ministere de l’enseignement superieur et de la...

N° Ordre........../FSI/UMBB/2015

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE M’HAMED BOUGARA-BOUMERDES

Faculté des sciences de l’ingénieur

Thèse de Doctorat

Présentée par :

Mme

TALANTIKITE - KELLIL SOUAD

En vue de l’obtention du diplôme de DOCTORATen :

Filière : TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE.

Option : GENIE ALIMENTAIRE ET BIOTECHNOLOGIE.

TITRE :

Purification et caractérisation d’une enzyme coagulante

d’origine microbienne pour application en fromagerie

Devant le jury composé de :

Mr BENAMARA Salem Pr. UMBB Président

Mme FAZOUANE Fethia Pr. UMBB Directrice de thèse

Mme MECHAKRA Aicha Pr. U. Constantine Examinatrice

Mr BELLAL Mohamed Mouloud Pr. ENSA El Harrach Examinateur

MrAMIALI Malek MCA ENSA El Harrach Examinateur

Mr NOUANI Abdelouahab MCA. UMBB Invité

Année Universitaire 2014/2015

A la mémoire de mes parents

A mon époux

A mes enfants Mourad, Sid-Ahmed et Maya.

A mes belles filles,

A mes petits enfants Anis, Hella et Lina

A mes frères et sœurs.

Remerciements

J’adresse mes vifs remerciements à Madame Fazouane-NaimiFethia

professeur à l’université de Boumerdes qui a dirigé ce travail, je lui

adresse toute ma reconnaissance pour sa disponibilité, qu’elle trouve

ici l’expression de ma profonde gratitude.

Je tiens à remercier les membres du Jury particulièrement Monsieur

Benamara Salem professeur à l’UMBB qui me fait l’honneur de

présider ce jury, Madame Mechakra-Maza Aicha professeur à

l’université Mentouri de Constantine d’avoir accepté d’évaluer ce

travail. Mes remerciements s’adressent aussi à monsieurBellal

Mohamed Mouloud professeur à l’ENSA d’El Harrach ainsi que

monsieurAmiali Malek maitre de conférence (A)qui me font l’honneur

de juger ce travail.

Mes remerciements s’adressent également à monsieur

NouaniAbdelouahab maitre de conférences (A) à l’UMBB pour ses

encouragements et ses conseils durant la réalisation de ce travail.

Je tiens à remercier également Madame Louisa Gillmann Maitre de

conférences à l’I.U.T d’Angers de m’avoir accueillie dans son

laboratoire.

Je remercie chaleureusement Madame Monique Saunier Maitre de

conférences à l’université d’Angers pour son aide tout au long de mes

travaux au sein du laboratoire LASBA.

Ces remerciements s’adressent aussi au personnel de l’I.U.T d’Angers

en particulier Blandine Bregeon,PascalTulik ,LaetitiaAugeraud ainsi

qu’à Laurence Graindorge avec qui j’ai partagé de bons moments, ce

qui a permis de rendre mon séjour plus agréable.

Je voudrais remercier aussi Madame Odile Rolet-Repecaud de l’INRA

de Poligny pour m’avoir fourni gracieusement la poudre de lait

écrémé « lowheat » (substrat standard de Berridge)

Je remercie également Monsieur Arnaud-Dudoit responsable du

service micropolluants du laboratoire d’hydrologie et d’hygiène

d’Angers pour son aide dans l’analyse statistique lors de la réalisation

des plans d’expériences.

Enfin je remercie le personnel du département de technologie

alimentaire de la faculté des sciences de l’ingénieur pour leur soutien

au cours de l’élaboration de ce travail.

Résumés

i

Titre :Purification et caractérisation d’une enzyme coagulante

d’origine microbienne pour application en fromagerie

Résumé

L’objectif de notre travail consiste dans un premier temps à isoler des microorganismes

provenant de la terre prélevée à proximité d’une laiterie fromagerie située à BOUDOUAOU

(Boumerdes –Algérie), le milieu utilisé est le P.C.A, contenant 10% de lait écrémé stérile

auquel on a ajouté 2% de l’actidione.

Les bactéries sont cultivées dans un milieu contenant 5% de son de blé, 0,3% d’extrait de

levure, 0,4% de glucose, 0,2% de caséine et 0,3% d’Na2HPO4. C’est un milieu qui a été

adopté dans des travaux précédents pour la culture de Bacillus.

L’incubation a lieu à 30°c pendant 24h sous agitation 110 rpm. L’extraction de l’enzyme

s’effectue après filtration du milieu sur un tissu pour fromagerie. Le filtrat subit une

centrifugation à 4°c pendant 30 minutes à 4200g. Le surnageant est maintenue à basse T° pour

le test d’activité.

Après avoir testé une soixantaine de souches nous avons sélectionné trois d’entre-elles qui

paraissent différentes (I33M, FK6A et P47M), elles ont été identifié par biologie moléculaire.

Les résultats du BLAST donnent : I33M : Bacillus mojavensis, P47M : Bacillus subtilis,

FK6A: Bacillus amyloliquefaciens.

La souche I33M a été sélectionnée par rapport à son activité coagulante très satisfaisante.

Nous avons réalisé deux plans d’expériences type composite centré, pour le premier la

composition du milieu de production est de : 5% de son, 0,3% d’extrait de levure, 0,3%

d’NA2HPO4, 0,05% de glucose, 1,01% de caséine et à T° 39°c. L’agitation est à 200 rpm…

Nous pouvons conclure que le glucose n’étant pas significatif. Un deuxième plan nous a

donné : 7% de Son, 0 ,094% de caséine, 0,3% d’extrait de levure, 0,3% d’Na2HPO4, la

température est de 39°c et l’agitation est de 150 rpm. L’activité coagulante est de

2,18UP.L’activité protéolytique est de 19,302 µgtyr/ml/min. Lors de la fermentation, la

croissance est suivie par dénombrement des colonies en milieu PCA après des dilutions

successives, puis l’activité coagulante est mesurée.

La production de l’enzyme a lieu en fin de phase exponentielle et augmente avec la phase

stationnaire.

Pour ce qui est des moisissures, la souche sélectionnée a été identifiée comme étant Mucor

circinelloides. Un plan statistique (composite centré) a été employé afin d’optimiser les

conditions de production de la coagulase par le mucor sélectionné. L’utilisation de la

fermentation sur milieu solide contenant : 30gr son de blé, 1gr de caséine, 60ml de sulfate

d'ammonium (0,01%) à 30°c pendant 5 jours ont donné une activité maximale de 2,667

UP/ml. La caractérisation de la protéase a révélé des conditions optimales : température

d’activité coagulante de 55°c, un pH de 5,5 et une concentration de CaCl2 de 0,03 M.

Mots clés : Mucor circinelloides ,Bacillus mojavensis, enzyme coagulante, optimisation.

ii

Title:Purification and characterization of a milk clotting enzyme of

microbial origin for use in cheese

Summary

The objective of our work for the first step is to isolate microorganisms from soil. They were

collected near a cheese dairy, located at Boudouaou (Boumerdes-Algeria). The medium used

is the PCA, with 10% sterile skim milk and which we’veadded 2% of the actidione.

The bacteriaare cultured in a medium containing 5% of wheatbran, 0.3% of yeast extract,

0.4% of glucose, 0.2% of casein and 0.3% of Na2HPO4. The mediumis generally adopted in

precedent work for theBacillus’s culture.

The incubation was carried out at 30 ° C for 24 h with stirring 110 rpm. The enzyme’s

extraction is performed after the medium is filtered on a cheese cloth. Thefiltrate was

centrifuged at 4 ° C for 30 minutes at 4200g, and then the supernatant was kept at low temp

for activity test.

After testing sixty souches we have selected three of them that seem different (I33M, FK6A

and P47M). Theywere identificated by molecular biology. Theresults of BLAST gives:

I33M: Bacillus mojavensis, P47M: Bacillus subtilis, FK6A: Bacillus velezensis.

The I33M strain was selected from its very satisfactory clotting activity.

We conducted two experimental plans, for the first composition of the culture medium is: 5%

wheat bran, 0.3% of yeast extract, 0.3% of Na2HPO4, 0.05% of glucose, 1.01% of casein,

under T 39 ° C and 200 rpm agitation .... We can conclude that, the glucose is not significant.

A second plane has given us:7% of His, 0, 094% of casein, 0.3% of yeast extract, 0.3% of

Na2HPO4, under temperature about 39 ° C and agitation 150 rpm The clotting activity is 2.18

UP.L, proteolytic activity is 19.302 μgtyr / ml / min. Under fermentation, growth was

followed by counting the colonies in PCA medium after successive dilutions and clotting

activity is measured.

The enzyme’s production takes place at the end of the exponential phase and increases with

the stationary phase.

As for molds, the selected strain was identified as Mucor circinelloides. A statistically

significant (centered composite) was used to optimize the conditions of production of

coagulase by the selected Mucor. Use of the solid fermentation medium containing: 30g

wheat bran, 1gr casein, 60 ml ammonium sulfate (0.01%) at 30 ° C for 5 days, gave maximal

activity of 2.667 UP / ml. The characterization of the protease revealed optimal conditions:

temperature of clotting activity of 55 ° C, pH 5.5 and a concentration of 0.03M CaCl2.

Keywords : Mucor circinelloides, Bacillus mojavensis, milk clotting enzyme, optimization.

iii

ميكروبيةلالستخدامفيالجبنأصلذو تنقيةوتوصيفانزيمتخثر: العنوان

:ملخص

التي عزاللكائنات الدقيقةمنالتربةالتي تم جمعهابالقرب مناأللبانوالجبنبالخطوة األولىفيالهدفمنعملنا

الحليب الخالي من ٪ 01أضافactidioneعلىPCAهي(، والوسيلة المستخدمة الجزائر/ بومرداسبودواو)بتقع

الدسممعقمة.

٪ 1.0٪الجلوكوزالكازينو 1.0٪، 1.0مستخلصالخميرة٪ 5حتوي علىنخالةالقمحيمثقففيوسط الالبكتيريا

1.0٪Na2HPO4العصويةثقافة سابقة للدراسات فيعليها عتماداالتم طهو وسBacillu..

دورة في الدقيقة. يتم تنفيذ استخراج انزيم بعد 113ساعة مع التحريك 42درجة مئوية لمدة 03تم تنفيذ حضانة بها في

طاف تم 2433gدقيقة في 03درجة مئوية لمدة 2اللراشح كان طرد في تصفية المتوسطة على قطعة قماش الجبن

االحتفاظ بها في درجة الحرارة المنخفضة الختبار النشاط

إلى ت(، أرسلP47MوI33M ،FK6Aالتييبدومختلفا) منها لثالثنااخترسالالت بعد اختبارستين

، العصويةالرقيقة: mojavensis ،P47Mالعصوية: I33M: انفجارإعطاء، ونتائج المختبرلتحديدالبيولوجيا

FK6A :العصويةvelezensis.

مننشاطهاتخثرمرضية للغاية.I33Mوقد تم اختيارساللة

٪ 1.31٪ 3.35 الجلوكوزNa2HPO4 0.3٪٪ 3.0 ،خالصةالخميرة٪5مكون من وسطمنىولاألأجريناخطتينتجريبية

الكازين٪ 7 نخالة :الثانيةلناالخطة ،أعطتغير هامنستنتجأنالجلوكوز.... دورةفيالدقيقةالتحريض 433 و T 39 ° C الكازين

4.12 دورةفيالدقيقةواالنفعاالتوالنشاطتجلطهي Na2HPO4 39 ° C 150 درجةحرارة٪ 3.0 الخميرةمستخلص ،392٪

UP.L 19.034 النشاطهوبروتين μgtyr / مل / min.lors الوسط التخمير،وأعقبالنموعنطريقعدالمستعمراتفي

PCAبعدالتخفيفاتالمتتاليةويتمقياسالنشاطتجلط.

ت.ابثالمرحلة ترتفع فيالواآلسيةفينهاية المرحلة يحدثإنتاجإنزيمإن

( مركزمركب) ذاتداللةإحصائية A .العفنة circinelloides ،تمالتعرفعلىساللةمختارةكمابالفطرياتفيما يتعلق

نخالةالقمح،من غ 03: استخداموسيلةالتخميرالصلبةالتيتحتويعلى. كانتتستخدملتحسينشروطإنتاجالمخثرةقباللعفنةالمحدد

1GR ،4.007 أيامأعطىالنشاطالقصوىمن 5 درجةمئويةلمدة 03 عند٪( 3.31) ملكبريتاتاألمونيوم 03 الكازين UP / مل .

3.30M وتركيز 5.5 درجةمئوية،ودرجةالحموضة 55 درجةحرارةالنشاطتجلطالدممن: توصيفالبروتينيكشفالظروفالمثلى

CaCl2

،تخثراالنزيمmojavensis العفنة،العصوية circinelloides :لمفتاحية:الكلماتا

iv

ABREVIATIONS

AA : Acidesaminés

AC : Activité coagulante

AP :Activité protéolytique

BSA: Bovine sérum albumine

BYNB: :Buffered Yeast Nitrogen Base

CMP: Caseinomacro peptide

CCD : Central composite design

DFP : Diisopropylfluorophosphate

ECC : Expérience composite centrale

EEB : Extrait enzymatique brut

EEP : Extrait enzymatique purifié

E.C. :Enzyme Commission numbers

EFT: Expérience factorielle totale

FDA: Food drug administration

G.R.A.S: Generally Recognized As Safe

IMCU: International milk clotting unite

PCA: Plate count agar

PCC: Phosphate de calcium colloïdal

PCR: Polymerase Chain Reaction

RSM : Méthode de réponse surface

SEL : Son Extrait de Levure

Rpm :Rotation par minute

TCA : Acide trichloro-acetique

UHT : Ultra haute température

UP : Unité présure

v

Liste des figures

Figures Titres des figures Pages

Figure 1 : Structure primaire de la caséine -CN B-1P 9

Figure 2 : Modèle de micelle de caséine avec sous-unités 10

Figure 3 : Les différentes étapes de la fabrication d’un fromage 37

Figure 4: Phase de la coagulation enzymatique du lait 39

Figure 5 : Classification des mycètes 48

Figure 6: La place de Mucor sp dans la classification des champignons 52

Figure 7 : Surface de réponse pour un domaine expérimental 61

Figure 8 : Photo de la caséolyse 66

Figure 9 : Diagramme de la fabrication d’un fromage type « EDAM » à L.F.B 87

Figure 10: Photos des observations microscopiques 99

Figure 11 : Galerie API 50CH pour la souche I33M 104

Figure 12: Galerie API 50CH pour la souche P47γ 104

Figure 13: Galerie API 50CH pour la souche FK6A 104

Figure 14 : Blast de la souche I33M 107

Figure 15 : Dendrogramme de la souche I33M (Bacillus mojavensis) 108

Figure 16 : Surface de réponse de l’activité coagulante de la protéase produite par Bacillus

mojavensis, avec effet de la température et de l’agitation 111

Figure 17 : Graphique de Pareto obtenu avec les résultats des essais du plan 111

Figure 18 : Evolution de la croissance bactérienne en fonction du temps d’incubation 116

Figure 19 : Détermination du temps de génération de B.mojavensis 117

vi

Figure 20 : Effet de la variation du pH du milieu sur la croissance bactérienne(I33M) 117

Figure 21 : Evolution de l’activité coagulante de l’enzyme en fonction du temps

d’incubation de la souche I33M 118

Figure 22 : Variation du taux de protéines totales de l’extrait enzymatique brute en

fonction du temps d’incubation de la souche I33M 118

Figure 23 : Variation de l’activité protéolytique de l’enzyme en fonction du

temps d’incubation de la souche I33M 119

Figure 24:Profil chromatographique de l’extrait enzymatique produit par I33M filtré

sur gel Séphadex G-75

122

Figure 25 : Influence de la température du lait sur L’activité coagulante de l’EEB (I33M) 123

Figure 26 : Influence de la température du lait sur L’activité coagulante de l’EEP (I33M) 124

Figure 27: Influence du pH du lait sur l’activité coagulante de l’EEB de B.mojavensis 125

Figure 28: Influence du pH du lait sur l’activité coagulante de l’EEP de B.mojavensis 125

Figure 29: Influence de la concentration en CaCl2 du lait sur L’activité coagulante

de l’EEB de B.mojavensis 127

Figure 30: Influence de la concentration en CaCl2 du lait sur L’activité coagulante

de l’EEP de B.mojavensis 127

Figure 31: Photos des aspects macroscopiques de certaines moisissures isolées à

partir du sol 130

Figure 32 : Photos des aspects microscopiques des moisissures isolées 131

Figure 33 : Blast de la souche « 4D » 134

Figure 34 : Dendrogramme de Mucor circinelloides

135

vii

Figure 35 : Surface de réponse de l’activité coagulante des protéases produites par

Mucor circinelloides en fonction des facteurs choisis 140

Figure 36 : Profil d’élution sur Séphadex G75 de l’extrait enzymatique brut de

Mucor circinelloides 142

Figure 37 : Profil d’élution sur Séphadex G75 de l’extrait enzymatique précipité de


Figure 38 : Influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’EEB et l’EEP de


Figure 39: Influence de pH du lait sur l’activité coagulante de l’EEB et l’EEP de Mucor

circinelloides 146

Figure 40. : Influence de CaCl2 du laitsur l’activité coagulante de l’EEB et l’EEP de Mucor

circinelloides 147

viii

Liste des tableaux

Tableaux Titre des tableaux Pages

Tableau 1 : La composition moyenne du lait de vache 4

Tableau 2 : Les matières azotées totales 6

Tableau 3 : Composition moyenne de la micelle de caséine en g/100g 7

Tableau 4 : Caractéristiques physico-chimiques des caséines 11

Tableau 5 : Origine de différentes enzymes utilisées pour coaguler le lait 26

Tableau 6 : Plantes locales d’Algérie pour la coagulation du lait 28

Tableau 7 : Spécificité de quelques succédanés d’origine animale 30

Tableau 8 : Préparations commerciales 33

Tableau 9 : Impact de la température sur la coagulation du lait par la présure 41

Tableau 10 : Les paramètres d’une expérience composée centrale rotatable 64

Tableau 11 : Récapitulatif des souches bactériennes isolées à partir du sol 68-71

Tableau 12 : Caractères étudiés des bactéries sélectionnées ainsi que leur

technique d'ensemencement

76

Tableau 13 : Variation des bornes 80

Tableau 14 : Volumes d’EEB utilisés dans les essais de fabrication de

l’EDAM

84

Tableau 15 : Niveaux expérimentaux des trois facteurs utilisés dans le plan

composite centré

91

Tableau 16 : Matrice expérimentale utilisée pour mettre en place les

expériences

91

Tableau 17: Bactéries possédant une enzyme coagulante 96

Tableau 18 : Observation macroscopique des différentes souches 98

ix

Tableau 19 : Résultats des tests en galerie pour les différentes souches 100

Tableau 20 : Résultats des tests et interprétation des Hugh et Leifson 101

Tableau 21 : Résultats des tests en galerie pour les différentes souches 102

Tableau 22 : Comparaison Résultats du plan d’expérience 103

Tableau 23 : Résultats du plan d’expérience 109

Tableau 24 : L’analyse de la variance de l’activité coagulante 112

Tableau 25 : Effets estimés de l’activité coagulante 112

Tableau 26 : Coefficient de régression de l’activité coagulante 112

Tableau 27 : Résultats du suivi de la fermentation 115-116

Tableau 28 : Activité coagulante des éluâts en fonction du numéro du tube 121

Tableau 29 : Activité coagulante de l’extrait enzymatique brut 123

Tableau 30 : Description macroscopique de la collection des moisissures

isolées du sol

129

Tableau 31 : Souches possédant une enzyme coagulante et caractéristiques 132

Tableau 32 : Matrice expérimentale et activité coagulante des extraits bruts

obtenus

137

Tableau 33 : Activité de précipitation de l’extrait enzymatique brut au sulfate

d’ammonium

141

Tableau 34 : Bilan de purification de l’extrait coagulant de Mucor

circinelloides

144

SOMMAIRE

i

Sommaire

Résumés …………………………………………………………………………………….. i

Abréviations ……………………………………………………………………………….. iv

Liste des figures ……………………………………………………………………………. v

Liste des tableaux viii

Sommaire x

Introduction ………………………………………………………………………………… 1

CHAPITRE 1- SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Généralités sur le lait 4

I.1 Définition légale du lait............................................................................................ ……….. 4

I.2 La composition du lait ........................................................................................................ .. 4

I.2.1 L’eau : .................................................................................................................................. 5

I.2.2 Lactose : ............................................................................................................................... 5

I.2.3 Matière grasse : .................................................................................................................... 5

II. Généralités sur les proteases ………………………………………………………….. 13

II.1 Définition ............................................................................................................................... 13

II.2 Classification ......................................................................................................................... 13

II.2.1 Selon le mode d’attaque de la chaine polypeptidique ........................................................ 14

II.2.2 Selon le pH d’activité ......................................................................................................... 14

II.2.3 Selon la nature de résidu impliqué dans le site actif ........................................................... 14

II.3 Applications alimentaires ...................................................................................................... 16

II.3.1 Industrie laitière .................................................................................................................. 16

II.3.2 Industrie de panification ..................................................................................................... 17

II.3.3 Synthèse d’aspartame ......................................................................................................... 17

II.3.4 Préparation des produits à base de soja .............................................................................. 17

II.4 Applications médicales et pharmaceutiques .......................................................................... 18

II.5 Autres applications ................................................................................................................ 18

II.5.1 Détergents ........................................................................................................................... 18

II.5.2 Tanneries ............................................................................................................................ 18

II.5.3 Traitement de divers rejets.................................................................................................. 18

II.5.4 Législation .......................................................................................................................... 18

III. Les enzymes coagulant le lait .............................................................................................. 20

III.1 La présure ............................................................................................................................. 20

ii

III.1.1 Origine et dénomination .................................................................................................... 20

III.1.2 Propriétés et mode d’action ............................................................................................... 20

III.1.3 Les composants de la présure ............................................................................................ 20

III.1.4 Obtention de la présure commerciale ......................................... 23

III.1.5 Propriétés spécifiques exigées des succédanés de présure ................................................ 23

III.2 Autres enzymes coagulant le lait .......................................................................................... 24

III.2.1 Les enzymes coagulantes d’origine végétale .................................................................... 27

III.2.2 Les enzymes coagulantes d’origine animale ..................................................................... 29

III.2.3 Les enzymes coagulantes d’origine microbienne .............................................................. 30

III.2.4 La chymosine produite par génie génétique ...................................................................... 33

III.3Action des enzymes coagulantes sur les caséines du lait ...................................................... 34

IV. Le fromage ………………………………………………………......... .............................. 36

IV.1 Généralités ........................................................................................................................... 36

IV-2 Différentes étapes de la transformation du lait en fromage ................................................. 37

IV.3 Coagulation .......................................................................................................................... 38

IV.3.1 Coagulation acide .............................................................................................................. 38

IV.3.2Coagulation par voie enzymatique ..................................................................................... 38

IV.3.3 Coagulation mixte ............................................................................................................. 40

IV.4 Egouttage ............................................................................................................................. 42

IV.5 Salage ................................................................................................................................... 42

IV.6 Affinage ............................................................................................................................... 42

V. Coagulases d’origine bacterienne ……………………………………………………… 42

V.1. Le genre Bacillus .................................................................................................................. 44

V.2. Intérêt industriel ................................................................................................................... 45

V.3 Les protéases de Bacillus....................................................................................................... 45

VI. Coagulases d’origine fongique ............................................................................................ 46

VI.1Generalités sur les moisissures ............................................................................................. 46

VI.2 Structure .............................................................................................................................. 47

VI.3 Aperçu de la classification .................................................................................................. 47

VI.4 Cycle de vie des moisissures ................................................................................................ 48

VI.5 Conditions de croissance des moisissures ........................................................................... 49

VI.5.1 Éléments nutritifs ............................................................................................................. 50

VI.5.2 Activité de l’eau ................................................................................................................ 50

iii

VI.5.3 Température ...................................................................................................................... 50

VI.5.4 pH ...................................................................................................................................... 50

VI.5.5 Oxygène ............................................................................................................................ 50

VI.6 Importance économique des moisissures dans la production d’enzymes ............................ 51

VI.7 Les especes exploitées industriellement............................................................................... 51

VI.7.1 Définition, caractéristiques et position taxonomique du genre Mucor ............................. 51

VI.7.2 Les protéases du genre Mucor et leur application en fromagerie ..................................... 53

VII. La fermentation industrielle ............................................................................................. 53

VII.1 Buts de la fermentation industrielle .................................................................................... 53

VII .2 Types de fermentation ....................................................................................................... 53

VII .2.1 Fermentation sur milieu liquide ...................................................................................... 55

VII .2.2 La fermentation solide ou semi-solide ............................................................................ 55

VII. 3 Production d’une enzyme industrielle d’origine microbienne ........................................... 58

VII.4 Sélection d’une souche microbienne .................................................................................. 58

VII.5 Production industrielle ........................................................................................................ 59

VII.6 Extraction et purification .................................................................................................... 59

VIII. Planification experimentale ............................................................................................. 59

VIII.1 L’optimisation du milieu de culture .................................................................................. 59

VIII.2 Plan d’expérience .............................................................................................................. 60

VIII.3 Notion d'espace expérimental ............................................................................................ 60

VIII.4 Notion de surface de réponse ............................................................................................ 60

VIII.5 Expérience factorielle de 2éme

ordre ................................................................................. 61

VIII.6 L’expérience composite centrée ........................................................................................ 62

VIII.7 Types d’expériences composées centrales ........................................................................ 63

VIII.8 Etape de planification, de réalisation et de traitement des résultats de l’expérience

composite centrée .........................................................................................................................

64

CHAPITRE 2. MATERIEL ET METHODES

I.Methodes d’isolement des microorganismes d’intérêt ......................................................... 65

II.Protease d’origine bacterienne .............................................................................................. 66

II.1. Isolement des souches bactériennes...................................................................................... 66

II.1.1. Choix et purification des souches ...................................................................................... 66

II.1.2. Observations macroscopiques et microscopiques ............................................................. 66

II.1.3.Conservation des souches ................................................................................................... 67

iv

II.2. Sélection des souches à activité coagulante ......................................................................... 71

II.2.1 Les milieux de culture : étude préalable ............................................................................. 72

II.3 Détermination des activités enzymatiques............................................................................. 73

II.3.1Obtention de l’extrait enzymatique brut .............................................................................. 73

II.3.2 Méthode de détermination de l’activité coagulante ............................................................ 73

II.3.3 Méthode de détermination de l’activité protéolytique ........................................................ 74

II.3.4 Dosage de la quantité protéique .......................................................................................... 75

II.4 Identification de souches à activité coagulante par voie biochimique .................................. 75

II.4.1 Tests d'identification en tubes............................................................................................. 75

II.4.2 Galerie miniaturisée API 20E ............................................................................................. 77

II.4.3 Galerie miniaturisée API 50CH .......................................................................................... 77

II.5 Identification par biologie moléculaire .................................................................................. 77

II.5.1 Les différentes étapes de l’identification moléculaire ........................................................ 78

II.5.2 Cas de l’identification de la souche I33M .......................................................................... 78

II.6 Optimisation par un plan d’expérience de la production d’enzyme ...................................... 79

II.6.1Méthodologie des surfaces de réponses ............................................................................... 79

II.7 Suivi de la croissance de la souche I33M en fermenteur....................................................... 81

II.7.1. Préparation du milieu, conditions de culture et inoculum ................................................. 81

II.7.2 Dénombrement et activités ................................................................................................. 81

II.10 Essai de fabrication de fromage ........................................................................................... 84

III. Protease d’origine fongique ................................................................................................ 88

III.1 Isolement des souches ......................................................................................................... 88

III.1.1 Méthode d’isolement ........................................................................................................ 88

III.1.2 Choix et purification des souches ..................................................................................... 88

III.1.3 Observations macroscopiques et microscopiques ............................................................ 88

III.2 Sélection des souches fongiques coagulantes ...................................................................... 88

III.2.1 Les milieux de culture ....................................................................................................... 88

III.2.2 La préparation de l’inoculum et l’ensemencement des milieux ........................................ 89

III.3Determination des activités enzymatiques ........................................................................... 89

III.3.1 Obtention de l’extrait enzymatique brut ............................................................................ 89

III.3.2 Méthode de détermination de l’activité coagulante .......................................................... 89

III.3.3 Méthode de détermination de l’activité protéolytique ...................................................... 89

III.3.4. Dosage de la quantité protéique ....................................................................................... 90

v

III.4 Sélection des souches fongiques .......................................................................................... 90

III.5 Identification des moisissures par biologie moleculaire ...................................................... 90

III.6 Optimisation de la production de la protéase ....................................................................... 90

III.6.1 Optimisation des conditions opératoires ........................................................................... 90

III.6.2 Ensemencement des milieux de culture ............................................................................ 92

III.6.3 Extraction de l’enzyme ...................................................................................................... 92

III.6.4 Evaluation statistique des composants du milieu de culture par le plan composite

centré ............................................................................................................................................

92

III.7 Essai de purification ............................................................................................................. 93

III.7.1Précipitation au sulfate d’ammonium ................................................................................ 93

III.7.2 Dessalage de l’extrait enzymatique par dialyse ................................................................ 93

III.8 Caractérisation de l’extrait enzymatique purifié ................................................................. 94

III.8.1 Influence de la température ............................................................................................... 94

III.8.2 Influence du pH ................................................................................................................. 95

III.8.3 Influence de la concentration en CaCl2 ............................................................................. 95

III.9 Essai de fabrication de fromage à pâte pressée non cuite type « EDAM » à partir de

l’extrait enzymatique brut (EEB) de Mucor circinelloides ..........................................................

95

CHAPITRE 3. RESULTATS ET DISCUSSION

I. Protease d’origine bacterienne .............................................................................................. 96

I.1 Sélection des souches possédant une enzyme coagulante ...................................................... 96

I.2 Observations macroscopique et microscopique ...................................................................... 98

I.3 Tests d'identification en tubes ................................................................................................. 99

I.4 Test d’identification en galerie pour les différentes souches .................................................. 101

I.4.1 Galerie Api 20 E .................................................................................................................. 101

I.4.2 Galerie API 50 CH ............................................................................................................... 103

I.5 Résultats de l’identification bactérienne ................................................................................. 105

I.6 Résultats de l’optimisationdu milieu de production ............................................................... 109

I.7 Résultats de la croissance durant lafermentation de la souche I33 M .................................... 115

I.7.1Analyse des résultats ............................................................................................................. 119

I.7.2.Discussion ............................................................................................................................ 120

I.8. Essai de purification de l’extrait enzymatique brut de Bacillus mojavensis .......................... 121

I.9 Caractérisation de l’enzyme coagulante de Bacillus mojavensis ............................................ 122

I.9.1 Détermination de l’activité coagulante ................................................................................ 122

vi

I.9.2.Influence de la température du lait ....................................................................................... 123

I.9.3 Influence de pH du lait ......................................................................................................... 125

I.9.4Influence de concentration en CaCl2 ..................................................................................... 126

II.Protease d’origine fongique ................................................................................................... 128

II.1Collection de souches ............................................................................................................. 128

II.2 Observations macroscopiques ............................................................................................... 128

II.3 Observations microscopiques ................................................................................................ 130

II.4 Détermination de l’activité enzymatique des extraits bruts des moisissures isolées. ............ 132

II.4.1Activité coagulante .............................................................................................................. 132

II.4.2L’activité protéolytique ....................................................................................................... 132

II.5 Identification des moisissures par biologie moléculaire ........................................................ 133

II.5.1 Séquences d’ADNr-18S obtenues ...................................................................................... 134

II.5.2Identification de la souche 4D ............................................................................................. 134

II.6 Optimisation de la production de l’enzyme coagulante ........................................................ 136

II.6.1Evaluation statistique des composants du milieu de culture par le plan composite

centré ......................................................................................................................................... ..

136

II.6.2L’analyse de l’influence de la composition du milieu de culture sur l’activité

coagulante des enzymes ...............................................................................................................

136

II.6.3 Essais de purification de l’extrait coagulant brut ............................................................... 140

II.7 Caractérisation de l’extrait enzymatique brut ........................................................................ 144

II.7.1 Influence de la température du lait sur l’activité coagulante .............................................. 144

II.7.2 Influence du pH de lait ....................................................................................................... 145

II.7.3 Influence de la concentration de CaCl2 .............................................................................. 146

Conclusion…………………………………………………………………………...…..…. 148

Références Bibliographiques ……………………….…………………………………….... 154

Annexes 167

Introduction

Introduction

1

La première étape de la transformation du lait en fromage nécessite traditionnellement

l’emploi d’un agent coagulant, appelé présure.

La coagulation joue un rôle déterminant dans la technologie fromagère. Elle est réalisée en

vue d’exploiter une propriété particulière des gels lactés qui est de s’égoutter spontanément.

Cette évolution se traduit par la séparation progressive de la majorité de l’eau constitutive du

lait sous forme de lactosérum et d’un substrat semi-solide ou caillé primitif.

Le lait coagulé constitue le début de la fabrication du fromage. Au final, l’action conjuguée et

variable d’enzymes et de microorganismes (affinage ou maturation) permettront l’obtention

d’un produit aux saveurs spécifiques, le fromage maturé. Ce dernier peut être caractérisé

comme la conversion d’un aliment périssable à grande teneur d’humidité (le lait) en un

aliment compact de longue conservation et de haute valeur nutritive. Il occupe une place de

choix comme aliment de bonne conservation, riche en protéines, matière grasse, calcium,

phosphore et autres éléments nutritifs (DAVIS,1976).Ainsi, les fromages sont par excellence

des aliments hautement digestibles, capables de satisfaire le besoin nutritionnel élémentaire et

intéressants pour tous les groupes d’âges.

L’origine du fromage remonte à la plus haute antiquité, des textes vieux de plus de 4000ans

en faisait déjà mention. Il est établi que des techniques fromagères étaient bien connues en

Mésopotamie il y a 5000ans. Différents textes bibliques prouvent par ailleurs que le fromage

était un aliment recherché dans le Proche Orient.

Il est probable que la production fromagère soit le résultat d’une recherche fortuite.En effet, la

légende l’attribue à un marchand d’Arabie qui, partant en voyage à travers le désert, aurait

rempli de lait une outre faite de l’estomac d’un animal. A la chaleur du soleil, les enzymes

des parois stomacales auraient fait coaguler le lait et avec les mouvements dus au transport,

cela a entrainé la séparation du caillé et du petit lait. Le processus de coagulation est

provoqué par l’action d’un coagulant ajouté à un taux bien défini au lait de fabrication, lui-

même utilisé à une température et un pH précis. Le coagulant traditionnel de l’industrie

laitière est la présure ; elle est extraite de l’estomac du jeune veau nourri au lait.

En ce qui concerne l’Algérie, le secteur de l’industrie laitière connait beaucoup de problèmes

du fait de l’insuffisance de la quantité de lait produite localement. En effet, la consommation

de lait est estimé à 143l/an /habitant : elle est la plus importante du Maghreb. De ce fait, nous

importons plus d’un milliard de litres de lait par an (Ministère de l’agriculture, Mars 2014).

Introduction

2

En outre, notre pays est totalement dépendant des firmes étrangères quant à

l’approvisionnement en agents coagulants.

Concernant les agents coagulants, la quantité de présure de veau disponible est devenue

insuffisante du fait de l’augmentation de la production mondiale de fromage :le besoin de

coagulants de remplacement s’est fait sentir dès le début des années 1960.De nombreux

substituts d’origine variable (animale, végétale, ou microbienne) ont été proposés.

(Ernesrom, 1997).

Cependant, les recherches continuent dans le but de trouver des enzymes de remplacement de

la présure. Depuis une quarantaine d’années, les industries de fermentations se sont

considérablement développées dans le monde et produisent des molécules variées dont un

grand nombre d’enzymes.

En particulier, un travail considérable a été réalisé dans la sélection de microorganismes

capables de produire des enzymes coagulantes.

Les plus intéressants sont des coagulants microbiens extraits des champignons

microscopiques (Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Cryphonectria parasitica),ainsi

que la chymosine elle-même, obtenue par fermentation à partir d’un microorganisme cloné.

Plusieurs raisons sont à l’origine de cet intérêt.D’une part, ces enzymes microbiennes peuvent

être produites en quantité pratiquement illimitée sans qu’il y ait dépendance d’un

approvisionnement en matière première. En effet, le microorganisme utile est cultivé sur un

milieu spécifique de composition optimisée et son cycle de développement, limité à quelques

jours, est rapide comparativement à celui nécessaire à la génération d’un animal ou d’une

plante. Les enzymes sont extraites à partir du milieu réactionnel, puis purifiées selon des

techniques bien élaborées qui garantissent une composition constante.

D’autre part, les microorganismes producteurs d’enzymes exo cellulaires sont relativement

simples à cultiver et de ce fait les prix de revient sont satisfaisants. Enfin, l’usage des

préparations coagulantes d’origine microbienne est universel : il peut être envisagé dans les

pays où des règles philosophique ou religieuse peuvent limiter l’emploi d’autres catégories de

coagulants (Cuvellier, 1993)

De multiples souches de bactéries, moisissures et levures ont été étudiées en vue de la

production de protéases coagulantes. Les enzymes d’origine fongique ont été les plus

Introduction

3

largement explorées et développées (Scriban, 1999). Elles ont donné des résultats souvent

comparables et parfois supérieurs à ceux obtenus avec la présure. Aussi, ont-elles été

rapidement validées en fabrication industrielle. Différentes préparations sont commercialisées

sur le marché international par des laboratoires spécialisés et sont employées à plus ou moins

grande échelle selon le pays (Yadav et Mishra, 1994 ; Goursaud, 1999)

L’objectif de notre travail est donc d’isoler à partir du sol algérien, une souche microbienne

capable de fournir une protéase de bonne activité coagulante et de faible activité

protéolytique, d’optimiser les conditions de production par le choix d’un milieu de culture

adéquat ainsi que de purifier et de caractériser l’enzyme obtenue.

L’ensemble de ce travail est reparti en plusieurs volets :

La première partie comporte une synthèse bibliographique traitant des protéases en général et

des enzymes coagulantes en particulier, de la fabrication du fromage, des microorganismes

impliqués, du processus de fermentation et des plans d’expériences. Une deuxième partie

consacrée aux méthodes employées afin d’atteindre les objectifs (optimisation de la

production d’enzymes, extraction, caractérisation, et un essai de fabrication de fromage),

respectivement pour les bactéries et pour les moisissures.

Une autre partie comporte la purification des enzymes puis les résultats seront présentés

discutés dans un nouveau chapitre.

Chapitre 1

Synthèse

bibliographique

Chapitre 1. Synthèse bibliographique

4

I. Généralités sur le lait

I.1 Définition légale du lait

Le lait est le produit de sécrétion des glandes mammaires des mammifères, comme la vache,

la chèvre et la brebis, destiné à l’alimentation du jeune animal naissant. Du point du vue

physicochimique, le lait est un produit très complexe. Une connaissance approfondie de sa

composition, de sa structure et de ses propriétés physiques et chimiques est indispensable à la

compréhension des transformations du lait et des produits obtenus lors des différents

traitements industriels(Amiot et al., 2002).

I.2 La composition du lait

Tableau 1 : Composition moyenne du lait de vache (Alais et al., 1984).

Eléments Composition (g/l)

Eau 905

Glucides 49

Lipides :

Matière grasse :

Lécithine (phospholipide)

Partie insaponifiable (stérols, carotène)

35

34

0,5

0,5

Matières azotées :

Caséines

Protéines solubles (globulines, albumines)

Substances azotées non protéiques

34

27

5,5

1,5

Sels 9

Constituants divers (vitamines,

enzymes, gaz dissous)

Traces


5

I.2.1 L’eau :

Le lait contient en moyenne 875 g l-1

d’eau. Cette eau se trouve sous deux états :

- l’eau extramicellaire représente environ 90% de l’eau totale, et contient la quasi-totalité du

lactose, des sels minéraux solubles, de l’azote soluble, etc... Une petite partie de cette eau est

liée aux éléments hydrosolubles, dont les protéines solubles.

- l’eau intermicellaire représente environ 10% de l’eau totale ; une fraction de cette eau est

liée aux caséines et l’autre conserve des propriétés solvants, mais les transferts de cette eau

dans les opérations de déshydratation et hydratation seraient beaucoup plus lents (Mahaut et

al., 2003).

I.2.2 Lactose :

Diholoside parfois appelé « sucre de lait », il est synthétisé par la glande mammaire à partir

du glucose sanguin (Boudier et Luquet, 1981). Présent à une dose de 47 à 52 g/l, c’est le

constituant le plus abondant du lait de vache. Il joue un rôle important, lié notamment à sa

valeur nutritionnelle et à sa fermentescibilité qui commande l’élaboration de divers produits

laitiers. C’est un disaccharide réducteur qui existe sous deux formes isomères α et ß, formes

se distinguant par certains caractères physiques (Mahaut et al., 2003).

Le lactose est un disaccahride constitué d’une unité galactose et d’une unité glucose, le β-D-

galactopyranosyl (1-4) D-glucopyranose, α ou β (Jeantet et al., 2007).

I.2.3 Matière grasse :

La matière grasse du lait se compose principalement de triglycérides, de phospholipides et

d’une fraction insaponifiable, constituée en grande partie de cholestérol et de ß-carotène.

La matière grasse du lait se présente sous la forme de petits globules sphériques qui sont

invisibles à l’œil nu (Amiot et al., 2002).

La teneur en matière grasse du lait est standardisée pour les laits de consommation :

- 36g/l pour le lait entier

- de 14,45 au minimum à 18,15 au maximum g/l pour le lait ½ écrémé.


6

- au maximum 3,09g/l pour le lait écrémé (Luquet, et al., 1986).

I. 2.4 Matières azotées :

On peut distinguer 2 groupes de matières azotées dans le lait : les protéines et les matières

azotées non protéiques (ANP) qui représentent respectivement 95 % et 5 % de l’azote minéral

du lait. Ces 2 groupes sont sans aucune comparaison, ni sur le plan quantitatif ni sur le plan

qualitatif (Luquet et al., 1985).

Tableau 2 :Matières azotées totales du lait (Mathieu, 1998).

Groupes de constituants Teneur moyenne exprimée en

gramme par litre

Substances azotées totales

Substances azotées non protéiques

Substances azotées protéiques

Protéines solubles

Caséines

33,6

1,6

32

6

26

I .2 .4.1 Protéines :

Ce sont des composés organiques azotés macromoléculaires à l’état colloïdal, donnant par

hydrolyse des acides aminés. Constituants essentiels des tissus des êtres vivants, poids

moléculaire compris entre 15 et 500 kDa (Boudier et Luquet, 1981).

Elles comprennent les caséines (insolubles à pH 4,6) et les protéines du lactosérum (solubles à

pH 4,6) (Guillou et al., 1986

Les caséines du lait :

La caséine entière représente 80% des protéines du lait de vache et se présente sous une forme

micellaire. La micelle est formée par l’association des caséines αs1, αs2, β, κ et de composants

salins dont les deux principaux sont le calcium et le phosphate. Les proportions moyennes des


7

différents constituants de la micelle sont données dans le tableau 3. Toutes les micelles n’ont

pas les mêmes dimensions, ni la même composition. Les grosses micelles ont une charge

minérale plus élevée et des proportions relatives de caséines β et κ plus faibles que les petites

(Brule et al., 1997).

Le diamètre moyen généralement admis est voisin de 180 nm avec une distribution entre 100

et 500nm (Cayot et Lorient, 1998). On estime que la masse micellaire doit être comprise

entre 0,5 et 1 × 109 Da. La forme est considérée comme sphérique mais avec une surface

granuleuse (Schmidt, 1982 ; Walstra, 1999).

Tableau 3 : Composition moyenne de la micelle de caséine en g/100g (Brule et al., 1997)

Caséines Composants salins

αѕ1………………………………………………………………..33

αѕ2…………………………………….........11

β…………………………………………....33

κ…………………………………………....33

γ…………………………………………….4

total caséines………………………………92

Calcium………………………………….2,9

Magnésium……………………………...0,2

Phosphate inorganique…………………4,3

Citrate …………………………………..0,5

Total……………………………………..8,0

1. Les caséines αS :

La caséine αS1 :

C’est la protéine la plus importante en masse, elle possède 199 AA et un poids moléculaire de

23 614 g/mol. Cette caséine est très sensible au calcium au pH normal du lait (=6,7) : quelle

que soit la température et en présence de calcium, on constate une formation de flocons.


8

La caséine αS2 :

Elle représente 8 à 11% de la micelle de caséine, possède 207 AA et 13 à 10 phosphates (il

s’agit deαS2 ou αS3 ou αS4ou αS6selon le nombre de phosphates) et son poids moléculaire

estimé varie de 25150 à 25390 g/mol. Grâce à la présence des 2 résidus cystéine, les

molécules peuvent s’associer en dimères qui s’agrègent entre eux par interactions

électrostatiques pour former des polymères (αS5 dimère de αS3 et αS4).

Par sa richesse en phosphate, elle est très sensible au calcium, et comme pour αS1, la

caséineαS2 semble ne pas être en surface de la micelle.

2 . Les caséines β et γ :

La caséine ß :

Représentant 25 à 35% de la micelle, avec ses 209 AA et ses 5 groupements phosphates, elle

possède beaucoup d’analogie avec la caséine αS1.

Elle est sensible au calcium à température ambiante mais après déphosphorylation, la

molécule perd cette sensibilité et devient capable d’empêcher la précipitation de la caséine

αS1 par le calcium.

La caséine γ :

Il s’agit des fragments C-terminaux résultant de la protéolyse de la caséine ß par la plasmine.

3. La caséine κ :

Une grande majorité de cette caséine se trouve à la surface de la micelle, accessible à la

présure. Il s’agit d’une protéine de 169 AA, phosphorylée (Serine 149) comportant 2 variants

génétiques A et B. Elle comporte un constituant majeur non glycosylé (Fig.1) et des

constituants mineurs glycosylés dont la structure précise est élucidée (Eigelet al., 1984).

Cette caséine est insensible au calcium et stabilise les autres caséines phoshorylées vis à vis

de ce cation. La coagulation du lait se fait suite à la protéolyse de cette caséine par la présure

(ou chymosine : enzyme naturelle de la caillette du jeune bovin pré-ruminant) qui scinde la


9

molécule en deux parties : la partie N-terminale (1-105)ou paracaséine et le fragment C-

terminal (106-169) ou caséinomacropeptide (CMP) aux propriétés très contrastées.

Dans le caillé, seules sont récupérées les caséines αS1, αS1etß et la paracaséine k tandis que le

CMP se retrouve dans le lactosérum. Il est à noter que le CMP contient tous les glucides,

quand ils existent, sur les Thréonine 131, 133, 135 et 136 (variant A uniquement).

PyroGlu-Glu-Gln-Asn-Gln-Glu-Gln-Pro-Ile-Arg(10)-Cys-Glu-Lys-Asp-Glu-Arg-Phe-

Phe-Ser- Asp(20)

Lys-Ile-Ala-Lys-Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr(30)-Val-Leu-Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-

Gly-Leu(40)- Asn-Tyr-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Val-Ala-Leu (50)-Ile-Asn-Asn-Gln-

Phe-Leu-Pro-Tyr-Pro-Tyr (60)- Tyr-Ala-Lys-Pro-Ala-Ala-Val-Arg-Ser-Pro (70)-Ala-

Gln-Ile-Leu-Gln-Trp-Gln-Val-Leu-Ser (80)- Asp-Thr-Val-Pro-Ala-Lys-Ser-Cys-Gln-

Ala(90)-Gln-Pro-Thr-Thr-Met-Ala-Arg-His-Pro-His (100)- Pro-His-Leu-Ser-Phe-

Met-Ala-Ile-Pro-Pro (110)-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys-Thr-Glu-Ile-Pro (120)- Thr-

Ile-Asn-Thr-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro (130)-Thr-Ser-Thr-Pro-Thr-Ile*-Glu-Ala-Val-

Glu (140)- Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Ala*-Ser-Pro (150)-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-

Pro-Pro-Glu-Ile-Asn (160)-

PThr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Val-OH (169)

Glu (1)…..Phe (105) …..Met (106)-…. Val(169) (Action de la chymosine)

Figure 1 : Structure primaire de la caséine -CN B-1P (Eigel et al ; 1984).

Structure

La grande majorité des caséines sont présentes sous la forme de particules colloïdales

nommées micelles de caséine qui sont passablement stables. Les quatre principales façons

d’induire l’agrégation sont : l’utilisation d’enzymes protéolytiques, les conditions acides, les

traitements par la chaleur.

Modèle avec sous-unités

Le modèle avec sous-unités, présenté à la Figure 2, suggère que les sous-unités n’étaient pas

toutes de même composition mais que certaines étaient plus riches en κ-CN et étaient situées


10

en surface de la micelle. Finalement, Schmidt (1982) précisa que les sous-micelles étaient

reliées par des agrégats de Ca9 (PO4)6.

Dans le modèle actuel, les micelles sont en fait composées de sous-unités comprenant de 10 à

100 molécules de caséines et nommées sous-micelles. Les sous-micelles sont reliées entre

elles par des ponts phosphate de calcium. La composition des sous-micelles au centre et en

périphérie est différente. En effet, les caséines β et αs1 sont plus présentes au centre de la

micelle et forment le cœur hydrophobe alors que la partie externe, davantage hydrophile, est

formée de caséine αs1, αs2 et κ (Amiot et al., 2002).

Figure 2 : Modèle de micelle de caséine avec sous-unités (Amiot et al., 2002).

I.2.4.1.2 Propriétés des caséines :

pHi et charge électrique :

Les groupements acides libres des résidus glutamyle, aspartyle et phosphoryle en nombre

supérieur aux groupements basiques libres –NH des lysines et autres acides aminés diaminés,


11

confèrent à la caséine entière un pHi de 4.65, une charge négative et des propriétés acides

(réaction avec les métaux alcalino-terreux).

Propriétés associatives des caséines :

A pH = 7, lorsqu’on élève la température, les caséines ß donnent des polymères d’une

vingtaine à une trentaine d’unités, les différentes molécules étant unies par des liaisons

hydrophobes. De plus, des polymères résultent de liaisons disulfures S-S intermoléculaires.

Le Ca+2

complexe les molécules αs1, αs2, ß et diminue ainsi leur charge, leur hydrophilie et les

insolubilise (Rattray et al., 1997).

Propriétés des différentes fractions caséiniques de la micelle

Les caséines ont un certain nombre de caractères communs, la présence de phosphore sous la

forme de groupements phosphoséryls, la forte proportion de résidus apolaires. Elles se

distinguent les unes des autres par le nombre de groupements phosphoséryls, la présence ou

non de cystéine, la présence ou non de glucides, leur caractère plus ou moins hydrophobe.

La présence des groupements phosphoséryls confère aux caséines une très grande affinité vis-

à-vis du calcium, du magnésium et des oligoéléments. Dans le cas des caséines αs1, αs2, et β,

qui sont hautement phosphorylées, les sites phosphorylés sont en majeure partie groupés, ce

qui a pour conséquence de créer dans la chaîne peptidique des zones à caractère acide et

hydrophile très marqué.

Tableau 4 : Caractéristiques physico-chimiques des caséines (Creamer, 2002).

Caractéristiques Caséine-αѕ1 Caséine-αѕ2 Caséine-β Caséine-κ

Poids moléculaire (Da) 236172 25230,0 23984,8 19007,0

Conc. g/l de lait 10,25 2,75 9,62 3,5

Nombre d’acides aminés 199 207 209 169

Présence de glucides - - - +

Sensibilité au Ca++

++ +++ + -

Les différentes formes d’un type de caséine se distinguent par leur composition, en particulier,

le nombre de groupements phosphate (Mathieu, 1998 ; Creamer, 2002).


12

La caséine k, bien que non majoritaire dans la micelle est la protéine laitière de loin la plus

étudiée car elle détient le rôle clef dans la coagulation du lait par la présure. Le variant

génétique A est le plus fréquemment rencontrée dans le lait (75 à 85 % des cas). La liaison

peptidique 105-106 entre le résidu phénylalanyl et le résidu méthionyl est la liaison

hydrolysée spécifiquement par la chymosine après emprésurage du lait. La partie qui

correspond au glycomacropeptide (106-169) est de nature très hydrophile et donne un

caractère très amphiphile à la protéine.

La partie N-terminale (1-105) est légèrement cationique et très hydrophobe. Lors de

l’hydrolyse par la chymosine, la para-caséine k (1-105) reste accrochée à la micelle ; la

micelle en perdant son pôle hydrophile stabilisant, précipite. De toutes les caséines, c’est la

seule qui soit glycosylée. Les sites possibles de glycosylation ont été déterminés comme étant

situés sur les résidus de thréonine 131, 133, 135, et 136 ( Creamer, 2002).

Le calcium et le phosphate sont les constituants inorganiques majeurs de la micelle. Le

calcium est en partie (environ 1/3) directement fixé sur les caséines, essentiellement sur les

groupements esters phosphoriques (Brule et al., 1997). Le phosphore lié aux résidus sérine,

appelé phosphore organique, représente environ 40% du phosphore de la micelle. L’autre

fraction du calcium est à l’état de phosphate de calcium colloïdal (PCC) présent en petits

amas sphériques d’un diamètre proche de 1nm et de composition Ca9(PO4)6 (Schmidt,1982).

I.2.4.1.3 Protéines sériques

La fraction des protéines sériques englobe toutes les protéines solubles à pH 4,6. La ß-

lactoglobuline, l’α-lactalbumine, la bovine sérum albumine, les immunoglobulines, la

lactoferrine représentent plus de 90% des protéines sériques totales.

Ce sont majoritairement des protéines globulaires présentant une grande sensibilité aux

traitements thermiques. Elles sont globalement riches en acides aminés soufrés et possèdent

des résidus tryptophane leur conférant une excellente valeur nutritionnelle (Jeantet et al.,

2007).

I.2.4.2 Matières azotées non protéiques

De nombreuses substances azotées restent en solution dans les conditions de précipitation des

protéines du lait : acidification, élévation de la température ou addition de présure ; leurs


13

molécules ne s’agrègent pas mais demeurent séparées par l’eau. Elles ne précipitent pas sous

l’action de l’acide trichloracétique (TCA) dans les proportions de 12 g pour 100g. Bien que

contenant de l’azote, ce ne sont pas des protéines ; elles sont dites non protéiques (Mathieu,

1998).

II. Généralités sur les protéases

II.1 Définition

Les protéases ou peptidases sont des enzymes protéolytiques qui catalysent l´hydrolyse de

liaisons peptidiques. Dans certains cas, les enzymes sont hautement spécifiques et hydrolysent

une unique liaison peptidique d´une protéine donnée. Dans d´autres cas, les peptidases

hydrolysent plusieurs liaisons peptidiques qui présentent une séquence ou conformation

déterminée (Hartely, 1960).

Les protéases sont nombreuses, représentant environ 2% de tous les produits géniques

(Rawlings et Barrett, 1994) et environ 10% des enzymes réunies dans la liste « EC ».

Les protéases sont la seule classe d’enzyme qui occupe une position centrale par rapport à leur

application dans les domaines physiologique et commercial. Les progrès des techniques

analytiques ont démontré que les protéases induisent des modifications hautement spécifiques

et sélectives des protéines : comme l’activation de la forme zymogène par protéolyse, la lyse

des caillots des fibrines (coagulation du sang), la transformation et le transport des protéines

secrétées à travers les membranes (Rao et al., 1998).

II.2 Classification

Selon la nomenclature de l’Union internationale de Biochimie et Biologie moléculaire, les

protéases sont classées dans le sous-groupe 4 du groupe 3 des hydrolases. Cependant elles ne

se soumettent pas facilement à ce système de classification à cause de la complexité de leur

structure et leurs mécanismes d’action. Récemment, les protéases sont classées sur la base de

trois critères majeurs : le type de réaction à catalyser, la nature chimique du site catalytique et

l’évolution du site de référence.


14

II.2.1 Selon le mode d’attaque de la chaine polypeptidique

En fonction de leur mode d’attaque, les protéases sont divisées en deux groupes :

Les exopeptidases qui réalisent une hydrolyse à partir des extrémités N-terminale, ou

C-terminale des peptides et libèrent soit un unique résidu d’acide aminé, soit un

dipeptide ou un tripeptide (Scriban, 1999 ; Rao, 1998).

Les Endopéptidases qui hydrolysent une liaison peptidique interne.

II.2.2 Selon le pH d’activité

Selon ce paramètre, les enzymes protéolytiques de différentes origines sont classées en trois

groupes: les protéases acide, neutre et alcaline (Sumantha et al., 2006).

II.2.3 Selon la nature de résidu impliqué dans le site actif

Certains chercheurs ont développé une nouvelle approche de classification des endopeptidases

en 5 groupes distincts, sur la base de leur site actif et leur sensibilité à différents inhibiteurs. Il

existe les endopeptidases à serine, à cystéine, acide aspartique, à métal et à thréonine.

II.2.3.1 Protéases à serine

Les protéases à serine sont très répandues dans la nature aussi bien chez les eucaryotes, que

chez les bactéries et virus. Leur mécanisme catalytique implique la présence de groupement

serine dans leur site actif, ce dernier agit comme un nucléophile qui attaque alors une liaison

peptidique. Les protéases à serine sont classées en 2 superfamilles ; chymotrypsine et

subtilisine (Barrett, 1994).

Les protéases appartenant à la famille S1 (chymotrypsine), sont rencontrées chez les micro-

organismes procaryotes et eucaryotes, les plantes et les animaux vertébrés tandis que celles

appartenant à la famille S8 (subtilisine) sont uniquement rencontrés chez les bactéries. La

structure tridimensionnelle est différente pour ces deux familles mais elles possèdent la même

géométrie du site actif et le mécanisme catalytique se déroule de la même manière (Barrett et

Rawlings, 1995).

Les protéases à serine sont actives à pH neutre et alcalin avec un optimum entre 7 et 11, leur

poids moléculaire varie entre 18 et 35 kDa. Les pH isoélectriques des protéases à serine sont

généralement entre 4 et 6.


15

Les protéases à serine sont inhibées irréversiblement par le diisopropylfluorophosphate

(DFP).

II.2.3.2 Protéases à cystéine

Les protéases à cystéine sont présentes chez les microorganismes, les plantes et les animaux.

Leur activité dépend du site catalytique qui est composé de cystéine et d’histidine dont l’ordre

diffère entre les familles. Elles sont généralement actives seulement en présence d’agents

réducteurs comme le cyanure et la cystéine. Selon la spécificité de leurs chaines, les protéases

à cystéines sont divisées en : papaïne, trypsine, acide glutamique spécifique et autres

(Barrett, 1994).

La majorité des protéases à cystéine présente un pH optimum à la neutralité et peu d’entre

elles sont actives à pH acide. Elles sont sensibles aux agents sulfidryl, mais ne sont pas

affectées par le DFP, et le chélateur métallique (Rao et al., 1998).

II.2.3.3 Protéases à acide aspartique

Elles sont communément connues comme des protéases acides, ce sont des endopeptidases

qui dépendent de la présence d’un résidu aspartyl pour leurs activités catalytiques. Les

protéases acides sont regroupées en trois familles nommées : pepsine, rétropepsine et les

enzymes de rétrovirus (Hartley, 1960; Barrett, 1995).

La majorité des protéases à acide aspartique montre une activité maximale à faible pH (3 à 4)

avec un pH isoélectrique dans l’intervalle est de 3 à 4,5. Leurs masses moléculaires varient de

30 à 45 kDa.

Les protéases à acide aspartique sont inhibées par la pepstatine.

La protéase à aspartyl d’origine microbienne peut être divisée en deux groupes :

La pepsine comme les enzyme produite par Aspergillus, Penicillium, Rhizopus et

Neurospora (Kumar et al., 2005).

La rénine comme les enzymes produites par Endothia et Mucor sp (Sardinas, 1968 ;

Escobar et Barnett, 1993).


16

II.2.3.4 Les Métalloprotéases

Les métalloprotéases sont le groupe le plus diversifié. Il se caractérise par la présence d’ions

métalliques divalents (généralement le zinc) dont le rôle est important pour leurs activités.

Elles incluent des enzymes de différentes origines dont les plus importantes sont : les

collagénases des organismes supérieurs, les toxines hémorragiques du venin de serpent et la

thermolysine (Barrett et al., 1995).

II.2.3.5 Protéases à thréonine

Ce nouveau type catalytique ná été découvert que très récemment grâce aux recherches

effectuées sur les protéasomes. Un protéasome est, en effet, un complexe de protéases

impliqué dans la dégradation protéique. Il est dúne grande importance pour la croissance et la

viabilité de la cellule en raison de ses fonctions dans le cycle mitotique et dans le contrôle de

la demi-vie de la plupart des protéines cellulaires.

La recherche chez les procaryotes de particules ressemblant aux protéasomes eucaryote a

conduit à la découverte dún complexe protéolytique chez Thermoplasma acidophilum.

II.3 Applications alimentaires

II.3.1 Industrie laitière

L’application principale des protéases dans l’industrie laitière est la préparation du fromage.

Les enzymes coagulant le lait sont classées dans trois principaux groupes : la présure animale,

les coagulants d’origine microbienne et la chymosine génétiquement modifiée. Les deux

premiers groupes proviennent de la classe des protéases acide à aspartique dont le poids

moléculaire varie de 30 à 45 kDa (Foltman, 1971; Fox, 1995).

Des recherches intensives dans ce domaine visent à produire des enzymes qui sont

complètement inactivées à la température de pasteurisation et contenant un faible taux de

protéases non spécifiques. Les protéases produites : GRAS (Generally Recognized As Safe)

par Mucor miehei, Bacillus subtilis et Endothia parasitica, remplacent graduellement la

chymosine dans la production de fromage (Sardinas, 1968 ; Fernandez-Lahore et al., 1998;

Escobar et Barnett, 1993 ; Shieh et al., 2009).


17

II.3.2 Industrie de panification

La farine de blé est le composant principal dans l’industrie de panification. Il contient des

protéines insolubles appelées gluten qui détermine les propriétés du pain. Les endos et les

exopeptidases d’Aspergillus oryzae sontutilisées pour modifier par protéolyse, le gluten de la

farine du blé (Bourgeois et al., 1989).

Le traitement enzymatique du pain par les protéases améliore son extensibilité, réduit le temps

de mélange et augmente son volume.

II.3.3 Synthèse d’aspartame

L’utilisation d’aspartame comme un édulcorant artificiel hypocalorique est approuvée par la

F.D.A

L’aspartame est un dipeptide composé d’acide aspartique et de l’ester méthyle de L-

phénylalanine. La configuration L des deux acides aminés est responsable du goût sucré de

l’aspartame, mais la maintenance de cette configuration reste un processus couteux. Les

protéases sont des enzymes hydrolytiques, qui catalysent la réaction reverse sous certaines

conditions contrôlées. L’immobilisation de la thermolysine de Bacillus thermoproteolyticus

est utilisée pour la synthèse enzymatique d’aspartame. Toya Soda(Japon) et DSM (The

Netherland) sont les principaux producteurs industriels d’aspartame.

II.3.4 Préparation des produits à base de soja

Le soja est une source d’aliment riche du fait de sa contenance en protéines de bonne qualité.

Les protéases sont utilisées depuis longtemps pour la préparation de la sauce de soja et

d’autres produits à base de soja. Les protéases neutres et alcalines d’origine fongique jouent

un rôle important dans la préparation de la sauce de soja. Les modifications protéolytiques des

protéines de soja conduisent à l’amélioration de leurs propriétés fonctionnelles. Du traitement

des protéines de soja avec les protéases alcalines à pH8 résultent un bon rendement en

protéines, des hydrolysats très solubles et faible amertume (Bourgeois et al., 1989 ; Botton et

al., 1990 ).


18

II.4 Applications médicales et pharmaceutiques

La grande diversité et spécificité des protéases a été exploitée pour le développement d’agents

thérapeutiques. L’administration orale de protéases d’Aspergillus oryzae améliore la digestion

suite à la déficience de certaines enzymes lytiques. L’utilisation de la subtilisine en

combinaison avec les antibiotiques pour le traitement des brûlures et des blessures.

L’asparaginase isolée d’Escherichia coli est utilisée pour éliminer l’asparagine du sang

leucémique. Et la protéase alcaline de Conidiobolus coronatus est utilisée pour remplacer la

trypsine dans les cultures de cellules animales (Chiplunkar et al., 1985)

II.5 Autres applications

II.5.1 Détergents

A l’heure actuelle, les protéases sont ajoutées comme des ingrédients clé dans la formulation

des détergents pour usage domestique (détergents à lessive, détergents à vaisselle), les

produits de nettoyage pour usage industriel et les produits de nettoyage pour les lentilles

cornéennes et les appareils dentaires. Cependant, le marché le plus important au niveau des

détergents est de loin celui des détergents à lessive. Une protéase détergente idéale doit avoir

une large spécificité de substrat et demeurer stable dans l’environnement hostile de la

machine à laver (température élevée et pH alcalin) (Rao et al., 1998). Bien que la pepsine soit

utilisée depuis 1913, la plupart des protéases ajoutées dans les détergents sont produites par

des souches de Bacillus (Gupta et al., 2002).Clear-lens Pro®, une marque de Novozyme

Danemark est utilisée pour enlever les dépôts à base de protéines ainsi que les films

protéiniques présentent dans les lentilles cornéennes (Sumantha et al., 2006).

II.5.2 Tanneries

Les protéases sont utilisées en tannerie depuis le début du siècle dernier pour leurs capacités à

libérer les poils et la laine. Les trois traitements de la peau à tanner (le reverdissage, le

délainage et le confitage) sont susceptibles de solutions enzymatiques de protéases produites

par B. licheniformis, A. oryzae, B. amylolyquefasciens. Jusqu'à présent, l’usage des protéases

a été limité car leur emploi est souvent plus coûteux que l’utilisation de produits chimiques.

Par contre, l’emploi de produits chimiques comporte plusieurs inconvénients (Rao et al.,

1998; Gupta et al., 2002).


19

II.5.3 Traitement de divers rejets

Les protéases sont considérées aussi comme moyen efficace pour le traitement des rejets

riches en protéines. La protéase neutre de B. subtilis peut être également utilisée pour le

décreusage de la soie naturelle. Les protéases sont employées aussi avec des mélanges

d’enzymes hydrolytiques pour dégrader les polymères constitutifs de la matière végétale

servant pour l’alimentation animale (Aviron-Violet et al., 1982). Une autre utilisation des

protéases neutres est la récupération d’argent à partir des films photographiques par hydrolyse

de la gélatine (Sumantha et al., 2006).

II.5.4 Législation

D’un point de vue réglementaire, comme tout additif l’emploi des enzymes doit être soumis à

une règlementation stricte qui permet d’éviter tout risque de toxicité (Noor-Develliet et al.,

1983).

Le milieu de culture utilisé dans le cas des enzymes microbiennes ne doit laisser aucun résidu

nocif ou toxique ou de substances cancérigènes. Les préparations enzymatiques

commercialisées ne doivent pas contenir de contaminants microbiens. Les agents de

stabilisation et de dilution doivent être dans un état d’innocuité. En ce qui concerne les

chymosines de fermentation elles suivent l’arrêté du 28 avril 1998 qui concernent Escherichia

coli k12 renfermant un gène de prochymosine A de veau, Aspergillus niger var. awamoriet

Kluyveromyces lactis renfermant un gène de prochymosine V de veau. Elles sont utilisables

pour la fabrication des fromages à l’exception des fromages bénéficiant d’une appellation

d’origine.

III. Les enzymes coagulant le lait

III.1 La présure

III.1.1 Origine et dénomination

La présure de veau est la préparation coagulante traditionnelle la plus utilisée pour la

coagulation du lait (Alais, 1984 ; Wigley, 1996). De moindres quantités sont obtenues à partir

de l’estomac de chevreau et d’agneau. La dénomination présure est réservée à l’extrait

coagulant provenant de la troisième poche de l’estomac appelée abomasum ou caillette. Elle


20

renferme deux enzymes actives. La chymosine est la protéase majeure responsable d’au moins

85% de l’activité coagulante totale ; le complément est apporté par la pepsine. On observe les

plus fortes teneurs en chymosine chez les animaux non sevrés ; dès que la ration alimentaire

renferme des aliments solides et que le jeune animal commence à brouter, la proportion de

chymosine chute très fortement ; à l’inverse, la pepsine devient dominante et caractérise la

sécrétion stomacale du mammifère adulte (Cogitore, 1982).

III.1.2 Propriétés et mode d’action

La chymosine et la pepsine sont des holoprotéines dont le poids moléculaire est voisin de

30 000 Da. Ce sont des enzymes qui ont une double action sur la caséine.Elles ont une

activité élevée et spécifique sur la caséine Kappa qui conduit à la libération du

caseinomacropeptide et à la déstabilisation micellaire.Elles ont une activité faible de

protéolyse générale sur les autres fractions de la caséine. Celle-ci intervient dès la mise en

coagulation et se poursuit pendant l’affinage du fromage.Comme pour toutes les préparations

enzymatiques, l’activité protéolytique de la présure est fortement influencée par les facteurs

de milieux en particulier le pH et par la température.

- Influence du pH :

Le pH optimum d’activité coagulante de la présure sur le lait est voisin de 5,5. Au pH du lait

frais (pH6,65) l’activité est modérée. En fabrication fromagère, on a intérêt à acidifier

légèrement le lait pour accroitre l’activité enzymatique.

- Influence de la température :

La température optimum d’activité de la présure se situe à 40-42°C. En dessous de 20°C,

l’activité devient faible. L’inactivation thermique totale de l’enzyme se produit à 65°C.

En fromagerie classique les températures du lait au moment de l’emprésurage se situent dans

la fourchette 20-40°C.

- Influence de la concentration en présure :

Il existe une règle approximative de proportionnalité entre la dose de présure et l’inverse du

temps de floculation : plus la dose est forte plus le temps est court.


21

- Influence de la concentration en calcium :

La présence d’ions Ca++

est indispensable au déroulement de la phase secondaire. Toute cause

susceptible de faire baisser la teneur de ces ions dans le lait entrave la coagulation. Ces causes

peuvent être naturelles.

Un traitement thermique sévère insolubilise le calcium : il est nécessaire de restaurer la charge

en ions calciques par un apport de CaCl2 lorsque ces laits sont destinés à être coagulés par la

présure.

L’apport de calcium soluble modifie les équilibres salins vers les formes insolubles, l’addition

de CaCl2 provoque en outre une légère baisse de pH favorable à l’action présure. Ce

phénomène résulte d’un échange entre ions H+ fixés sur les protéines et le calcium incorporé.

III.1.3 Les composants de la présure

III.1.3.1 La chymosine

La chymosine est la protéase majeure responsable d’au moins 85% de l’activité coagulante

totale (Ramet, 1997). Elle est synthétisée sous forme de prochymosine, activée sous l’action

du suc gastrique. Elle subit alors une conversion en chymosine active.

La chymosine est une holoprotéine, de poids moléculaire voisin de 30 kDa (Scriban, 1993).

Elle est stable entre pH 5 et 6 ; son activité est optimale à pH voisin de 5 ; elle est inactivée à

pH 7,5 et est dénaturée à pH 8. Sa température optimale d’action est voisine de 40°C.

L’inactivation thermique a lieu dès 50°C, elle est totale à 61°C (Lenoir et al, 1985 ; Scriban,

1993).

Production de la chymosine fermentaire

Grâce au développement du génie génétique, il est actuellement possible de produire de la

chymosine à partir de micro-organismes (Alais et Linden., 1997 ; Collin et al., 1997 ; Rao et

al., 1998 ; Beldarrain et al., 2000 ; Munoz et al., 2004).

La chymosine fermentaire résulte du clonage du gène responsable de la production de la

chymosine à partir de l’estomac de veau sur certains micro-organismes. Les plus utilisés sont :

Escherichia coli, Kluyveromyces et Aspergillus.


22

Cette méthode constitue l’une des voies porteuses d’espoir pour la synthèse d’enzymes

utilisables dans l’industrie laitière.

III.1.3.2 La pepsine

La pepsine est le constituant mineur de la présure dont la sécrétion gastrique ne devient

prépondérante qu’après sevrage (Ramet, 1997). Elle est produite sous forme d’un précurseur

inactif, le pepsinogène. Il passe par acidification sous la forme active : la pepsine de poids

moléculaire 35 kDa (Alais, 1984).

A l’opposé de la chymosine, la pepsine possède une activité protéolytique élevée et une faible

activité coagulante. D’après (Broome et Hickey, 1990), 20% de l’activité coagulante est

assurée par la pepsine dans la fabrication fromagère (Cheddar, Emmental,…).

La pepsine est relativement stable à des pH compris entre 5 et 5,5. Son activité enzymatique

est plus élevée entre pH 1 et 4 avec un maximum vers 1,8 et varie selon la nature du substrat.

C’est une enzyme thermosensible en solution après 55°C. Elle est dénaturée à des

températures à 70°C (Graiday, 1978).

Comme pour toutes les préparations enzymatiques, l’activité protéolytique de la présure est

fortement influencée par les facteurs de milieux en particulier par le pH et par la température.

L’activité la plus élevée se situe à pH 5,5 et à la température de 42◦C. De part et d’autre de ces

valeurs, l’activité décroit rapidement ; elle devient nulle au voisinage de 0◦C et vers 65

◦C.

En fromagerie, on règle l’action de la présure en ajustant les conditions de milieu à des

valeurs plus ou moins éloignées de ces optimums et en fixant la concentration enzymatique.

Ces paramètres sont particuliers à chaque famille de fromages (Eck et Gillis ,1997).

III.1.4 Obtention de la présure commerciale

Industriellement la présure est extraite par macération de morceaux de caillettes sèches de

veaux non sevrés, dans une saumure à 10% NaCl contenant des additifs nécessaires à la

préparation (telle que le phosphate disodique), à la conservation (les plus utilisés étant les

antiseptiques et les antifongiques) et à la coloration (caramel). Le jus brut est ensuite purifié

par diverses méthodes physico-chimiques.


23

Selon Goursaud (1999), il faut de 1 à 2 caillettes de 60 g pour obtenir 1L d’extrait

commercial au 10000e. Ce dernier, après ajustement avec de la saumure, contient alors 10 à

16% de NaCl. Il est de couleur jaune d’or.

Le mélange contient les deux enzymes : la chymosine et la pepsine bovine (Goursaud, 1999).

III.1.5 Propriétés spécifiques exigées des succédanés de présure

Les enzymes de remplacement de la présure doivent répondre aux critères suivants (Ramet,

1997) :

- Une bonne solubilité dans l’eau.

- Une odeur et une couleur faibles ou nulles.

- Une activité coagulante bonne et une durée de consommation raisonnable.

- Une absence de toxicité pour le consommateur et un degré de pureté élevé pour éviter tout

accident de prolifération de microorganismes indésirables.

- Les propriétés rhéologiques du coagulum doivent être évaluées après floculation de façon à

permettre le travail mécanique du gel dans les délais habituels.

- La synérèse du coagulum au cours de l’égouttage et les modalités de l’affinage devrait

permettre d’obtenir les caractéristiques usuelles des fromages dans un délai sensiblement égal

à celui de la présure.

- Les rendements fromagers doivent être très proches ou supérieurs à ceux révélés lors de

l’emploi de la présure.

III.2 Autres enzymes coagulant le lait

Les enzymes sont des catalyseurs biochimiques de nature protéique qui interviennent dans

toutes les réactions métaboliques énergétiquement possibles, qu’elles accélèrent par activation

spécifique dans des conditions douces de température et de pH.

Ce sont des outils clés de la biotechnologie et de la bio- industrie. Un grand nombre

d’enzymes protéolytiques ont la propriété de coaguler le lait (Tableau 5) (Mietton, 1991).


24

Les enzymes coagulantes, la présure ou ses substituts, sont des endopeptidases appartenant au

groupe des aspartyl protéases. Ces enzymes ont une double activité : l’une très spécifique sur

la caseine k, l’autre de protéolyse générale portant sur toutes les protéines, qui sont

susceptibles de se manifester aux cours de l’affinage des fromages.

La fabrication des fromages nécessite une phase de coagulation du lait qui permettra

l’expulsion (synérèse) d’une plus ou moins grande partie de l’eau et de matière soluble(le

sérum). On obtiendra ainsi un caillé ou fromage non affiné (Lenoir et al., 1983 ; Brule et

Lenoir, 1997).

De nombreuses protéases sont capables de provoquer la coagulation du lait, mais toutes ne

sont pas pour autant aptes à la fabrication fromagère car elles ne présentent pas les propriétés

biochimiques et technologiques requises (Ramet, 1997).

Les inconvénients majeurs de l’utilisation des protéases de remplacement sont dans certains

cas, la baisse du rendement fromager (Amiot et al., 2002).

Les protéases, en plus de leur activité coagulante, interviennent dans l’affinage des fromages.

(Mahaut et al., 2003).

En industrie laitière, le caractère fluctuant de l'approvisionnement en présure a conduit à

l'emploi de préparations enzymatiques d'origines diverses, coagulant le lait de façon analogue

à la présure (Guérard, 1987).

Des préparations enzymatiques coagulant le lait dans lesquelles la chymosine est remplacée

plus ou moins totalement par d'autres enzymes à mode d'action analogue.

Dans cette optique, un certain nombre d'enzymes ont été caractérisées.

Il s'agit toujours de protéases susceptibles d'attaquer les caséines du lait et plus

particulièrement la caséine k, dont la rupture d'une liaison peptidique particulièrement labile,

la liaison Phe105-Met106 provoque la coagulation du lait (Swaisgood, 1982).

Ces enzymes appartiennent au groupe des pepsines. La pepsine bovine, qui est assez proche

de la chymosine au plan de la structure primaire (Foltmann, 1970), est déjà présente dans la

présure avec la chymosine.


25

La présure est encore à l’heure actuelle la préparation la plus largement utilisée en fromagerie

(Choisy et al .,1997).

Tableau 5 : Origine de différentes enzymes utilisées pour coaguler le lait(Mietton, 1991):

ORIGINES ENZYMES

Animaux

Ruminants

-Veaux

-Agneaux

-chevreaux

-Bovins adultes

Monogastrique

-Porcs

Oiseaux

-Poulets

chymosine₊pepsine

chymosine₊pepsine

chymosine₊pepsine

chymosine+pepsine

Pepsine

Pepsine

Végétaux

-Figuier (suc)

-Ananas (tige)

-Chardon, artichaut

-Gaillet

-Courge…

Ficine

Broméline

Cardosines

Cyprosine

Moisissures -Endothiaparasitica

-Mucorpusillus

-Mucormeihei

-Aspergillus niger

Protéase

Protéase

Protéase

Protéase

Chymosine (génétique)

Levures -Kluyveromyces lactis Chymosine (génétique)

Bactéries -Echerichia coli

-Bacillus subtilis

Chymosine (génétique)

Subtiline(génétique)


26

III.2.1 Les enzymes coagulantes d’origine végétale

Contrairement à la présure qui est spécifique à la κ-caséine, les aspartyl-protéases des plantes

peuvent hydrolyser les caséines α, β et κ, ce qui provoque, une amertume et des défauts de

texture des fromages et qui limite leur utilisation industrielle. (Simöes et Faro, 2004).

Plusieurs préparations coagulantes sont issues du règne végétal et sont extraites par

macération de différentes parties de plantes supérieures (Ramet, 1997). L’utilisation de la

fleur de cardon comme agent coagulant a été considérée comme l’un des facteurs

déterminants de la qualité des fromages typiques portugais au lait de brebis (Agboola, 2002,

Zhao et al., 2003) l’extrait coagulant du Cynara cardunculus a fait l’objet de nombreuses

études (Macedo et al., 1993 ;Martin et al., 1996 ; Vioque et al., 2001).

Cependant il a été conclu que cet agent coagulant se caractérise par une activité protéolytique

excessive ce qui confère un goût amer au fromage. D’autres végétaux fournissent des

coagulases telles que les ficines extraites du latex du figuier, la papaine du papayer, la

bromelaine de l’ananas (Sardinas, 1968) etc… L’activité coagulante de ces préparations

végétales est très variable car elle est fortement influencée par l’état de maturité de la plante et

par les conditions de collecte et de stockage (Lopez et al, 1996). De ce fait, l’emploi de ces

protéases coagulantes est toujours resté limité aux aires locales de production (Eck, 1987).

Généralement, les protéases végétales sont rarement utilisées en industrie fromagère en raison

de leur activité protéolytique très élevée, qui se traduit par l’apparition d’un ensemble

d’inconvénients technologiques tels que (Alais, 1984) : mauvaise fermeté des caillés obtenus,

baisse du rendement fromager, apparition d’amertume.

Ces difficultés sont liées au fait que ces préparations brutes renferment souvent des mélanges

de plusieurs enzymes dont l’activité manque de spécificité sur la caséine k (Ramet, 1997).

Malgré les inconvénients évoqués précédemment, des études récentes ont été réalisés par

différents auteurs, qui approuvent quelques avantages aux protéases extraites des végétaux

(Tab 6). Ces dernières, sont plus stables à la chaleur par rapport aux protéases d’origine

microbienne et animale (Morsli, 1996).


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Tableau 6 : Plantes locales d’Algérie utilisées pour la coagulation du lait (Morsli, 1996)

Nom scientifique Nom vulgaire

Français Anglais Algérien

Bryoniadoïcajacq Bryone White bryony Tailoula /kerma beïda

Chrysanthemum

partheniumL.pers.

matricaire Fever few Mouniat

Conium maculatum L. Ciguë Hemlock Sikrane/Guebaba

Cucurbita pépo L. Citrouille Pumpkin Takhiart/ Garâa Kabouïa

Cucumis melo L. Melon ……. Feggouce/Betikha

Cucumis sativus L. Concombre Cucumber Takhiart/ Lekhiar

Cynara cardunculus

L.

Cardon Cardoon Thaga/ khorchef

Cynara humilisL. Cardon nain …….. Tharédouit/ Fegaa

Cynara scolymusL. Artichaut Artichocke Karnoune

Dipsacus sylvestris

Mill.

Cardére Teasel Tadjahnit-guizen/ denb-es-

sebaa

Ficus carica L. Figuier Figtree Taguérourt/ Kerma

Galium verum L. Gaillet Lady’sbedstraw Fouaoua sefra

Heracleum spondylum

L.

Berce Hogweed Aréoul

Malva sylevetris L. Mauve Common Amedjir/ Khobbeïza

Ricinus communis L. Ricin Casteroilseeds Akhilouane/ Kharoua

Silybum marianum L.

gaertn.

Chardon

Marie

Milk

thistle……….

Douj-n-ilou’man/ Chouket-el-

beïda

Senecio jacobaeaL. Séneçon Ragwort Debouz-el-arab

Salanum dulcamara

L.

Douce amére ………. Aouzizi/ H’LLOUA M’RRA

Urtica dioïca L. Ortie Stingingnettle Azedouf /Bouzegdouf


28

III.2.2 Les enzymes coagulantes d’origine animale

Des substituts de présure sont produits par plusieurs mammifères comme le chameau

(Elagamy, 2000 ; Siboukeur, 2005), le buffle (Mohanty et al., 2003)…et même par les

viscères de poissons (Guérard, 1987). L’étude comparative des activités coagulantes et

protéolytiques de ces enzymes a révélée qu’elles présentent des caractéristiques proches de

celles de la présure (Polaina et Mac Cabe, 2007).

De nombreuses protéases d’origine animale ont fait l’objet d’expérimentation en vue d’une

utilisation potentielle en fromagerie (Tab. 7). Cependant toutes ne sont pas pour autant aptes

à la fabrication fromagère ; seules les pepsines porcines et bovines présentent un intérêt

industriel (Eck, 1987).

Les pepsines ont une activité protéolytique assez voisine de celle de la chymosine ; leurs

sensibilités aux variations des facteurs de milieu sont semblables sauf pour l’effet pH ; elles

ont un caractère plus acide avec un optimum au voisinage de pH 1,5-2,0(Ramet, 1997).

Certains succédanés d’origine animale peuvent être considérés comme des produits de

remplacement acceptables de la présure de veau.

Plusieurs pepsines de poissons, tels que celles issues de:sardine (Noda et Murakami,1981),

morue d’Atlantique (Brewer et al, 1984) et requin (Nungaray et Legoffic, 1996) ont été

purifiées et partiellement caractérisées.

Les chercheurs sont également arrivés à extraire la pepsine à partir de la muqueuse gastrique

du phoque (Shamsuzzaman et Haard, 1985) et de l’estomac du lapin (Ramman, 1994)

L’obtention de la pepsine sous forme cristallisée à partir d’extraits de muqueuse gastrique

bovine a été réalisée pour la première fois par Northrop en 1929(Moll et Moll, 1998). La

deuxième enzyme gastrique obtenue sous forme cristallisée été la pepsine porcine et cela par

Herriot en 1938 (Banga-Mboko et al., 2002).


29

Tableau 7: Spécificité de quelques succédanés d’origine animale (Boudier, 1974)

Origine Enzyme Marque commerciale

Préparation de présure de veau Chymosine-pepsine Rennet Hansen

Présure de veau pur, cristallisée Chymosine Strersen (Bengeas)

Pepsine de porc Pepsine Pantex-peptilac (Hansen)

Pepsine de bœuf Pepsine Colepsine

Mélange enzymatique animal Chymosine Metroclot (Pfizer)

III.2.3 Les enzymes coagulantes d’origine microbienne

En pratique, l’utilisation des préparations enzymatiques microbiennes a été soumise à une

stricte réglementation, imposant des contrôles hygiéniques (liés à leur production et

extraction) et toxicologiques sévères, afin d’éviter tout risque de toxicité lié à la présence

d’antibiotiques et/ou d’aflatoxines (Noor-Devillietet al., 1983).On distingue deux catégories

de protéases microbiennes : les succédanés d’origine bactérienne et les succédanés d’origine

fongique.

D’origine bactérienne

Depuis une quarantaine d’années, une puissante industrie de transformations s’est développée

dans le monde. Elle produit des substances variées dont une grande partie d’enzymes qui

trouvent de nombreuses applications dans des secteurs industriels variés et en particulier des

protéases susceptibles de coaguler le lait.

Ce sont surtout les souches du genre Bacillus : Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus

polymixa et Bacillus coagulans, qui ont fait l’objet de plusieurs recherches pour la production

de coagulases. Leur utilisation demeure limitée par suite de réglementation stricte et leur prix

de revient. D’autre part, leur aptitude à la coagulation est meilleure que celle d’origine

végétale et moins bonne que celle des enzymes produites par les moisissures. Les caillés


30

obtenus manquent de cohésion du fait d’une trop forte activité protéolytique par comparaison

à la présure animale (Alais , 1984).

Selon Puhan et Irivine (1973 a et b) , des fabrications de fromages type cheddar canadien

avec la coagulase de Bacillus subtilis, en comparaison avec un fromage témoin fait avec la

présure traditionnelle, présentaient des différences notables de point de vue rendement

fromager et qualité organoleptique due à un degré excessif de protéolyse, corrigé par

acidification du lait préalablement à l’addition de l’enzyme au lait.

Un travail considérable a été réalisé dans la sélection de microorganismes capables de

produire des enzymes coagulantes. Plusieurs raisons sont à l’origine de cet intérêt.

Les enzymes microbiennes peuvent être produites en quantité pratiquement illimitée sans

qu’il y ait dépendance d’un approvisionnement en matière première. Le microorganisme utile

est cultivé sur un milieu spécifique de composition optimisée. Son cycle de développement,

limité à quelques heures ou quelques jours, est rapide comparativement à celui nécessaire à la

génération d’un animal ou d’une plante.

A la fin du cycle de développement du microorganisme, les enzymes sont extraites et

purifiées selon des techniques bien élaborées qui garantissent une composition constante. On

préfère sélectionner des microorganismes producteurs d’enzymes exo cellulaires plus faciles à

isoler du milieu de culture que les enzymes endocellulaires qui impliquent de réaliser une

rupture préalable des structures bactériennes pour libérer le composé actif.

En Algérie, (Matoub, 2000) a mis en évidence la possibilité d’obtenir une coagulase à partir

d’une souche locale de Bacillus subtilis sélectionnée (Lc33), mais leur utilisation n’a pas

dépassé le stade expérimental en raison de leur prix de revient et de la réglementation stricte.

D’origine fongique :

Actuellement, c’est sur les protéases d’origine fongique que l’on fonde le plus d’espoir.

Contrairement aux protéases bacteriennes, les protéases fongiques ont donné des résultats

meilleurs, souvent comparables à ceux obtenus avec la présure (Luquet ,1985).

Par ailleurs, certains auteurs (Green et Stackpoole, 1975 et Jarmulet al., 1982) ont démontré

l’efficacité d’utiliser une préparation fongique "Noury ou fromase"en mélangeavec la pepsine

dans la fabrication de fromage.


31

Plusieurs préparations sont déjà commercialisées sur le marché international et utilisées à plus

ou moins grande échelle selon les pays (Tab.8), elles proviennent de trois espèces de

moisissures (Alais ,1984 ; Green et Stackpoole , 1975 ; Berankovaet al., 1987) :

-Endothiaparasitica : moisissure parasite du châtaignier de laquelle, la firme américaine

"PFIZER" a extrait une préparation coagulante en poudre commercialisée sous le nom de

"sure-curd" et "suparen".

-Mucor pusillusLindt : moisissure banale mésophile du sol, de laquelle la firme

japonaise "MEITO-SANG YO" a extrait une préparation commercialisée par " NOURY".

-Mucor miehei : moisissure banale thermophile du sol dont quatre préparations

enzymatiques différentes sont exploitées (Awad et al., 1999).Il s’agit de :

Rennilase commercialisée par la firme danoise « NOVO ».

Fromase : commercialisée par la firme française « RAPIDASE ».

Marzyme commercialisée par la firme américaine « MARSHALL ».

Hannilase commercialisée par la firme danoise « HANSEN »

Ces préparations enzymatiques, ont été soumises à des contrôles hygiéniques et

toxicologiques sévères, afin de démontrer l’absence d’antibiotiques et d’aflatoxines (Noor-

Devilliet et al., 1983). Ainsi, il ressort d’après plusieurs recherches que les préparations issues

de Mucor miehei, sont celles qui se rapprochent le plus de la présure animale (Alais et

Lagrange, 1972). Cité par Scriban (1993), il confirme qu’il est parfaitement possible grâce à

l’utilisation d’enzyme extraite de Mucor miehei (solution Rennilase), de fabriquer des

fromages d’excellentes qualités en leur adoptant les processus technologiques requis.

Parmi les substituants de la chymosine,les enzymes de Mucor pusillus et de M. miehei ont

connu le plus large développement. De par ses propriétés, la protéase de M. miehei se

rapproche le plus de la présure animale, notamment pour ce qui concerne le ratio activité

coagulante/ activité protéolytique (Joyeaux, 1982).

De plus, les enzymes fongiques se caractérisent par une stabilité thermique analogue à celle

de la présure (Goursaud, 1993).


32

III.2.4 La chymosine produite par génie génétique

Les méthodes modernes du génie génétique ont été récemment appliquées à la production de

chymosine par des micro-organismes clonés par le gène induisant l’expression de la

prochymosine. Actuellement, plusieurs préparations commerciales sont disponibles sur le

marché (Maxiren, Chymax, Chymogen,…).

La présure bovine recombinante est produite en utilisant comme hôtes les espèces

microbiennes suivantes : Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger

et Trichoderma reesei. (Mohantyet al., 1999). Par ailleurs, la protéase recombinante

d’agneau a été produite par Rogelj et al. (2001) en utilisant E.coli.

La composition de ces préparations diffère de celle de la présure par l’absence de pepsine.

L’analyse biochimique fine montre une identité absolue entre les isomères de la chymosine

naturelle et celles produites par les micro-organismes recombinés. L’activité protéolytique

mesurée sur les différentes fractions de la caséine est également rigoureusement la même.

Sur le plan technologique, les essais nombreux et variés de fabrication de fromages réalisés

dans le monde indiquent qu’aucune différence majeure ne peut être détectée entre les produits

obtenus avec les chymosines génétiques et la présure traditionnelle en ce qui concerne les

modalités de la coagulation, de l’égouttage et de l’affinage, et les caractéristiques

organoleptiques(Ramet, 1997). Plusieurs préparations commerciales sont disponibles sur le

marché.

Tableau 8 : Préparations commerciales d’origines fongiques (Ramet, 1997).

Microorganisme recombiné Société productrice Nom de préparation

Kluyveromyceslactis

Kluyveromyceslactis

Aspergillus awamori

Gist brocardesn.v (NL)

Pfizer Inc (U.S.A)

Ch. hansen Lab (DK)

Maxiren

Chymax

chymogen


33

III.3Action des enzymes coagulantes sur les caséines du lait

Le site principal pour la réaction de coagulation est la liaison Phe105-Met106 de la caséine-ĸ.

D’une manière générale, les principales protéases utilisées pour la coagulation du lait

hydrolysent la même liaison peptidique (Phe105-Met106), à l’exception de la protéase de

Cryphonectria parasitica qui hydrolyse la liaison Ser104-Phe105 (Lucey, 2002).Toutefois,

l’attaque d’autres sites dans la caséine ĸ, la caséine αs et β se produit et elle est généralement

indésirable. Cette action est souvent qualifiée d’action protéolytique générale ou non

spécifique. Les protéases acides utilisées en fromagerie bien qu’elles présentent généralement

une grande spécificité dans leur action, exercent une activité protéolytique non spécifique.

Cependant, l‘extension de la protéolyse diffère d’une enzyme à une autre. La chymosine est la

protéase qui donne le minimum de protéolyse, L’attaque de la caséine β et de la caséine αs1

par la chymosine est plus lente que l’attaque spécifique de la caséine ĸ (Dalgleish, 1982).

Ainsi une telle action se produit avec une vitesse minimale au cours de la coagulation. Les

substituts de la présure sont généralement choisis par rapport à leur activité coagulante élevée

combinée et à une activité protéolytique générale limitée.

Une activité protéolytique non-spécifique élevée au cours de la coagulation peut donner

naissance à des peptides qui seront perdus en solution provoquant la diminution du rendement

fromager. D’une manière générale la majorité des enzymes coagulantes montre une activité

protéolytique plus importante que la chymosine lorsque la caséine est prise comme substrat.

Cependant les différences sont moins évidentes lorsqu’elles sont comparées dans le lait

écrémé ou durant la fabrication du fromage. Toutefois, il a été démontré que la plupart des

enzymes coagulantes provoquent des pertes dans le rendement comparé à la présure.

(Barbano et Rasmussen, 1992).

L’activité protéolytique durant l’affinage du fromage qui est due à la quantité d’enzyme

retenue par le caillé, joue un rôle essentiel dans la dégradation des caséines. La quantité

d’enzyme retenue par le gel est influencée par la température de coupe du coagulum et le pH

au cours du drainage du lactosérum. En effet, l’abaissement du pH augmente le taux

d’adsorption de la chymosine sur les micelles de caséine. Toutefois, le taux retenu pour les

protéases fongiques ne semble pas influencé par l’abaissement du pH (Ramet, 1997).


34

L’activité résiduelle est également liée à la stabilité thermique de l’enzyme coagulante

employée. La protéase de Cryphonectria parasitica, la pepsine bovine, la chymosine, les

protéases de Rhizomucor pusillus et Rhizomucor miehei montrent une meilleure stabilité

thermique .D’autre part, le taux d’hydrolyse des fractions caséiniques, au cours de l’affinage,

dépend fortement du taux d’enzyme coagulante employée

La caséine αs est hydrolysée par la chymosine au niveau de la liaison Leu192-Tyr193, alors

que la caséine αs1 est hydrolysée au niveau des liaisons Phe23- Phe24 ou bien Phe24-Val25.

L’hydrolyse de la caséine αs1 par la chymosine est beaucoup plus rapide que celle de la

caséine αs. La formation du goût amer est due à l’action successive des enzymes coagulantes

et des protéases microbiennes des cultures employées dans l’affinage, sur les caséines.

En effet, il y a formation de peptides de taille moyenne sous l’action des enzymes coagulants.

Ces peptides sont ensuite hydrolysés à leur tour par les protéases microbiennes en peptides de

bas poids moléculaire responsables d’amertume (Sousa et al., 1997).

La majorité des enzymes coagulantes employés présentent la même spécificité que la

chymosine au niveau de la caséine α et la caséine β en attaquant les mêmes liaisons

précédemment citées, cependant, avec une vitesse d’action variable.

La pepsine bovine et la protéase de Rhizomucor miehei hydrolysent la caséine β plus

lentement que la chymosine, alors que la protéase de Cryphonectria parasitica et celle de

Cyanara cardunculus montrent la plus grande activité protéolytique en attaquant plus

rapidement la caséine β (Barbano etRasmussen, 1992).

La pepsine de poulet semble attaquer plus rapidement la caséine αs comparée à la présure.

Du cheddar préparé à l’aide de pepsine de poulet a montré un taux de protéolyse et

d’amertume plus élevé que celui préparé par la présure. (Green et al., 1977). Cependant,

l’utilisation de la pepsine de poulet dans la fabrication de certains fromages à pâte cuite tels

que "Emmental" et "Kashkaval" a donné des résultats satisfaisants

Cela est due probablement au fait que la quantité d’enzyme résiduelle maintenue par le

coagulum a été détruite par le chauffage au cours de l’étape de cuisson. Ceci indique la

possibilité de l’emploi de la pepsine de poulet dans la fabrication de fromages à pâte cuite.

Son emploi pour les fromages à pâte fraîche, qui ne subissent pas d’affinage, semble


35

également possible du fait que la protéolyse au cours de cette étape est évitée. (Sousa et al.,

2002).

IV. Le fromage

IV.1 Généralités

Non seulement le lait se consomme à l’état nature, il peut également subir différentes

biotransformations qui contribuent à élargir considérablement ses qualités sensorielles et

nutritionnelles. L’un des dérivés de ces transformations est le fromage (Henri et al., 2008).

Très vite, l’homme a compris que le lait produit par les animaux pouvait constituer une partie

de son alimentation. Lorsqu’il a voulu le conserver il s’est heurté à sa fragilité. En effet, de

par sa composition favorable au développement de nombreux micro-organismes qui peuvent

l’altérer et le déstabiliser, il change d’aspect. Il se transforme en gel qui laisse s’échapper un

liquide clair de couleur jaunâtre.

En ce faisant, les éléments les plus nutritifs se retrouvent sous certaines conditions en une

masse acide de plus longue conservation que le lait. Celle-ci peut évoluer vers des produits

possédant des gouts différents et variés.

L’origine exacte de la transformation du lait est incertaine. On s’entend pour dire que le

fromage serait originaire du sud-ouest asiatique et daterait d’environ 8000 ans. Les Romains

auraient stimulé le développement de nouvelles variétés durant leur invasion de l’Europe

entre 60 av.j-c.et 300 apr.j.c. (St-Gelais et Tirard-Collet, 2002).

Progressivement, des techniques de transformation se sont développées, souvent autour de

pratiques régionales guidées par la nature du lait disponible, les habitudes alimentaires et le

contexte socioculturel. L’accumulation des connaissances en science du lait et la maitrise des

procédés de transformation font qu’aujourd’hui on dénombre de très nombreuses variétés de

fromages possédant chacune sa propre originalité.

Il est d’usage, pour les comparer ou pour en faciliter le commerce, de les classer en grandes

catégories selon différents critères tels que l’espèce animale, la teneur en eau, le degré

d’affinage, le type de croutage, les moisissures apparentes, la texture, les techniques de

fabrication.


36

La fabrication de fromage par la méthode classique comporte trois phases successives : la

coagulation, l'égouttage et l’affinage.

IV-2 Différentes étapes de la transformation du lait en fromage

Préparation

-standardisation

-maturation

Physique

Biochimique

Micro-organismes

Coagulant Coagulation = changement d’état

Formation d’un réseau

Égouttage= concentration

Elimination de lactosérum

Sortie lactosérum -décaillage

Intragranulaire -brassage

(En cuve et moule) -(chauffage)

-acidification

intergranulaire -retournements

(En moule) -(pressage)

Salage modification des constituants

Affinage

Figure 3 : Les différentes étapes de la fabrication d’un fromage

Lait

Lactosérum

Caillé

Fromage affiné

Gel


37

IV.3 Coagulation

La coagulation du lait est une étape importante dans le processus de fabrication du fromage. Il

s’agit de la transformation du lait liquide en un gel, appelé aussi coagulum ou caillé qui, après

un certain nombre de transformations, deviendra un fromage.

La coagulation peut être obtenue par abaissement du pH (acidification), par action des

enzymes coagulantes ou par action mixte.

On distingue donc trois types de coagulation.

IV.3.1 Coagulation acide

L’acidification du lait peut conduire suivant les conditions, soit à un précipité de caséine, soit

à la formation d’un gel.

Elle consiste à précipiter les caséines à leur point isoélectrique (pHi =4.6) par acidification

biologique à l’aide des ferments lactiques qui transforment le lactose en acide lactique ou par

acidification chimique (injection de CO2, addition de gluconoδ-lactone ou ajout de protéines

sériques à pH acide).La voie chimique (acide organique) est uniquement utilisée en France

pour la standardisation du pH du lait avant emprésurage. L’addition d’acide minéral n’est

quant à elle pas autorisée.

Une acidification progressive obtenue par fermentation lactique, conduit à la formation d’un

gel lisse homogène qui occupe entièrement le volume initial du lait (Eck et Gillis, 1997).Ce

type de gel de par la solubilisation du phosphate de calcium colloïdal au cours de

l’acidification présente une bonne perméabilité mais une friabilité élevée ; le manque de

structuration du réseau (liaisons de faibles énergies de type hydrophobe) a pour conséquences

une élasticité et une plasticité pratiquement nulles et une faible résistance aux traitements

mécaniques (Mahaut et al., 2003).

IV.3.2Coagulation par voie enzymatique

Un grand nombre d’enzymes protéolytiques d’origine animale, végétale ou microbienne ont la

propriété de coaguler le complexe caséinique.

Mécanisme de la coagulation enzymatique :


38

La coagulation comporte trois phases (Fig.4) :

L’hydrolyse enzymatique de la caséinek.

L’agrégation des micelles déstabilisées.

La réticulation et la formation du gel.

Figure 4:Phases de la coagulation enzymatique du lait (Mietton, 1994)

1ère

phase (hydrolyse enzymatique)

Elle concerne l’hydrolyse de la caséine k,au niveau de la liaison peptidique phénylalanine

(105) et méthionine (106), qui conduit à la formation de paracaséine k (1-105), et de

CMP (106-169). La libération du CMP se traduit par une réduction du potentiel de surface

des micelles et en conséquence, une diminution des répulsions électrostatiques qui à l’état

initial contribue à la stabilité du système colloïdal (Eck et Gillis, 1997).

Cette phase est indépendante des ions de Ca2+

et elle se produit à des températures variées (de

0 à 50°).


39

2ème phase ou dite d’agglomération

Cette phase prend place lorsque 80% environ de la caséine k sont hydrolysés. La vitesse

d’agrégation s’accroit rapidement avec l’état d’avancement de la réaction enzymatique (Eck

et Gillis, 1997).

3ème phase ou de protéolyse générale

Les micelles agrégées subissent de profondes réorganisations : des liaisons de nature variée

s’établissent entre les micelles (électrostatiques, hydrophobes et salines) pour former un gel

constitué par un réseau lâche emprisonnant le lactosérum et la matière grasse. Dans le gel

ainsi formé, la caséine est présente sous une forme fortement minéralisée et ce degré de

minéralisation élevé confère au gel présure des caractères différents de ceux du gel lactique.

Le gel présure est souple, très cohésif, imperméable et contractile (Scriban, 1999).

IV.3.3 Coagulation mixte

Elle résulte de l’action conjuguée de la présure et de l’acidification. La multitude de

combinaisons conduisant à différents états d’équilibres spécifiques est à l’origine de la grande

diversité des fromages à pâte molle et à pâte pressée non cuite (Mahaut et al., 2003).

Dans la pratique industrielle, un gel mixte peut être obtenu selon deux techniques :

l’emprésurage d’un lait acide, l’acidification d’un gel présure (Veisseyre, 1975).

IV.3.3.1 Facteurs influençant l’activité coagulante

IV.3.3.1.1 Concentration en enzyme

Le temps de coagulation est inversement proportionnel à la concentration en enzyme, ce qui

peut se formaliser selon l’équation suivante (Mahaut et al ., 2003)

tc =K/E +ta

Avec : tc : temps de coagulation (s)

K : inverse de la constante de vitesse

E : concentration en enzyme


40

ta : temps écoulé entre la fin de la réaction enzymatique et le point de coagulation (s).

IV.3.3.1.2Température

Le phénomène de coagulation est fortement dépendant de la température :

Au-dessous de 10°C, la coagulation du lait ne se produit pas.

Dans l’intervalle 10 à 20° C, la vitesse de coagulation est lente.

Au-dessus de 20°C, elle augmente progressivement jusqu'à 40 à 42°C, au-delà elle

diminue.

Au-dessus de 65°C, il n’y a plus de coagulation, l’enzyme est inactivée.

La température influe considérablement sur l’étape de l’interaction micellaire relativement à

son action sur l’étape de l’hydrolyse enzymatique (Brule et al ., 1987).

Tableau 9 : Impact de la température sur la coagulation du lait par la présure

(St-Gelais et Tirard-Collet, 2002).

Température Impact

<10°C Il n’y a pas de coagulation mais l’enzyme agit quand même.

10-20°C La coagulation est lente

30-42°C Il y a une augmentation progressive de la vitesse de coagulation.

42-55°C La vitesse de coagulation diminue.

55°C et + Il y a absence de coagulation.

IV.3.3.1.3 pH

L’abaissement du pH du lait entraine un temps de coagulation plus court. Cela résulte d’une

part d’un effet sur l’activité de l’enzyme, dont le pH optimal d’action sur la caséine kest de

5,5, d’autre part de la diminution de la stabilité des micelles, liée à la neutralisation des


41

charges et de la libération d’ions calcium à partir des complexes dissous et colloïdaux

(Mahaut et al ., 2003).

IV.3.3.1.4 Teneur en CaCl2

L’addition de CaCl2 entraine une augmentation du calcium ionisé et du calcium colloïdal

ayant pour conséquence une augmentation de la taille des micelles (plus la dimension de la

micelle est grande, plus le temps de coagulation est court.)(Lenoir, 1985 ; Mahaut et al .,

2003).

IV.4 Egouttage

L’égouttage est l'étape de séparation du caillé (la phase solide) et du lactosérum ou petit lait

(la phase liquide) composée d'eau et de matières solubles telles que le lactose (75%), des

minéraux (essentiellement du calcium), des vitamines et des protéines (10%). Durant cette

phase, ce sont 80% de l'eau contenue dans le caillé qui sont éliminés.

Cette étape est importante puisque la nature du fromage fabriqué dépend de la méthode

d'égouttage pratiquée. Il faut notamment savoir que la capacité à s'égoutter d'un caillé est

directement en relation avec sa coagulation et que l'égouttage commence dès la coagulation

du lait.

Les pertes sont de deux natures :

- directes : chutes de caillé ou de résidus collant aux moules durant le pressage.

- indirectes : une irrégularité dans la répartition des grains (plus ou moins gros) au cours du

moulage ainsi qu’une irrégularité de traitement après moulage (température, hygrométrie,

pression) vont entrainer une évaporation irrégulière du sérum et accroitre les dispersions de

poids et d’extrait sec de fromages vendus à la pièce. On peut chercher à détecter ces

irrégularités en comparant les écarts types avant et après pressage, dans le cas de pates pressés

et voir ainsi la part des différents facteurs. Il est plus délicat d’évaluer les dispersions dues

respectivement au moulage et à l’égouttage des pâtes molles (Pointurier et al., 2003).

IV.5 Salage

Le salage peut s’effectuer selon deux techniques :


42

salage à sec par saupoudrage superficiel, par frottage ou par incorporation dans la

masse du caillé (cantal, cheddar) ;

salage en saumure par immersion dans une solution saturée en NaCl.

L’incorporation du chlorure de sodium dans le fromage a pour objectifs :

- d’assurer un complément d’égouttage ;

- de contribuer éventuellement à la formation de la croute ;

- de régler l’activité de l’eau (aw) du fromage qui oriente et freinte les développements

microbiens et les actions enzymatiques au cours de l’affinage ;

- d’accroître le potentiel organoleptique fromage (Mahaut et al., 2003)

IV.6 Affinage

L’affinage correspond à une phase de digestion enzymatique des constituants du caillé, c’est

un processus biochimique complexe pour plusieurs raisons :

- d’une part, la matrice issue de la coagulation et de l’égouttage du lait présente une très

grande hétérogénéité physicochimique ;

- d’autre part, les enzymes intervenant dans l’affinage ont plusieurs origines.

Elles peuvent être présentes à l’origine dans le lait (plasmine, lipase, etc.), ajoutées au lait

(enzymes coagulantes, microorganismes), ou produites au cours de l’affinage par synthèses

microbiennes (bactéries, levures, moisissures).

L’affinage est dominé par trois grands phénomènes biochimiques : la fermentation du lactose,

l’hydrolyse de la matière grasse et la dégradation des protéines.

Les transformations confèrent à la pâte fromagère des caractères nouveaux. Elles la modifient

dans son aspect, dans sa composition, dans sa consistance. Simultanément, saveur, arome et

texture se développent.


43

V. Coagulases d’origine bacterienne

Des études ont permis de mettre en évidence les potentialités de certaines bactéries à produire

des coagulases. Ce sont surtout les genres Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus coagulans,

Bacillus licheniformis) et Pseudomonasqui ont été plus particulièrement explorés (Green,

1977).

V.1 Le genre Bacillus

Le genre Bacillus englobe des bactéries à Gram positif en forme de bâtonnets droits,

généralement mobiles grâce à des cils péritriches, capables de former des endospores,

aérobies ou anaérobies facultatives. Les cultures âgées peuvent apparaitre gram négatif.

Les Bacillus sont très répandus dans la nature surtout dans le sol ; ils font partie de la flore

banale contaminant de nombreux produits alimentaires et sont souvent protéolytiques.

Le genre de Bacillus est classiquement subdivisé en fonction de la morphologie et de la

position de la spore en trois groupes :

Le groupe I : ce groupe est constitué des bacilles à Gram positif, présentant une spore

centrale ou terminale, sphérique ou ovoïde, ne déformant pas la cellule. Ce groupe est divisé

en 2 sous-groupes : le groupe IA constitué des bacilles d’un diamètre supérieur à 1 mm et

contenant des inclusions de poly-bêta-hydroxybutyrate (Bacillus anthracis, Bacillus cereus,

Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus thuringensis) ; et

le groupe IB rassemblant des bacilles d’un diamètre inférieur à 1 mm et dépourvus

d’inclusions de poly-bêta-hydroxybutyrate (Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus

licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus...).

Le groupe II : ce groupe est constitué des espèces à Gram variable, présentant une spore

ovoïde, centrale ou terminale, déformante (Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus).

Le groupe III : ce groupe est caractérisé par des bacilles à Gram variable et présentant une

spore sphérique, déformante, terminale ou sub-terminale (Bacillus globisporus, Bacillus

insolitus, ...).


44

V.2 Intérêt industriel

Le développement considérable qu’a connu le genre Bacillus dans le domaine de la

production d’enzymes industrielles, revient aux caractéristiques intéressantes que présente ce

groupe :

Ces micro-organismes se cultivent facilement et s’adaptent parfaitement à un

développement industriel,

Ils présentent un fort potentiel génétique : les différentes espèces se rencontrent

dans des habitats variés et présentent de nombreux types trophiques

(psychrophiles, mésophiles, thermophiles, neutrophiles, acidophiles,

alcanophiles).

Ils excrètent à l’extérieur des cellules une quantité importante de leurs

protéines enzymatiques.

Enfin, ces enzymes exocellulaires sont des hydrolases, famille qui a connu le

plus large développement pour les applications industrielles, notamment les

amylases et les protéases (Schiff, 1992).

V.3 Les protéases de Bacillus

Les protéases de Bacillus sont des enzymes sécrétées dans le milieu extracellulaire. Parfois

leurs productions sont réprimées par l’adjonction en milieu de culture d’un hydrolysat de

protéines ou de mélange d’acides aminés (Arnaud et Guiraud, 1993).

Elles sont parmi les enzymes les plus anciennement connues et sécrétées par la plupart des

espèces de Bacillus telles que : Bacillus megaterium et Bacillus subtilis (Sastryet Mathur,

1979).

La quasi-totalité des protéases extracellulaires du genre Bacillus sont :

V.1.3.1 Les protéases alcalines (sérines protéases) :

Leur appellation est due à leur pH optimum d’action compris entre 9 et 11.

Les sérines protéases ont un poids moléculaire compris entre 25 000 et 30 000 et

sont caractérisées par la présence d’un résidu sérine au niveau de leur site actif.


45

Elles sont stabilisées aux hautes températures par les ions Ca2+

.

En fonction de leurs propriétés générales, elles peuvent être classées en deux groupes :

Subtilopeptidase A : enzymes sécrétées par Bacillus licheniformis et Bacillus pumilus.

Subtilopeptidase B : enzymes sécrétées par Bacillus amyloliquefaciens et Bacillus

subtilis.

V.1.3.2 Les protéases neutres (métalloprotéases)

Elles ont un poids moléculaire variant entre 32,9 et 47,5 KDa. Les métalloprotéases

représentent le groupe des métalloendopeptidases ayant une activité maximale à un pH neutre

ou se rapprochant de la neutralité.

Les protéases neutres ne présentent aucune activité estérasique. L’insertion de l’ion de zinc au

niveau de la molécule enzymatique est primordiale pour son activité.

VI. Coagulases d’origine fongique

VI.1Généralités sur les moisissures

Les moisissures sont définies comme l’ensemble des champignons microscopiques

saprophytes présentant une végétation notable et qui ont de l’importance dans l’industrie

humaine (Leyral et Vierling, 2001).

Ce sont des eucaryotes (noyau vrai) avec des noyaux typiques entourés d’une membrane et

contenant des chromosomes (Marie, 1997).

Elles sont hétérotrophes car elles ne peuvent pas, comme les plantes vertes, synthétiser la

matière organique à partir du gaz carbonique atmosphérique (Marie, 1997).

Les plus répandues sont les Pénicilliums et les Aspergillus. Elles sont aérobies strictes.

Exemptes de chlorophylle, elles sont incapables de photosynthèse et tirent leur énergie de la

respiration et de la fermentation des matériaux organiques solubles qu’elles trouvent dans leur

environnement. Hétérotrophes et peu exigeantes, elles sont capables d’assimiler une grande

variété de substrats organiques grâce à leur potentiel élevé de sécrétion d’enzymes exo


46

cellulaires leur permettant de s’attaquer à une gamme très large de composés naturels, dont

certains sont particulièrement rebelles comme la cellulose, la chitine ou la lignine. La plupart

des hydrates de carbone sont facilement assimilés. Les sources d’azote utilisées sont

nombreuses : sels d’ammonium, nitrites et nitrates, urée, acides aminés et source complexes

d’azote organique (Florent, 1993).

VI.2 Structure

Les champignons sont des organismes vivants constitués en grande partie de filaments de

cellules de structure simple et de quelques cellules plus spécialisées qui donneront naissance à

des spores. Les champignons ont un matériel génétique confiné dans un noyau au même titre

que les plantes et les animaux. Ils possèdent toutefois un certain nombre de caractéristiques

qui en font un groupe à part : parois contenant de la cellulose et de la chitine, absence de

chlorophylle et de mobilité. L’ensemble de ces caractéristiques fait en sorte que les

taxonomistes classent les champignons dans un règne distinct, soit celui des mycètes

(Kendrick, 1999 ; Malloch, 1997).

VI.3 Aperçu de la classification

La classification des moisissures, tout comme celle des autres champignons, est d’abord basée

sur le mode de reproduction sexuée ou phase téléomorphe. Ce critère définit quatre des cinq

ordres des mycètes, soit les Chytridiomycètes, les Zygomycètes, les Basidiomycètes et les

Ascomycètes (Fig.5).


47

-Protozoaires

-Chromiste

---Eucaryotes -Plantes

(matériel génétique dans un noyau) -Animaux

-Mycètes Chytridiomycètes

Monde vivant (champignons) Zygomycètes

Basidiomycètes

Ascomycètes

Deutéromycètes

---Procaryotes - -Eubactéries

(matériel génétique diffus) -Archaebactéries

Figure 5 : Classification des mycètes (champignons) (Blackwell et al., 1998)

Certaines moisissures sont le plus souvent ou exclusivement rencontrées à des stades de

multiplication asexuée, dits anamorphes, et sont alors classées d’après le mode de production

des spores asexuées ou conidies. Ces espèces sont classées dans le cinquième ordre, les

Deutéromycètes, ou Fungi imperfecti.

VI.4 Cycle de vie des moisissures

Le réservoir naturel des moisissures se situe à l’extérieur, sur les végétaux, la matière

organique en décomposition, à la surface d’eau stagnante ainsi que dans le sol ou à la surface

de ce dernier (Malloch, 1997). Lorsque les conditions le permettent, les moisissures

produisent, à maturité, des spores qui peuvent être transportées par les courants d’air ou par

les humains et les animaux domestiques et se retrouver éventuellement dans les maisons et

édifices.


48

Dans les climats tempérés, c’est durant la saison de croissance des végétaux et quelque temps

après celle-ci, que le nombre de spores se trouvant à l’extérieur est le plus élevé (Who, 2000).

Ces spores sont une forme latente des moisissures. La dispersion des spores peut se faire sur

de grandes distances. Des études effectuées en milieu contrôlé ont démontré qu’une petite

proportion des spores aéroportées peut se retrouver jusqu’à cent mètres de la source

d’émission bien que la grande majorité de celles-ci se retrouvent à proximité de leur lieu de

libération (Carlile et Watkinson, 1994).

En présence de conditions favorables à la sporulation, le mycélium donnera naissance à des

structures plus spécialisées, qui produiront des spores asexuées (conidies) ou, plus rarement,

des spores sexuées (Kendrick, 1999).

Chaque moisissure produit un très grand nombre de spores dont l’ensemble, appelé sporée, se

présente très souvent sous un aspect poudreux et coloré à la surface de la moisissure. La taille,

la forme et la couleur des spores de moisissures varient grandement d’une espèce à l’autre.

Par contre, en microscopie, toutes les spores d’une même espèce sont de couleur, de

dimension et de forme relativement constante ce qui, dans bien des cas, constitue un élément

d’identification taxonomique (Acgih, 1999). Le diamètre des structures fongiques de

reproduction varie entre 2 et 200 μm (Stetzenbach et Buttner, 2000), bien qu’il se situe pour

une forte proportion des spores entre 2 et 20 μm (Who, 2000). Certaines spores se retrouvent

à l’intérieur de structures fongiques spécialisées qui peuvent mesurer jusqu’à 250 μm de

diamètre. Tous les types de spores pourront dans des conditions favorables, recommencer un

cycle de vie, soit à proximité du thalle original ou même à forte distance de celui-ci, dans les

jours ou les mois suivant sa production.

VI.5 Conditions de croissance des moisissures

Dans leur milieu naturel, la plupart des moisissures sont saprophytes, tirant leur nourriture de

matières organiques mortes ou plus ou moins décomposées. Même si toute matière organique

peut constituer un substrat de croissance pour les moisissures, les conditions optimales de

croissance peuvent varier d’une espèce à l’autre, chacune d’entre elles ayant un degré

différent d’adaptation à son environnement. Certaines moisissures requièrent un taux

d’humidité très élevé pour croître tandis que d’autres préfèrent des taux beaucoup moins

élevés. Certaines peuvent croître sur des feuilles en décomposition, substance humide et

facilement pénétrable, tandis que d’autres s’attaqueront à des matières plus ligneuses, telles le


49

bois ou même à des matières animales chitineuses tels les cheveux et les ongles. De plus, la

compétition inter-espèces procurera un avantage aux moisissures les mieux adaptées, référant

à la notion de niches écologiques particulières pour la croissance optimale de chaque type de

moisissure (Robbins et al., 2000 ; Malloch, 1997 ; Grant et al., 1988).

VI.5.1 Éléments nutritifs

La majorité des moisissures sont peu exigeantes quant aux éléments nutritifs nécessaires à

leur croissance. Les plus importants sont le carbone et l’azote, utilisés sous forme de

composés organiques, et des ions minéraux (Potassium, Phosphore, Magnésium…) en

quantités très faibles.

VI.5.2 Activité de l’eau

Les spores ne germent pas lorsque la teneur en eau d’un substrat est inférieure à 13% ou 14%

cependant, les exigences et la tolérance vis-à-vis de l’eau sont variables selon les groupes :

- Certaines moisissures ne se développement que sur substrat humide, c’est le cas par

exemple des mucorales ;

- D’autre peuvent proliférer sur des substrats dont l’humidité est très faible. Ce sont les

moisissures xérophiles qui rassemblent les espèces les plus osmophiles. Parmi ces espèces, les

mieux adaptées aux substrats secs sont les Aspergillus (Leyral et Vierling, 2001).

VI.5.3 Température

La végétation maximale est produite entre 20°C et 30°C, mais les moisissures tolèrent

généralement de +3°C à 40°C. Certaines espèces sont capables de continuer à croître à des

températures supérieures à 50°C. Les spores de moisissures sont détruites par un chauffage à

120°C pendant 20 à 30 min en chaleur humide, 3 heures à160°C en chaleur sèche (Leyral et

Vierling, 2001).

VI.5.4 pH

La majorité des espèces se développent dans des zones de pH assez larges, entre 3 et 8

(Florent, 1993).


50

VI.5.5 Oxygène

Les moisissures se développent normalement dans les conditions aérobies (Florent, 1993).

VI.6 Importance économique des moisissures dans la production

d’enzymes

Les moisissures ou champignons filamenteux, ont une grande importance économique, en

raison à la fois de leur nocivité et de leur utilité. Leurs activités néfastes sont multiples :

altération des produits alimentaires et détérioration dans de nombreux autres domaines,

production de mycotoxines, vie parasitaire au dépond de l’homme, des animaux et des

plantes.

Les actions nocives de ces micro-organismes sont, heureusement, largement compensées par

leurs activités bénéfiques. Responsables de la destruction d’une grande partie de la matière

organique terrestre, les moisissures contribuent largement à l’accomplissement des grands

cycles biologiques naturels. Elles sont utilisées depuis fort longtemps par l’homme pour la

préparation d’aliment, intervenant notamment comme agents de fermentation dans la

fabrication de fromage. Elles synthétisent un grand nombre de substances complexes

économiquement très importantes : enzymes, acides organique, antibiotiques, etc. (Florent,

1993).

VI.7 Le genre Mucor

VI.7.1 Définition, caractéristiques et position taxonomique du genre Mucor

Selon (Gueguen, 1992), les Mucorales sont des champignons à "glucides simples", elles

compensent une faiblesse dans leur équipement enzymatique par leur rapidité foudroyante de

croissance, en consommant de petites molécules organiques. L’azote inorganique est utilisé

sous forme de sel d’ammonium. Un apport en macroéléments (P, K, Mg) et en oligo-éléments

(Zn, Fe, Mg, Cu, Mo) est nécessaire.

La plupart des Mucor vivent sur des matières végétales ou animales en décomposition mais

aussi dans le sol. Leurs spores asexuées, habituellement dispersées par le vent, se développent

dans les sporanges à l’extrémité des hyphes aériens. La reproduction sexuée produit des


51

zygotes durs, entourés par une paroi épaisse et appelés zygospores ; ils restent dormants

quand l’environnement est trop rude pour la croissance du mycètes.

Une classification, proposée par Botton et al. (1990) ainsi que celle de (Yadav et Mishra,

1994), est illustrée par la figure 6. Cette classification est limitée à l’espèce utilisée dans notre

étude.

Protistes

Procaryotes Eucaryotes

Amastigomycota Mastigomycota Gymnomycota

Zygomycotina Ascomycotina Deuteromycotina Basidiomycotina

Entomophtorales Mucorales

Thamnidiaceae Mucoraceae

Thamnidium Mucor Mucor sp

Rhizopus

Absidia

Figure 6: la place de Mucor sp dans la classification des champignons (Botton et al., 1990)

VI.7.2Les espèces exploitées industriellement

Deux espèces ont été plus particulièrement exploitées au niveau industriel.


52

Mucor pusillus

Il s’agit d’une moisissure banale du sol, exploitée par la firme japonaise METTOSANGYO. La

préparation enzymatique est commercialisée par Noury sous la dénomination de Noury- renn.

L’extrait est utilisé surtout aux Etats-Unis pour la fabrication du cheddar depuis de

nombreuses années. Ce fromage est semblable à celui obtenu par la présure

En ce qui concerne le fromage de type EDAM, la flaveur est moins fréquemment défectueuse

que l’EDAM fabriqué par la présure (Eck, 1987).

D’après Pien (1974), cette enzyme a permis d’obtenir des fromages de tous les types de

bonne qualité. Cependant, il a été constaté qu’une des causes possible d’une faible perte de

rendement peut être la fragilité un peu plus grande des caillés obtenus avec cette enzyme. Il

faut éviter une agitation trop grande au moment du décaillage pour que les poussières de caillé

ne partent pas dans le sérum. Toujours d’après le même auteur, on peut obtenir des fromages

un peu secs avec cette enzyme.

Mucor miehei :

Les préparations obtenues à partir de cette moisissure banale du sol, sont produites

par diverses firmes:

Française RAPIDASE sous la dénomination fromase,

Danoise nano industrie sous le nom de rennilase,

Américaine mille sous l’appellation marzyme,

Danoise Ball Hansen sous le nom hammilase.

Endothia parasitica :

C’est une moisissure parasite du châtaignier.

La préparation enzymatique est produite par la firme américaine PFIEZER et commercialisée

sous le nom sufaren.


53

VI.7.3 Les protéases du genre Mucor et leur application en fromagerie

Mucor pusillus secrète, selon Somkuti et Babel (1968), une seule protéase acide active à pH

3,8 et 5,6 sur substrat hémoglobine et caséine respectivement. L’enzyme est très thermostable,

son optimum thermique est de 50°C; elle est irréversiblement dénaturée à 65°C.

Cependant (Khanet al., 1979) ont montré la production de deux protéases à la place d’une

seule ; l’une est semblable à la présure, l’autre caractérisée par une activité protéolytique

insignifiante.

D’après (Luquet, 1985), cette enzyme a permis d’obtenir des fromages de bonne qualité.

Cependant, la diminution du rendement fromager observée peut être due, selon (Houins et al.,

1973), à une production importante de peptides solubles dans l’eau. En effet selon les mêmes

auteurs, l’enzyme extrait du Mucor pusillus se caractérise par une forte concentration de gros

peptides pouvant expliquer le gout amer décelé dans certains fromages fabriqués avec cette

enzyme.

En revanche, les travaux de (Polychroniadou et Manolkidis, 1984), ont montré la bonne

aptitude que possèdent les extraits coagulants microbiens : Noury-Rennet, Rennilase et

Suparen à la fabrication de fromage de chèvre à croûte fleurie.

Par ailleurs, certains auteurs (Green et Stackpoole, 1975 ; Jarmul et al., 1982) ont démontré

l’efficacité d’utiliser une préparation fongique (Noury ou fromase) en mélange avec la

pepsine dans la fabrication de fromage.

VII. La fermentation industrielle

Le mot fermentation présente deux significations différentes pour les biochimistes et les

microbiologistes industriels. En biochimie, les fermentations sont des voies cataboliques

anaérobies au cours desquelles des composés organiques servent à la fois de donneurs et

d’accepteurs d’électrons, la synthèse d’ATP étant réalisée par phosphorylation au niveau du

substrat. En microbiologie industrielle, le terme de fermentation désigne l’opération unitaire

qui permet de produire de la biomasse ou des produits de bioconversion par la culture de

microorganismes.


54

Ainsi, contrairement au sens biochimique, le terme de fermentation industrielle ne se réfère

pas au métabolisme du microorganisme. Ce terme s’applique en industrie pour des

métabolismes aérobies et anaérobies (Pascal et al., 2004).

VII.1 Buts de la fermentation industrielle

La mise en œuvre des procédés de la fermentation industrielle peut tendre vers divers buts qui

sont :

- L’obtention des micro-organismes eux-mêmes ; en quantité importante pour la

préparation des protéines, ou des autre constituants cellulaires ;

- La production de composés ou produits sécrétés naturellement par les micro-

organismes comme les enzymes, les pigments ou les toxines ;

- La production des métabolites, dans certaine condition, comme les antibiotiques, les

vitamines ou les aminoacides par les micro-organismes (Simon et Meunier, 1970).

VII .2 Types de fermentation

VII .2.1 Fermentation sur milieu liquide

Cette technique a été la première utilisée. Elle consiste à cultiver les moisissures sur la surface

d’un milieu nutritif liquide, elle nécessite des conditions aseptiques strictes. La culture en

milieu liquide s’effectue dans des récipients agités, et le plus souvent dans des Erlenmeyers,

placés sur des appareils d’agitation qui favorisent la diffusion de l’air à travers les tampons de

coton servant à les boucher.

Ce type de fermentation a été traditionnellement utilisé pour la production industrielle des

enzymes, en raison de la facilité de contrôle des différents paramètres comme le pH, la T°,

l’aération, l’oxygène dissout et l’humidité. La fermentation submergée est généralement plus

facile à exploiter de manière aseptique par rapport à la fermentation solide et peut être

appliquée plus facilement à l’échelle industrielle

VII .2.2 La fermentation solide ou semi-solide

VII .2.2.1. Définition


55

La fermentation solide (fermentation de substrats solides, fermentation humide, culture solide

est généralement définie comme une croissance microbienne sur des particules solides

humides en l’absence d’eau libre (Durand, 2003 ; Gervais et al., 2003 ; Rahardjoet al.,

2006). De façon simplifiée, les microorganismes se développent dans un système à trois

phases : une matrice solide, une phase liquide qui lui est liée et une phase gazeuse prise au

piège dans les particules ou entre celles-ci.

Rahardjo et al. (2006) expliquent la diffusion des moisissures filamenteuses dans le substrat

solide humide. Selon les substrats considérés, l’apparition d’eau libre se manifeste pour des

teneurs en eau comprises entre 12 et 90 %, soit 0,65 et 0,98 d’activité d’eau (aw). (Mathot,

1996 ; Gervais et al., 2003).

VII .2.2.2 Avantages de la fermentation solide

La fermentation solide possède une réputation de technique simple à mettre en œuvre, ne

nécessitant pas obligatoirement une stérilisation énergétique du substrat de culture et requiert

un faible espace. Elle assure une forte productivité en métabolites. La faible teneur en

humidité empêche la contamination bactérienne. Cependant, cette renommée est largement

surfaite, surtout lors du développement d’applications pilotes ou en vraie grandeur. Dans ces

conditions et bien d’autres, la fermentation solide présente de nombreux inconvénients

(Assamoi et al., 2008).

VII .2.2.3 Inconvénients des fermentations solides

Les problèmes de transfert d’oxygène et de chaleur rendent difficile l’augmentation d’échelle

des procédés. En effet, la faible quantité d’eau ralentit les échanges de chaleur, pouvant créer

des problèmes de surchauffe lorsque des masses importantes sont mises en fermentation.

L’évaporation compense partiellement cet échauffement, mais en réduisant l’eau disponible.

L’évacuation des calories métaboliques peut donc poser un problème qu’il s’agit de résoudre

lors du passage de petits essais de laboratoire aux applications en vraie grandeur.

La nature solide et hétérogène des substrats utilisés complique le suivi direct des paramètres

de fermentation. Les sondes utilisées en fermentation liquide ne sont pas utilisables, même si

Bellon-Maurel et al. (2003) proposent de nouveaux types de sondes adaptées aux cultures

solides. Il est pratiquement difficile d’assurer une distribution parfaitement homogène de

substances ajoutées au substrat et donc du milieu de culture. Ce qui rend le contrôle on line


56

des paramètres de culture tels que le pH, l’humidité et la concentration des nutriments, assez

aléatoire. Les microorganismes étant inséparables du substrat, l’estimation de la biomasse est

délicate. Étant donné la forte concentration des métabolites obtenus, des produits inhibiteurs

générés par les microorganismes peuvent s’accumuler en concentration élevée dans le milieu

de culture.

VII .2.2.4 Les diverses étapes suivies en fermentations solides

Ce sont respectivement la préparation du substrat ou du milieu de culture, la stérilisation du

milieu (généralement à 121 °C pendant 21 minutes) suivie par le refroidissement de celui-ci,

l’inoculation du milieu de culture, l’incubation du milieu inoculé et l’incubation en

maintenant dans la mesure du possible les conditions environnementales optimales

(température, pH, teneur en eau) (Assamoi et al., 2008).

L’isolement des microorganismes : il n’existe que deux moyens d’obtenir des

microorganismes :

- les isoler à partir des fermentations naturelles de l’eau, de l’air, du sol, ou les matériaux

organiques ou même inorganiques plus au moins décomposées.

- les obtenir déjà isolés à l’état de culture en s’adressant au collecteur des souches (Simon

et Meunier, 1970).

La préparation du substrat carboné : les substrats carbonés utilisés en fermentation

solide proviennent essentiellement des résidus agricoles et agroalimentaires. Ce sont

les substrats lignocellulosiques (sous forme de paille, de son, de bagasse, de pulpe,

etc.), les féculents (résidus de banane, de soja, les graines, etc.

La préparation du substrat carboné vise à lui faire subir divers traitements physique,

chimique ou biologique (enzymes) afin de favoriser une grande accessibilité des

constituants aux microorganismes. Le traitement physique peut se faire soit

mécaniquement (broyage, concassage, hachage, aplatissage), soit thermiquement

(chauffage, autoclavage, traitement à la vapeur), soit par irradiation ou par ultrasons.

Le traitement chimique se fait par la voie des alcalis, acides, oxydants, gaz et solvants


La fermentation proprement dite: après avoir amélioré la souche par culture dans

des milieux sélectifs afin de favoriser le développement rapide de la souche et après


57

l’avoir purifiée, tout cela à une température adéquate, on prépare l’inoculum. Il faut

inoculer largement le milieu nutritif afin que la souche ensemencée se développe

rapidement dans le plus court délai, à une température spécifique. Cette technique est

utilisée souvent dans la production enzymatique et pour la production de divers

produits d’intérêt industriel agroalimentaire (Aguilar et al., 2008).

L’inoculation du milieu de culture : l’inoculation du milieu de culture se fait le plus

souvent à partir d’une suspension de spores (Mathot, 1996). Celles-ci restent viables

plus longtemps que du mycélium ; elles sont moins sensibles aux conditions externes

et se conservent plus facilement. La quantité optimale de spores à inoculer diffère

selon les cas. Un excès de spores peut parfois inhiber la germination. Les spores sont

cependant métaboliquement dormantes, impliquant que la dégradation du substrat ne

peut s’installer qu’après la germination. Pour minimiser cet inconvénient, une pré

germination des spores est parfois envisagée. Des inoculum spores + mycélium +

substrat de production peuvent être utilisés également (Assamoi et al., 2008).

L’optimisation de la température, de la teneur en eau, du pH et de l’aération de

la culture :à l’échelle industrielle, les contrôles de la température de culture et de

l’humidité du milieu sont très importants (Bellon-Maurel et al., 2003). La faible

conductibilité thermique des substrats utilisés et leur faible teneur en eau réduisent le

transfert de chaleur, qui lui-même dépend de la taille des particules de la couche

solide. Une élévation de la température dans la masse fermentable due à un

dégagement de chaleur métabolique peut aller jusqu’à atteindre 80°C, causant un

assèchement de la culture et une baisse de l’aw et de la disponibilité en nutriments


L’extraction et la purification des enzymes : la fermentation terminée, les enzymes

doivent être séparées des cellules et du milieu, et traitées de façon à obtenir une

préparation commerciale répondant aux critères de pureté et de stabilité souhaités. Ces

traitements sont des opérations unitaires simples telles que centrifugation, filtration,

évaporation, précipitation, séchage… Les préparations enzymatiques sont

commercialisées sous différentes formes : liquide, poudre, concentré, lyophilisée,

immobilisée (Scriban, 1988).

VII. 3 Production d’une enzyme industrielle d’origine microbienne

La production industrielle d’enzymes s’est orientée vers les processus fermentaires.


58

Selon (Joyeaux, 1982), des fermentations en profondeur assurent une meilleure homogénéité

et un contrôle plus strict des paramètres critiques de la synthèse de l’enzyme au cours de la

fermentation.

VII.4 Sélection d’une souche microbienne

Les souches productrices d’enzymes doivent présenter un certain nombre de caractéristiques

pour être définitivement retenues :

- pousser sur milieu simple et bon marché.

- produire le moins possible des métabolites secondaires (antibiotiques,…).

- ne pas conduire à différents polluants.

- produire une enzyme exocellulaire facile à séparer et purifier.

- ne pas être pathogène ou produire des composés toxiques.

VII.5 Production industrielle

Actuellement les cultures submergées sont préférées aux cultures de surface car elles sont

mieux adaptées aux différents contrôles de température, d’aération et d’humidité, par des

méthodes modernes, et réduisent les risques de contamination.

VII.6 Extraction et purification

Une fois la fermentation terminée, les enzymes doivent être séparées des cellules et du milieu

de culture et traitées par des opérations unitaires simples telles que la centrifugation, filtration,

évaporation, précipitation, séchage.

Les préparations enzymatiques peuvent être commercialisées sous différentes formes : liquide

concentrée, poudre, lyophilisée.

VIII. Planification expérimentale

VIII.1 L’optimisation du milieu de culture

La recherche de conditions optimales de production est très importante en analyse

fondamentale pour l’industrie et l’ingénierie. En effet optimiser une production ou même un

système c’est aboutir à un rendement maximal.


59

Les expériences au laboratoire ou en contexte industriel concernant généralement l’étude de

l’influence de nombreux facteurs sur les résultats d’un phénomène ou d’un procédé. Pendant

longtemps la procédure expérimentale consiste à faire varier un facteur à la fois en maintenant

fixe tous les autres facteurs. L’utilisation d’un plan d’expérience où plusieurs facteurs varient

à la fois, a permis d’alléger l’expérimentation en terme de temps et de coûts, tout en

permettant l’étude des interactions entre les facteurs et en augmentant la précision des

estimations des effets.

Ainsi, les plans d’expérience concernés sont utilisés pour l’amélioration de la qualité et de la

sécurité des produits et des procédés (Christine et al., 2006).

VIII.2 Les plans d’expériences

C’est le plan d’organisation des essais expérimentaux dans le but de connaître le

comportement du résultat (réponse) à partir de la variation des facteurs choisis. Un bon plan

permet une diminution notable du nombre d’essais tout en donnant une bonne précision dans

la détermination des résultats.

Les plans d'expériences permettent d'organiser au mieux les essais qui accompagnent une

recherche scientifique ou des études industrielles (Goupy, 2001). Ils sont applicables à de

nombreuses disciplines et à toutes les industries à partir du moment où l’on recherche le lien

qui existe entre une grandeur d’intérêt (réponse), y, et des variables(facteur), xi. Il faut penser

aux plans d'expériences si l’on s’intéresse à une fonction du type : y = f (xi)

Avec les plans d'expériences on obtient le maximum de renseignements avec le minimum

d'expériences. Pour cela, il faut suivre des règles mathématiques et adopter une démarche

rigoureuse (Box, 2005). Il existe de nombreux plans d'expériences adaptés à tous les cas

rencontrés par un expérimentateur. Les principes fondamentaux de cette science seront

indiqués et les principaux plans seront passés en revue. La compréhension de la méthode des

plans d'expériences s'appuie sur deux notions essentielles, celle d'espace expérimental et

celle de modélisation mathématique des grandeurs étudiées.


60

VIII.3 Notion d'espace expérimental

Un expérimentateur qui lance une étude s'intéresse à une grandeur qu'il mesure à chaque

essai. Cette grandeur s'appelle la réponse, c'est la grandeur d'intérêt. La valeur de cette

grandeur dépend de plusieurs variables.

Au lieu du terme «variable» on utilisera le mot facteur. La réponse dépend donc de un ou de

plusieurs facteurs.

VIII.4 Notion de surface de réponse

On définit un axe orthogonal à l’espace expérimental et on l’attribue à la réponse. La

représentation géométrique de plan d’expériences et de la réponse nécessite un espace ayant

une dimension de plus que l’espace expérimental.

A chaque point du domaine d’étude correspond une réponse. À l’ensemble de tous les points

du domaine d’étude correspond un ensemble de réponses qui se localisent sur une surface

appelée la surface de réponse (Fig.7).

Les plans du second degré ou plans pour surfaces de réponse permettent d'établir des modèles

mathématiques du second degré (Box, 2005). Ils sont utilisés pour les variables continues.

Pour trois facteurs, on a :

y = α0+ α1X1+α2X2 + α3X3+ α11X2 2+α22 X2

2 +α33X3

2 + α12 X1X2+α13X1X3+α23X2X3

La représentation géométrique de plan d’expériences et de la réponse nécessite un espace

ayant une dimension de plus que l’espace expérimental.


61

Figure 7 : Surface de réponse pour un domaine expérimental

VIII.5 Expérience factorielle de 2éme

ordre

L’expérience factorielle totale (EFT) est habituellement utilisée pour l’obtention d’un modèle

mathématique linéaire. Cependant, très souvent, les liaisons entre les facteurs et les

paramètres sont plus complexes. Dans ce cas leur description au moyen du modèle

mathématique de 1er

ordre est insuffisante.

VIII.6 L’expérience composite centrée

Parmi les catégories d’expériences factorielles pouvant être utilisées pour l’obtention du

modèle mathématique de 2éme

ordre, figurent les expériences dite composées centrales (ECC).

Ces plans ont été proposés pour la première fois par Box et Wilson(1951). Ils sont

construits à partir des plans factoriels complets ou fractionnaires et permettent d’estimer

efficacement un modèle du 2e degré en assignant aux facteurs plus de 2 niveaux.

L’expérience composite centrée (ECC) à K facteurs comporte trois groupes d’essais :


62

Les essais dans le noyau du plan :

Ce noyau représente l’expérience factorielle totale ou partielle. Dans le premier cas, le

nombre d’essais dans ces points est égale à :

Nn=φK

Où : φ= nombre de niveau de chaque facteur =2

K= nombre de facteurs

Donc Nn=2K

Les essais dans les points étoilés ou points axiaux :

Pour chaque facteur il y a deux points étoilés. Le nombre d’essais dans ces points est égal

à : Npe=2K

Les essais dans le centre de l’expérience :

Le nombre d’essai au centre du domaine.

Remarque :

Le nombre total d’essais dans l’expérience composée centrale est égale :

N=Nn+Npe+Nce.


63

Il faut cependant noter que, dans l’expérience composée centrale, chaque facteur varie sur 5

niveaux. En valeurs codées, nous avons les niveaux suivants :

Xi= -α (Niveau inférieur dans le point étoilé ; α est souvent appelée épaule étoilée

Xi= -1 (Niveau inférieur)

Xi= 0(Niveau zéro)

Xi= +1(Niveau supérieur)

Xi= + α (Niveau supérieur dans le point étoilé).

VIII.7 Types d’expériences composées centrales

En fonction de la valeur α et du nombre d’essais dans le centre de l’expérience Nc, on distingue

deux types d’expériences composées centrales :

L’expérience composée centrale orthogonale ;

L’expérience composée centrale rotatable.

A noter que le deuxième type d’expérience est le plus répandu. Les paramètres de cette expérience

sont présentés dans le tableau 10.

Tableau 10 : Les paramètres d’une expérience composée centrale rotatable.

Nombre de facteurs Nn Npe Nce N α Noyau du plan

2 4 4 5 13 1.414 EFT22

3 8 6 6 20 1.682 EFT23

4 16 8 7 31 2.000 EFT24

5 32 10 10 52 2.378 EFT25

6 64 12 15 91 2.828 EFT26


64

VIII.8 Etape de planification, de réalisation et de traitement des résultats de

l’expérience composite centrée

La planification, la réalisation et le traitement des résultats de l’expérience composite centrée

comprennent les étapes suivantes :

Le choix de plan factoriel de l’expérience ;

La codification des facteurs ;

La réalisation des essais dans le noyau (toutes les expériences) ;

La réalisation des essais aux points étoilés et au centre de l’expérience ;

L’estimation de la variance de l’erreur de l’expérience;

Le calcul des coefficients du modèle mathématique de 2éme

ordre ;

La vérification de la signification statistique des coefficients du modèle

mathématique ;

La vérification de l’adéquation du modèle mathématique obtenu.

Chapitre 2

Matériel et méthodes

Chapitre 2. Matériel et Méthodes

65

I..Méthode d’isolement des microorganismes d’intérêt

Une première étape du travail a consisté à isoler des microorganismes susceptibles de

produire des enzymes coagulant le lait, à partir du sol.

La terre utilisée pour la recherche des microorganismes a été prélevée à proximité de la

laiterie fromagerie de Boudouaou, précisément aux alentours du local contenant les sacs de

poudre de lait.100 à 150 grammes de sol sont pris à des profondeurs variant entre 3 et 15cm à

l’aide d’une spatule stérile et stockés dans des contenants stériles.

Les échantillons de terre sont tamisés dans des tamis métalliques à maille de 2mm de diamètre

environ. Le produit de tamisage est recueilli sur des grandes feuilles de papier sulfurisé ; 50 à

100g sont préservés en flacon stérile. Puis de manière aseptique, 10 gr de terre tamisés sont

pesés, puis broyés le plus finement possible afin de libérer au mieux les microorganismes. La

terre est transférée dans une fiole de 100ml, complétée avec de l’eau physiologique stérile. Le

mélange est ensuite homogénéisé pendant 20 minutes sous agitation magnétique (Davet et

Rouxel, 1997). Nous obtenons ainsi une dilution au 1/10.

A partir de là nous préparons les autres dilutions (1ml de10-1

dans 9ml d’eau physiologique

stérile pour avoir 10-2

et ainsi de suite jusqu’à 10-9

).

Les milieux de culture à utiliser sont coulés en boîte de Pétri (d= 9cm), puis ensemencés (pour

les dilutions de 10-3

à 10-9)

par étalement de 0,1 ml de chaque dilution à l’aide d’un râteau à la

surface des milieux

En ce qui concerne l’isolement des bactéries, le milieu employé est le milieu Plate Count

Agar (P.C.A.), additionné de 10% lait écrémé UHT et d’actidione (cycloheximide) à2%.

L’incubation s’effectue à 30°C pendant 48h à 72h.

Dans le cas des moisissures, le milieu utilisé est le Sabouraud-chloramphénicol, dans lequel

est ajouté 10% lait écrémé UHT. L’incubation a lieu à 25° pendant 3 à 4j.

Dans un premier temps, nous ferons référence aux méthodes utilisées lors de l’étude portant

sur les bactéries. Celles qui sont relatives aux moisissures, seront évoquées dans un deuxième

temps.


66

II. PROTEASE D’ORIGINE BACTERIENNE

II.1. Isolement des souches bactériennes

II.1.1. Choix et purification des souches

Au bout de 30h d’incubation, des colonies de bactéries apparaissent et nous nous intéressons

particulièrement aux colonies qui présentent un halo clair d’hydrolyse du lait ou caséolyse.

Les souches caséolytiques sont prélevées et repiquées sur des milieux P.C.A. contenant du

lait, puis purifiées éventuellement par plusieurs isolements par la méthode des quadrants

jusqu’à l’obtention de souches pures.

Au final, seules les souches isolées présentant un halo de caséolyse témoignant d’une action

sur les protéines du lait sont retenues.

II.1.2. Observations macroscopiques et microscopiques

Le pouvoir caséolytique des souches pures sélectionnées a été vérifié par un isolement sur

milieu P.C.A. additionné de lait (1ml de lait écrémé stérile pour 15ml de milieu P.C.A.).

Après incubation (30°c/48h), la présence d’un halo clair autour de la colonie caractérise le

pouvoir caséolytique : le diamètre de la zone de caséolyse mesuré (Fig.8)

Figure 8 : colonies caséolytiques après plusieurs heures d’incubation

P47 FK6

JF9


67

L’étude microscopique des différentes souches est entreprise à l’aide d’une coloration Gram

et éventuellement d’une coloration de spores (Méthode Benitto), en fonction de l’observation

morphologique.

Méthode de coloration de Benito :

- déposer le frottis de bactéries sur une platine chauffante

- recouvrir largement le frottis avec du vert Malachite à 5% (5g dans 100ml d’eau

distillée)

- chauffer jusqu’à émissions de vapeur et laisser refroidir

- renouveler plusieurs fois (3) l’opération, laissée en contact 10mn en ajoutant si

nécessaire du vert Malachite pour éviter l’évaporation

- rincer à l’eau courante, puis recouvrir le frottis d’une solution de safranine à 0,25%

(0,25g dans 100ml d’eau distillée) pendant une minute

- rincer à l’eau, sécher et observer à l’objectif *100 à immersion.

- Résultats : les spores apparaissent colorées en vert, les cellules végétatives en rose

II.1.3.Conservation des souches

Au final, nous disposons d’une collection de 70 souches qui ont été codées afin de les

différencier. Elles ont été étudiées du point de vue macroscopique et microscopique en

procédant à une coloration de Gram et éventuellement une coloration de Benito (mise en

évidence de spores) et en mesurant le diamètre de la plage de caséolyse.

Ces souches sont présentées dans le tableau N°11


68

Tableau N° 11 : Collection de souches bactériennes isolées à partir du sol

Code de la souche Aspect microscopique GRAM Caséolyse

en mm

FK 1 grands bâtonnets + 3

FK 2 Bacillus taille moyenne + 5

FK 3 Mélange de cocci et de bacilles courts + 1

FK 4 grands Bacillus + 5

FK 5 Mélange de bacilles + 4

FK 6 A Très longs bacilles, spore légèrement déformante + 5

FK 6 B Bacilles formant des petites chainettes, spores

terminales légèrement déformantes + 8

FK 7 petit Bacilles avec spore terminale déformante + 5



FK 11 Bacillus très granuleux plus gros que KF10 + 5

FK 12 Bacillus court + 3

FK 13 Bacillus granuleux gros trapus rectangulaire et court + 3

FK 14 Bacillus taille moyenne en voie de sporulation + 5




A 1 Petit bacilles - 6


69

A 2 Petit bacilles - 5

A 3 Cocco bacille - 5

C 1 Cocco bacille - 5

C 2 Bâtonnet assez grand + 5

C 3 Bacilles courts - 1

C 4 Bacilles courts - 5

C 5 Grands bacilles + 5

C 6 Bacilles plus courts + 4

P 43 Ressemble à JF9 en plus minces bacilles + 5

P 47 Bacilles droit extrémités carrés + 4

P 47 M Bacilles courts et fins, plus fins que FK6 + 5

P 47 A Bacilles longs et fins assez polymorphes + 6

P 47 β Petits bacilles en faisceaux, pas de spore en

apparence + 6

P 47 γ Bacilles plus longs et plus fins que P47β + 6

P 47 R Bacilles courts peu sporulés + 6

P 48 Bacilles taille moyenne plus long que P47 et plus

gros + 6

J F 2 Bacillus courts plus mince + 3

J F 3 Bacillus courts plus mince + 5

J F 5 Bacillus courts + 5

J F 6 Bacciles assez fins taille moyenne + 3


70

J F 8 Bacillus taille moyenne, spores terminales

déformantes + 7

J F 9 Tres long bacillus en voie de sporulation + 5

J F 10 Bacilles courts + 5

J F 11 Bacilles courts + 5

J F 13 Bacillus granuleux assez gros, présence de spores + 6

J F 14 Bacillus taille moyenne formants des chainettes + 2

J F 15 Bacillus courts, spores terminales déformantes + 4

J F 16 Bacillus taille moyenne formants des chainettes + 2

P47 Bacillus taille moyenne + 6

F3 Bacciles taille moyenne granuleux parfois en

chainettes + 2

F4 Petit bacilles en faisceaux + 3

F5 Gros bacilles + 1

F6 long bacilles droit et fin + 1

F7 bacillus moins gros que F3 mais plus long + 2

F8 bacillus moins gros que F3 mais plus long + 3

F10 Bacilles courts trapus et fins + 2

F13 Bacilles taille moyenne granuleux parfois en

chainettes + 3

F14 Gros bacilles + 5

F15 Bacillus avec granulation fines + 6

F16 Bacillus long et fins en faisceaux + 5


71

F18 Bacillus avec granulation fines F15 en plus petit + 2

I 1 Bacillus en chainette assez gros granuleux + 1

I 2 Bacilles assez long et fins + 1

I 4 Petit bacillus + 1

I 5 Bacillus assez gros granuleux spores centrale + 2

I 6 Bacillus granuleux avec spores ovoides non

déformantes + 2

I 7 Bacillus plus trapus différents de I5 et I6 + 1

I 10 Long bacilles sporulés flexueux + 3

I 11 Bacillus taille moyenne avec spores terminales

déformante + 4

I 12 Bacilles courts + 2

I 33 Bacilles courts + 1

I 33M Bacillus assez gros peu de chainettes + 6

Les souches isolées sont conservées sur gélose inclinée de milieu « conservation », formule

Institut Pasteur, et cela à température ambiante.

Les souches islées ont été testées pour leur activité coagulante, les bactéries gram- ox- ayant

été éliminées en raison du risque de pathogénicité.

II.2. Sélection des souches à activité coagulante

L’activité coagulante de 70 souches de la collection a été évaluée. Une étude préalable

concernant les milieux de production de l’enzyme a été entreprise et un nouveau milieu « au

jus de son » a été mis au point. Les extraits enzymatiques obtenus après culture ont été

caractérisés par les activités coagulante et protéolytique et un dosage de protéines.


72

II.2.1Choix des milieux de culture : étude préalable

Deux milieux de culture ont été expérimentés afin de rechercher l’activité coagulante des

différentes souches. Le premier est un milieu liquide de nature synthétique (Ageito et Vallejo,

2007), le deuxième est le milieu semi-solide (S.E.L) selon Rao et Mathur, 1976.

Après avoir testé un grand nombre de souches parallèlement sur ces deux milieux, il s’est

avéré que le milieu liquide ne favorisait pas la production de l’enzyme coagulante des souches

sélectionnées. Nous avons donc opté pour des milieux semi solide : le milieu au son selon

Rao et Mathur, 1976, et un milieu au son modifié mis au point pour des raisons pratiques.

II.2.1.1 Composition des milieux de culture

Milieu liquide : en g/l (Ageito et Vallejo, 2007)

20g : Glucose, 10g : (NH4)2SO4 , 1g: KH2PO4 ; 0,4g: MgSO4; 2mg FeSO4, 2 mg : MnSO4;

50mg : NaCl, 3g : Urée, 2g : Caséine.

Semi-solide en g/l préconisé par Rao et Mathur (1976).

50g : Son de blé, 3g : Extrait de levure:4 g Glucose : 2 g caséine : 3g Na2HPO4.

II.2.1.2 Préparation du milieu au son modifié

Nous avons élaboré un milieu au son modifié, réalisé à partir du jus de son. Le jus de son est

fabriqué en mélangeant dans un flacon 125g de son et 750ml d’eau. Le mélange est autoclavé

pendant 1h à 120°C. Une fois refroidi, ce mélange est pressé manuellement dans un tissu fin,

le jus est récupéré, la matière sèche est ensuite déterminée. 5 g de jus de son (3exemplaires)

sont placés dans des petits récipients en aluminium et mis à sécher à 105°C jusqu’à poids

constant.

Le milieu est préparé en fonction de la matière sèche du jus de son. Après calcul des

pourcentages, les ingrédients sont pesés et ajoutés au son, dont nous connaissons la

composition moyenne (annexe 1)

L’avantage de ce milieu est que les substances nutritives du son sont plus disponibles pour les

microorganismes. Le milieu est plus fluide et l’étape de filtration n’est plus nécessaire.


73

L’emploi de ce nouveau milieu a été validé par une étude comparative des résultats obtenus

avec ceux du milieu au son classique (Rao et Mathur, 1976).

Une fois les différents milieux préparés, ils sont répartis par 50 ml dans des erlems et sont

stérilisés par autoclavage (120°C pendant 20 minutes).

II.2.1.3 Ensemencement et incubation des milieux

L’ensemencement se fait à raison de 5 107 à 5 10

8 bactéries par millilitre de milieu. 5ml d’une

suspension bactérienne Mac Farland 3 (annexe 7) (environ 9 108/ml) sont ajoutés dans le

milieu. Le nombre des bactéries inoculées est vérifié par dénombrement sur milieux coulés en

boîte de Pétri au moment de l’ensemencement.

L’incubation a lieu à 30°C pendant 24H sous agitation à 110 rpm ((Poza et al., 2003). dans

une étuve rotative IKA® KS 4000i control shaker

II.3 Détermination des activités enzymatiques

II.3.1Obtention de l’extrait enzymatique brut

Après incubation, le milieu de culture au son de type classique est filtré sur un tissu pour

fromagerie, le filtrat est centrifugé à 4000 g pendant 30mn à 4°C dans une centrifugeuse

réfrigérée (JOUAN GR422). Le surnageant ou extrait enzymatique brut (EEB) est maintenu à

basse température pour la recherche des activités enzymatiques.

En ce qui concerne le milieu « au jus de son », l’étape de filtration est supprimée. L’E.E.B.,

est obtenu directement après centrifugation.

II.3.2 Méthode de détermination de l’activité coagulante

La détermination de l’activité coagulante du lait est faite selon la norme internationale FIL

(IDF) 157A :1997.

11 g de poudre de lait écrémé « low heat »standard de « Berridge »(substrat fourni par

l’INRA de Poligny. France) sont dissout dans 100 ml d’une solution de CaCl2 à 0,01M sous

agitation magnétique pendant 30minutes ; le pH est d’environ 6,5.Le substrat ainsi reconstitué

est reparti dans des tubes à essais à raison de 10 ml par tube. Les tubes sont placés dans un

bain marie à 32°C pendant 30 min.


74

1ml de l’extrait enzymatique est alors ajouté au substrat. Le tube est agité et on note à l’aide

d’un chronomètre, l’apparition de la première floculation sur la paroi du tube.L’activité

coagulante est exprimée en unité présure (U.P.) (ml).

L’unité présure correspond à la quantité d’enzyme contenu dans un ml d’extrait enzymatique

pouvant coaguler 10 ml de substrat en 100 secondes à 32°C.

UP = 10 V / Tv

V= Volume de lait

T = temps de coagulation en secondes

v = volume de l’enzyme.

L’activité coagulante peut être également exprimée en ‘’force coagulante’’, exprimée en unité

Soxhlet et représente le nombre de volumes de lait frais coagulés par un volume de présure en

40 minutes à 35 °C.

Une unité internationale UI= 400 SU (unité soxhlet) correspondant à la quantité d’enzymes

qui coagulent les 10ml de lait en 1 minute

F = 2400.V/T. v

Il existe une relation UP=F x 0,00457 (Alais, 1984).

II.3.3 Méthode de détermination de l’activité protéolytique

La méthode utilisée est celle de Murado et al. (1993).

L’activité protéolytique est mesurée en utilisant comme substrat une solution de caseine

(Sigma) à 1% dissoute dans NaOH 0,02M.

1ml de substrat est incubé avec 1ml de la solution enzymatique dans du tampon phosphate

pH6 pendant 10 min à 35 °C. La réaction est stoppée par l’ajout de 5ml de TCA à 5%. Après

un repos de 15 min, la solution est filtrée. Puis à 1 ml de filtrat, sont ajoutés 5ml de la solution

réactive, on incube à 35°C pendant 10 min, puis on ajoute 0 ,5 ml du réactif de Folin dilué au

1/3. Après agitation, on incube à 35°C pendant 30min, puis la DO est mesuré à 660 nm.


75

Une unité d’activité est définie comme la quantité d’enzyme qui libère 1µg d’acide aminé

exprimé en tyrosine par minute dans les conditions d’essais.

II.3.4 Dosage de la quantité protéique

Ce dosage est réalisé selon la méthode de Lowry (1951).

Le principe repose sur une méthode colorimétrique par référence à une courbe étalon établi à

partir d’une solution standard de protéine pure (BSA). La DO est mesuré à 660 nm.

II.4 Identification de souches à activité coagulante par voie biochimique

Un ensemble d’observations a permis de sélectionner, à partir de la collection initiale de 70

souches initiales, 8 souches dont l’activité coagulante semblait satisfaisante.

Après purification des souches et vérification du gram et du pouvoir caséolytique sur milieu

P.C.A. + lait, des tests d'identification en tubes et en galeries miniaturisées (Galerie API) ont

été réalisés pour les 8 souches sélectionnées.

Après ce travail, 3 d’entre elles ont fait l’objet d’une identification moléculaire.

II.4.1 Tests d'identification en tubes

Les manipulations ont été effectuées à partir des souches de 24h, ensemencées sur milieu

PCA. Pour chaque souche, une suspension dense (Mac Farland 2) a été réalisée dans de l'eau

distillée stérile. Elle a permis l'inoculation des milieux d'identification. Les milieux utilisés

ainsi que leur méthode d'ensemencement figure dans le tableau 12.

De plus, des milieux de Mossel +œuf (10 ml d'émulsion de jaune d'œuf /90 ml de milieu de

base) ont été utilisés. Des isolements ont été réalisés pour chaque souche afin d’en vérifier la

pureté.


76

Tableau 12: Caractères étudiés des bactéries sélectionnées ainsi que la technique

d'ensemencement des milieux employés.

Caractère étudié Milieu utilisé Méthode de préparation et d'ensemencement

Type respiratoire Milieu VF en tube

Veillon

-Régénération

-Piqure centrale : remonter la pipette en

tournant

Voie d'attaque du glucose Hugh et Leifson

-Régénération et ajout de 5 gouttes de glucose à

30%

-Piqure centrale

Utilisation des nitrates Bouillon nitrate

-Ensemencement avec trois gouttes de

suspension Mac Farland 2

-Réactif de Griess A et B; si pas de coloration,

utilisation de la poudre de zinc

Utilisation du mannitol et

mobilité Mannitol-mobilité

- Ensemencement par piqure centrale

Utilisation du citrate Citrate de Simmons -Ensemencement par 1 à 2 gouttes déposées sur

la pente

Production d'acétoïne (voie

de fermentation du

glucose)

Clark et Lubs

-Ensemencement avec 3 gouttes de suspension

Mac Farland 2

Attaque du glucose et du

lactose Kliger

-Ensemencement par 1 goutte le long de la pente

et piqure dans le culot


77

II.4.2 Galerie miniaturisée API 20E

Les galeries ont été ensemencées à partir de souches de 24h cultivées sur milieu PCA. Pour

chaque souche, une colonie a été prélevée et mis en suspension dans 5 ml d'eau distillée

stérile (Mac Farland 0,5).

Une première série de galeries a été ensemencée où chaque tube de la galerie a été rempli

selon les indications du fabriquant. Certaines lectures n'étant pas très franches, des galeries

ont été recommencées en modifiant les conditions d’ensemencement : les souches s'étant

révélées aérobies strictes, nous avons proposé, en ce qui concerne les tests relatifs à

l'utilisation des sucres, d'ensemencer tubes et cupules afin d'améliorer la lisibilité des

résultats.

II.4.3 Galerie miniaturisée API 50CH

Ces galeries miniaturisées permettent d'étudier l'utilisation par les souches bactériennes de 50

substances carbonées, soit par oxydation (utilisation du milieu BYNB: Buffered Yeast

Nitrogen Base), soit par fermentation (utilisation du milieu B dans le cas des Bacillus).

Après sélection de certaines souches, au total 6 galeries ont été ensemencées, respectivement

deux pour I33M et deux pour FK6A; les deux restantes ont été utilisées pour les souches

P47M et P47γ.

La première série de galeries a été ensemencée avec du milieu BYNB à 7g/l d'agar (étude de

l'oxydation des «sucres») pour les souches P47M, I33M et FK6A.

Le deuxième série de galeries concernait les souches I33M, FK6A et P47γ, et

l'ensemencement a été fait à l'aide d'ampoules API 50CHB/E medium destiné à l'identification

des Bacillus.

II.5 Identification par biologie moléculaire

Après avoir étudié plusieurs caractères biochimiques des souches retenues, nous avons pu

conclure que certaines souches sont semblables.

Les trois d’entre elles paraissant différentes (I33M,FK6etP47M), elles ont fait l’objet d’une

identification par biologie moléculaire (Laboratoire Geno-screen, Campus de l’Institut

Pasteur de Lille, 1 rue du Professeur Calmette - 59000 Lille - France).


78

II.5.1 Les différentes étapes de l’identification moléculaire

Elles ont été les suivantes :

Amplification des régions hypervariables de l’ADNr16S.

Purification et séquençage double sens des produits PCR.

Validation et correction des séquences.

Blast des séquences sur les bases de données internationales.

Rapport incluant la séquence au format fasta, l’interprétation des séquences en %

d’homologie et un arbre phylogénétique.

II.5.2 Cas de l’identification de la souche I33M

L’étude macroscopique et microscopique a été effectuée sur des boîtes de Pétri avec gélose

PCA (plate cout Agar) sur les colonies de 24 h.

Pour l'analyse de séquençage, l'ADN génomique a été extrait de la souche par la méthode

standard de l’alcool isoamyl en utilisant le kit PrepMan ultra (Applied Biosystems) et purifiés

sur des plaques Nucleo Fast (Macherey Nagel). L'amplification de l'ADNr 16S a été réalisée

par la technique de PCR, en utilisant la Taq ADN polymerase, l'ADN génomique comme

matrice, et des amorces 3’ (forward) et 5’ (reverse) universel

Les séquences de ces amorces sont les suivantes :

- F1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),

- R1 (5’GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’),

- F2 (5’-CTCCTACGGGAGGCAG3’)

- R2 (5’-GACACGAGCTGACGACA-3’).

Les produits PCR sont séquencés à l’aide de la technique Sanger sous des conditions

optimales réalisées par Geno screen (Laboratoire spécialisé en biologie moléculaire)

Après avoir reçu les résultats de séquençage, la séquence de nucléotides de l’ADNr 16S de la

souche a été déposée dans la GenBank, et alignée avec des séquences d’ADNr 16S

disponibles dans les bases de données publiques dans NCBI (National Center for

Biotechnology Information) (retrouvées dans les sites: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), et

LeBibi database (http://umr5558-sud-str1.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi)en utilisant le

logiciel de recherche de l’alignement local de base (BLAST).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://umr5558-sud-str1.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi


79

II.6 Optimisation du mileu de culture par un plan d’expérience de la

production d’enzyme

L’optimisation d’un milieu de production nécessite des méthodes qui consistent à faire

varier successivement chacun des facteurs qui influencent la culture, ce qui conduit à

minimiser le nombre d’expériences.

L’utilisation d’une méthodologie de recherche expérimentale ou plan d’expérience permet de

déterminer l’influence de nombreux paramètres, d’étudier leurs interactions et par la même

d’optimiser la réponse expérimentale.

Le plan choisi est un plan de surface de réponse de type composite centré (CCD).

II.6.1Méthodologie des surfaces de réponses

Cette étude est basée sur la conception composite centrale (CCD) utilisée pour obtenir des

données expérimentales, qui devraient correspondre à un modèle empirique polynomial du

second degré représentant des surfaces de réponse sur une gamme relativement large de

paramètres tel que rapporté par Duttet al. (2008).

Chaque facteur de la CCD a été étudié à 3 différents niveaux : niveau faible (-1), niveau

moyen (0) et niveau élevé (+1). Pour cela, l’approche de la surface de réponse a été utilisée et

une mise au point a été réalisée. La gamme et les niveaux des variables expérimentales

étudiées sont présentés dans le Tableau 13. Quatre différentes variables ont été utilisées pour

déterminer l’interaction entre différents facteurs (24 CCD avec 4 facteurs ont été appliqués)

incluant 6 points centrés et un ensemble de 60 expériences réalisées. Les valeurs centrales

(niveau zéro) choisies pour la conception expérimentale sont : son de blé 5% (p/v), caséïne

1.01% (p/v), température 37.5°C et agitation 150 rpm.

Les résultats ont été analysés grâce au module de conception expérimental du

STATGRAPHICS plus V5 .1 software (Statsoft, USA). Ce modèle a permis l’évaluation des

effets des conditions linéaires, quadratiques et interactives des variables indépendantes sur les

variables dépendantes. La significativité statistique des coefficients de régression a été

déterminée par le coefficient Test de T Student et le modèle d’équation du second degré a été

déterminé par le test de Fisher.


80

Des points de surface en 3 dimensions ont été conduits pour illustrer les effets principaux et

interactifs des variables indépendantes sur la production de protéases de la coagulation du lait

(Myers et Montgomery, 2002 ; Thys et al., 2006).

Pour la validation du CCD, seuls les facteurs de la température et de l’agitation ont été pris en

compte, et les facteurs restants ont été fixés à la base de données obtenue lors de la mise au

point de la conception expérimentale.

Dans notre plan, 30 essais dupliqués sont nécessaires pour optimiser les 4 paramètres, il faut

varier la température, l’agitation, la quantité de son ainsi que la quantité de caséine.

Nous avons réalisé deux plans d’expériences afin d’optimiser le milieu de culture pour la

production de l’enzyme coagulante.

Le premier plan d’expérience consistait à varier la teneur en glucose,en caséine avec la

température et l’agitation ; ce plan a montré que le glucose n’était pas significatif c’est à dire

le glucose n’influe pas sur la production et l’activité de l’enzyme.(annexe 4)

Lors du deuxième plan d’expériences, nous avons fait varier les paramètres suivants : caséine,

son, agitation, température. Les bornes sont déterminées sur la base des données

bibliographiques (Shieh et al., 2009, Kakoli Dutt et al., 2009)

Tableau 13 : Variation des bornes

Variables Minimum Code Milieu Code Maximum Code

Son %P/V

3 -1 5 0 7 +1

Caséine%P/V 0,02

-1 1,01 0 2 +1

Température °C 25

-1 37,5 0 50 +1

Agitation rpm 100

-1 150 0 200 +1


81

II.7 Suivi de la croissance de la souche I33M en fermenteur

Une fois les conditions optimales déterminées grâce au plan d’expériences, une croissance en

fermenteur a été effectuée. Les conditions de cette croissance correspondent aux valeurs

déterminées par le plan d’expérience précédemment décrit.

II.7.1. Préparation du milieu, conditions de culture et inoculum

La composition du milieu correspond à : 7% de son, 0 ,094% caséine, 0 ,3% Na 2, HPO4, 0,3%

extrait de levure. Nous avons préparé 1500ml de milieu stérile, le fermenteur ayant une

capacité de 2000 ml.

La culture s’effectue à une température de 39°C et sous une agitation de 150 rpm.

L’oxygénation est maintenue à 1 bar. Au cours du suivi, le pH n'est pas régulé.

L’inoculum est préparé à partir de la souche pure isolée sur boite de Pétri avec une

concentration de bactéries de 9. 108 UFC /ml (Mac Farland 3). 45ml de suspension

bactérienne sont introduites dans les 1500 ml de milieu.

II.7.2 Dénombrement et activités

Lors de la fermentation, la croissance est suivie par dénombrement des colonies sur milieu

P.C.A. après des dilutions décimales et successives. Le premier prélèvement s’effectue à To

après agitation du milieu au début de la fermentation ; les prélèvements sont ensuite effectués

toutes les 2 heures au début puis toutes les 3 h pendant 48h.

Une fois l’échantillon prélevé (5ml), son pH est mesuré, puis 1 ml est utilisé pour les

dilutions et ensemencé les boîtes de milieu de culture. Le reste de l’échantillon servira pour le

test de coagulation, le dosage des protéines et l’activité protéolytique.

II.8 Essai de purification partielle de l’extrait enzymatique brut :

L’extrait coagulant issu de Bacillus mojavensis est soumis à une chromatographie

d’exclusion moléculaire.


82

Principe :

La chromatographie d’exclusion moléculaire est une Méthode fréquemment utilisée dans

la purification et la séparation des protéines en utilisant un gel (Durang et Monsan, 1974).

Les protéines sont éluées dans un ordre décroissant, les protéines de poids moléculaire

élevé sont éluées les premières, les autres de masse moléculaire moyenne et petite passent à

travers les pores du gel et sont éluées tardivement.

Les molécules quittent donc un gel Séphadex placé dans une colonne de verre dans l’ordre

des masses moléculaires décroissantes (Kamoun,1977).

Appareillage :

Colonne en verre (PHARMACIA)

Réservoir pour la solution tampon

Pompe péristaltique

Collecteur de fraction à 100 tubes

Spectrophotomètre (réglé à 280 nm)

Préparation du gel:

Le gel Séphadex G 75 est lavé avec la solution tampon (pH 7 . 0,02M), puis mis à gonfler

dans un excès de cette même solution tampon pendant 24 heures. A l’aide d’une pompe à

vide, le gel est dégazé pour éviter la formation des bulles d’air dans la colonne.

Remplissage de la colonne :

Une fois le gel prêt, il est coulé sur les parois de la colonne afin d’éviter la formation des

bulles d’air. Le gel doit être bien tassé et homogène et présenter une seule phase. Ensuite la

colonne est équilibrée avec la solution tampon.

Dépôt de l’échantillon :

Avant le dépôt de l’échantillon,on procède à un lavage du gel dans la colonne avec la

solution tampon, ensuite 1ml de la solution enzymatique brut est déposé délicatement à la

surface du gel.


83

Elution :

Le débit d’élution des protéines(0,5 ml/min). Les éluats sont recueillis dans le collecteur de

fraction à raison de 2ml par tube.

La lecture de l’absorbance a été faite à une longueur d’onde de 280 nm.

La recherche de l’activité coagulante a été effectuée au niveau de chaque tube.

II.9 Caractérisation des extraits enzymatiques bruts et partiellement

purifiés :

Afin de pouvoir déterminer les conditions optimales de l’activité coagulante des protéases

extraites à partir de Bacillus mojavensis on procède à l’étude des paramètres qui influencent

sur le lait :la température, le pH, la concentration en CaCl2 .

La mesure de l’activité coagulante a été déterminée en mesurant le temps de coagulation

du lait en faisant varier les valeurs du paramètre étudié selon les conditions standards

(T=35°C, pH=6,4, concentration en CaCl2 =0,01M).

II.9.1.Influence de la température du lait :

la température optimale de coagulation du lait a été déterminée en faisant varier la

température du lait de 30 à 70°C avec un intervalle de 5°C ;les autres paramètres sont fixés

selon les conditions standards (pH=6,4, concentration en CaCl2 =0,01M ).

II.9.2.Influence du pH du lait :

Le pH optimum de coagulation du lait est déterminé en faisant varier le pH du lait de 5 à 7

par l’addition d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique, les autres paramètres sont

établis selon les conditions standards(T=35°C, concentration en CaCl2 =0,01M)

II.9.3.Influence de la concentration en CaCl2 :

L’activité coagulante a été déterminée en faisant varier les concentrations en CaCl2 allant de

0,005 à 0,1, les autres paramètres sont fixés selon les conditions standards (T=35°C, pH=6,4).


84

II.10 Essai de fabrication de fromage

Nous avons utilisé 6 litres de lait, avec des volumes des extraits enzymatiques bruts différents

pour les quatre essais que nous avons entrepris.

L’activité protéolytique étant très élevée, nous avons diminué la quantité d’extrait

enzymatique.

Tableau 14: Volumes d’EEB utilisés dans les essais de fabrication de l’EDAM

50% EEB de Bacillus mojavensis

50% de présure

4ml

0.08 ml (dilution de 0.25g de présure dans 3 ml

d’eau physiologique

100% EEB de Bacillus mojavensis 6ml

La pasteurisation du lait se fait à température de 90° C pendant 15 secs. Ce traitement va

permettre de réduire la flore banale et d’éliminer la flore pathogène, le lait est ensuite refroidi

à 38°C pour la présure et à 45 °C pour les extraits enzymatiques bruts.

II.8.1.2 L’ensemencement

Il s’agit de rajouter au lait déjà pasteurisé :

0.3g des ferments lactiques (mésophile et thermophile)

1.5g de phosphate mono-calcique.

Quelques gouttes de colorant (Rocou).

Le melange est agité pendant 10 min.

II.8.1.3L’emprésurage

Cette étape est réalisée quand le pH est d’environ de 6.4 et à la température de 38 °C pour la

présure et à 45°C pour les extraits enzymatiques bruts (cette température reste stable jusqu’à

la fin de la fabrication dans un bain marie), et cela avec une agitation pendant 1min. La dose

des E.E.B additioné est calculée préalablement à partir de la force coagulante.


85

II.8.1.4La coagulation

Le mouvement du lait doit être stoppé immédiatement afin d’évite l’obtention de caillé

feuilleté.

Le temps de coagulation des E.E.B est plus long que celui de la présure.

II.8.1.5Le décaillage

Il se fait par un couteau à une vitesse très faible pour limiter les pertes car le caillé est encore

fragile.

II.8.1.6 Le brassage

Avec une agitation et à l’aide d’un fouet dans le but dediminuer la taille des grains de caillé.

II.8.1.7Le délactosage

Un repos de 5 min est nécessaire pour le dépôt des grains au fond, puis l’évacuation du 1er

lactosérum. Ensuite un lavage des grains a été effectué, avec un volume d’eau à 38°C égal à

1/3 de la quantité de lactosérum soutiré soit 20 à 30 % du volume total du lait. Le 2ème

lactosérum povenant du 2ème

brassage est évacué après 20 min.

II.8.1.8 Le pré-préssage

Après avoir éliminé le lactosérum II, le caillé obtenu a été pré-pressé à l’aide d’une toile dans

un couscoussier.

II.8.1.9 Le moulage

Lesmoules sont couverts avec des toiles, et remplis avec le caillé.

II.8.1.10 Le préssage

Les moules remplis subissent un pressage à l’aide d’une plaquette pendant 5 heures (le

retournement se fait après 30 minutes).


86

II.8.1.11 Le salage

Après le démoulage, les boules de fromage sont déposés dans un bain de saumure pendant 4

heures à température de 10 à 15°C et une concentration en NaCl de 350g/l.

II.8.1.12 L’affinage

Dans des hâloirs d’affinage, les boules de fromage ont été placées sur des planches en bois, à

une T= 10° C avec 85 à 95 % d’humidité. La durée de l’affinage est au minimum 21 jours au

bout desquels les fromages sont retournés au moins une fois.

II.8.1.13Le lavage des boules

Après l’affinage les boules sont normalement plongées dans une solution fongicide si non

dans un bain d’eau salée puis lavées avec une brosse à main.

II.8.1.14 Le grattage des boules

Les boules sont grattées à l’aide d’un couteau pour éliminer la croûte dure externe.

II.8.1.15 Le conditionnement

A la fin les fromages sont enrobés avec de la paraffine fondue, et laissés un certain temps

pour sécher et emballés sous vide dans du papier cellophane.

Le procédé de fabrication est représenté sous forme d’un diagramme


87

Lait

Figure 9 :Diagramme de la fabrication d’un fromage type « EDAM » à la L.F.B

Pasteurisation : 90°C pendant 15

secondes.

Refroidissement à 38° C

Ensemencement du lait

Addition des ferments lactiques

mésophiles : 0 ,3 g / 6L agitation:10mn

Emprésurage

Coagulation

Découpage et brassage

repos du caillé :20 mn

Soutirage du lactosérum I

Délactosage

Ajouter le meme volume d’eau que

le lactosérum I soutiré

Soutirage du lactosérum II

Moulage

Lesmoules sont couverts avec des toiles,

et remplis avec le caillé.

Pressage

A une pression d’environ 5 à 6

bars pendant 5 heures

Démoulage

Salage

Bain de saumure

pendant4hhheures; T° : 10 à

15°C

Affinage

T= 10° C avec 85 à 95 %

d’humidité. La durée 21 jours

Lavage

Avec Une solution fongicide

Grattage

Pour éliminer la croûte dure

externe.

conditionnement

Enrobage avec de la paraffine fondue,

emballage sous vide


88

III. PROTEASE D’ORIGINE FONGIQUE

III.1 Isolement des souches

III.1.1 Méthode d’isolement

La méthode d’isolement des souches fongiques, à partir de prélèvements de sol, est identique

à celle qui a été employée pour les bactéries. A partir de la solution mère au 1/10, on effectue

aussi des dilutions que l’on ensemence à la surface d’un milieu de culture. Il s’agit du milieu

Sabouraud-chloramphénicol, additionné de 10% de lait écrémé stérile. L’incubation s’effectue

à 27°C pendant 4 à 5 jours.

III.1.2 Choix et purification des souches

Après incubation, de nombreux thalles de moisissures apparaissent à la surface du milieu. On

procède alors aux repiquages des différents types de moisissures afin de purifier les souches.

Nous avons obtenu 24 moisissures avec des caractéristiques sensiblement différentes. Ces

souches ont été codées afin de constituer la collection de base.

III.1.3 Observations macroscopiques et microscopiques

Des photos des observations microscopiques ont été prises au laboratoire de microbiologie du

département de génie biologique de l’IUT d’ANGERS, à l’aide d’un microscope ordinaire de

marque Olympus (CH30), muni d’une tête trinoculaire permettant l’adaptation d’un appareil

photo de la même marque.

III.2 Sélection des souches fongiques coagulantes

III.2.1 Les milieux de culture

Sur la base de travaux antérieurs (Srinivasan et al.,1964 ; Tubesha et al.,2003) nous avons

choisi deux types de milieux de culture :

un milieu liquide : le milieu de CZAPEK dont la composition est en gr/l : 2,5 NaNo3 ;

1 KH2PO4 ; 0,5 MgSO4 7H2O ; 0,5KCl ; 0,01 FeSO47H2O ; 10 glucose ; 10 de poudre

de lait écrémé. Il est réparti en erlen à raison de 50ml.


89

un milieu semi solide de composition suivante : 30gr de son de blé, 2,5g de poudre de

lait écrémé, additionné de 60 ml de sulfate d’ammonium à 0,01% (Levadoux, 1989),

réparti dans des erlenmeyers qui sont ensuite stérilisés à 121°C pendant 15min.

III.2.2 La préparation de l’inoculum et l’ensemencement des milieux

Pour chaque souche une fois purifiée, les spores sont récupérées à l’aide d’une solution de

tween 80 (0,01%) que l’on déverse dans la boîte de Pétri. Puis la surface est grattée et la

suspension de spores obtenue, constitue l’inoculum.

Le nombre de spores est alors déterminé par dénombrement à la cellule de Malassez. Le

volume de l’inoculum à introduire dans les erlens est calculé de manière à avoir environ 5.

106spores/ ml de milieu de culture (Guilherme Garcia da Silveira et al., 2005)

L’incubation des milieux de culture s’effectue par agitation à 27°C pendant 4 à 5 jours dans

un shaker (IKA®

KS 4000i control,) à 110 rpm.

III.3Determination des activités enzymatiques

III.3.1 Obtention de l’extrait enzymatique brut

Après fermentation, le contenu des erlens est d’abord filtré, puis à 4000g pendant

30minutes à 4°C (Jouan GR 422). Le surnageant constitue l’extrait enzymatique brut (EEB)

dont on détermine certaines activités enzymatiques et qui servira à la fabrication de fromage.

III.3.2 Méthode de détermination de l’activité coagulante

La méthode utilisée est identique à celle qui a été employée dans le cas des bactéries.

III.3.3 Méthode de détermination de l’activité protéolytique

L’activité protéolytique est mesurée selon la méthode de Murado et al. (1993)La même

méthode que celle utilisée pour les bactéries.


90

III.3.4. Dosage de la quantité protéique

Le dosage des protéines de l’extrait enzymatique est réalisé selon la méthode décrite par

Lowry et al (1951).

III.4 Sélection des souches fongiques

13 souches sur 24 se sont avérées possédant des enzymes coagulantes. Leurs caractéristiques

macroscopiques et microscopiques ont été étudiées afin de les différencier. Trois d’entre elles

qui offraient certaines différences (« 4D », SF15 et « 5F »), ont été envoyées pour

identification. Une seule espèce a été retenue, pour laquelle a été entreprise la suite du travail.

III.5 Identification des moisissures par biologie moleculaire

Les moisissures ont été identifiées avec la même méthode que pour celle des bactéries dans le

même laboratoire sauf que c’est l’ADNr-18S qui est séquencé

III.6 Optimisation de la production de la protéase

III.6.1 Optimisation des conditions opératoires

L’influence de la composition du milieu et de la concentration de chaque constituant, sur

l’activité coagulante et l’activité protéolytique de certaines bactéries et moisissures, a

beaucoup été étudié (Kakoli et al., 2009 ; Sathya et al., 2009 ; Srinu Babu et al., 2007).

A cet effet, nous avons étudie l’influence de quelques facteurs sur la production des protéases

à activité coagulante.

Des cinétiques de production ont été réalisées grâce à un plan d’expérience où plusieurs

facteurs varient simultanément.

La température, la quantité de son de blé, ainsi la quantité de caséine, ont été choisis comme

étant les variables qui affectent le plus la production de protéase (Palaiswamy, 2009), alors

que les autres composants du milieu restent constants (volume et densité de l’inoculum,

volume et concentration en sulfate d’ammonium).

A cet effet 20 expériences ont été réalisées, en répétant chaque expérience deux fois avec les

trois facteurs et chaque facteur varie sur 5 niveaux. (Tab. 15 et 16).

Toutes les expériences ont été réalisées dans des ErlenMeyers de 250 ml, les cultures sont

ensuite stérilisées à 120°C pendant 20min.


91

Tableau 15: Niveaux expérimentaux des trois facteurs utilisés dans le plan composite

centré.

Facteurs

Niveau

(-α) (-1) (0)

(+1)

(+α)

Température °C 21 25 31 37 41

Quantité de son (g) 14 20 30 40 46

Quantité de caséine(g) 0.2 0.5 1 1.5 1.8

Les résultats sont analysés grâce au logiciel statistica 6.

Tableau 16 : Matrice expérimentale utilisée pour mettre en place les expériences.

N° Température °C Quantité de son(g) Quantité de caséine (g)

Nn= 2K

=8

1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1

3 -1 +1 -1

4 +1 +1 -1

5 -1 -1 +1

6 +1 -1 +1

7 -1 +1 +1

8 +1 +1 +1

NA=2

K=6

9 -α 0 0

10 +α 0 0

11 0 -α 0

12 0 +α 0

13 0 0 -α

14 0 0 +α

Nce= 6

15 0 0 0

16 0 0 0

17 0 0 0

18 0 0 0

19 0 0 0

20 0 0 0


92

III.6.2 Ensemencement des milieux de culture

10 ml de la suspension de spore (≈3×106) (Guilherme et al ., 2005) servant à inoculer chaque

milieu de culture. Les milieux ensemencés sont ensuite incubés à cinq températures

différentes (25, 27, 31,35 et 37°C) pendant 5 jours.

III.6.3 Extraction de l’enzyme

Après l’incubation, 150 ml d’eau distillée stérile est ajoutée dans les Erlens. Après agitation

mécanique pendant 1 heure à 300 tours/min, le contenu est filtré puis centrifugé à 10 000

tours/min pendant 20 min à 4°C. Le surnageant constitue l’extrait enzymatique brut qui

servira pour le test de coagulation.

L’activité coagulante des 40 expériences est déterminée par la méthode de Berridje, (1951) et

les résultats sont interprétés par la méthode statistique selon le plan composite centré afin de

choisir les conditions optimales de la production.

III.6.4 Evaluation statistique des composants du milieu de culture par le plan

composite centré

La méthode utilisée, pour optimiser et caractériser comment les facteurs choisis affectent la

production, est celle préconisée par le plan composite centré à 5 niveaux.

Les conditions expérimentales (niveau de facteurs et réponses) figurent dans la matrice des

expériences présentées dans le tableau 15 et 16.

III.7 Essai de purification

III.7.1Précipitation au sulfate d’ammonium

Principe

Le sulfate d’ammonium provoque, dans une solution protéique, une déshydratation et une

précipitation des protéines induisant ainsi le phénomène de relargage. L’avantage du

relargage est que les protéines conservent leur conformation native et peuvent être ensuite

dissoutes habituellement sans dénaturation. Le choix s’est porté sur le sulfate d’ammonium du

fait de sa solubilité dans l’eau et de sa force ionique élevée (Kamoun, 1977).


93

Méthode

L’extrait enzymatique brut est soumis à une précipitation au sulfate d’ammonium à trois taux

de saturation à savoir (p/v) : 40%, 60%, 80%. A 140 ml d’extrait enzymatique, on ajoute

respectivement 34,86 g, 54,6g, 78,54g de sulfate d’ammonium sous agitation douce à 4°C.

La solution enzymatique ainsi saturée est mise à décanter pendant une nuit. Après

centrifugation à 13000 tr/min pendant 30mn à 4°C, le culot obtenu est mis en suspension, lavé

deux fois avec du tampon acétate de sodium (0.1 M ; pH 5,2), puis centrifugé à 13000 tr/min

pendant 20 min à 4°C. Les culots obtenus sont remis en suspension dans un volume réduit de

tampon acétate de sodium (0,1M ; pH 5,2). L’activité enzymatique de la protéase est dosée

dans le surnageant et le culot.

III.7.2 Dessalage de l’extrait enzymatique par dialyse

Principe

La dialyse est une technique de séparation qui permet d’éliminer d’une solution

macromoléculaire des ions ou petites molécules, par leur passage à travers une membrane

semi-perméable. Les protéines, par leurs poids moléculaires élevés, ne sont pas diffusibles.

Méthode

Nous avons utilisé une membrane semi-perméable. Le boudin contenant les protéines

précipitées par le sulfate d’ammonium est fermé à ses deux extrémités et maintenu en

suspension dans la solution de dialyse. La dialyse est contre le tampon acétate de sodium

(0,1M ; pH 5,2) à 4°C et sous agitation constante pendant 24 heures. Le tampon de dialyse est

régulièrement renouvelé.

III.7.3 Chromatographie d’exclusion moléculaire

Principe

C’est une technique qui permet la séparation des molécules en fonction de leurs poids

moléculaires et de leurs tailles.

Les molécules de masse moléculaire élevée sont exclues et éluées les premières, les autres de

masse moléculaires moyenne et petite passent à travers les pores du gel et sont éluées

tardivement, la séparation est réalisée dans un ordre décroissant des poids moléculaires

(Kamoun, 1997).

Mode opératoire


94

Pour la purification partielle de notre extrait enzymatique brut, notre choix s’est porté sur le

sephadex G -75 dont le domaine de fractionnement est compris entre 3 et 80 KDa.

Le gel gonflé et coulé dans une colonne de type pharmacia (1,5 30cm) est calibré par un

tampon acétate de sodium (0,1 M ; pH5, 2).

Un volume aliquote de 0,5 ml d’échantillon est élué avec le tampon acétate de sodium (0,1

M ; pH 5.2) à un débit de 0,93ml/min. Les éluâts sont recueillis dans un collecteur de fraction

à raison de 3 ml/tube et sur chaque fraction l’absorbance (280 nm) et l’activité coagulante

sont déterminées.

III.8 Caractérisation de l’extrait enzymatique purifié

Afin de déterminer l’activité coagulante optimale sur le lait, nous avons étudié l’influence de

certains facteurs.

III.8.1 Influence de la température

La température optimale de coagulation de lait a été déterminée en portant le lait à différentes

température, de 30 à 70°C avec un intervalle de 5°C. Les autres paramètres sont fixés selon

les conditions standards (pH du lait = 6,3, concentration de CaCl2= 0,01 M).

III.8.2 Influence du pH

Le pH optimal de coagulation de lait a été déterminé en mesurant le temps de coagulation du

lait à divers pH, de 5 à 7 avec un intervalle de pH de 0.5. Les autres paramètres sont fixés

selon les conditions standards (CaCl2 = 0,01, température 35°C).

III.8.3 Influence de la concentration en CaCl2

L’influence de la concentration en CaCl2 a été déterminée en faisant varier la concentration du

lait en CaCl2 de 0.005M à 0.05 M avec un intervalle de 0.005M (pH du lait = 6,3, température

35°C).


95

III.9 Essai de fabrication de fromage à pâte pressée non cuite type

« EDAM » à partir de l’extrait enzymatique brut (EEB) de Mucor

circinelloides

Il s’effectue suivant les mêmes opérations de fabrication à base de présure. La dose utilisée de

l’EEB est calculée préalablement à partir de sa force coagulante.

Deux essais de fabrication de fromage type EDAM ont été effectués:

Le procédé de fabrication est le même que celui utilisé dans le cas des enzymes bactériennes.

Chapitre 3

Résultats et discussion

Chapitre 3. Résultats et discussion

97

I. PROTEASE D’ORIGINE BACTERIENNE

I.1 Sélection des souches possédant une enzyme coagulante

leSur les 70 souches isolées, seulement 20 possèdent une activité coagulante. Leurs

caractéristiques sont représentées dans tableau 17

Tableau 17 : Bactéries possédant une enzyme coagulante

Code de la

souche

Aspect

macroscopique

Aspect

microscopique

Gram Caséolyse

(largeur en

mm)

Activité

coagulante

en

UP /ml

P 47

Colonies plates très

sèches qui adhèrent

fortement à la

gélose couleur mâte

Bacillus en

faisceaux

environ 1µm

X 2/3 µm

+ 6 0, 55

FK6

Colonies d’un blanc

mât brillante

gluante b

Bacillus petits,

longs, fins

différents des

autres

+

4 0,33

F13

Colonies rondes,

sèches avec une

empreinte au centre

Gros bacilles

+ 6

0 ,16

F3

(ressemble à F13)

Colonies rondes,

sèches avec une

empreinte au centre

Bacilles + 5 0 ,270

P48

Colonies jaunes

différentes des

autres, colonies

plates relativement

sèches jaune clair.

Bacilles taille

moyenne plus

long que P47

et plus gros

+

6 0,23

JF9

Colonies rondes

avec une empreinte

au centre , pas très

sèches.

Bacilles plus

minces

+ 5 0,056

I33

Colonies

envahissantes

petites plus ou

moins brillantes

Bacilles taille

moyenne

sporulant

+ 6 0,84


98

Code de la

souche

Aspect

macroscopique

Aspect

microscopique

Gram Caséolyse

(largeur en

mm)

Activité

coagulante

en

UP /ml

P43

Colonies

légèrement

bombées avec une

empreinte au centre

Ressemble à

JF9 en plus

minces bacilles

+ 1 0,083

F15

Souche initiale

Colonies sèches

mâtes avec un

centre

Bacillus + 4 0,27

A3

Colonies luisantes

beiges lisses

Bacilles courts - 6 0,33

C5

Colonies brillantes

lisses


C6

Petites colonies

rondes, beiges

brillantes


I33M Colonies plates, très

fines sèches très

étalées avec un

centre

Bacilles assez

gros amas

sporulant,

spore terminale

+ 6 1,67

FK6A Colonies larges,

muqueuses, bords

irréguliers qui

s’assèchent au bout

de 48H

Très longs

bacilles, spore

légèrement

déformante

+ 5 1,30

FK6B Larges colonies

muqueuses à la

surface, bordures

irrégulières, restent

muqueusesjusqu’à5

jours très

caseolytiques

Bacilles

formant des

petites

chainettes,

spores

terminales

légèrement

déformantes

+ 3mm 0,84

P47A Colonies sèches,

bordures

irrégulières

dentelées, surface

planes

Bacilles longs

et fins assez

polymorphes

+ 6mm 0,56

P47β Colonies sèches

mâtes, bordures

dentelées

Petits bacilles

en faisceaux,

pas de spore en

apparence

+ 6mm 0,84

P47M Colonies

irrégulières très

sèches ont

tendance à s’étaler

Bacilles courts

et fins, plus

fins que FK6

+ 6mm 1,67

P47R Ressemble à P47M Bacilles courts

peu sporulés

+ 6mm 1,67

P47 γ Ressemble à P47β Bacilles plus

longs et plus

fins que P47β

+ 6mm 1,67


99

I.2 Observations macroscopique et microscopique

Tableau 18: Observation macroscopique des 8 différentes souches

Souches Observation

I33M Colonies gris-verte avec le centre plus foncé

FK6A Colonies gris vert clair, assez grosses (4-3 mm)

FK6B Colonies gris-vert clair, assez grosses (de 2 à 5 mm)

P47A Colonies noir-vert

P47β Petites colonies (<1 mm) très sombres

P47γ Colonies (1-2 mm) très sombres

P47M Colonies (2-3 mm) gris-verdâtre avec le centre plus foncé

P47R Colonies (2 mm) gris-verdâtre avec le centre plus foncé

Les lignes de même couleur représentent les souches ayant des ressemblances

macroscopiques sur ce milieu.L'observation macroscopique a été faite sur des souches de 24h.

De couleur blanche crème, certaines présentent des colonies de type R (irrégulières et sèches :

cas de la souche P47); d'autres sont bombées et visqueuses quand on les prélève (colonie M :

cas de la I33).

FK6A

A A

AAA

AAA

AAA

AA

I33M


100

Figure 10: Photos des observations microscopiques (FK6A, I33M, P47M et JF9)

Pour leur aspect microscopique, ce sont toutes des bacilles Gram+.Toutes les souches

présentent sur milieu PCA+lait, des auréoles caractéristiques de l'hydrolyse de la caséine.

Cependant les zones de caséolyse sont plus ou moins grandes suivant les souches.

I.3 Tests d'identification en tubes

Huit souches offrant les caractéristiques que nous recherchions, avaient été sélectionnées :

I33M, FK6A, FK6B, P47A, P47β, P47, P47R et P47γ

Les résultats des tests biochimiques effectués sont présentés dans les tableaux suivants (19,

20, 21, 22).

Kligler

Les résultats pour le milieu kligler ne sont pas très nets même après 48h d'incubation. On peut

cependant avoir une idée des tubes qui vont virer au jaune(Tableau 19).

P47M JF9


101

Tableau 19: Résultats des tests sur les tubes Kligler

Souche Résultats

I33M Pousse faible, couleur initiale

FK6A Pente et culot rouge

FK6B Pente et culot rouge

P47A Pente et culot rouge

P47β Pente rouge, culot jaune

P47γ Pousse faible, couleur initiale

P47M Pente rouge, culot jaune

Mannitol mobilité

Le caractère mobilité ne peut être étudié car les souches n'ont pas poussé le long de la piqure.

Toutes les souches se sont développées en surface mise à part la P47R (aucun

développement). Quatre tubes ont viré au jaune; ce sont les tubes des souches P47A, P47β,

P47γ et P47M, elles sont donc Mannitol+.

Hugh et Leifson

Aucun changement de couleur net n'a pu être observé. Cependant, certains tubes ont

commencé à virer au jaune (Tab.20). De plus les souches se sont surtout développées en

surface.

Milieu Citrate de Simmons

Pour les souches P47R, P47β, P47A et I33M certaines zones commencent à virer au bleu,

elles sont donc citrate +, les colonies sont alors visibles et jaunes.

Pour toutes les autres, il n'y a aucun changement de l'indicateur coloré.

Tube Veillon

Ce milieu permet d'étudier le type respiratoire de la bactérie. Dans notre cas, il a démontré

que toute les souches sont aérobies strictes. Cependant pour certaines, on peut se demander si

elles ne seraient pas aussi micro-aérophiles ou si ce résultat est dû à des bulles d'air qui

auraient été introduite lors de l'ensemencement.


102

Tableau 20 : Résultats des tests et interprétation des Hugh et Leifson

Souche Résultats Interprétation

I33M Aucun changement de

l'indicateur coloré

Pas d'oxydation du glucose

ou ensemencement

insuffisant

FK6A Virage au jaune en surface Oxydation du glucose

FK6B Aucun changement de

l'indicateur coloré

Pas d'oxydation du glucose

ou ensemencement

insuffisant

P47A Vire au jaune Oxydation du glucose

P47β Vire au jaune Oxydation du glucose

P47γ Vire au jaune Oxydation du glucose

P47M Vire au jaune Oxydation du glucose

P47R Vire au jaune Oxydation du glucose

Clark et Lubs

Après avoir vérifié que toutes les souches se sont développées dans le milieu, la voie de

Voges-Proskauer a été testée.

Il est apparu que toutes les souches étaient positives à ce test.

Bouillon nitrate

Comme dans le cas précédent, il a fallu tout d'abord vérifier que toutes les souches s'étaient

développées sur le milieu.

Au test de Griess, toutes les souches sont positives sauf I33M. Elles sont donc toutes nitrate+

sauf une.

I.4 Test d’identification en galerie pour les différentes souches

I.4.1 Galerie Api 20 E


103

Tableau 21: Résultats des tests en galerie pour les différentes souches

Souche

ON

PG

AD

H

LD

C

OD

C

Cit

rate

H2

S

Uré

e

TD

A

Ind

ole

V.P

.

Gél

ati

na

s

e

I33M + - - - - - - - - + +

FK6A - - - - + - + - - + +

FK6B - - - - + - - - - + +

P47A + - - - + - - - - + +

P47β + - - - + - - - - + +

P47γ + - - - + - + - - + +

P47M + - - - + - + - - + +

P47R + - - - + - + - - + +

Souche

Glu

cose

Ma

nn

ito

l

Ino

sito

l

So

rbit

ol

Rh

am

no

se

Sa

cch

aro

s

e Mel

ibio

se

Am

ygd

ali

ne

Ara

bin

ose

I33M +/- + +/- + - + - + -

FK6A - +/- +/- - - - - - -

FK6B - +/- - - - - - - -

P47A + + + + - + - + -

P47β + + + + - + - + -

P47γ + + + + - + - + -

P47M + + + + - + - + -

P47R + + + + - + - + -


104

A partir des résultats des galeries (Tab 21), on peut voir apparaître certaines différences entre

les souches. Ainsi P47A et P47β ont les mêmes caractéristiques, elles diffèrent des autres

souches P47 qui sont toutes uréase +.

Lorsque l'on compare les caractères qui ont été étudiés en galerie et en tube on peut constater

des différences.

Ainsi pour le caractère citrate, les résultats obtenus sont différents (Tab.22).

Tableau 22: Comparaison entre les tests en tubes et les galeries pour un même caractère

Souches Résultats en tube de

Simmons

Résultats de la galerie API

20 E

I33M Citrate + Citrate -

FK6A Citrate - Citrate +

FK6B Citrate - Citrate +

P47A Citrate + Citrate +

P47β Citrate + Citrate +

P47γ Citrate - Citrate +

P47M Citrate - Citrate +

P47R Citrate + Citrate +

I.4.2Galerie API 50 CH

Pour la première série de galeries ensemencées avec le milieu BYNB gélosé, les lectures se

font par estimation du trouble du à la croissance bactérienne. Bien que les souches soient

aérobies strictes, les résultats n'ont pas été très lisibles: c'est pourquoi l'étude a été reprise à

l'aide du milieu B (Bacillus) qui contient un indicateur coloré (rouge de phénol).


105

Figure 11: Lecture à 24h et 48h de la galerie API 50CH pour la souche I33M

Figure 12:Lecture à 24h et 48h de la galerie API 50CH pour la souche P47γ

Figure 13: Lecture à 24h et 48h de la galerie API 50CH pour la souche FK6A

A partir des résultats obtenus, nous avons sélectionné trois souches, I33M, P47M et FK6A

Les tests d'identification en tubes ont fourni des résultats plutôt mitigés; en effet pour la

plupart des tests, les réponses n'étaient pas franches, ce qui n'a pas permis d'établir avec

certitude, si les souches possédaient tel ou tel caractère.


106

Cependant, des ressemblances ont pu être notées entre les souches et il apparaissait peu

probable que les huit souches soient toutes différentes. C'est pourquoi seules certaines

souches ont été choisies pour l'étude en galeries miniaturisées Lorsque les galeries API 20E

ont été réalisées, on a pu remarquer que la I33M et les P47 avaient beaucoup plus de points

communs que les FK6.

A partir des résultats des galeries 50 CH et du tableau d’identification, Les souches ont une

forte probabilité d'être des Bacillus subtilis.

Après avoir vérifié plusieurs de leurs caractères, on peut en conclure que certaines des

souches sont semblables et qu'il y a une forte probabilité qu'elles appartiennent toutes à

l'espèce B. subtilis. Cependant, pour vérification, les souches I33M, FK6A et P47M ont été

envoyées à un laboratoire de biologie moléculaire, afin d'avoir une confirmation.

I.5 Résultats de l’identification bactérienne

Après avoir envoyé nos trois souches au laboratoire de biologie moléculaire pour

identification, nous avons reçu les résultats suivants :

FK6A :Bacillus Amyloliquefaciens

P47M :Bacillus subtilis

I33M :Bacillus mojavensis

Mais nous avons choisi la souche I33M pour la suite du travail, car c’est la bactérie qui

possède une relative faible activité protéolytique et une bonne activité coagulante


107

Identification de la souche :

L’analyse de la séquence de gène de l’ADNr 16S a été décrite comme étant nécessaire,

principalement pour détecter certaines erreurs d’identifications du Bacillus (Ben et al., 2011).

Cette technique est également l’une des plus utilisées aujourd’hui pour l’identification

d’espèces étant donnée sa rapidité, sont efficacité et sa reproductibilité comparée aux

techniques conventionnelles utilisant des critères morphologiques et physiologiques. Pour une

meilleure caractérisation, le produit PCR de la souche I33M a été analysé par électrophorèse,

purifié, et enfin séquencé par GenoScreen (Campus de l’Institut Pasteur de Lille, France).

En plus de l’identification biochimique et morphologique, le gène de l’ADNr 16S a été

amplifié avec succès à partir de l’ADN génomique de la souche I33M (Fig.13). Cette

séquence de 999 paires de bases a une longueur de séquence Query de 195 A, 254T, 321C et

229G. La recherche BLAST de la séquence du gène de l’ADNr 16S comparée à d’autres

séquences de la base de données a montré 100% d’homologie avec la souche B. mojavensis.

Notre souche a été nommée B. mojavensis I33M et les bases de données nous ont permis

d’élaborer un dendrogramme phylogénétique pour I33M et les souches associées (Fig.14).

L’Analyse phylogénétique montre que la souche testée est proche de la souche B .subtilis

Des résultats similaires ont été reportés par Thuy et Bose (2011).

Roberts et al., 1994 ont également reporté que l’isolat a été ensuite retrouvé appartenant a un

phénotype associé au B. subtilis qui a été récemment décrit comme étant une souche B.

mojavensis.

B. mojavensis peut être distinguée uniquement par des différences dans la composition

d’acides gras de la cellule entière, dans la divergence de l’analyse de la séquence d’ADN et de

la résistance à la transformation génétique au sein du groupe B. subtilis (Bacon et Hinton,

2001)

La séquence d’ADNr 16s de la souche I33M est représentée à la figure 14


108

CCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTT

GCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTT

GCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCC

TAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCT

TTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTAC

GCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGAC

CCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCA

ATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTT

TCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTT

TACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATT

CCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCA

GGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCA

TCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTA

GCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCC

GCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCAC

Figure 14 : Résultat séquences D’ADNr-16S obtenues(Souche I33M)

Séquence similaire à Bacillus mojavensis à 100% de similarité sur un fragment de 999 pb

Le dendrogramme de la souche est representé à la figure 15


109

Figure 15 : Dendrogramme de la souche I33M (Bacillus_mojavensis)


110

I.6 Résultats de l’optimisation

Tableau 23 : Résultats du plan d’expérience

N° ordre

son caséine température agitation Temps de

coagulation (s)

Activité coagulante

(UP)

Activité protéolytique (µg TYR/ml)

1 -1 0 0 0 55 1,82 21,18

2 0 0 0 0 37 2,7 28,92

3 0 0 1 0 44 2,27 27,07

4 0 0 0 0 47 2,13 26,2

5 1 0 0 0 35 2,86 26,2

6 0 0 0 0 43 2,33 28,3

7 0 -1 0 0 35 2,86 29,4

8 1 1 -1 -1 9000 0,01 19,62

9 0 0 0 0 42 2,38 26,4

10 0 0 -1 0 420 0,24 24,39

11 1 1 1 1 10800 0,01 20,74

12 1 -1 -1 1 1980 0,05 15,4

13 -1 1 -1 -1 198 0,51 19,93

14 -1 -1 1 -1 - - 10,64

15 0 0 0 -1 660 0,15 22,28

16 -1 1 1 1 240 0,42 25,4

17 -1 -1 1 1 840 0,12 13,73

18 1 -1 1 -1 - - 11,31

19 0 0 0 0 41 2,44 29,6

20 1 -1 1 1 - - 14,4

21 0 1 0 0 75 1,33 32,9

22 -1 1 1 -1 3600 0,03 20,13

23 -1 -1 -1 1 1680 0,06 11,45

24 -1 -1 -1 -1 6000 0,02 10,7

25 0 0 0 0 46 2,17 26,2

26 0 0 0 1 240 0,42 21,2

27 -1 1 -1 1 - - 10,24

28 1 1 -1 1 9000 0,01 19,34

29 1 1 0 -1 240 0,42 21,38

30 1 -1 -1 -1 9000 0,01 12,63

31 -1 0 0 0 56 1,79 22,4

32 0 0 0 0 38 2,63 29,3

33 0 0 1 0 45 2,22 26,4

34 0 0 0 0 42 2,38 25,3

35 1 0 0 0 30 3,33 25,71

36 0 0 0 0 37 2,7 27,4


111

37 0 -1 0 0 35 2,86 29,6

38 1 1 -1 -1 9000 0,01 15,76

39 0 0 0 0 36 2,78 25,8

40 0 0 -1 0 480 0,21 24,8

41 1 1 1 1 60 1,67 29,8

42 1 -1 -1 1 - - 12,3

43 -1 1 -1 -1 7080 0,01 19,01

44 -1 -1 1 -1 - - 10,43

45 0 0 0 -1 480 0,21 23,2

46 -1 1 1 1 10800 0,01 20,15

47 -1 -1 1 1 2700 0,04 9,89

48 1 -1 1 -1 - - 12,4

49 0 0 0 0 46 2,17 30,85

50 1 -1 1 1 300 0,33 21,84

51 0 1 0 0 72 1,39 28,48

52 -1 1 1 -1 9000 0,01 21,82

53 -1 -1 -1 1 1680 0,06 12,2

54 -1 -1 -1 -1 4800 0,02 9,14

55 0 0 0 0 47 2,13 26,8

56 0 0 0 1 600 0,17 23,82

57 -1 1 -1 1 - - 12,4

58 1 1 -1 1 7200 0,01 18,2

59 1 1 0 -1 6300 0,02 20,85

60 1 -1 -1 -1 9000 0,01 12,96

Réponse optimisée de l’activité coagulante :

Valeur optimale = 2,40661

Facteur minimum maximum Optimum

------------------------------------------------------------------------------

Son 3, 0 7, 0 7, 0

Caséine 0, 02 2,0 0,0941462

Température 25, 0 50,0 39,2587

Agitation 100, 0 200,0 150,799


112

Surface de Réponse Estimée

son=7,0,Caseine=0,094

Temperature

Agitation

Activité

co

ag

ula

nte

Agitation

2530

3540

4550 100 120 140 160 180 200

-0,1

0,4

0,9

1,4

1,9

2,4

2,9

Figure 16 : Surface de réponse de l’activité coagulante de la protéase produite par

Bacillusmojavensis, avec effet de la température et de l’agitation.

Diagramme de Pareto pour l'Activité coagulante

Effet s tandardisé

+-

0 2 4 6 8 10

B:Caseine

D:Agitation

A:son

C:T emperature

CC

DD

Figure 17 : Graphique de Pareto obtenu avec les résultats des essais du plan. D : agitation ;

DD : effet au carré de l’agitation ; A : quantité de son ; CC : effet au carré de la température ;

AA : effet au carré de la quantité de son ; C : Température ; B : caséine.


113

Tableau 24: L’analyse de la variance de l’activité coagulante

R-carré = 83,924 %;R-carré (ajusté pour DL) = 82,1041 %; erreur standard estimé = 0,485462;

l’erreur absolue moyenne= 0,330268; Durbin-Watson statistic = 2,11832 (P=0,2560); Lag 1 residuel

auto corrélation = -0,0634366

Tableau 25 : Effets estimés de l’activité coagulante

Facteur Valeurs --------------------------------------------------------------------------------- Moyenne 2,27234 ± 0,103779 A:son 0,212778 ± 0,161821 B:Caseine -0,0316667± 0,161821 C:Temperature 0,351667 ± 0,161821 D:Agitation 0,107778 ± 0,161821 CC -1,20806 ± 0,369922 DD -3,20306 ± 0,369922 Block 0,0466667 ± 0,125346 ----------------------------------------------------------------------------------- Les erreurs types sont basées sur l'erreur totale avec 52 d.L.

Tableau 26 : Coefficient de régression de l’activité coagulante

---------------------------------------------------------------------- Constante -18,5167 ----------------------------------------------------------------------- A:son 0,0531944 B:Caséine -0,0159933 C:Température 0,304002 D:Agitation 0,193262 CC -0,00386581 DD -0,000640613 ----------------------------------------------------------------------

Paramètres Somme des carrés DL Moyenne des carrés

F-Ratio P-Value

A:son 0,407469 1 0,407469 1,73 0,1943

B:Caseine 0,009025 1 0,009025 0,04 0,8456

C:Temperature 1,11303 1 1,11303 4,72 0,0343

D:Agitation

0,104544 1 0,104544 0,44 0,5083

CC 2,51345 1 2,51345 10,66 0,0019

DD 17,6693 1 17,6693 74,97 0

blocks 0,0326667 1 0,0326667 0,14 0,7112

Total error

12,255 52 0,235673

Total (corr.)

76,2317 59


114

I.6.1 Discussion

Optimisation par méthode de surface de réponse:

L’approche du modèle statistique utilisant la méthode de surface de réponses est utilisée pour

étudier les effets interactifs de différents facteurs chimiques et physiologiques sur la

production de la protéase coagulant le lait par B. mojavensis. L’objectif principal est de

maximiser l’activité de coagulation et de minimiser l’activité protéolytique. L’expérience a

été effectué 60fois et les données ayant le plus d’influence sur la réponse finale du système

ont été identifiées à partir de l’interaction de quatre facteurs : son de blé (source de carbone)

et caséine (source d’azote), température et agitation (facteurs physiques), ont été examinés à

travers la RSM suivant le CCD. Nous rappelons que les niveaux faibles et élevés (% p/v)

codés entre parenthèses pour ces facteurs sont définis à 3(-1) et 7(+1) pour le son de blé,

0,02(-1) et 2.0(+1) pour la caséine, 25°(-1) et 50°C(+1) pour la température, 100rpm(-1) et

200(+1) pour l’agitation.

Les résultats des expériences CCD pour l’étude de ces variables sur la production de protéases

dans l’activité de coagulation du lait (IMCU/ml) sont présentés dans le tableau 23

accompagnés des réponses observées.

L’analyse statistique de ces résultats montre que la gamme étudiée, effet quadratique de la

température et de l’agitation a un effet considérable sur la production de protéases suivi de

l’effet quadratique de l’agitation.

La température a un effet significatif (Fig.16). Le tableau 25 montre les effets estimés et les

interactions du modèle de surface de réponse du second ordre sous la forme d’une analyse de

la variance (ANOVA) et sont présentées dans le tableau 24.

Le test-F de Fisher démontre une significativité dans le modèle de régression où le coefficient

de détermination R² était de 0.8392. Le R² statistique indique que le modèle établi explique

83,924% de la variabilité de l’activité de coagulation du lait. Le R² ajusté, le plus adapté à la

comparaison des modèles avec des nombres de variables indépendantes, est de 82,1041%..

Cette équation de régression (en termes de facteurs codés) des niveaux de protéase produite

est exprimée en IMCU/ml(Y) en fonction du son de blé (A), de caséine(B), de température

(C) et de l’agitation (D).


115

Y= -18.5167 + 0.0531944* A – 0.0159933*B + 0.304002*C + 0.193262*D –

0.00386581*CC -0.000640613*DD.

Les coefficients de régression sont listés dans le tableau 26. La magnitude des effets indique

un niveau de significativité de la variable de production de protéases. Parmi les variables

étudiées ; il semblerait que seuls les facteurs physiques (température et agitation) sont

identifiés comme les variables les plus significatives dans l’influence de la production des

enzymes coagulantes (Fig. 16) que le son de blé et de caséine.

En réalité, les résultats des réponses observées dans les expériences réalisées en utilisant le

CCD (Fig.17) montre que la température et l’agitation sont des facteurs limitants pour la

production d’enzyme quel que soit la concentration du substrat. La combinaison des niveaux

de facteurs qui maximisent l’activité de coagulation du lait a été donnée par un milieu

composé de son de blé : 7.0% ; caséine : 0,094% ; température 39,2% et agitation : 150rpm.

La valeur optimale de l’activité coagulante est de 2,4 (IMCU/ml).

La réponse de surface en 3dimensions est représentée dans la figure 16, qui montre les effets

relatifs de 2 facteurs : température et agitation qui sont en association que lorsque tous les

facteurs (concentration de son de blé et de caséine) sont maintenus à leur niveau central.

Il n’a été observé qu’une augmentation de la production de protéases à des températures

relativement élevée et une production de protéase maximale obtenue de 38 à 39° (Fig.16).

Notre modèle indique que la température a un effet majeur sur la production de protéase par la

souche B. mojavensis. Des résultats d’études RSM ont aussi montré que la température est un

facteur très important dans la production de protéase microbienne (Wu et Hang, 2000 ;Thys

et al., 2006). La méthodologie RSM a été montrée comme étant très efficace dans la

détermination des conditions optimales pour la production de protéases par Bacillus (Thys et

al., 2006)

En général, il est clairement montré qu’aucun milieu défini n’a été établi pour la production

de protéases à partir de sources microbiennes de protéases (Gupta et al., 2002). Chaque

organisme ou souche a sa propre exigence de conditions spéciales pour la production

d’enzyme maximale. Ainsi, dans notre cas, les acteurs physiques, température et agitation

sont plus significatifs que les facteurs nutritionnels.


116

I.7 Résultats de la croissance durant lafermentation de la souche I33 M

Les dénombrements ont lieu au bout de 24h. L'activité coagulante a été mesurée ainsi que le

pH.Les résultats obtenus de la croissance sont représentés dans le tableau 27 et illustrés par

les figures 19, 20, 21, 22, 23, 24.

Un suivi de croissance et divers dosages ont permis d’évaluer les conditions de la production

de l'enzyme coagulante par la souche I33M.

Tableau 27 : Résultats du suivi de la fermentation

Temps

d'incubation

(en h)

N Ln (N) pH AC (en

UP/ml)

Protéine

µg/ml

Protéine

mg/ml

AP

µg/ml/min

0 1,42E+06 14,1648862 6,7 0 3400 3,4 9,8

1,5 1,36E+06 14,1256655 6,67 0 3200 3,2 9,4

3 2,41E+07 16,9973451 6,68 0 3357 3,4 10,2

4,5 4,36E+08 19,8939865 6,5 0 3314 3,3 9,4

6 4,91E+08 20,0117695 6,23 0,00641026 3893 3,9 12,9

7,5 7,55E+08 20,4416261 6,14 0,01754386 3871 3,9 18,1

10,5 1,25E+09 20,9500392 6,34 0,04761905 4164 4,2 21,2

13,5 1,11E+09 20,8268065 6,26 0,09803922 4257 4,3 28,4

16,5 1,09E+09 20,8102772 6,27 0,16666667 4286 4,3 28,9

19,5 1,66E+09 21,2322716 6,14 0,27777778 4071 4,1 34,0

22,5 1,43E+09 21,0790313 6,01 0,35087719 4493 4,5 37,6

25,5 1,58E+09 21,1818408 6 0,35087719 4829 4,8 31,9

28,5 1,50E+09 21,1287309 6,08 0,48780488 3936 3,9 43,1

31,5 1,81E+09 21,3160903 6,1 0,52631579 4271 4,3 41,8

34,5 2,26E+09 21,5402384 6,12 0,5 5586 5,6 47,3

37,5 1,88E+09 21,3555043 6,22 0,55555556 4350 4,4 48,2

40,5 2,09E+09 21,4608648 6,22 0,52631579 4286 4,3 48,5

43,5 1,67E+09 21,2377212 6,24 0,60606061 4343 4,3 44,9

46,5 1,84E+09 21,3310532 6,26 0,64516129 4321 4,3 49,5


117

Figure 18 : Evolution de la croissance bactérienne en fonction du temps d’incubation

Figure 19 : Détermination du temps de génération

G = 0,36048844 G : temps de génération

21,629306721min36s taux de croissance= 1,9228

y = 1,9228x + 11,237 R² = 1

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5

Ln (

N)

Temps d'incubation (en h)

14

15

16

17

18

19

20

21

22

0 10 20 30 40 50

Ln(N

)



118

Figure 20 : Effet de la variation du pH du milieu sur la croissance bactérienne

Figure 21 : Evolution de la croissance et de l’activité coagulante de l’enzyme en

fonctiondu temps d’incubation de la souche

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

14

15

16

17

18

19

20

21

22

0 10 20 30 40 50

pH

Ln(N

)


Ln (N)

pH

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

14

15

16

17

18

19

20

21

22

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

AC

Ln(N

)


Ln (N)



119

Figure 22 : Variation du taux de protéines totales de l’extrait enzymatique brut en fonction

du temps d’incubation de la souche

Figure 23 : Variation de l’activité protéolytique de l’enzyme en fonction du temps

d’incubation de la souche

I.7.1Analyse des résultats

La croissance de la souche I33M en milieu optimisé au son a été suivie pendant deux jours,

par dénombrement des cellules viables sur milieu P.C.A.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50

Pro

téin

es m

g/m

l


0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0 10 20 30 40 50

tyr

osi

ne

µg/

ml/

min



120

L’analyse de la courbe de croissance Ln (N) en f(t) (Fig.18) montre qu’après une courte

période de latence de moins de 1h, la phase exponentielle est rapide et la phase décélération

est atteinte en moins de 5h. La phase stationnaire s’est prolongée sur la durée de l’expérience,

sans que l’on puisse mettre en évidence au bout de deux jours une phase de déclin.

Le taux de croissance népérien calculé sur les 3 points de la phase exponentielle (Fig.19)

montre une vitesse de croissance extrêmement rapide puisque le temps de génération

exponentiel est évalué à 22 mn environ.

La mesure du pH en cours de croissance (Fig.20), montre que le pH voisin de 7 au départ se

stabilise à 6 dès le début de la phase stationnaire.

Concernant les activités coagulante (Fig.21) et protéolytique (Fig.23) et du surnageant, elles

augmentent progressivement dès le début de la phase stationnaire et cela jusqu’à la fin de

l’expérience. L’activité coagulante semble augmenter moins rapidement et n’apparaitre de

façon significative qu’au bout d’une dizaine d’heure de culture. La quantité totale de protéines

du surnageant augmente légèrement en parallèle de ces activités (Fig.22).

I.7.2.Discussion

La souche I33M en culture dans le milieu au son, se caractérise par un temps de génération

très faible, ce qui témoigne de son aptitude à mobiliser et dégrader les constituants du milieu

de culture employé.

La phase stationnaire se prolonge sur les deux jours de l’expérience : on peut supposer que la

stabilisation du pH contribue au maintien de la phase stationnaire. La bibliographie indique

que chez Bacillus subtilis (Dutt et al., 2008 ), elle peut durer de 3 à 8jours .

L’évolution du pH (diminution en phase exponentielle et stabilisation à pH 6) peut s’expliquer

par le fait que les bactéries consomment en premier lieu les glucides contenus dans le milieu ;

l’acidification qui en résulte est rapidement neutralisée par les produits basiques issus de

l’activité protéolytique des Bacillus.

Au bout des deux jours d’expérience, l’activité coagulante est toujours en augmentation. Il ne

nous est donc pas possible de dire si le maximum est atteint. Dutt et al. (2008) précise que

l’activité coagulante diminue au bout de 45h alors que Shieh et al. (2009) montre, dans les

conditions de l’expérience, que le maximum est atteint au bout d’1 jour ; cependant, celui-ci

signale que d’autres auteurs rapportent que l’optimum de production est atteint au bout de 3 à

8 jours.


121

Concernant l’enzyme coagulante produite par Bacillus mojavensis, deux hypothèses peuvent

être formulées. On peut supposer que cette protéase est très vraisemblablement un

métabolite secondaire (son taux ne cesse d’augmenter durant la phase stationnaire alors qu’un

métabolite primaire est produit durant la phase exponentielle). L’autre hypothèse est qu’il

s’agit d’une protéine intracellulaire (taux très faible en phase exponentielle) libérée

progressivement à la mort des cellules en phase stationnaire). La lyse du culot bactérien

obtenu en phase exponentielle et le dosage de l’activité coagulante permettraient de

différencier les deux hypothèses.

.8. Essai de purification de l’extrait enzymatique brut de Bacillus

mojavensis

L’avantage de la chromatographie d’exclusion moléculaire est de pouvoir être appliqué

indifféremment aux extraits bruts ou partiellement purifiés (Milliere, 1984).

Les protéines de l’extrait enzymatique brut sont séparées selon leur poids moléculaire par le

gel Séphadex G-75 (La phase stationnaire) dont la zone de fractionnement est comprise entre

3 000 et 70 000 Daltons, la phase mobile étant la solution tampon phosphate (pH 6 – 0,4M)

qui va transporter les protéines.

Le volume de l’extrait brut injecté est de 1 ml, les éluâts de la colonne sont recueillis dans le

collecteur de fraction à raison de 2 ml/tube et on détermine par la suite la densité optique de

chaque tube à 280 nm.

L’activité coagulante a été mesurée pour chaque fraction collectée. Les résultats obtenus sont

reportés sur le tableau 28.

Tableau 28: Activité coagulante des éluât en fonction du numéro du tube.

N° du tube Activité coagulante (UP)

10 ∞

11 0,081

12 0,088

13 0,094

14 0,038

15 ∞


122

Le profil chromatographique de l’extrait coagulant de Bacillus mojavensis montre deux pics

d’adsorption bien distincts (Fig.24). L’activité coagulante a été retrouvée dans les tubes du

n°11, 12, 13 et 14 qui forment le premier pic ; ces résultats révèlent que seul le premier pic est

doué d’une activité coagulante.

Le second pic n’est pas doué d’activité coagulante et correspond aux protéines non

coagulantes. On peut dire que ce niveau de purification n’est que partiel, car il n’est pas exclu

que d’autres protéines de masses moléculaires très rapprochées peuvent être incluses dans

cette même fraction.

Figure 24: profil chromatographique de l’extrait enzymatique produit par I33M filtré sur gel

Séphadex G-75.Tampon phosphate 0,4M pH 6, debit 0,3 ml/min (2ml/tube)

1.9 Caractérisation de l’enzyme coagulante de Bacillus mojavensis

I.9.1 Détermination de l’activité coagulante

Après l’extraction, l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut de Bacillus mojavensis

a été déterminée par la méthode de Berridge et qui a permis d’obtenir les résultats illustrés

dans le tableau 29.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 10 20 30 40 50 60 acti

vit

é coa

gu

lan

te (

UP

/ml)

DO

à

28

0n

m

N° de tubes

activité coagulante profil d'elution


123

Tableau 29: Activité coagulante de l’extrait enzymatique brut


(UP)

Force de coagulation

(US)

Activité

protéolytique

(µg/ml/min)

L’extrait enzymatique

brut de Bacillus

mojavensis

0,625 UP/ml

150 US

460

I.9.2.Influence de la température du lait

L’influence de la température du lait sur l’activité coagulante des extraits enzymatiques bruts

et purifiés a été étudiée dans un intervalle de température de 30°C à 70°C.

Figure 25 : Influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’EEB

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

30 40 50 60 70 80

Act

ivit

é co

ag

ula

nte

(U

P/m

l)

Température (°C)


124

Figure 26 : Influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’EEP

D’après les résultats rapportés par les figures 26 et 27, on note que la température optimale de

l’activité coagulante de nos extraits enzymatiques est de 65°C. De 30°C à 65°C, l’activité

coagulante augmente progressivement et au delà de 65°C on note une baisse rapide de

l’activité coagulante.

Nos résultats obtenus sont similaires à ceux réalisés par Yang etal. (1987) qui ont démontré

un optimum d’activité coagulante à une température de 65°C.

Chopra et Mathur (1985)ont obtenu une coagulase purifiée de Bacillus stearothermophilus

avec une activité optimale à 70°C. Matoub (2000) a montré que l’activité optimum de

l’enzyme purifié de Bacillus subtilis est de 70°C.

Selon Garnot et Martin (1980), la présure est caractérisée par une activité optimale à une

température voisine à 42°C.D’après Morsli (1996), l’optimum d’activité obtenue pour

l’extrait enzymatique du figuier a été enregistré à 85°C, pour l’artichaut est de 72°C.

En général, les extraits enzymatiques d’origine animale ont une activité importante à des

températures modérés cependant les coagulases d’origine microbienne et végétale se montrent

plus actives aux températures élevées.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Acti

vit

é coa

gu

lan

te (

UP

/ml)

Température (°C)


125

I.9.3 Influence de pH du lait

Nous avons exposé l’extrait enzymatique de Bacillus mojavensis à un intervalle de pH allant

de 5 à 7 afin d’optimiser l’activité exprimé en unité présure.

Figure 27:Influence du pH du lait sur l’activité coagulante de l’EEB.

Figure 28:Influence du pH du lait sur l’activité coagulante de l’EEP.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Acti

vit

é coa

gu

lan

te (

UP

/ml)

0,03

0,032

0,034

0,036

0,038

0,04

0,042

0,044

0,046

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

Act

ivit

é co

ag

ula

nte

(U

P/m

l)

pH


126

Les variations de l’activité coagulante des extraits enzymatiques bruts et purifiés en fonction

du pH du lait illustrées par les figures 28 et 29, montrent que l’activité coagulante augmente

progressivement de pH 5 à 6 et baisse au-delà de pH optimum (pH 6) pour s’annuler

complètement à pH 7.

Nos résultats se rapprochent de ceux de Yang et al. (1987) qui dans une étude similaire sur

une coagulase purifié de Bacillus subtilis ont rapporté un pH d’activité optimal de 5,8.

Matoub (2000) indique un pH optimum d’action de 6,2 pour une coagulase produite par une

souche locale sélectionné de Bacillus subtilis (LC33) par contre Chopra et Mathur (1985)

ont obtenu une coagulase de Bacillus stearothermophilus dont l’activité optimale est observée

à pH 8.

Selon Garnot et Martin (1980), le pH d’activité de la présure est compris entre 5,3 et 6,3.

Son optimum d’action est à pH 5,8. Elle est inactivée à pH 7,5.

Morsli (1996), indique un pH optimum de 6,5- 6,2- 6,5 pour des préparations enzymatique de

l’artichaut, du figuier et du poulet respectivement.

Scriban (1999), note une activité coagulante optimale entre pH 5,5 et 6,7 pour les enzymes

issues d’Endothia parasitica et Mucor pusillus.

En définitif, on peut conclure que le pH optimum des coagulases varie dans l’intervalle de

5,5 à 8 selon leur origine.

Les valeurs habituelles de pH utilisées en technologie fromagère sont de pH 6,5 à 6,3 ; voisin

d’un lait frais (pH 6,6) ou légèrement acidifié (pH 6,4). Dans certains cas, quand les

conditions de technologie fromagère le permettent, le pH du lait peut être abaissé au pH 6,2.

I.9.4Influence de concentration en CaCl2

D’après Lenoir (1985), l’ion calcium est un activateur des protéases, il est donc indispensable

pour la coagulation du lait en associant ainsi les micelles des caséines afin de former un gel

plus ferme. Cette coagulation se produit par l’agrégation des molécules en présence du

calcium après hydrolyse de la caséine k par la protéase coagulase.


127

Les concentrations habituellement utilisées en technologie fromagère se situent dans

l’intervalle de 0,01 à 0,02M de CaCl2, l’extrait purifié de Bacillus mojavensis a une meilleure

activité à cette concentration, ce qui permet leur utilisation dans ces conditions. L’influence

de calcium sur l’activité coagulante de l’extrait enzymatique a été étudiée en faisant varier sa

concentration dans le lait de 0,005 à 0,1 M.

Figure 29:Influence de la concentration en CaCl2 du lait sur l’activité coagulante

de l’EEB.

Figure 30:Influence de la concentration en CaCl2 du lait sur l’activité coagulante

de l’EEP

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Concentration en CaCl2 (M)

A

ctiv

ité

coa

gu

lan

te (

UP

/ml)

0,03

0,032

0,034

0,036

0,038

0,04

0,042

0,044

0,046

0,048

0,05

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

A

ctiv

ité

co

agu

lan

te (

UP

/ml)


128

Les figures 30 et 31 expriment les résultats en montrant que l’activité coagulante croit lorsque

la concentration en CaCl2 augmente. On obtient ainsi un optimum d’activité pour une

concentration de 0,04M, au-delà de cette valeur l’activité diminue et ceci par un effet

inhibiteur de l’ion calcium.

Dans une étude similaire de la coagulase de Bacillus subtilis, Chemlal (1998), a obtenu une

concentration optimale de 0.05M. Par contre, Matoub (2000), a rapportée une activité

optimale de la coagulase purifiée à une concentration de 0.02M.

Par ailleurs, Morsli (1996), lors d’une étude du pouvoir coagulant de quelques plantes

locales et d’une coagulase de poulet indique une concentration du lait en CaCl2 de l’ordre de

0,02M pour l’ensemble des préparations et d’après Garnot et Martin (1980) une activité

optimale de la présure est obtenue à 0,02M de CaCl2.

En général, les extraits enzymatiques d’origine animale sont moins sensibles à la baisse

de la concentration en CaCl2 du lait, contrairement à ceux d’origine végétale qui nécessitent

une concentration plus importante.

II.PROTEASE D’ORIGINE FONGIQUE

II.1Collection de souches

24 souches isolées du sol ont constitué la collection de base (Tab.30). Le critère de

sélection a été leur pouvoir caséolytique sur milieu de culture (Sabouraud +CMP+ lait),

témoignant d’une action sur les protéines du lait. Elles ont été ensuite étudiées d’un point de

vue macroscopique puis microscopique.

II.2 Observations macroscopiques

Les résultats sont présentés dans le tableau 30 et dans la figure 31.


129

Tableau 30: Description macroscopique de la collection des moisissures isolées du sol.

Code des

souches Aspect macroscopique des moisissures

4A souche étalée grise centre blanc

4 B halle étalé mycélium gris vert

4 C centre jaune clair pourtour jaune foncé

4 D centre jaune foncé pourtour gris-vert

5 F jaune au centre pourtour gris blanc

S 1 centre plus clair, pourtour gris foncé

S 3 centre clair pourtour foncé

S F 11 souche grise

SF 12 thalle de couleur grise

SF 19 colonies envahissante jaune foncé à la base et presque blanche

à la surface,

W centre foncé, pourtour beige foncé

SF 14 colonies jaune très envahissante,

SF 15 souches de couleur grise

4 E couche étalée pourtour gris vert,

A 2 mycélium blanc avec base jaune

I/5 colonie avec un centre claire et un pourtour vert foncé.

T7 thalle noir

Y centre jaune pourtour vert

P/M centre jaune pale pourtour gris

K/L centre duveteux blanc pourtour gris

E mycélium blanc avec spores noires

D centre jaune avec un Mycélium qui monte jusqu'au couvercle

de la boite de pétri.

A1/B1 base jaune pourtour gris vert.

A/B centre du ventre blanc pourtour gris vert.


130

Figure 31: Aspect des colonies sur boîtes de Pétri pour quelques moisissures

Conclusion :

De nombreuses colonies isolées se caractérisent par un mycelium duveteux et très extensif.

Les couleurs varient du blanc au gris foncé ; des zones de fructification centrales sont bien

visibles et leur aspect laisse supposer que nous sommes essentiellement en présence de

Mucorales.

II.3 Observations microscopiques

La figure 32 montre l’aspect microscopique de certaines moisissures isolées. Elles sont toutes

caractérisées par un appareil de fructification caractéristique des Mucorales.

Celui-ci éclate et libère les spores à maturité. Les spores ont des formes ovoïdes ou rondes

suivant la souche isolée.

Conclusion :

Comme nous l’avons observé avec les bactéries, la microflore fongique isolée montre une

certaine homogénéité et semble essentiellement constituée de Mucorales (Rhizopus, Mucor).

Ces genres forment un très grand nombre de spores. Il est vraisemblable que dans les

prélèvements effectués, ces spores constituaient l’élément fongique majeur et sont à l’origine

des souches isolées sur milieu de culture.

C/D S2/S3 I/J

4A 5F 4C


131

Figure 32 : aspect microscopique de quelques moisissures isolées

S1

4 C

4A

4 D

5F

SF 15


132

II.4 Détermination de l’activité enzymatique des extraits bruts des

moisissures isolées.

La fermentation des souches sur milieu solide à base de son de blé selon Levadoux(1989) a

permis d’obtenir une quantité intéressante de protéases. La composition du milieu de

fermentation a une grande influence sur la régulation de la production de protéases par les

souches et permet d’accroitre de façon substantielle l’activité coagulante des extraits bruts.

Les résultats concernant les paramètres qui reflètent l’activité enzymatique des EEB (activités

coagulante et protéolytique) ont été déterminées pour les 24 souches de la collection.

II.4.1Activité coagulante

L’activité coagulante de la protéase issue des moisissures est exprimée en unité présure/ml.

Les résultats sont reportés dans le tableau 31.

II.4.2L’activité protéolytique

Les données du calcul de l’activité protéolytique des extraits enzymatiques bruts sont portées

dans le tableau 31.

Après avoir testé les 24 souches de moisissures, nous avons obtenu uniquement 12 souches

produisant une enzyme coagulante, elles sont présentées dans le tableau 31.

Tableau 31 : souches possédant une enzyme coagulante et caractéristiques

Code des

Souches

Aspect macroscopique ACen

UP/ml

AP en

µg/ml/min

4A Etalée, envahissante, grise, centre un peu plus clair 0.104 59.7

4C Centre clair (gris clair)

Pourtour gris vert

0.098 56.7

4D

Centre jaune foncé

Pourtour gris vert

0.208 49.06

5F

Centre jaune

Pourtour vert

0.277 62 .2

S1

Centre plus clair, pourtour gris foncé 0.098 79.34

S 2 / S3

Centre plus clair, pourtour foncé 0.208 74.28

SF14 Colonies très envahissantes/ vert clair. Centre plus clair 0.277 79.39


133

SF15 Grise. envahissante 0.280 57. 74

I/J

Centre plus clair; pourtour vert foncé 0.128 61.8

P/M

Centre jaune ; pourtour vert. 0.119 64.5

K/L Centre clair, pourtour jaune vert. 0.277 49.89

C/D

Envahissante ; centre jaune ; pourtour gris vert. 0.084 50 .44

Conclusion

50% des souches montrent une activité coagulante, ce qui est important par rapport aux

résultats obtenus avec la microflore bactérienne. Cependant, l’activité coagulante des souches

positives est faible et varie de 0,08 à 1 avec une moyenne de 0,18 UP/ml. En revanche

l’ensemble des extraits montrent une forte activité protéolytique (moyenne = 62,2 µg/ml).

Ces résultats (fort % de souches coagulantes, faibles activités coagulantes de EEB) peuvent

s’expliquer par une certaine homogénéité des souches isolées.

II.5 Identification des moisissures par biologie moléculaire

Après avoir observé de manière minutieuse au microscope les 12 souches sélectionnées pour

produire une enzyme coagulante, il s’est avéré que seules 3 d’entre elles se différentiaient

d’un point de vue microscopique (souches 4D, 5F, SF15). Ces 3 souches ont été identifiées

par biologie moléculaire seuls les résultats de 4D sont présentés (Blast : figure 33).


134

II.5.1 Séquences d’ADNr-18S obtenues

Souche 4D

TAATCAATAATTTTGGCTTGTCCATTATTATCTATTTACTGTGAAATGTATTATTACTTGACGCTTGAGG

GATGCTCCACTGCTATAAGGATAGGCGGTGGGGATGCTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGCTTGG

TATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACA

ACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAATGTG

AATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACG

CCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGA

TCTATTCTGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTT

AATATAAAGAGAAGCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTTTTTTTAAATTT

GATCTGAAATCAGGCGGGATTACCCGCTGAACTTAA

Souche 4D

Séquence similaire à Mucor circinelloides à 100% de similarité sur un fragment de 586 pb.

Figure 33 : Blast de la souche « 4D »

Nous avons choisi la souche 4D pour la suite du travail car elle possède une bonne activité

coagulante et une activité protéolytique relativement basse par rapport aux 2 autres souches.

II.5.2Identification de la souche 4D

La séquence étudiée est similaire à Mucor circinelloides avec 100% de similarité sur un

fragment de 586 pb.

L’arbre phylogénétique de la souche sélectionnée est présenté dans la figure 34.


135

Figure 34 : Position de la souche 4D dans l’arbre phylogénétique de Mucor circinelloides.


136

II.6Optimisation de la production de l’enzyme coagulante

La production de l’enzyme coagulante a été réalisée par fermentation sur son de blé pendant 5

jours au bout desquels un bon développement du champignon fut observé donnant au milieu

une texture laineuse blanche caractéristique des mucors.

L’extraction de l’enzyme est faite après fermentation. L’activité coagulante des 40

expériences est déterminée par la méthode de Berridje (1951) et les résultats sont interprétés

par la méthode statistique selon le plan composite centré afin de choisir les conditions

optimales de la production.

II.6.1Evaluation statistique des composants du milieu de culture par le plan composite

centré

La méthode utilisée est le plan composite centré à 5 niveaux. Les conditions expérimentales

(niveau de facteurs et réponses) figurent dans la matrice des expériences présente dans le

tableau 15.

II.6.2L’analyse de l’influence de la composition du milieu de culture sur l’activité

coagulante des enzymes

Les activités coagulantes obtenues varient de 0.603 UP/ml à 2.667 UP/ml ce qui indique

l’influence des paramètres choisis sur la production (tableau 32). L’activité coagulante

maximale 2.667 UP/ml a été observée dans l’expérience N°18, où les composants du

milieu sont à un niveau moyen: température : 31°C ; quantité de son de blé : 30 g ; quantité de

caséine : 1 g.

Ce résultat est probablement du à la température choisie. En effet, selon Tubesha et Delaimy

(2003), l’enzyme de la plus forte activité a été produite à température égale à 30°C.

La faible activité coagulante 0.609 U/ml a été déterminée dans l’expérience N°6 :

température : 37°C ; quantité de son de blé : 20g ; quantité de caséine : 1,5g.

Ceci peut s’expliquer soit par la température élevée (Tubesha et Delaimy, 2003) ou la faible

quantité de son de blé.


137

Tableau 32:Matrice expérimentale et activité coagulante des extraits bruts obtenus.

II.6.2.1Analyse statistique

L’analyse statistique des résultats est effectuée par un pro-logiciel de calcul, qui teste les

critères de l’adéquation du modèle mathématique.

Nombre

D’essais

Température

(°C)

Son de

blé

(g)

Caséine

(g)

Réponse

mesurée

Réponse prédite

statistiquement

1 25 20 0.5 1.247 1.225

2 37 20 0.5 0.715 1.444

3 25 40 0.5 1.708 1.623

4 37 40 0.5 1.442 1 .842

5 25 20 1.5 1.376 1.216

6 37 20 1.5 0.603 0.998

7 25 40 1.5 2. 488 2.069

8 37 40 1.5 1.589 1.851

9 27 30 1 1.561 1.918

10 35 30 1 2.605 1.918

11 31 25 1 1.212 0.782

12 31 35 1 1.799 1.835

13 31 30 0.6 1.732 1.498

14 31 30 1.4 1.656 1.498

15 31 30 1 2.088 2.254

16 31 30 1 2.109 2.254

17 31 30 1 2.196 2.254

18 31 30 1 2.667 2.254

19 31 30 1 2.338 2.254

20 31 30 1 2.138 2.254


138

Vérification de l’homogénéisation des valeurs par le test de Cochran

Le test de Cochrane a été effectué sur la variable dépendante (activité coagulante) et nous a

permit de vérifier l’homogénéité de la variance (valeur de Cochrane calculée = 0.2170 est

inférieur à celle tabulée 0.3894).

Vérification de la signification statistique des coefficients du modèle

mathématique

Grâce au test de Student, les coefficients de régression non significatifs sont éliminés. Les

coefficients significatifs sont utilisés afin de construire un modèle mathématique adéquat qui

nous permet de déterminer en fonction des valeurs des variables utilisées ; l’activité

coagulante correspondante.

Le modèle mathématique est donné par l’équation :

Il a 7 coefficients significatifs :

α0 = 2.254 (la valeur de la réponse au point central du domaine expérimental).

α2 = +0.313 (effet de la quantité du son de blé).

α13= -0.109 (effet de l’interaction entre la température et la quantité de caséine).

α23= +0.114 (effet de l’interaction entre la quantité du son et la quantité de caséine).

α11= -0.119 (effet de la température).

α22= -0.334(effet de la quantité du son de blé).

α33= -0.267 (effet de la quantité de caséine).

Gc < Gt, les variances sont homogènes donc l’expérience est reproductible.

Ac = 2.254+0.313 X2 - 0.109X1X 3+0.114 X2X3-0.119 X12-0.334 X2

2-0.267 X3

2


139

L’analyse des coefficients de régression des facteurs montre que la température exercent un

effet négatif –0.119, alors que la quantité de son exerce un effet positif +0.313.

En conclusion, plus on cultive à des températures inférieures à 37°C, meilleure est la

production ; de même, plus on augmente la quantité de son, meilleure est la réponse.

Vérification de l’adéquation de modèle mathématique obtenu

La vérification de l’adéquation du modèle obtenu permet de préciser si ce modèle décrit

fidèlement le procédé étudié. L’estimation de l’adéquation du modèle est effectuée au moyen

du critère de Fisher, (valeur de Fisher calculée = 0.118 est inférieur à celle tabulée 2.46).

Afin de déterminer les conditions optimales pour la meilleure production de coagulase, la

surface de réponse tridimensionnelle est réalisée par le logiciel Statistica 6.0 en fixant les

variables température, quantité du son et quantité de caséine sur les axes X, Y, Z

respectivement.

La figure 36 montre la réponse à l’interaction entre ces variables. L’activité coagulante

maximale prédite par le logiciel Statistica est de 2.254 UP/ml correspondant à une

température de 31°C et à une quantité du son égale à 30 grammes, alors que dans les

conditions expérimentales, cette valeur est légèrement élevée et est égale à 2.667 UP/ml. Elle

est représentée dans le graphique par la couleur marron.

La valeur déterminée expérimentalement est en corrélation avec celle déterminée par le

logiciel ce qui confirme l’adéquation de notre modèle. De ce faitMucor circinelloides produit

une protéase coagulant le lait avec une activité coagulante de 2.667 UP/ml sous les conditions

optimales choisies.

Fc < Ft, le modèle est adéquat à une probabilité de 95%.


140

Figure 35 : Surface de réponse de l’activité coagulante des protéases produites par Mucor

circinelloidesen fonction des facteurs choisis.

II.6.3 Essais de purification de l’extrait coagulant brut

La présence d’enzymes non spécifiques pose un problème dans la production de fromage.

Pour cette raison l’extrait coagulant brut issu de Mucor circinelloides caractérisé par une

activité coagulante de 2,667 UP/ml, une quantité en protéine de 4,27 mg/ml et une force

coagulante de 640,085 US/ml est soumis à une précipitation au sulfate d’ammonium, suivie

d’une filtration sur gel.

II.6.3.1Précipitation au sulfate d’ammonium

Cette technique permet de fractionner et de précipiter les protéines contenues dans l’extrait

brut. Après la précipitation de l’extrait enzymatique brut au sulfate d’ammonium à 40%, 60 %

et 80% de saturation, le culot est repris dans le tampon acétate de sodium (0.1M, pH 5.2) et

l’activité coagulante du culot et du surnageant est mesurée (Tableau 33)


141

D’après les résultats portés dans le tableau 30, nous avons constaté que le taux de saturation

de 80% en sulfate d’ammonium a donné une activité coagulante maximale au niveau de culot

avec absence de cette activité coagulante au niveau de surnageant.

Nos résultats concordent bien avec ceux de Khan et al.,(1983) qui ont obtenu une

précipitation totale des protéines à 80% de saturation en sulfate d’ammonium. Alors que

Kasemi-Vaysari et al., (2002) rapportent que l’activité coagulante optimale de la protéase de

Mucor miehei et Rhizopus oryzae est observée pour un taux de saturation en sulfate

d’ammonium égale à 50% et à 60% respectivement.

Tableau 33 : Activité de précipitation de l’extrait enzymatique brut au sulfate d’ammonium

Pourcentage en sulfate

d’ammonium (%)


du surnageant (UP/ml)

Activité coagulante du

Culot (UP /ml)

40 0.256 0. 100

60 0.047 0.541

80 0 0.621

II.6.3.2Chromatographie d’exclusion moléculaire

La séparation des composants protéiniques de l’extrait enzymatique brut et les protéines

obtenues par précipitation à 80% de sulfate d’ammonium a été réalisée par chromatographie

sur gel Séphadex G75.Les éluats de la colonne sont recueillis dans un collecteur de fraction à

raison de 3ml/tube pour chaque fraction collectée, l’activité coagulante a été mesurée.


142

Le profil d’élution et l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut

Figure 36: Profil d’élution sur Séphadex G75 de l’extrait enzymatique brut de Mucor

circinelloides (0.5 ml de l’extrait enzymatique est injecté dans une colonne de Séphadex G75

(1 x 30cm) équilibrée par le tampon acétate de sodium (0.1M ; pH 5.2), le débit des fractions

est de 0.93ml /min).(3ml/tube)

Le profil chromatographique d’exclusion moléculaire sur Séphadex G75 de l’extrait

enzymatique brut révèle deux pics d’élution, dont seul le premier pic est doué d’une activité

coagulante.

Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par Hashem, (2000) qui a obtenu un seul pic

correspondant à l’activité coagulante de la protéase de Penicillium oxalicum. Alors que

Areces et al. (1992), rapportent que la protéase de Mucor bacilliformis présente deux pics

correspondant à l’activité coagulante après purification.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20 25 30

DO

280

nm

Fractions

DO à 280 nm

Activité coagulante UP/ml


143

Le profil d’élution et l’activité coagulante de l’extrait enzymatique précipité

Figure 37 : Profil d’élution sur Séphadex G75 de l’extrait enzymatique précipité de Mucor

circinelloides (0.5 ml de l’extrait enzymatique est injecté dans une colonne de Séphadex G75

(1 x 30cm) calibrée par le tampon acétate de sodium (0.1M ; pH 5.2), le débit des fractions est

de 0.93ml /min).(3ml/tube)

Le profil chromatographique d’exclusion moléculaire sur séphadex G75 de l’extrait

enzymatique précipité révèle un seul pic d’élution, dont les fractions présentent une activité

coagulante très faible. Cela est du à la perte de l’enzyme lors de la remise du culot en

suspension dans le tampon et à la dilution de l’extrait enzymatique.

Les conditions dans lesquelles a été effectuée la filtration sur gel de l’extrait enzymatique

n’ont pas permis de déterminer le poids moléculaire de la protéase coagulante ; la résolution

de la séparation est insuffisante.

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0 5 10 15 20 25

Do

280

nm

Fractions

Do à 280 nm


144

Tableau 34 :Bilan de purification de l’extrait coagulant de Mucor circinelloides

Paramètres

Etapes

purification

Ac coagulante

(UP/ml)

Protéines

(mg/ml)

Ac

spécifique

(UP/mg)

Rendement

(%)

Facteur de

purification

E.E.B 2,667 4,27 0,62 100% 1

Précipitation

(80%) d’EEB

1,724 0,487 3,54 64.64% 5,7

Gel de filtration

d’EEB

0.358 0,318 1,125 13.42% 1,8

D’après les résultats portés dans le tableau 34, nous constatons que la concentration en

protéines diminue au cours des étapes de purification. Elle passe de 4.27mg/ml dans l’extrait

brut à 1,724 mg/ml après la précipitation par sulfate d’ammonium.

Par ailleurs, une augmentation de l’activité spécifique et du facteur de purification a été

constatée avec un rendement de 64,64%.

De même, nous constatons que la concentration en protéines passe de 4.27mg/ml dans

l’extrait brut à 0.318mg/ml dans l’extrait enzymatique purifié par gel filtration. La filtration

sur gel a permis d’éliminer 92.5 % des protéines non actives, une légère augmentation de

l’activité spécifique et du facteur de la purification avec un rendement de 13,42%.

II.7 Caractérisation de l’extrait enzymatique brut

II.7.1. Influence de la température du lait sur l’activité coagulante

L’influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’enzyme a été étudiée dans

un intervalle de température de 30°C à 70°C


145

Figure 38 : Influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’extrait brut et

purifié

Les résultats indiquent que l’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut et purifié

augmente au fur et à mesure pour atteindre une valeur maximale à température égale à 55°C,

pour des valeurs supérieures nous avons noté une baisse rapide de l’activité coagulante ; elle

atteint sa valeur minimale à 70°C.

Des résultats similaires ont été obtenus par Somkuti et al., (1968) plus récemment Goursaud

(1999), a noté un optimum thermique entre 58°C et 62°C, pour les préparations fongiques

coagulantes de Mucor miehei,Mucor pusillus et l’endothia parasitica.

II.7.2 Influence du pH de lait

L’activité coagulante optimale de l’extrait brut a été étudiée en fonction du pH du lait en

variant le pH de 5 à 7 avec un intervalle de 0,5.

-20

0

20

40

60

80

100

120

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Act

ivit

é co

agu

lan

te e

n %

Température du lait °c

Ac de l'extrait brut

Ac de l'extrait purifié


146

Figure 39:Influence de pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait brut et purifié

A pH 5, il y a apparition des flocules avant d’ajouter l’enzyme, nous sommes dans le cas

d’une coagulation acide (pH pHi de la caséine).En effet, l’acidification du lait favorise la

réaction d’agrégation par suite de la diminution de la stabilité des micelles, liée à la

neutralisation des charges négatives et à libération d’ion calcium.

Une activité relativement importante et maximale à pH 5,5 pour l’extrait brut et purifié ; au

delà de cette valeur l’activité diminue.

Les enzymes fongiques, selon Fernandez-Lahore et al. (1998), se caractérisent par un pH

optimum entre 2.5 et 5.5.

II.7.3 Influence de la concentration de CaCl2

L’influence de la concentration en CaCl2 a été déterminée en faisant varier la concentration du

lait en ion CaCl2 de 0.005M à 0.05 M avec un intervalle de 0.005M.

0

20

40

60

80

100

120

5,5 6 6,5 7

Act

ivit

é c

oag

ula

nte

%

pH du lait




147

Figure 40 : Influence de CaCl2 du lait sur l’activité coagulante de l’extrait brut et purifié

Nous observons que l’activité coagulante augmente de manière proportionnelle avec la

concentration en CaCl2 pour atteindre une activité maximale à une concentration de 0,03M

pour l’extrait brut et purifié.

L’ion de calcium est un activateur des protéases .Il est indispensable pour la coagulation du

lait et joue le rôle de ciment dans la polymérisation des caséines par la formation de ponts

calciques, après hydrolyse de la caséine қ par la protéase coagulante.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Act

ivit

é co

agu

lan

te %

Ca Cl2 du lait (M)



Conclusion

Conclusion

149

Cette étude a été entreprise dans le but de contribuer à la recherche de protéases issues de la

culture de souches microbiennes destinées à être utilisées comme succédanées de la présure.

Ce travail nous a permis d’isoler à partir d’échantillons de terre des souches microbiennes

productrices d’une enzyme coagulant le lait en vue de la fabrication de fromage. Cette

protéase doit être douée d’une bonne activité coagulante et de faible activité protéolytique.

La terre utilisée pour la recherche des microorganismes a été prélevée à proximité de la

laiterie fromagerie de Boudouaou

En ce qui concerne l’isolement des bactéries, le milieu employé est le milieu Plate Count

Agar (P.C.A.), additionné de 10% lait écrémé UHT et d’actidione (cycloheximide) à 2%.

L’incubation s’effectue à 30°C pendant 48h à 72h.

Dans le cas des moisissures, le milieu utilisé est le Sabouraud-chloramphénicol, dans lequel

est ajouté 10% lait écrémé UHT. L’incubation a lieu à 25° pendant 3 à 4j.

Dans cette première partie nous nous sommes intéressés aux bactéries qui présentent un halo

clair d’hydrolyse du lait ou caséolyse. Les souches caséolytiques sont prélevées et repiquées

sur des milieux P.C.A. contenant du lait, puis purifiées éventuellement par plusieurs

isolements par la méthode des quadrants jusqu’à l’obtention de souches pures.

Sur les 70 souches bactériennes isolées, présentant une caséolyse, uniquement 20 souches

possèdent une activité coagulante. Des observations macroscopiques et microscopiques ont

été effectuées sur l’ensemble des souches.la plupart présentaient des similitudes sur le plan

morphologique, d’où la sélection de 8 souches qui semblaient différentes. Une identification

biochimique a été réalisée pour ces dernières.

Après avoir vérifié plusieurs de leurs caractères, on a pu conclure que certaines des souches

sont semblables et qu'il y a une forte probabilité qu'elles appartiennent toutes à l'espèce B.

subtilis. Cependant, pour vérification, les souches I33M, FK6A et P47M ont été envoyées à

un laboratoire de biologie moléculaire, afin d'avoir une confirmation :nous avons obtenu

comme résultat :FK6A : Bacillus Amyloliquefaciens P47M : Bacillus subtilis et I33M :

Bacillus mojavensis

Conclusion

150

La bactérie (I33M), identifiée comme étant Bacillus mojavensis a été sélectionnée pour sa

bonne activité coagulante et sa relative faible activité protéolytique, son activité coagulante

est de 2,18 U.P et son activité protéolytique de 19,302 µg /tyr/min.

Une optimisation du milieu de culture de Bacillus mojavensis a été réalisée par les plans

d’expériences.

L’optimisation d’un milieu de production nécessite des méthodes qui consistent à faire varier

successivement chacun des facteurs qui influencent la culture, ce qui conduit à minimiser le

nombre d’expériences.

L’utilisation d’une méthodologie de recherche expérimentale ou plan d’expérience permet de

déterminer l’influence de nombreux paramètres, d’étudier leurs interactions et par la même

d’optimiser la réponse expérimentale. Le plan choisi est un plan de surface de réponse de

type composite centré (CCD). L’objectif principal est de maximiser l’activité de coagulation

et de minimiser l’activité protéolytique. Les résultats obtenus sont donnés pour un milieu

composé de : son de blé : 7% ; caséine : 0,094% ; température 39°c et agitation : 150 rpm

La valeur optimale de l’’activité coagulante est de 2,4 (IMCU/ml).

La réponse de surface en 3 dimensions montre les effets relatifs de 2 facteurs : température et

agitation qui ont un effet significatif considérable sur la production des protéases.

Une croissance en fermenteur a été effectuée pour la production de l’enzyme et parallèlement

la croissance de la souche a été suivie ainsi que l’évolution du pH, de l’activité coagulante,

protéolytique ainsi que le taux de protéines.

L’analyse de la croissance de la souche I33M en milieu optimisé au son a été suivie pendant

deux jours, par dénombrement des cellules viables sur milieu P.C.A. Elle montre qu’après une

courte période de latence de moins de 1h, la phase exponentielle est rapide et la phase de

décélération est atteinte en moins de 5h. La phase stationnaire s’est prolongée sur la durée de

l’expérience, sans que l’on puisse mettre en évidence au bout de deux jours une phase de

déclin.

Le taux de croissance montre une vitesse extrêmement rapide puisque le temps de génération

exponentiel est évalué à 22 mn environ.

Conclusion

151

Le pH voisin de 7 au départ se stabilise à 6 dès le début de la phase stationnaire. La stabilité

du pH du milieu de fermentation, peut s’expliquer par le fait que les bactéries consomment en

premier lieu les glucides contenus dans le milieu ; l’acidification qui en résulte est rapidement

neutralisée par les produits basiques issus de l’activité protéolytique des Bacillus.

Concernant les activités coagulante et protéolytique, elles augmentent progressivement dès le

début de la phase stationnaire et cela jusqu’à la fin de l’expérience. L’activité coagulante

semble augmenter moins rapidement et n’apparaitre de façon significative qu’au bout d’une

dizaine d’heure de culture.

Concernant l’enzyme coagulante produite par Bacillus mojavensis, deux hypothèses peuvent

être formulées. On peut supposer que cette protéase est très vraisemblablement un

métabolite secondaire. L’autre hypothèse est qu’il s’agit d’une protéine intracellulaire (taux

très faible en phase exponentielle) libérée progressivement à la mort des cellules en phase

stationnaire).

Des essais de purification de l’extrait enzymatique brut ont été effectués, nous avons obtenus

deux pics, dont uniquement un est doué d’une activité coagulante.

Une caractérisation de l’extrait enzymatique a été effectuée, on note des valeurs optimales de

l’activité coagulante, qui sont 65°C pour la température, un pH de 6 et une concentration

enCaCl2de 0,04M

Plusieurs essais de fabrication de fromage affiné à pâte pressée non cuite type «EDAM » ont

été réalisés, en faisant varier le type et la concentration en extrait coagulant.

Nous avons obtenu des fromages fabriqués avec 100% présure, 100% EEB Bacillus

mojavensis, 50% EEB Bacillus mojavensis et 50% présure, Pour résoudre le problème causé

par l’activité protéolytique élevé de nos extraits enzymatiques, nous avons cuit le caillé après

l’étape de brassage, et nous avons obtenu un caillé de bonne consistance.

La deuxième partie du travail concerne les moisissures. 24 souches ont été isolées et

purifiées, la plupart de souches sont des Mucor, dont seulement 12 possèdent une activité

coagulante. Nous avons remarqué que beaucoup de souches se ressemblent après observation

au microscope. Seulement 3 souches (5F, 4D et SF15) semblaient être différentes des autres,

et elles ont été identifiées par biologie moléculaire. La souche 4D, a été retenue pour la suite

du travail, et a été identifié comme étant Mucor circinelloides.

Conclusion

152

Une optimisation du milieu de culture, de type composite centré a été réalisée comme pour les

bactéries Les meilleurs résultats concernant l’activité coagulante ont été obtenus pour un

milieu de culture composé de 30g de son de blé auxquels on ajoute 1g de caseine puis 50 ml

de sulfate d’ammonium à 0,01%. Et la température d’incubation de 31°C

L’extrait coagulant brut issu de Mucor circinelloides caractérisé par une activité coagulante

de 2,667 UP/ml, une quantité en protéine de 4,27 mg/ml et une force coagulante de 640,085

US/ml, a subit une précipitation au sulfate d’ammonium d’abord, puis une purification sur

gel. Un profil chromatographique de l’extrait enzymatique sur gel séphadex (G75) a été

effectué avec le tampon acétate de sodium (0,1M ; pH 5,4).

La caractérisation de l’enzyme fongique a donné une température optimale de 70°C, un pH de

6 et une concentration en CaCl2 de 0,03M

La fabrication de l’EDAM avec l’extrait enzymatique brut (EEB) de Mucor circinelloides,

s’effectue suivant les mêmes opérations de fabrication à base de présure. La dose utilisée de

l’EEB est calculée préalablement à partir de sa force coagulante.

Deux essais de fabrication de fromage type EDAM ont été effectués ; (1) le fromage est

préparé à partir de 50% présure et 50% de EEB, (2) le fromage est préparé à partir de 100%

EEB.

Actuellement les substituts d’origine fongique dominent le marché mondial des agents

coagulant le lait comparés aux présures de remplacement d’origine animale. Certes, le génie

génétique a développé le clonage de la Chymosine de veau et constitue aujourd’hui, avec

quelques rares restrictions règlementaires une autre voie d’application dont l’emploi en

fromagerie est en pleine croissance.

L’analyse de ces résultats indiquent que les deux souches ont une aptitude à la coagulation et

peuvent être utilisées comme des succédanées de présure dans la fabrication du fromage,

mais l’étude comparative entre les 2 souches indique que le Bacillus mojavensis a une

meilleure activité coagulante que celle de Mucor circinelloides, mais que son activité

protéolytique (64 µg/ml) reste toujours plus élevée que celle de Mucor sp (46µg/ml).

Cette étude nous a permis de contribuer aux travaux de recherches préexistants dans le

domaine de l’industrie fromagère, et de renforcer l’idée de pouvoir trouver de nouvelles

sources potentielles de succédanés de présure.

Conclusion

153

Enfin nous proposons de compléter cette étude par une suite de recherche qui portera sur :

Tester d’autres milieux de fermentation (solide, semi solide varier la

composition du milieu).

Vérification de la pureté de l’enzyme par électrophorèse SDS-PAGE.

Etudier les domaines d’application de l’enzyme et son mécanisme d’action.

Il serait intéressant d’approfondir les connaissances concernant les souches

sélectionnées afin de valoriser leurs capacités pour de meilleures applications

industrielles.

154

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ANNEXES

167

Annexe 1 :

Composition Du son utilisé

Origine Moulin ‘Algérie’ Blida

- Humidité: 14. 5 %

- Matières minérales :5.6 %

- Protides (N X 5.7) : 15.7%

- Protides (N X 6.25) : 17.2%

- Lipides : 7.25%

- Amidon : 23.05%

- Acidité (g H2SO4): 0.375

- Sucres réducteurs exprimés en glucose au % de matière sèche : 0.465 %

168

Annexe 2

Resultats de l’analyse statistique pour minimiser l’activité protéolytique Multiple Response Optimization ------------------------------ Data variables: Activité coagulante Activité protéolytique Observed Response Minimum Maximum ------------------------------------------------ Activité coagulante 0,0 3,33 Activité protéolytique 9,14 32,9 ------------------------------------------------ Desirability Weights Response Low High Goal First Second Impact ------------------------------------------------------------------------------------------ Activité coagulante 0,0 3,0 Maximize 1,0 3,0 Activité protéolytique 9,0 32,0 Minimize 1,0 3,0 ------------------------------------------------------------------------------------------ Predicted Observed Row Activité coagulante Activité protéolytique Desirability Desirability ------------------------------------------------------------------ 1 1,82 21,18 0,541658 0,534226 2 2,7 28,92 0,354779 0,347162 3 2,27 27,07 0,350608 0,402728 4 2,13 26,2 0,354779 0,423135 5 2,86 26,2 0,477186 0,490312 6 2,33 28,3 0,354779 0,353471 7 2,86 29,4 0,481947 0,328281 8 0,01 19,62 0,0 0,042358 9 2,38 26,4 0,354779 0,439499 10 0,24 24,39 0,409494 0,162695 11 0,01 20,74 0,176673 0,0403966 12 0,05 15,4 0,106105 0,109677 13 0,51 19,93 0,0 0,298686 14 0,0 10,64 0,149887 0,0 15 0,15 22,28 0,290586 0,145363 16 0,42 25,4 0,152741 0,200434 17 0,12 13,73 0,226958 0,178252 18 0,0 11,31 0,288033 0,0 19 2,44 29,6 0,354779 0,291324 20 0,0 14,4 0,290431 0,0 21 1,33 32,9 0,144699 0,0 22 0,03 20,13 0,0863406 0,0718392 23 0,06 11,45 0,0 0,133677 24 0,02 10,7 0,0 0,0785743 25 2,17 26,2 0,354779 0,42709 26 0,42 21,2 0,299052 0,256396 27 0,0 10,24 0,0 0,0 28 0,01 19,34 0,0489329 0,0428344 29 0,42 21,38 0,202956 0,254251 30 0,01 12,63 0,0 0,0529835 31 1,79 22,4 0,545852 0,499043 32 2,63 29,3 0,355754 0,320801

169

33 2,22 26,4 0,352868 0,424469 34 2,38 25,3 0,355754 0,48073 35 3,33 25,71 0,479803 0,522951 36 2,7 27,4 0,355754 0,424264 37 2,86 29,6 0,484899 0,315402 38 0,01 15,76 0,0 0,0485142 39 2,78 25,8 0,355754 0,499797 40 0,21 24,8 0,414421 0,148031 41 1,67 29,8 0,186748 0,230752 42 0,0 12,3 0,152316 0,0 43 0,01 19,01 0,0 0,043389 44 0,0 10,43 0,190723 0,0 45 0,21 23,2 0,300904 0,163654 46 0,01 20,15 0,174291 0,0414414 47 0,04 9,89 0,253934 0,113214 48 0,0 12,4 0,310072 0,0 49 2,17 30,85 0,355754 0,190175 50 0,33 21,84 0,30649 0,220434 51 1,39 28,48 0,139535 0,26629 52 0,01 21,82 0,124255 0,0384104 53 0,06 12,2 0,0 0,131215 54 0,02 9,14 0,0 0,0814008 55 2,13 26,8 0,355754 0,400652 56 0,17 23,82 0,307827 0,141963 57 0,0 12,4 0,0 0,0 58 0,01 18,2 0,107782 0,0447214 59 0,02 20,85 0,220111 0,0568497 60 0,01 12,96 0,0 0,0525302 ------------------------------------------------------------------ The StatAdvisor --------------- This procedure helps determine the combination of experimental factors which simultaneously optimize several responses. It does so by maximizing a desirability function. You may set various characteristics of the desirability function through the Analysis Options dialog box. The goals for each of the responses are currently set as: Activité coagulante - maximize Activité protéolytique - minimize Optimize Desirability -------------------- Optimum value = 0,634486 Factor Low High Optimum ----------------------------------------------------------------------- son 3,0 7,0 3,0 Caseine 0,02 2,0 0,0200001 Temperature 25,0 50,0 40,2713 Agitation 100,0 200,0 153,333 Response Optimum --------------------------------- Activité coagulante 2,18755 Activité protéolytique 19,302

170

--------------------------------- The StatAdvisor --------------- This table shows the combination of factor levels which maximize the desirability function over the indicated region. It also shows the combination of the factors at which that optimum is achieved. Use the Analysis Options dialog box to indicate the region over which the optimization is to be performed.

Surface de Réponse Estiméeson= 3,0,Caseine= 0,02

Temperature

Agitation

Obje

ctif

25 30 35 40 45 50100

150

200

0

0.2

0,4

0,6

0,8

171

Annexe 3

Photos de quelques bactéries sélectionnées

172

Annexe 4

Résultats du 1er

plan d’expérience

Standardized Pareto Chart for Activité coagulante

Standardized effect

+-

0 1 2 3 4

B:Caseine

D:Agitation

A:Glucose

C:Temperature

BB

CC

Main Ef fects Plot for Activité coagulante

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

Activité

co

ag

ula

nte

GlucoseCaseine

TemperatureAgitation

173

Estimated Response SurfaceTemperature=40,0,Agitation=200,0

Glucose Caseine

Activité c

oagula

nte

0 1 2 3 4 50

0,40,8

1,21,6

20,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

Analysis Summary ---------------- File name: C:\Documents and Settings\automate\Bureau\Souad 260309\Souad 260309 replicate.sfxCentral composite design: 2^4 + star Comment: Plan Souad Estimated effects for Activité coagulante ---------------------------------------------------------------------- average = 2,13812 +/- 0,196957 A:Glucose = -0,0871 +/- 0,307112 B:Caseine = 0,0019 +/- 0,307112 C:Temperature = -0,1149 +/- 0,307112 D:Agitation = 0,0215667 +/- 0,307112 BB = -2,17448 +/- 0,702058 CC = -2,22848 +/- 0,702058 block = -0,0270067 +/- 0,237888 ---------------------------------------------------------------------- Standard errors are based on total error with 52 d.f. The StatAdvisor --------------- This table shows each of the estimated effects and interactions. Also shown is the standard error of each of the effects, which measures their sampling error. To plot the estimates in decreasing order of importance, select Pareto Charts from the list of Graphical Options. To test the statistical significance of the effects, select ANOVA Table from the list of Tabular Options. You can then remove insignificant effects by pressing the alternate mouse button, selecting Analysis Options, and pressing the Exclude button.

174

Analysis of Variance for Activité coagulante - Plan Souad -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- A:Glucose 0,0682777 1 0,0682777 0,08 0,7778 B:Caseine 0,00003249 1 0,00003249 0,00 0,9951 C:Temperature 0,118818 1 0,118818 0,14 0,7098 D:Agitation 0,00418609 1 0,00418609 0,00 0,9443 BB 8,14327 1 8,14327 9,59 0,0031 CC 8,55275 1 8,55275 10,08 0,0025 blocks 0,0109404 1 0,0109404 0,01 0,9100 Total error 44,1406 52 0,848858 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corr.) 104,441 59 R-squared = 57,7363 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 52,9517 percent Standard Error of Est. = 0,921335 Mean absolute error = 0,611637 Durbin-Watson statistic = 3,10235 (P=0,0000) Lag 1 residual autocorrelation = -0,600491 The StatAdvisor --------------- The ANOVA table partitions the variability in Activité coagulante into separate pieces for each of the effects. It then tests the statistical significance of each effect by comparing the mean square against an estimate of the experimental error. In this case, 2 effects have P-values less than 0,05, indicating that they are significantly different from zero at the 95,0% confidence level. The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains 57,7363% of the variability in Activité coagulante. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 52,9517%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 0,921335. The mean absolute error (MAE) of 0,611637 is the average value of the residuals. The Durbin-Watson (DW) statistic tests the residuals to determine if there is any significant correlation based on the order in which they occur in your data file. Since the P-value is less than 0.05, there is an indication of possible serial correlation. Plot the residuals versus row order to see if there is any pattern which can be seen. Regression coeffs. for Activité coagulante - Plan Souad ---------------------------------------------------------------------- constant = -11,1569 A:Glucose = -0,017596 B:Caseine = 2,24177 C:Temperature = 0,614234 D:Agitation = 0,000143778 BB = -1,10931 CC = -0,00773777 ---------------------------------------------------------------------- The StatAdvisor

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--------------- This pane displays the regression equation which has been fitted to the data. The equation of the fitted model is Activité coagulante = -11,1569 - 0,017596*Glucose + 2,24177*Caseine + 0,614234*Temperature + 0,000143778*Agitation - 1,10931*Caseine^2 - 0,00773777*Temperature^2 where the values of the variables are specified in their original units. To have STATGRAPHICS evaluate this function, select Predictions from the list of Tabular Options. To plot the function, select Response Plots from the list of Graphical Options. Optimize Response ----------------- Goal: maximize Activité coagulante Optimum value = 2,1932 Factor Low High Optimum ----------------------------------------------------------------------- Glucose 0,05 5,0 0,0500001 Caseine 0,02 2,0 1,00992 Temperature 28,0 52,0 39,6883 Agitation 50,0 200,0 200,0 The StatAdvisor --------------- This table shows the combination of factor levels which maximizes Activité coagulante over the indicated region. Use the Analysis Options dialog box to indicate the region over which the optimization is to be performed. You may set the value of one or more factors to a constant by setting the low and high limits to that value.

176

Annexe 5

Courbe d’étalonnage de la tyrosine et de la BSA

Figure : Courbe étalon de la tyrosine.

Figure : Courbe étalonde sérum d’albumine bovin (BSA).

y = 0,009x + 0,090 R² = 0,993

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 20 30 40 50 60

Ab

sorb

ance

à 6

60 n

m

μg/ml

y = 0,0014x + 0,0192 R² = 0,9946

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Ab

sorb

ance

à 6

50 n

m

μg/mL

177

Annexe 6

Photos de quelques moisissures isolées

S1-52

4c-57

4a-61

4a-62

C/D-68

5F-71

178

Annexe 7

Echelle de Mc Farland

In microbiology, McFarland standards are used as a reference to adjust the turbidity of

bacterial suspensions so that the number of bacteria will be within a given range to

standardize microbial testing. An example of such testing is antibiotic susceptibility testing by

measurement of minimum inhibitory concentration which is routinely used in medical

microbiology and research. If a suspension used is too heavy or too dilute, an erroneous result

(either falsely resistant or falsely susceptible) for any given anti microbial agent could occur.

Original McFarland standards were mixing specified amounts of barium chloride and sulfuric

acid together. Mixing the two compounds forms a barium sulfate precipitate, which causes

turbidity in the solution. A 0.5 McFarland standard is prepared by mixing 0.05 mL of 1.175%

barium chloride dihydrate (BaCl2•2H2O), with 9.95 mL of 1% sulfuric acid (H2SO4).

Now there are McFarland standards prepared from suspensions of latex particles, which

lengthens the shelf life and stability of the suspensions. The standard can be compared

visually to a suspension of bacteria in sterile saline or nutrient broth. If the bacterial

suspension is too turbid, it can be diluted with more diluent. If the suspension is not turbid

enough, more bacteria can be added.

179

McFarland Nephelometer Standards:

McFarland Standard No. 0.5 1 2 3 4

1.0% Baruim chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

1.0% sulruric acid (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6

Approx. cell density (1X10^8 CFU/mL) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0

% Transmittance* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5

Absorbance* 0.08 to 0.1 0.257 0.451 0.582 0.669

*at wavelength of 600 nm

McFarland standards. No. 0.5, 1 and 2.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:McFarland_standards.JPG

African Journal of Biotechnology Vol. 11(100), pp. 16594-16606, 13 December, 2012 Available online at http://www.academicjournals.org/AJB DOI: 10.5897/AJB12.1115 ISSN 1684–5315 ©2012 Academic Journals

Full Length Research Paper

Isolation and identification of bacterial strain I33M producing milk-clotting enzyme: Optimization of culture

parameters using response surface

Talantikite-Kellil, S1, Nouani, A. 1,2*, Saunier, M3, Gillmann, L3, Brahmi, A4 and Fazouane, F1

1Food Technology Laboratory, University of Boumerdes, Algeria.

2Food Technology laboratory, ENSA, Algeria.

3lasba-Sonas (UPRES - EA 921 , Antenne IUT - Université d’Angers 49000, France.

4Department of Mathematics and Statistics - Moncton University, NB, Canada.

Accepted 19 October, 2012

A strain I33M which produces a milk-clotting enzyme was screened from Algerian soil near a dairy factory. This strain was identified as Bacillus mojavensis based on morphology and internal transcription spacer sequence. Sequencing analysis of 16S rDNA gene showed 100% identity of the tested strain with the B. mojavensis in the database. Phylogenetic analysis of this strain showed that it was most closely related to Bacillus subtilis strain. The optimum levels of these significant parameters to obtain the highest milk clotting activity and the lowest proteolytic activity were determined employing the response surface methodology (RSM), which revealed these as follows: wheat bran 7%, casein 0.094%, temperature 39°C, agitation size (rpm) 150. Among the various variables screened, agitation and temperature were most significant in submerged fermentation (SmF). The optimal value of milk clotting activity (MCA) is esteemed at 2.40. Key words: Milk clotting protease, Bacillus, response surface methodology, sequencing analysis.

INTRODUCTION The proteases constitute at least 65% of the total industrial enzyme market (Rao et al., 1998) and are also known as peptidyl_/peptide hydrolases (EC 3.4.21-24 and 99) which catalyze the hydrolysis of a peptide bond in a protein molecule such as casein for cheese making production (Beg et al., 2003).

In cheese technology, these extracellular proteases are obtained especially from microbial culture and throughout the world, many strains of clotting protease microorganisms are being produced industrially mainly fungi such as Mucor miehei, Mucor pusillus, Endothia parasitica, Irpex lacteus, Aspergillus niger var. Awamori, Kluyveromyces lactis and Escherichiacoli using solid state fermentation process (Olson, 1995; Chen et al., 2011). *Corresponding author. E-mail: [email protected].

It is well known that with the increase in world cheese production and consumption, attempts were made to find substitutes for this enzyme (Neelakantan et al., 1999). So far, most efforts for calf rennet substitute focus on finding new milk clotting-enzymes that could be used in cheese production and many microbial and plant proteases were identified and have been suggested as milk coagulants. Microbial proteases, especially from Bacillus sp. have traditionally held the predominant share of the industrial enzyme market of the worldwide enzyme sales with major application such as detergent product, waste treatment, food industry (Sepahy and Jabalameli, 2011). However, few studies have demonstrated the value of proteases as a substitute for rennet. Although, Ding et al. (2011) report that only few research work on bacteria are reported, wild bacteria with a high milk-clotting activity (MCA) in submerged fermentation show a great potential, due to shorter fermentation period, larger capacity of extracellular secretion and higher material utilization ratio.

Talantikite-Kellil et al. 16595

Figure 1. Photograph of microscopic observation of the strain I33M and other Bacillus strain Gram+ (A. B. C not studied).

Protease production is an inherent capacity of all microorganisms, however, only those microbes that produce substantial amounts of extracellular enzyme are of industrial importance such as dairy industry (Beg et al., 2003). Also, it is well known that extracellular protease production by microorganisms is greatly influenced by physical factors such as pH, temperature, time and by others factors (Thys et al., 2006) where submerged fermentation (SmF) has been traditionally used. The optimization of parameters becomes obvious and the RSM is a collection of statistical techniques for designing experiments, building models, evaluating the effects of factors and searching for the optimum conditions (Chen et al., 2011).

Thus, our present study is a contribution of the achievement of a milk clotting enzyme from the isolation of a bacterial strain local. Statistical methods have been applied for optimization of protease production (Gangadharan et al., 2008). A statistical approach has been employed for identifying significant variables influencing protease production under submerged fermentation (SmF). The levels of the significant variables were further optimized using response surface methodology.

MATERIALS AND METHODS

Microorganism, culture conditions and Isolation method

Fifty grams of soil samples were collected near a dairy factory in the region of Boumerdes, Algeria. A small amount of soil was homogenized under magnetic agitation for 20 mn with 90 mL sterile physiological water to make an initial dilution (10

−1) (Davet and

Rouxel, 1997). Serial dilutions were made for each sample and 0.1 mL of the appropriate dilution to 10

−9 was spread on plate count

agar (PCA) medium containing 2% (w/v) actidione antifungal agent to prevent fungal growth and 12% (w/v) sterilised skimmed milk powder. The plates were incubated at 30°C for 48 h for the enumeration of the caseolytic strain producing milk clotting protease by the presence of a clear halo around the colony (Figures 1 and 2). Colonies with distinct morphologies differences such as color (Gram technique), shape and size were selected (Table 1) and purified by streaking using the same medium. Of the 68 strains selected, 52 were Gram positive and 16 were Gram negative. All isolates were checked for milk clotting production and examined microscopically before stock preparations. The Gram positive bacterial isolates identified as Bacillus was purified and the selected strains are those with a clotting activity and are maintained on agar conservation.

Protease production in shake flask cultures, medium composition and inoculum

According to Rao and Mathur (1976), the basal minimal medium

16596 Afr. J. Biotechnol.

Figure 2. Caseolyse area of some strains tested. Strain I33M and other Bacillus strain Gram positive (A. B. C not studied).

Table 1. Experimental range and levels of the independent variables used in RSM in terms of actual and coded factors.

Variable Range of level

Actual Coded Actual Coded Actual Coded

Wheat bran (%w/v) 3 -1 5 0 7 +1

Casein (%w/v) 0.02 -1 1.01 0 2 +1

Temperature (°C) 25 -1 37.5 0 50 +1

Agitation (RPM) 100 -1 150 0 200 +1

(pH 6.8) used for milk clotting protease production, contained (g.l

-1):

Wheat bran (50), yeast extract (3), glucose (4), casein (2), Na2HPO4 (3). The production medium (50 ml) in a 250 ml Erlenmeyer flask) was inoculated with 10

7 to 5.10

8 bacteria per

milliliter (Mac Farland3) and incubated at 30°C on a rotary shaker with agitation (110 rpm) for 24 h (Poza et al., 2003 ) in a IKA

® KS

4000i control shaker. After incubation, the culture broth was filtered and then centrifuged at 4,000 g for 30 min at 4°C in a cold centrifuge (Jouan GR 422). Total protease yield and milk clotting activity was determined in the cell-free supernatant. Strain that showed the highest milk-clotting activity and the lowest proteolytic activity was selected for further studies and identified using 16S rDNA sequencing. The selected strain is called I33M.

In the next stage, response surface methodology is used to study the interactive effects of four variables, that is, wheat bran, casein,

temperature and agitation for improving total protease production by the strain I33M

Response surface methodology

The present work was based on the central composite design (CCD) utilized to obtain the experimental data, which would fit an empirical, full second-order polynomial model representing the response surfaces over a relatively broad range of parameters as reported by Dutta et al. (2004). Each factor in the central composite design (CCD) was studied at three different levels, low (-1), medium (0) and high (+1). For this purpose, the response surface approach was used and a set of experiment was performed. The range and levels of experimental variables investigated are presented in Table 2. Four independent variables were used to approach the


Table 2. Experimental designs by using four independent variables showing observed and predicted values of milk clotting activity of strain IM33 (B. mojavensis).

Run order Coded level

Wheat bran Casein Temperature Agitation Enzyme activity (IMCU/ml)

1 -1 0 0 0 1.82

2 0 0 0 0 2.70

3 0 0 1 0 2.27

4 0 0 0 0 2.13

5 1 0 0 0 2.86

6 0 0 0 0 2.33

7 0 -1 0 0 2.86

8 1 1 -1 -1 0.01

9 0 0 0 0 2.38

10 0 0 -1 0 0.24

11 1 1 1 1 0.01

12 1 -1 -1 1 0.05

13 -1 1 -1 -1 0.51

14 -1 -1 1 -1 -

15 0 0 0 -1 0.15

16 -1 1 1 1 0.42

17 -1 -1 1 1 0.12

18 1 -1 1 -1 -

19 0 0 0 0 2.44

20 1 -1 1 1 -

21 0 1 0 0 1.33

22 -1 1 1 -1 0.03

23 -1 -1 -1 1 0.06

24 -1 -1 -1 -1 0.02

25 0 0 0 0 2.17

26 0 0 0 1 0.42

27 -1 1 -1 1 -

28 1 1 -1 1 0.01

29 1 1 0 -1 0.42

30 1 -1 -1 -1 0.01

31 -1 0 0 0 1.79

32 0 0 0 0 2.63

33 0 0 1 0 2.22

34 0 0 0 0 2.38

35 1 0 0 0 3.33

36 0 0 0 0 2.70

37 0 -1 0 0 2.86

38 1 1 -1 -1 0.01

39 0 0 0 0 2.78

40 0 0 -1 0 0.21

41 1 1 1 1 1.67

42 1 -1 -1 1 -

43 -1 1 -1 -1 0.01

44 -1 -1 1 -1 -

45 0 0 0 -1 0.21

46 -1 1 1 1 0.01

47 -1 -1 1 1 0.04

48 1 -1 1 -1 -

49 0 0 0 0 2.17


Table 2. Continued.

50 1 -1 1 1 0.33

51 0 1 0 0 1.39

52 -1 1 1 -1 0.01

53 -1 -1 -1 1 0.06

54 -1 -1 -1 -1 0.02

55 0 0 0 0 2.13

56 0 0 0 1 0.17

57 -1 1 -1 1 -

58 1 1 -1 1 0.01

59 1 1 0 -1 0.02

60 1 -1 -1 -1 0.01

interaction among different factors (2

4 CCD with four factors was

applied) including 6 centre points and a set of 60 experiments was carried out. The central values (zero level) chosen for experimental design were: wheat bran 5% (w/v), casein 1.01% (w/v), temperature 37.5°C and agitation 150 rpm.

Results were analyzed by the experimental design module of the STATGRAPHICS plus V 5.1software (Statsoft, USA). The model permitted evaluation of the effects of linear, quadratic and interactive terms of the independent variables on the dependent variable. The statistical significance of the regression coefficients was determined by Student’s t-test and the second order model equation was determined by Fisher’s test. Three-dimensional surface plots were drawn to illustrate the main and interactive effects of the independent variables on milk clotting protease production (Myers and Montgomery, 2002; Thys et al., 2006).

For the validation of CCD, only two factors, temperature and agitation were taken, and remainder of the factors were fixed on the basis of the data obtained from the first set of experimental design. Analytical procedures Milk clotting activity assay Milk clotting activity (MCA) was measured according to the procedure described by international dairy federation (IDF) standard (IDF, 2002). Skim milk powder was reconstituted by dissolving 12.5 g in 100 ml of 0.5 g/L of CaCl2 solution (pH 6.5). The clotting assay was carried out by mixing 10 ml of this substrate with 1 ml of sample. Clotting activity was expressed in international milk clotting units (IMCU)/ml Proteolytic activity Proteolytic activity was determined according to the study of Murado and Siso (1993). One millilitre of the enzymatic extracts was added to 1 ml of 2% (w/v) alkali soluble casein in 0.02 M sodium-citrate buffer (pH 5.2). The reaction mixture was incubated at 35°C in a water bath for 10, 30, 60, 90 and 180 min, and the reaction was terminated by adding 5 ml of 12% (w/v) trichloroacetic acid. After 15 min, the precipitates formed were removed by filtration through Whatman no. 1 filter paper. Five millilitres of 0.5 M sodium carbonate solution was added to 1 ml of the aforementioned clear filtrate. The mixtures were incubated at 35°C for 10 min, when 0.5 ml of Folin–Ciocalteu reagent was added. The reaction was incubated for 20 min at 35°C for colour development. The optimal density at 660 nm expresses the rate of tyrosine released during hydrolysis.

Protein estimation Protein concentration was measured by the method of Lowry et al. (1951), with crystalline bovine albumin as the standard. Identification of strain I33M Macroscopy and microscopy were performed on Petri dishes with plate count agar (PCA) on colonies of 24 h. For sequencing analysis, the genomic DNA was extracted from the strain by the standard chloroform isoamyl alcohol method using PrepMan ultra sample preparation reagent kit (Applied Biosystems) and purified on plates NucleoFast (Macherey Nagel). The amplification of the 16S rDNA was performed through PCR technique, using Taq DNA polymerase, genomic DNA as a template, and 3 forward and 5reverse universal primers. The sequences of these primers used are as follows: F1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’), R1 (5’-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’), F2 (5’-CTCCTACGGGAGGCAG-3’) and R2 (5’-GACACGAGCTGACGACA-3’). PCR products were sequenced by Sanger technique using optimised conditions performed by Geno screen (Geno-screen Campus de l’Institut Pasteur de Lille 1, rue du Professeur Calmette – 59000 Lille – France). Receiving the sequencing results, 16S rDNA nucleotide sequence of the strain was deposited in GenBank, and aligned with the 16S rDNA sequences available in public data bases in National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), and LeBibi database (http://umr5558-sud-str1.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi) using basic local alignment search tool (BLAST) software. Bacterial growth and protease production in a fermentor The final validation of the statistical approach to protease production from B. mojavensis was carried out in a 2 l bioreactor (Sartorius Biostat A+, Switzerland) with a working volume of 1.5 L. The optimized medium (pH 6.8, 7% (w/v) wheat bran and 0.094% (w/v) casein) containing 0.3%(w/v) yeast extract and 0.3% (w/v) Na2HPO4 was sterilized in situ at 120°C for 30 min. The medium was inoculated aseptically with 60 ml of inoculum (Mc Farland 3) (9. 10

8 CFU / ml). The fermentation was carried out at 39°C for 50 h

with uncontrolled pH and the impeller speed was initially adjusted to 150 rpm. Samples were withdrawn periodically at an interval of 2 h and analyzed for protein and protease production (as described previously) and biomass estimation was determined using the technique described by Thys et al. (2006). The nutrient agar plates loaded by bacterial suspension were incubated for 24 h at 37°C and




Figure 3. Sequence of the 16S rDNA of strain I33M (B. mojavensis).

counts performed on plates having between 20 and 300 colonies. Other fermentation parameters, such as pH, were continuously monitored using microprocessor-controlled probes.

RESULTS AND DISCUSSION Screening of strains producing bacterial

Milk-clotting enzyme

In this study, some strain with different milk-clotting activity (MCA) were isolated from soil and identified as bacillus Gram positive by Biochemical tests (data not shown). Among these strains, four Bacillus sp (A, B, C and I33M ) had a good milk-clotting activity and caseolytic effect on casein agar plates as shown in Figure 2 and were selected to be studied further. In the present work and in a first step, we report the results of extracellular protease activity and molecular identification and phylogenetic analysis of strain I33M which also has the best enzyme activity (Up to 3.3 IMCU/ml) followed by high proteolytic effect. It is well known that protease production is an inherent capacity of all microorganisms, however only those microbes that produce substantial amounts of extracellular enzyme are of industrial importance (Gupta et al., 2002; Kole et al., 1988). Thus, the most common and widely used bacteria for industrial proteases belong to the genus Bacillus (Ara et al., 2007). Ghaffour and Hasnain (2010) reported that the strains of B. subtilis was highly active on milk agar plates and caseinase activity was confirmed by growing the organism on casein agar plates concentration ranging from 0.3 to 1%. In light of the examined literature, no work, in our opinion, has reported on milk clotting proteases produced by B. mojavensis. So, According to the results, B. mojavensis could be a good producer of extracellular milk clotting protease. As Fungal milk-

clotting enzymes, the Bacillus species could find applications in cheese industry. Identification of the strain The 16SrDNA gene sequence analysis has been described to be necessary mainly to detect some misidentification of Bacillus and related strains (Ben et al., 2011). Also, this technique is one of the most commonly used today for the identification of species, as it is a quick, reliable, and reproducible method compared to conventional technique using morphological and physiological criteria. For further characterization, the PCR product of strain I33M was examined by electrophoresis, purified, and then sequenced by Geno-screen (Campus de l’Institut Pasteur de Lille, France). In addition to biochemical and morphological identification, the 16S rDNA gene was successfully amplified from the genomic DNA of the strain I33M (Figure 3). This sequence consists of 999 bp and the length of Query sequence is: 195 A, 254 T, 321 C and 229 G. The BLAST search of 16S rDNA gene sequence against sequences in nucleotide database has shown 100% homology with B. mojavensis strain. Therefore, our strain was named B. mojavensis I33M and the data bases allowed us to elaborate a phylogenetic dendrogram for I33M and related strains (Figure 4). The phylogenetic analysis showed that the tested strain was closest to B. subtilis. Similar results were reported by Thuy and Bose (2011). Also, Roberts et al. (1994) report that isolate was subsequently found to belong to the closely related B. subtilis-like phenotype that has been recently described as B. mojavensis. B. mojavensis can be distinguished only by differences in whole-cell fatty acid composition, divergence in DNA sequence analysis, and resistance to genetic transformation between taxa within the B. subtilis group. Moreover, Bacon and Hinton (2001) revealed


Figure 4. Phylogenetic tree derived from analysis of 16S rDNA sequence of strain I 33M and related sequences obtained from NCBI. Scale bar. 0.001 substitutions per nucleotide position. The GenBank accession number for each strain follow the species name.


Figure 5. Bar graph of standardized estimated effects of the different variables tested in the prospective experiment on milk clotting protease production by strain I33M (B. mojavensis). The variables tested were wheat bran. temperature. agitation and casein. The point at which the effect estimates were statistically significant (at P = 0. 05) is indicated by the vertical line.

Table 3. Estimated effects for Milk clotting activity.

Factor Value

Average 2.27234 ±0.103779

A:Wheat bran 0.212778 ± 0.161821

B:Casein -0.0316667 ± 0.161821

C:Temperature 0.351667 ± 0.161821

D:Agitation 0.107778 ± 0.161821

CC -1.20806 ± 0.369922

DD -3.20306 ± 0.369922

Block 0.0466667 ± 0.125346

Standard errors are based on total error with 52 d.f.

in their works that the identity of a patented endophytic bacterium was established by 16S rRNA sequence analysis as a strain of B. mojavensis, a recently erected species within one of the B. subtilis subgroups. Optimization by response surface methodology The statistical design approach using response surface methodology was used to study the interactive effects of various chemicals and physical factors on protease (milk clotting) production by B. mojavensis. The primary aim is to maximize the milk clotting activity and to minimize the proteolytic activity. The experiment was conducted in 60 runs and the input variables that have the maximum influence on the final response of the system were identified from the interaction of four factors namely, wheat bran (carbon source) and casein (nitrogen source)

(nutritional factors), temperature and agitation (physical factors), was examined through RSM following the CCD. We recall that the respective low and high levels (% w/v) with the coded levels in parentheses for the factors were defined as 3 (-1) and 7 (+1) for wheat bran, 0.02 (-1) and 2.0 (+1) for casein, 25°C (-1) and 50°C (+1) for temperature, 100 rpm (-1) and 200 (+1) for the agitation.

The results of CCD experiments for studying the effects of these variables on protease production in milk clotting activity (IMCU/ml) are presented in Table 2 along with the observed responses.

Statistical analysis of results showed that in the range studied, quadratic effect of temperature and agitation has a strong effect on protease production followed by the quadratic effect of agitation. The temperature have a significant effect but slightly higher than the limit of significance for 95% of significance (Figure 5). Table 3 shows the estimate effects and interactions. The results


Table 4. Analysis of variance for Milk clotting activity.

Source Sum of squares Df Mean square F-Ratio P-Value

A:Wheat bran 0.407469 1 0.407469 1.73 0.1943

B:Casein 0.009025 1 0.009025 0.04 0.8456

C:Temperature 1.11303 1 1.11303 4.72 0.0343

D:Agitation 0.104544 1 0.104544 0.44 0.5083

CC 2.51345 1 2.51345 10.66 0.0019

DD 17.6693 1 17.6693 74.97 0.0000

blocks 0.0326667 1 0.0326667 0.14 0.7112

Total error 12.255 52 0.235673

Total (corr.) 76.2317 59

R-squared = 83.924%; R-squared (adjusted for d.f.) = 82.1041%; Standard error of est. = 0.485462; Mean absolute error = 0.330268; Durbin-Watson statistic = 2. 11832 (P=0. 2560); Lag 1 residual autocorrelation = -0.0634366.

Table 5. Regression coefficients for milk clotting activity.

Constant -18.5167

A:Wheat bran 0.0531944

B:Casein -0.0159933

C:Temperature 0.304002

D:Agitation 0.193262

CC -0.00386581

DD -0.000640613

of the second-order response surface model in the form of analysis of variance (ANOVA) are given in Table 4. Fischer F-test demonstrates significance for the regression model where the coefficient of determination (R

2) was 0.8392. The R-Squared statistic indicates that

the model as fitted explains 83.924% of the variability in milk clotting activity and this value indicates the aptness of the model. The adjusted R-squared statistic, which is more suitable for comparing models with different numbers of independent variables, is 82.1041%. The standard error of the estimate shows the standard deviation of the residuals to be 0.485462. The mean absolute error (MAE) of 0.330268 is the average value of the residuals. The following regression equation (in terms of coded factors) of the levels of protease produced expressed in IMCU /ml (Y) as a function of wheat bran (A), casein (B), temperature (C) an agitation (D). Y= -18.5167 + 0.0531944* A – 0.0159933*B + 0.304002*C + 0.193262*D – 0.00386581*C

2 -

0.000640613*D2.

The regression coefficients are listed in Table 5. The magnitude of the effects indicates the level of the significance of the variable on protease production and among the variable screened; it seems that only the physical factors (temperature and agitation) were

identified as most significant variables influencing milk clotting protease production as shown in Figure 5 than the substrate, wheat bran and casein. In fact, the results of observed responses for the experiments performed using CCD (Figure 2) showed that temperature and agitation are limiting factors for enzyme production of whatever substrate concentration. The combination of factors levels which maximize milk clotting activity has given a medium composed of wheat bran: 7.0; casein: 0.00941462; temperature: 39.2587 and agitation: 150.799) and the optimum value of milk clotting activity is 2.40661 (IMCU/ml).

After this, the three-dimensional response surface is plotted and represented as shown in Figure 6, which shows the relative effects of two factors, viz. temperature and agitation in combinations when all the factors (wheat bran and casein concentration) were kept at their central levels. The response surface obtained is convex and the convexity seems high enough. This suggests that there were well-defined optimum operating conditions. It was observed that there was an enhancement in protease production at relatively high temperatures and the maximum protease production was obtained at 38 to 39°C (Figure 6). On the other hand, above this temperature the protease production is very low. The same results are obtained with agitation. So, our model indicates that temperature has a major effect on protease


Figure 6. Response surface curve of milk clotting protease production from strain I33M (B. mojavensis) showing interaction between temperature and agitation.

production by the B. mojavensis strain. This result is reported by Thys et al. (2006) and other RSM studies also showed that temperature is a very relevant factor for microbial protease production (Wu and Hang, 2000). The RSM methodology was found to be very efficient to determine the optimal conditions for protease production by Bacillus sp. PE-11 (Thys et al., 2006). In general, it is clearly shown that no defined medium has been established for producing protease from different microbial sources (Gupta et al., 2002). Each organism or strain has its own requirement of special conditions for maximum enzyme production. So, in our case, the physical factors, temperature and agitation are more significant than nutritional factors. Growth and protease production at optimal conditions in laboratory-scale bioreactor During the period of growth, we notice that the lag phase is short and the exponential phase, after 10 h of fermentation, the stationary phase begins and continues for 48 h, the growth rate is 1.9228 while the generation time is 29 min 36 s (Figure 7). In terms of the stationary phase, there have been a number of studies conducted on B. subtilis fermentation. These studies show that it can last from 3 to 8 days. Thus, Dutt et al. (2008) report that clotting activity decreases after 45 h whereas maximum is reached after one day (Shieh et al., 2009). The pH was fairly stable throughout the fermentation

period (Figure 7). This could be explained by the fact that the bacteria consuming sugars produced acids that were quickly neutralized by the basic products from the proteolytic activity of Bacillus. The milk clotting and proteolytic activities increase over time while the protein level remains more or less telling; the two activities are linked (Figures 8 and 9).

On the clotting enzyme produced by B. mojavensis, the results show that this protease is a secondary metabolite because its rate continues to increase during stationary phase when a primary metabolite is produced during the exponential phase. Conclusion From this study, it can be concluded that milk clotting protease from B. mojavensis can be considered as a suitable alternative to the conventional rennet but it is more important to increase in the milk clotting activity (MCA) per proteolytic activity (PA) index. On the other hand, the present work show that protease production in B. mojavensis can be improved by controlling various factors simultaneously viz. agitation and temperature and this interaction could only be well understood by suitable RSM selection. In fact, this statistical method which includes factorial design and regression analysis helps in evaluating the effective factors and in building models to study interaction and select optimum conditions of variables for a desirable response. In our case, maximum


Figure 7. Evolution of the growth of the strainI33M (B. mojavensis) and pH of the medium in the fermenter [CFU (●). pH (♦)].

.

Figure 8. Production of milk clotting enzyme during growth of Bacillus mojavensis in optmized medium. CFU (●) and enzyme activity (■) were monitored.

milk clotting protease production was achieved at temperature 39°C and agitation 150 RPM.

However, additional studies about quality of the enzyme are needed in the future to confirm its usefulness

(h)

(h)


Figure 9. Curve of the proteolytic activity of strainI33 M (B.mojavensis) depending on the incubation time.

in the dairy processing. ACKNOWLEDGEMENTS Dr. ARNAUD DUDOIT, responsible micropollutants service in the laboratory of Hydrology and hygiene, Angers, is acknowledged for his assistance in statistical analysis. We also acknowledge the helpful collaborations of Odile ROLET-REPECAUD engineer, INRA (POLIGNY (39801, France). REFERENCES Ara K, Ozaki K, Nakamura, Yamane K, Sekiguchi J, Ogasawara N

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