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MISSION EXPLORATOIRE

LABORATOIRE D'ANALYSE MEDICALE

HOPITAL REGIONAL DE KANKAN 30 septembre au 12 octobre 2013

Dr Chantal KOLHER, MCUPHD. Département d'histologie, cytologie, embryologie. Faculté de Médecine de Nancy. Nancy Université – Université de Lorraine.

Le laboratoire est géré par deux biologistes : le Dr Issa CAMARA, chef de service et son adjoint, le Dr Mamoudou CAMARA. Cinq techniciennes titulaires et cinq stagiaires assurent les examens. (cf annexe 1 : organigramme du laboratoire). Le personnel technique (titulaire et stagiaire) tourne sur les différents postes. Le changement se fait toutes les semaines.

Le laboratoire comporte plusieurs pièces : le hall d’accueil des patients, une salle de prélèvement, une pièce réservée aux colorations, une pièce de lecture des lames comportant deux microscopes* (frottis et goutte épaisse pour la recherche de paludisme, microbiologie), une pièce de biochimie comportant un automate de biochimie, un petit spectrophotomètre, une hotte et une étuve (Seul le spectrophotomètre est utilisé), une pièce comportant divers appareils (un microscope, une centrifugeuse, un compteur de CD4 (non fonctionnel) et un bain-marie). Cette pièce peut être utilisée pour la réalisation des tests rapides (HIV, Hépatites B et C).

* Il est à noter que les microscopes ne comportent pas d’ampoule mais sont éclairés par une lampe torche, ce qui permet les

lectures même en absence de courant.

Circuit d’une demande d’examen :

La demande est faite sur un bulletin d’examens. Avec celui-ci, le patient se rend au bureau des entrées pour régler l’analyse.

Accueil au laboratoire : les éléments du ce bulletin sont notés sur le cahier journalier qui comporte le nom, prénom, âge, sexe, service demandeur, examens demandés et un numéro constitué par la date sous forme jj-mm et le

numéro d’ordre d’arrivée du patient (ex : 28-9-14) :

Photo de gauche : Accueil

Photo du centre : cahier journalier Photo de droite : bulletin d’examens : en bleu les données fournies par le bureau des entrées ; en rouge les résultats après examen

Ce même document qui comporte les résultats des analyses sera remis au patient.

Prélèvements : ils sont faits dans la salle attenante au hall d’accueil. Les tubes prélevés sont étiquetés avec un marqueur (seulement le N° d’arrivée au labo) et sont dispatchés selon les demandes. Les groupes sanguins, les frottis et les gouttes épaisses sont faites directement dans la salle de prélèvement puis sont envoyés dans la salle de lecture. Si un tube primaire est partagé en plusieurs tubes secondaires, ceux –ci sont numérotés par le même n° d’arrivée au labo. Tous les examens sont faits dans les salles prévues pour et sont notés sur le cahier de paillasse correspondant.

Rendus des résultats : ils sont recopiés sur le cahier de paillasse puis sur le cahier journalier de l’accueil et sur l’ordonnance médicale, rendue au patient.

Objectifs de la mission :

Liste des examens et modes opératoires :

Alors que les techniciennes tournent sur les différents postes, il est apparu que les modes opératoires de chaque analyse n’étaient pas disponibles sur chacun des postes. L’objectif de la mission a été d’écrire avec Issa CAMARA l’ensemble des modes opératoires. Un exemplaire sera rassemblé dans un classeur disponible pour tous et dans chaque pièce, le mode opératoire de la technique faite dans cette pièce sera accroché sur le mur.

Nous avons pu ainsi rédiger la liste des examens faits au laboratoire avec le tube nécessaire au prélèvement et la quantité minimale à prélever (annexe 2) et établir le classeur de 19 modes opératoires (annexe 3). Ces documents ont été présentés par Issa CAMARA à l’ensemble du personnel lors d’une réunion de laboratoire qui s’est déroulée à la fin du séjour.

Observation de la réalisation des examens

Lors de la mission, l’observation de la réalisation des techniques a permis de mettre en évidence des points à modifier et/ou à améliorer :

Dans la pratique des examens :

1. Examen de biochimie

a. Rincer les godets entre chaque mesure (une valeur élevée par exemple glycémie à 4g/L va entrainer

une augmentation artificielle de la glycémie du patient suivant)

2. Examens d’hématologie

a. Rinçage de la pipette de Sahli après la décontamination dans l’eau de javel (l’eau de javel provoque

une acidité ; la quantité d’H Cl sera moindre et le taux d’hémoglobine sera abaissé)

b. Une numération des globules blancs en même temps que la réalisation de la goutte épaisse

permettrait de rendre un résultat de densité parasitaire plus réelle

c. Les résultats notés sur les cahiers de paillasse seront plus facilement retrouvés s’ils conservent le

même numéro que celui attribué à l’accueil (notamment pour les selles qui sont souvent techniquées

le lendemain).

Dans le rendu des résultats

1. La Guinée est un pays d’endémie pour les salmonelloses typhiques. Il est conseillé de réaliser le test de Widal

avec un sérum dilué au 1/8e. D’autre part il faut tenir compte du type d’anticorps présents dans le sang :

l’Anticorps O traduit une maladie récente et peut être associé à l’anticorps H ; l’anticorps H seul traduit plutôt

une maladie ancienne.

2. Rendre les résultats du test rapide de syphilis (RPR) sous forme de 4 réponses possibles : Test négatif, test

faiblement positif, test positif, test très positif.

3. L’étude faite parmi les membres de la Mission (12 personnes) et de personnels de l’hôpital (8 personnes)

montre que le taux de plasmodium falciparum dans le sang est quasiment égal à 0 quand il n’existe pas de

signes cliniques. Une densité parasitaire positive même faiblement traduit une crise paludéenne (même si

cette crise paludéenne n’est pas la seule responsable des signes cliniques présentés par le patient).

Ces différents points ont été validés par Issa CAMARA qui les a présentés à l’ensemble du personnel.

Points non abordés dans cette mission

1. L’automate de biochimie n’a pas pu être mis en route car très compliqué à utiliser (maintenance avant

démarrage de près d’une demi-heure, nombreux contrôles, date de péremption des réactifs assez courte)

2. Le compteur de CD4 n’est plus fonctionnel car l’ordinateur associé au compteur ne fonctionne plus et le

logiciel pilote de l’appareil a disparu.

3. Le rendu des résultats est à améliorer.

4. Un fichier Excel est à concevoir afin d’améliorer l’accès à tous les résultats des examens faits au laboratoire

(études épidémiologiques et dénombrement des examens).

Liste du matériel manquant au laboratoire (liste faite par Issa CAMARA ):

Compteurs de cellules (différentiel à 5 touches et mécanique à 2 touches)

Hématimètre (cellule de Malassez ou de Neubauer ou de Nageotte)

Pipettes à VS

Appareil à mesure automatique du taux d’hémoglobine

Microscope

Lames et lamelles

Tubes

Garrot

Vaccinostyles et aiguilles

Seringues

Lames rodées

Métabisulfite de sodium

Balance électrique

Annexe 1 : Organigramme du laboratoire

Annexe 2 : Liste des examens

NomNomNomNom

de l’examende l’examende l’examende l’examen

Autre nom du test

Nature du prélèveme

nt Type de

tube

Volume minimum à prélever

Remarques particulières pré-traitement

GlycémieGlycémieGlycémieGlycémie glucomètre sang

capillaire ………………

en urgence et si examen unique

dosage dosage dosage dosage

hémoglobinehémoglobinehémoglobinehémoglobine sang capillaire ………………. en urgence

groupage groupage groupage groupage

sanguinsanguinsanguinsanguin sang capillaire …………….. en urgence

recherche de recherche de recherche de recherche de

plasmodiumplasmodiumplasmodiumplasmodium TDR sang capillaire ……………..

en urgence test réalisé au lit du

malade ou à l'accueil

GlycémieGlycémieGlycémieGlycémie sang tube sec (rouge)

2 ml examen sur sérum centrifugation

dosage dosage dosage dosage

hémoglobinehémoglobinehémoglobinehémoglobine sang

tube hépatiné (vert) ou EDTA (violet)

1 goutte sang total

groupage groupage groupage groupage

sanguinsanguinsanguinsanguin sang

tube hépariné ou tube EDTA

5 gouttes sang total

goutte épaissegoutte épaissegoutte épaissegoutte épaisse sang tube EDTA 2 gouttes frottis + goutte

épaisse sur lame

NFSNFSNFSNFS sang

tube hépariné ou EDTA (violet)

2 ml sang total

test de Widaltest de Widaltest de Widaltest de Widal TD/TH sang tube sec 2 ml examen sur sérum centrifugation

SyphilisSyphilisSyphilisSyphilis RPR/TPHA sang tube sec 2ml avant don du sang examen sur sérum

centrifugation

ASLOASLOASLOASLO sang tube sec 2ml examen sur sérum centrifugation

Hépatite BHépatite BHépatite BHépatite B SD Bioline

HBsAg sang tube EDTA 2 ml avant don du sang sérum ou sang total

Hépatite CHépatite CHépatite CHépatite C SD Bioline

HBsAg sang tube EDTA 2 ml avant don du sang sérum ou sang total

VIHVIHVIHVIH

Determine Dépistage et confirmation

sang tube EDTA 2 ml avant don du sang sérum ou sang total

Vitesse de Vitesse de Vitesse de Vitesse de

sédimentationsédimentationsédimentationsédimentation VS sang tube EDTA 2 ml

tube préparé (0,4ml anticoagulant + 1,6

ml sang) fait à l'accueil

Temps de Temps de Temps de Temps de

saignementsaignementsaignementsaignement TS sang tube sec 1 à 2 ml

1 à 2 gouttes sur lame de verre

fait à l'accueil

Temps de QuickTemps de QuickTemps de QuickTemps de Quick TC sang tube sec 1 à 2 ml fait à l'accueil

test d'Emelltest d'Emelltest d'Emelltest d'Emell TE sang

capillaire 1 goutte sur lame

Examen d'urineExamen d'urineExamen d'urineExamen d'urine ECBU urine prélèvement à

domicile

examen de examen de examen de examen de

sellessellessellesselles selles

prélèvement à domicile

LCRLCRLCRLCR LCR prélèvement par le

médecin prescripteur

sécrétions sécrétions sécrétions sécrétions

vaginalesvaginalesvaginalesvaginales

sécrétions vaginales

tube sec étalement sur lame dès le prélèvement

Autres liquides Autres liquides Autres liquides Autres liquides

biologiquesbiologiquesbiologiquesbiologiques

Ascite, liquide

pleural, …

prélèvement par le médecin prescripteur

CholestérolCholestérolCholestérolCholestérol sang tube sec 2 ml examen sur sérum centrifugation

Acide uriqueAcide uriqueAcide uriqueAcide urique sang tube sec examen sur sérum centrifugation

uréeuréeuréeurée sang tube sec examen sur sérum centrifugation

créatininémiecréatininémiecréatininémiecréatininémie sang tube sec examen sur sérum centrifugation

TransaminasesTransaminasesTransaminasesTransaminases

ALAT (GPT), ASAT (GOT)

sang tube sec examen sur sérum centrifugation

CalcémieCalcémieCalcémieCalcémie sang tube sec examen sur sérum centrifugation

Annexe 3 : Modes opératoires

Modes opératoires

Modes opératoires..................................................................................................................................7

Prélèvement veineux ..............................................................................................................................8

Prélèvement capillaire ............................................................................................................................9

Coloration de Gram...............................................................................................................................10

Coloration de Giemsa............................................................................................................................11

Coloration de May Grunwald Giemsa ..................................................................................................12

Numération des globules rouges..........................................................................................................13

Numération des globules blancs ..........................................................................................................14

Formule sanguine..................................................................................................................................15

Détermination des groupes sanguins...................................................................................................16

Dosage du taux d’hémoglobine............................................................................................................18

Test d’Emmel.........................................................................................................................................19

(épreuve de falciformation des hématies) ..............................................................................19

Recherche de paludisme.......................................................................................................................21

(goutte épaisse + frottis) .........................................................................................................21

Test rapide HIV de dépistage (Determine)...........................................................................................22

Test rapide HIV de confirmation (Bioleme)..........................................................................................23

Test rapide de recherche de syphilis (RPR) ..........................................................................................24

Test de Widal.........................................................................................................................................25

Recherche d’une hépatite B (SD Bioline HBsAg)..................................................................................27

Recherche d’une hépatite C (SD HCV) ..................................................................................................28

Bilan biochimique .................................................................................................................................29

Prélèvement veineux

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser un prélèvement veineux.

Matériel nécessaire

- Gants à usage unique

- Container d’aiguilles

- Garrot

- Antiseptique

- Coton

- Aiguilles + seringues

- Tubes adaptés au prélèvement

- Feutre permanent

Technique

- Installer le malade sur le siège

- Préparer le matériel de prélèvement adéquat

- Inscrire le numéro du patient sur le ou les tubes et les lames

- Le patient est en face du technicien, bras tendu, paume en haut

- Désinfecter la zone à piquer avec un tampon (coton imbibé d’alcool)

- Placer le garrot et demander au patient de fermer le poing

- Adapter l’aiguille à la seringue

- Piqure de la veine la plus visible, biseau de l’aiguille dirigée vers le haut

- Prélever 5 CC de sang et le transvider dans les tubes préparés.

- Retirer l’aiguille + seringue ; placer le tampon sur le point de piqure

- Ne pas recapuchonner l’aiguille et mettre l’aiguille + seringue dans le container

- Le patient est convoqué pour le lendemain afin d’obtenir les résultats

Prélèvement sur tube sec

- Centrifugation à 1300 Tours / min

- Recupération du sérum

Prélèvement capillaire

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser un prélèvement capillaire.


- Gants à usage unique

- Container d’aiguilles

- Antiseptique

- Tampon (coton + alcool)

- Micro-lance

- Matériel nécessaire pour l’examen (lames, plaques, tests rapides)

- Feutre permanent

Technique

- Installer le malade sur le siège

- Préparer le matériel de prélèvement adéquat

- Inscrire le numéro du patient sur le matériel adéquat

- Le patient est placé à gauche du prélèveur (si celui-ci est droitier)

- Désinfecter le bout du doigt à piquer (annulaire) avec un tampon

- Essuyer avec un coton sec

- Piquer d’un coup sec et rapide le côté du doigt

- Eliminer la première goutte de sang sur le coton sec

- Appuyer sur le doigt pour recueillir le sang pour les examens

- Placer directement la goutte sur le matériel d’examen

- Placer un coton sec sur le point de piqure

- Le patient attend son résultat sur le banc de la pièce d’accueil

Coloration de Gram

Cette coloration permet de mettre en évidence des bactéries Gram+ et Gram (-) sur un frottis.

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser une coloration de Gram.


- Solution de Violet de Gentiane

- Solution de Lugol

- Alcool /Acétone ou Alcool à 95%

- Solution safranine

o Ces solutions sont prêtes à l’emploi et peuvent exister dans un Kit

Technique

- Fixer la lame à la flamme

- Placer la lame sur un support situé au-dessus de l’évier de coloration

- Recouvrir la lame au violet de gentiane pendant une minute

- Rincer à l’eau

- Recouvrir la lame avec la solution de lugol pendant une minute

- Rincer à l’eau

- Décolorer avec la solution alcoolique (décoloration des bactéries gram (-) alors que les bactéries gram +

restent violets)

- Rincer à l’eau

- Recouvrir avec la solution safranine pendant 30 secondes. (coloration des germes gram (-) en rose)

- Observation au microscope x100 à l’immersion

Coloration de Giemsa

Cette coloration est utilisée pour les gouttes épaisses et les frottis

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser un coloration de Giemsa.


- Solution mère

- Une éprouvette de dilution

- Eau distillée ou eau du robinet

- Pipette de 1 ml

- Alcool à 95%

Technique

- Diluer la solution mère : 1ml de solution mère / 9 ml d’eau. Cette solution diluée peut être utilisée pendant

24 heures.

- Fixer la lame à l’alcool 95% pendant 2 à 3 minutes.

- Laisser sécher la lame.

- Recouvrir la lame avec la solution de Giemsa pendant 30 minutes.

- Rincer à l’eau du robinet

- Faire sécher à température ambiante

- Lire au microscope , objectif x100 à immersion

-

Résultat

- Les noyaux sont colorés en violet foncés, le cytoplasme des cellules en rose clair, les hématies en gris

Coloration de May Grunwald Giemsa

Cette coloration est utilisée pour les gouttes épaisses et les frottis

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser un coloration de May Grunwald

Giemsa.


- Solution mère de Giemsa

- Solution de May Grunwald

- Une éprouvette de dilution

- Eau distillée ou eau du robinet

- Pipette de 1 ml

- Alcool à 95%

Technique

- Diluer la solution mère de Giemsa au 1/2 : 1ml de solution mère / 1 ml d’eau. Cette solution diluée peut être

utilisée pendant 24 heures.

- Fixer la lame à l’alcool 95% pendant 2 à 3 minutes.

- Laisser sécher la lame.

- Recouvrir la lame avec la solution May Grunwald pendant 5 minutes

- Egoutter la lame

- Recouvrir la lame avec la solution de Giemsa pendant 10 minutes.

- Rincer à l’eau du robinet

- Faire sécher à température ambiante

- Lire au microscope, objectif x100 à immersion

Résultat

Numération des globules rouges

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser une numération des globules rouges

en hématimètre.


- Pipette de Sahli

- Flacon vide en verre (10 ml)

- Pipette pasteur

- Hématimètre (cellule de Malassez ou de Neubauer)

- Sérum physiologique

Technique

- Prélever du sang veineux (cf fiche technique) ou du sang capillaire (cf fiche technique)

- Déposer 4 ml de sérum physiologique dans le flacon en verre

- Ajouter 20 µl de sang (prélever avec pipette de Sahli)

- Mélanger doucement en remuant le flacon

- Placer une lamelle sur l’hématimètre après avoir humecter les zones de contact

- Remplir la chambre de l’hématimètre avec la solution

- Compter au microscope, objectif x40

Résultats

Nombre de globules rouges par mm3 :

- Compte en hématimètre x 10 000 si cellule de Neubauer

- Compte en hématimètre x 5 000 si cellule de Malassez

Règle de comptage pour éléments figurés sur les lignes de l’hématimètre (éléments à cheval) : les éléments sur les

bords droit et inférieur sont comptés dans le carré

-

Numération des globules blancs

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser une numération des globules blancs

en hématimètre.


- Pipette de Sahli

- Flacon vide en verre (10 ml)

- Pipette pasteur

- Hématimètre (cellule de Malassez ou de Neubauer)

- Solution de turck (préparée au laboratoire)

Technique


- Déposer 0,4 ml de solution de turck dans le flacon en verre

- Ajouter 20 µl de sang (prélever avec pipette de Sahli

- Mélanger doucement en remuant le flacon

- Placer une lamelle sur l’hématimètre après avoir humecter les zones de contact

- Remplir la chambre de l’hématimètre avec la solution

- Compter les globules blancs au microscope, objectif x40 (sans coloration)

Résultats

Nombre de globules blancs par mm3 :

- Compte en hématimètre x 50 si cellule de Neubauer

- Compte en hématimètre x 40 si cellule de Malassez

Formule sanguine

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes à respecter pour réaliser une formule sanguine sur frottis

Détermination du % des différents types de globules blancs


- Lame de verre

- Alcool à 95%

- Coloration de giemsa diluée au 1/10

Technique


- Déposer une groutte sur la lame de verre et atirer à l’aide d’une autre lame de verre

- Laisser sécher à température amvbiante

- Fixer à l’alcool 95%

- Coloration au Giemsa

-

-

Résultats

- Détermination du pourcentage de polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basohiles

- Détermination du pourcentage de lymphocytes

- Détermination du pourcentage de monocytes

Lymphocyte Polynucléaire neutrophile Monocyte Eosinophile

Détermination des groupes sanguins

Les globules rouges (ou hématies) portent, sur leur membrane, des protéines spécifiques (appelées récepteurs ou antigènes) Il

existe deux protéines différentes A et B. Les globules rouges d’un individu peuvent posséder la protéine A ou la protéine B, ou bien

les deux, ou bien aucune. On définit ainsi les groupes sanguins : groupe A, groupe B, groupe AB, groupe O. Un autre type de

protéines (appelée rhésus) peut exister sur les hématies. Le seul antigène testé dans la détermination des groupes sanguins et la

protéine D. Pour déterminer le groupe sanguin d’un sujet, la technique utilisée est celle de Beth Vincent qui recherche le ou les

antigène(s) existant sur les hématies

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes de la détermination des groupes sanguins.


- 1 plaque émaillée - Lames - Nécessaire à prise de sang veineux ou capillaire - Coffret de réactifs : sérum anti A, anti B, sérums anti A + anti B, sérum anti D. Ce coffret doit impérativement

être conservé à +4°C. - Rhésuscope ou à défaut de l’eau tiède

Technique

- Recueillir le sang par prélèvement veineux (cf fiche technique) ou par prélèvement capillaire (cf fiche technique).

- Déposer 3 gouttes de sang sur une plaque émaillée et 1 goutte sur une lame de verre. - A côté de chaque goutte de sang, déposer les sérums Anti A, anti B et anti AB. Mélanger à l’aide d’un

agitateur et attendre l’apparition d’une agglutination en provoquant un mouvement des gouttes par inclinaison répétée de la plaque.

- Pour la détermination du groupe rhésus, faire la même opération (goutte + sérum anti D) sur la lame posée sur un flacon d’eau tiède et agiter de la même façon.

Résultats

Les antigènes présents sur les hématies réagissent avec les sérums : protéine A avec sérum anti A, protéine B avec sérum anti B, protéine D avec sérum anti D. Le tableau suivant donne les résultats pour chaque groupe sanguin :

Agglutination

Groupe

Anti A Anti B Anti AB Anti D

Groupe A+ + - + +

Groupe A – + - + -

Groupe B+ - + + +

Groupe B – - + + -

Groupe AB+ + + + +

Groupe AB- + + + -

Groupe O+ - - - +

Groupe O- - - - -

A noter : dans tous les cas, les transfusions isogroupes sont à préférer. Dans les cas d’extrême urgence on peut donner du sang d’un Donneur A à un receveur A ou AB Donneur B à un receveur B ou AB Donneur O à un receveur A, B, AB et O Donneur rh (D) + à un receveur rh+ Donneur rh – à un receveur rh+ ou rh-

Dosage du taux d’hémoglobine

Le dosage du taux d’hémoglobine est le seul paramètre qui permet de définir une anémie.

Objet

Cette fiche technique décrit la méthode de détermination du taux d’hémoglobine.


- hémoglobinomètre de Salhi - pipette de Salhi - H Cl 0,1 N - Microlance - Solution désinfectante

Technique

- Préparer le tube de Sahli : vérifier que le tube contient HCl jusqu’à la graduation 2 - Réaliser un prélèvement capillaire (cf fiche technique) - Rincer la pipette deux fois dans l’eau avant utilisation - Aspirer sans faire de bulles avec la pipette de Sahli la goutte de sang

déposée sur une lame de verre - Pipeter le sang dans la pipette jusqu’à la graduation de 20 µl après avoir

bien essuyé les parois de la pipette avec un coton - Refouler le sang dans le tube de l’hémoglobinomètre, aspirer et refouler

l’HCl contenu dans ce tube afin d’éliminer le sang restant sur les parois de la pipette

- Attendre 2 à 3 minutes après avoir agité et homogénéiser le sang dans le liquide acide.

- Compléter avec l’acide jusqu’à l’obtention de la même nuance de coloration dans le tube qu’au niveau du comparateur coloré placé à côté du tube

- Lire le taux d’hémoglobine en g/100 ml sur la partie graduée du tube. Il correspond à la base du ménisque du liquide.

- Décontaminer la pipette de Sahli dans l’eau de javel après chaque utilisation - Vider et rincer le tube de Sahli - Ajouter HCl 0,1 N jusqu’à la graduation 2

Résultats

- Le résultat est rendu en g/100 ml A noter : cette méthode est assez imprécise et ne donne qu’un ordre d’idée du taux d’hémoglobine

-

Test d’Emmel (épreuve de falciformation des hématies)

L’hémoglobine S peut exister chez certains individus et constitue une anomalie héréditaire. Si cette anomalie est

transmise par les deux parents, le sujet est S-S, homozygote et souffre d’une anémie appelée drépanocytose

(inférieure à 8 g / 100 ml). Si elle est transmise par un seul parent, le sujet est H-S, hétérozygote ; il ne souffre pas de

troubles sévères mais ces hématies ont tendance à la falciformation. (trait drépanocytaire).

Le test d’Emmel ne permet pas de distinguer une drépanocytose d’un trait drépanocytaire.

Objet

Cette fiche technique décrit la méthode de falciformation des hématies.


- Lame et lamelle - Microlame - Solution de métabisulfite de sodium à 2% préparer extemporanément (0,02 g de métabisulfite dans 1 ml

d’eau physiologique filtrée) - Boite de Petri - Bougie

Technique

- Faire un prélèvement de sang capillaire (cf fiche technique) - Déposer une petite goutte de sang sur une lame - Ajouter une goutte de même volume de solution de métabisulfite de sodium à 2% - Mélanger avec le coin d’une lamelle - Couvrir avec la lamelle en s’assurant qu’il n’y ait pas de bulle d’air - Placer dans une boîte de Pétri humide après avoir observé l’aspect et la répartition des hématies (objectif

x40). - Observer au bout de 15 minutes puis au bout de 30 minutes, 1H et 2H en cas de négativité

Variante de la technique

- En cas d’absence de métabisulfite de sodium, remplacer par de l’eau physiologique filtrée et lire au bout de 24 heures. Lutter la lamelle en entourant par de la bougie chauffée.

Résultat

Test négatif : les hématies gardent leur forme ronde Test positif : les hématies prennent une forme de faucille

Test négatif Test positif

Remarque : Il est important d’observer plusieurs champs de microscopie, la falciformation pouvant se produire plus rapidement sur certains champs. Lors de l’observation avant la mise en place dans la boite de Pétri, l’aspect des hématies peut être variable :

- Les patients hétérozygotes présentant un trait drépanocytaire ont des hématies normales - Les patients homozygotes sont porteurs d’une anémie et leurs hématies sont falciformes, ou en cellules

cibles.

Hématies normales cellules en cibles cellules en faucilles

Recherche de paludisme (goutte épaisse + frottis)

L’examen se goutte épaisse de sang permet de faire le diagnostic de paludisme.

Objet

Cette fiche technique décrit la recherche de trophozoïtes dans le sang


- Microlance - Lame - Coloration de Giemsa diluée au 1/10 (cf fiche technique)

Technique

- Faire un prélèvement capillaire (cf fiche technique) - Déposer une goutte de sang sur une lame - Bien étaler la goutte de sang avec une lame (étape importante) - Réaliser un frottis sanguin à côté de la goutte de sang - Laisser sécher à température ambiante - Déposer le colorant sur la lame - Laisser pendant 30 minutes - Rincer la lame - Laisser sécher - Observer au microscope (objectif x100 à immersion) : dénombrement du nombre de trophozoïtes et de GB

par champ. Compte jusqu’à 100 GB

Résultats

Test positif : Calcul de la densité parasitaire / nombre de globules blancs : détermination du nombre de trophozoïtes pour 100 leucocytes (nb). Densité = nb * 8000 /100 Paludisme grave si > à 4000 trophozoïtes plasmodium falciparum / mm3

Test rapide HIV de dépistage (Determine) Il s’agit de dépistage réalisé en moins de 20 minutes reposant sur le principe antigène / antigène : les antigènes sont

sur une bandelette, si les anticorps existent dans le sérum du patient, ils se fixent sur les antigènes et provoquent une

coloration rouge.

Objet

Cette fiche technique décrit la recherche d’anticorps anti VIH à l’aide d’un Kit

Matériel

- Kit conservé à température ambiante o Bandelettes o Diluant o Capillaires de prélèvement

- Micropipette + embouts

Technique

- Ouvrir la bandelette - Inscrire le numéro du patient sur la bandelette - Réglage de la micropipette (50µl) - Prélèvement 50 µl de sérum - Déposer sur la bandelette (extrémité indiquée par des flèches) - Attendre que le sérum migre jusqu’à la fin de la fenêtre témoin

0Résultats

- Test négatif : Absence de trait rouge à la fenêtre patient et présence de trait rouge à la fenêtre témoin

- Test positif : présence de deux traits rouges (patient et témoin) - Test non valide : Absence de trait rouge à la fenêtre témoin

Remarque : le test peut être réalisé sur sang total. Dans ce cas, on dépose 10 µl de sang total à l’extrémité de la bandelette et on ajoute 4 gouttes du diluant du kit. Si le test est positif, confirmer par le test de confirmation BIOLEME

Test (-) Test +

Ce test est réalisé avant chaque transfusion.

Test rapide HIV de confirmation (Bioleme) Ce test est réalisé pour confirmer un test de dépistage HIV positif. Il est réalisé en moins de 20 minutes et repose sur le

même principe que le test de dépistage. Il permet d’identifier le type du virus (VIH1 ou VIH2).

Objet

Cette fiche technique confirme la recherche d’anticorps anti VIH à l’aide d’un Kit

Matériel

- Kit conservé à température ambiante o Bandelettes o Diluant o Capillaires de prélèvement


Technique

- Ouvrir la bandelette - Inscrire le numéro du patient sur la bandelette - Réglage de la micropipette (10µl) - Prélèvement de 10 µl de sérum - Déposer sur la bandelette (extrémité indiquée par des flèches) - Ajouter 4 gouttes de diluant - Attendre que le sérum migre jusqu’à la fin de la fenêtre témoin

Résultats

- Trois résultats différents : o Trait rouge en regard du n° 1 = VIH 1 o Trait rouge en regard du n°2 = VIH 2 o Absence de traits rouges -> test négatif ; A confirmer trois mois plus tard

- Test non valide : Absence de trait rouge à la fenêtre témoin -

VIH 2 positif

Remarque : le test peut être réalisé sur sang total. Dans ce cas, on dépose 10 µl de sang total à l’extrémité de la bandelette et on ajoute 4 gouttes du diluant du kit. Procèder de la même façon qu’avec le sérum.

Test rapide de recherche de syphilis (RPR) Il s’agit d’un test diagnostique de syphilis utilisé en dépistage initial des patients ou en contrôle de l’évolution sous

traitement. Si l’échantillon à tester contient des anticorps spécifiques (IgG ou IgM), ceux-ci forment une agglutination

avec les antigènes du réactif.

Objet

Cette fiche technique décrit la recherche d’anticorps anti syphilis à l’aide d’un Kit

Matériel

- Kit conservé à +4 à 8°C (frigidaire à panneau solaire) o Cartes en carton permettant de réaliser 10 tests o Trois flacons : Contrôle positif (bouchon rouge), contrôle négatif (bouchon bleu), réactif (bouchon

blanc) o Capillaires de prélèvement


Technique

- Prélèvement du sang veineux (cf fiche technique) - Recueillir le sérum (cf fiche technique) - Tous les échantillons de sang d’une journée sont testés ensemble. - Sur une carte, dépôts des contrôles positifs et négatifs puis des sérums des patients. - Déposer 50 µl de sérum ou des contrôles dans un cercle. - Étaler le sérum et les contrôles sur toute la surface du cercle - Homogénéiser le flacon de réactif - Prélever à l’aide d’une aiguille fine 1 goutte de réactif et la déposer sur chaque cercle - Placer la carte sur l’agitateur et faire tourner à 100 tours / minutes pendant 8 minutes.

Résultats

- Test négatif : absence d’agglutination : aspect homogène ou accumulation du carbone en un point. - Test positif : présence d’une agglutination : dépôts larges et nombreux avec fond clair (très positif), dépôts

dispersés (positif) ou petits dépôts périphériques (faiblement positif) Remarque : Des contrôles positifs et négatifs peuvent être réalisés avec des sérums connus positif ou négatif et conservés au laboratoire au frigidaire (alimenté par panneau solaire) Si le test est positif, possibilité de compléter avec un test quantitatif avec trois dilutions du sérum : 1/16, 1/64, 1/256.

Test de Widal

Ce test permet de rechercher la fièvre typhoïde de type salmonelle typhique H et salmonelle typhique O. Le test

recherche des anticorps anti-salmonelle ; les anticorps anti O disparaissent rapidement après l’infection alors que

les anticorps anti - H persistent longtemps dans le sang. La présence d’anti O traduit une infection récente alors

que la présence d’anti H traduit une maladie ancienne, une vaccination ou une maladie récente (associée à la

présence d’anti-O).

Objet

Cette fiche technique a pour objet de décrire les étapes de la détermination des groupes sanguins.


- 1 plaque émaillée - Lames - Nécessaire à prise de sang veineux ou capillaire - Coffret de réactifs : réactif pour Salmonella typhi H et réactif pour Salmonelle typhi O. Ces réactifs doivent

être impérativement conservés à +4°C.

Technique

- Recueillir le sang par prélèvement veineux (cf fiche technique) ou par prélèvement capillaire (cf fiche technique).

- Centrifuger et faire le test sur sérum (cf fiche technique) - Déposer 2 gouttes de sang sur une plaque émaillée. - Déposer 1 goutte de réactif sur les gouttes de sang : réactif O sur la goutte de gauche et réactif H sur la goutte

de droite. Mélanger à l’aide d’une lame le sang et le réactif. - Déposer la plaque sur l’agitateur et mélanger pendant huit minutes à 100 tours / minute et attendre

l’apparition d’une agglutination. - A la fin de l’agitation, lire les résultats sous un fort éclairage artificiel

Variante de technique

- En région avec grande prévalence de la maladie, il est recommandé de réaliser les tests avec un sérum dilué

au 1/8.

- Préparation des dilutions dans trois tubes secs : Tube N° 1 N°2 N°3

Dilution ½ ¼ 1/8

Sérum physiologique 100 µl 100 µl 100 µl

Sérum du patient 100 µl

Action Mélanger le sérum du patient avec le sérum physiologique et transférer 100 µl dans le tube n° 2

Mélanger avec le sérum physiologique et transférer 100 µl dans le tube n° 3

Mélanger avec le sérum physiologique

Réalisation du test Prélever une goutte de la dilution 1/8

Résultats

Attention, lire le test dans les 60 secondes après l’agitation ; une lecture retardée peut conduite à des faux positifs.

Test positif : présence d’agglutination

Test négatif : pas d’agglutination

Interprétation :

Anticorps O Anticorps H Conclusion

+

-

Maladie en cours

+

+

Maladie en cours

-

+

Maladie ancienne ou vaccination

-

-

Pas de maladie

Recherche d’une hépatite B (SD Bioline HBsAg) L’hépatite B est une maladie virale qui provoque l’apparition d’anticorps pouvant être détectés dans le sérum des

patients selon une réaction antigène / anticorps. Les tests rapides de détection de ces anticorps comportent une

bandelette sur laquelle est déposé l’antigène spécifique du virus. Si le patient est porteur d’anticorps, la mise en

contact avec les antigènes provoque l’apparition d’une ligne visible à l’œil. (principe d’immuno chromatoraphie)

Objet

Cette fiche technique décrit la recherche d’anticorps anti hépatite B à l’aide d’un Kit.

Matériel

- Kit SD HBsAg conservés à température ambiante o Bandelettes o Capillaires de prélèvement


Techniques

Hépatite B (SD HBsAg)

- Ouvrir la bandelette - Inscrire le numéro du patient sur la bandelette - Réglage de la micropipette (100µl) - Prélèvement 100 µl de sérum - Déposer sur la bandelette au niveau de la cupule - Attendre 20 minutes que le sérum migre

Résultats

- Test négatif : Absence de trait en regard du « T » patient et présence de trait en regard du « C » (contrôle) - Test positif : présence de deux traits (patient et contrôle) - Test non valide : Absence de trait rouge en regard du contrôle -

Neg Pos

Invalide

Recherche d’une hépatite C (SD HCV) L’hépatite C est une maladie virale qui provoque l’apparition d’anticorps pouvant être détectés dans le sérum des

patients selon une réaction antigène / anticorps. Les tests rapides de détection de ces anticorps comportent une

bandelette sur laquelle est déposé l’antigène spécifique du virus. Si le patient est porteur d’anticorps, la mise en

contact avec les antigènes provoque l’apparition d’une ligne visible à l’œil. (principe d’immuno chromatoraphie)

Objet

Cette fiche technique décrit la recherche d’anticorps anti hépatite C à l’aide d’un Kit.

Matériel

- Kit SD HCV conservé à température ambiante o Bandelettes o Diluant o Capillaires de prélèvement


Techniques

- Ouvrir la bandelette - Inscrire le numéro du patient sur la bandelette - Réglage de la micropipette (10µl) - Prélèvement 10 µl de sérum - Déposer sur la bandelette au niveau de la cupule - Ajouter 4 gouttes de diluant - Attendre de 5 à 20 minutes que le sérum migre (ne pas dépasser 20 minutes)

Résultats

- Test négatif : Absence de trait en regard du « T » patient et présence de trait en regard du « C » (contrôle)

- Test positif : présence de deux traits (patient et contrôle) - Test non valide : Absence de trait rouge en regard du contrôle

Bilan biochimique Les différents dosages de biochimie sont réalisés sur sérum sur un automate. Le principe de dosage est la sprectro-

colorimétrie.

Objet

Cette fiche technique décrit la méthode des dosages biochimiques faits au laboratoire : glycémie, cholestérol, acide urique, urée, créatininémie, calcium, transaminases,

Matériel

- Solution de travail pour chaque dosage - Micro-Pipette (pipetage jusqu’à 1000 µl) - Micro-pipette de 50 µl - Tubes en verre - Embouts bleus - Embouts jaunes - Spectrophotomètre - Godets

Techniques

- prélever du sang veineux (cf fiche technique) - centrifuger et récupérer le sérum - Allumer l’appareil (attendre 15 minute avant les mesures) - numéroter les tubes en verre - Placer 1000 µl de la solution de travail (spécifique à chaque dosage) dans autant

de tubes de verre que de dosage + un tube témoin - Ajouter 10 µl de sérum (sauf pour créatinimémie : 200 µl et calcium : 20µl) - Attendre 5 à 10 minutes avant de faire la lecture - Programmer l’appareil :

o Choix du test à réaliser - Lecture au spectrophotomètre :

o Témoin dans le godet o Lancer l’analyse o Attendre le signal pour placer l’échantillon qui est placé dans un godet ; o Le résultat est donné en deux minutes environ (valeurs maximales et

minimales puis valeurs des patients. - Rincer le godet avant le patient suivant

Les Enfants de l’Aïr – Association humanitaire – 10, rue Kléber – 82000 MONTAUBAN

Tél/Fax : 00 33 (0)5 63 63 29 68 – Courriel : [email protected] – Site : www.enfants-air.com

mission exploratoire laboratoire … · tdr sang capillaire …………….. en urgence test...

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