22/05/2013

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Henriette Poaty10ème RENCONTRE DE BIOLOGIE TECHNIQUE

BRAZZAVILLE

14-05-2011

CHORIOCARCINOME

� Cancer utérin

� Maladie gestationnelle

trophoblastique

� 20 % - 50 % complication de la môle

hydatiforme complète

Droz, 1999; Shapter et coll., 2001; Xue coll., 2004

� Grossesse anormale

� Dégénérescence hydropique des

villosités choriales placentaires

� Absence d’embryon

� Origine Androgénique++ou biparentale

Absence de gènes maternelle

MÔLE HYDATIFORME COMPLETE

�Faible incidence Pays du Nord • Europe : Amérique du Nord: 0,6 –1/1000 nces

• France: 1/1000 nces (800 cas /an)

�Forte incidence pays du Sud

• Sud-est asiatique: 3,2 - 9,9/1000 nces

• Afrique: 3,7 /1000 - 4,3/1000 nces

Incidence de la Môle

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Variable selon les régions (France: 50 à 100 cas /an)

� Sénégal 5 %

� Maroc (254 MHC) 6 %

� Congo (47 MHC) 18 %

� Afrique du Sud (112) 20 %

Incidence transformation MH en CC

Bouffetal et coll., 2010; Moodeley et coll., 2003; Moukassa, 1997

OBJECTIFS DE L’ ETUDE

Choriocarcinome

Maintien déséquilibre ?Evolution ?

Anomalies chromosomiques ?

Gains oncogènes/antioncogènes ?

Certains responsables ? transformation maligne

Immunité

Régulation anarchique d’autres gènes

Empreinte de type paternel

Môle

Caryotype diploïde

Tumeur greffée

MATERIEL ET METHODES

� Môles Hydatiformes (20)10 ADN, 10 coupes paraffine

� Choriocarcinomes post môlaires (47) 14 ADN, 33 Coupes en paraffines

� Lignées cellulaires choriocarcinome (3) BeWo JAR JEG

� Placenta normal 9 SA 10 SA 11 SA

MATERIEL D’ETUDE

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TECHNIQUES D’ETUDE

� ADN: CGH-array 244K

� Cultures cellulaires: caryotypes pour lignées

� FISH

� Coupes & immunohistochimie

TECHNIQUE DE CGH

�Technique de cytogénétique moléculaire:

Combine caryotype à la biologie moléculaire

�Analyse global du génome: visualise à la fois

anomalie CH (CNA, CNV) et moléculaire (profil du

génome par gain/pertes) avec faible résolution 1Mb

�Type puces:

1. Génome complet: 44K, 60K, 105K, 180K, 244K

2. 1 chromosome donné

3. Région dédiée: région d’intérêt, ADN

mitochondrial (30K)

Détection quantitative des signaux

Mesure rapport rouge - vert

CalculGains - Pertes

ADN test Marqué

Cy3 vert

ADN référenceMarqué

Cy5 rouge

Mélange équimolaire + ADN compétiteurcot 1

Lame microarray + oligonucléotidessynthétiques 60 mers n = 244 000 spots

Hybridation

Normalisationet

Segmentation

ADM2 Algorithm

Hybridation Génomique Comparée

Prénatal

• Malformations fœtales , SAE

• Cytogénétique : DPN, FCS, MFIU

• Caryotype anormal

� Postnatal = constitutionnel

�Tumeurs solides: cancer sein, chorioK…

� Retard mental idiopathique� Maladies psychiatriques: Schizophrénie…

Indications

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RESULTATS

CGH

� Môles: profils normaux. 10 mCGH

� Choriocarcinome de novo: anomalies

modérées. 5/11 mCGH ; 7/11 aCGH

� Lignées cellulaires anomalies 3/3

chromosomiques complexes

aCGH

M176+14q

aCGH

M26-18q

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5

aCGH

JEG

+5

-18

-8

+9q

-X+14q

+1q32

+20q+16q

FISH

M176

Sonde 14q32 (IGH-V) et 16q23 (MAF-R) Cellule avec

3 copies du 14 illustrant une trisomie du 14q32 et 2

copies normale du 16.

Trisomie 14

FISH Perte du 18

Sonde BCL2 / SERPINB2. 1 copie du 18

JEG

CNA (Copy Number Abnormalities) des choriocarcinomes par aCGH (partiel)

Tumeurs CNA Position (Mb), [ratio] LC CNA Position (Mb), [ratio]

+14q24.2q24.3 72.40-77.45 [1.20] JAR +5q23.2q35.2 121.69-174.48 [1.25]

+14q32.3q32.3 100.26-105.67 [1.23] -7q31.1q34 110.84-138.80 [0.67]

+17 - 8p23.1p12 7.25-36,32 [0.70]

+19 - 8q13.1q22.1 66.29-84.72 [0.6]

+20q 26.56-35.35 [1.27] - 8q21.1q22.1 84.72-96.49 [0.48]

M176 + 1p36.3p36.1 2.53-19.06 [1.24] +8q23.3q24.3 115.85-146.26 [1.25]

+1p35.3p34.1 29.56-44.84 [1.7] +9q32q34.3 115.26-139.30 [1.25]

+ 1p13.2 115.13-115.36 [1.3] -10p15.3q23.2 0.12-88.26 [0.73]

- 1q21.2 148.74-148.86 [0.72] -10q25.2q25.3 113.91-116.56 [0.51]

+14q 19.38-106.30 [1.5] -10q25.3qter 116.63-133.66 [0.74]

M232 -X -11pterp11.2 0.19-46.69 [0.75]

M26 +11q13.1 63.41-65.54 [1.25] +12p13.3 0.03-9.81 [1.35] (3)

-18q12.2q23 34.20-75.22 [0.75] +12p13.2p13.1 11.72-13.28 [2.3] (3)

+19p13.1 16.46-19.64 [1.22] +12p12.3 15.00-16.27 [2.1] (3)

M27(2) +11q13.1 63.47-65.55 [1.20] +12p12.3p12.2 18.89-20.50 [3.6] (3)

+12p12.2p11.2 20.83-31.62 [2.1] (3)

+12q12q13.1 37.37-44.71 [1.3] (3)

+12q13.1 52.33-52.67 [2.29] (3)

CNAs (126): CC 21, BEWO 27,

JAR 47, JEG 31

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+12p13.2p13.1

+14q24.3

+14q32.2q32.3

+16q11.2q24.3

-18q21.2q21.3

-18q21.3

+19q13.4

+20q11.2

-Xp22.2p21.3

-Xp22.3

+1p36.2p35.1

+1p35.3p34.3

+ 1p13.2

+1q21.2q23.1

+5p13.3p12

+5q23.2q35.2

+5q35.2q35.3

-8p23.3p12

-8q13.1q22.1

+9q32q33.1

11p14.3p12

+11q13.1

Régions minimales communes (MCR)

CNA (126): CC 21, BEWO 27, JAR 47, JEG 31 40 MCR

MCR et GENESMCR Position (Mb) Taille

(Mb)Gain

/PerteCC LC Gènes sélectionnés

14q32.2q32.3 <100,26-101,22> 0.9 G 2 2 DIO3 DLK1 RTL1

16q11.2q24.3 <45.05-88.69> 43.64 G 2 MMP2 MMP15

18q12.2q21.3 <50,15-59,79> 9.67 P 1 2

SERPINB2 PMAIP1 BCL2MBD2 MDEA TCEB3

19q13.1 3.6 G INSL3

19q13.4 <58.76-58.98> 0,22 G 1 3 DPRX ZNF33

20q11.2 <32,34-34,90> 2,5 G 1 3 PROCR MMP24 DNMT3B

Xp22.31 <7,25-7,37> 0.12 P 2 3 STS

Xp22.2p21.3 <12,57-25,24> 12.6 P 2 3 PRDX4

2 groupes de gènes:

• Métalloproteïnases: MMP2 MMP7 MMP9

MMP14 MMP24

• et leurs inhibiteurs: TIMP2² SERPINB2

• ²Gènes soumis Empreinte

ETUDE FONCTIONNELLEpar immunohistochimie

� Technique qui associe les principes

d’immunologie à l’histochimie

� Permet la détection d’un antigène

(protéine) dans un tissu donné grâce

à l’utilisation d’un anticorps

� Détermine marqueurs moléculaires

(membranaire, cytoplasmique, nucléaire, intercellulaire)

L’ IMMUNOHISTOCHIMIE

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� Utilisation des AC primaires

correspondants qui se fixe à l’Ag

� AC secondaire

� AC couplé à un traceur permet

de visualiser liaison Ag-AC

• Avidine biotine (vitamine H) ou

streptavidine biotine ou polymère Antigène

Anticorps I

Anticorps II

Biotine

Avidine

Peroxydase

Applications IHC

Multiples: anapath, cancérologie…

�Confirmation de certains diagnostics

�Prise en charge thérapeutique

�Valeur pronostic dans certains cas

�Permet une meilleure recherche

� Oncogène. Dégrade collagène IV, Clive KISS1

� Reproduction, développement embryonnaire, régulation vascularisation, réponse inflammatoire

� Plusieurs voies de régulation: TIMPs (TIMP2+), PTK œstrogène, progestérone

MMP2(Matrix metalloproteinase 2/72 kDa type IV collagenase/72 kDa gelatinase)

16q12.2

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Placenta Môle Choriocarcinome

x40M176x40M269x40

MMP2

Placenta 10 SA cytoplasme CTB+ Lame basale, MH + +, CC +++

CC M281x40 CC M176x40

MMP2

Choriocarcinome: marque Cytoplasme et membrane des CTB des villosités en prolifération , MEC

SERPINB2[serine proteïnase inhibitor /serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin)/ plasminogen activator-inhibitor 2/PAI-2)]

18q21.2q23

� Antioncogène,

� dégrade les proteïnases

� Contribution FCS + AP, rôle inflammation, immunité

� invasion tumorale

SERPINB2

Cytoplasme STB + microvillosités +++

Placenta x40 M176 x 40

Môle M114

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CONCLUSION

CONCLUSION (4)

� Maladie polygénique

� dérèglements géniques secondaires se superposeraient au déséquilibre génique initial des gènes soumis à empreinte parentale

� Modèle classique de cancer avec une signature génomique spécifique (empreinte et

miRNA)

Intérêt de présenter ce travail

Importations des techniques au Congo:

1. FISH2. Immunohisochimie

Poster

Poaty H. et al.

�Genome-wide High-Resolution aCGH

Analysis of Gestational

Choriocarcinomas. PloS one 2012, 7(1):

e29426

�Etude cytogénomique de la môle

hydatiforme et du choriocarcinome

gestationnels. Bull du Cancer 2012,

20(10) 1-17

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REMERCIEMENTS

A. Bernheim

P. Coullin

P. Dessen

AL Diata

E. Leguern

C. Gombé

D Carles

JF. Peko

A. Valent

S. Prevost

A. Ngolet

B. M Lebwaze

JY. Picard

MERCI A TOUS

Danse des Moyes à Tongo

Villosité œdémateuse

d’une môle partielle

Cordon

ombilicalFœtus

mortifié

(Kierszenbaum, 2006)

2323

Duplication SPZ → Môle complète homozygote 46,XX

46p

23

Fécondation Ovocyte II anucléé → Môle complète

hétérozygote 46,XX ou 46,XY

23

A

ou

Maturation ovocytedéfectueuse

23

23

23B 46p

46

D23

692323

23→ Môle partielle

69,XXX / XXY / XYY23

ou

Fécondation anormale

4623

2323

Môle complète biparentale 46,XX/XY ou partielleC

Mère mutation NLRP7

Présents dans 2 MCR au moins (hg18)et deux des critères ci-dessous

1. Expression dans le placenta

2. Implication dans développement embryonnaire /placentaire

3. Implication dans le cancer/apoptose

4. soumis à l’empreinte parentale

Critères de sélection des gènes

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BeWo

71-72,XXY,add(X)(p21-22), +1, add(1)(p36),+2,

-4,+5,-6, add(7)(p22),-11,-13x2, i(13q),-18,der(19)t(9;19)(q13;p13), +mar[cps16].

JEG

71-74,XXY,add(X)(p21-22),+2,+5, add(7)(p22), add(7)(q32),

+9,t(10;15)(p10;q10),-11,-13, i(13q),t(14;11)(q15;p13),

-18, del(18)(q22), +mar[cps21].

JAR

66-68,XXY, add(X)(p22),del(1)(p31), t(1;13)(p13;q14),

t(3;3)(q12;qter), add(4)(q22),+5, -8, del(8)(q22),-10,

add(11)(q10), der(13)(q11q34), add(17)(p12),-19,-21,

+mar[cps18]

Caryotype des lignées

3

1 1

2

3 3 3 3 3

3

3

2

2

1

3

3

2

3

3

1

3

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 x

No

mb

re d

’éch

anti

llon

s

CC + CL

CC

Môle

CH

Chromosomes impliqués

CNAs (126): CC 21, BEWO 27, JAR 47, JEG 31

TIMP2

Chorio M281 x 40Placenta 9SA x 40 Môle M114x20

Placenta 9SA, cytoplasme CTB ++Môle et choriocarcinome. Négatifs

17q25.3