjects without nasal disease wherephagocytic cells are rare in the nasal cavity.It can be speculated that the rise in nasal NO after
GCs could be due, at least in part, to an improvement ofthe communication between paranasal sinuses and nasalcavity. Indeed, it was clearly shown that in patients withostia occluded by polypes, improvement of the commu-nication between the sinuses and the nasal cavities afterpolypectomy may increase nasal NO (12, 13). Moreover,we only verified ostium patency with a nasendoscopy,because the experimental design of our study did notallow us to perform a precise assessment of ostium by CTor MRI scan. However, the contribution of an increaseof ostium patency to the rise in nasal NO is not certainfor at least to reasons. First, patients and controls werefree from any history of allergic or obstructive upperairway disease. Second, Weitzberg et al. suggested thatnasal NO measured during quiet breathing in subjectswith patent ostia does not depend on the size of theostia (14).We studied 15 patients with multiple sclerosis, among
whom 10 were treated with interferon-beta. We did not
find any influence of this latter treatment on nasal NO atany time. Interferon-beta has however been reported tointerfere with the production of NO and the expression ofNOS2, but the findings depend on the model. Interferon-beta acts as a co-activator of NOS2 expression in murinemacrophages (15), but decreases the production of NO inhuman astrocytoma cells (16) and the expression ofNOS2 in human glial cells (17).
It was largely demonstrated that GCs decrease NOS2transcription in inflammatory conditions (18). However,patients with maxillary sinusitis and sepsis who hadconsiderably lower maxillary NO concentrations thancontrols before sinus fenestration increased their maxil-lary sinus NO release in the time period followingfenestration despite of ongoing corticosteroid therapy(6). In particular, the single patient who reached amaxillary sinus NO concentration in the range of thecontrols after fenestration still received hydrocortisone ata dose of 250 mg/day at the time of the measurement (6).Last but not least, it was demonstrated that dexameth-asone enhanced NO production by the human astrocy-toma cell line (16). Then, the hypothesis that GCs mayincrease paranasal and/or nasal NO production in ourstudy population cannot be discarded.
Glucocorticoids are among of the most often usedtherapies for sinus and nasal diseases, especially inchronic inflammation. It is possible that the spectacularefficacy of GCs is due, at least in part, to the preservationof the first line of host defense (i.e. high NO) that appearsto be specific to this anatomic site. However, despiteshort-term beneficial effects, long-term effects of GCsshould be considered due to the numerous effects on geneexpression.
Acknowledgments
We are especially indebted to Doctor Mathieu Rigal, from theDepartment of Neurology of Rangueil, and to Doctor FrederiqueViala, from the Department of Neurology of Purpan, who kindlyhelped us to recruit the patients.
This work was sponsored by the University Hospital of Toulousefor regulatory and ethic submissions.
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Glucocorticoids increase nasal nitric oxide
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Degano et al.
1326
117
ANNEXE 2
118
Effect of Treatment on Maxillary Sinusand Nasal Nitric Oxide Concentrationsin Patients With Nosocomial MaxillarySinusitis*
Bruno Degano, MD; Michele Genestal, MD; Elie Serrano, MD;Jacques Rami, PhD; and Jean-Francois Arnal, MD, PhD
Study objectives: In maxillary nosocomial sinusitis (MNS) related to severe sepsis, nitric oxide(NO) concentration in the maxillary sinuses is drastically reduced secondarily to a downregulationof type-2 NO synthase. NO plays a major role in nonspecific immune defense of sinuses. Wetherefore aimed to study maxillary NO concentration during the treatment of MNS with drainage,daily lavage, and removal of any nasally introduced tube.Patients and methods: Nine patients were studied during the first 4 days of treatment of MNS. Wemeasured the concentration of NO gas in the maxillary sinus and in the nasal cavity, and the NOmetabolite levels (nitrites/nitrates [NOx]) in the sinus lavages.Measurements and results: Maxillary NO concentration (median [25 to 75 percentile]) increasedfrom 70 parts per billion (ppb) [40 to 100 ppb] to 2,050 ppb (1,700 to 3,000 ppb) after 4 days oftreatment of MNS (p < 0.0001). In the meantime, nasal NO increased from a median of 100 ppb(98 to 148 ppb) to 180 ppb (180 to 188 ppb) [p < 0.001]. At any time, there was a correlationbetween maxillary NO (logarithmic value) and nasal NO (r2 � 0.57, p < 0.0001). NOx levelsremained stable in the lavages.Conclusions: We conclude that the treatment of the sinusitis with drainage, daily lavage, andremoval of the gastric tube lead to a spectacular increase of maxillary and nasal NOconcentrations. (CHEST 2005; 128:1699–1705)
Key words: nitric oxide; nosocomial maxillary sinusitis; sepsis
Abbreviations: CRP � C-reactive protein; MNS � maxillary nosocomial sinusitis; NO � nitric oxide; NOS � nitricoxide synthase; NOS2 � type-2 nitric oxide synthase; NOx � nitrites/nitrates; PCD � primary ciliary dyskinesia;ppb � parts per billion; SOFA � sepsis-related organ failure assessment
N itric oxide (NO) is implicated in a wide range ofdisease processes, exerting both detrimental and
beneficial effects.1 NO is a free-radical gas generatedfrom L-arginine by a family of enzymes, the NOsynthases (NOS).2 NO generated by the type 2 NOS
(NOS2) has a major role in nonspecific host defensein humans.3 In most organs, basal expression ofNOS2 and thereby basal NO concentrations are verylow, while in case of inflammation or infection,NOS2 expression is induced and NO acts as a secondline of defense.4 In case of severe sepsis, induction ofNOS2 results in sustained production of NO for aprolonged period of time, and this increased NOproduction plays a pivotal role in hypotension, lead-ing to septic shock.5 The scenario for host defense inthe paranasal sinuses appears to be exactly thereverse: the epithelium constitutively expressesNOS2, leading to NO concentrations of 5,000 to20,000 parts per billion (ppb),6 whereas in case ofmaxillary sinusitis related to severe sepsis and septicshock, paranasal NO production is almost completelysuppressed due to a downregulation of NOS2.7
Maxillary nosocomial sinusitis (MNS) is a fre-quently unrecognized cause of fever in critically ill
*From Service de Pneumologie (Dr. Degano), Serviced’Otorhinolaryngologie (Dr. Serrano), and Service d’ExplorationFonctionnelle Respiratoire (Dr. Rami), CHU Larrey, Toulouse,France; INSERM U589 (Dr. Arnal), CHU Rangueil, Toulouse,France; and Unite de Reanimation Polyvalente et Hyperbare(Dr. Genestal), CHU Purpan, France.This work was supported by a grant from the Clinical ResearchHospital Program from the French Ministry of Health 2001(PHRC No. 0103508).Manuscript received December 12, 2004; revision acceptedMarch 20, 2005.Reproduction of this article is prohibited without written permissionfrom the American College of Chest Physicians (www.chestjournal.org/misc/reprints.shtml).Correspondence to: Bruno Degano, MD, CHU Larrey, TSA30030, 31059 Toulouse Cedex 4, France; e-mail: [email protected]
www.chestjournal.org CHEST / 128 / 3 / SEPTEMBER, 2005 1699
patients.8 Treatment classically consists in sinusdrainage and lavages, nasal tracheal tube removal ortracheotomy, nasal gastric tube removal, and paren-teral antibiotics.9 The underlying mechanisms forfluid retention and compromised immune defense inMNS are poorly understood. The sinuses communi-cate with the nasal cavity through a narrow ostium.Blockage of this ostium by nasal tubing has beenconsidered to be a central event in the pathogenesisof sinusitis, but this is still controversial.10 Deja et al7have described a drastic reduction of maxillary NOconcentration in patients with MNS. Simple inflam-mation of the sinus mucosa (without evidence ofinfection) was associated with dramatic inhibition ofthe expression of NOS2 within the epithelium. Theresultant substantial decrease of intracavitary NOmay account for marked impairments of nonspecifichost defenses, thus promoting mucus accumulationand rapid superinfection.11
The aim of the present study was to investigate theeffect of treatment of MNS (drainage, daily lavage,and removal of nasally introduced tubes) on NOconcentration in the maxillary sinus and in the nasalcavity. We also measured NO metabolite levels(nitrites/nitrates [NOx]) in the sinus lavages.
Materials and Methods
Study Population
This prospective study was conducted in a 16-bed ICU at theteaching hospital in Toulouse, France. The study protocol wasapproved by the local ethics committee. Patients enrolled in thestudy fulfilled all the following criteria: (1) age � 18 years, (2)endotracheal intubation, (3) mechanical ventilation for � 72 h,and (4) criteria of severe sepsis, according to the currentdefinition.12 The worst simplified acute physiology score IIduring the first 24 h of intensive care stay was recorded.13 Thesepsis-related organ failure assessment (SOFA) score14 was cal-culated retrospectively for the 4-day follow-up. For each patient,the worst value for each organ system (respiratory, cardiovascu-lar, renal, coagulation, liver, and neurologic) in each 24-h periodwas considered. Patients were excluded from the study if theymet at least one of the following criteria: (1) history of sinusitis,(2) transfer to the radiology department considered by theattending physician as a high risk of morbidity because of severerespiratory state, or (3) coagulation disorders contraindicatingtransnasal puncture. Patients underwent a routine fever workupthat included a chest radiograph, urine analysis with culture, andblood cultures. When these studies failed to identify the source ofthe fever or if fever was persistent despite administration ofantibiotics effective against isolated causative organisms of adiagnosed infection, CT of the paranasal sinuses (5-mm incre-mental thickness scans in the axial plane) was performed within24 h. Maxillary sinusitis was defined as the presence of unilateralor bilateral opacification on a CT scan, reflecting air/fluid levelsand/or opacification within the maxillary sinuses. Patients withradiographic maxillary sinusitis underwent transnasal puncture ofthe maxillary sinus involved and placement of an Albertini drain(Porges SAS; Le Plessis Robinson, France). The antibiotic regi-men was not modified during the follow-up.
Microbiological Examination
Transnasal sinus puncture was performed by an otorhinolaryn-gologist using a standardized protocol; nostrils were disinfectedwith antiseptic solution (povidone-iodine solution). If necessary, ageneral anesthesia was induced, using a combination of sufenta-nyl and midazolam. Transnasal puncture of the maxillary sinuseswas performed using an Albertini trocar. Sinus contents weredirectly aspirated prior to lavage and immediately transported forbacteriologic examination. An Albertini drain was left in the sinuscavity.
Gas Sampling and NO Measurements
For gas sampling in the sinus, the Albertini drain was con-nected to a glass syringe. The atmospheric NO in the room wascontrolled to be inferior to 5 ppb. We collected 250 mL of gas inaliquots of 50 mL with a continuous aspiration rate of 0.1 L/min.The five syringes were pooled in an inert plastic bag (Tedlar bag;Hoffmann-Plastiques; Saint-Etienne, France), and NO concen-tration was measured immediately by a chemiluminescence NOanalyzer (Cosma; Igny, France) sampling with a constant flow of0.7 L/min.
To measure nasal NO, we used the same chemiluminescenceNO analyzer (Cosma) sampling with a constant flow of 0.7 L/min.The probe was connected to a nasal olive and gently introducedinto the vestibulum of one nostril. The contralateral nostril wasleft open. Measurements were performed in both nostrils.
Lavages
The sinuses were irrigated with 20 mL of sterile saline solutionin order to remove pus from the surface of the sinuses so that a“true” lavage could be obtained with minimal effects frombacterial debris.15 Lavage was then performed with 5 mL salinesolution and immediately reaspirated into a plastic syringethrough the Albertini drain. The lavage was immediately placedon ice, removed from light, and subsequently stored at � 80°Cuntil assay for NOx was performed.
Measurement of NOx
Samples were assayed in duplicate for oxidation end-product ofNO (NOx). Nitrate (NO3
-) in the samples was first reduced tonitrite (NO2
-) by incubating the samples for 1 h with Escherichiacoli nitrate reductase enzyme prepared from bacteria grownunder anaerobic conditions, in the presence of nicotinamideadenine dinucleotide phosphate and flavine adenine dinucleotide(Boehringer-Mannheim; Mannheim, Germany). NO2
- levelswere then determined by the Griess reaction by measuring theabsorbance of each sample at 543 nm. The total amount of nitritewas expressed in micromoles per liter.
Statistics
The data were expressed as median (25 to 75 percentiles).Comparisons were made by the Friedman analysis of variancefollowed by posttests of Wilcoxon with a correction of Bonferroni.The correlation analysis was performed with the Pearson corre-lation test for n � 30 and with the Spearman correlation test forn � 30; p � 0.05 was considered significant. Analysis was per-formed using statistical software (SPSS version 11.0; SPSS;Chicago, IL).
Results
A total of nine patients fulfilling the inclusioncriteria completed the whole procedure during a
1700 Clinical Investigations in Critical Care
1-year period. Patient characteristics are displayed inTable 1. At inclusion, intubation was performedthrough the oral route in all patients, and a gastrictube was placed through the nasal route in allpatients.
The median (25 to 75 percentile) NO concentra-tion measured in the maxillary sinuses within 6 h ofdrain placement was 70 ppb (40 to 100 ppb) In themeantime, nasal NO in the nostril homolateral to thedrainage was 100 ppb (98 to 148 ppb), and NOxconcentration in the lavage was 12.0 �mol/L (11.6 to14.0 �mol/L).
Maxillary NO concentration and nasal NO in-creased significantly on measurements conductedduring the 4 days following the onset of treatment(Fig 1, 2). We found a correlation between SOFAscore and sinus NO at day 4 (Fig 3). There was acorrelation between maxillary NO (logarithmicvalue) and nasal NO (Fig 4). In the meantime, NOxconcentration in the lavage (Fig 5) did not changesignificantly.
Discussion
To study NO in paranasal sinuses of patients withsevere sepsis treated for a MNS, we measured NOlevels in the sinus and in the nose daily during the 4days of drainage. Our data confirm that such patientspresent with very low NO concentration within themaxillary sinuses. We found that maxillary NO in-creased with the treatment of the sinusitis withdrainage, daily lavage, and removal of the gastrictube. We also found that nasal NO increased in themeantime, and that nasal NO (logarithmic value) wascorrelated with maxillary NO.
Deja et al7 clearly demonstrated that the reductionof maxillary NO concentration in patients with MNSwas secondary to a downregulation of NOS2 withinthe ciliated epithelial cells of the maxillary sinus
mucosa; however, those authors did not study thetwo other isoforms of NOS (NOS type 1 and NOStype 3), and they did not investigate the mucosaduring the recovery of the MNS for any isoforms ofNOS. In our study, we did not investigate directlythe sinus mucosa at any time. We therefore cannotconclude about which type of NOS is involved in theincrease of NO within the sinus cavity during recov-ery. However, Lundberg et al6 showed that NOS2was the only isoform that displayed a positive stain-ing in immunohistochemistry and in situ hybridiza-tion in normal sinus mucosa. We therefore believethat NOS2 is the major (if not the only) enzymepresent in the ciliated epithelium either in normal6or inflamed7 sinus mucosa, and that NOS2 also playsthe major role in the restoration of NO gas withtreatment of MNS.
The increase of NO concentration in the sinus airmay be related not only to an increase of productionby NOS but also to a decrease of catabolism. In orderto approach the NO catabolism, we measured thelevels of metabolic end products of NO (NOx) in thesinus lavage. We found that NOx was almost stablewhile NO gas increased. This stability of NOx mayhave several explanations. First, NOx is generated bythe interaction between NO and superoxide anion(O2
-).16 Sinusitis induces the recruitment of phago-cytic cells in the sinus cavity (monocyte/macrophageand polymorphonuclear), which on activation gener-ate large amounts of O2
-. Because NO and O2- both
contain an unpaired electron, they rapidly reacttogether, leading to the secondarily production ofnitrite and nitrate, which could explain the initialconcentration of NOx (relatively low NO gas and lowO2 gas, and relatively high O2
-). Second, induction ofNOS2 in the airway epithelium is expected to in-crease levels of NO gas in air and, in the meantime,to increase the metabolic end products NOx inrespiratory tract fluids.17 Indeed, in aqueous aerobic
Table 1—Description of Patients*
PatientNo.
Age,yr
MainDiagnosis
Microorganisms Isolatedin Sinus Puncture
SAPSII
SOFAScore
(Day 0)
SOFAScore
(Day 4)
CRP(Day 0),
mg/L
CRP(Day 4),
mg/L
1 45 COPD Pseudomonas aeruginosa 33 5 5 230 1852 25 Aspiration pneumonia Staphylococcus epidermidis anaerobe 39 10 9 302 3243 47 ARDS Acinetobacter baumanii anaerobe 31 10 10 110 894 28 Thoracic trauma Streptococcus spp 37 4 4 115 1235 62 Abdominal surgery P aeruginosa 42 8 6 410 1956 69 Abdominal surgery Staphylococcus aureus anaerobe 32 12 11 365 3787 78 COPD S epidermidis; E coli 38 6 7 105 968 59 COPD P aeruginosa 35 5 4 157 1029 32 Aspiration pneumonia E coli 36 8 7 268 296
*SAPS II � simplified acute physiology score II (calculated during the first 24 h of intensive care stay).
www.chestjournal.org CHEST / 128 / 3 / SEPTEMBER, 2005 1701
solution, NO autoxidizes and hydrolyzes to yieldnitrite.18 Based on kinetic data and NO concentra-tions, this reaction of NO with O2 is expected to bemuch slower than the reaction between NO andO2
-.19 This could account for the final concentrationof NOx during the recovery of MNS (relatively highNO and high O2, and relatively low O2
-). Third, NOx
concentration may be decreased by the presence ofbacteria, especially during the initial phase of MNStreatment.3 Many bacteria we found in the sinussputum, such as Pseudomonas and E coli, are deni-trifying and consume NOx during protein synthesisand energy production.
A question arises to know whether the fall in sinus
Figure 2. Time course of nasal NO concentration in patients. *p � 0.001 vs day 0. **p � 0.0001 vsday 0.
Figure 1. Time course of maxillary sinus NO concentration in patient with MNS and severe sepsis(n � 9). Maxillary NO was measured within 6 h of drain placement (day 0), and then during the first4 days of treatment. *p � 0.001 vs day 0. **p � 0.0001 vs day 0.
1702 Clinical Investigations in Critical Care
NO concentration is a cause or a consequence ofMNS. Deja et al7 clearly showed that the drops inNO concentration and in NO production in MNSwere related to sepsis and not to sinus infection.According to this scenario, low NO concentrationcould impair ciliary motility and cytotoxic activityagainst microorganisms and thus increase the risk forsecondary superinfection. We found a relationshipbetween SOFA score and sinus NO at day 4, sug-
gesting that the severity of illness was associated withlow NO concentration and thus with impaired localdefense. However, we also measured a spectacularincrease of NO at day 4 compared to day 0, while theSOFA score and the inflammatory marker C-reactiveprotein (CRP) did not decrease significantly in themeantime. We therefore believe that the local treat-ment of MNS associating drainage, lavage, and re-moval of nasally introduced tubes contributes to the
Figure 4. Nasal and maxillary NO concentrations. There was a correlation between nasal and maxillaryNO (r2 � 0.57, p � 0.0001).
Figure 3. NO concentration in the maxillary sinus and SOFA score at day 4. There was a correlationbetween SOFA score and sinus NO (r2 � 0.84, p � 0.01).
www.chestjournal.org CHEST / 128 / 3 / SEPTEMBER, 2005 1703
increase in sinus NO and thus to a restoration of thelocal defense of the paranasal sinuses.
An interesting finding of this study is that nasalNO increased during the treatment of MNS. More-over, nasal NO was well correlated with maxillaryNO. This is in agreement with a study20 conducted inchildren with acute sinusitis, whose concentration ofnasal NO was initially very low and returned tonormal after antibiotic therapy. Lindberg et al21
reported that patients with chronic sinusitis had asignificantly lower nasal NO than healthy subjects.After sinus surgery, the nasal NO of the patients withsuccessful outcome of surgery increased to the samelevel than subjects.21 Those results are most oftenbelieved to be a consequence of a restoration of thesinus ostium permeability rather than a restoration ofmaxillary NO concentration. As we found that thenasal NO concentration was well correlated withmaxillary NO, our data strongly suggest that theincrease of maxillary NO largely participate in theincrease of nasal NO.
We found that maxillary NO increased as early as2 days after the onset of treatment. This is not inaccordance with the findings of Deja et al,7 whofound an increase of sinusal NO that was delayed andlower than ours. There are at least two explanationsfor this discrepancy. First, Deja et al7 performedfenestration, while we performed drainage. It ispossible that fenestration lead to a better ventilationof the sinus but also to a slower increase of NO gasconcentration within the sinus. Second, we per-formed a daily lavage of the sinus cavity, which couldlead to a better elimination of bacteria and mononu-clear cells, and then to a better NO availability.
There are some limitations in our study. The mainlimitation is the uncontrolled design. We did notinclude a control group of untreated patients forethical reasons. Indeed, Holzapfel et al22 clearlydemonstrated that the treatment of nosocomial si-nusitis decreased the occurrence rate of nosocomialpneumonia in patients undergoing prolonged me-chanical ventilation. Another limitation is the smallsample size. Despite the 1-year period of enrollment,only nine patients completed the study. Four werepatients who were discarded because it was impos-sible to aspirate gas from the sinus through theAlbertini drain; in these four patients, the evolutionof nasal NO was, however, similar to the nineincluded patients (data not shown). We did not lookfor the diagnosis of primary ciliary dyskinesia (PCD)in our patients, although a dramatically low nasal NOwas clearly described in such patients. It is, however,unlikely that one of our patients had PCD for at leastthree reasons. First, PCD is a very infrequent dis-ease, with a prevalence of 1/16,000.23 Second, thepatients in our study had no history of sinus disease,which is common in PCD. Third, all of our patientshad a nasal NO � 150 ppb, which is higher than theconcentration usually found in PCD.24,25
In conclusion, we found that in patients with MNSthe impaired concentration of maxillary NO spectac-ularly increased with the treatment of the sinusitiswith antibiotics and daily lavages. We also found thatnasal NO increased in the meantime. According tothe important role of NO on ciliary function andnonspecific immune defense, the restoration of nasaland maxillary NO could contribute to prevent max-illary cavity superinfection and eliminate one of the
Figure 5. Time course of NO metabolites concentration (NOx) within the maxillary sinus lavage inpatient (n � 9). NOx concentration did not change significantly.
1704 Clinical Investigations in Critical Care
reasons why the lung is a target organ for nosocomialmicroorganisms in critically ill patients receivingmechanical ventilation.
ACKNOWLEDGMENT: The authors thank Marie-Jose Fouquefor technical assistance. They also are indebted to Drs. SebastienVerges and Bertrand Gardini from the Department of Otorhino-laryngology, and Dr. Jacques Giron from the Department ofRadiology.
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www.chestjournal.org CHEST / 128 / 3 / SEPTEMBER, 2005 1705
126
127
ANNEXE 3
128
129
Exploration of nitric oxide synthases in nasal polyps from patients with primary ciliary
dyskinesia.
Bruno Degano1,2, Séverine Valmary3, Elie Serrano4, Jean-François Arnal2
1Department of Respiratory Medicine, CHU Larrey, Toulouse, France; 2INSERM U858 -
I2MR, CHU Rangueil, Toulouse, France; 3Department of Pathology, CHU Purpan, Toulouse,
France; 4Department of Otorhinolaryngology, CHU Larrey, Toulouse, France
Address Correspondence to: Bruno Degano, CHU Larrey, TSA 30030, 31059 Toulouse
Cedex 4, France.
Phone: 33 5 67 77 17 40, FAX: 33 5 67 77 14 76, E-mail: [email protected]
Short title: nitric oxide synthases in primary ciliary dyskinesia
Key words: nitric oxide; primary ciliary dyskinesia; nasal polyps
130
Abstract
Patients with primary ciliary dyskinesia (PCD) have very low concentration of nasal nitric
oxide (NO) regardless of the type of ciliary ultrastructural defects. The mechanisms
underlying this drop of NO are however unknown. In order to address this, we analysed some
of the putative causes for NO decrease in 5 PCD patients and 10 aged and sex matched non-
allergic patients (control group) undergoing nasal endoscopic polypectomy.
The nasal NO concentration (mean of the right and left concentration ± SD) in PCD patients
was lower than in controls (10 ± 7 ppb vs. 205 ± 48 ppb, p<0.0001). Immunohistochemistry
displayed a distinct NO-synthase 2 (NOS2) staining in the apical part of the ciliated epithelial
cells which was similar in PCD and control patients, whereas NOS3 staining was restricted to
endothelial cells. NADPH-diaphorase staining was positive in both groups, being localized in
the apical part of the ciliated epithelial cells and in endothelial cells. Superoxide production,
assessed by in situ dihydroethidium labelling, did not differ between PCD and control
patients. Equally arginase 1 expression was found, but arginase 2 expression was higher in
PCD patients than in controls.
We conclude that the drop in nasal NO concentration in PCD patients is not secondary to the
loss of NOS2 expression and function, but may be secondary, at least in part, to a decrease of
substrate biodisponibility due to increased arginase 2 expression.
131
Introduction
Primary ciliary dyskinesia (PCD) is an autosomal recessive disease in which abnormal or
absent beating of cilia hinder normal mucociliary clearance. The commonest presentations are
in the upper and/or lower respiratory tracts, with mucus retention and recurrent infection
leading to nasal polyposis and/or bronchiectasis (1). Diagnosis relies on a combination of
clinical evaluation and electron microscopic analysis of ciliary ultrastructure (2). Patients with
PCD have also very low levels of nasal nitric oxide (NO) concentration regardless of the type
of ciliary ultrastructural defects (3). The measurement of nasal NO has therefore become a
helpful tool to screen patients with clinical symptoms suggestive for PCD and to decide on the
need for further, more invasive testing (4).
In upper airways in humans, NO in thought to play a major role in non-specific host defence
and regulation of ciliary motility (5, 6). NO is a free radical gas generated from the semi-
essential amino-acid L-arginine and molecular oxygen by a family of enzymes, the NO
synthases (NOS). Three isoforms of NOS are known, NOS1 and NOS3 being constitutive and
calcium-calmodulin dependant, and NOS2 being inducible and calcium-calmodulin
independent (7). NO measured in nasal air is mainly produced in the epithelial cells of the
nasal cavity, particularly in the paranasal sinuses, by a constitutively expressed NOS2 (6). A
number of variables collectively dictate the concentration of NO measured in the nasal cavity.
Nasal NO is reduced in the absence of paranasal sinuses (8) and when naso-sinusal ostia are
occluded (9). The amount of NO that is produced by cells depends on factors including the
amount of NOS and the availability of substrates and cofactors (10, 11). Normally produced
NO can be inactivated in aqueous phase through interaction with superoxide anion (O2·)
(12). Moreover, correct apical localization of NOS2 together with interaction of NOS2 with
apical proteins like actin and EBP-50 are mandatory in order to direct vectorial NO outside
the epithelial cells.
132
With the purpose to approach the cause(s) of the very low nasal NO measured in PCD, we
investigated some of the putative causes for NO decrease in patients with PCD undergoing
nasal polyp ablation.
133
Methods
Patients
Nasal polyps were obtained from 5 PCD patients and 10 aged and sex matched non-allergic
patients (control group) undergoing nasal endoscopic polypectomy. A definitive diagnosis of
PCD was made on the basis of abnormal ciliary ultrastructure after electron microscopic
analysis. For immunohistochemistry, sections were taken from paraffin-embedded normal
paranasal sinus mucosa and inflammatory polyps in allergic patients retrieved from our files
at the Purpan Hospital in Toulouse.
In all subjects with nasal polyposis, glucocorticoid treatment was discontinued at least 2
weeks before surgery. None had suffered from upper respiratory infection during the 4 weeks
before surgery. Patients and controls had multislice computed tomography (MSCT) before
polypectomy was performed. The study protocol was approved by the local ethics committee
(CCPPRB Toulouse 1).
Tissue preparation
The nasal polyps were collected at the time of surgery. One part (~0.5 cm3) was fixed in
Formalin for 24 hours and then embedded in paraffin, and one part (~3 cm3) was frozen in
isopentane and stored at -80°C for further analysis.
Microscopic analysis
Surgical specimens were examined using standard haematoxylin-eosin staining methods by a
pathologist who was blind to the clinical data. The abundance of inflammatory cells was
estimated using a semiquantitative score: 1 for a low number of inflammatory cells, 2 for a
moderate infiltration by inflammatory cells on the chorion surface, and 3 for an intense
134
infiltration by inflammatory cells on the chorion surface. Inflammatory cells, including
eosinophils, lymphocytes, plasma cells and polymorphonuclear cells, were then quantified
and the results were related to 100 inflammatory cells.
Nasal nitric oxide measurement
Nasal nitric oxide (NO) concentration was measured using a chemiluminescent analyzer
(EVA4000, Seres, France) with a lower limit of detection of 1 ppb sampling with a constant
flow of 0.5 L.min-1. The probe was connected to a nasal olive and gently introduced into the
vestibulum of one nostril. The contralateral nostril was left open. Subjects were asked to
breathe through the mouth, without speaking or swallowing. Measurements were performed
and repeated twice in both nostrils. An average value was calculated from the right and left
values and was recorded as nasal NO concentration. The atmospheric NO in the room was
controlled to be inferior to 5 ppb.
Immunohistochemistry
Immunostaining on paraffin sections was performed using the method described elsewhere
with little modifications. Briefly, paraffin sections were mounted on glass slides coated with
silane (Sigma chemical Co, Saint Quentin, France). Sections were deparaffinized, placed in
10mmol/L Na-citrate buffer (pH=6), and heated in a microwave oven (Whirlpool model;
Philips, Eindhoven, Holland) at 900 Watts for cycles of 20 minutes and 10 minutes. The
slides were removed from the oven and allowed to cool for 30 minutes at room temperature.
After washing in water, endogenous peroxidase was blocked with 1% hydrogen peroxide in
methanol for 30 minutes. Slides were then rinsed in PBS before staining with a streptavidin-
biotin three stage technique, with the DAKO Strept ABC complex/HRP Duet kit (Dako, code
No. K492, Carpinteria, CA, USA). In parallel, amplification with catalysed system
135
amplification (CSA, Dako, Carpintera, CA, USA) was applied according to the supplier
recommendations.
Immunostaining on frozen sections was performed according the alkaline phosphatase
antialkaline phosphatase technique without prior antigen reactivation. The working dilution of
the antibody was identical to that of paraffin sections.
To localize NOS isoforms and arginases in the tissue samples, immunohistochemistry was
performed with the following characterized specific antibodies: monoclonal anti-NOS1 (clone
N31020; 250 µg/ml; working dilution 1:100; Transduction Laboratories, Lexington, KY);
monoclonal anti-NOS2 (clone N32020; 250 µg/ml; working dilution 1:200; Transduction
Laboratories, Lexington, KY); monoclonal anti-NOS3 (clone N30020; 250 µg/ml; working
dilution 1:200; Transduction Laboratories, Lexington, KY); polyclonal anti-arginase 1 (clone
H-52; 200 µg/ml; working dilution 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Inc); polyclonal anti-
arginase 2 (clone H-64; 200 µg/ml; working dilution 1:200; Santa Cruz Biotechnology, Inc).
Intensity of staining was quoted from “0” (absence of staining) to “+++” (intense staining) by
two blinded independent readers.
NADPH diaphorase staining
Frozen sections (4 µm, post-fixed for 30 seconds in 4 % formaldehyde) were rinsed with Tris-
HCl buffer (100mM, pH 7.6 – 7.8). The slides were then incubated at room temperature with
a mixture consisting of 4-nitroblue tetrazolium chloride (0.2%, Boeringer Manheim), β-
NADPH (1 mM, Sigma) and Triton X-100 (0.2 %) in Tris-HCl buffer for 90 min, as described
previously. Sections were then washed in cold Tris-HCl buffer and covered with Aquatex
mounting medium (Merck, Darmstadt, Germany). For control purposes, either the β-NADPH
was omitted or the 15 mM ρ-nitrophenylphosphate was added to inhibit endogenous
phosphatases that can cause false-positive staining.
136
Dihydroethidium labelling
To measure superoxide (O2·) production in polyps in situ, frozen cross sections were stained
with the oxidative fluorescent dye dihydroethidium (DHE) using a previously validated
method. In the presence of O2·, DHE is converted to the fluorescent molecule ethidium,
which can then label nuclei by intercalating with DNA. Ethidium is excited at 488 nm with an
emission spectrum of 610 nm. Fresh-frozen unfixed sections of polyps (10 µm) were stained
with 10 µM DHE (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) in a light-protected
humidified chamber at 37°C for 30 minutes, rinsed, counterstained with nuclear fast red,
mounted, and observed using fluorescent microscopy.
Statistical analysis
The data were expressed as median (percentile 25 – percentile 75). Comparisons were made
by the Friedman’s analysis of variance (ANOVA) followed by post tests of Wilcoxon with a
correction of Bonferroni. A p value less than 0.05 was considered as significant. Analysis was
performed with the SPSS program (SPSS, Chicago, Illinois, USA).
137
Results
Subject’s characteristics are summarized in Table 1. The number of abnormal and occluded
paranasal sinuses did not differ between PCD patients and controls patients. The histological
study showed a similar percentage of eosinophils, lymphocytes, polymorphonuclear cells, and
plasma cells in the two groups, as shown in Table 1. The nasal NO concentration (mean of the
right and left concentration ± SD) in PCD patients with nasal polyposis (10 ± 7 ppb, n = 5)
was significantly lower compared with that of the controls patients with nonallergic polyposis
(205 ± 48 ppb, n = 10, p<0.0001).
NOS protein
We first verified that the NO-synthases staining was strictly similar in normal sinus mucosa
from patients without PCD and in polyps from controls (data not shown).
Immunohistochemistry displayed a distinct staining in the apical part of the ciliated epithelial
cells but no staining in endothelial cells with the antibody raised against NOS2. There was no
difference in NOS2 staining between PCD and control patients (Fig. 1). Antibodies raised
against NOS1 and against NOS3 did not stain the epithelium. A staining was however shown
in endothelial cells with NOS3 antibody in both groups and in normal sinus mucosa (Fig. 1).
Because we did not find any staining for NOS1 in the sections of polyps, NOS1 antibody was
verified to stain normal human brain tissue (data not shown).
NADPH-diaphorase staining
NADPH-diaphorase staining was positive in all nasal polyp tissues studied, being localized in
the apical part of the ciliated epithelial cells (Fig. 2) and in endothelial cells (data not shown).
No staining was found in control sections incubated either without NADPH or in the presence
of ρ-nitrophenylphosphate (data not shown).
138
Arginases expression
Arginase 1 staining was strong but similar in DCP and control patients (data not shown). For
arginase 2, immunohistochemistry displayed a moderate staining in the epithelium in the
control group, but an intense staining in the epithelial cells of polyps from DCP patients (Fig.
3). In the PCD group, staining was “+++” in 4 patients and “++” in the other patient. In the
control group, staining was “+” in 8 patients and “++” in 2 patients (p<0.001). We also noted
an intense staining for arginase 2 in polyps from allergic patients with intense infiltration by
inflammatory cells on the chorion surface (data not shown).
Dihydroethidium labelling
Using appropriate controls, we observed a red staining that was related to the presence of O2·
in epithelial cells and inflammatory cells. We however were unable to find any difference in
quantitative staining between DCP and control patients (Fig. 4).
139
Discussion
The major results of our study are that in PCD patients how have markedly lower nasal NO
than controls (i) NOS2 is equally expressed in epithelial ciliated cells, (ii) NOS2 is active ex
vivo, (iii) superoxide anion production is not increased and (iv) arginase 2 expression is
increased compared to controls.
Air sampled from the nostrils is supposed to reflect the balance between production and
catabolism of NO from the upper airways, namely the parasasal sinuses and the nasal cavities.
In normal subjects, the large majority of the measured NO is produced by a type 2 nitric oxide
synthase (NOS2) that is constitutively expressed at the apical side of the ciliated epithelial
cells of the sinus cavities and, to a lesser extend, of the nasal cavities. Here, we confirm that
despite the anatomical persistence of paranasal sinuses, NO completely collapsed in patients
with PCD (4). In contrast, for a similar degree of paranasal sinus alteration and of polyposis,
nasal NO was preserved in control patients with non-allergic polyposis (13). It is important to
take into account the degree of alteration of the sinuses because a drop of nasal NO
concentration can be encountered due to the absence (8) and/or the occlusion (9) of paranasal
sinuses. Indeed, Levandowski et al. showed that baboons, who constitutively have no
paranasal sinus cavities, have very low nasal NO concentration (∼ 1 ppb) compared to the
nasal concentration measured in rhesus monkeys which have paranasal sinuses (∼ 100 ppb)
(8). On the other hand, Baraldi et al. reported that nasal NO was clearly reduced in infants
with sinus occlusion due to acute sinusitis, and that treatment with antibiotics allowed an
increased of nasal NO secondary to the aeration of the sinuses (9). We did not take into
consideration the size of the ostia as a possible cause of the drop in nasal NO in our patients
because NO was measured during quiet breathing. Indeed, Weitzberg et al. suggested that
nasal NO measured during quiet breathing (and not during humming manoeuvres) in subjects
with patent ostia does not depend on the size of the ostia (14).
140
Very low concentrations of NO either in the nose or in the paranasal sinuses were previously
reported to be secondary to the downregulation of the expression of NOS2 in the particular
condition of nosocomial sinusitis (15). However, this condition reverse with the treatment of
the sinusitis. We verified the expression of the NO-synthase isoforms in patients and controls.
The expression of NOS3 was strictly restricted to the endothelial cells, and we were unable to
display any positive staining for NOS1. For NOS3, we found on the same tissue sections a
positive staining in endothelial cells and no staining in epithelial cells, either in formalin fixed
or in frozen sections, either in PCD patients or in controls. We believe that this result consist
in an internal positive control for the NOS3 antibody, and we conclude that NOS3 is not
expressed in the ciliated epithelial cells of paranasal polyps. Our results are in accordance
with those of Lundberg and al. who did not find any positive staining for NOS1 and NOS3
(either by immunohistochemical or by in situ hybridisation studies) in epithelial cells from
normal human paranasal sinuses (6). Guo et al. also found an expression of NOS2 but the
absence of NOS1 and NOS3 in freshly harvested lower ciliated respiratory cells using an
immunoblot technique (16). By contrast, other authors described positive staining for NOS3
located at the basis of the cilia in murine ciliated airway epithelial cells (17). To know
whether or not this expression of NOS3 in ciliated cells is restricted to murine species is still
unknown. Grasemann et al. reported a role for NOS1 in the airway NO as a correlation was
found between the polymorphism of the gene encoding NOS1 and the concentration of NO in
exhaled air. NOS1 in these cells was however not described (18).
We found a similar expression and tissue repartition of NOS2 in patients and controls.
However, our microscopical examinations were unable to precisely localize NOS2 in the
cells. There are increasing evidences that optimal subcellular localization of NOS2 is essential
for optimal enzyme function (19). Indeed, it was reported that in normal conditions, NOS2
localizes to the apical domain of polarized ciliated epithelial cells in association with the
141
cortical actin cytoskeleton. The disruption of this interaction does not lead to a non-functional
enzyme but to a production of NO which is not directed outside the cells. In other words,
NOS2, in common with the other NOS isoforms, is targeted to a specific cellular location,
suggesting that subcellular compartmentalization of NO synthesis is important in limiting NO
production to the region of the cell where required. Given the high reactivity of NO, it would
be advantageous to the cell to locate the site of high concentration NO synthesis in close
proximity to its site of action, limiting access to other cell compartments. This would
maximize the efficiency of NO delivery to its targets such as apical transporters and reduce
potential toxicity elsewhere in the cell (20). Further experiments using confocal microscopy
are mandatory in order to examine the possible loss of colocalization of NOS2 and cortical
actin cytoskeleton in PCD patients as an explanation for the drop of nasal NO concentration in
those patients. The presence of a near normal NOS2 expression but of an abnormal release of
NO in the ambient air would be in agreement with the observation that NO metabolites are
not decreased in exhaled breath condensate from PCD patients with low NO concentration in
nasal and lower airway air (21).
An other pathway that may contribute to decrease NO bioavailability is the interaction
between NO and the superoxyde anion (O2·) (22). Because NO and O2
· both contain an
unpaired electron, they rapidly react together, leading to their reciprocal inactivation and
eventually to peroxynitrite (ONOO ). The in vivo interaction between NO and O2·, as well
as the consequences for host defense and cell toxicity, are however hard to predict for at least
two reasons. First, in vivo concentrations of NO at the site of interaction with superoxide
cannot be easily determined with the technologies currently available, and the estimates in the
literature vary widely according to the authors. Second, the generation of O2· is even more
difficult to determine, due to the very short half-life of this ROS (22). Here, we used an in situ
assay using the fluorescent dye dihydroethidium (DHE) to show the presence and distribution
142
of O2· within the epithelial cells of nasal polyps. DHE has already been used in cells and in
tissues to detect ROS (23). DHE permeates the cell membrane easily, where it can be oxidized
by O2· to red fluorescent EtBr and trapped intracellularly by intercalation into DNA.
Extracellular O2· would not be expected to significantly contribute to the observed cellular
fluorescence, since EtBr is impermeable to cell membranes. Similarly, once oxidized
intracellularly, there would be minimal loss of EtBr out of the cell. Neither hydroxyl radical,
NO, peroxynitrite, H2O2, hypochlorite, nor singlet O2 significantly oxidizes DHE (24). For
these reasons, we interpreted EtBr fluorescence to specifically indicate O2· generation within
the fluorescing cell. As we did not find any difference in cell fluorescence between PCD
patients and controls, we conclude that inactivation of NO by superoxide is unlikely to be a
significant cause for the drop of nasal NO concentration in PCD patients.
Last but not least, a defect in arginine metabolism may affect NO production. L-arginine is the
only substrate of NOS. Theoretically, L-arginine concentration in human plasma is largely
above the Km of all the NO-synthases for their substrate, and L-arginine is therefore thought
not to be able to be a limiting factor of NO production. However, it has been largely observed
that L-arginine administration can upregulate NO formation in humans, leading to the concept
of “arginine paradox” (25). This “paradox” highlights the fact that the most important
parameter for the interaction between L-arginine and NOS is the biodisponibility of L-arginine
at the catalytic site of the enzyme, and not the extracellular concentration. Biodisponibility
depends on L-arginine concentration, L-arginine cellular uptake by the enzymes cationic
amino acid transporter-2 (CAT-2) (26), expression of the enzymes arginase 1 and arginase 2
(27), local concentration of endogenous NOS inhibitors like asymmetric dimethylarginine
(ADMA) (28). Here, we aimed to examine possible differences in arginases expression in the
ciliated epithelial cells as a determinant of nasal NO. Staining for arginase 2 was significantly
stronger in polyps from PCD patients than in polyps from nonallergic controls. However, we
143
also noted that arginase 2 expression was intense in epithelial cells of polyps from allergic
patients, in which intense infiltration by inflammatory cells on the chorion surface (especially
by eosinophils) was present. Our interpretation of this finding is that arginase 2 expression
may be regulated by inflammation and/or intracellular NO release. In the case of non allergic
and non inflammatory polyps from PCD patients, a defect of extracellular release of NO
produced by a functional but mislocalized NOS may lead to an intracellular inflammatory
state secondary to the toxicity of NO, and downstream to an activation of arginase 2
expression. In inflammatory polyps from allergic patients, arginase 2 expression may be
induced by locally released cytokines (29). Whatever the cause of its induction, the increase
of arginase 2 expression in PCD patients may participate in the drop of nasal NO
concentration, and may also explain the observation that nasal nebulization of L-arginine in
patients with PCD increase nasal NO concentration (30).
Taken together, our results indicate that the drop in nasal NO concentration encountered in
PCD patients can due at least in part to an increase of arginase 2 expression. However, there
are strong arguments for the presence of a normally functional NOS2 in the epithelial cells.
We then postulate that NO may be produced within the epithelial cells but not released in the
nasal air at the apical pole of the cells. Because the NO release from epithelial cells
necessitate the interaction between NOS2 and the cortical actin cytoskeleton, and because all
the described mutations in PCD concern the cytockeletal enzymes dyneins, we aim in a near
future to examine a possible loss of interaction between NOS2 and the apical cytoskeleton as
a cause for the drop in nasal NO in PCD patients.
144
Tables
PCD patients
(n = 5) Control patients (n = 10)
Age ( median value [min – max] ) 42 [12 – 52] 42 [11 – 55]
Nasal NO (mean of the right and left concentration ± SD) 10 ± 7 ppb 205 ± 48 ppb * Tomodensitometric imaging (median [25–75th percentile])
Abnormal sinuses 4 [4 – 5] 4 [3.25 – 4.75] Occluded sinuses 1 [1 – 2] 1.5 [1 – 2]
Inflammatory score (median [25–75th percentile]) 2 [1 – 2] 2 [1 – 2] Cell count (median [25–75th percentile])
Lymphocytes (%) 42 [22 – 53] 38 [17 – 49] Plasma cells (%) 27 [ 19 – 35] 22 [18 – 31] Polymorphonuclear cells (%) 4 [4 – 5] 4 [3 – 5] Eosinophils (%) 11 [8 – 12] 14 [10 – 17]
*: p<0.0001 vs. PCD patients Table 1. Demographic characteristics, tomodensitometric abnormalities and results of histological analysis of patients with primary ciliary dyskinesia (PCD) and control nonallergic patients
145
Figures legends
Figure 1. Immunohistochemical analysis showing the staining of polyp mucosa from PCD
and control patients. Incubation with a monoclonal antibody raised against type 2 NO-
synthase (NOS2) displayed a strong staining at the top of the ciliated epithelial cells.
Incubation with a NOS3 antibody stained the endothelial cells but not the epithelial cells.
Figure 2. NADPH-diaphorase histochemical staining in polyp tissue from control patients and
from PCD patients. Positive cells are identified by their dark-black staining. Ciliated
epithelium cells are strongly stained at their apical part.
Figure 3. Typical immunohistochemical positive staining for arginase 2 in epithelial cells of
paranasal polyps from PCD patients and controls. Staining was significantly stronger in PCD
patients than in controls (p<0.001)
Figure 4. In situ detection of superoxide in paranasal polyp mucosa. At identical image
setting, fluorescence did not differ between PCD and control groups, indicating similar
amount of superoxide anion.
146
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152
153
RESUMÉ DE LA THÈSE EN FRANÇAIS Le monoxyde d’azote (NO) est normalement présent à une concentration élevée dans l’air des voies aériennes supérieures (VAS). La NO-synthase de type 2 (NOS2) des cellules épithéliales ciliées des VAS, qui semble être contrôlée de façon originale dans les VAS, a été étudiée dans 3 situations cliniques. Dans un premier travail, l’effet de glucocorticoïdes (GCs) sur le NO nasal a été étudié. Avant GCs, le NO nasal [moyenne (écart à la moyenne)] était comparable chez les patients [n=15, 219 (13) parties par billion (ppb)] et chez les témoins (n=30, 233 (8) ppb). Après GCs, le NO nasal augmentait chez les patients [250 (13) ppb, p < 0.0001], témoignant de l’absence d’inhibition de la NOS2 par les GCs au niveau des voies aériennes supérieures. Dans un deuxième travail, 9 patients présentant une sinusite aiguë nosocomiale on été étudiés pendant les 4 premiers jours d’un drainage sinusien. La concentration de NO dans le sinus maxillaire (médiane [25ème-75ème percentile]) passait de 70 ppb [40-100 ppb] à 2050 ppb [1700-3000 ppb] (p < 0.0001), montrant un effet favorable du traitement de la sinusite sur le NO sinusien. Dans un dernier travail, des polypes nasosinusiens extraits de patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (DCP, n = 5, NO nasal = 10±7 ppb) et de témoins appariés (n = 10, NO nasal = 205±48 ppb, p<0.0001) ont été étudiés. L’expression des NOS, l’activité NADPH-diaphorase, le marquage par la dihydroéthidine étaient comparables entre les deux groupes. On observait une augmentation de l’expression de l’arginase II chez les patients DCP, pouvant expliquer pour partie la baisse du NO nasal.
RESUMÉ DE LA THÈSE EN ANGLAIS Nitric oxide (NO) is normally found at very high concentration in upper airway cavities in man. A type 2 NO-synthase (NOS2) located at the apical pole of ciliated epithelial cells accounts for the production of NO. We studies NOS2-NO pathway in upper aiways in 3 clinically relevant situations in man. First, the effect of glucocorticoids (GCs) on nasal NO was studied. Before GCs, nasal NO [mean (SE)] did not differ between patients [n=15, 219 (13) parts per billion (ppb)] and controls (n=30, 233 (8) ppb). After GCs treatment, nasal NO increased in patients [250 (13) ppb, p < 0.0001]. We concluded that contrarily to other sites and/or organs, NO production by NOS2 was not inhibited by GCs in upper airways. Second, 9 patients with maxillary nosocomial sinusitis were studied during the 4 first days of treatment consisting in sinus drainage and lavages. NO concentration within the sinus cavities (median [25 to 75 percentile]) increased from 70 ppb [40 to 100 ppb] to 2050 ppb [1700 to 3000 ppb] (p < 0.0001), demonstrating a favourable effect of treatment on sinus NO concentration. Last, we studied nasal polyps from patients with primary ciliary dyskinesia (PCD, n = 5, nasal NO = 10 ± 7ppb) and from matched controls (n = 10, nasal NO = 205 ± 48 ppb, p<0.0001). expression of NOS enzymes, NADPH-diaphorase and dihydroethidine stainings did not differ between the two groups. Expression of type II arginase was however increased in PCD patients, which could explain at least in part the drop of nasal NO in this group. In further studies, we aim to examine a possible loss of interaction between NOS2 and the apical cytoskeleton as a cause for the drop in nasal NO in PCD patients.