modÈle ex-vivo de sang complet - université laval · la parodontite chronique est une maladie...
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mLIA CAZALIS
MODÈLE EX-VIVO DE SANG COMPLET: Propriétés immunomodulatrices des tétracyclines et différence
de réponse entre patients atteints de parodontite et sujets . sains
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l 'Université Laval
dans le cadre du programme des études en sciences dentaires pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
©Julia Cazalis, 2009
FACULTÉ DE MÉDECINE DENTAIRE UNIVERSITE LA V AL
QUEBEC '
2009
Résumé
La parodontite chronique est une maladie infectieuse des tissus de soutien de la dent,
entraînant une perte d ' attache et une résorption osseuse. Elle résulte d'un déséquilibre entre le
biofilm sous-gingival et la réponse inflammatoire de l 'hôte. Le modèle de sang complet
permet de recréer des conditions apparentées à celles présentes dans la poche parodontale.
Utilisant ce modèle stimulé par le lipopolysaccharide (LPS) de Porphyromonas gingivalis, il
nous a été permis de démontrer que la tétracycline, la doxycycline et la tétracycline lTIodifiée
chimiquement (CMT-3) peuvent inhiber la production d'importants médiateurs pro
inflammatoires. En comparant les réponses de patients atteints de parodontite et de suj ets
sains dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS, nous avons pu établir que le taux
d'accroissement de la production de cytokines et de métalloprotéinases n1atricielles était plus
important chez le premier groupe, laissant supposer une réaction iInmune plus importante de
leur part.
11
Avant-propos
Je tiens à remercier mon directeur de mémoire le Dr Daniel Grenier pour son
encadrement, sa grande patience et son appui tout au long de ce proj et, mon co-directeur Dr
Guy Gagnon pour sa supervision clinique et son aide dans la rédaction des articles
scientifiques, mes compagnons de laboratoire pour leur disponibilité et leur sympathie ainsi
que Dre Fatiha Chandad, examinatrice du mémoire.
Contribution des auteurs
Premier article
Cet article a été publié dans la revue « Journal of Periodontology » sous la référence :
Cazalis J, Bodet C, Gagnon G et Grenier D, Doxycycline reduces lipopolysaccharide-induced
inflammatory mediator secretion in macrophage and ex vivo human whole blood models, J
Periodontol, 2008, 79(9) : 1762-8. Le Dr Charles Bodet s'est occupé de tout ce qui concerne
le modèle macrophage. Le Dr Daniel Grenier a supervisé la rédaction de l'article et a
également rédigé l'introduction et la discussion. Le Dr Guy Gagnon a contribué à la rédaction
et a supervisé la phase clinique de l'étude. Le premier auteur a travaillé sur le modèle ex vivo
de sang complet humain, a contribué à la sélection des patients, a réalisé les prélèvements et
le traitement des échantillons et a participé à l'analyse des résultats ainsi qu'à la rédaction des
parties méthodologie et résultats.
Deuxième article
Cet article a été publié dans la revue «Inflammation» sous la référence: Cazalis J,
Tanabe S-I, Gagnon G, Sorsa T et Grenier D, Tétracyclines and chemically modified
tetracycline-3 (CMT-3) modulate cytokine secretion by lipopolysaccharide-stimulated whole
blood, Inflammation, 2009, 32(2): 130-7. Le Dr Shin-ichi Tanabe a réalisé les essais
immunoenzymatiques pour l'étude des taux de MMP-8 et MMP-9. Le Dr Timo Sorsa a fourni
la CMT-3 nécessaire à l'étude. Le Dr Guy Gagnon a contribué à la rédaction et a supervisé la
phase clinique de l'étude. Le Dr Daniel Grenier a réalisé la supervision et la rédaction de
l'article. Le premier auteur a contribué à la sélection des patients, a réalisé les prélèvements et
le traitement des échantillons, a obtenu les résultats des taux de cytokines, a participé à
l'analyse des résultats et à la préparation des tableaux, a contribué aux analyses statistiques et
à la rédaction de la partie matériels et méthodes.
111
Troisième article
Cet article sera soumis pour publication dans la revue « Journal of Periodontal Research »
sous la référence: Cazalis J, Gagnon G et Grenier D, Comparative inflan1matory responses of
periodontitis patients and healthy subjects using an ex vivo whole blood model stimulated
with Porphyromonas gingivalis. Le Dr Guy Gagnon a contribué à la rédaction de l ' article et a
supervisé la phase clinique de l'étude. Le Dr Daniel Grenier a réalisé la supervision et la
rédaction de l 'article. Le premier auteur a contribué au prélèvement et à la stimulation des
échantillons de même qu'à la rédaction de l ' article. La quantification des cytokines et des
métalloprotéinases matricielles dans les échantillons à été réalisée par un laboratoire
d'analyses externe alors que les analyses statistiques ont été effectuées par le Bureau des
statistiques de l'Université Laval.
IV
Table des matières
Résumé .. .... ... ..................... : ..... .... ................................................................................... ..... ... i
Avant-propos ......................... ............... ............ ............................................. ............... ...... ... ii
Table des matières .......................... ........ .. ..... .... .................... ............................. .............. .... . iv
Liste des figures ... ....... .......... ... .... ...... ..... .... ...... .. ... .................. ........ .. ..... ... ....... ...... .. .......... vvi
Liste des tableaux ............................................ ........ .............. ... ... : .............. ... ....... .... ....... .... . vii
Liste des abréviations ... ....... ....... ....... ........ ........... ... ... ..... ........ ... ............ ...... .............. .... ....... ix
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE ....... .. ....... .. .................... .. ........... ........... ... ... 1
Parodonte ........... ..... ... ..... .. .... ... .. .... ........ ........ ... ..... ... ........ ...... .............. ...... .... ... ....... . 1
1.1 Anatomie du parodonte sain ............... .. ........... ~ ............................................ .. .. .. .. ... l
1.2 Attache dento-gingivale ................. .. ..... ......... ... ......................................... .... .... .... . 3
1.2.1 Attache épithéliale .... ................... ....................................... ....... ~ ................. ... . 3
1.2.2 Attache conjonctive .............. . ~ ..... ..................................... .. ..... ... ................ ..... 4
2 Maladies parodontales ......... ................... ......................... ... ..... ................... ......... ...... . 5
2.1 Epidémiologie .... .. ............ ..... .............. ....... ........................................ .......... .. .... .. ... 5
2.2 Etiologie ............ .. ................................ ............ .................... ...... .. ............ ~ ........... .... 6
2.2.1 Facteur bactérien ................................. .......................................... ................ .... 6
2.2.2 Réponse de l 'hôte .................................... ...... ... .. ............. ........................... ..... 7
2.3 Parodontite chronique ........................................ ....... .................................... ....... . 10
2.4 Autres formes de parodontite ..... ..................................................... ...................... 12
2.5 Différence de susceptibilité à la maladie parodontale entre individus ................ ... . 12
3 Porphyromonas gingivalis ......................................................................................... 1 7
3.1 Facteurs de virulence de P. gingivalis ............................................. ... ................... 17
3.1.1 Acide désoxyribonucléique ................... ..... ................................ .. ........... ... ... 1 7
3.1.2 Fimbriae ..... ......... ........................................................... .............. ...... ........... 18
3.1.3 Hémagglutinines ....... ..... .. ............ .............. .................... .................. .... ........ . 18 1
3.1.4 Lipopolysaccharide (LPS) ............................................................... : ............. 19
3.1.5 Capsule ..................... ................... ............. ' .... .. ... ........................... .. .............. 19
3.1. 6 Vésicules membranaires ..... .......... ....... .................... ................. ........... ........ .. 19
3.1 .7 Enzymes ................... ....... ............ ........................ ............... ......... ................. 20
3.1.8 Produits métaboliques toxiques .... ........................................... ............... ....... 20
3.2 Mécanismes d'action de P. gingivalis .................... .................... ........ ... .. .. ... ..... ... 21
v
3.2.1 Adhésion et invasion tissulaire ...................................................................... 21
'3.2.2 Inactivation du système de défense de l'hôte ................................................. 22
3.2.3 Destruction tissulaire ..................................................................................... 23
3.3 Influence des facteurs environnementaux sur la physiologie de P. gingivalis ......... 23
4 Modèle ex vivo de sang complet. ............................................................................... 24
5 Utilisation des antibiotiques en parodontie ...................................... ................... .... ... 25
5.1 Traitement systémique ....................................................................... ...... ... ...... ... 26
5.2 Traitement local ................................................ .................................................. .. 27
5.3 Traitement immunomodulateur ................................................................ ... .......... 28
5.3.1 Doxycycline à dose sub-antimicrobienne (Periostat®) ............................... ... . 29
5.3.2 Tétracyclines modifiées chimiquement (CMT) .............................................. 30
Hypothèses de travail ............................................................ ........ .... ................................... 33
Objectifs .......................................................................... ......... ........................................ ... 33
Pertinence de la recherche ........................................... ......................................................... 33
CHAPITRE 2: ARTICLES SCIENTIFIQUES .................................. ; .................................. 35
Article 1: Publié dans Journal of Periodontology, 2008, 79: 1762-1768 ........... .. ............. 35
Article 2: Publié dans Inflammation, 2009,32 : 130-137 ................................................ 54
Article 3: Soumis à Journal ofPeriodontal Research ....................................................... 76
CHA~ITRE 3 : CONCLUSION ................................................... Erreur! Signet non défini.
Bibliographie ................................................................................................................... 9999
Liste des figures
Figure 1 : Schéma du parodonte sain ............................................................................ 2
Figure 2 : Schéma du parodonte avec parodontite chronique ............................... Il
Figure 3 : Figure 1 de l'article 1 : Sécrétions d 'IL-1~ (A), TNF-a (B), IL-6 (C), et IL-8
(D) par les macrophages traités avec la doxycycline et stimulés par le LPS de A.
actinomycetemcomitans ATCC 29522 ........... . ............................................. 51
Figure 4 : Figure 2 de l'article 1 : Sécrétions d'IL-1~ (A), TNF-a (B), IL-6 (C), et IL-8
(D) par le sang complet humain traité avec la doxycycline et stimulé par le LPS de P.
gingivalis ATCC 33277 ............. . ............................................................. 52
VI
Liste des tableaux
Tableau 1 : Tableau de l'article 1 : Ch(;lngements induits par le LPS de A".
actinomycetemcomitans et la doxycycline dans l'état de phosphorylatiori protéine kinase
des macrophages ................................... ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Tableau 2 : Tableau 1 de l'article 2 : Sécrétions d'IL-lp, IL-6, Il-8, MMP-8 et MMP-9
induites dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS de P. gingivalis ...... . . . . .. 70
Tableau 3 : Tableau 2 de l'article 2 : Effets de la tétracycline," de la doxycycline et de
CMT-3 sur la sécrétion d'IL-lp dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS de P.
gingivalis ................................. . ....................................... ~ .. '.' .. . ........... 71
Tableau 4 : Tableau 3 de l'article 2 : Effets de la tétracycline, de la doxycycline et de
CMT-3 sur la sécrétion d'IL-6 dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS de P.
gingivalis ............................................................................................ 72
Tableau 5 : Tableau 4 de l'article 2 : Effets de la tétracycline, de la doxycycline et de
CMT-3 sur la sécrétion d'IL-8 dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS de P.
gingivalis " .... '.' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 73
Tableau 6 : Tableau 5 de l'article 2 : Effets de la tétracycline, de la doxycycline et de
CMT-3 sur la sécrétion de MMP-8 dans le modèle de sang complet stin1ulé par le LPS de
P. gingivalis ............................................................. . ......................... 74
Tableau 7 : Tableau 6 de l'article 2 : Effets de la tétracycline, de la doxycycline et de
CMT -3 sur la sécrétion de MMP-9 dans le modèle de sang complet stimulé par le LPS
de P. gingivalis .................................................................................... 75
Tableau 8 : Tableau 1 de l'article 3 : Réponse comparative de la sécrétion d'IL-lp, IL-6,
TNP-a et IL-Ira de sujets sains et de patients atteints de parodontite dans le modèle de
sang complet stimulé par P. gingivalis .... . .................................................... 90
Tableau 9 : Tableau 2 de l'article 3 : Réponse comparative de la sécrétion d'IL-8,
RANTES, MCP-I et IP-I 0 de sujets sains et de patients atteints de parodontite dans le
modèle de sang complet stimulé par P. gingivalis .......................................... 91
Tableau 10 : Tableau 3 de l'article 3 : Réponse comparative de la sécrétion de MMP-8
et MMP-9 de sujets sains et de patients atteints de parodontite dans le modèle de sang
complet stimulé par P. gingivalis ................................................................ 92
VIl
Tableau Il : Tableau 4 de l 'article 3 : Valeur-p du groupe des sujets sains et du groupe
des patients atteints de parodontite pour la sécrétion des cytokines et des MMPs dans le
modèle de sang complet stimulé par P. gingivalis ........................................... 93
Tableau 12 : Tableau 5 de l'article 3 : Taux d'induction de cytokines et de MMPs
sécrétées par le groupe des sujets sains et le groupe des patients atteints de parodontite
dans le modèle de sang complet stimulé par P. gingivalis ............. . .................... 94
VIll
IX
Liste des abréviations
ADN .......... . ..... . .. . ........... Acide désoxyribonucléique ARN ......... . ..................... Acide ribonucléique ATCC ............................. American type culture collection BID .. .. ..... . ...... . .... . .. . ........ Bis in die CCD ... . ................ . .... . .... . Charge-coupled device CMT ..... .. ... . ...... .. ............ Tétracyclines modifiées chimiquement CMH .......... . .................. . Complexe majeur d'histocompatibilité DAT -cella ..... . .... . .............. . Directly attached ta the tooth cells DMSO ......................... . .. Dimethylsulfoxyde ELISA ............... . .......... ... Enzyme-linked immunosorbent assay Fc ........ . .... .. ................... Fragment constant FBS ............................. ... Fetal bovine serum RgpA et RgpB .... . ........ . ...... Arg-gingipaïnes A et B ICAM-1 .. ... . . .................... Molécule d'adhésion intercellulaire 1 Ig ........................... . ....... .Immunoglobulines IL ..... . ............................ Interleukine IP .................................. . Interferon-inducible p rotein lU .............. . ... . .... .. .. ... .. .. International unit JEC ............ . ................... . Jonction énamo-cémentaire Kgp ............ . ........ . ..... . ..... Lys-gingipaïne LMG ........... ; ........ . .. . ....... Ligne muco-gingivale LPS ................................. Lipopolysaccharide MCP-1 .............................. Protéine chémoattractrice des protéines 1 MEC ........... " ...... . ............... Matrice extracellulaire MMP . .. ............................. Métalloprotéinases matricielles P AMP . .......... . ................. .. Motif moléculaire associé aux pathogènes PG ................................... Prostaglandines PMA .......... .. ................... . Phorbol myristic acid PMN ........... . .................... Polymorphonucléaires RANTES .......................... . Regulated upon activation, normal T cell expressed and
secreted SDD ................................. Doxycycline à dose sub-antimicrobienne SOD ................................ Superoxyde dismutase SRP ............ . ...... . .............. Surfaçage radiculaire TC .............. . .. ' ..... .. .......... Tétracyclines " TIMP .. . .. . ........................ .Inhibiteur tissulaire des. métalloprotéinases matricielles THB .............................. .. Todd-Hewitt broth TLR ................................. Récepteur Toll-like TNF -u .............................. Facteur de nécrose tumoral alpha VCAM -1 ........................... Molécule d'adhésion des cellules vasculaires 1 WB ............. . ................... Whole blood
1
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE
1 Parodonte
1.1 Anatomie du parodonte sain
Le parodonte est un ensemble fonctionnel qUI maintient la dent au seIn de l'os
alvéolaire. Il comprend la gencive, le ligament parodontal, le cément et l 'os alvéolaire. Un
parodonte sain recouvre la racine dentaire jusqu'au niveau de la jonction énamo-cémentaire
(JEC).
La gencive peut être divisée en 2 parties: la gencive marginale et la gencive attachée.
La gencive marginale est de couleur rose corail et d'une consistance ferme. Son sommet est
situé de 1,5 à 2 mm coronal à la JEC et sa base se situe au niveau de la JEC. Elle comprend
les versants buccal et lingual du tissu gingival autour de la dent ainsi que les papilles
interdentaires. Entre la gencive marginale et la dent existe un sillon appelé sulcus gingival.
La gencive attachée est en continuité avec la gencive marginale et est limitée en apical par
la ligne muco-gingivale (LMG) où elle est en continuité avec la muqueuse alvéolaire. De
consistance ferme et de couleur rosée, elle peut présenter, dans 40% des cas, de petites
dépressions en surface, lui donnant un aspect de peau d'orange. Elle est fermement fixée au
cément ou à l'os alvéolaire sous-jacent par l'intermédiaire de fibres conjonctives. Sa
hauteur varie en fonction de sa localisation dans la bouche et augmente avec l'âge (Bowers,
1963).
Le ligament parodontal est un tissu conj onctif cellulaire, richement vascularisé qui
entoure la racine de la dent et lie le cément radiculaire à l'os alvéolaire par l'intermédiaire
des fibres de Sharpey. Au niveau coronal, il est en continuité avec la lamina propria de la
gencive. L'épaisseur du ligament parodontal est d'environ 0,25 mm.
Le cément est un tissu minéralisé qui couvre la surface radiculaire des dents. Il est
caractérisé par un dépôt continu au cours de la vie. Il est principalement constitué de deux
types distincts: un cément acellulaire déposé tout le long de la surface radiculaire et dans
lequel les fibres d'ancrage du ligament se fixent et un cément cellulaire, situé au tiers apical
des dents pluriradiculées et des zones de furcation dans lequel sont entrappés des
2
cémentocytes. Son épaisseur moyenne de 20 à 50 J-lm au niveau coronal augmente en
direction apicale pour atteindre 150 à 250 J-lm.
L'os alvéolaire entoure la dent jusqu'à enVIron 1,5 mm de la JEC. Les murs de
l'alvéole sont constitués d'os cortical, appelé « os alvéolaire propre» ou « bundle bone »,
dans lequel les fibres du ligament s' insèrent pour constituer le système d'attache de la dent.
Son « tum-over » est important et pennet l'adaptation aux contraintes fonctionnelles. Cette
mince couche d'os cortical se prolonge par de l'os spongieux qui est en plus ou moins
grande quantité, selon la localisation dans la cavité buccale. Les corticales externes de l'os
alvéolaire sont en continuité avec celles de l'os basal sous-jacent (Newman et al. , 2006) .
sulcus
Alvoolar
,~~--..-".""-""--""- C0t'oant()>> enarnei itjr1(;t~O()
Figure 1 : Schéma du parodonte sain. L'épithélium sulculaire s'arrête à la jonction amélocémentaire (image adaptée de Rose et Mealey, 2004).
.-------- - ------------- ---
3
1.2 Attache dento-gingivale
La jonction dento-gingivale est d'une importance considérable car elle représente une
zone de faiblesse potentielle dans la cavité buccale. Les bactéries situées sur les surfaces
denta~res p~oduisent des toxines susceptibles de créer de l' inflammation et des dommages
dans cette zone.
La face interne de la gencive marginale est constituée de deux types d'épithélium:
l'épithélium sulculaire qui fait face à la dent sans être en contact avec elle, et l'épithélium
de j onction qui forme l'attache épithéliale.
L'épithélium sulculaire n ' appartient pas, à proprement parler, à l'attache dento
gingivale. Son aspect histologique est comparable à celui de l'épithélium gingival avec
lequel il est en continuité, c'est-à-dire pavimenteux, stratifié mais non-kératinisé. Sa portion
apicale représente le site d'exfoliation des cellules de l'épithélium de jonction. Il contient
des kératinocytes mais aussi des cellules de Langerhans, des cellules de Merkel et des '
mélanocytes, situées au niveau de ses couches basales et supra-basales (Newman et al.,
2006).
L'attache dento-gingivale se compose d'une attache épithéliale et d'une attache
conjonctive. La fonction de l'attache épithéliale est la protection biologique de la jonction
alors que celle de l'attache conjonctive est de garantir une adhésion ferme à la dent. Les
longueurs moyennes du sulcus, de l'attache épithéliale et de l'attache conj onctive sont
respectivement 0.69 mm, 0.97 mm et 1.07 mm (Gargiulo et al., 1961). Le sulcus est
constamment baigné par le fluide ' gingival, exsudat sérique traversant l'épithélium de
j onction et originant des nombreux capillaires présents autour de la racine dentaire.
1.2.1 Attache épithéliale
L'attache épithéliale se forme au moment de l'éruption dentaire. Elle est constituée
par l'épithélium de jonction, originaire de l'épithélium réduit de l'organe de l' émail.
L'épithélium de jonction a une triple fonction: sceller l'ouverture créée par l'éruption
dentaire pour maintenir la continuité du tégument oral, permettre une voie de diffusion pour
les molécules par une certaine perméabilité et représenter une zone de défense périphérique
contre l'infection parodontale.
4
L'épithélium de jonction est caractérisé par une épaisseur de 15 à 30 cellules à sa
portion coronaire et d'environ 3-4 à sa portion apicale. Il possède deux couches distinctes,
une couche basale et une couche supra-basale (Listgarden, 1986). Ces cellules ont une
importante activité mitotique (<< turn-over » deux fois plus rapide que celui de l'épithélium
gingival). Les couches basales sont cuboïdes et restent à la limite du tissu conjonctif, avec
des fibres d'ancrage contre la membrane basale externe alors que les couches supra-basales
sont de forme aplatie, orientées parallèlement à la surface dentaire et vont exfolier dans le
fond du sulcus. Les plus proches de la dent ou DAT -cell [directly attached ta the taath]
forment la membrane basale interne. Les cellules sont liées par un faible nombre de
desmosomes' (6 à 14/J.lm2 contre 60 à 100 dans l'épithélium gingival) donnant place à des
espaces intercellulaires plus importants et flexibles qui permettent l ' exsudation en cas
d'inflamination.
Environ 1 à 2% de l'espace est occupé par des neutrophiles dont la concentration est
plus importante près du sulcus qu'en position apicale de l'épithélium de jonction. Leur
migration vers le sulcus est permanente à l'état sain et augmente en cas d'inflammation. Les
cellules épithéliales expriment à leur surface, surtout en coronal, l'interleukine 8 (IL-8) qui
a un rôle d'attraction des neutrophiles polyrnorphonucléaires (PMN).
La membrane basale interne est située entre l'émail et l'épithélium de jonction. Elle
est en continuité avec la membrane basale externe et permet le lien avec la surface dentaire
via des hémi-desmosomes. Sa structure s'apparente à celle de la membrane .basale externe
sauf qu'elle ne dispose pas de fibres d'ancrage (collagène de type VII) et de collagène de
type IV (Schroeder et al., 1996 ; Newman et al., 2006).
1.2.2 Attache conjonctive
Dans un parodonte sain, l'attache conjonctive a une limite coronale au niveau de la
JEC et, en apical, est en continuité avec le ligament parodontal. Il s'agit d'un tissu
conj onctif constitué au niveau cellulaire de fibroblastes, en maj orité. On trouve également
des macrophages, des mastocytes et des cellules inflammatoires (neutrophiles,
lymphocytes). Le constituant principal de l'attache conjonctive est le collagène de type l ,
organisé en fibres à orientation distincte. Les fibres dento-gingivales, dento-périostées et
5
transseptales sont directement liées au cément. Les fibres circulaires encerclent la racine et
permettent de renforcer cette attache (Newman et al., 2006).
2 Maladies parodontales
Il existe deux principaux types de maladies parodontales: les gingivites et les
parodontites.
Les gingivites sont des réactions inflammatoires, non spécifiques et réversibles de la
gencive marginale, en réponse à une augmentation du nombre de bactéries, au niveau du
sulcus. Les parodontites sont le résultat d 'une inflammation des tissus plus profonds du
parodonte, caractérisée par une perte d'attache ayant une progression discontinue, alternée
de phases de destruction et de phases de rémission, fonction des rapports entre les bactéries
et les réponses de 1'hôte.
2.1 ~J7itié~iolo~ie
La parodontite est retrouvée de façon ubiquitaire sur le globe. Différents schémas de
destruction existent. Une étude longitudinale, réalisée durant 15 ans, au Sri Lanka, sur 480
cultivateurs de thé n'ayant jamais bénéficié de soins dentaires, a permis de révéler que dans
cette population, 8% montraient une progression rapide de la parodontite, 81 % montraient
une progression modérée et Il % étaient quasiment épargnés par cette pathologie (Loe et
al., 1986).
En 1997, une étude nationale américaine a conclu que, si on prend comme critère la
présence d'au moins un site avec une perte d'attache de 4 mm ou plus, au moins 50% de la
population adulte âgée entre 55 et 64 ans, est affectée tandis qu'une étude plus récente
montre que 48% des adultes américains présentent une parodontite chronique (Burt, 2005 ;
Albandar, 2005).
En 2003, l'analyse de 2144 adultes vivant en France, âgés entre 35 et 64 ans, a montré
que 95,4% de cette population montrait une perte d'attache et 82,2% avait au moins une
poche parodontale. Une perte d'attache, sur au moins un site, égale ou supérieure à 5 mm
était retrouvée sur 46,7% des individus, ce qui est en adéquation avec les deux études
6
américaines, précédemment citées. Chez les patients présentant une forme généralisée de
parodontite, 78% avaient une atteinte légère, 18% une atteinte modérée et 4% une atteinte
sévère (Bourgeois et al., 2007).
Si on prend la population globalement, on peut estimer que 5 à 15% vont présenter
une parodontite généralisée d'atteinte sévère et que la majorité des adultes va plutôt
présenter une forme plus modérée de la maladie (Burt, 2005).
2.2 Etiologie
La maladie parodontale est le résultat d'une interaction entre un biofilm microbien
associé aux surfaces dentaires et la réponse immune de l 'hôte, souvent modulée par des
facteurs environnementaux. Les microorganismes forment une communauté cloisonnée
dans une matrice, appelée biofilm, qui confère un degré de protection aux bactéries
incorporées et permet la possibilité de coopération métabolique. Les bactéries, par leurs
facteurs de virulence et l'excrétion de produits métaboliques, provoquent une réponse
inflammatoire à l'origine de la maladie parodontale. Cependant, la réponse de l 'hôte est le
facteur-clé pour expliquer l'expression de la maladie parodontale. Ainsi, 20% de la maladie
parodontale est attribuée à la virulence bactérienne, 50% au facteur génétique et donc à la
réponse de l 'hôte et le reste aux influences extérieures dont l'usage du tabac qui représente
le facteur de risque le plus important (Burt, 2005). Plusieurs autres facteurs de risque
potentiels ont été étudiés et pour l'instant, ceux qui ont pu être identifiés comme ayant un
rôle certain sont l'âge, la plaque dentaire et 1'hygiène buccale, les prédispositions
génétiques, le stress et certaines maladies systémiques comme le diabète (Albandar, 2005).
2.2.1 Facteur bactérien
On estime qu'environ 500 espèces bactériennes colonisent la cavité buccale dont
environ 300 à 400 qui ont, pour niche écologique, la plaque sous-gingivale. Parmi celles-ci,
environ une douzaine sont considérées comme potentiellement parodontopathogènes
(Kinane et al., 2008).
Les bactéries du biofilm présentent plus ou moins d'affinité entre elles et s'organisent
en complexes dans lesquels elles fonctionnent en coopération pour potentialiser leur
7
multiplication et leur survie. Socranscky et coll. ont défini cinq complexes ma] eurs
retrouvés dans la cavité buccale (1998). Les complexes associés à la parodontite sont les
complexes orange et rouge, ce dernier ayant une relation frappante avec les signes cliniques
de profondeur de poche et de perte d'attache, observés dans la parodontite.
On définit une bactérie comme parodontopathogène, grâce aux critères établis par
Socransky, en 1977, soit qu'elle est retrouvée en grande quantité dans les sites d'atteinte
parodontale et en très faible nombre ou absente dans les sites sains, que son élimination des
sites affectés conduit à une résolution de la pathologie et à une amélioration clinique,
qu'elle déclenche une réaction immune spécifique de l 'hôte contre elle, qu'elle exprime des
facteurs de virulence contribuant aux manifestations cliniques observées et que son
potentiel délétère pour le parodonte a été montré sur un modèle animal (Wolf et al., 2005).
Le complexe rouge apparaît tard, dans le développement du biofilm et est constitué
de trois bactéries parodontopathogènes : Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola
et Tannerella forsythia. Ces trois bactéries sont anaérobies strictes et à Gram négatif. En
exprimant leurs facteurs de virulence et par leurs mécanismes de coopération cellulaire,
elles sont capables de coloniser l'espace sous-gingival, de perturber le système de défense
de l'hôte, d'envahir et de détruire les tissus parodontaux ou encore de promouvoir la
réponse immunodestructrice de l'hôte, conduisant à la perte des tissus de soutien de la dent
(Holt et Ebersole, 2005 ; Bodet et al., 2007).
2.2.2 Réponse de l'hôte
Habituellement, les processus inflammatoires et immunitaires agissent au niveau des
tissus gingivaux pour prévenir les attaques microbiennes locales et empêcher une invasion
des microorganismes dans les tissus. En raison de la chronicité de la maladie parodontale, il
s'établit une réponse exagérée des processus de défense de l 'hôte conduisant à des
dommages aux cellules et aux structures tissulaires avoisinantes. De plus, ces réactions
immunitaires et inflammatoires s'étendent plus en profondeur dans le tissu conj onctif et
peuvent conduire à une destruction du parodonte profond. Ainsi, bien que les bactéries
parodontopathogènes soient le facteur étiologique primaire de la parodontite, la destruction
8
des tissus de soutien, résulte essentiellement de la réponse immunitaire de l 'hôte, face à
l'agression bactérienne (Preshaw et al., 2004).
La première ligne de défense de l'hôte est la barrière épithéliale, représentée par le
sulcus et l'épithélium de jonction, qui comprend, outre les cellules épithéliales, des
neutrophiles attirés par l'IL-8, mais aussi des cellules dendritiques qui servent de sentinelles
et quelques macrophages et lymphocytes. Toutes ces cellules expriment des peptides
antibactériens tels que la calprotectine, l'a et la B-défensine ou encore la cathelicidine
(Schenkein, 2006 ; Kinane et al., 2008).
La stimulation par les facteurs bactériens de virulence, des cellules de l' immunité
innée de l'hôte, soit les neutrophiles et les macrophages mais aussi des cellules résidentes
du parodonte, dont les fibroblastes, engendre l'expression d' enzymes hydrolytiqu~s et la
sécrétion de médiateurs inflammatoires permettant d'activer diverses voies de dégradation
tissulaire~ Elle se traduit par une forte production de cytokines pro-inflammatoires dont
l'interleukine 1 B (IL-I B), l'interleukine 6 (IL-6), l'IL-8, le facteur de nécrose tumorale
alpha (TNP-a), de prostaglandines E2 (PGE2), de métabolites de l'acide arachidonique et de
métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-3, MMP-8 . et MMP-9), associés à la
destruction des tissus parodontaux (Schenkein, 2006 ; Bodet et al., 2007).
Les cytokines pro-inflammatoires sont présentes en importante quantité dans le fluide
créviculaire et les tissus parodontaux des patients atteints de parodontite. Elles possèdent
des rôles physiologiques étroitement liés à la pathogénèse de ces maladies.
L'IL-lB est une cytokine pro-inflammatoire multi-fonctionnelle qui induit la
production de récepteurs cellulaires, d'autres cytokines, de MMPs, de PGE2 et d'activateurs
du . plasminogène par les macrophages, les plaquettes et les cellules endothéliales, ceCI
favorisant le processus inflammatoire et la résorption osseuse (Y oshie et al., 2007).
Le TNF-a partage plusieurs activités biologiques avec l'IL-l dont les propriétés pro
inflammatoires, la stimulation de la synthèse de MMPs, la production d' eicosanoïdes et la
résorption osseuse. Sa sécrétion par les monocytes et les fibroblastes est stimulée par le
lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram négatif (Schenkein, 1999).
L'IL-6 produite par les lymphocytes, les monocytes et les fibroblastes, est également ·
pro-inflammatoire. Elle stimule la croissance et la différenciation des lymphocytes B en
plasmocytes et stimule la sécrétion des protéines de l'inflammation comme le fibrinogène et
9
la protéine C réactive. Elle stimule aussi la formation des ostéoclastes et joue donc un rôle
dans le phénomène de résorption osseuse (Schenkein, 1999 ; Houle et Grenier, 2003).
L'IL-8 est une chimiokine, principalement produite par les monocytes en réponse au
LPS bactérien, à l'IL-1 et au TNP-a. Elle augmente l'activité des neutrophiles par
chimiotactisme, et diminue leur adhésion. C'est un médiateur import':lnt de l'inflammation
qui stimule la libération de MMPs par les neutrophiles et contribue donc, à la destruction de
la matrice extracellulaire (MEC).
La PGE2 est synthétisée principalement par les monocytes et les fibroblastes. Elle est
reconnue comme un puissant inducteur de la résorption osseuse qui joue un rôle
déterminant dans la destruction de l'os alvéolaire et la perte d'attache, observées dans la
parodontite. On la retrouve en importante quantité, dans le fluide créviculaire des poches
parodontales. Elle est impliquée dans la formation des ostéoclastes et stimule l'expression
des MMPs (Schenkein, 1999 ; Offenbacher et al., 1993).
Les MMPs ont, à l'état sain, une fonction de remaniement tissulaire et de remodelage
de la MEC. Elles font partie d'une famille de 25 endopeptidases zinc-dépendantes, capables
de dégrader la quasi-totalité des composants de la MEC incluant le collagène, la
fibronectine et la laminine et peuvent être synthétisées par les fibroblastes, les macrophages,
les cellules épithéliales et les neutrophiles (Sorsa et al., 2006). Leur production excessive
contribue de façon importante à la destruction tissulaire et osseuse, rencontrée dans la
maladie parodontale. Une forte corrélation a été établie entre la sévérité de la maladie
parodontale et le taux de MMPs présentes dans le fluide créviculaire et les tissus
parodontaux (Sorsa et al., 2004). La MMP la plus destructrice est la MMP-8 qui est une
collagénase, suivie des MMP-2 et MMP-9 qui sont des gélatinases. La MMP-3, aussi
appeléestromélysine, joue également un rôle dans la dégradation de la fibronectine et des
protéoglycanesde la matrice extracellulaire .et favoriserait l'activation des collagénases et
de la MMP-9 (Houle et Grenier, 2003).
Les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans l'initiation et la régulation de
l'immunité innée et acquise. Elles assurent également, la communication entre les deux
immunités en circulant par les vaisseaux lymphatiques vers les ganglions pour présenter les
antigènes aux lymphocytes T naïfs (Azuma, 2006). Dans les premiers stades de l'infection,
un infiltrat lymphocytaire de type T (réponse à médiation cellulaire) est présent dans les
10
tissus. Par la suite, lorsque la lésion devient établie, cet infiltrat se compose de lymphocytes
B et de plasmocytes favorisant une réponse immunitaire humorale par des anticorps ciblés
contre les bactéries pathogènes (Page et Schroeder, 1976). Les IgG2 sont les
immunoglobulines les plus fréquemment retrouvées dans les poches parodontales (Kinane
et Lappin, 2002).
Le complément joue également un rôle important en permettant la lyse de bactéries
par la formation du complexe d'attaque membranaire et en favorisant la phagocytose par le
phénomène d'opsonisation (Slaney et Curtis, 2008).
2.3 Parodontite chronique
La parodontite chronique est une maladie infectieuse résultant de l'inflammation des
tissus de soutien de la dent, d'une perte d'attache progressive et d'une perte d'os. Elle est
caractérisée par la formation de poches et/ou de récessions gingivales, des mobilités et des
migrations dentaires et est connue comme la forme la plus fréquente de parodontite. Elle
affecte les individus de tout âge mais est plus fréquemment rencontrée chez les adultes. La
prévalence et la sévérité de la maladie augmentent avec l'âge. Son évolution est en relation
avec la présence de facteurs locaux et du tartre sous-gingival est fréquemment retrouvé. Elle
peut affecter un nombre plus ou moins important de dents et avoir des taux de progression
variables. La parodontite chronique est initiée et maintenue par la plaque bactérienne mais
les mécanismes de défense de l'hôte ont aussi un rôle dans sa pathogénèse. Elle peut être
associée ou modifiée par des maladies systémiques comme le diabète ou l'infection au virus
de l'immunodéficience humaine ou par des facteurs d'exposition tels que le tabagisme ou le
stress. La nature de la progression de la maladie ne peut être confirmée que par des
examens successifs, espacés dans le temps.
La parodontite chronique est caractérisée par son extension et sa sévérité. Elle est dite
localisée ou généralisée selon qu'elle affecte plus ou moins de 30% de sites dans la cavité
buccale. Sa sévérité est fonction du niveau de perte d.'attache : légère (perte d'attache de 1 à
2 mm), modérée (de 3 à 4 mm) ou sévère si la perte d'attache est supérieure ou égale à 5
mm (Flemming, 1999).
Il
Dans la parodontite chronique, la flore microbienne des poches parodontales varie
sensiblement d'un site à l'autre et entre patients. Pendant les phases de rémission, elle
s'apparente à celle de la flore sous-gingivale saine mais, dans les lésions actives, cette flore
est trois fois plus dense que celle retrouvée dans les cas de gingivite. Elle est caractérisée
par une forte proportion de bactéries anaérobies à Gram négatif et de bactéries motiles.
Parmi les 500 espèces de bactéries retrouvées dans la cavité buccale, une dizaine de
bactéries sont associées à la parodontite chronique dont Campy lobacter rectus} Eikenella
corrodens} Fusobacterium nucleatum} Peptostreptococcus micros} P. gingivalis} Prevotella
intermedia, Prevotella nigrescens, T forsy thia et T denticola (Newman, 2006).
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Figure 2: Schéma du parodonte avec parodontite chronique (image tirée de Rose et Mealey, 2004).
12
2.4 Autres formes de parodontite
Outre la parodontite chronique, d'autres formes de parodontites existent et sont
répertoriées dans la classification du workshop international de 1999 organisé par
l'Académie Américaine de Parodontologie (Arrnitage, 1999).
Des formes aigues telles que la parodontite ulcérative nécrosante caractérisée par la
nécrose des tissus gingivaux, du ligament parodontal et de l 'os . alvéolaire sont plus souvent
rencontrées chez les patients présentant une immunodéficience grave. Les abcès
parodontaux sont caractérisés par une infection purulente localisée et peuvent conduire à la
destruction du ligament parodontal et de l'os alvéolaire.
La parodontite agressive est un type spécifique de parodontite qui peut être localisée
ou généralisée selon son extension. Elle se caractérise par une perte d'attache rapide et une
destruction osseuse chez des individus en bonne santé, principalement au niveau des
incisives et premières molaires. L'apparition est généralement précoce, avant 3.0 ans. Il
existe également une" prédisposition familiale. La sévérité de la destruction parodontale est
importante par rapport à la faible présence de facteurs locaux (plaque, tartre). Des
proportions élevées de Aggregatibacter actinomycetemcomitans et P. gingivalis dans les
poches parodontales ainsi que des anomalies au niveau de la fonction phagocytaire chez ces
patients, ont été associées à cette pathologie. La progression de cette maladie peut s'arrêter
d'elle-même (Oh et al., 2002).
Enfin, il existe des parodontites en relation avec des pathologies systémiques qu'elles
soient d'ordre endocrinien comme le diabète, d'ordre hématologique comme les leucémies
ou d'~rdre génétique comme les syndromes de Down ou de Papillon-Lefèvre, par exemple
(Newman, 2006).
2.5 Différence de susceptibilité à la maladie parodontale entre
individus
Comme mentionnée précédemment, en fonction de la microflore présente dans le
sulcus, du contexte environnemental et des défenses de 1 'hôte, certaines bactéries
parodontopathogènes peuvent se multiplier et initier la destruction parodontale, conduisant
à une perte des tissus de soutien de la dent. Cependant, malgré la forte prévalence
13
d'individus arborant des bactéries parodontopathogènes, seul un faible pourcentage
d'individus va exhiber un schéma de destruction rapide alors que la plupart auront plutôt
une parodontite à évolution plus lente voire même, aucun symptôme (Schenkein, 2006).
La susceptibilité à la maladie parodontale est déterminée en partie, par une
prédisposition génétique. Pour cela, Y oshie et coll., en 2007, définissent la maladie
parodontale comme «une maladie génétique complexe dont le phénotype est déterminé, à
la fois par le profil. génétique et par les influences environnementales du patient affecté ».
Les variations génétiques qui ont une prévalence de plus de 1 % dans la population sont
appelées polymorphismes (Hart et Marazita, 2005).
De nombreuses études longitudinales ont permis de mettre en évidence une origine
génétique à la fois, pour la parodontite chronique et pour la parodontite agressive. Ainsi, il a
été prouvé que, dans les faI?illes avec une parodontite agressive, il existe une pénétrance
génétique de l'ordre de 70% (Kinane et Hart, 2003). Pour la ·parodontite chronique, une
étude comparant l'évolution du statut parodontal dans le temps, chez de vrais et de faux
jumeaux, a permis de révéler que la présence de la maladie était à hauteur de 50%, d'origine
héréditaire (Hart et Marazita, 2005).
À la différence des maladies parodontales associées à des syndromes comme le
syndrome de Cohen ou le syndrome d'Ehlers-Danlos dont un gène spécifique est
responsable du phénotype observé, les autres maladies parodontales, chroniques et
agressives, ne sont pas liées au défaut d'un seul gène, c;est pourquoi on dit qu'elles sont
complexes. Ces maladies génétiques complexes sont le résultat de plusieurs
polymorphismes génétiques qUI interagissent entre eux et avec les facteurs
environnementaux. Les polymorphismes modifient le risque d'apparition et de progression
de la maladie mais ne sont pas suffisants pour la causer. Ainsi, les polymorphismes
génétiques peuvent être retrouvés chez des individus sains, sans qu'ils ne déclarent jamais
la maladie. Il apparaît donc difficile d'identifier et de démontrer le rôle étiologique exact de
ces polymorphismes (Hart et Marazita, 2005 ; Kinane et Hart, 2003).
Au cours de l'évolution de la maladie . parodontale, les neutrophiles représentent la
première ligne de défense anti-bactérienne. Ils sont aussi impliqués dans la destruction
tissulaire car ils libèrent des enzymes hydrolytiques et des composés oxygénés. Pour sa
fonction de phagocytose, le neutrophile dispose d'un récepteur trans-membranaire, le
14
FcyRIla qui permet la fixation du fragment constant (Fc) des IgG (Yoshie et al., 2007). Ce
. récepteur possède deux formes allotypiques: FcyRIla-H131 et FcyRIla-R131 selon qu'il
possède une histidine ou une arginine sur la position 131 de sa chaîne peptidique. A partir
d'une hypothèse suggérant que l'hyperactivité des neutrophiles, rencontrée dans la
parodontite, était liée à cette variante génétique, Nicu et coll. (2007) ont montré, en
comparant des patients atteints de parodontite chronique, que les patients porteurs de la
variante génétique 131 HlH avaient significativement plus de destruction des tissus
parodontaux que les patients 131 RIR. En effet, les neutrophiles des patients 131 HIH ont
montré une hyperactivité pour la phagocytose, la dégranulation et l'excrétion d'élastase ;
cette sécrétion de molécules actives pouvant expliquer l'aggravation de la destruction
parodontale.
Le polymorphisme des cytokines a aussi été largement étudié. À partir de 1997 avec la
découverte par Kornman et coll. (1997), de l'implication du polymorphisme de l 'IL-l dans
la sévérité de la maladie parodontale chez les non-fumeurs; de très nombreuses études ont
approfondi le sujet avec des résultats peu concordants. Globalement, on peut dire que le
polymorphisme de l'IL-l n'est pas impliqué dans la parodontite agressive mais qu'il joue le
rôle d'un facteur contribuant dans la parodontite chronique, qu'il confère un risque
indépendant de celui du tabac, que son rôle en tant que marqueur génétique est peu fiable,
particulièrement en fonction de sa prévalence différente selon les ethnies étudiées et que
donc, le test commercial disponible doit être interprété avec précaution (Kinane et Hart,
2003 ; Meng et al., 2007 ; Y oshie et al., 2007, Huynh-Ba et al., 2007).
Le gène du TNF-a est situé sur le chromosome 6, dans la section du ·CMH de classe
III. Huit polymorphismes différents ont été rapportés sur sa région promotrice. Le seul
impliqué dans la parodontite chronique serait celui sur le locus -380 mais des résultats très
variables sont obtenus en fonction des études. Aucun lien n'a pu être démontré avec la
parodontite agressive (Kinane et Hart, 2003 ; Y oshie et al., 2007).
Le polymorphisme de l 'IL-4 a également été étudié suite à la constatation que son
taux était plus élevé dans le sérum des patients atteints de parodontite chronique que des
patients sains. Toutes les études faites à ce jour, n'ont pas permis de montrer d'association
quelconque entre ce polymorphisme et les parodontites chronique et agressive (Y oshie et
al., 2007).
15
L'IL-10 est considérée comme une 'cytokine anti-inflammatoire ayant un rôle de
régulation dans la réaction inflammatoire de l'hôte (Y oshie et al., 2007). De nombreux
polymorphismes existent pour cette cytokine, sur son promoteur aux positions -1082, -819
et -592 donnant différents haplotypes GCC, ATA et ACC. Ces 3 haplotypes conduisent à
des taux de sécrétion différents de la cytokine, ce qui modifie les caractéristiques
. phénotypiques, en cas de maladie parodontale (Y oshie et al.,. 2007). Des études suédoises et
turques montrant que lès variations alléliques en position -1087 et -592 sont associées à une
parodontite chronique sévère, ont conduit à une étude longitudinale réalisée 'sur 252
australiens, pendant 5 ans, pour lesquels les facteurs de covariance comme l'âge ou
.l'utilisation de tabac étaient pris en compte. Les résultats de cette étude ont permis de
montrer que les patients porteurs des génotypes ATAIACC et ACC/ACC avaient une
progression de la maladie significativement diminuée et que ces génotypes pouvaient être
considérés comme protecteurs vis-à-vis de la progression de la parodontite (Cullinan et al.,
2008).
Une étude comparant 51 patients atteints de parodontite chronique versus un groupe
contrôle sain, a permis de mettre en évidence l'impact des polymorphismes de l'IL-6 et du
récepteur CD14 des lymphocytes T (Nibali et al., 20(8). Les auteurs ont pu montrer que les
polymorphismes en position -260 sur le gène du CD14 et en position -174 du gène codant
pour l'IL-6 étaient associés à la sévérité de la maladie parodontale, après contrôle des
facteurs confondants. En ne prenant en compte que les patients souffrant d'une parodontite,
ils ont également pu montrer que les patients porteurs de ces polymorphismes étaient
affectés plus sévèrement (Temoven et al., 2007). Ce même polymorphisme d'IL-6 est
associé à une plus grande détection de A. actinomycetemcomitans et de P. gingivalis dans
les poches parodontales, faisant suggérer aux auteurs qu'il existe des relations complexes
entre la microflore bactérienne et le génome de l'hôte (Nibali et al., 2008).
Les ToU like receptor (TLR) 2 et 4 sont des récepteurs de reconnaissance, en
particulier du LPS des bactéries à Gram négatif, retrouvés chez différents types cellulaires.
Deux mutations, sur chacun de leurs gènes, sont considérées comme des polymorphismes
car on les retrouve chez 3 à 8% de la population caucasienne. Puisque l'expression de ces
deux récepteurs est augmentée, dans le tissu conjonctif gingival des patients atteints de
parodontite chronique, des chercheurs ont émis l'hypothèse que le polymorphisme de ces
16
récepteurs pouvait avoir un rôle dans la susceptibilité de 1 'hôte à développer ou non une
parodontite . . Malgré de nombreuses études, les résultats restent très controversés et
nécessitent des analyses supplémentaires pour certifier leur implication dans le processus
pathologique parodontal (Fukusaki et al., 2007 ; Emingil et al., 2007).
Le polymorphisme des MMPs a aussi été étudié. Les MMP-2, -9 et -12 sont
impliquées dans la destruction du collagène de type IV et des composants non
collagéniques de la MEC. Le polymorphisme de ces 3 MMPs est connu et a déjà été associé
à d'autres pathologies dont une susceptibilité au cancer et à l'infarctus du myocarde pour la
MMP-2, une augmentation des troubles cardio-vasculaires pour la MMP-9 et au cancer du
poumon, pour la MMP-12. En ce qui concerne le lien avec la parodontite, il existe
actuellement, encore très peu d'études et avec des résultats peu concordants. Une étude
comparant 87 · patients souffrant de parodontite chronique avec 107 patients sains·, tous
d'origine turque a permis de montrer après élimination des facteurs confondants qu'il n'y
avait pas d'association entre les polymorphismes des MMP-2 et -12 et la parodontite
chronique d'atteinte sévère. Par contre, le polymorphisme de la MMP-9 (une thymidine en
position -1562 sur le promoteur du gène) serait associé à une diminl;ltion de la susceptibilité
à la parodontite (Gürkan et al., 2008).
De nombreuses études ont rapporté des associations entre le complexe ma] eur
d'histocompatibilité (CMH) et la parodontite. Une méta-analyse vient de faire le point sur
ces découvertes, chez les caucasiens. A partir de 174 publications, elle en a retenu douze
qui ont permis de conclure qu'il n'existe pas d'association significative entre le CMH et la
parodontite chronique. Par contre, il existe une association positive entre la parodontite
agressive et les CMH-A9 et -B 15 laissant supposer qu'ils représentent des facteurs de
susceptibilité à la maladie, et une association négative avec les CMH-A2 et -B5 qui
représenteraient des facteurs protecteurs potentiels. Contrairement à d'autres études (Kinane
et Hart, 2003), cette méta-analyse n'a pas permis de montrer d'association avec les CMH de
classe II (Stein et al., 2008).
En conclusion, les recherches sur l'implication du polymorphisme génétique sont une
piste importante pour la compréhension du mécanisme de déclenchement et de progression
de la maladie parodontale. Elles seront probablement, à l'origine de nouvelles possibilités
de dépistage et de nouveaux traitements, dans l'avenir. Nous avons vu que la multiplicité
17
des variables causales dans ces pathologies, rend les recherches complexes et des études
supplémentaires sont encore nécessaires.
3 Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis est une bactérie asaccharolytique, à Gram négatif, anaérobie strict,
formant des colonies à pigmentation noire. P. gingivalis se présente sous la forme d'un
bacille ou coccobacille de petite taille (0,5 à 1 ~m de diamètre pour 2 ~m de long), non
motile et non sporulé. Son ADN est composé de 46 à 48% de bases GC et la souche type
pour les expériences de laboratoire est ATCC 33277.
Sa transmission s'effectue par contact direct ou VIa la salive et sa prévalence
augmente avec l'âge et est corrélée avec la présence d'une parodontite et d'une hygiène
buccale déficiente. Son habitat préférentiel dans la cavité buccale est situé dans les sites
sous-gingivaux où la température, le pH et l'apport en nutriments (peptides) sont favorables
à son développement (Chardin et al., 2006). En absence d'inflammation gingivale, P.
gingivalis est présente en faible quantité dans la salive et sur les parois des muqueuses.
L'augmentation du nombre de ces bactéries est un facteur de risque d'aggravation de la
destruction parodontale (Holt et Ebersole, 2005).
P. gingivalis est plus particulièrement associée aux parodontites agressIves
généralisées ou chroniques sévères. Elle est aussi rencontrée dans d'autres affections
buccales telles que les gingivites et parodontites nécrosantes ainsi que les péricoronites. Un
rôle lui a été assigné dans des troubles plus généraux comme la formation de plaques
d'athérome et la naissance de bébés présentant un déficit pondéral (Holt et Ebersole, 2005).
3.1 Facteurs de virulence de P. gingivalis
3.1.1 Acide désoxyribonucléique
L'acide désoxyribonucléique de P. gingivalis possède un motif nucléaire associé aux
pathogènes (PAMP pour Pathogen Associated Molecular Pattern) qui interagit avec des
récepteurs de reconnaissance, les TLR, retrouvés sur la membrane cellulaire des
kératinocytes et des cellules de l' immunité innée. Cette interaction mène à la libération de
18
cytokines inflammatoires et contribue à la pathogénèse de la maladie parodontale
(Nonnenmacher et al., 2003).
3.1.2 Fimbriae
P. gingivalis possède des fimbriae réparties de façon péritriche, les unes sont longues
et filamenteuses (fimbriae majeures), les autres sont courtes et fines (fimbriae mineures). Il
en existe six types différents (l, lb, II, III, IV et V) qui influencent la virulence de la
bactérie. Les souches porteuses des fimbriae de type II semblent être les plus virulentes
(Chardin et al., 2006).
Les fimbriae sont des adhésines qUI participent à la formation des biofilms en
permettant l'adhésion à des composés salivaires et la coagrégation avec différents genres
bactériens (Actinomyces, Treponema, Fusobacterium et Streptococcus). Elles peuvent aussi
adhérer à des molécules de la MEC comme le fibrinogène ou les cytokératines (Chardin et
al., 2006).
Les fimbriae sont également des P AMP et interagissent avec des divers récepteurs
membranaires; notamment CD 14 et ~2-intégrine, déclenchant la synthèse de cytokines pro
inflammatoires, la protéine chémoattractive des monocytes 1 (MCP-1), le TNF-a, l ' IL-1~,
l'IL-6, l'IL-8, et l'induction de l'expression de molécules d'adhésion comme la molécule
d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1), la molécule d'adhésion des cellules vasculaires 1
(VCAM-1), les P- et E-sélectines et de molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86)
(Amano et al., 2004 ; Chardin et al., 2006 ; Kinane et al., 2008).
3.1.3 Hémagglutinines
Les hémagglutinines sont immunogéniques, tout comme les fimbriae. Il en existe cinq
types (Hag A à Hag E), exprimées à la surface cellulaire (Chardin et al., 2006). Elles sont
impliquées dans la liaison de P. gingivalis aux récepteurs des cellules humaines (Lamont et
J enkinson, 1998). L'activité hémolytique de la bactérie ainsi que les hémagglutinines
permettent de se lier puis de lyser les érythrocytes, libérant ainsi de l 'hémoglobine, source
de fer essentielle à sa croissance (Chardin et al., 2006).
19
3.1.4 Lipopolysaccharide (LPS)
Le LPS est ancré dans le feuillet externe de la membrane externe des bactéries à Garn
négatif. Il se compose de deux parties qui présentent des propriétés biologiques différentes.
La partie lipidique (lipide A) est à la fois, une toxine et un P AMP alors que la partie
polysaccharidique (polysaccharide 0) est immunogénique. Le lipide A a une faible activité
endotoxique, il inhibe l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales et
empêche l'apoptose des neutrophiles. Il présente également une activité
d 'hémagglutination.
Des récepteurs spécifiques aux LPS de P. gingivalis ont été identifiés à la surface des
fibroblastes gingivaux, des macrophages, des neutrophiles et des ostéoclastes. En se fixant à
ses récepteurs, les LPS induisent une cascade de réponse immunitaire dont l'induction de
médiateurs pro-inflammatoires telles que les cytokines IL-1, IL-6, IL-8 et TNP -u, favorisant
l'établissement d'un état inflammatoire chronique, responsable de la destruction tissulaire
(Wang et Ohura, 2002).
3.1.5 Capsule
Elle confère un caractère hydrophile à la surface de la bactérie, cé qui lui permet de
résister à la phagocytose (Sundqvist, 1993). L'épaisseur Gusqu'à 100 nm) et la présence ou
non d'une capsule chez P. gingivalis varie d'une souche à une autre.
3.1.6 Vésicules membranaires
P. gingivalis produit des vésicules extracellulaires Issues de l'évagination de sa
membrane externe. Elles contiennent les composantes exprimées à la surface de la bactérie
incluant les protéases, les hémolysines, les adhésines et le LPS.
Leur faible diamètre, de 50 à 250 nm, pourrait leur permettre de migrer à travers les
espaces intercellulaires, contribuant à la dissémination des bactéries dans les tissus
(Mayrand et HoIt, 1988). Elles jouent un rôle dans l'adhérence, l'hémagglutination, la
dégradation tissulaire et confèrent une protection contre l'activité bactéricide du sérum èt
contre les systèmes de défense de l'hôte (Mayrand et Grenier, 1-989).
20
3.1.7 Enzymes
P. gingivalis possède le plus fort pouvoir protéolytique parmi les bactéries du
complexe rouge. Ces activités hydrolytiques sont impliquées dans de nombreux processus
pathologiques dont la croissance des bactéries, le processus d'invasion et de destruction
tissulaire ainsi que l'évasion des systèmes de défense de l'hôte.
Un premier groupe d'enzymes non-protéolytiques inclue la phospholipase A2, les
phosphatases alcaline et acide, la hyaluronidase, la chondroïtine sulfatase et l 'héparinase
(Chardin et al., 2006).
Les activités protéolytiques incluent aussi la famille des gingipaïnes qui compte trois
enzymes à groupement cystéine : les Arg-gingipaïnes A et B (RgpA et RgpB) et la Lys
gingipaïne (Kgp). RgpA et RgpB induisent une augmentation de la perméabilité vasculaire
via la voie de signalisation kallikreine/kinine et activent les voies de la coagulation
sanguine. Ceci a pour effet d' augment~r le volume du fluide créviculaire et la progression
de l'inflammation. Kgp est une enzyme dont l'activité principale est la dégradation du
fibrinogène et de la fibrine. Elle est aussi responsable de la dégradation de l 'hémoglobine et
des autres hémoprotéines, favorisant ainsi un apport nutritionnel pour la bactérie. Les
gingipaïnes sont également capables de dégrader le récepteur CD 14 des macrophages, ayant
pour conséquence une diminution de l'activation des leucocytes par le LPS, ce qui facilite
la colonisation de P. gingivalis (Imamura, 2003). À elles seules, les gingipaïnes sont
responsables d'environ 85% de l'activité protéolytique de P. gingivalis et jouent un rôle
critique dans la pathogénèse de la parodontite chronique (Kadowaki et al., 2000). Leur
activité est positivement corrélée · avec les pertes d'attache observées chez les patients
atteints de parodontite chronique et la quantité de P. gingivalis présente dans les sites sous
gingivaux (Suido et al., 1988). Leurs actions s'exercent à différents niveaux et entraînent
une atteinte de l'intégrité tissulaire et une perturbation des défenses de l'hôte.
3.1.8 Produits métaboliques toxiques
P. gingivalis utilise préférentiellement des peptides plutôt que des acides aminés libres
comme source d'énergie. Les produits du métabolisme de P. gingivalis incluent notamment \
l'ammoniaque et des acides gras à courte chaîne (butyrate, propionate). Ces produits
21
exercent une toxicité envers les cellules de l'hôte et sont également utilisés par d'autres
espèces bactériennes du biofilm pour favoriser leur multiplication (Takahashi et al., 2000).
P. gingivalis a également la capacité physiologique de produire des composés sulfurés
volatils (H2S et CH3SH), lesquels sont directement responsables du phénomène d'halitose.
De plus, ces composés sulfurés ont un pouvoir toxique vis-à-vis les cellules de l'hôte
(Hinode et al., 2003).
3.2 Mécanismes d'action de P. gingivalis
3.2.1 Adhésion et invasion tissulaire
L'adhésion aux surfaces dentaires et aux muqueuses buccales constitue une étape
essentielle dans la colonisation des sites sous-gingivaux et la survie des bactéries dans un
environnement soumis aux flux de la salive et du fluide gingival. Pour cela, P. gingivalis
possède des adhésines, des fimbriae et des LPS. De plus, la RgpA et la Kgp contiennent
jusqu'à 4 domaines hémagglutinines-adhésines fortement impliqués dans l'adhésion de
cette bactérie (Imamura, 2003). Les adhésines sont présentes sur la membrane externe et
peuvent être également associées aux fimbriae (Chandad et Mouton; 1995). Elles
permettent une adhérence interbactérienne hétérotypique, une adhérence à différents types
cellulaires notamment les cellules épithéliales, les fibroblastes, les érythrocytes et les
leucocytes ainsi qu'à de nombreuses protéines salivaires, du fluide créviculaire et de la
MEC (Lamont et J enkinson, 1998, Chardin et al., 2006). Les fimbrire et les
hémagglutinines, exprimées sur la surface cellulaire, jouent un rÔle crucial dans l'adhésion
de P. gingivalis aux cellules de l'hôte par une liaison aux récepteurs oligosaccharidiques de
la membrane cellulaire (Amano, 2003). Les protéases de la bactérie peuvent aussi favoriser
sa capacité d'adhérence en exposant des sites d'adhésion bactériens masqués, appelés
cryptitopes, à la surface des cellules eucaryotes, permettant d'amplifier l'adhésion des
fimbriae.
L'adhérence bactérienne aux cellules épithéliales est à l'origine de communications
moléculaires qui mènent à l'activation de différentes voies de signalisation chez la cellule
hôte incluant la phosphorylation de protéines, l'augmentation du · flux calcique et la
réorganisation du cytosquelette conduisant à une modification de l'expression des gènes
22
chez la bactérie (Lamont et al., 1995 ; Agnani et al., 2000). L'adhésion de P. gingivalis
induit également, la fonnation d'une invagination de la membrane plasmatique conduisant à
son internalisation via une voie de signalisation médiée par l'actine (Amano, 2007). La
bactérie possède la capacité de se multiplier à l'intérieur de la cellule et peut se propager
d'une cellule épithéliale à une autre sans passer par l'espace extracellulaire, assurant ainsi
sa dissémination dans les tissus parodontaux, en restant protégée de la réponse de l 'hôte
(Yilmaz et al., 2006, Amano, 2007). L'invasion des cellules épithéliales empêcherait la
migration des neutrophiles à travers l'épithélium en inhibant la production d ' IL-8 et
d'ICAM-l. De plus, la bactérie est capable de migrer à travers la membrane basale et de
pénétrer plus profondément dans les tissus parodontaux (Bodet et al. , 2007). La diffusion
dans les tissus parodontaux est facilitée par la production des vésicules membranaires qui
contiennent les principaux facteurs de . virulence de la bactérie et entraînent leur
dissémination ' dans des zones inaccessibles aux bactéries entières, fragilisant aInSI
l'intégrité du parodonte et rendant plus aisée la destruction des tissus parodontaux.
Enfin, les gingipaïnes libèrent le syndécane-1 de la surface des cellules épithéliales
gingivales. Ce co-récepteur de nombreux facteurs de croissance et molécules matricielles
est notamment impliqué dans l'adhésion des cellules à la MEC. Sa destruction pourrait
donc jouer un rôle important dans l'invasion bactérienne (Andrian et al., 2006).
3.2.2 Inactivation du système de défense de l'hôte
P. gingivalis met en œuvre différentes stratégies pennettant l'évasion des défenses
immunitaires de l'hôte. Ceci lui assure un fort potentiel pathogénique, sa prolifération et sa
survie à long tenne. Les gingipaïnes favorisent l'établissement de la bactérie en contournant
les défenses de l'hôte car elles possèdent la capacité de dégrader les immunoglobulines
(IgA, IgG, IgM), certains récepteurs membranaires, les protéines du complément, les
cytokines pro-inflammatoires (IL-1~, IL-6, TNF -u) et les chimiokines (IL-8 et RANTES)
(Imamura, 2003). Cette dégradation entraîne une forte perturbation des réactions
inflammatoires locales et une rupture du gradient de chimiokines à proximité de la plaque
sous-gingivale ayant pour effet d'inhiber l'afflux des leucocytes au site de l'infection. La
dégradation des immunoglobulines pennet à la bactérie d'échapper au système
23
d' opsonisation par les ce~lules phagocytaires et à l'action du complément (Grenier et al. ,
1992). P. gingivalis atténue également l'effet bactéricide du complément en clivant la
protéine C3 et en inactivant le récepteur de la protéine C5 du complément présent à la
surface des neutrophiles qui joue un rôle essentiel dans leur chimiotactisme au site de
l'infection. Il en résulte une forte perturbation des fonctions phagocytaires (Bodet et al. ,
2007 ; Slaney et Curtis, 2008).
3.2.3 Destruction tissulaire
Les protéases de P. gingivalis ont un rôle non négligeable dans la destruction des
tissus patodontaux. La collagénase dégrade le collagène de type l et les gingipaïnes
dégradent de nombreux constituants de la membrane basale dont le collagène IV, la
laminine et la fibronectine (Imamura, 2003). Les protéases de P. gingivalis peuvent aussi
dégrader les jonctions intercellulaires des cellules épithéliales affectant la perméabilité de la
barrière épithéliale et l'intégrité des tissus parodontaux (Katz et al., 2000).
De nombreux inhibiteurs de protéases de 1 'hôte (a l-antitrypsine, antichymotrypsine,
a2-macroglobuline, antithrombine III, antiplasmine et cystatine C) sont également
dégradés, compromettant la régulation des activités protéolytiques lors de la réaction
inflammatoire. P. gingivalis peut activer le plasminogène en plasmine, enzyme impliquée
dans la dégradation de protéines matricielles (fibronectine et laminine) et dans l'activation
des formes latentes de MMPs (Bodet et al., 2007). Ces actions combinées résultent en une
dégradation incontrôlée des composants des tissus parodontaux et interfère avec la
réparation des tissus détruits.
3.3 Influence des facteurs environnementaux sur la physiologie de P.
gingivalis
L'expression des facteurs de virulence chez une bactérie pathogène est influencée par
les facteurs environnementaux. P. gingivalis présente une certaine aérotolérance grâce à la
présence d'une superoxyde dismutase (SOD) qui catalyse la dismutation de l'anion
superoxyde en peroxyde d'hydrogène. Ainsi, lors d'une exposition à l'air, l'expression de
24
SOD augmente, protégeant la bactérie contre les mécanismes de bactéricidie dépendants de
l'oxygène, utilisés par les phagocytes. La croissance de P. gingivalis s'effectue de façon
optimale entre 37 et 39°C. Quand la température augmente vers 39°C, l'expression de SOD
augmente alors que celle des fimbriae et des gingipaïnes diminue.
P. gingivalis peut se développer dans un milieu de culture dont le pH est compris
entre 6,5 et 8,3. Sa croissance maximale se situe à un pH de 7-7,5. À l'état sain, le pH du
sulcus est proche de la neutralité mais augmente en cas d'inflammation pouvant atteindre
8,5 voire 9. Ceci favorise l'expression de la SOD et des gingipaïnes.
P. gingivalis utilise de 1 'hème pour la formation du pigment qui le protège contre le
peroxyde d'hydrogène. L'hème assure aussi à la bactérie, une protection contre le stress
oxydatif et permet une · plus forte expression des fimbriae. L'atome de fer de l 'hème a un
rôle de cofacteur pour la SOD et participe à la régulation des facteurs de virulence (Holt et
Ebersole, 2005 ; Chardin et al., 2006).
4 Modèle ex vivo de sang complet
Le fluide gingival origine du plexus veineux du chorion sous-jacent à l'épithélium de
jonction et longeant l'espace dento-gingival. Il contient des molécules originaires du sang,
des tissus de l'hôte et de la plaque sous-gingivale incluant des électrolytes, des petites
molécules organiques, des protéines, des cytokines, des anticorps spécifiques, des antigènes
bactériens et des enzymes provenant à la fois de l'hôte et des bactéries (Delima et Van
Dyke, 2003). Il contient également des cellules dont des bactéries de la plaque sus-jacente,
des cellules épithéliales desquamées qui s'exfolient dans la cavité buccale par
l'intermédiaire du fluide gingival, et des leucocytes dont des neutrophiles, des macrophages
et des lymphocytes. Des érythrocytes peuvent également s'y retrouver lorsqu'il y a présence
d'inflammation sévère (Delima et Van Dyke, 2003).
Concernant la composition leucocytaire, il existe une similitude entre le sang et le
fluide gingival quoique la proportion diffère. Ainsi, à l'état sain, Ebersole et coll. (2003) ont
rapporté que les neutrophiles, à hauteur de 60% des globules blancs dans le sang
représentent 95 à 97% dans le fluide gingival, que les monocytes à hauteur de 5 à 10% dans
le sang représentent 2 à 3% dans le fluide gingival et que les lymphocytes à hauteur de 20 à
25
30% dans le sang représentent 1 à 2% des leucocytes dans le fluide gingival. Il est
important de noter qu'il existe un rapport inversement proportionnel entre les lymphocytes
T et B entre le sang et le fluide gingival. En effet, si dans le sang, les lymphocytes T sont
prédominants de l'ordre de 50 à 75% des lymphocytes, ils ne représentent que 290/0 dans le
fluide gingival. Par contre, les lymphocytes B qui ne représentent que 15 à 30% de la
population de lymphocytes dans le sang se retrouvent à hauteur de 71 % dans le fluide
gingival. En cas de parodontite chronique, les quantités de globules blancs augmentent mais
en restant dans les mêmes proportions (Ebersole, 2003).
Le but de notre étude étant de considérer la réaction inflammatoire déclenchée par P.
gingivalis, il est d'un grand intérêt que "tous les différents types de cellules immunitaires
soient représentés. Pour cela, le modèle ex vivo de sang complet permet de se rapprocher de
la composition du fluide créviculaire car il possède, certes, des proportions différentes mais
les mêmes composants immunitaires. Ainsi, le modèle de sang complet représente un
environnement physiologique pertinent à une situation in vivo, pour étudier la production de
médiateurs inflammatoires suite à la stimulation par les bactéries car les interactions
cellulaires qui se produisent entre les différents leucocytes sont préservées (Bodet et al.,
2005).
5 Utilisation des antibiotiques en parodontie
Considérant le fait que la destruction tissulaire et osseuse observée dans la parodontite
chronique est à la fois le résultat de l'agression bactérienne et de la réponse immuno
inflammatoire exagérée de l'hôte, les antibiotiques, en administration systémique et en
administration locale, ont fait l' obj et de nombreuses étu~es pour évaluer leur impact sur
l'amélioration de la condition parodontale. Parallèlement, les propriétés
immunomodulatrices des tétracyclines ont aussi permis de développer d'autres thérapies
comme la prise de doxycycline à des doses sub-antimicrobiennes et plus récemment des
tétracyclines modifiées chimiquement (CMT) qui agissent sur la régulation de la réponse
inflammatoire de 1 'hôte.
Le surfaçage radiculaire est considéré comme le « gold standard» du traitement de la
parodontite car il permet à la fois de retirer les concrétions tartriques fonnées le long de la
26
racine et de désorganiser le biofilm. Malgré certains articles récents tendant à montrer que
l'emploi d'antibiotiques (métronidazole et amoxicilline) pourrait seul, permettre de
stabiliser une parodontite non-traitée mécaniquement (Lopez et al., 2006), la communauté
scientifique s'accorde à dire que l'emploi d'antibiotiques en thérapie unique est une erreur,
cela pour plusieurs raisons (Haffajee, 2006 ; Walter et al., 2006 ; Ferez-Filho et al., 2006) . .
D'abord, parce que le biofilm est une organisation complexe dans lequel les concentrations
d'antibiotiques devraient être jusqu'à 500 fois supérieures à celles délivrées pour que la
concentration bactéricide minimale soit atteinte en son centre (Magnusson et al. , 1984). De
plus, il existe des risques de favoriser l'apparition de résistances aux antibiotiques. Enfin,
pour des problèmes de compliance de la prise des traitements par les patients et pour le coût
économique d'une telle procédure, l'utilisation d'antibiotiques doit être limitée à certaines
circonstances. Ainsi, le débridement mécanique et le contrôle de plaque post-traitement
semblent indispensables au succès thérapeutique malgré l'apport des antibiotiques.
5.1 Traitement systémique
Selon une revue de littérature réalisée par Haffajee et coll. en 2003, essayant de
déterminer le bénéfice clinique qu'apporte une antibiothérapie systémique dans le
traitement des parodontites, il ressort que tous les antibiotiques seuls ou en combinaison
apportent une amélioration supplémentaire par rapport au débridement mécanique seul.
Cependant, aucune conclusion ne peut être tirée sur la posologie et la durée de traitement
idéal. Compte tenu du risque de créer des résistances bactériennes, il est conseillé de ne
prescrire ces médicaments que dans le cas de la parodontite aiguë, de la parodontite
agressive et de la parodontite chronique récurrente (réfractaire) (Haffajee et al. 2003, 2006 ;
Mombelli, 1998 ; Slots, 2004).
L'utilisation systémique d'~ntibiotiques permet via une administration par voie orale,
. d'affecter les bactéries présentes au niveau de tous les sites d'activité de la maladie
parodontale mais aussi au niveau des niches extra-dentaires comme la langue ou les
tonsilles palatines, diminuant ainsi le risque de translocation bactérienne et donc de
récurrence de l'infection des sites affectés. Par contre, il apparaît qu'il peut être difficile
27
d'obtenir une concentration efficace de la molécule au niveau du fluide gingival. Il existe
également, un risque de développement de résistance bactérienne à l'antibiotique.
Les combinaisons d'antibiotiques semblent être la meilleure stratégie thérapeutique
car elles permettent un spectre d'action plus large. Ainsi, l'amoxicilline et métronidazole ou
la ciprofloxacine et métronidazole pour les patients allergiques aux pénicillines, permettent
une bonne couverture antibiotique, apportant une amélioration significative en complément
de la thérapie mécanique (Slots, 2002, 2004).
5.2 Traitement local
Selon une revue de littérature de Bonito et coll. (2005), comparant les effets de la
tétracycline, la minocycline, le métronidazole et la chlorhexidine, les antimicrobiens en
administration locale, dans les poches parodontales apportent une amélioration en terme de
réduction de profondeur de poches et de gain d'attache par rapport au surfaçage seul. La
minocycline suivie de la tétracycline semblent représenter les molécules permettant les
meilleures améliorations devant le métronidazole et la chlorhexidine. Cependant, les gains
moyens obtenus sont de l'ordre de 0,25 à 0,5 mm de réduction de profondeur de poches et
de l'ordre de 0,1 à 0,5 mm pour le gain d'attache, à 6 mois post-traitement. Si ces résultats
sont statistiquement significatifs, il n'en reste pas moins que cette amélioration peut paraître
négligeable au niveau clinique, d'autant que la différence observée entre les groupes tests et
les groupes contrôles (surfaçage seul) semble s'amoindrir avec le temps. L'efficacité de ces
thérapies semble plus importante dans les cas de parodontite sévère avec poches profondes
et atteinte de furcation. Les auteurs suggèrent que ces traitements devraient être réservés
aux sites parodontaux qui ne répondent p'as favorablement à la thérapie par surfaçage ou
aux patients dont la condition médicale ne permet pas une intervention chirurgicale.
La doxycycline délivrée sous forme de gel à 15% s'avère également efficace
comparativement au surfaçage seul avec des gains au niveau de la profondeur de poches et
de l'attache (0,4 mm) supérieurs à 6 mois sur 111 patients laissant suggérer que
l'amélioration apportée par ce . traitement pourrait permettre de limiter une intervention
chirurgicale aux poches les plus profondes (Eickholz et al. , 2002).
28
Le principal problème des antibiotiques délivrés localement au niveau des poches
parodontales est de pouvoir maintenir une concentration efficac~ sur le long terme. En effet,
le flux gingival constant au niveau créviculaire entraîne cette problématique et le véhicule
idéal pour délivrer l'antibiotique est encore à l'étude (Johnson et al., 2002). Parmi les
produits actuellement disponibles, mentionnons la minocycline 2% commercialisée sous
forme de microsphères (Dentomycin®), la doxycycline sous forme de gel à 10%
(Atridox®), le métronidazole sous forme de gel à 25% en suspension semi-solide (Elysol
dental gel®) et la tétracycline sous forme de fibres de copolymère non-résorbable contenant
25% d'hydrochlorure de tétracycline (Actisite periodontal fiber®) que l'on place dans une
poche parodontale pendant 7 à 12 jours avant de la retirer.
5.3 Traitement immunomodulateur
Les tétracyclines sont un groupe d'antibiotiques à large spectre et bactériostatiques
utilisés dans un grand nombre d ' infections. Leur noyau est constitué de quatre cycles. La
tétracycline fait partie de la première génération de tétracyclines tandis que la doxycycline
et la minocycline sont des molécules semi-synthétiques issues de la tétracycline sur laquelle
des groupements ont été modifiés au niveau de la zone périphérique supérieure de la
structure cyclique de la molécule entraînent des modifications sur leur action biologique
(Sapadin et al., 2006). Elles agissent en bloquant la liaison entre le site amino-acyl de
l'ARN de transfert et le ribosome, empêchant ainsi la synthèse protéique. En plus de leur
activité bactériostatique qui permet d'inhiber la croissance et la multiplication bactérienne,
les tétracyclines possèdent des propriétés anti-inflammatoires, capables de lutter contre les
réponses immuno-inflammatoires exagérées de l'hôte, de réduire l'activité destructrice des
MMPs, de bloquer l'angiogénèse pathologique dans les phénomènes tumoraux et de
moduler les phénomènes d'apoptose et le métabolisme osseux (Sapadin et al., 2006).
La doxycycline qui présente les meilleures propriétés anti-inflammatoires à la plus
petite concentration a servi à développer la tétracycline à dose sub-antimicrobienne dans le
traitement des parodontites (Preshaw et al., 2004). Les tétracyclines sont aujourd 'hui
utilisées pour ces propriétés anti-inflammatoires dans le cadre de nombreuses maladies dont
les maladies de peau comme l'acné ou la rosacée, les désordres bulleux, la sarcoïdose ou
29
encore le sarcome de Kaposi, certaines maladies auto-immunes dont la polyarthrite
rhumatoïde ou encore la sclérodermie et de certains cancers (Sapadin et al., 2006).
Les tétracyclines ont de nombreux effets secondaires dont notamment, l'induction
d'une photosensibilité, de dyscrasies sanguines, de dysfonctions hépatiques et de troubles
gastro-intestinaux ainsi que des manifestations allergiques. Elles ne doivent pas être
utilisées chez les enfants de moins de huit ans et chez la femme enceinte, en raison de la
fixation qui se fait sur les tissus durs, en cours de minéralisation. Des interactions
médicamenteuses se font avec le bicarbonate de sodium et tous les cations polyvalents qui
se chélatent à la molécule et diminue son absorption au niveau gastrique. Elles altèrent les
dosages sanguins du lithium et diminuent le besoin en insuline chez les diabétiques. Les
barbituriques, la carbamazépine et les hydantoïnes, en augmentant le métabolisme
hépatique, diminuent les concentrations sériques des tétracyclines. Leur effet inhibiteur sur
la production de vitamine K par la flore intestinale, associé à la prise d'anticoagulants
coumariniques, risque de prolonger l'effet de ces médicaments sur l'INR et de provoquer
des épisodes de saignement.
5.3.1 Doxycycline à dose sub-antimicrobienne (Periostat®)
Le risque principal d'administrer une antibiothérapie à long terme est de voir se
développer des résistances bactériennes. 'Golub et coll. (1994) ont ainsi développé, à la fin
des années 80, une thérapie basée sur la prise de doxycycline à dose sub-antimicrobienne
(SDD), soit 20 mg deux fois par jour au lieu des 50 ou 100 mg recommandés pour obtenir
l'effet antibiotique de cette molécule. Ces auteurs ont ainsi montré que suite à un traitement
de deux semaines, 60 à 80% des patients atteints de parodontite chronique montraient une
réduction significative de l'activité collagénase dans les tissus gingivaux (Golub et al.,
1990) et cela sans création de résistance ou d'effet indésirable lié aux propriétés
antibiotiques (Golub et al., 1994). En effet, utilisé à cette dose, le pic de concentration
sérique de doxycycline est de 0,7 à 0,8 J.lg/ml, ce qui est en deçà de la concentration
minimale inhibitrice de cette molécule, évitant ainsi le développement de résistance
(Preshaw et al., 2004). L'effet de cette thérapie, est donc axée uniquement sur les propriétés
immunomodulatrices de la molécule et n'a pas d'impact sur les flores bactériennes buccale
30
et intestinale (Walker et al., 2000, 2005). De nombreuses études cliniques ont montré
l'efficacité de ce traitement en terme de réduction de profondeur de poche et de gain
d'attache quand utilisé en complément du surfaçage radiculaire versus la thérapie par
surfaçage, seule.
La SDD interfèrerait avec les MMPs à plusieurs niveaux: en inhibant leur activité
catalytique, en supprimant l'expression des gènes codant pour la synthèse de ces molécules
et en empêchant l'activation de leurs molécules précurseurs (Sorsa et al., 2006).
Une étude en double aveugle, réalisée sur 32 patients atteints de parodontite
chronique, a évalué l'effet de la SDD sur les taux de MMP-8, MMP-9, TIMP-1 et IL-6
après 120 j ours de traitement, en comparant deux groupes : surfaçage radiculaire (SRP) et
SDD versus SRP et placebo (Choi et al., 2004). Il a été constaté que le niveau de MMP-8
avait significativement diminué <;lans le groupe test, que le niveau de TIMP-1 avait
augmenté dans les deux groupes et que les taux de MMP~9 et d'IL-6 montraient une
diminution dans le groupe test, sans toutefois, être significatif. Les auteurs ont conclu que
l'amélioration des paramètres cliniques observés avec SRP et SDD est liée au contrôle du
taux de MMP-8 dans le fluide gingival (Choi et al., 2004). L'approche thérapeutique
recommandée à ce jour, est un traitement initial de trois mois de doxycycline à 20 mg BID,
en complément du surfaçage radiculaire. Si les paramètres de profondeur de poche et de
perte d'attache sont stables à la réévaluation, un maintien par des contrôles aux trois mois
suffirait à maintenir la santé parodontale. Si on observe une dégradation des résultats
obtenus, il est alors recommandé de renouveler le traitement pour trois mois (Zahavi et
Caton, 2006 ; Caton et al., 2000).
Enfin, une étude a pu montrer un effet synergique des propriétés immunomodulatrices
de la SDD avec le flurbiprofène, dans le contrôle de la parodontite chronique, expliqué par
une meilleure efficacité des effets anticollagénases (Lee et al., 2004).
5.3.2 Tétracyclines modifiées chimiquement (CMT)
Golub et coll. (1990) ont étudié la spécificité des propriétés anti-collagénolytiques des
tétracyclines et ont localisé le site sur la molécule, responsable de l'effet anti -collagénase.
Le retrait du groupe diméthylamide en C4 des molécules de tétracyclines réduit leurs
31
propriétés antibiotiques et améliore leurs propriétés non antibiotiques. C'est sur ce principe
qu'a été développée la CMT-1 (Sapadin et al., 2006). Une série de 8 CMTs ont ainsi été
créées à partir de modifications sur la molécule de tétracycline de base. De nombreuses
études pré-cliniques ont observé les effets de ces molécules et elles se sont avérées efficaces
dans le contrôle de l'activité des MMPs. Par exemple, elles permettent une inhibition des
gélatinases MMP-2 et MMP-9, des stromélysines (MMP-3, MMP-10, MMP-11) et des
collagénases (MMP-1, MMP-8, MMP-13). La MMP-8 est la collagénase la plus
fréquemment rencontrée au niveau des sites parodontaux malades et est celle qui initie la
destruction tissulaire d'où l'intérêt que suscitent ces molécules ·pour améliorer l'arsenal
thérapeutique contre les maladies parodontales (Kirkwood et al., 2007). Les CMTs auraient
aussi la capacité d'inhiber la résorption osseuse et l'activité ostéoclastique et
démontreraient des propriétés anti-proliférative et anti-métastatique, ouvrant la voie à de
nouvelles thérapeutiques pour lutter contre le cancer.
Leur mécanisme d'action n'est pas complètement élucidé mais plusieurs hypothèses
ont été proposées dont l'inhibition de l'activation des molécules pro-MMPs ou l'inhibition
directe des MMPs actives par la fixation des CMTs à un des récepteurs zinc-dépendants.
Elles agiraient comme un chélateur, entraînant des modifications de conformation de ces
protéines et leur inactivation (Acharya et al., 2004 ; Bitl et al., 2006).
Dans la gestion des désordres parodontaux, les CMTs sont donc une arme
supplémentaire encore à l'étude, contre la réponse' inflammatoire exagérée de l'hôte.
Comparativement aux tétracyclines, elles présentent plusieurs avantages: leur
administration systémique à long terme ne risque pas d'entraîner de résistance, n'entraîne
pas d'effets secondaires tels que la photosensibilité par exemple et n'entraîne pas de toxicité
gastro-intestinale. De plus, étant donné la possibilité d'administrer des doses importantes, le
nombre de prises de comprimés pourrait être diminué (Acharya et al., 2004).
Dans les études in vitro, CMT -3 et CMT -8 montrent le plus fort pouvoir inhibiteur sur
l'activité des MMPs. Comparant l'effet de différentes CMTs sur la production de
gélatinases par les cellules du ligament parodontal, il est intéressant de noter que Bilt et
coll. (2006) ont remarqué qu'à faibles concentrations, les CMTs entraînaient une
augmentation de la production des MMPs alors qu'à concentrations élevées, une réduction
importante de ces mêmes gélatinases était observée. Les auteurs ont émis l'hypothèse que
32
les cellules seraient capables de détecter une diminution des taux de MMPs extracellulaires
et en réponse d'en augme,nter leur production (Bilt et al., 2006).
En 2002, une étude réalisée sur un modèle de rat, a permis de comparer l'efficacité de
la doxycycline et de 5 CMTs sur la production de TNP-a, d'IL-l~, de IL-6, de MMP-2 et de
MMP-9. Toutes ces molécules se sont avérées efficaces pour diminuer les . taux des
cytokines et MMPs étudiées avec, par ordre décroissant d'efficacité, la CMT -8, puis la
CMT-l, la CMT-3, la doxycycline, la CMT-4 et enfin la CMT-7 (Ramamurthy et al. ,
2002).
33
Hypothèses de travail
Dans le cadre de ce travail de maîtrise, deux hypothèses ont été définies :
~ Les antibiotiques de la famille des té~racyclines permettent de réduire la réponse
inflammatoire induite par P. gingivalis dans un modèle ex vivo de sang complet.
~ La réaction ·inflammatoire déclenchée par P. gingivalis dans un modèle ex vivo de
sang complet, issu de patients atteints d'une parodontite chronique, présente une différence
significative par rapport à celle mesurée dans le sang de patients sains.
Objectifs
Afin de vérifier ces hypothèses, deux objectifs ont été définis:
~ Evaluer l'effet anti-inflammatoire des tétracyclines et de ses dérivés dans un
modèle ex vivo de sang complet stimulé avec le LPS de P. gingivalis.
~ Comparer la production d'une gamme de médiateurs inflammatoires dans un
modèle de sang complet de patients sains et atteints de parodontite chronique, suite à une
stimulation avec des cellules entières de P. gingivalis.
Pertinence de la recherche
Bodet et coll. (2006), dans une étude utilisant le modèle ex vivo de sang complet et
portant sur la production de cytokines pro-inflammatoires chez des individus sains, suite à
une stimulation par différentes souches et concentrations de P. gingivalis, ont montré une
induction de la sécrétion d'IL-l~, TNF-a, IL-6, IF-y, IL-8"RANTES, MCP-l et PGE2. Les
taux de sécrétion étaient dépendants de la souche utilisée et de la dose infectieuse
34
appliquée. A partir de ces analyses, les auteurs ont rapporté que les réponses les plus
importantes avaient lieu à des doses infectieuses de 107 cellules/mL avec une période de
stimulation de six heures (Bodet et al., 2006). Dans notre projet, nous nous baserons sur ces
résultats pour établir les conditions de stimulation de nos échantillons.
La première partie de l'étude compare l'effet anti-inflammatoire de différentes
tétracyclines. Elle permettra d'identifier quelle molécule et quelle concentration entraîne
une inhibition efficace de la réponse inflammatoire exagérée, déclenchée par le LPS de P.
gingivalis dans le sang complet, en vue de mieux cibler les futurs traitements thérapeutiques
à apporter aux patients.
La deuxième partie de notre étude compare la réactiori immuno-inflammatoire de
patients atteints de parodontite chronique et de sujets sains face · à une stimulation du sang
complet avec P. gingivalis (cellules entières). Le fait d'étudier cette réponse à partir d'un
modèle de sang complet dans lequel les interactions cellulaires se produisant entre les
différents types leucocytaires sont préservées, peut nous permettre de mieux comprendre la
réponse inflammatoire induite par P. gingivalis. Ces résultats pourraient aussi ouvrir des
pistes pour la mise au point d'un test de susceptibilité en cas de différence de réponse entre
les deux groupes.
35
CHAPITRE 2: ARTICLES SCIENTIFIQUES
Article 1: Publié dans Journal of Periodontology, 2008, 79: 1762-'
1768.
Doxycycline reduces lipopolysacc'haride-induced inflammatory
mediator secretion in macrophage and ex vivo
human whole blood models
Julia Cazalis DDS, Charles Bodet PhD, Guy Gagnon DDS, PhD, and Daniel Grenier, PhD
Research Group in Oral Ecology, Faculty of Dentistry, Université Laval,
Quebec City, Quebec, Canada
Correspondence: Dr. Daniel Grenier, Research Group in Oral Ecology, Faculty of
Dentistry, Laval University, Quebec City, Quebec, Canada, G1K iP4. Fax: (418) 656-2861.
E-mail: [email protected]
36
RÉSUMÉ
Introduction : Les tétracyclines ont été abondamment utilisées en complément, dans le
traitement de certaines formes de parodontites .. Le but de cette étude était d'évaluer la
capacité de la doxycycline à moduler la sécrétion de médiateurs inflammatoires par les
macrophages et, dans un modèle ex vivo de sang complet stimulé par le lipopolysaccharide
(LPS) de bactéries parodontopathogènes.
Méthodes: Les macrophages dérivés des monocytes ont été SOumIS à différentes
concentrations de doxycycline avant d'être stimulés par le LPS de Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. La capacité de la doxycycline à moduler la réponse inflammatoire
a aussi été testée dans un modèle ex vivo de sang complet (sang complet prélevé sur des
sujets sains et de patients atteints de parodontite chronique) stimulé avec le LPS de
Porphyromonas gingivalis. La sécrétion d'interleukine-l~ (IL-l~), du facteur de nécrose
tumoral alpha (TNF-a), d'interleukine-6 (IL-6) ej d'interleukine-8 (IL-8) a été quantifiée
dans les deux modèles par la technique ELISA. Les changements de l'état de
phosphorylation des kinases, . induits par le LPS de A. actinomycetemcomitans et la
doxycycline dans le modèle de macrophages, ont été évalués par une analyse ELISA.
Résultats: La sécrétion d'IL-l~, de TNF-a et d'IL-8 par les macrophages a diminué
significativement (P < 0.05) quand ils étaient préalablement traités avec 2 IlM de
doxycycline, alors qu'une concentration de 10 IlM a été nécessaire pour réduire
significativement la sécrétion d'IL-6. Le pré-traitement des macrophages avec 10 IlM de
doxycycline, avant la stimulation par le LPS de A. actinomycetemcomitans a entraîné une
nette diminution de la phosphorylation de ERKI/2 (-76%). Dans le modèle de sang
complet, la doxycycline, plus particulièrement à la concentration de 10 IlM, a aussi montré
une capacité d'inhibition de la réponse inflammatoire concernant la production de cytokines
pro-inflammatoires.
Conclusion: Ces deux modèles apportent une preuve évidente que les bénéfices observés
cliniquement par l'administration de doxycycline, sont liés à sa capacité à moduler la
sécrétion de médiateurs inflammatoires par les cellules de l'hôte ..
37
ABSTRACT
Background: Tetracyclines have been extensively used as adjuncts in the treatment of
sorne fonns of periodontitis. The aim of this study was to evaluate the capacity of
doxycycline to influence the secretion of inflarnmatory mediators in macrophage and ex
vivo human whole blood models stimulated with periodontopathogen lipopolysaccharides
(LPS).
Methods: Monocyte-derived macrophages were treated with varlOUS concentrations of
doxycycline prior to being stimulated with Aggregatibacter actinomycetemcomitans LPS.
The capacity of doxycycline to mediate inflammatory response was also tested in an ex vivo
whole blood model (whole blood isolated from periodontitis patients and healthy subjects)
stimulated with Porphyromonas gingivalis LPS. The secretion of interleukin-1 ~ (IL-1~)
tumor necrosis factor a (TNF -a), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-8 (IL-8) . in both
models was assessed by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Changes in
phosphorylation state of kinases induced by A. actinomycetemcomitans LPS and
doxycycline in the macrophage model were characterized by a multiplex ELISA analysis.
Results: The secretion of IL-1~, TNF -a and IL-8 by macrophages decreased significantly
(P < 0.05) when they were pretreated with 2 JlM doxycycline, while a concentration of 10
JlM was required to significantly reduce IL-6 secretion. Pre-treatment of macrophages with
10 JlM doxycycline prior to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation resulted in a
marked decrease in the phosphorylation of ERK1/2 (-76%). In the whole blood model,
doxycycline, more particularly at 10 JlM, was also a potent inhibitor of the pro
inflarnmatory cytokine response.
Conclusions: These two models provided clear evidence that sorne of the clinically proven
benefits o~ doxycycline may be related to its ability to regulate inflammatory mediator
release by host cells.
38
INTRODUCTION
Periodontitis is a multifactorial polymicrobial infection characterized by a destructive
inflammatory process affecting the tooth supporting tissues and resulting in periodontal
pocket formation, alveolar bone resorption, . and, ultimately, tooth loss. The local host
Immune response to . periodontopathogens and their products such as cell-associated
lipopolysaccharide (LPS) results in the recruitment of polymorphonuclear neutrophils and
macrophages and the subsequent release of inflammatory mediators, which play crucial
roles in the pathogenesis of periodontal disease. l The continuous secretion of large amounts
of inflammatory mediators, including interleukin-l ~ (IL-l ~) , interleukin-6 (IL-6),
interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor alpha (TNF -u), and prostaglandin E2 (PGE2), by
host cells following stimulation by periodontopathogens has 'been shown to modulate
matrix metalloproteinase (MMP)-mediated periodontal tissue destruction.2,3
While human subgingival plaque harbors sorne 500 bacterial species4, evidence points to
Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans as the major
etiologic agents of chronic periodontitis and localized aggressive periodontitis,
respectively.5 LPS from Gram-negative bacteria are potent inducers of pro-inflarnmatory
mediators and can initiate a number of host-mediated destructive processes.6 More
specifically, A. actinomycetemcomitans a1)d P. gingivalis LPS induce the secretion of
inflarnmatory mediators and MMPs by macrophages and gingival fibroblasts. 7-9
Given the infectious nature of periodontal diseases and the limited success of conventional
mechanical therapies for the treatment of aggressive and refractory perioàontitis, the use of
antibiotics is warranted in certain cases. lO Tetracyclines have been extensively used as
adjuncts in the treatment of periodontitis. 11 Classic tetracyclines come from Streptomyces
spp., but the newer derivatives, such as doxycycline, are semi-synthetic. The beneficial
effect of tetracyclines arise from five distinctive properties: (i) their efficiency in
suppressing the growth of periodontopathogenic bacteria, (ii) their capacity to attain high
concentrations in the gingival crevicular fluid, (iii) their prolonged substantivity resulting
from their ability to bind to the tooth surface and to be released slowly into the periodontal
pocket in an active form, (iv) their capacity to inhibit the activity and expression of MMPs,
39
and (v) their capacity to protect serine proteinase inhibitors (serpins), such as ul-proteinase
inhibitor, from proteolytic inactivation in gingival crevicular fluid. 11-15
The a1m of this study was to evaluate the capacity of doxycycline to influence the
production of inflammatory mediators by immune cells stimulated with LPS from
periodontopathogens. Since monocytes and macrophages are found in higher numbers in
active periodontallesions than in inactive sites16, we used monocyte-derived macrophages
as one model. The effect of doxycycline on phosphorylation state of macrophage
intracellular kinases, which are implicated in inflammatory signaling pathways, was also
investigated. In addition, we used an ex vivo human whole blood model, which has the
advantage of taking into consideration the interactions between different immune cell types
that contribute to the inflammatory response.
MATERIALS AND METHODS
Bacteria and LPS preparations
A. actinomycetemcomitans ATCC (American Type Culture Collection) 29522 was grown in
Todd-Hewitt broth (THB) supplemented with 1 % yeast extract while P .. gingivalis ATCC .
33277 was grown in THB supplemented with 0.001 % hemin and 0.0001 % vitamin K. The
bacterial cultures were incubated at 37°C under anaerobic conditions (80% N2, 100/0 H2,
100/0 CO2) for 24 h. LPS were isolated from both bacterial species using the protocol
described by Darveau and Hancock17, which is based on the digestion of a whole cell
extract by proteinase K, and successive solubilization and precipitation steps. The LPS
preparations were freeze-dried and stored at -20°C until used. The amount of contaminating
protein was evaluated using a protein assay kit, with bovine serum albumin as a control.
Contaminating protein made up less than 0.001 % (w/w) of the LPS preparations.
Monocyte cultures and differentiation into adherent macrophages
U937 cells (ATCC CRL-1593.2, human monoblastic leukemia cellline) were cultivated at
37°C in a 5% CO2 atmosphere in RPMI-1640 medium supplemented with 10% heat-
40
inactivated fetal bovine serum (FBS) (RPMI-FBS) and 100 J.1g/mL of peniciIlin
streptomycin. Monocytes (2 x 105 cells/ml) were incubated in RPMI -FB S containing 10
ng/ml of phorbol myristic acid (PMA) for 48 h to induce differentiation into adherent
macrophage-like cells as previously reported. 18 Following the PMA treatment, the RPMI.;.
FBS was replaced with fresh medium and differentiated cells were incubated for an
additional 24 h prior to use. Adherent macrophages were suspended in RPMI-FBS and
centrifuged at 200 x g for 8 min. The cells were washed and suspended at 1 x 106 cells/ml in
RPMI supplemented with 1 % heat-inactivated FBS. Two ml were added to each weIl of 6-
well plates (2 x 106 cells/well), and incubated at 37°C in a 5% CO2 atmosphere for 2 h prior
to the doxycycline and LPS treatments.
Treatment of macrophages
Various concentrations of doxycycline hyclate (0, 2, 5, 10, and 20 J.1M) were added to the
macrophage cultures, which were then incubated at 37°C in 5%·C02 for 2 h prior to ad ding
A. actinomycetemcomitans LPS at a final concentration of 1 J.1g/ml. After a 24 h incubation
(37°C in 5% CO2), the culture medium supematants were removed and stored at - 20°C
until used. Cells incubated in culture medium without doxycycline and LPS were used as
controls. An MTT (3-[ 4,5-diethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay
performed according to the manufacturer' s protocol was used to test the toxicity of
doxycycline and LPS on macrophages.
Analysis of phosphorylated macrophage intracellular kinases
Searchlight Kinase Assays, which provide quantitative information on phosphorylated
protein kinases, were performed by Pierce Biotechnology (Wobum, MA, USA). The
multiplex sandwich ELISA assays use highly specific immunological reagents.
Macrophages were treated with 10 J.1M doxycycline (37°C in 5% CO2 for 1 h) prior to
stimulation with A. actinomycetemcomitans LPS at a final concentration of 1 J.1g/ml during
1.5 h. Macrophages stimulated with 1 J.1g/ml of LPS during 1.5 h were used as a control.
After the incubation period, cell lysates were prepared according to the protocol provided
by Pierce Biotechnology. Briefly, cells were washed twice with ice-cold 50 mM phosphate
buffered saline (pH 7.2) and homogenized at 4°C in a buffer containing 25 mM Tris-Hel
41
(pH 7.6), 150 mM so.dium chlo.ride, 1 % No.nidet P-405, 1 % so.dium deo.xycho.late, and 1 %
o.dium do.decyl sulfate. The buffer also. co.ntained Halt Pro.tease inhibito.r co.cktail and Halt
pho.sphatase inhibito.r co.cktail, bo.th fro.m Pierce Bio.techno.lo.gy and used acco.rding to. the
manufacturer. Cells were bro.ken by so.nicatio.n o.n ice and lysates were centrifuged at
13,000 x g fo.r 10 min at 4°C to. pellet the cell debris. Pro.tein co.ncentratio.ns in the cell
lysate supematant fractio.ns were estimated using the Bradfo.rd assay and adjusted to. 1
mg/ml.
Whole blood collection
Samples of venous blood were collected from the antecubital vein of four human subjects
(two. mo.derate to. severe generalized . chro.nic perio.do.ntitis patients [#1 and #2] and two.
healthy patients [#3 and #4]) using the Vacutainer™ system and sterile endo.to.xin-free blood
co.llectio.n tubes co.ntaining 150 lU o.f so.dium heparin. Info.rmed co.nsent was obtained from
the do.no.rs prio.r to. the experiments. The Université Laval ethics committee ~pproved the
pro.to.co.l. The patients were no.n-smokers with no. systemic diseases that co.uld po.tentially
alter immune functio.ns and ha.d not received any medicatio.n (antibio.tics, anti-inflammato.ry
agents) o.r perio.do.ntal therapy fo.r three mo.nths prio.r to. sampling. The generalized
perio.do.ntitis patients had at least 30% o.f perio.do.ntal sites sho.wing bleeding upon pro.bing
and attachment lo.ss greater than o.r equal to. 4 mm. The perio.do.ntally healthy patients had
clinically healthy gingiva with no. perio.do.ntal po.ckets greater than o.r equal to. 3 mm in
depth. Hemato.lo.gical analyses perfo.rmed at the Centre Ho.spitalier de l'Université Laval
(Quebec City, QC, Canada) revealed that the fo.ur subjects had no.rmal leuko.cyte co.unts.
Who.le blo.o.d samples were diluted 1:3 in RPMI-1640 medium and seeded in 4-ml aliquo.ts
in 6-well plates.
Whole blood. stimulation
Do.xycycline was added to. the who.le blo.o.d samples at final co.ncentratio.ns o.f 0, 1, o.r 10
J.lM. The samples were then incubated at 37°C in 5% CO2 fo.r 2 h prior to. the additio.n o.f P.
gingivalis LPS (1 J.lg/ml). The incubatio.n was co.ntinued at 37°C in a 50/0 CO2 humidified
atmo.sphere with o.ccasio.nal gentle shaking. After 6 h, the samples were centrifuged at 2000
42
x g for 5 min and the supematants were collected and stored at - 20°C until used. Control
blood was incubated in the absence of doxycycline and LPS.
Determination of cytokine production
Commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits were used to quantify IL-
lP, TNP-a, IL-6, and IL-8 in the cell-free supematants according to the manufacturer' s
protocols. The absorbance at 450 nm was read using a microplate reader with the
wavelength correction set at 550 nm. The sensitivities of the commercial ELISA kits were
3.9,15.6,9.3, and 31.2 pg/ml for IL-lp, TNP-a, IL-6, and IL-8, respectively.
Statistical analysis
The differences betweeIi the means ± standard deviations of the macrophage and whole
blood stimulations were analyzed for statistical significance using the Student' st-test and .
were considered significant at P < 0.05.
RESULTS
PMA-differentiated macrophages were treated with doxycycline prior to being stimulated
with A. actinomycetemcomitans LPS in order to investigate the effect of this antibiotic on
pro-inflammatory cytokine secretion. Preliminary assays showed that doxycycline (20 ~M)
had no effect on the basallevel of cytokines secreted. In addition, an MTT assay revealed
no obvious cytotoxic effects following a 24 h treatment of the macrophage-like cells with
50 JlM doxycycline, indicating that any decrease in inflammatory mediator production was
likely not related to cell toxicity (data not shown). Except for IL-8 (6,566 ± 989 pg/ml), the
monocyte-derived macrophages did not secrete detectable basal levels of cytokines. A.
actinomycetemcomitans LPS (1 Jlg/ml) induced the' secretion of large amounts of IL-l p,
TNP-a, IL-6, and IL-8 by PMA-differentiated macrophages (Fig. 1). The LPS-induced IL
lP, TNF-a, and IL-8 responses were significantly (P < 0.05) inhibited by 2: 2 ~M
doxycycline (Figs. lA, lB, and ID). The secretion ofIL-lp, TNF-a, and IL-8 was reduced
by 76%, 33%, and 280/0, respectively, in the presence of 2 JlM doxycycline, while 2: 10 J.lM
43
doxycycline was required to significantly inhibit LPS-induced IL-6 secretion by
macrophage~ like ceUs.
Changes induced by A. actinomycetemcomitans LPS and doxycycline ln the
phosphorylation state of five macrophage intraceUular kinases involved in inflammatory
signaling pathways were characterized by a multiplex ELISA analysis. As shown in table 1,
A. actinomycetemcomitans LPS induced a marked increase in the phosphorylation state of
p38a MAPK (+230%), JNK2 (+107%), and ERK1/2 (+55%). Pre-treatment of
macrophages with 10 JlM doxycycline prior to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation
resulted in a decrease of phosphorylated ERKI/2 (-760/0) and to a lesser extent of p38a
MAPK (-23%).
Whole blood samples from two generalized chronic periodontitis patients and two
periodontally healthy patients were pre-treated for 1 h with 1 or 10 JlM doxycycline prior to
the addition of 1 J.lg/ml of P. gingivalis LPS. Baseline levels of inflammatory mediators
were below threshold detection for aU mediators, with the exception of patients 3 and 4
(healthy patients) where low levels of TNF-u can be detected (Fig. 2B). P. gingivalis LPS
increased the secretion of IL-6 and IL-8 and, to a lesser extent, IL-l ~ and TNF -u in whole
blood from both periodontitis and healthy patients, withsome inter-patient variability and
no relationship with periodontal conditions (Figs. 2A, 2B, 2C, and 2D). A significant
reduction in TNF-a. (65-83%) and " IL-l~ (18-37%) secretion occurred when 1 J.lM
doxycycline was added to the blood samples from patients 2, 3, and 4, while 10 JlM was
required to achieve significant TNP -u and IL-l ~ reduction for the sample from patient 1
(Figs 2A and 2B). The level of IL-6 in aU the blood samples was significantly reduced by a
pre-treatment with 1 and 10 J.lM doxycycline, and ranged from 15-680/0 with 1 JlM
doxycycline (Fig. 2C). Doxycycline had a much weaker effect on IL-8 secretion. Ten JlM
was required to reduce secretion in the blood of patients (Fig. 2D).
44
. DISCUSSION
The immune response to periodontopathogens, which results in a continuous release of
inflammatory mediators by host cells, mediates local tissue destruction in periodontitis. The
high levels of inflammatory mediators -in the periodontal tissues and gingival crevicular
fluid of periodontitis patients have been associated with the etiology of periodontitis.2,3
Therapeutic modalities presenting antibacterial properties and the capacity to modulate the
host immune response are thus of great interest in the management of periodontitis.
Tetracyclines have been reported to exhibit multiple anti-inflammatory properties, including
the inhibition of neutrophil chemotaxis,19 granuloma formation,20 and MMP activity and
activation. 21 In this study, we used macrophage and ex vivo whole blood models to
investigate the capacity of doxycycline to modulate cytokine secretion induced by LPS
from two major periodontopathogens (P. gingivalis and A. actinomycetemcomitans).
Using the macroph~ge model, we tested the ability of doxycycline to inhibit IL-1p, TNF-a,
IL-6, and IL-8 secretion by A. actinomycetemcomitans LPS-stimulated macrophage-like
cells. Given the multifunctional roles of monocytes/macrophages, these immune cells are
likely important in the initiation and maintenance of inflammatory processes and in the
tissue destruction observed in adult periodontitis. Our findings showed that 2 J.lM
doxycycline can strongly inhibit the secretion ofIL-1p, TNP-a, and IL-8, while 10 J.lM was
required for IL-6. Multiplex ELISA analysis revealed that A. actinomycetemcomitans LPS
activates several macrophage intracellular kinases, including of p38a MAPK, JNK2, and
ERK1/2. Doxycycline markedly modulated the phosphorylation state of ERK1/2. Since
several inflammatory processes involve ERK1/2 activation22, inhibition of this signaling
pathway by doxycycline is likely responsible for the decreased , secretion of pro
inflammatory mediators by A. actinomycetemcomitans LPS-stimulated macrophage-like
cells.
Whole blood represents a more realistic physiological environment for investigating the
secretion of inflammatory . mediators in response to LPS stimulatiori since cellular
interactions are preserved in the presence of various plasma proteins such as soluble CD 14,
LPS-binding proteins, hormones, and soluble cytokine receptors. This model more closely
45
recreates the in vivo situation and is therefore highly relevant for studying periodontitis
since gingival crevicular fluid, which bathes the periodontal pocket, is derived from
gingival capillary beds and harbors both resident and emigrating inflammatory cells. It thus
contains high levels of serum-derived proteins such as immunoglobulins and complement
components as well as immune cells such as polymorphonuclear neutrophils,
monocytes/macrophages, and lymphocytes.23 We tested the anti-inflammatory properties of
doxycycline in this model stimulated with P. gingivalis LPS and observed that doxycycline
inhibited the LPS-induced secretion of TNF-a, IL-l p, IL-6 and, to a lesser extent, IL-8,
indicating that the anti- inflammatory property of doxycycline is still possible in the
presence of serum components. Surprisingly, in the case of two patients (#2 and #3), the
inhibition of TNF -a secretion was even better at 1 IJ.M compared to 10 IJ.M. This suggests
that concentrations of doxycycline lower than 1 IJ.M may continue to exert anti
inflammatory acti vi ty.
Interestingly, the anti-inflammatory effects observed in both models were obtained with
therapeutic concentrations of doxycycline. According to Sakellari et al.,24 average
doxycycline concentrations 2 h post-administration of standard oral systemic doses are 2.35
IJ.g/ml (4.7 ~M) in plasma and 1.65 IJ.g/ml (3.3 IJ.M) in gingival crevicular fluid. When used
at subantimicrobial doses to suppress collagenase activity, serum concentration of
doxycycline is approximately 0.79 IJ.g/ml (1.6 ~M).
IL-l P and TNF -u antagonists were reported to significantly reduce the inflammatory
response and bone loss in ligature-induced periodontitis in monkeys,26 suggesting that
inhibiting these cytokines at the site level may be a successful approach for preventing or
decreasing bone resorption in periodontitis. In the present study, we showed that treating
macrophages and whole blood with doxycycline can inhibit LPS-induced IL-1p and TNP-a
secretion and may thus contribute to reduce the impact of cytokine-mediated host
destructive processes in periodontitis. Shapira et al. 27 previously reported that tetracycline
inhibits P. gingivalis LPS-induced TNF-u and IL-1~ secretion in human monocytes in vitro.
However, the concentration of tetracycline used (100 ~M) was much higher than that
normally found in plasma and gingival crevicular fluid.
46
IL-8 is a potent chemokine that directs the migration of polymorphonuclear leukocytes,
monocytes, and macrophages to sites of infection. Higher levels of IL-8 are found in the
gingival crevicular fluid of inflamed periodontal sites than in healthy sites.28-30 Periodontal
therapy reduces the number of immune cell in t1;le infiltrate as well IL-8 levels, pointing to a
correlation between this chemokine and periodontal status. 31 Doxycycline inhibited LPS
induced IL-8 secretion in both the macrophage and ex vivo human whole blood models,
suggesting that it may contribute to reduce the migration of inflammatory cells to diseased
sites.
Other antibiotics also have an effect on the inflammatory response induced by whole
bacteria or LPS. For instance, erythromycin inhibits TNF-a and IL-6 secretion in whole
blood stimulated with heat-killed Streptococcus pneumoniae,32 while the quinolone
antibiotic ciprofloxacin causes an attenuated LPS-induced TNF-a response in whole blood33
and in a murine mode!. 34
In summary, our two models provided strong evidence that sorne of the clinically proven
benefits of doxycycline in the treatment of periodontitis may be related to its ability to
regulate inflammatory mediator release by host cells. Evidences suggested that this anti
inflammatory property of doxycycline may be through modulation of signaling pathways
involved in inflammation.
Acknowledgements
This study was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health Research. AlI
authors report no conflicts of interest related to this study.
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51
A B
2500 1800
:;- 2000 .-' 1600
~ ~ ~ ~gg dl 1500 a 1000 CL ; 1000 l;i 800
~ u:. 600
500 ~ 400 200
a 0 Control LPS LPS LPS LPS LPS Control LPS LPS LPS LPS LPS
+ doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy 2~ SIJM 10IJM 20 IJM 2~ 5 IJM 10~M 20 ~M
C D
1400 250000 1200 _ _ 200000 f 1000
.,. a 800 .. ~ 150000 ,: 600
Q.
~ ;- 100000 ~ 400 ~
200 SOOOO
0 0 Control LPS LPS LPS LPS LPS Control LPS LPS LPS LPS LPS
+ doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy + doxy 2IJM SIJM 10~M 20 ~M 2 1-1'11 S 0M 10~M 20~M
Figure 1. Effect oftreating macrophages with doxycycline (doxy) on the secretion ofIL- l ~
(A), TNF-a (B), IL-6 (C), and IL-8 (D) induced by A. actinomycetemcomitans ATCC
29522 LPS. The data are the means ± standard deviations of triplicate assays for two
independent experiments. *, P < 0.05 compared ta an LPS control with no doxycycline.
ND: not detected.
A
4000
3500
3000
~ 2500
~ 2000 ~
;; 1500
c
1000
600
14000
12000
10000
1 8000
6000 ~
4000
2000
o control CLP S Il LP S + [bxycycl ine 1 !lM
• LP S + [bxycycline 10 !lM
o control
oLP S Il LP S + Ooxycycline 1 ~M
• LP S + Doxycycline 10 ~M
B
5000
5000
î 4000
~ -; 3000 U. ~ 2000
1000
D
30000
25000
~ 20000
:€ ~ 15000
== 10000
5000
52
o con1r ol
El LPS
Il LPS + DO>o/cycline 1 ~M • LPS + DO>o/cycline 10 !lM
o control [!)LP S III LP S + Ooxycycline 1 ~M
• LPS + Doxycycline 10 ~M
Figure 2. Effect of treating human whole blood with doxycycline on the secretion of IL-l ~
(A), TNF-a (B), IL-6 (C), and IL-8 (D) induced by P. gingivalis ATCC 33277 LPS. The
data are the means ± standard deviations of triplicate assays. *, P < 0.05 compared to an
LPS control with no doxycycline. Moderate to severe generalized chronic periodontitis
patients were # 1 and #2, while healthy patients were #3 and #4. ND: not detected.
53
Table 1. Changes induced by A. actinomycetemcomitans LPS and doxycycline ln the
macrophage protein kinase phosphorylation state.
Protein Signal (% change from control)
U nstimulated LPS vs LPS +
Full name Abbreviation Epitope doxycycline vsLPS
Protein-serine kinase B PKBa (Akt1) S473 +7 + 9
alpha
Protein-serine kinase B PKBa(Akt1) T308 - 20 + 10
alpha
Extracellular regulated protein-serine kinase 1/2 ERK1/2 T202/Y204 + 55 - 76 (p42, p44 MAP kinase)
Jun N-terminus protein-serine kinase (stress-activated protein kinase JNK2 T183/Y185 + 107 - 9 2)
Mitogen-activated protein-serine kinase p38
p38a MAPK T180/Y182 + 230 - 23 alpha
Firstly, unstimulated macrophages were used as control and compared to macrophages
stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS (1 I-lg/ml) during 1.5 ·h. Secondly,
macrophages stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS (1 I-lg/ml) during 1.5 h were
used as control and compared to macrophages treated with doxycycline (10 I-lM) during 1 h
prior to stimulation with A. actinomycetemcomitans LPS (1 I-lg/ml) during 1.5 h.
54
Article 2: Publié dans Inflammation, 2009, 32 : 130-137.
Tetracyclines and chemically modified tetracycline-3 (CMT -3)
modulate cytokine secretion by lipopolysaccharide-
stimulated whole blood
Julia Cazalis l, Shin-ichi Tanabe1
, Guy Gagnon1, Timo Sorsa2
, and Daniel Grenier1* Groupe de Recherche en Écologie Buccale, Faculté de Médecine Dentaire, Université
Laval, Quebec City, Quebec, Canada, and Department of Oral and Maxillofacial Diseases,
Helsinki University Central Hospital, and Cell Biology of Oral Diseases, Institute · of
Dentistry, University of Helsinki, Helsinki, Finland
Corresponding author. Mailing address: Groupe de Recherche en Écologie Buccale, Faculté
de Médecine Dentaire, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada, G 1K 7P4
Phone: (418) 656~7341. Fax: (418) 656-2861. E-mail: [email protected]
55
RÉSUMÉ
Introduction: La parodontite est une infection polyrnicrobienne multifactorielle
caractérisée par un processus inflammatoire destructif affectant les tissus de soutien de la
dent. Les tétracyclines constituent une famille d'antibiotiques qui a été abondamment
utilisée en complément, dans le traitement de certaines formes de parodontites. Des
tétracyclines modifiées chimiquement (CMTs), dépourvues de leur activité antibiotique, ont
aussi été développées. Le but de cette étude était d'étudier les effets de la tétracycline, de la
dQxycycline et de la CMT-3 sur la production de médiateurs pro-inflammatoires et de
métalloprotéinases matricielles (MMPs) dans un modèle ex vivo de sang complet stimulé
par le LPS de Porphyromonas gingivalis.
Méthodes : Le sang complet, obtenu à partir de quatre patients atteints de parodontite et de
six suj ets sains, a été stimulé avec le LPS de P. gingivalis en absence et présence de
tétracycline, de doxycycline et de CMT -3. Suite à cette stimulation, la sécrétion
d'interleuki~e-l~ (IL-l~), du facteur de nécrose tumoral alpha (TNF-a); d'interleukine-6
(IL-6), d'interleukine-8 (IL-8), de MMP-8 et de MMP-9 a été quantifiée par ELISA.
Résultats : Le LPS de P. gingivalis a augmenté significativement la sécrétion de tous les
médiateurs inflammatoires et des MMPs testés dans le modèle de sang complet, chez les
patients sains et atteints de parodontites. Bien qu'une variabilité importante inter-patient ait
été observée, la présence de tétracycline, de doxycycline ou de CMT -3 entraînait dans
plusieurs cas une réduction de la sécrétion de cytokines par le sang complet stimulé par le
LPS. Cependant, dans certains cas, la présence d'antibiotiques a eu pour effet d'augmenter
la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. La tétracycline, la doxycycline et la CMT-3
n'ont pas démontré un effet significatif sur la sécrétion des MMP-8 et MMP-9 par les
échantillons de sang complet stimulés par le LPS.
Conclusion: En conclusion, en utilisant un modèle qui prend en considération les
interactions entre cellules immunitaires en présence de protéines plasmatiques, nous avons
montré que la tétracycline, la doxycycline et la CMT -3 peuvent réduire la production de
médiateurs ' pro-inflammatoires à des degrés divers. Cette propriété peut contribuer au
bénéfice observé cliniquement de ces molécules dans la gestion de la parodontite.
56
ABSTRACT
Background: In addition to their bacteriostatic effect, tetracyclines, which are often used in
the treatment of periodontitis, also present anti-inflammatory properties. In the present
study, we investigated the effects of tetracycline (TC), doxycycline (doxy), and chemically
modified tetracycline-3 (CMT-3) on the production of pro-inflammatory mediators and
matrix metalloproteinases (MMPs) in an ex vivo human whole blood (WB) - model
stimulated with Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (LPS).
Methods: WB samples obtained from three periodontitis patients and six healthy subjects
were stimulated with P. gingivalis LPS in the absence and presence of TC, doxy, or CMT-
3. The secretion of interleukin-l f3 (IL-l f3), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), MMP-
8, and MMP-9 by the WB samples was deterrnined using enzyme-linked immunosorbent
assays.
Results: P. gingivalis LPS significantly increased the secretion of aIl cytokines and MMPs
tested. While we observed inter-patient variations, TC, doxy, and CMT -3 caused reductions
of LPS-induced cytokine secretion to various degrees. TC, doxy, and CMT -3 had no
significant effect on MMP-8 and MMP-9 secretion by LPS-stimulated WB samples.
Conclusions: In conclusion, we used a human WB model that takes into consideration
relevant in vivo immune cell interactions in the presence of plasma proteins to show that
TC, doxy, and CMT -3 can reduce the production of pro-inflammatory mediators. This
property may contribute to the clinically proven benefits of these molecules in the treatment
of periodontitis and other chronic inflammatory diseases.
57
INTRODUCTION
Periodontitis is a multifactorial polymicrobial infection characterized by a destructive
inflammatory process affecting tooth-supporting tissues and resulting in periodontal pocket
formation, alveolar bone resorption and, eventually, tooth loss. Periodontopathogens in
subgingival sites induce host cellular and humoral responses [1]. In most cases, these
responses target the elimination or control of periodontopathogens and prevent the
progression of periodontal diseases and related inflammatory processes [2]. However, in
other cases, the continuous challenge of host immune and resident cells by
periodontopathogens and their virulence factors such as lipopolysaccharide (LPS) results in
enhanced and uncontrolled secretion of inflammatory cytokines, including interleukin- l ~
(IL-l ~) , interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and tumor necrosis factor alpha (TNF -u)
as well as of matrix metalloproteinases (MMPs) [1, 3]. These host mediators directly or
indirectlyparticipate to tissue destruction and bone resorption [4, 5]
While a group of approximately ten bacterial species have been associated with chronic
periodontitis, increasing evidence points to Porphyromonas gingivalis as the key pathogen
[6] . P. gingivalis LPS induces the secretion of inflammatory mediators and MMPs by
macrophages and gingival fibroblasts [7-9]. In a recent study, we showed that stimulating
human WB with P. gingivalis LPS causes a strong inflammatory response, with the
production ofpro-inflammatory cytokines and chemokines [10].
Given the infectious nature of periodontal diseases and the limited results of conventional
mechanical therapies for the treatment of aggressive and refractory periodontitis, the use of
antibiotics is warranted [11]. Tetracyclines (TCs) are extensively used as adjuncts in the
treatment of periodontitis [12]. TCs are broad-spectrum antibiotics that bind to ribosomes
and inhibit protein synthesis. A number of studies have shown that TCs also have various
non-antibiotic properties, making them suitable for clinical application [13]. TCs are potent
inhibitors of MMPs (14), which are zinc-dependent endopeptidases that play important
roles in wound healing, metastasis, rheumatoid arthritis, and periodontitis [15]. They also
exert anti-inflammatory activities by inhibiting leukocyte chemotaxis [16] and down
regulating the expression of pro-inflammatory mediators [14]. Chemically modified
58
tetracyclines (CMTs) that lack the antibacterial activity of TCs but that retain their anti
inflammatory properties were first described by Golub et al. [17]. Of the numerous CMTs
that have been developed, CMT -3 is one of the most promising, particularly in terms of
anti-tumor activity [18].
The aun of the present study was to compare the anti-inflammatory properties of
tetracycline, doxycycline, and CMT -3 with regard to the secretion of IL-10, IL-6, IL-8,
MMP-8, and MMP-9 by immune cells stimulated with P. gingivalis LPS. While most
studies investigate anti-inflammatory properties of compounds on individual celllines, we
used an ex vivo human whole blood (WB) model to better simulate the relèvant in vivo
interactions between immune cells, in the presence of plasma proteins, such as found in
diseased periodont.al sites. .
MATERIALS AND METHODS
Antibiotics
Tetracycline hydrochloride (TC) and doxycycline hyclate (doxy) were purchased from
Sigma-Aldrich Canada (Oakville, ON, Canada). CMT-3 (6-demethyl-6-deoxy-4-
dedimethylamino tetracycline, Metastat®) was kindly provided by CollaGenex
Pharmac eutic aIs (Newton, PA, USA). Stock solutions (20 mM) were prepared in
dimethylsulfoxide (DMSO).
Bacteria and LPS preparation
P. gingivalis ATCC 33277 was grown in Todd;..Hewitt broth (BBL Microbiology Systems,
Cockeysville, MD, USA) supplemented with 0.001 % hemin and 0.0001 % vitamin K at
37°C under anaerobic conditions (80% N2, 10% H2, 10% C02) for 24 h. LPS was isolated
using the protocol described by Darveau and Hancock [19], which is based on the digestion
of a whole cell extract by proteinase K and successive solubilization and precipitation steps.
The LPS preparation was freeze-dried and stored at -20oe until used. The amount of
contaminating protein, which was evaluated using a protein assay kit (Bio-Rad
59
Laboratories, Mississauga, ON, Canada) with bovine serum albumin as a control, was less
than 0.001 % (w/w).
Whole blood collection
Samples of venous blood were collected from the antecubital vein of nine human subj ects
(three periodontitis patients and six periodontally healthy patients) using the V acutainer ™
system and sterile endotoxin-free blood collection tubes containing 150 lU of sodium
heparin (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Informed consent was obtained
from all the donors prior to the experiments. The protocol was approved by the ethics
conupittee of Université Laval. The patients were · non-smokers, did not have system ic
diseases that can alter immune functions, and did not receive any medication (antibiotics,
anti-inflammatory agents) or periodontal therapy for three months prior to sampling. The
periodontitis patients had clinically diseased gingiva with at least 30% of periodontal sites
showing attachment losses 2: 4 mm. The periodontally , healthy patients had clinically
healthy gingiva with no periodontal pockets > 3 mm in depth. Hematological analyses of
whole blood samples performed at the Centre Hospitalier de l'Université Laval (Quebec
City, Canada) showed that all the subjects had normalleukocyte counts. The whole blood
(WB) samples were collected, immediately diluted 1:3 in RPMI-1640 medium (HyClone
Laboratories, Logan, UT, USA), and seeded in 4-ml aliquots in 6-well plates.
Stimulation of whole blood samples
TC, doxy, or CMT -3 (0, 1, or 1 ° ~M) was added to the WB samples. The samples were
incubated at 37°C in 5% CO2 for 2 h prior to adding P. gingivalis LPS at a final
concentration of 1 ~g/m1. Preliminary experiments showed that this concentration induced a
marked secretion of inflammatory mediators in the ex vivo WB model (data not shown).
The WB samples were incubated for 6 h at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere with
occasional gentle shaking. The samples were then centrifuged at 2,000 g for 5 min and the
sup~matants were collected and stored at -20°C until used. Control blood was incubated in
the absence of TCs or TC derivatives and LPS.
60
Determination of cytokine and MMP production
Commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA) were used to quantify IL-1 p, IL-6, IL-8, MMP-8, and MMP-9
concentrations in the cell-free supematants according to the manufacturer' s protocols. The
absorbance at 450 nm was read using a microplate reader with the wavelength correction set
at 550 nm. The sensitivities of the commercial ELISA kits were 3.9 pg/ml for IL-1~ , 9.3
pg/ml for IL-6, 31.2 pg/ml for IL-8, 20 pg/ml for MMP-8, and 156 pg/ml for MMP-9.
Statistical analysis
Differences between means were analyzed for statistical significance using the Student' s t-
test at:ld were considered significant at P < 0.01.
RESULTS
Ruman WB samples from SIX periodontally healthy patients and three generalized
periodontitis patients were stimulated for 6 h with P. gingivalis LPS at a final concentration
of 1 ~g/m1. WB supematants were th en analyzed for cytokine (IL-1 p, IL-6, IL-8) and MMP
(-8, -9) production. Table 1 shows that IL-1 p, IL-6, and IL-8 in unstimulated WB samples
were below the sensitivity levels of the ELISA kits. P. gingivalis LPS significantly (P <
0.01) increased the secretion of all cytokines and MMPs. We observed high inter-patient
variations in the amounts of cytokines and MMPs. While the number of patients was low,
no statistical differences in cytokine or MMPs secretion between the two groups of patients
were observed (data not shown).
The anti-inflammatory properties of TC, doxy, and CMT-3 were investigated by adding
them at 1 and 1 0 ~M concentrations to the WB samples 2 h prior to adding P. gingivalis
LPS. As reported in Table 2, IL-1 P secretion was inhibited in a concentration-dependent
manner by TC and doxy in a number of WB samples. More particularly, doxy (1 0 ~M)
caused a significant inhibition of IL-1 ~ secretion in six of the nine WB samples. Inhibition
observed was up to 80%. Similarly, TC (10 JlM) and CMT-3 (10 JlM) significantly
61
decreased 1L-1 P secretion in four and two WB samples, respectively. 1L-6 secretion was
significantly inhibited by TC, doxy, and CMT -3 (10 IlM) in four, five, and five WB
samples, respectively (Table 3). The secretion of IL-8 was significantly inhibited by 10 IlM
doxy in five of ni ne samples tested (Table 4), while 10 IlM TC and 10 IlM CMT-3
significantly inhibited IL-8 secretion in two and four samples, respectively. None of the
antibiotics caused a significant inhibition of MMP-8 and MMP-9 secretion (Tables 5 and
6). For severa1 WB samp1es, a given antibiotic' may decrease significantly the secretion of
specific cytokines whi1e not affecting the secretion of others. For instance, in patient 8,
doxy at 1 and 10 IlM significantly decreased secretion of 1L-1 p, and IL-6 whi1e having no
effect on IL-8.
DISCUSSION
The immune response to periodontopathogens, which results in a continuous release of
inflammatory mediators by host cells, mediates local tissue destruction in periodontitis.
High levels of inflammatory mediators in periodontal tissues and gingival crevicular fluid
have been correlated with periodontitis [3, 4]. In addition, excessive MMP activity is a
hallmark of human periodontal disease, 1eading to the 10ss of gingival collagen, the
degradation of periodontal ligament, and the resorption of alveolar bone [5]. 1t is thus
logical to consider, in addition to antibacterial approaches in the management of chronic
periodontitis, the use of therapeutic modalities that modùlate the host response. TCs and TC
derivatives with no antibiotic activity, CMT -3 in particu1ar, possess interesting anti
inflammatory properties. For instance, they inhibit prostaglandin E2 [20] and nitric oxide
[21] production as well as phospholipase A2 activity [22]. Recently, we reported the
capacity of doxy to inhibit cytokine production in macrophage and ex vivo human whole
blood models (23). In the present study, we used the ex vivo human WB model stimulated
with P. gingivalis LPS to compare TC, doxy, and CMT -3 in their capacity to modû1ate
cytokine and MMP secretion.
62
Individual cell lines stimulated with LPS or other virulence factors from pathogens are
mostly used to test the anti-inflammatory properties of a wide variety of compounds. Since
cellular interactions in WB are preserved in the presence of various plasma proteins
(soluble CD 14, LPS-binding proteins, hormones, soluble cytokine receptors, etc.), WB
more closely simulates the in vivo environment than celllines taken separately. As such, it
is a good model for studying periodontitis since gingival crevicular fluid, which bathes
periodontal pockets, is derived from gingival capillary beds and is home to resident and
emigrating inflammatory and immune cells, in addition to contain various plasma proteins.
P. gingivalis LPS induced the secretion of large amounts of IL-1 p, IL-6, IL-8, MMP-8, and
MMP-9 in the WB model. Large inter-patient variations in the levels of cytokines and
MMPs secreted were observed. The inter-individual variation in host mediator levels may
have been caused by microbial infections or sub-infectious states in patients, resulting in
leukocyte pre-activation or a tolerance effect since there was no significant variation in
leukocyte counts in the WB samples (data not shown). It may also be due, in part, to
cytokine gene polymorphisms [24].
P. gingivalis LPS-induced IL-1 p secretion by the mixed · leukocyte and immune cell
populations in WB may contribute to the progression of periodontitis because of the
capacity of IL-1 p to enhance MMP expression and osteoclast formation and activity [25].
The ability of doxy and, to a lesser extent, TC and CMT-3 to reduce LPS-induced IL-1p
secretion may contribute to diminishing the impact of cytokine-mediated host destructive
processes in periodontitis. For example, Assuma et al. [26] reported that local inhibition of
IL-l p pathway in periodontal tissues can significantly reduce the inflammatory response
and bone loss in ligature-induced periodontitis in monkeys.
IL-6 secretion was also highly up-regulated by P. gingivalis LPS. This is in agreement with
Takahashi et al. [27], who showed that the diseased gingiva of periodontitis patients contain
higher levels of IL-6 than the gingiva of periodontally healthy subjects. IL-6 plays an
important role in bone resorption by regulating osteoclast differentiation [28] and inducing
MMP secretion [29]. The reduced secretion of IL-6 observed when several WB samples
63
were stimulated with LPS in the presence of TC, doxy or CMT -3 indicated these antibiotics
may help prevent periodontal tissue destruction, including alveolar bone resorption.
The secretion of IL-8, which is a potent chemokine that can direct the migration of
polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and macrophages to sites of infection, was
significantly increased in WB samples stimulated with P. gingivalis LPS. The gingival
crevicular fluid of inflamed periodontal sites contains higher levels of IL-8 than that of
healthy sites [30]. Periodontal therapy reduces immune cell numbers and IL-8 levels in
infiltrates, suggesting that there is a correlation between this chemokine and periodontal
status [31 J. TC, doxy, and CMT -3 inhibited P. · gingivalis LPS-induced IL-8 secretion in a
number of WB samples, suggesting that these antibiotics may help reduce the influx of
inflammatory cells to diseased sites.
TCs and TC analogues represent interesting molecules to treat human disorders with high
levels of proteinase activity such as rheumatoid arthritis and chronic periodontitis. Non
antimicrobial TC derivatives, including CMT -3, appear to be more efficient at inhibiting
MMP activity [32]. Hanemaaijer et al. [33] showed that doxy can down-regulate TNF-a
and. phorbol myristic acetate (PMA)-induced MMP-8 mRNA production and protein
expression by cultured human endothelial cells and synovial and gingival fibroblasts. Our
study showed that TC, doxy, and CMT-3 did not inhibit the secretion ofMMP-8 and MMP-
9 in WB samples stimulated with P. gingivalis LPS. It thus suggests that the inhibitory
effects observed on cytokine secretion are specific rather than associated with an overall
decreased of protein synthesis. However, our analysis did not allow to determine if activity
of secreted MMPs are inhibited by antibiotics. One should not exclude that higher
concentrations may be effective in inhibiting the secretion ofMMPs.
TC and doxy exerted their anti-inflammatory effects in the WB samples at therapeutic
concentrations. Sakellari et al. [34] measured the concentrations of doxy and TC in the
plasma and gingival crevicular fluid of patients 2 h after inj ecting the antibiotics. They
reported that the average concentrations of TC and doxy were 2.35 Jlg/ml (4.7 JlM) and
1.02 Jlg/ml (2.1 JlM), respectively, in the plasma, and 1.65 Jlglml (3.3 JlM) and 0.61 Jlg/ml
64
(1.3 JlM), respectively, in the gingival crevicular fluid. Thomas et al. [35] reported that a
plasma concentration of 0.79 Jlg/ml (1.7 JlM) of TC and doxy were required to suppress
collagenase activity.
The WB model used in the present study is much too complex to clearly identify the
transcriptional and post-transcriptional molecular mechanisms involved in the anti
inflammatory effect of the antibiotics we tested. However, the suppression of cytokine
secretion in the WB model may involve the down-regulation and activation of key kinases.
In a recent study, we reported that doxy markedly modulated the phosphorylation state of
ERK1/2 in LPS-stimulated monocyte-derived macrophages [23J.
In conclusion, we used an ex vivo human WB model to providé evidence that part of the
clinically proven benefits of TCs and CMT -3 may be related to their ability to regulate
inflammatory mediator secretion by immune cells.
Acknowledgements
This work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research. We
would like to thank Charles Bodet for his technical assistance and invaluable editorial input.
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Table 1. Secretion, of IL-1 p, IL-6, IL-8, MMP-8, and MMP-9 by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient Amounts secreted (condition)
--- IL-1 P (pg/ml) IL-6 (pg/ml) IL-8 (pg/ml) MMP-8 (ng/ml)
Control + LPS Control + LPS Control + LPS Control + LPS 12,666 ± 7,266 ±
1 (healthy) =::; 3.9 168 ± 12 =::; 9.3 548 =::; 31.2 365 3 ± 1 20 ± 1
7,160 ± 1,599 ± 2 (healthy) =::; 3.9 938 ± 43 =::; 9.3 324 =::; 31.2 603 4±1 18 ± 1
11,755 ± 11,553 ± 3 (healthy) =::; 3.9 322 ± 21 =::; 9.3 558 =::; 31.2 566 2±1 12 ± 3
7,649 ± 18,221 ± 4 (healthy) =::; 3.9 499 ± 20 =::; 9.3 355 =::; 31.2 392 8±2 14 ± 2
7,531 ± 5,042 ± 5 (healthy) =::; 3.9 1,830 ± 38 =::; 9.3 516 =::; 31 .2 372 9±4 22 ± 3
12,187 ± 9,994 ± 6 (healthy) :5 3.9 3,009 ± 37 :5 9.3 933 =::; 31.2 840 5 ± 1 88 ± 32
3,338 ± 7,603 ± 17,380 ± 7 (periodontitis) :5 3.9 191 =::; 9.3 222 =::; 31.2 523 4±1 38 ± 3
8,979 ± 24,480 ± 8 (periodontitis) :5 3.9 300 ± 5 =::; 9.3 187 :5 31.2 1,425 4±1 45 ± 5
22,370 ± 2,662 ± 9 (periodontitis) :5 3.9 2,372 ± 98 =::; 9.3 45 =::; 31.2 202 5±2 34 ± 13
MMP-9 (ng/ml)
Control + LPS
11 ± 3 172 ± 5
64 ± 5 324 ± 92
13 ± 3 281 ± 30
218±101 268 ± 81
17 ± 2 255 ± 57
51 ± 15 258 ± 14
38 ± 6 410±13
47 ± 8 692 ± 63
51 ± 22 340 ± 12
-..l o
Table 2. Effect of TC, doxy, and CMT -3 on IL-1 ~ secretion by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient (condition) Relative IL-1 ê secretion 1
TC Doxï
1 ~M 10 ~M 1 ~M 10 ~M
1 (healthy) 76.20/0 56.5%) 2 63.1 % 2 28.6%) 2
2 (healthy) 92.1 % 83.5% 86.9% 59.7% 2
3 (healthy) 92.8% 101.5% 101.8% 78.3%
4 (healthy) 46.9%) 2 25.20/0 2 10.0% 2 20.2%) 2
5 (healthy) 89.4% 81.4% 81.6% 65.60/0 2
. 6 (healthy) 101.9%) 100.2%) 107.4% 99.5%
7 (periodontitis) 92.1 % 64.60/0 2 100.10/0 72.1%) 2
8 (periodontitis) 98.3% 67.0% 2 70.00/0 2 49.60/0 2
9 (periodontitis) 101 .2% 1 09.2% 1 09.1 % 87.4%
~ A value of 100% was assign~d to theamount of IL-1p secreted in the absence of TC, doxy or CMT-3. 2 Significantly lower compared to the control (no antibiotic) (p < 0.01).
CMT-3
1 ~M
64.30/0 2
84.3%
79.5%
530/0 2
96%
91.9%
100%
92.3%
114.0%
10 ~M
94.6%
1 06.9%
95.6%
23.60/0 2
82.1 %
85.3%
74.90/0 2
92%
100.50/0
-..l
Table 3. Effect of TC, doxy, and CMT-3 on IL-6 secretion by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient (condition) Relative IL-6 secretion 1
TC Doxï 1 ~M 10 ~M 1 ~M 10 ~M
1 (healthy) 93.4% 79.5%) 84.60/0 64.8%) 2
2 (healthy) 89.4%) 720/0 2 70.3%) 2 81%
3 (healthy) 97.7% 81.4%) 110.2% 85.9%
4 (healthy) . 109% 99.2% 94.1 % 74 .20/0 2
5 (healthy) 99.5% 51 .. 60/0 2 58.70/0 2 50.9% 2
6 (healthy) 42.1 % 2 49.90/0 2 50.90/0 2 80.2%
7 (periodontitis) 75.60/0 79.60/0 80.2% 68.2% 2
8 (periodontitis) 64.1 % 2 50.90/0 2 31.60/0 2 47".90/0 2
9 (periodontitis) 93.2% 101.20/0 96.4% . 96.7%
1 A value of 100% was assigned to the amount of IL-6 secreted in the absence of TC, doxy or CMT-3. 2 Significantly lower compared to the control (noantibiotic) (p < 0.01).
CMT-3
1 ~M
98.1 %
28.5%) 2
1 04.9%
80.6%
56.70/0 2
60.1% 2
72.30/0 2
15.70/0 2
84.1 %
10 ~M
830/0
84.5%)
76.80/0 2
84.3%
40.50/0 2
49.90/0 2
40.90/0 2
51 .20/0 2
95.9%
-......l l'V
1
Table 4. Effect of TC, doxy, and CMT-3 on IL-8 secretion by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient (condition) Relative IL-8 secretion 1
TC Doxï
1 ~M 10 ~M 1 ~M 10 ~M
1 (healthy) 87.70/0 76.8% 92% 75.80/0 2
2 (healthy) 101.4% 94.3% 85.7% 87.70/0
3 (healthy) 98.80/0 82.90/0 70.3%> 2 550/0 2
4 (healthy) 76.8% 64.50/0 2 60.40/0 2 57.60/0 2
5 (healthy) 97.4% 94.4% 106.9% 72.80/0 2
6 (healthy) 82.9% 74.20/0 2 95.6% 85 ~ 7%
7 (periodontitis) 105.5% 86.2% 1 00.5% 87.6%
8 (periodontitis) 95.4% 82.8% 100.20/0 86.1 %
9 (periodontitis) 97.5% 86.1 % 90.3% 600/0 2
1 A value of 100% was assigned to the amount of IL-8 secreted in the absence of TC, doxy or CMT-3. 2 Significantly lower compared to the control (no antibiotic) (p < 0.01).
CMT-3
1 ~M
100.3%
1 00.5%
69.80/0 2
76.30/0 2
100.30/0
1 01.2%
83.2%
104.2%
64.80/0 2
10 ~M
111.6%
86.6%
53.70/0 2
80.70/0 2
82.30/0 2
71.80/0 2
124.8%
88.70/0
80.3%
-.l w
Table 5. Effect of TC, doxy, and CMT-3 on MMP-8 secretion by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient (condition) Relative MMP-8 secretion 1
TC Doxï CMT-3
1 ~M 10 ~M 1 ~M 10 ~M 1 ~M
1 (healthy) 102.8% 105.7%) 1 07.8°(0 86.9% 1 09.3%
2 (healthy) 86.7% 89.3% 89.1 % 85.7% 97.70/0
3 (healthy) 89.1%) 87.4% 93.3% 91 .2% 92.6%
4 (healthy) 110.2% 1 03.2% 92.6% .106.4% 111 .9%
5 (healthy) 109.5%> 88.8% 102.4%> 93.4% 106.1%
6 (healthy) 92.3% 102.3%> 89.3% 92.5% 95.6%
7 (periodontitis) 91.7% 88.6°/0 105.9°/0 101.70/0 102.9°/0
8 (periodontitis) 109.8% 1 03.5% 112.8°/0 99.1 % 97.20/0
9 (periodontitis) 112.7% 101.1% 104.70/0 97.5% 106.5°/0
1 A value of 100% was assigned to the amount of MMP-9 secreted in the absence of TC, doxy or CMT -3.
10 ~M
112.4%
105.2%
87.9%
1 04.5%
110.3%
84.70/0
91 .8°/0
88.1 °/0
98 .8°/0
........:) ~
Table 6. Effect of TC, doxy, and CMT -3 on MMP-9 secretion by whole blood stimulated with P. gingivalis LPS.
Patient (condition) Relative MMP-9 secretion 1
TC Doxï CMT-3
1 ~M 10 I:!M 1 ~M 10 ~M 11:!M
1 (healthy) 94.5% 87.7% 108.7% 95.6% 103.50/0
2 (healthy) 102.2% 101.7% 102.20/0 89.7% 93.4%
3 (healthy) 101.6% 88.40/0 90.3% 91.6%> 99.8%
4 (healthy) 89.8%> 97.7% 97.3% 99.6%) 93.60/0
5 (healthy) 98.6% 86.7% 89.9% 94.4% 102.9%
6 (healthy) 89.9% 93.10/0 95.7% 105.2% 1 05.4%
7 (periodontitis) 102.3% 95.90/0 100.9°/0 89.3%) 96.5°/0
8 (periodontitis) 91 .6% 87.6%> 104.2% 88.6%> 91.8%
9 (periodontitis) 96.6% 86.9% 92.3%> 96.6%> 104.6%>
1 A value of 100% was assigned to the amount of MMP-9 secreted in the absence of TC, doxy or CMT -3.
10 ~M
93.8%
85.60/0
93.1 %
100.7%
105.90/0
94.5%
103.3°/0
86.6%
98.4%
-.l VI
Article 3: Soumis à Journal of Periodontal Research.
Comparative inflammatory response of healthy and
periodontitis subjects using an ex vivo whole blood model
stimulated with Porphyromonas gingivalis
Julia Cazalis, Guy Gagnon, and Daniel Grenier.
76
Groupe de Recherche en Écologie Buccale, Faculté de Médecine Dentaire, Université
Laval,
Quebec City, Quebec, Canada
Correspondence: Dr. Daniel Grenier, Groupe de Recherche en Écologie Buccale, Faculté de
Médecine Dentaire, Université Laval, 2420 de la Terrasse, Quebec City, Quebec, Canada,
G1V OA6. Tel: (418) 656-7341. Fax: , (418) 656-2861. E-mail:
Daniel. [email protected]
77
RÉSUMÉ
Introduction: La parodontite implique une r"elation complexe entre des bactéries
parodontopathogènes et la réponse immunitaire de l'hôte, et est caractérisée par un
processus inflammatoire destructif affectant les tissus de soutien de la dent. Le but de cette
étude était de comparer la réponse inflammatoire de patients atteints de parodontite et de
sujets parodontalement sains à partir d'un modèle ex vivo de sang complet, stimulé par
Porphyromonas gingivalis.
Méthodes : Le sang complet, obtenu de 17 patients atteints de parodontite chronique et de
6 sujets parodontalementsains, a été stimulé avec des cellules de P. gingivalis (I07/ml).
Suite à cette stimulation (6 h), les sécrétions de cytokines et de MMPs ont été quantifiées en
utilisant une technique ELISA.
Résultats: Chez les patients saIns et malades, P. gingivalis a induit la sécrétion des
cytokines IL-IJ3, IL-6, TNF-a et IL-Ira ainsi que des chémokines IL-8, RANTES, MCP- l
et IP-IO. Les niveaux de MMP-8 et MMP-9 sécrétés par le sang complet ont également
augmentés, suite à la stimulation avec P. gingivalis. Une analyse de covariance a montré
qu'il n'y avait pas de différence significative dans les quantités sécrétées entre les patients
atteints de parodontite chronique et les sujets parodontalement sains. Cependant, les taux
d'induction (non-stimulé versus stimulé) de MMPs et de cytokines, suite à la stimulation
par P. gingivalis, tend à être plus importante chez le groupe porteur d'une parodontite,
comparativement au groupe sain.
Conclusion: Cette étude suggère que P. gingiva lis , en induisant de hauts nIveaux de
médiateurs inflammatoires et de MMPs, peut contribuer à la progression de la parodontite.
Des études additionnelles sont nécessaires pour supporter la tendance observée entre les
sujets sains et atteints parodontalement, concernant les taux d'induction de certaines
cytokines, après stimulation par P. gingivalis. -
78
ABSTRACT
Background: Periodontitis is a complex interplay between periodontopathogens and the
host immune response, and is characterized by a destructive inflammatory process affecting
the tooth supporting tissues. The aim of this study was to compare the inflarnrnatory
response of periodontitis patients and periodontally healthy subj ects using an ex vivo whole
blood model stimulated with Porphyromonas gingivalis.
Methods: Whole blood, collected from 17 periodontitis patients and 6 healthy subjects, was
stimulated for 6 hours with P. gingivalis cells. Following stimulation, the secretion of
cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs) was quantified using sandwich enzyrne
linked irnrnunosorbent assays combined with piezoelectric printing technology.
Results: In healthy and periodontitis subjects, P. gingivalis induced the secretion of the
cytokines IL-l~, IL-6, TNF-a and IL-Ira, as well as the chemokines IL-8, RANTES, Mep-
1, and IP-lO. The levels of MMP-8 and MMP-9 secreted by whole blood were also
increased following stimulation with P. gingivalis. No significant differences (p ::s 0.05)
were observed between periodontitis patients and periodontally healthy subj ects in the
amounts of P. gingivalis-induced host molecules secreted. However, the induction of
secreted cytokines and MMPs following stimulation with P. gingivalis tended to be higher
in the periodontitis group compared to those observed in the healthy subject group.
Conclusion: This study suggests that P. gingivalis, by inducing high levels of inflarnrnatory
mediators and MMPs from a mixed leukocyte population, can cQntribute to the progression
of periodontitis. Additional studies are required to support the tendency observed between
periodontitis and healthy subj ects in regard to the fold inductions of certain inflammatory
mediators following P. gingivalis stimulation.
79
INTRODUCTION
Periodontitis is initiated by an overgrowth of specific bacteria, called periodontopathogens,
colonizing the subgingival sites. It is characterized by a significant breakdown of the
supporting tissues surrounding the teeth, including the alveolar bone and the periodontal
ligament, and may result in tooth loss. Although a group of about ten bacterial species have
been associated with chronic periodontitis (1), strong evidence points to Porphyromonas
gingivalis as a key pathogen (2). When P. gingivalis and other periodontopathogens, reach a
critical concentration in subgingival sites, they induce host cellular and humoral responses.
In most cases, these responses result in the elimination or control of the periodontopathogens
and thus prevent the establishment and progression of periodontal diseases (3). However, in
other cases, the continuous aggression to the host immune system by periodontopathogens or
their end-products, such as the lipopolysaccharides, leads to the accumulation of cytokines
and matrix metalloproteinases (MMPs), which mediate soft tissue and bone destructive
processes (4-7).
The number of leukocytes migrating toward the gingival sulcus and periodontal pockets
increases during the progression of inflammation (8). While most neutrophils recruited into
the gingival tissues are able to invade the sulcus, the maj ority of the mononuclear cells,
including monocytes/macrophages, T lymphocytes, andB cells persist in the connective
tissue and forrn the local cell infiltrate (6). Hyperfunctional immune cells may be deleterious
for the host by secreting exaggerated amounts of inflammatory mediators. Kornrnan et al. (9)
reported that a specific genotype in the interleukin-1 (IL-1) gene cluster, which includes a
locus associated with a 2-4 fold increase in IL-1 production, correlates with severe
periodontitis. In addition, it has been reported that polymorphonuclear neutrophils from
patients with periodontitis, more particularly refractory and rapidly progressive periodontitis,
respond more intensively to stimulation, in terrns of production of oxygen radicals (10, Il).
In this study, we used an ex vivo whole blood model, ,which takes into consideration the
interactions that may occur between the different immune . cell types encountered in
periodontally diseased sites, to test the hypotheses that P. gingivalis is capable to induce a
strong immune inflammatory response and that the intensity of this response is different in
80
periodontitis and healthy subjects. More specifically, whole blood obtained from generalized
periodontitis patients and healthy subjects were stimulated with P. gingivalis cells and the
secretion of cytokines, chemokines and MMPs was monitored.
MATERIALS AND METHODS
Bacteria
P. gingivalis ATCC 33277 was grown in Todd-Hewitt broth (BBL Microbiology Systems,
Cockeysville, MD) supplemented with 0.001 % hemin and 0.0001 % vitamin K at 37°C
under anaerobic conditions (80% N2, 10% H2, 10% CO2) for 24 h. The cells were harvested
by centrifugation at Il 000 g for 10 min and suspended in RPMI-1640 medium (HyClone
Laboratories, Logan, UT) to a concentration of 1 x 109 bacteria/ml, as determined using a
Petroff-Hausser counting chamber.
Whole blood collection
Samples ofvenous blood were collected from the antecubital vein of,23 human subjects (17
generalized periodontitis patients and 6 periodontally healthy subj ects) using the
Vacutainer™ system and sterile endotoxin-free blood collection tubes containing 150 lU of
sodium heparin (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Written informed consent was
signed from aIl donors prior to the experiments. The protocol was approved by the ethics
committee of the Université Laval (#2006-078R-2). The patients were non-smokers, did not
present systemic diseases that could potentially alter immune functions" and did not receive
any medication (antibiotics, anti -inflammatory agents) or periodontal therapy for six
months prior to sampling. At the initial examination, the generalized periodontitis patients
presented at least 30% of periodontal sites showing attachment 10ss ~ 5 mm and bleeding
upon probing. The periodontally healthy subj ects presented with no attachment 10ss and no
periodontal pockets greater than 3 mm in depth and absence of bleeding upon probing.
Hematological analyses of whole blood samples performed at the Centre Hospitalier de
l'Université Laval showed that all the subjects had normal1eukocyte counts.
81
Whole blood stimulation
The conditions for stimulation of whole blood were established in a previous study (12) .
Briefly, whole blood samples were diluted 1:3 with RPMI-1640 medium and divided irito
6-ml aliquots in 6-well plates. The cell suspension of P. gingivalis was added to the diluted
whole blood samples to obtain a final concentration of 107 bacteria per ml. The infected
whole blood samples were incubated at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere with
occasional gentle shaking. After 6 h, the samples were centrifuged at 2 000 g for 5 min. The
supematants were collected, further centrifuged at Il 000 g for 10 min to eliminatebacteria,
and stored at -30°C until used. Control blood was incubated in the absence ofbacteria.
ELISA analysis
Culture supematants were shipped on dry ice to SearchLight Protein Array Service (Pierce
Biotechnology, Wobum, MA) to assay the concentrations of IL-1~, IL-6, TNP-a, IL-Ira,
IL-8, RANTES, MCP-1, IP-10, MMP-8, and MMP-9 using sandwich enzyme-linked
immunosorbent assays (ELISA) combined with piezoelectric printing technology. This
procedure uses microplate wells pre-.spotted with highly specific capture antibodies. After
the incubation, unbound pro teins are removed by rinsing, and biotinylated detection
antibodies are added. Excess detection antibodies are removed by rinsing, and streptavidin
horseradish peroxidase and chemiluminescent substrate are added. The enzyme':'substrate
reaction produces a luminescent signal that is detected with the SearchLight Plus CCD
Imaging System. The signal level in the sample spots is proportional to the amount of each
specific protein in the standard and is measured by imaging the plate with a cooled CCD
camera. Target protein concentrations in the samples are quantified by comparing the
intensity of the spots to the corresponding standard curve using Array Vision version 8.0
software (Imaging Research). The protein concentrations were measured in duplicate at
three dilutions, and the mean values of the best measurements were calculated.
Statistical analysis
An analysis of covariance with the ANCOV A model was used to evaluate differences in
means of host molecules secreted by P. gingivalis-stimulated whole blood between
82
periodontally group and healthy group. Results were considered significant at p values <
0.05.
RESULTS
Ruman whole blood from 17 generalized periodontitis patients and 6 periodontally healthy
subj ects were stimulated for 6 hours with P. gingivahs at a final concentration of 107
bacteria per ml. The whole blood supematants were then analysed for the secretion of
cytokines (IL-l~, IL-6, TNP-a, IL-Ira), chemokines (IL-8, RANTES, MCP-l , IP-lO), and
MMPs (-8, -9). Table l shows that low levels of IL-I~, IL-6, TNF-a and IL-Ira were
present in non-stimulated whole blood from both healthy and diseased subjects. However,
stimulation of whole blood with P. gingivahs increased significantly the secretion of all
four cytokines. IL-6 was the pro-inflammatory cytokine produced in largest amounts by the
healthy subjects group (14 272 ± 10 660 pg/ml) and the periodontitis patients group (18 368
± 8 997 pg/ml).
The secretion of chemokines by whole blood is reported in Table 2. In non-stimulated
whole blood samples, low levels of IL-8 and IP-l 0 were detected, whereas more important
levels of MCP-l and RANTES were found. Stimulation of whole blood with P. gingivalis
increased markedly the secretion of IL-8 and MCP-l, and to a lesser extent of IP-lO. The
secretion of RANTES by P. gingivahs-stimulated whole blood was reduced compared to
non-stimulated controis in both groups. Lastly, the secretion of MMP-8 and -9 by P.
gingivahs-stimulated whole blood samples was tested. In most subj ects, P. gingivalis
induced the secretion ofMMP-9 and to a lesser extent ofMMP-8 (Table 3).
On average, the cytokine and MMP profiles in the group of patients suffering from
generalized periodontitis were comparable to the ones of healthy subjects. A very high
variability in the amounts of cytokines secreted was observed between patients from both
groups. No statistical differences (p ::; 0.05) were found in the concentration of all host
molecules tested between periodontitis group and periodontally healthy group (Table 4).
Rowever, when the induction leveis of cytokine and MMP secretion were calculated after
83
infection of whole blood with P. gingivalis, a tendency for higher values was observed in
the periodontitis patient group as compared to the healthy subject group (Table 5). The most
pronounced differences · between the periodontitis group and the healthy group were
obtained with MMP-8 (19.7- vs 2.3-fold induction, respectively; p = 0.076) and MMP-9 (9-
'vs 1.8-fold induction, respectively; p = 0.038).
DISCUSSION
Whole blood represents an interesting model to characterize the overall inflammatory
response of mixed leukocyte populations to bacterial stimulation. The advantage of the ex
vivo whole blood model is that it contains a variety of immune cell populations that are
likely ,to come in contact with periodontopathogens during periodontitis. In addition, it
takes into consideration the complex cell/cell interactions that occur in vivo and reduces the
confounding factors that may be associated with cell isolation procedures such as activation
of isolated cells and contamination with lipopolysaccharides. The whole blood model is
highly relevant for studying periodontitis since the gingival crevicular fluid, which bathes
the periodontal pocket, is derived from gingival capillary beds and contains resident and
emigrating inflammatory cells. In this study, we tested the hypothesis that whole blood
from generalized periodontitis patients and healthy subj ects may respond differently in
terms of cytokine and MMP secretion following stimulation with P. gingivalis.
In this study, cells of P. gingivalis were used to stimulate whole blood collected from
generalized peri·odontitis patients and periodontally healthy subjects. This Gram negative
anaerobic bacterium is closely associated with several forms of periodontal diseases,
including chronic periodontitis and generalized aggressive periodontitis (2, 13). P.
gingivalis showed a strong capacity to induce IL-6 and to a lesser extent IL-1 p and TNP-u
secretion by the mixed leukocyte populations in whole blood, suggesting that it can activate
various periodontal tissue destruction pathways mediated by these pro-inflammatory
cytokines. IL-6 plays an important role in regulating the immune response to periodontal
pathogens and is notably responsible for the differentiation of osteoclasts and activated B
cells into immunoglobulin-secreting plasma cells (7). In addition, IL-6 participates in the
84
recruitment of leukocytes to sites presenting inflammation by increasing the local
production of chemokines such as MCP-l and IL-8 (14). This was supported by our data,
which showed that IL-6 levels were positively correlated with MCP-l and IL-8 levels. IL
lp and TNF-a are determinant cytokines in the progression of periodontitis (15). This is
supported by the fact that local inhibition of these two mediators in periodontal tissues
significantly reduces the inflammatory response and bone loss in ligature-induced
periodontitis in monkeys (16).
Increased levels of IL-Ira were detected in whole blood stimulated with P. gingivalis ceUs.
IL-Ira is an agoni st molecule that binds to IL-I receptors, blocking IL-I and preventing
signal transduction (17). Therefore, IL-Ira may play an important role in regulating the . .
local effect of IL-l in inflammatory periodontal disease. Except for RANTES, the secretion
of chemokines (IL-8, MCP-l and IP-lO) was increased following stimulation of whole
blood with P. gingivalis. Selective chemokine-mediated recruitment of different ceU types
to the gingival tissue is potentiaUy involved in the immunopathogenesis ofperiodontitis. IL-
8, MCP-l, and IP- lO are chemokines found in diseased periodontal tissues (18, 19). IL-8 is
involved in the recruitment of neutrophils, eosinophils, monocytes, and TH I ceUs to
infected sites (20). MCP-l is a potent chemoattractant for monocytes and macrophages (21)
whereas IP-lO attracts monocytes and activated T lymphocytes to inflammatory foci (22).
P. gingivalis ~ay thus trigger a dense infiltration of various inflammatory ceUs in
periodontal tissue through the induction of these chemokines, which in turn may induce a
strong inflammatory reaction at local sites, resulting in the destruction of tissue and alveolar
bone.
The excessive secretion of host cell-derived MMPs is clearly linked to the pathological
tissue destruction observed in periodontitis (4). Stimulating whole blood with P. gingivalis
induced the secretion of important amounts of MMP-8 and MMP-9. The major MMPs
expressed in the periodontitis-affected gingiva, gingival crevicular fluid, and oral fluids are
MMP-8 and MMP-9 (23). MMP-8 has the specific ability to break down type l and type III
coUagens, a critical event in the process of periodontal tissue destruction. Salivary MMP-8
levels were reported to be significantly higher in adults with periodontitis than in healthy
85
adults and those with gingivitis (23). In addition, there is a strong relationship between
MMP-8 levels and probing depth, clinicalloss of attachment, and bleeding on probing (24).
MMP-9 is a gelatinolytic enzyme degrading several extracellular matrix proteins, including
basement membrane (type IV) collagen. High levels of active MMP-9 in gingival crevicular
fluid have been associated with periodontal tissue destruction (24). In addition, serum
MMP-9 levels correlated positively with P. gingivalis IgG antibody levels (25).
A high inter-individual variability in the levels of cytokines secreted by P. gingivalis-
stimulated whole blood samples was observed. This could be related, at least in part, to
cytokine gene polymorphisms (26, 27) or be the consequence of a more or less recent
microbial challenge or sub-infectious state in certain subj ects, resulting in leukocyte pre
activation. On the one hand, no significant (p ~ 0.05) differences in the amounts of
cytokines and MMPs secreted by whole blood (non-stimulated and P. gingivalis-stimulated)
could be observed between the generalized ' chronic periodontitis patient group and the
healthy subj ect group. This observation is in agreement with a previous study by
Mahanonda et al. (28) who showed no significant differences in IL-l P and prostaglandin E2
secretion between aggressive periodontitis patients and non-periodontitis subjects in whole
blood stimulated with lipopolysaccharide purified from P. gingivalis. On the other hand, the
fold inductions (non-stimulated vs P. gingivalis-stimulated) in cytokines and MMPs '
secreted tended to be higher in the periodontitis group compared to those observed in the
healthy subject group. The most pronounced differences were obtained with MMP-8 and
MMP-9.
In summary, our study showed that cells of P. gingivalis induce the secretion of elevated
levels of inflammatory mediators (except RANTES) and MMPs by whole blood containing
immune cells and plasma proteins found in diseased periodontal pockets. This phenomenon
may contribute to periodontitis and other chronic systemic inflammatory conditions.
Immune cells present in whole blood fromgeneralized periodontitis patients and healthy
subjects ' did not produce significantIy different levels of host molecules once stimulated
with cells of P. gingivalis. Additional studies are required to support the tendency observed
86
between periodontitis and healthy subjects in regard to the fold inductions of certain
inflammatory mediators following P. gingivalis stimulation.
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Pati.en. llr 1 ~ CRglnù) Ilr6 (pg/nù) lNF-CJr,JJglnù) Ilrlra Control +P.g Control +p. g Control + P. g Control + e.~g
Healthy 4 3±1 589 ±''l7 28 ±3 1OO9±9B 121 ± 15 433 ± 13 357 ± 12 811 ± 14 6 52 677 ± 100 10 ± 1 7812 ±jJ5 49 ±4 1 5S0 ± 85 608± 5 5670 ± 182 7 52 136L9 ± 435 52 24878 ±4115 8±4 458± 25 205 ± 15 729 ± 38 9 52 1 415 ± 145 5±2 8747 ±825 24 ± 1 1 356 ± 75 363± 4 3274 ±499 10 52 1442±170 13 ± 1 14513 ± 375 44±4 2316 ± 230 170± 7 5482 ±32 12 11 ± 1 980± 15 76 ±7 28676 ±865 213± 8 4936 ± JU 164 ± 20 1 280 ± 49
:Mean.::I: sn 4::1:3 J.I22::1:5159 22 ::1:27 14272 :i: 10 660 76 :i:77 1848::1: 1672 JII::I: 170 2874::1: 2 288
Pemdorditis 1 52 1 834 ± 325 19 ± 1 20378 ± 4845 66 ±4 3877 ±137S 342 ± dS 2358 ± 148 2 52 2347±9O 17 ±3 20240 ±I15 74 ±6 4351 ± 290 328 ± 12 8073 ±003 3 52 536 ± ID 4±1 203œ ±2 000 32 ±5 . 1821±75 340 ± 11 8929 ±248 5 52 2444 ± 00 19 ± 1 25304 ±725 90 ± 12 3204 ± 85 433 ± 10 3256 ± 194 8 52 14550 ± 450 52 31165 ± 545 12 ± 1 584 ± 29 762 ± 195 1 454 ± 450 11 52 2969 ±540 5 ± 1 25990 ±15O 27 ±7 4731 ± 340 112 ± 15 4071 ± 193 13 3 ± 1 1 393 ± 185 32 ±2 24549 ±1 965 38 ±2 4247 ±630 216 ± 41 3733 ± 511 14 52 1145 ± 310 9.8 ±3 7271 ± 1975 42±2 1 532 ± jJ 200 ± 22 3 152 ± 194 15 52 3œ6 ±480 13 ± 1 18 8dS ± 3425 105 ± 10 4836 ± 1 710 276 ± 00 4254 ±623 16 52 6000 ± 1910 9 ± 1 33774 ±I140 73 ± Il 113tIJ ± 2945 168 ± 65 1 380 ± 164 17 52 718 ±56 7 ± 1 20 927±l 315 40 ±2 2631 ± 160 196 ± 10 2861 ±81 18 3 ± 1 1 026 ± 90 30 ±2 11219 ±79O 568 ± 32 3509 ± 530 162± 3 7132 ±27~ 19 52 1 056 ± 105 9±1 11296 ± 375 48 ±9 1 534 ± 00 145 ± 6 5 ~2 ± 1851 20 52 636± 15 6 ± 1 6575 ±325 38 ±2 1 423 ±147 226± 6 3635 ±471 21 52 1072± 74 16 ± 1 23706 ±455 67± 13 2332 ±213 148 ± Il 1 184 ± 158 22 4 ± 1 646 ± aJ 24 ±4 4403 ± 190 157± 22 874 ± 171 52 ± 16 5473 ±t91 23 52 1021 ± 15 17 ± 1 6334 ± 109 82 ±2 1 192 ± 104 263± 4 5731 ± 13~
r.1e an. ::1: sn 2::1:1 2~9 ::1:3391 14::1:9 18363::1: 8997 92::1: 127 3182::1: 2 531 257::1: 161 4279::1: 2 341
\0 o
J.~v'y Comparativeresponse of P. gingivahs (P. g)-sbmulatedwhole bloodfrom healthy and periodontitis patients for secretion of the ~~~ .. ~, IL-8~ RANTES~ MCP~l and IP-10.
Patien" IJ;8 CDg/nil) RANfES (pglnù) MCP-I ~glnù) IP-IO (pgInù) Control +P. g Control +P. g Control +P.g Control +P. g
Healthy 4 32 ±8 705± JJ 13027 ± 1140 8491 ±220 474 ± 3J 1 .598 ± 109 97 ±4 136 ± 18 6 52 ±3 1775 ±BJ 18891 ± 1 185 3627 ± 625 811± 92 2215 ± 65 61 ±2 591 ± 3§ 7 s2 46.579 ± 70.5 20004 ± 165 20418 ± 2.50 9425± 1265 36 5lS ± 890 14 ±2 74 ± 1 9 7 ± 1 2920 ± 175 19 779± 48] 7038 ±415 4944 ± 185 7 113 ±240 30 ±2 325± 15 10 14 ± 1 17696±2670 9656·± 350 5320 ± 120 260 ± 15 2 161 ±~O 52 ± 1 126± 2 12 46 ±2 49613 ±240 22949 ±510 7653 ± 320 685± 95 8347 ±290 268± 7 410 ± 15
Mean± sn 26 :21 19891 : 22 752 17386:4987 8757 :5972 2766 :3708 9661: 13 469 87 :93 277: 201
Pemdontitis 1 13 ± 1 22009 ±6 015 14587±2710 8423 ± 145 965 ± 100 6516 ± 2 245 105± 9 252 ± 28 2 13 ± 1 7659 ±BJ 15-013 ±3 475 5510 ± 115 687± 15 151&g ± 290 55 ± 1 877 ± 19 3 6±1 19596 ±380 6224 ±925 3592 ± 109 245 ± 25 4612 ± 45 26 ± 1 199± 8 .5 36 ±5 34290 ± 30.5 12981 ± 500 3932 ± 625 427 ± 10 3673 ± 49 68 ± 5 99 ±2 8 s2 50 90s ±3 ·175 20875 ± 285 17274 ± 825 13901 ± 1 015 39 95é ± 2970 15 ±2 90 .±2 Il 12 ± 1 12241 ± 156 18896 ± 1 OSO 4 .553± 155 432 ± 10 4531 ±290 41 ± 3 495± 6 13 12± 1 26224 ±3 225 24·100 ±2BJ 10286 ±970 1 448 ±250 4428 ±700 32 ±5 105 ± .5 14 17 ± 1 2220 ± 570 22607 ± 80 10095 ±3 070 598 ± 150 4 132 ± 1145 46 ±5 554 ± 34 15 54 ±2 20818 ±6675 22722 ± 665 14 3JJ ± 2340 596 ± 70 26318 ±3 ~O 1I5± 3 807 ± 16 16 20 ± 1 56543 ±5 470 22 765 ± 1465 9853 ± 153J 433 ± 25 9017 ± 2 23J 45 ±2 269± 5 17 10± 1 9008 ± 14JJ 21346 ± 465 6420 ± 630 497 ± 53 4 159 ± 230 29 ±3 170± 14 18 14 ±2 3859 ±325 4365 ±.55 4034 ± 565 429 ± 3J 1 857 ± 15 103± 2 265± 2J 19 12 ± 1 1 880 ± 160 5037 ± 350 5349 ± 1045 548 ± 40 3 109 ±460 44 ±3 1 640 ± 69 20 15±1 1 910± 105 6444 ±970 5237 ± 125 1034 ±515 4643 ± 190. 37 ±2 450 ±104 21 32±2 13 8JJ± 9.55 12142 ± 375 11171±17O 584 ± 15 3704 ±7O 58 ± 10 253 ± 19 22 18 ±3 1 747 ±.50 4322 ± 210 4571±ro 296 ± 3J 1 988 ± 3J 104± 9 849 ± 15 23 Il ± 1 1225 ± BJ 5616±465 5 ro2 ± 800 410 ± 10 3779 ± 95 44 ±4 840 ± 48
r.lean : sn 17:]3 16825 : 17059 14123 :7 '~0 7660: 3 966 1384: 3 239 8332: 10 122 57 :31 483: 410
\0 ~
92
Im.1,. Comparative response of P. gingivalis , (P. g)-stirnulated whole blood flDm healthy and
periodontitis' patients for secretion ofIvIIvIP -8 and!Vl1VIP -9.
Patienis , l\11).[P-8 (pgInil) l\JIMP-9(~~) Control + P g Control + P, g
Healthy 4 3 ± 1 6 ± 1 35 ±48 41 ±5 6 6 ± 1 131 ± 8 66 ±46 12 ±3 '] 78 ±28 3 ±,1 75 ±8 36 ±7 9 121 ± SS 14 ±2 211± 19 110± 7J 10 3'± 1 208 ±2J 5 ± 1 192 ±2i 12 4±3 125±35 27 ±5 383± 22
?tlean:: sn 36:: 51 81 :86 70 :74 129: 140
Pemdomitis 1 2 ± 1 224± Ti 5 ±1 427 ± 10 2 4± 1 194± 28 9 ± 1 341± 12 3 7 ±1 337 ± 91 40 ±3 58±2 5 ;;;2 434 ±ffi 38 ±7 87 ±9 8 62 ±43 ;;;2 31 ±5 39 ± 1 Il 3±1 335± &5 17±2 240 ± 108 13 ;;;2 29 ±3 31 ± 1 220 ± 104 14 ~2 33 ± 10 8±2 81± 18 15 3 ± 1 49 ±23 15 ±3 106 ± 24 16 ;;;2 27 ±5 17 ±1 109± 8 17 ;;;2 36 ±2 20 ±2 223± 'S7 18 2 254± 151 6±2 303±S3 19 3 ± 1 36±10 17 ± 1 601± 114 20 lO±1 121 ± 3J 107 ± 61 467 ± 18 21 3±! 10S± J) 14 ± 13 275±26 22 ;;;2 95±16 20 ±OS 522 ±62 23 7±1 34 ±4 58 ± 12 '48±2
Mean:SD 7: 14 138: 134 27 =25 244: 178
--------- _.~_ .. ~--- ---- --- -----,
IwJG~4~ P values for the secretion of cytokines and _~. by P. gingivalis-stimulated whole blood from
healthy patient group ~periodontitis patient group.
Cytokines or MMP.! Pvalue
Ilr1 ~ 0.998
Ilr6 0.207
TNF4 0.137
Ilr1ra 0.117
Ilr8 0.795
RANTES 0.725
MCP-1 0.151
IP;.10 0.163
NIDIIP-8 0.893
NIDIIP;.9 0.205
93
94
Table 5. Fold induction of cytokine or IvlIVlP secreted for control vs P gingivalis-stimulated TWhole blood
from hea1 thy pati ent group vs peri odonti ti s pati ent eroup.
CytoIdne or IVIIVIP Fokl induction (tontrol vs P. gingivalis stiullùa tion)
Healthy }) atiE!lt group Perilclolltiti-ç p adeut grol1?
~-1~ 781 1 250
lL-6 649 1 312
TNF-a. 24 35
~-1ra 9 16
~-8 765 989
RAN1ES -2 -1. 8
MCP-1 3.5 6
IP-10 3.2 8.5
IvIIvlP-8 2.3 19.7
IvlIvIP-9 1.8 9
95
CHAPITRE 3 : CONCLUSION
La maladie parodontale est le résultat d'une interaction étroite entre le biofilm
microbien associé aux surfaces dentaires et la réponse immune de l'hôte. Elle se traduit par
une inflammation des tissus de soutien de la dent et une perte d'attache progressive pouvant
mener à l'exfoliation de la dent.
Parmi les quelques 500 espèces bactériennes qui . constituent la flore buccale, environ
une douzaine sont considérées comme ayant un potentiel parodontopathogène (Kinane et
al., 2008). Le complexe rouge est constitué de trois bactéries parodontopathogènes:
Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola et Tannerella forsythia. P. gingivalis est
reconnue comme un important parodontopathogène. Ses nombreux facteurs de virulence lui
permettent de coloniser les tissus de l'hôte, d'inactiver son système de défense et de
détruire les structures parodontales. Cependant, la réponse de l'hôte représente un facteur
clé permettant d'expliquer .l'expression de la maladie parodontale. La stimulation par les
facteùrs bactériens de virulence des cellules de l'hôte, engendre l'expression d'enzymes
hydrolytiques et la sécrétion de médiateurs inflammatoires permettant d'activer diverses
voies de dégradation tissulaire.
Malgré la forte prévalence d'individus arborant des bactéries parodontopathogènes,
seul un faible pourcentage d'individus va exhiber un schéma de destruction rapide
(Schenkein, 2006). La susceptibilité à la maladie parodontale pourrait donc être déterminée
en partie par une prédisposition génétique.
Le surfaçage radiculaire est considéré comme la modalité non-chirurgicale de choix
pour le traitement de la parodontite. Les antibiotiques, en administration systémique ou
locale, ont fait l'objet de nombreuses études pour évaluer leur impact sur 1'amélioration de
la condition parodontale. Les propriétés immunomodulatrices des tétracyclines ont aussi
permis de développer d'autres thérapies comme la prise de doxycycline à des doses sub
antimicrobiennes et plus récemment des tétracyclines modifiées chimiquement (CMT) qui
agissent sur la régulation de la réponse inflammatoire de 1 'hôte.
Notre projet de recherche avait deux objectifs principaux: i) évaluer l'effet anti
inflammatoire des tétracyclines et de ses dérivés dans un modèle ex vivo de sang complet
96
stimulé avec le LPS de P. gingivalis, et ii) comparer la production . d'une gamme de
médiateurs inflammatoires dans un modèle de sang complet de suj ets sains et de patients
atteints de parodontite chronique, suite à une stimulation avec des cellules entières de P.
gingivalis. Le modèle ex vivo de sang complet a été choisi car il offre la possibilité de se
rapprocher de la ré~t1ité clinique. En effet, il existe une similitude entre le sang et le fluide
gingival concernant la composition leucocytaire. Même si les proportions des cellules
immunitaires sont différentes, le modèle de sang complet représente un environnement
physiologique pertinent pour étudier la production de médiateurs inflammatoires suite à la
stimulation par les bactéries car les interactions cellulaires qui se produisent entre les
différents leucocytes sont préservées (Bodet et al., 2005).
Le but de notre première partie de projet était d'évaluer la capacité · de la doxycycline à
mo~uler la production de médiateurs inflammatoires par les cellules immunitaires,
stimulées par le LPS de bactéries parodontopathogènes. Pour ce faire, deux modèles ont été
étudiés : un modèle de macrophages stimulés par le LPS de A. actinomycetemcomitans et
un modèle ex vivo de sang complet stimulé par le LPS de P. gingivalis. Le modèle de sang
complet présentait l'avantage de prendre en considération les interactions qui existent entre
les différentes cellules immunitaires contribuant à la réponse inflammatoire. Les deux
modèles ont permis de montrer que la doxycycline possédait une capacité d'inhibition de la
réponse inflammatoire en ayant un impact négatif sur la production de médiateurs pro
inflammatoires. Dans le modèle des macrophages, une forte inhibition de la sécrétion d'IL-
1p, de TNF-a et d'IL-8 a été observée avec 2 IlM· de doxycycline et d'IL-6 avec 10 IlM. La
doxycycline semblait exercer cet effet grâce à son action modulatrice sur l'état de
phosphorylation des kinases de la voie de signalisation ERK1/2. Dans le modèle de sang
complet, une inhibition de la sécrétion de ces mêmes cytokines a également été observée.
L'inhibition de sécrétion du TNF-a s'est avérée significative, même à 1 IlM , ce qui laisse
supposer que des concentrations plus faibles que 1 IlM pourraient continuer à exercer une
activité anti-inflammatoire. Dans les deux modèles, les effets anti-inflammatoires observés
ont été obtenus avec des concentrations thérapeutiques de doxycycline. Les concentrations
moyennes de doxycycline, deux heures après leur administration par voie orale, aux doses
systémiques recommandées, sont 2,35 ~g!ml (4,7 ~M) dans le plasma et 1,65 Ilglml (3,3
97
~M) dans le liquide créviculaire. Quançl la doxycycline est utilisée à dose sub
antimicrobienne, sa concentration sérique est approximativement 0,79 ~g/ml (1,6 ~M)
(Sakellari et al., 2000). Ainsi, on a observé que les propriétés anti-inflammatoires de la
doxycycline mises en évidence dans le modèle de macrophages sont conservées en présence
des protéines plasmatiques du modèle de sang complet. Cette · première étude a aussi
confirmé le bénéfice clinique que peut représenter la doxycycline dans le traitement des
parodontites agressives localisées et des parodontites réfractaires en association avec une
thérapie mécanique conventionnelle. Elle nous permet également de valider la pertinence du
modèle ex vivo de sang complet dans l'étude des propriétés inflammatoires de molécules
synthétisées en laboratoire, destinées à un futur usage thérapeutique.
Le but de notre deuxième étude était de comparer les propriétés anti-inflammatoires
de la tétracycline, de la doxycycline et de la CMT -3 à partir d'un modèle ex vivo de sang
complet stimulé par le LPS de P. gingivalis, afin de confirmer leur impact immuno
modulateur dans un modèle plus proche de la réalité clinique que d'autres modèles
n'impliquant qu'une seule lignée cellulaire. Si l'étude a permis de montrer une inhibition de
la sécrétion des cytokines étudiées, elle a aussi montré que les trois formes de tétracyclines
n'ont pas d'impact sur la production de MMP-8 et de MMP-9. Ceci suggère que l'effet
inhibiteur observé sur la sécrétion de cytokines est spécifique plutôt qu'associé à une
diminution globale de la synthèse protéique. Cette absence d'effet sur la sécrétion de MMP-
8 et de MMP-9 pourrait s'expliquer par le fait que de trop importantes quantités de MMPs
sont produites (en moyenne, 1000 fois plus que les cytokines). Des concentrations plus
élevées de tétracyclines pourraient cependant démontrer un effet inhibiteur. Ce modèle a
permis de montrer que les bénéfices cliniques observés avec l'utilisation des tétracyclines
dans le traitement des parodontites réfractaires, pourraient être liés à la capacité de ces
molécules, ainsi que CMT -3 qui ne possède pas de propriétés antibiotiques, à réduire la
sécrétion de médiateurs inflammatoires par les cellules immunitaires impliquées dans la
réponse inflammatoire de la parodontite. Cette étude a confirmé la validité de l'utilisation
de ces molécules dans le traitement spécifique des parodontites réfractaires de même que la
validité des études faites auparavant sur ces molécules, dans des modèles monocellulaires.
Elle montre également qu'il apparaît difficile de comparer le pouvoir anti-inflammatoire de
98
ces molécules entre elles, en raIson de la très grande variabilité des réponses inter
individuelles.
Le but de notre troisième étude était de comparer la réponse inflammatoire de patients
atteints d'une parodontite et de sujets parodontalement sains dans un modèle ex vivo de
sang complet, stimulé par P. gingivalis. L'étude n'a pas permis de montrer de différence
sigriificative entre les niveaux de sécrétion de cytokines, de chémokines et de MMPs chez
les patients sains et malades. Ceci, principalement en raison de la trop grande variabilité qui
existe entre individus. Cependant, si on compare le taux d'accroissement de ces sécrétions,
c'est-à-dire, le niveau de sécrétion du contrôle à celui après stimulation, on remarque qu'il
est beaucoup plus important chez le groupe des patients atteints de parodontite, laissant
supposer une prédisposition de certains individus à réagir de façon exagérée à la stimulation
médiée par certaines bactéries parodontopathogènes dont P. gingivalis. La suite logique de .
cette étude pourrait être basée sur le même modèle mais avec une cohorte beaucoup plus
importante pour arriver à montrer une différence significative entre les deux groupes. Il
serait également intéressant d'utiliser ce modèle sur des sujets parodontalement atteints et
porteurs d'un polymorphisme génétique afin de confirmer la tendance d'hyper-réaction de
leur système immuno-inflammatoire.
En conclusion, le modèle de sang complet humain, utilisé tout au long de cette
recherche, apparaît être un bon modèle d'étude, se rapprochant de la situation cellulaire
immunitaire présente dans le liquide créviculaire, en présence de parodontopathogènes. Il
est facile à mettre en place et a montré sa validité au cours de ces trois études.
99
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