UFR DES SCIENCES PHYSIQUES DE LA TERRE

IUP GÉNIE DE L’ENVIRONNEMENT

STAGE EN MILIEU PROFESSIONNEL

UE 39USPR2 - DEUG Génie de l’Environnement (2003-2004)

Mise au point d’une méthode expérimentale de mesure de lavitesse de sédimentation par caméra CDD.

Application à l’étude du pollen de maïs.

Rapport soutenu le jeudi 17 juin 2004par

Julien Louchard

Tuteur de StageD. RichardLED (Laboratoire Environnement et Développement)Université Paris 7

Maître de stage B. Loubet, S. Saint-Jean INRA Centre Versailles-Grignon Grignon (78)

REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je tiens à remercier Pierre Cellier, le directeur de l’UMR-EGC, et

Laurent Huber, qui dirige l’équipe atmosphère-biosphère, de m’avoir accueilli au sein de

l’INRA.

Je remercie tout particulièrement Benjamin Loubet et Sébastien Saint-Jean pour la

qualité du stage qu’ils m’ont proposé, pour m’avoir laissé une grande autonomie et pour l’aide

qu’ils m’ont apporté dans la rédaction de ce compte rendu.

J’exprime toute ma gratitude envers Céline Decuq, Brigitte Durand et Sylvie Masson

pour leur gentillesse et leurs nombreuses réponses à mes question.

Je suis très reconnaissant envers Jean Pierre Petraud de l’INRA de Versailles qui m’a

appris la méthode du tamisage à l’eau des particules microscopiques, avec beaucoup de

pédagogie et d’hospitalité.

Grâce à Marina Pavlidès ce rapport a connu une véritable extermination des fautes

d’orthographes qui pullulaient. Merci d’avoir eu le patience de le lire jusqu’au bout !

Enfin merci à l’ensemble de l’équipe, les stagiaires et le service administratif pour leur

sympathie ce qui m’a permis d’effectuer un stage dans une ambiance forte agréable.

Résumé

Pour estimer la dispersion dans l’atmosphère des spores et du pollen par des modèlesmécanistes, un paramètre physique est indispensable : la vitesse de sédimentation (Vs). Dansce stage une méthode de mesure de Vs par analyse d’image a été testé en utilisant la théorie deStockes. Cela a nécessité de déterminer la densité et le diamètre des deux particules étudiées :spores de lycopodes et billes de verre. Les résultats montrent que la méthode par imagerie estbiaisée. Les causes de ce biais ont été identifiés : si il y a trop de traces sur l’image, leurrecoupement tend à augmenter la vitesse mesurée, de plus si l’éclairage est mauvais, leurmorcellement tend à diminuer la vitesse mesurée.

Abstract

For estimating the atmosphere’ dispersion of spores and pollens with mechanisticmodels, a physical parameter is essential: the settling velocity (Vs). In this study a method formeasure Vs by image analysis has been tested against Stockes’ theory. This has necessitatedto determine the density and diameter of the two particles studied: lycopodium spores andglass marble. The results show that the image analysis method is biaissed. Causes of this biaishave been identied : if there are too many traces in the image the superposition tend toincrease the velocity measured, in addition if lighting is bad the dividing up tend to decreasethe velocity measured.

SOMMAIRE

I. PRÉSENTATION DE L’INSTITUT.......................................................................................................................... 1

A . PRÉSENTATION GÉNÉRALE....................................................................................................................................... 1B. PRÉSENTATION DE L’EQUIPE ATMOSPHÈRE.............................................................................................................. 2

II. INTRODUCTION ...................................................................................................................................................... 3

A. CONTEXTE................................................................................................................................................................ 3B. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS................................................................................................................................. 3

III. OUTILS ET MÉTHODOLOGIE............................................................................................................................ 4

A. ESTIMATION THÉORIQUE DE LA VITESSE DE SÉDIMENTATION ................................................................................... 4B. MESURE DES DENSITÉS ET DIAMÈTRES DES BILLES DE VERRE ET DES SPORES DE LYCOPODE .................................... 4

1. Principe Coulter ................................................................................................................................................... 52. Distribution des diamètres et des vitesses de sédimentation ................................................................................ 53. Mesure de la densité............................................................................................................................................. 6

C. TAMISAGE DES BILLES DE VERRE.............................................................................................................................. 7D. MESURE DE LA VITESSE DE SÉDIMENTATION PAR CAMÉRA CCD.............................................................................. 7

IV. RÉSULTATS ET ANALYSES .............................................................................................................................. 10

A. TAMISAGE ET DISTRIBUTION EN TAILLE DES BILLES DE VERRE ............................................................................... 10B. DENSITÉ ET DISTRIBUTION EN TAILLE DES SPORES.............................................................................................. 11

1. Distribution en taille des spores ......................................................................................................................... 112. Densité des spores : expérience de base............................................................................................................. 113. Recherche du problème...................................................................................................................................... 12

C. DENSITÉ DES BILLES DE VERRE ............................................................................................................................... 13D. COMPARAISON ENTRE LES VITESSES ESTIMÉES PAR LA LOI DE STOCKES ET CELLES DÉTERMINÉES PARL’ANALYSES D’IMAGE .................................................................................................................................................. 15

1. Les spores de lycopodes ................................................................................................................................ 152. Les billes de verre tamisées ........................................................................................................................... 17

V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES.................................................................................................................... 19

BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................................... 20

1

I. Présentation de l’institut

A . Présentation générale Créé en 1946, l'Institut national de la recherche agronomique est un établissement public àcaractère scientifique et technologique, placé sous la double tutelle des ministères chargés de laRecherche et de l'Agriculture.

Il est chargé de :♦ Oeuvrer au service de l'intérêt public tout en maintenant l'équilibre entre les exigences de la

recherche et les demandes de la société♦ Produire et diffuser des connaissances scientifiques et des innovations, principalement dans les

domaines de l'agriculture, de l'alimentation et de l'environnement♦ Contribuer à l'expertise, à la formation, à la promotion de la culture scientifique et technique, au

débat science/société.

Le contexte socio-économique : Les recherches de L’INRA sont au service de 2 millions d’actifs dans les domaines agricoles et 60millions de consommateurs.

Avec 4300 entreprises et 375 000 salariés, le secteur agroalimentaire est le premier secteurindustriel français. Dans ce domaine, la France est le deuxième exportateur mondial après les EtatsUnis.

L’agriculture couvre près de 54% du territoire, les forêts et bois 27%. On compte 68 000exploitations en France, d’une surface moyenne de 42 hectares. Ces productions regroupent 1.5million d’actifs permanents. La totalité de la production agricole française représente 22% de cellede l’Union Européenne.

Pour répondre aux attentes, l’INRA a défini 7 axes stratégiques avec leurs objectifs opérationnelssuivants :

1. Gérer l’espace, préserver l’environnement et produire durablement.

2. Améliorer la nutrition humaine, répondre aux attentes des consommateurs, contribuer à

préserver la santé.

3. Diversifier les produits et leurs usages, améliorer leur compétitivité.

4. Développer les stratégies génériques pour la connaissance du vivant et la transformation des

produits.

5. Adapter les espèces et les pratiques à des contextes changeants.

6. Aider la décision des agents économiques. Favoriser l’emploi.

7. Informer le citoyen et éclairer la décision publique.

L’INRA se compose de :♦ 14 départements de recherche touchant l'agriculture, l'alimentation et l'environnement♦ 21 centres régionaux répartis en près de 200 sites dans toute la France♦ 470 unités dont 260 unités de recherche, 80 unités expérimentales et 130 unités d'appui et de

service♦ 596 millions d'euros de budget en 2004

2

Mon stage s’est déroulé au centre de Versailles-Grignon dans l’Unité Mixte de RechercheEnvironnement et Grandes Cultures (UMR-EGC) dépendant du département de rechercheEnvironnement et Agronomie.

B. Présentation de l’Equipe Atmosphère L’équipe atmosphère, dirigée par Laurent Huber, dans laquelle j’ai effectué mon stage, estconstituée de 8 chercheurs, 5 ingénieurs, 2 enseignants-chercheurs, 5 techniciens et 4 thésards.

L’objectif de l’équipe est l’étude des mécanismes d'émission, de dépôt et de transfert par voieatmosphérique des gaz traces et particules biotiques dans les systèmes agricoles, et l’intégration deces processus dans les cycles biogéochimiques. Les composés auxquels on s'intéresse sont l'eau, legaz carbonique, les composés azotés (NH3, NOx, N2O), les pesticides et les particules biotiques(pathogènes, pollens).

Les recherches sont structurées selon 4 axes thématiques, comportant chacun des activitésd'expérimentation (principalement au champ), d'étude des mécanismes et de modélisationmécaniste.

Thème 1 : Emissions de polluants gazeux dans les systèmes agricoles : influence des facteurs del'environnement et des techniques agricoles sur les émissions de composés azotés et pesticides.

Thème 2 : Mise au point de modèles de fonctionnement de culture (simulation des flux d'eau,carbone, azote et pesticides) pour la réalisation de bilans environnementaux à l'échelle de la parcelleagricole.

Thème 3 : Etude des transferts par voie aérienne : transferts turbulents végétation-atmosphère,régulation des échanges à l'échelle de la plante et du couvert, dispersion et dépôt atmosphérique àproximité de sources de pollution.

Thème 4 : Dispersion de particules biotiques par la pluie et le vent : mécanismes de dispersion etrisques de contamination.

C’est une partie du thème 4 qui a fait l’objet de mon étude.

Régulièrement l’équipe se réunit pour rendre compte de l’avancement des travaux mis en place etdes futurs projets. De plus, chaque semaine une personne de l’équipe expose son travail, lesrésultats, les analyses et perspectives. Cette équipe possède une véritable dynamique de groupe oùl’ambition collective semble primer sur l’ambition personnelle.

3

II. Introduction

A. Contexte Une des conséquences de l'évolution des connaissances en biologie moléculaire, science jeune, aété de donner accès au patrimoine génétique des individus. Elle a conduit à développer un outilpuissant, la transgénèse ou génie génétique, qui, associé aux techniques classiques d'améliorationdes plantes et des animaux, permet de produire des «organismes génétiquement modifiés».

La transgénèse consiste à transférer des gènes, éléments de base du patrimoine génétique contenusdans les chromosomes, vers un autre organisme, ou bien à les déplacer à l'intérieur d'un mêmeorganisme, et à les faire exprimer dans leur nouvel environnement. Les nombreuses applicationspotentielles de ce genre de techniques sont liées par exemple à l'introduction de caractèresnouveaux dans un organisme qui n'aurait pu les acquérir autrement. C'est le cas notamment du maïsrésistant à la pyrale, un insecte parasite, ou des plantes résistantes aux herbicides, deux typesd'OGM qui focalisent l'attention du grand public et suscitent un large débat. Ce sont en effet lespremiers à mettre la société concrètement en face des conséquences contradictoires qu'ils laissententrevoir : d'une part une amélioration des techniques de production agricole, annoncée commemajeure par certains ; d'autre part un risque d'ordre alimentaire et surtout environnemental, présentécomme majeur par d'autres (Doussinault, 2004).

Augmentation des rendements, résistance aux maladies, amélioration de la qualité, adaptation auxconditions climatiques, l'amélioration génétique classique des plantes a joué un rôle central dansl'évolution des performances de l'agriculture depuis cinquante ans. Elle a été, en moyenne, àl'origine de la moitié des gains de productivité réalisés au cours des dernières décennies, tant dansles pays industriels que dans les pays en développement. Ainsi la génétique joue un rôle stratégique pour l'avenir de l'agriculture mondiale. Elle représenteun champ d'application prometteur des biotechnologies, avec en arrière-plan des enjeuxéconomiques considérables et de sérieux problèmes éthiques. Une telle abondance de nouveautésincite à la prudence dans la mise en place des dispositifs réglementaires.

B. Problématique et objectifs Les plantes transgéniques font l’objet du principe de prévention (Morin, 2004). Les essais enchamps de ces cultures nécessitent d’être contrôlé afin qu’elles ne contaminent pas les culturestraditionnelles (Gaymard, 2004). Il apparaît indispensable de connaître leur dispersion dansl’environnement. Deux modèles mécanistes ont été développés à l’INRA : SMOP (modèle lagrangien) etAQUILON (modèle eulérien) qui permettent de simuler la dispersion par le vent des grains depollen (Loubet, 2003). Pour utiliser ces modèles un paramètre aérodynamique essentiel intervient :la vitesse de sédimentation du pollen. Cela correspond à la vitesse de chute en air calme, c’est à diresans convection.

L’objectif de mon travail a été de comparer deux moyens d’estimer les vitesses de sédimentation,en vue de calibrer un de ces deux moyens qui est la mesure par caméra CCD. Le premier moyen estun calcul théorique qui, par l’intermédiaire de la loi de Stockes, estime la vitesse de chute. Lesecond est basé sur l’analyse des images des particules chutant face à la caméra. La première étape a été de déterminer les paramètres nécessaires à l’estimation de la vitesse par laformule de Stockes, c’est-à-dire le diamètre et la densité des particules. Deux particules ont étéutilisées : les spores de lycopodes et les billes de verre. La deuxième étape consistait à calibrer entaille les billes de verre afin d’obtenir des particules étalons. La dernière étape a été de comparer lesvitesses obtenues, par la formule de Stockes et par analyse d’images, les spores et les billescalibrées.

4

III. Outils et méthodologie Le but est de comparer la vitesse de sédimentation selon deux méthodes (Stockes et caméra CCD)et pour deux types de particules : les spores de lycopodes et les billes de verre, qui sontrespectivement des particules biotiques et inertes. Dans un premier temps, la loi de Stockes est explicitée. Dans un deuxième temps, la méthodologieet les outils, pour déterminer les paramètres physiques essentiels à l’estimation de la vitesse desédimentation par cette formule, sont indiqués. Ces paramètres sont la densité et la distribution desdiamètres. Enfin, sont présentés la méthode de mesure par caméra CCD et les logicielsd’acquisition.

A. Estimation théorique de la vitesse de sédimentation Cette vitesse limite résulte d'un équilibre entre le poids P de la particule, la force de traînée F et lapoussée d'Archimède A (Jarosz, 2003). Pour une particule sphérique, la force de traînée, F, a pourexpression:

F = 3π ρf µ dp Vs

où ρf est la densité de l’air (1,27 10-3 g cm-3 à 20°C), µ est la viscosité cinématique de l’air (1.7 ×10-4 poise à 20°C), dp le diamètre et Vs la vitesse de la particule. Cette relation est valable pour desnombres de Reynolds faibles (Rep < 1), le nombre de Reynolds de la particule étant défini commesuit:

Rep = force d'inertie

force de viscosité = ρfVs

2

dp

µρfV dp

2

= L Vs ρf

µ

avec L la longueur de la particule dans la direction perpendiculaire au mouvement en cm, soit lediamètre lorsque la particule est sphérique.

Une particule de diamètre dp sous le seul effet de son poids et de vitesse initiale nulle atteint savitesse limite de chute lorsque F équilibre la pesanteur soit, en tenant compte de la pousséed’Archimède, quand :

3π ρf µ dp Vs = π dp

3 (ρp-ρf) g6

D’où l’expression de la vitesse de sédimentation :

Vs = 118

dp² g (ρρρρp-ρρρρf)µµµµ

La loi de Stockes est une approximation de la vitesse de sédimentation. Elle est utilisée dans le casoù la vitesse de la particule est suffisamment faible pour que le mouvement du fluide puisse êtreconsidéré comme laminaire, c’est-à-dire pour un nombre de Reynolds inférieur à 1 (A.Renoux1998).

Ce calcul théorique est utilisé dans des conditions limitées. De plus, il mesure la vitesse de chuted’une particule considérée unitaire et sphérique alors que dans l’environnement les formes depollens et spores sont variées et leur mode de dispersion peut se faire par regroupement.

Afin d’obtenir cette vitesse, sans ces risques d’erreurs, une méthode expérimentale basée surl’analyse d’images à été mise au point lors d’un précédent stage (Moutton, 2002).

B. Mesure des densités et diamètres des billes de verre et des spores de lycopode La densité est une valeur indispensable pour estimer la vitesse de Stockes. Ce paramètre est égal àla masse volumique de la particule divisée par la masse volumique de l’eau (1000 kg/m3). La masse

5

volumique de la particule est le poids sur le volume. Le poids d’un volume donnée de particule estfacilement déterminable par pesée et le volume peut être déterminé très précisément en utilisant unappareil Coulter (Figure 1). Ce même appareil donne également la distribution des diamètres.

Figure 1 : Coulter (Multisizer 3) relié par l’intermédiaire d’un ordinateur à son logiciel d’acquisition

1. Principe Coulter

Les particules à analyser sont mises en suspension, à faible concentration, dans une solutionélectrolytique qui est l’isoton (eau salée). Cet électrolyte permet contrairement à l’eau de ne pascasser les lycopodes à cause d’une trop grande variation de pression osmotique. Les particulespassent dans un petit orifice situé entre des parois d’un isolant électrique appelé le tube orifice(Figure 2). Cet orifice constitue la zone de détection. Entre les deux électrodes immergées est établiun courant électrique qui passe à travers l’orifice, définissant ainsi l’impédance de base du circuit dedétection électrique. Chaque fois qu’une particule pénètre dans l’orifice, elle déplace un volumed’électrolyte égal à son propre volume, ce qui engendre une variation de l’impédance de baseproportionnelle au volume d’électrolyte déplacé. Il en résulte une impulsion électrique générée parchaque particule passant à travers l’orifice, l’amplitude de l’impulsion étant proportionnelle auvolume de la particule.

Figure 2 : Illustration du principe Coulter

2. Distribution des diamètres et des vitesses de sédimentation

Lorsque l’on incorpore un échantillon dans le Coulter, l’appareil détermine le diamètre de chaqueparticule et réalise une distribution en taille de l’ensemble. Cette distribution se fait par intervalle declasse réduite à moins d’un µm. Une fois l’acquisition de cette distribution effectuée, la densité deprobabilité des vitesses de sédimentation est calculée en multipliant les valeurs de diamètre au carré

par une fonction de la densité (ρp) : 118 *

g (ρp-ρf)µ

6

3. Mesure de la densité

Afin de pouvoir appliquer la formule de Stockes la densité des spores et des billes de verre doitêtre déterminée précisément.

a) Méthode Coulter avec 10 répétitions La méthode consiste à placer un échantillon de concentration connue en particules dans le vaseCoulter et d’effectuer 10 pompages d’un mL. Le vase contient un agitateur afin que la répartitiondes particules soit homogène. Pour chaque répétition le volume total de l’ensemble des particulesest mesuré, et connaissant la masse de ce volume la densité est calculée. Concernant les spores,l’expérience est réalisée avec 5 récipients et 10 répétitions.

Cette méthode ne peut pas s’appliquer pour les billes de verre. En effet, étant donné que les billesont une densité plus élevée que les spores, l’agitation n’amène pas une bonne homogénéisation. Ladensité va être déterminée selon deux autres méthodes : Archimède et une mesure totale du volumede l’ensemble des particules par le Coulter.

b) Principe d’Archimède

Figure 3 : détermination de la densité grâce au principe d’Archimède

Les billes de verre permettent de réaliser cette expérience rapide (Figure 3) où le volume introduitde billes est égale au volume déplacé. Connaissant la masse de billes, le calcul de la densité peut sefaire. Cette méthode n’a pas fonctionné pour les lycopodes car ils ne se sont pas mélangés à l’eau etse sont collés sur les parois.

c) Méthode par échantillonnage de l’ensemble des particules Afin d’éviter le problème de l’homogénéisation des billes de verre, on va chercher à échantillonnerl’ensemble des particules avec l’appareil de comptage Coulter. Pour cela la moitié de l’isotonprésent dans le vase du Coulter (le récipient) est pompé puis le vase est rempli à nouveau, cetteopération est renouvelée jusqu’à ce que le nombre de particules restant soit minime.

d) Incertitude du CoulterDeux sources d’erreurs existent : l’incertitude de la balance et le volume total des particules donnépar le Coulter.

ρ = mV

ln ρ= lnm – lnV

7

dρ/ρ = dmm +

dVV

dρ = dmm *ρ +

dVV *ρ

ρ est la masse volumique de la particulem = masse de particules initialement peséedm = incertitude de la balance = 0.1 mgV = volume total des particulesdV = écartype

C. Tamisage des billes de verre Les billes de verre sont le matériel utilisé pour calibrer la tour de sédimentation. En effet de parleur forme sphérique, leur homogénéité de densité et leur caractère inerte, elles constituent un bonoutil d’analyse. L’objectif est de comparer les résultats estimés par la loi de Stockes et ceuxmesurés par la méthode utilisant la caméra CCD et la chaîne de traitement d’images. Pour optimisercette comparaison il faut une distribution de vitesse étroite ce qui permet de comparer des pics devitesse et non une large répartition.

Les billes sont passées dans des tamis qui ont fait l’objet d’un certificat de conformité selon lesprescriptions des normes AFNOR. Des tamis sont utilisés dans l’objectif d’obtenir des classes detaille réduite à 3-4 µm. L’achat de 6 tamis permet théoriquement d’obtenir 3 classes de diamètre :36 à 38µm, 53 à 56µm et 71 à 75µm. Les billes de verres sont présentes dans des sacs de 25 kg et elles sont présélectionnées selon leurtaille : inférieures à 50 µm ou bien entre 70 et 110 µm (Figure 4).

0

200

400

600

800

1000

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

110

120

130

140

diamètre (µm)

particules

0

400

800

1200

1600

2000

2400

< 50 µm

70 à 110 µm

Figure 4 : Nombre de particules en fonction du diamètre, par mesure Coulter.Légende = annonce du constructeur.

Les valeurs données par le constructeur sont légèrement erronées. En effet, les sacs qui indiquentdes billes inférieur à 50µm possèdent des billes allant jusqu’à 65µm et les sacs qui indiquent desbilles supérieur à 70µm possèdent des billes de tailles plus faibles. La présence de nombreusesparticules en dessous de 70µm est vraisemblablement le résultat de cassures des billes par chocs. Letamisage 36-38µm et 53-56µm est effectué avec la présélection inférieure à 50µm et le tamisage 71-75µm avec la présélection supérieure à 70µm.

D. Mesure de la vitesse de sédimentation par caméra CCD La vitesse peut être déterminée théoriquement avec la loi de Stockes. Cependant, dans la réalitécette loi a des limites. Premièrement, il n’est pas sûr que l’utilisation de cette loi soit justifiée étantdonnée les limites qu’elles imposent : régime laminaire, nombre de Reynolds faible.Deuxièmement, les particules ne chutent pas toujours de manière indépendante les unes des autres

8

mais elles peuvent s’agréger comme pour le Colza. De plus le Coulter ne prend pas en compte laforme des particules, il les assimile comme sphériques ce qui biaise les résultats. Enfin l’humiditédes particules n’est pas prise en considération étant donnée qu’elles sont dans l’isoton. Il est donc essentiel d’utiliser une méthode de mesure directe. C’est pourquoi le laboratoire del’INRA a développé une méthode basée sur l’analyse d’image. C’est cette méthode qui est évaluéedans ce stage. La caméra XCD-X700 (Figure 5) est utilisée afin de déterminer la vitesse desédimentation des particules dans l’air.

Figure 5 : caméra CCD : réalisation de séquence vidéo

Les mesures de la vitesse de sédimentation en air calme sont obtenues à l'aide d'une méthodebasée sur l'analyse d'image. Le dispositif est composé d'une tour de sédimentation en inox (Figure6) de 0,95 m de hauteur et 0,15 m de diamètre, située au-dessus d'une chambre noire éclairée par lescôtés à l'aide de fibres optiques et d'une caméra CCD reliée à un ordinateur qui enregistredirectement les films.

Un dispositif de libération des particules est fixé en haut de la tour (Moutton, 2002). Il se composed’un moteur faisant vibrer une plaque inclinée contenant les particules. La vibration entraîne lesparticules et les libère dans la tour. Pendant leur chute dans la tour, les particules ont le tempsd'atteindre leur vitesse terminale avant d'entrer dans la chambre noire par une fente d’environ 5 mmpermettant aux spores ou billes de verre de se trouver dans le champ focal de la caméra. La chuteest alors photographiée 15 fois par seconde avec un temps d’exposition, τ, égal à 41,67 ms pourtoutes les mesures. Le système est fermé hermétiquement et isolé thermiquement à l'aide de plaquesd'isolation afin d'éviter tout courant d 'air extérieur ou convection thermique dans la chambrepouvant perturber la chute des grains.

Grains de pollen

Chambre noire

Tour de sédimentation

Fibre optique

caméra

isolant

Figure 6 : principe de mesure de la vitesse de sédimentation

9

Afin de déterminer la distribution des vitesses de sédimentation quatre logiciels sont utilisés(Tableau 1).

Tableau 1 : types de logiciels associées à leurs fonctions respectives Logiciels FonctionsSonyCap Acquisition des films

Virtual Dub Montage Vidéo avec sélection de la partied’intérêt pour l’étude

ImageJ film coupé et en noir et blanc et détermination des Vs

R Représentation graphique de la distributiondes Vs et analyse statistique (Saint Jean, 2003)

Les séquences vidéo sont traitées numériquement afin de déterminer la distribution de taille destraces obtenue à l'aide du logiciel Image J (librement accessible comme pour les trois autres) enappliquant deux filtres (un filtre gaussien et un filtre mettant en exergue les structures verticales del’image) et un seuil en nuances de gris. Les traces obtenues sont ensuite dénombrées et caractériséesgéométriquement de façon automatique. Pour finir, l’histogramme des tailles de trace est déterminé,puis divisé par le temps d’intégration pour obtenir la distribution de Vs. Le programme réalisé sous le logiciel « R » possède deux grandes parties :� 15 fois par seconde une image est effectuée et sur cette image certaines traces ne sont pas

visibles entièrement car dépassant du cadre. Elles ne sont donc pas prises en comptespuisqu’elles modifieraient la vitesse de sédimentation réel (elles la ralentiraient).

� Sur deux images successives une même trace peut être présente si la particule possède unefaible vitesse. Le programme prend soin de ne pas les compter plusieurs fois de suite.

Avant d’introduire les particules il faut connaître le nombre de pixels présents dans un cm. Pourcela une règle est introduite dans la chambre et le logiciel ImageJ permet la conversion.

10

IV. Résultats et analyses

A. Tamisage et distribution en taille des billes de verre De nombreuses difficultés sont apparus lors de cette étape :

♦ d’une part peu de particules possèdent un diamètre compris entre 53 et 56µm et entre 71 et75µm. Cette observation est confirmée par la Figure 4 qui montre une distribution importante entre20 et 45µm et également entre 80 et 100µm. Il est donc nécessaire de tamiser beaucoup de matièresi l’on souhaite recueillir suffisamment de billes tamisées.♦ d’autre part le tamisage n’a aucune efficacité à sec. Que ce soit manuellement ou avec unetamiseuse conçue à cette effet, les billes de verre colmatent la toile des tamis empêchant ainsi lepassage des particules.

La solution à ce problème est le tamisage à l’eau distillée. Les billes sont placées sur les toiles lesplus larges des 3 couples de tamis, c’est-à-dire 38, 56 et 75µm. Cette quantité doit être faible sinonles billes colmatent. En inclinant le tamis, un jet d’eau distillée provenant d’une pissette estappliqué sur la toile en continu, du haut vers le bas en traçant des horizontales. Les billes plus finesque la taille entre les mailles sont évacuées dans des réceptacles propres. Les billes plus grossesroulent sur la toile laissant ainsi une partie du tamis vide d’eau et de billes et une partie colmatéeavec le surplus de bille et de liquide. Le tamis est ensuite incliné dans l’autre sens et la même opération est réalisée jusqu’à ce que laquantité de billes dans les réceptacles apparaisse comme suffisante. Cette partie est introduite dansle tamis de diamètre inférieur. La même manipulation est effectuée en prenant soin qu’à la fin plusaucune bille ne passe. Pour cela il suffit de prendre un réceptacle propre et de continuer lamanipulation quelques minutes et de voir si au fond du réceptacle des billes apparaissent (ellesbrillent à la lumière). Ainsi la partie restante dans le tamis est théoriquement calibrée à 2-3 µm près.

Ce tamisage possède un inconvénient majeur : il est très lent et aboutit à une faible quantité dematière. Une fois les billes tamisées elles sont introduites dans le Coulter. L’appareil donne la distributiondes diamètres (Figure 7).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

30 35 40 45 50 55 60

diamètre en µm

disr

ibut

ion

tamisé 53-56 µmtamisée 36-38 µm

Figure 7 : résultat du tamisage à 36-38 et 53-56µm. La distribution (Figure 7) est correcte car les tamis ont une imprécision assez importante. En effetl’écart-type des trous entre les mailles et d’environ 5µm. Il n’est donc pas surprenant d’obtenir des

11

billes comprises entre 31 et 43 et entre 48 et 61µm. Les résultats du tamisage à 53-56 µmapparaissent comme les meilleurs pour la comparaison (Tableau 2) avec quasiment la moitié desbilles entre cette intervalle.

Tableau 2 : caractéristiques des distributions des diamètres des billes de verreBilles tamisées

entre 36 et 38 µmBilles tamisées

entre 53 et 56 µmPourcentage compris

entre les bornes28 % 45 %

Pourcentage inférieur 28 % 48 %Pourcentage supérieur 44 % 7 %

Mode 37,3 +/- 0,3 µm 53,2 +/- 0,3 µm

Les valeurs des modes sont en accords avec la taille des tamis.

Le tamisage est l’opération la plus longue et la plus contraignante de l’ensemble du travaileffectué. Idéalement il faudrait des billes calibrées à 2-3µm près seulement et renouveler lesexpériences assez de fois pour réaliser des tests statistiques. Il existe des billes calibrées à +/- 1µmmais le coût de ces billes (600 euros le gramme) est un frein pour la mise au point de la chambre desédimentation.

B. Densité et distribution en taille des spores

1. Distribution en taille des spores

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

10 15 20 25 30 35 40 45 50

diamètre (µm)

distribution

Figure 8 : distribution du diamètre des spores de lycopode

La distribution (Figure 8) en taille des spores de lycopodes se situe entre 10 et 50µm avec unemajorité comprise entre 30 et 40µm.

2. Densité des spores : expérience de base

Pour les 5 essais les volumes totaux sont donnés par l’appareil pour chaque répétition d’un mL.Dans l’expérience de base, les spores des 5 essais ont toutes été plongées dans l’isoton au mêmemoment. Ainsi entre l’essai 1 et 5, il s’est écoulé plus de 30 minutes. La densité est déterminée en calculant le rapport entre la masse de spores dans un mL et le volumetotal moyen des 10 répétitions.

12

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1 2 3 4 5

essais

densité

Figure 9 : Densité des spores de lycopode pour 5 essais consécutifsdont le temps de contact avec l’isoton croit avec les essais.

Les écart-type ne se recoupent pas bien qu’ils soient bons à l’exception du premier le premier(Figure 9). La tendance est à la diminution de la densité avec le temps, au moins pour les 3 premiersessais.

3. Recherche du problème

Il y a certainement une explication à cette évolution : mauvaise manipulation, appareil et/oubalance mal calibrés, propriétés des lycopodes non prises en compte. Cette dernière hypothèsesemble être la bonne car le diamètre moyen et donc le volume des lycopodes évolue avec le temps(Figure 10).

y = 0.112x + 34.744R2 = 0.9667

34

35

36

37

38

39

0 10 20 30

temps de contact (min)

diam

ètre

Figure10 : Diamètre des lycopodes en µm en fonction du temps de contact à l’isoton

La Figure 10 montre que le diamètre des lycopodes augmente significativement lorsque cesparticules sont dans l’isoton. Cette augmentation est linéaire pour des temps de quelques minutes.Les mesures précédentes sont donc biaisées. Or, le premier essai de l’expérience de base a eu lieu après quelques minutes de résidence alorsque dans le dernier essai les lycopodes ont été en contact avec l’isoton durant une trentaine deminutes. Les résultats sont donc erronés et la densité réelle doit s’approcher de l’essai 1 où leslycopodes n’ont pas eu le temps de gonfler. Afin de vérifier l’importance de ces variations, 5 expériences sont réalisées mais avec un temps derésidence identique et faible : environ 1 minute.

13

0.80

0.90

1.00

1.10

1.20

1.30

1.40

1.50

1 2 3 4 5

essais

densité

Figure 11 : densité des spores de lycopode pour les 5 essais

Les résultats (Figure 11) sont meilleurs et indiquent une densité proche de celle de l’eau. Ceci esten accord avec les valeurs présentes dans la littérature qui indique pour un Lycopodium sp. unedensité de 1.175 (Gredory, 1973) et pour des conidies une densité comprise entre 1.055 et 1.098(Sawyer, 1993). Les expériences sur les lycopodes doivent systématiquement prendre en compte letemps d’exposition des spores dans le milieu liquide. Les spores s’imbibent du liquide et par cephénomène elles augmentent de volume et voient leur densité apparente décroître. Lors des 50répétitions successives le diamètre des particules a évolué en fonction du temps et de manièresignificative (Figure 12).

32

33

34

35

36

37

38

39

0 10 20 30 40 50essais

diam

ètre

(µm

)

expérience 1expérience 2

Figure 12 : Evolution du diamètre pour les 50 répétitions successivesde la première et seconde expérience

Contrairement à la première expérience pour le second essai le diamètre varie en fonction dutemps mais de façon aléatoire (Figure 12). Les spores de lycopodes sont des particules dont lediamètre varie avec le temps donc elles ne sont pas utilisable pour la calibration.

C. Densité des billes de verre La méthode par le principe d’Archimède met en jeu la masse de billes ainsi que le volume déplacépar cette masse dans l’eau (Tableau 3).

Tableau 3 : valeur des données utilisées pour le calcul de la densitéMasse de billes de verre Volume d’eau déplacé

30.192 g +/- 0.1 mg 12 ml +/- 0.5 ml

14

La masse volumique des billes de verre est :

ρ = mV =

30.1920.012 = 2516 kg/m3 , soit une densité de 2.516

V = V1- V2 avec V1 le volume d’eau et de billes et V2 le volume d’eau avant l’ajout des billes deverre.

Calcul de l’incertitude :

dρρ =

dmm +

dXX avec X = V1 – V2 et dX = dV1 + dV2

dρ = (0.000130.192 +

112) * 2.516 = 0.2097

d = 2.5 +/− 0.2

Cette méthode a l’avantage d’être rapide et d’être facilement mise en place, cependant l’incertitudecausée par l’éprouvette graduée amène une incertitude importante de la densité. La méthode Coulter permet de déterminer la densité grâce au volume total des billes pesées etplacées dans le vase. La décroissance du nombre de billes (Figure 13) permet d’obtenir la massevolumique de façon plus précise.

y = 671223e-0.5162x

R2 = 0.9961

050000

100000150000200000250000300000350000400000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

nombre de répétition avec ajout d'isoton

particule

Figure 13 : évolution du nombre de billes en fonction du pompage successif d’isoton

Le nombre de particules diminue avec le nombre de répétitions et ceci de façon exponentiellesuivant l’équation obtenue par régression linéaire :

y = 671223 e –0.5162x

La valeur du coefficient de régression R2 est très bonne, cette équation caractérise donc ladécroissance du nombre de particules par cette méthode. D’après l’équation de la courbe après 11 répétitions plus de 99,5 % des particules présentes ont étépompées. Cette méthode est assez rapide et les erreurs commises sont faibles.

Après les 10 répétitions, le Coulter indique 10 volumes totaux dont la somme est de 16.103*10-9

m3, d’où la densité :

15

ρ = mV =

40.3*10-6

16.103*10-9 = 2503 kg/m3 , soit une densité de 2.503

ρ = 2.50 +/- 0.02

La densité calculé par les deux méthodes est égale, ce qui conforte la valeur à d=2.5.

D. Comparaison entre les vitesses estimées par la loi de Stockes et cellesdéterminées par l’analyses d’image Connaissant les valeurs de densité ainsi que la distribution des diamètres pour les différentesparticules la vitesse de sédimentation est estimée par la loi de Stockes. Afin de tester la validité decette loi le nombre de Reynolds est calculé pour les spores ainsi que pour les billes de verre. Le logiciel « R » permet des analyses statistiques comme la moyenne, le mode, l’écart-type et ladistribution des vitesses de sédimentation.

1. Les spores de lycopodes

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Vs (cm/s)

dist

ribut

ion

estimationCoulterCCD 1

CCD 2

Figure 14 : distribution des vitesses de sédimentation des spores de lycopode,soit estimée par Stockes soit déterminée par analyses d’images

La Figure 14 indique que la vitesse de sédimentation pour les lycopodes est compris entre 0 et 10cm/s et qu’elle n’excède pas ces valeurs. En abscisse il existe une incertitude liée à la densité et enordonnée une incertitude liée à l’écart-type des moyennes de particules présentes dans lesintervalles d’un µm. Le mode est égal à 3.92 cm/s et plus de 80 % des vitesses de sédimentations sont comprises entre 3et 5 cm/s.

Afin de voir la gamme des Re, les valeurs des plus petites particules et des plus grosses sontexprimées dans la formule :

Rep = LVs ρp

µ = 10-3x1X1.2x10-3

1.8x10-4 = 0.007

Rep= 5x10-3x8X1.2x10-3

1.8x10-4 = 0.3

Ces nombres sont bien inférieurs à 1 donc l’usage de la loi de Stockes semble justifié pour estimerde façon précise la valeur de la vitesse de sédimentation des spores de lycopode.

16

♦ par la méthode CCD Les vitesses de sédimentation des spores sont supérieures à celles estimées par la loi de Stockes.Les modes sont de 4.25 et 4.75 cm/s soit respectivement une majoration de 8.4 et 21 %. De plusl’étendue de la gamme des vitesses est bien plus importante que celle prédite. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces différences :1- Les spores étant hétérogènes en taille, il suffit que la partie qui passe devant la caméra ne soit

pas représentative de l’ensemble et provoque alors une différence dans les résultats.2- Pendant leur chute les spores peuvent s’agréger entre elles et ainsi ont obtient la vitesse de

sédimentation de plusieurs spores. Normalement les spores sont présentes dans l’air par unitémais selon le mode de libération elles peuvent s’agréger, ou être agrégées dès le départ,augmentant ainsi leur vitesse de sédimentation (Gredory, 1973).

3- Le Coulter donne le diamètre de la particule en supposant que celle-ci est sphérique. Cediamètre n’est pas le diamètre aérodynamique qui doit être utilisé dans la formule de Stockes.Les spores n’étant pas tout à fait sphériques l’estimation est biaisée.

4- D’après les films les particules ont subi lors de leur chute des mouvements de convection ce quipeut les accélérer ou les décélérer.

5- Enfin l’analyse d’image par le logiciel ImageJ n’est pas optimale et va par la suite être modifiée.En effet lorsque plusieurs traces se touchent le logiciel ne fait pas la distinction et compte uneseule et unique grande trace, possédant une vitesse plus élevée (Figures 15 et 16).

Figure 15 : image du logiciel Sony Cap, pour les spores de lycopodes

Figure 16 : image finale qui sert à la distribution des vitesses de sédimentation par le logiciel “R”.

Dans le cas de la trace numéro 807 il y a une erreur : la trace est en fait constituée de deux traces.Cela se voit sur la figure 15 ou l’intensité lumineuse est plus forte à l’endroit où s’accolent les deuxtraces. Ce problème n’est pas bénin car il s’accumule tout au long du film et de façon fréquente.

Les traces ne sont pas droites : il y a de la convection et un flux d’air qui sont dus respectivement àla chaleur de la lampe et à une mauvaise étanchéité de la tour. L’utilisation de diodes et d’isolantsont des solutions qui permettent de limiter cet effet. Les hypothèses les plus probables sont la 4 et la 5, les autres sont vraisemblablement négligeables.

17

2. Les billes de verre tamisées

Les distributions des vitesses de sédimentation (Figures 17 et 18) ainsi que le calcul de nombre deReynolds sont déterminés.

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0 5 10 15 20 25 30

Vs (cm/s)

dist

ribut

ion

estimation Stockes,moy=10.6, e.t=0.33CCD 1, moy=10.6,e.t=5.7CCD 2, moy=11.1,e.t=5.2

Figure 17 : distribution des vitesses de sédimentation des billes de verre tamisées à 36-38 µm,soit estimées soit déterminées par analyses d’images

Ces distributions indiquent des moyennes équivalentes mais la valeur des modes est différente. Ilsemblerait que l’estimation par caméra CCD sous-estime la vitesse. La valeur des nombres deReynolds est comprise entre :

Rep= 3x10-3x2X1.2x10-3

1.8x10-4 = 0.04

Rep= 4.5x10-3x30X1.2x10-3

1.8x10-4 = 0.9

Ces résultats sont un peu élevés mais ne devraient pas modifier significativement l’estimationde la vitesse de sédimentation par la loi de Stockes . Dans ce cas, la vitesse de sédimentationpeut être exprimée par la relation suivante :

Vs2 =

4 g dp ρp 3 CD ρ

où CD, nombre sans dimension, est le coefficient de traînée de la particule. Pour des valeurs de Rep> 0.1, le coefficient de traînée peut alors être exprimé par (Seinfeld and Pandis, 1998) :

CD = 24Rep

[1 + 316 Rep + 9

160 Rep2 ln(2 Rep)] 0,1 < Rep < 2

Cette formule ne change pas les résultats à plus de 5%.

18

0

0.02

0.04

0.06

0.080.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

0 5 10 15 20 25 30

Vs (cm/s)

dist

ribut

ion

CCD, moy=12.4,e.t.=5.6

estimation Coulter,mode=21.4,moy=16.7

Figure 18 : distribution des vitesses de sédimentation des billes de verre tamisées à 53-56 µm,soit estimée soit déterminée par analyses d’images

Les résultats (Figure 18) sont étranges et la présence de deux modes témoigne vraisemblablementd’une erreur de manipulation. En effet le premier mode est de 7-8 cm/s soit la même valeur quepour les billes tamisées de 36 à 38 µm. Un mélange entre les particules a sûrement eu lieu. Ladistribution de vitesse estimée est plus étroite que la précédente, il est fort probable que les résultatsauraient été meilleurs que pour le 36-38 µm. Cependant, à cause de la lenteur du tamisage il n’estpas possible de renouveler l’expérience. Une autre possibilité d’explication de ces résultats provientde la qualité très médiocre des films pour les billes. En effet, contrairement aux spores, les billessont translucides et elles se voient beaucoup moins lors de leur chute. Les billes de plus de 50µm dediamètre chutent rapidement accentuant la pauvreté d’intensité lumineuse des traces ce qui entraînedes erreurs dans l’analyse d’images (Figures 19 et 20).

Figure 19 : image traités par différents filtres du logiciel ImageJ, pour les billes de verre 53-56µm

Figure 20 : image finale qui sert à la distribution des vitesses de sédimentation par le logiciel “R”.

Dans cette exemple le logiciel donne les traces 7032, 7930, 7020 et 7027 alors qu’il estpossible qu’il n’y ait que deux traces d’après la Figure 17. Ces traces étant très mal contrastéeselles ne sont pas continues et aboutissent à une erreur potentielle d’interprétation du logiciel. Lelogiciel « divise » les traces en traces plus petites, ce qui explique que la distribution desvitesses de sédimentation soit plus faibles que l’estimation par Stockes.

19

V. Conclusion et perspectivesConclusion Le travail réalisé avait pour objectif la calibration d’une caméra CCD qui mesure la vitesse desédimentation de pollens. Cette vitesse est un paramètre essentiel pour modéliser la dispersion desparticules biotiques. L’intérêt de ces modélisations est la connaissance de la dispersion du pollen etdes spores dans l’environnement qui sont respectivement porteurs de gènes modifiés (si ce sont desOGM) et de maladies.

Afin de valider les résultats de cette méthode pratique, la comparaison avec une estimationthéorique est indispensable. Pour cela la loi de Stockes a été utilisée avec des billes de verre qui ontété tamisées et dont la densité a été déterminée au cours du stage. Cette loi ne peut être utilisée quedans des cas bien précis, c’est-à-dire en régime laminaire et pour un nombre de Reynolds inférieur à1, ce qui est le cas avec les spores et les billes de verre. Les résultats estimés par cette loi font ainsifigure de référence.

Deux grands problèmes ont été dégagés lors de cette étude :♦ premièrement, la calibration des billes est très lente et la quantité récupérée rend laborieuse larépétitivité des expériences dans l’optique d’effectuer des tests statistiques.♦ deuxièmement, la mesure des vitesses de sédimentation par analyse d’image aussi bien pour lesbilles de verre que pour les spores de lycopode est biaisée.

La différence entre les résultats provient certainement de la méthode d’imagerie qui provoquedeux erreurs. Pour les spores les traces se recoupent et le logiciel ImageJ compte une grande traceau lieu de deux plus petites. La vitesse mesuré est ainsi surestimé par rapport à la vitesse théoriquede Stockes. Pour les billes de verre le problème vient de fait qu’elles sont translucides et que parcette propriété leurs intensités lumineuses sur les films sont faibles. Les traces n’apparaissent pasentières et le logiciel en compte alors plusieurs à la place d’une seule. La vitesse mesurée est ainsisous-estimée par rapport à la vitesse théorique de Stockes.

Perspectives Afin de calibrer une plus grande quantité de particules une méthode simple apparaît judicieuse : ilsuffit de déposer les particules à la surface d’un fluide en mouvement continu et à vitesse constante.Plus la particule est lourde et plus son dépôt dans des récipients placés au fond de la structure est

proche du lieu de leur immersion. Le temps que la particule met à atteindre le fond est : t = hVs

et la

distance parcouru est : x = ut avec u la vitesse du fluide. En prenant la hauteur h=10 cm et u = 1cm/s et pour de l’eau pure, on obtient une distribution detaille de 30 à 70 µm entre 0.2 et 1.4 mètres.

Ceci est théorique mais ça semble être une méthode pertinente car peu coûteuse etvraisemblablement discriminante.

Concernant l’analyse d’images le problème est plus complexe. Il faudra à l’avenir mieux éclairerla chambre de sédimentation, modifier les contrastes pour obtenir des traces entières et enfinréaliser un programme pour éliminer les doubles traces comptées comme plus grandes. Cet aspect du travail est pris en charge par un stagiaire de maîtrise qui vient de débuter cette étude.

20

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