mÉcanismes d'action de la contraction musculaire … · 2009-03-23 · iv glucose induite par...
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KATHLEEN LEMIEUX
MÉCANISMES D'ACTION DE LA CONTRACTION MUSCULAIRE SUR LE TRANSPORT DU GLUCOSE
DANS LE MUSCLE SQUELETTIQUE DE RAT
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (PhD)
Physiologie-Endocrinologie FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
FÉVRIER 2003 © Kathleen Lemieux, 2003
iii
RÉSUMÉ Chez les mammifères, le muscle squelettique constitue un tissu d'importance majeure dans la
régulation du transport et du métabolisme du glucose durant l'exercice physique ou en période
postprandiale. La captation musculaire de glucose induite par l'insuline et la contraction
musculaire s'effectue grâce à la translocation des transporteurs de glucose GLUT4 à la
membrane plasmique et aux tubules transversaux à partir d'un réservoir interne. La première
partie des travaux constituant cette thèse a été effectuée dans le but de clarifier si l'insuline et
la contraction musculaire activent la translocation de GLUT4 à partir de réservoirs internes
distincts. Par fractionnement et immunoadsorption membranaire, nous avons démontré que la
contraction musculaire recrutait GLUT4 à partir de deux compartiments distincts : un
compartiment associé au récepteur de la transferrine sélectivement mobilisé à la membrane
plasmique et insensible à l'insuline, et un second compartiment non associé à cette protéine
recruté au niveau des tubules transversaux. Cette étude a permis de déterminer que l'insuline et
la contraction musculaire recrutaient GLUT4 à partir de réservoirs distincts et que la
contraction musculaire induisait la translocation de GLUT4 à la surface cellulaire à partir d'au
moins deux différentes populations de vésicules GLUT4.
Les deux dernières parties des travaux faisant l'objet de cette thèse ont permis de déterminer
l'implication de certains médiateurs intracellulaires dans la stimulation du transport du glucose
induite par la contraction musculaire ou par le AICAR, un agent mimétique de la contraction.
Tout d'abord, nos travaux ont révélé que l'infusion de AICAR induit sélectivement la
translocation de GLUT4 à la membrane plasmique à partir d'un compartiment enrichi en
récepteur de la transferrine. De plus, nous avons démontré que la stimulation du transport du
glucose par le AICAR était dépendante de l'activation de la p38 MAPK, une kinase proposée
comme agent régulateur de l'activité intrinsèque de GLUT4. D'autre part, une dernière étude
nous a permis de déterminer que le AICAR active spécifiquement le transport du glucose au
niveau des muscles glycolytiques isolés et que le monoxyde d'azote n'est pas impliqué dans
l'effet stimulateur du AICAR sur la captation du glucose au niveau de ce type de muscle.
Toutefois, l'infusion de AICAR in vivo stimule le transport de glucose dans tous les types de
fibres musculaires ainsi que la production de monoxyde d'azote. De plus, l'injection de AICAR
stimule la phosphorylation et l'activation de eNOS, suggérant que l'activation du transport du
iv
glucose induite par le AICAR in vivo est dépendante de l'augmentation du flot sanguin via la
production de monoxyde d'azote. Globalement, ces études nous ont permis de mieux
comprendre les mécanismes intracellulaires par lesquels la contraction musculaire active le
transport du glucose in vitro et in vivo dans le muscle squelettique.
v
REMERCIEMENTS
Au cours de mes études supérieures, beaucoup de personnes ont contribué à parfaire
ma formation scientifique à plusieurs niveaux. J'aimerais tout d'abord remercier mon directeur
de recherche, le Dr André Marette qui a grandement contribué à développer mon esprit et mes
connaissances scientifiques ainsi que mon sens critique par sa grande compétence scientifique,
son goût du dépassement, sa disponibilité exceptionnelle, son éternel optimisme et son
implication constante dans l'élaboration de mes projets de recherche. Merci André, je me
considère privilégiée d'avoir pu bénéficier de cette formation unique que tu transmets à tes
étudiants.
Je tiens également à remercier toutes les personnes qui ont participé à l'élaboration de
mes projets de recherche à titre de collaborateurs comme le Dr Arend Bonen ainsi que Xiao-
Xia Han de l'Université de Waterloo, le Dr Amira Klip ainsi que Daniel Konrad de
l'Université de Toronto. Un merci tout spécial à mes collègues Luce Dombrowski, Geneviève
Pilon, Van Diep Doan et Bruno Marcotte pour leur collaboration à mes études. Merci Luce
pour tes nombreux conseils et ton expertise appréciés à plusieurs niveaux. Merci Geneviève
pour ton écoute, ta joie de vivre et ta persévérance dans mon dernier projet. Merci Van Diep
pour ta contribution essentielle par la technique du clamp euglycémique à la réalisation de mes
travaux. Remerciements également au Dr Claude Côté et au Dr Benoît Lapointe ainsi qu'à
Julie Lefebvre pour l'enseignement du protocole de contraction. Je tiens finalement à
remercier tous les membres de mon équipe de recherche avec qui j'ai partagé de très bons
moments... et beaucoup de taquineries, ainsi que tous les membres des laboratoires de Claude
Côté, Jérôme Frenette, Benoît Lamarche, Jean-Pierre Després, Marie-Claude Vohl avec qui
j'ai eu beaucoup de plaisir au laboratoire et lors d'activités sociales et sportives.
Le soutien financier durant mes études doctorales a été assuré par les Instituts de
Recherche en Santé du Canada.
vi
AVANT-PROPOS
L'ensemble des travaux de recherche et des articles scientifiques présentés dans cette
thèse ont été réalisés dans le laboratoire du Dr André Marette du Centre de Recherche sur les
Maladies Lipidiques affilié au Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université
Laval. La rédaction des articles publiés ou non a été réalisée en collaboration avec mon
directeur de recherche, le Dr André Marette, figurant ainsi comme auteur correspondant.
Les travaux constituant le premier chapitre de cette thèse ont été effectués en
collaboration avec Xiao-Xia Han, membre du laboratoire du Dr Arend Bonen de l'Université
de Waterloo en Ontario ainsi qu'avec la contribution de Luce Dombrowski, membre de notre
laboratoire. Xiao-Xia Han a effectué la technique de perfusion in situ des muscles stimulés à
l'insuline ou contractés par stimulation électrique et les expériences d'immunoadsorption
membranaire ont été réalisées par Luce Dombrowski. Cet article scientifique a été publié dans
la revue Diabetes en février 2000 (Vol. 49, p. 183-189).
Le deuxième volet de mes études a été réalisé grâce à la collaboration du laboratoire du
Dr Amira Klip de l'Université de Toronto. Les mesures d'activités enzymatiques ont été
effectuées par Daniel Konrad, membre du laboratoire du Dr Amira Klip alors que la technique
du clamp euglycémique pour les études in vivo du second et du troisième chapitre a été
réalisée par mon collègue Van Diep Doan. Les deux derniers ouvrages scientifiques intégrés
dans cette thèse seront prochainement soumis pour publication dans les revues FASEB Journal
et Diabetes, respectivement.
L'ensemble des autres expériences couvrant ces trois chapitres ont été réalisées par
l'auteure de cette thèse. Celles-ci incluent principalement la technique de fractionnement
membranaire, la technique de captation du [3H] 2-désoxyglucose et de la [125I] transferrine, le
protocole de contraction in situ, l'injection de AICAR et l'analyse par immunobuvardage. J'ai
également mis au point une technique d'ablation endosomale dans le muscle squelettique qui a
fait l'objet d'études préliminaires rapportées dans la conclusion de cette thèse. Ce dernier
projet sera ultérieurement complété dans notre laboratoire.
À mes parents Éliane et René Avec tout mon amour, mon admiration et ma reconnaissance
viii
TABLES DES MATIÈRES
RÉSUMÉ..............................................................................................................iii
REMERCIEMENTS............................................................................................v
AVANT-PROPOS ...............................................................................................vi
TABLES DES MATIÈRES..............................................................................viii
Liste des tableaux ..............................................................................................xiii
Liste des figures .................................................................................................xiii
Liste des abréviations........................................................................................xiv
INTRODUCTION................................................................................................1
1 Le muscle squelettique ..................................................................................................... 1
1.1 Anatomie macroscopique et microscopique .......................................................... 1
1.2 Types de fibres musculaires................................................................................... 3
1.3 Physiologie de l'exercice........................................................................................ 6 1.3.1 Mécanismes de contraction............................................................................ 6 1.3.2 Métabolisme énergétique............................................................................... 6 1.3.3 Le système oxydatif ....................................................................................... 8
1.4 Transport du glucose : Première étape de régulation du métabolisme glucidique. 9
2 Les transporteurs de glucose .......................................................................................... 10
2.1 Classification, localisation et fonction. ................................................................ 10
2.2 GLUT1 ................................................................................................................. 13
2.3 GLUT4 ................................................................................................................. 14
2.4 Régulation du transport du glucose : Rôle de GLUT4......................................... 14 2.4.1 GLUT4 : Translocation sensible à l'insuline et à la contraction musculaire 15 2.4.2 GLUT4 : Activité intrinsèque ...................................................................... 16
3 Mécanismes de régulation du transport du glucose : Insuline et contraction musculaire.................................................................................................................................. 17
3.1 Translocation de GLUT4 ..................................................................................... 17 3.1.1 Signalisation insulinique.............................................................................. 17
ix
3.1.2 Signalisation associée à la contraction musculaire ...................................... 19
3.2 AMPK : un nouveau médiateur de l'effet de la contraction sur le transport du glucose ................................................................................................................. 24
3.2.1 Rôles de l'AMPK ......................................................................................... 24 3.2.2 Structure générale ........................................................................................ 25 3.2.3 Distribution tissulaire................................................................................... 26 3.2.4 Localisation cellulaire.................................................................................. 27 3.2.5 Mécanismes d'activation.............................................................................. 27 3.2.6 AMPK et contraction musculaire ................................................................ 29 3.2.7 AICAR : un activateur de l'AMPK.............................................................. 30 3.2.8 Modulation de l'activité de l'AMPK par le glycogène................................. 34
3.3 Activation de GLUT4 .......................................................................................... 36 3.3.1 Rôle de l'insuline.......................................................................................... 36 3.3.2 Rôle de la contraction musculaire et du AICAR ......................................... 37
4 Effet combiné de l'insuline et de la contraction musculaire sur le métabolisme du glucose...................................................................................................................... 40
4.1 Mécanismes additifs sur le transport du glucose ................................................. 40 4.1.1 Implication des molécules de signalisation insulinique dans les effets de la
contraction musculaire................................................................................. 40 4.1.2 Transport du glucose insulino-résistant vs contraction musculaire ............. 41 4.1.3 Translocation additive de GLUT4 ............................................................... 42
5 Endosomes et transport du glucose ................................................................................ 47
5.1 Le système endosomal ......................................................................................... 47 5.1.1 L'endocytose ................................................................................................ 47 5.1.2 Modèle de traffic inter-endosomal............................................................... 48
5.2 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 au niveau basal48
5.3 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 en présence d'insuline .............................................................................................................. 49
5.4 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 lors de la contraction musculaire. ........................................................................................ 50
6 Monoxyde d'azote et transport du glucose ..................................................................... 52
6.1 Physiologie et production du monoxyde d'azote ................................................. 52
6.2 Expression, régulation et fonction des synthases du monoxyde d'azote.............. 53 6.2.1 eNOS............................................................................................................ 53 6.2.2 nNOS ........................................................................................................... 54 6.2.3 iNOS ............................................................................................................ 56
x
6.3 Rôle du monoxyde d'azote dans le transport du glucose ..................................... 57 6.3.1 Rôle du monoxyde d'azote dans les effets de l'insuline sur le transport du
glucose. ........................................................................................................ 58 6.3.2 Rôle du monoxyde d'azote dans les effets de la contraction musculaire et du
AICAR sur le transport du glucose.............................................................. 59 6.3.3 iNOS et résistance à l'insuline ..................................................................... 62
7 Buts et aspects méthodologiques de la thèse.................................................................. 62
CHAPITRE 1 : Le récepteur de la transferrine définit deux différentes populations de vésicules GLUT4 sensibles à la contraction musculaire dans le muscle squelettique de rat. ..........................................................64
RÉSUMÉ.............................................................................................................................. 65
The transferrin receptor defines two distinct contraction-responsive GLUT4 vesicle populations in skeletal muscle.................................................................................. 66
CHAPITRE 2 : Un activateur de la kinase activée par l'AMP, le AICAR, ne stimule pas la translocation de GLUT4 aux tubules-T mais active la p38 MAPK α et β dans le muscle squelettique. ......................................93
RÉSUMÉ.............................................................................................................................. 94
The AMP-activated protein kinase activator AICAR does not induce GLUT4 translocation to transverse tubules but activates p38 mitogen-activated protein kinases α and β in skeletal muscle ......................................................................................................... 95
CHAPITRE 3 : Rôle du monoxyde d'azote dans la stimulation du transport du glucose induite par la kinase activée par l'AMP dans le muscle squelettique. .............................................................................................116
RÉSUMÉ............................................................................................................................ 117
Role of nitric oxide in the stimulation of glucose transport by activation of AMP-activated protein kinase in skeletal muscle........................................................................... 118
CONCLUSION GÉNÉRALE .........................................................................144
BIBLIOGRAPHIE...........................................................................................159
xii
Liste des tableaux
TABLEAU 1 : Caractéristiques fonctionnelles, métaboliques et structurales des différents types de fibres musculaires squelettiques. ............................................................. 5
TABLEAU 2 : Les transporteurs de glucose à système de transport facilité chez les mammifères : Distribution tissulaire et fonctions physiologiques........................ 12
TABLEAU 3 : Caractérisation biochimique distinctive des vésicules GLUT4 (VG) sensibles à l'insuline ou à la contraction musculaire dans le muscle squelettique. ................. 46
TABLEAU 4 : Caractéristiques des principaux isoformes des synthases du monoxyde d'azote................................................................................................................................ 57
xiii
Liste des figures
FIGURE 1 : Anatomie macroscopique et microscopique du muscle squelettique.................... 2
FIGURE 2 : Contribution des différents substrats énergétiques durant l'exercice physique..... 8
FIGURE 3 : Structure moléculaire d'un transporteur de glucose.. .......................................... 11
FIGURE 4 : Molécules de signalisation impliquées dans la stimulation du transport du glucose par l'insuline dans les tissus insulino-sensibles. ...................................... 19
FIGURE 5 : Modèle de l'association des différentes sous-unités de la kinase activée par l'AMP en absence et en présence d'AMP.............................................................. 28
FIGURE 6 : Mécanismes d'activation de l'AMPK par la contraction musculaire et par le AICAR. ................................................................................................................. 32
FIGURE 7 : Molécules de signalisation intracellulaire possiblement impliquées dans la stimulation du transport du glucose par la contraction musculaire dans le muscle squelettique.. ......................................................................................................... 39
FIGURE 8 : Modèle schématique du mouvement intracellulaire de GLUT4 au niveau basal et en présence d'insuline dans les cellules adipeuses.. .............................................. 51
FIGURE 9 : Modèle hypothétique de la translocation de GLUT4 stimulée par l'insuline et la contraction musculaire dans le muscle squelettique.. ......................................... 149
FIGURE 10 : Modèle hypothétique de la voie de signalisation par laquelle le AICAR stimule la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique..................................... 153
xiv
Liste des abréviations ADP : Adenosine Diphosphate AMP : Adenosine Monophosphate AMPK : AMP-activated protein Kinase AMPKK : AMP-activated protein Kinase Kinase ATP : Adenosine Triphosphate BH4 : Tetrahydrobiopterin CD-MPR : Cation dependant-Mannose-6-Phosphate Receptor EDL : Extensor Digitorum Longus EGF : Epidermal Growth Factor FAD : Flavine Adenine Nucleotide FMN : Flavine Mononucleotide GLUT : Glucose Transporter GSK-3 : Glycogen Synthase Kinase-3 GTP : Guanosine Triphosphate GTPase: Guanosine Triphosphatase CGMP : Cyclic Guanosine Monophosphate HMG-CoA: 3-Hydroxy-3-Methyl Glutaryl-Coenzyme A HRP : Horseradish Peroxidase Hsp 90 : Heat Shock Protein 90 IGF : Insulin-like Growth Factor IL-1 et 6 : Interleukine-1 et 6 IR : Insulin Receptor IRAP : Insulin Responsive Aminopeptidase IRS-1 et 2 : Insulin Receptor Substrate-1 et 2 Km : Constante de Michaelis-Menten L-NAME : NG-Nitro-L-Ariginine Methyl Ester L-NMMA : NG-monomethyl-L-arginine LPS : Lipopolysaccharide MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase mTOR : Mammalian Target of Rapamycin PDGF : Platelet Derived Growth Factor PH: Plecktrin Homology domain PTB : Phosphotyrosine Binding domain
xv
SCAMPS : SeCretory-Associated Membrane Proteins SH2 domain : Src Homology domain SNAREs : Soluble N-ethylmaleimide Attachment protein Receptor SNF1: Sucrose Non-Fermenting 1 SNP : Sodium Nitroprusside TGF-beta : Transforming Growth Factor-beta TNFα : Tumor Necrosis factor α Tubules-T : Tubules Transversaux VAMP : Vesicle Associated Membrane Protein W-7 : N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide ZMP : 5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside monophosphate ZTP : 5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside triphosphate
1
INTRODUCTION
1 Le muscle squelettique
1.1 Anatomie macroscopique et microscopique Le muscle squelettique est un tissu qui recouvre le squelette osseux et s'y attache via les
tendons. C'est un organe bien délimité qui contient des milliers de fibres musculaires, du tissu
conjonctif, des vaisseaux sanguins et des neurofibres. Macroscopiquement, l'ensemble du
muscle est recouvert d'une gaine de tissu conjonctif lâche, l'épimysium. À l'intérieur de cette
couche sont disposées les fibres musculaires réunies en faisceaux qui sont eux délimités par le
périmysium. Cette enveloppe de tissu conjonctif contient des vaisseaux sanguins nécessaires à
l'irrigation du muscle qui se prolongent en capillaires pour atteindre toutes les composantes
plus internes du muscle. À l'intérieur de chaque faisceau, chacune des fibres musculaires est
entourée d'une autre couche de tissu conjonctif lâche appelée endomysium. Chaque fibre
musculaire est ensuite entourée d'une membrane plasmique, le sarcolemme, qui abrite le
sarcoplasme contenant les nombreux noyaux cellulaires, les mitochondries, le réticulum
sarcoplasmique ainsi que d'autres organites plus ou moins spécialisés. Microscopiquement, la
fibre musculaire contient des milliers de longues structures cylindriques appelées myofibrilles,
qui sont des structures complexes composées de groupes de filaments. Ces myofibrilles
constituent l'élément contractile et chacune d'entre elles possède plusieurs unités contractiles,
les sarcomères. Ceux-ci sont constitués de plusieurs myofilaments minces d'actine et de
myofilaments épais de myosine, dont l'agencement donne naissance à différents types de stries
et de bandes. En présence d'ATP et de calcium, le glissement des filaments d'actine le long
des filaments de myosine permet le raccourcissement et l'allongement du muscle nécessaires à
une contraction musculaire complète. L'anatomie microscopique et macroscopique du muscle
squelettique est représentée à la figure 1.
2
FIGURE 1: Anatomie macroscopique et microscopique du muscle squelettique. (Schéma emprunté à Wilmore, J.H. et Costill, D.L., Physiologie du sport et de l'exercice, 1994 et Marieb, E.H., Anatomie et physiologie humaines, 1992).
Les tubules transversaux (tubules-T) sont des structures spécialisées qui jouent un rôle
fonctionnel clé dans le muscle squelettique. En effet, ces invaginations profondes du
sarcolemme sont essentielles à la propagation de l'influx nerveux aux structures impliquées
dans la contraction qui sont profondément enfouies dans la cellule. Puisque les tubules-T sont
3
situés tout près du réticulum sarcoplasmique, l'influx nerveux qui est acheminé le long des
tubules modifie le réticulum sarcoplasmique, ce qui permet la relâche d'ions calcium essentiels
au processus contractile. De plus, ces longues structures tubulaires communiquent avec le
milieu interstitiel, permettant également l'approvisionnement vital en glucose, oxygène et ions
aux parties plus profondément inscrites dans la cellule. Au niveau métabolique, les tubules-T
représentent environ 60 % de la surface cellulaire et c'est pourquoi ils sont principalement
responsables de l'augmentation du transport du glucose stimulé notamment par l'insuline et la
contraction musculaire (Cullen, MJ, et al. 1984; Dudek, RW, et al. 1994; Eisenberg, BR 1983;
Marette, A, et al. 1992; Roy, D and Marette, A 1996).
1.2 Types de fibres musculaires Des études histologiques du muscle squelettique ont révélé l'existence de deux types majeurs
de fibres musculaires : les fibres oxydatives à contraction lente de type I ainsi que les fibres
glycolytiques de type II à contraction rapide. Les fibres de type I sont habituellement petites
et possèdent une activité de l'ATPase de la myosine qui est lente, d'où le nom de fibres à
contraction lente. La présence d'une forte vascularisation ainsi que l'abondance en
myoglobine qui emmagasine l'oxygène leurs conférent une couleur rouge. Elles possèdent de
nombreuses mitochondries et les enzymes impliquées dans la voie de synthèse aérobie de
l'ATP sont très actives. Toutes ces caractéristiques démontrent l'importance du pouvoir
oxydatif de ces fibres assurant leur grande résistance à la fatigue ce qui leur permet de soutenir
un exercice modéré de longue durée lorsque l'apport en oxygène est suffisant.
Alternativement, les fibres musculaires de type II à contraction rapide, et plus particulièrement
les fibres de type IIb, sont généralement grosses, peu vascularisées et pauvres en myoglobine
et en mitochondries. Elles utilisent donc principalement les voies de dégradation anaérobies
pour la synthèse de l'ATP, ce qui conduit à la production d'acide lactique. Bien qu'elles
possèdent une réserve plutôt importante de glycogène, la dégradation rapide du glycogène et
l'accumulation subséquente d'acide lactique les prédisposent à la fatigue. Ces propriétés
accordent donc à ce type de fibres la capacité de se contracter intensément pour une courte
durée. Les fibres musculaires de type IIa possèdent des caractéristiques métaboliques et
structurales intermédiaires aux fibres de type I et IIb. Tout comme les fibres de type IIb,
4
l'activité de l'ATPase de ce type de fibres est rapide mais leurs besoins en oxygène, leur teneur
en myoglobine et leur grande vascularisation les apparentent davantage aux fibres de type I.
Puisqu'elles symthétisent l'ATP par des processus aérobies, les fibres de type IIa sont
résistantes à la fatigue mais dans une moindre mesure comparativement aux fibres musculaires
de type I. Le tableau 1 résume les principales caractéristiques fonctionelles, métaboliques et
structurales de ces fibres (Marieb, ÉN 1992; Wilmore, JH and Costill, DL 1994)
Le recrutement des différents types de fibres musculaires est fonction de l'intensité et de la
durée de l'effort. Durant un exercice prolongé à faible intensité où la tension musculaire est
sous-maximale, le système nerveux recrute préférentiellement les fibres de type I qui sont
mieux adaptées aux activités d'endurance. À mesure que l'intensité de l'exercice augmente, on
assiste à un recrutement progressif des fibres de type II, et plus particulièrement des fibres de
type IIa. Lorsque les fibres de type I et IIa s'épuisent, les fibres de type IIb possédant une
capacité glycogénolytique élevée ue à l'abondance de glycogène peuvent entrer en jeu,
permettant la poursuite de l'exercice en cours. Les fibres de type IIb sont reconnues pour être
davantages sollicitées lors d'un exercice très intense de courte durée.
5
TABLEAU 1 :
Caractéristiques fonctionnelles, métaboliques et structurales des différents types de fibres musculaires squelettiques.
Caractéristiques Fibres de type I Fibres de Type IIa Fibres de type IIb
Caractéristiques fonctionelles :
Vitesse de contraction
Force de contraction
Lente
Faible
Rapide
Élevée
Rapide
Élevée
Caractéristiques métaboliques :
Contenu en myoglobine
Pouvoir oxydatif
Activité glycogénolytique
Réserve de glycogène
Résistance à la fatigue
Élevé
Élevé
Faible
Faible
Élevée
Élevé
Élevé
Élevée
Élevée
Intermédiaire
Faible
Faible
Élevée
Élevée
Faible
Caractéristiques structurales :
Mitochondries
Dimension du réticulum sarcoplasmique
Vascularisation
Nombreuses
Petite
Forte
Nombreuses
Grande
Forte
Peu nombreuses
Grande
Faible
6
1.3 Physiologie de l'exercice En plus de permettre le mouvement des membres corporels et la locomotion, la contraction
musculaire constitue un processus essentiel au maintien de la vie de plusieurs espèces. Chez
l'humain, ce mécanisme permet entre autres d'assurer les fonctions vitales de l'organisme telles
que les battements cardiaques, le maintien de la pression artérielle par la contraction et la
relaxation des vaisseaux sanguins, la respiration pulmonaire et la digestion. Durant l'exercice
physique, le corps humain est soumis à plusieurs formes de stress ce qui l'amènent à
enclencher plusieurs mécanismes d'adaptation d'ordre hormonal, physiologique et métabolique
nécessitant l'interaction et la coordination de plusieurs systèmes (Hargreaves, M 1995; Marieb,
ÉN 1992; Weineck, J 1998; Wilmore, JH and Costill, DL 1994)
1.3.1 Mécanismes de contraction Le contrôle volontaire de la contraction musculaire squelettique est un phénomène complexe
qui est géré par le système nerveux somatique. Via les neurones moteurs efférents, ce système
permet d'acheminer l'influx nerveux aux cellules musculaires, provoquant la libération d'un
neurotransmetteur excitateur, l'acétylcholine. La production subséquente du potentiel d'action
permet la libération du calcium stocké dans le réticulum sarcoplasmique. En se liant à la
troponine, le calcium modifie la conformation du complexe troponine-tropomyosine ce qui
expose les sites de liaison de l'actine. La contraction est alors initiée lorsque les têtes de
myosine s'attachent aux sites de liaison de l'actine, ce qui induit le glissement des
myofilaments d'actine vers le contre du sarcomère. L'énergie nécessaire au fonctionnement de
ce cycle est fournie par l'hydrolyse de l'ATP grâce à l'ATPase associée aux têtes de myosine.
Après la fin du potentiel d'action, i.e. lorsque la contraction se termine, le calcium est
réabsorbé par le réticulum sarcoplasmique et la tropomyosine masque à nouveau le site de
liaison de l'actine, permettant ainsi à la fibre musculaire de relaxer.
1.3.2 Métabolisme énergétique La contraction musculaire nécessite une quantité importante d'ATP afin de permettre le
glissement des myofilaments dépendant de l'ATPase ainsi que pour activer les pompes à
7
calcium et la Na+/K+-ATPase. Afin de permettre une contraction musculaire soutenue, la
cellule doit constamment se munir de mécanismes régénérateurs de l'ATP. Pendant l'activité
musculaire, trois systèmes permettent la régénération de l'ATP : le système ATP/céatine
phosphate, le système glycolytique et le système oxydatif (Voir figure 2).
1.3.2.1 Le système ATP/créatine-phosphate Pour initier la contraction, la cellule musculaire hydrolyse la faible quantité d'ATP
emmagasinée dans le muscle ce qui produit de l'ADP. La forte demande en ATP que nécessite
ensuite la poursuite du processus provient de la réaction couplée de l'ADP et de la créatine
phosphate, un composé riche en énergie abondamment retrouvé dans le muscle. Sous le
contrôle de la créatine kinase, cette réaction rapide, ne nécessitant pas d'oxygène, permet le
transfert du groupement phosphate de la créatine phosphate sur la molécule d'ADP qui devient
alors de l'ATP. Cette réaction fournit donc rapidement de l'ATP, permettant ainsi au muscle de
préparer les voies aérobies et anaérobies à l'augmentation rapide de la demande en ATP.
1.3.2.2 Le système glycolytique Bien que la concentration de créatine phosphate du muscle soit quatre fois plus importante que
celle de l'ATP, cette source d'énergie n'est cependant pas suffisante pour fournir la quantité
d'ATP requise pour la contraction. Afin de fournir un supplément d'ATP, la cellule musculaire
en activité doit ensuite utiliser la glycolyse comme voie métabolique de dégradation du
glucose ce qui mène à la production d'ATP et d'acide pyruvique. La glycolyse se produit en
état d'anaérobie i.e. qu'elle ne nécessite pas d'oxygène. Le produit final de la glycolyse dépend
cependant de l'utilisation ou non de l'oxygène. En absence d'oxygène, l'acide pyruvique sera
transformé en acide lactique alors qu'en situation aérobie, le pyruvate pourra être oxydé par le
cycle de Krebs. Bien que l'hydrolyse de la créatine phosphate et la glycolyse (par molécule de
glucose) produisent moins d'ATP que la voie aérobie, leur utilisation permet de synthétiser de
l'ATP plus rapidement. Par conséquent, ils constituent les principales sources d'énergie lors de
la phase initiale d'un exercice de haute intensité.
8
1.3.3 Le système oxydatif La production oxydative de l'ATP se déroule dans les mitochondries et requiert donc la
présence d'oxygène. Ce système possède un rendement énergétique énorme et intervient
lorsque la contraction musculaire devient plus soutenue. Ainsi, le glucose emprunte d'abord la
voie de la glycolyse et le pyruvate formé est converti en acétyl-CoA dans les mitochondries.
Ce dernier produit est ensuite soumis à une série complexe de réactions chimiques via le cycle
de Krebs menant à la synthèse de 2 moles d'ATP par molécule de glucose, du carbone et de
l'hydrogène. En se liant à l'oxygène, le carbone libéré se transforme en dioxyde de carbone
pour être ensuite rejeté par les poumons via la circulation sanguine. Pour sa part, l'hydrogène
libéré s'élimine en empruntant la chaîne de transport des électrons ce qui prévient
l'acidification du milieu cellulaire.
Le métabolisme glycolytique et oxydatif du glucose constitue un processus essentiel au
maintien de l'activité contractile durant un exercice physique où la demande énergétique est
accrue. L'étude des mécanismes intracellulaires responsables du transport du glucose et de sa
régulation dans les myofibres durant la contraction musculaire est donc d'une importance
capitale.
FIGURE 2 : Contribution des différents substrats énergétiques durant l'exercice physique. (Schéma emprunté à Weineck, J, Biologie du sport, 1998).
9
1.4 Transport du glucose : Première étape de régulation du métabolisme glucidique
L'insuline est une hormone polypeptidique produite et sécrétée par les cellules bêta du
pancréas qui a été premièrement isolée et caractérisée par Frederick G. Banting and Charles H.
Best au début du 20 ième siècle. La connaissance des différents aspects de l'action de l'insuline
a considérablement évolué depuis 80 ans et a permis de déterminer qu'à l'état postprandial, le
métabolisme du glucose est primordialement assuré par l'insuline qui stimule la captation du
glucose sanguin au niveau des tissus insulino-sensibles comme le tissu adipeux et le muscle
squelettique. Le muscle squelettique est un tissu majeur de l'organisme qui représente environ
36 % et 45 % de la masse corporelle chez la femme et l'homme respectivement. Il constitue
donc le site majeur de l'utilisation du glucose en période postprandiale, mais également durant
la contraction musculaire puisque le glucose constitue le principal substrat énergétique. En
effet, la sécrétion élevée d'insuline suite à l'ingestion d'aliments contribue à l'augmentation de
la captation musculaire de glucose (Baron, AD, et al. 1988). Durant un clamp
euglycémique/hyperinsulinémique, il a été démontré que le muscle squelettique était
responsable de 80 % de la captation totale de glucose par l'organisme dans ces conditions
(DeFronzo, RA, et al. 1981). Paradoxalement, la sécrétion d'insuline diminue durant l'exercice
(Galbo, H 1983) alors que l'augmentation du transport musculaire de glucose est déterminante
et essentielle pour fournir l'ATP qui saura répondre aux besoins énergétiques de la cellule
musculaire en activité. Le transport du glucose à travers les membranes lipidiques a été
démontré comme étant l'étape limitante de son métabolisme (Kubo, K and Foley, JE 1986).
Puisque les membranes lipidiques sont imperméables au glucose, l'entrée de glucose à
l'intérieur de la cellule suite à une stimulation insulinique ou durant la contraction musculaire
est assurée par une famille de transporteurs de glucose à système de transport facilité, les
GLUT.
10
2 Les transporteurs de glucose
2.1 Classification, localisation et fonction. L'entrée du glucose à travers la membrane cellulaire représente un des plus importants
systèmes de transport de nutriments dans les cellules de mammifères puisque l'énergie fournie
par le métabolisme du glucose joue un rôle capital dans le maintien de l'homéostasie et donc,
de la survie cellulaire. Les transporteurs de glucose chez les mammifères (GLUT) assurent la
captation du glucose à travers les membranes par un système de transport facilité puisque
l'entrée de glucose est dépendante d'un gradient de concentration et ne requiert aucune source
d'énergie. Biochimiquement, les GLUTs sont composés de 12 domaines transmembranaires,
d'une longueur d'environ 500 acides aminés, dont les extrémités N- et C-terminale pointent
vers le cytoplasme (Bell, GI, et al. 1993) (Voir figure 3). Ils appartiennent à une famille de
transporteurs de glucose qui compte à ce jour 11 isoformes (GLUT1 à GLUT12) et un pseudo-
gène (GLUT6) ne codant pas pour un transporteur de glucose fonctionnel (Voir tableau 2).
L'existence de l'isoforme GLUT7 est remise en question puisqu'une étude a révélé qu'il serait
associé à une erreur de clonage (Burchell, A 1998). Ces transporteurs diffèrent en termes de
distribution tissulaire, de caractéristiques cinétiques et de spécificité relative au type d'hexoses
transportés. Aux six isoformes précédemment identifiés (GLUT1 à GLUT6) s'ajoutent cinq
nouveaux isoformes qui ont été plus récemment caractérisés. Chacun de ces transporteurs est
dérivé d'un gène différent ; les isoformes GLUT1 à GLUT5 présentent une homologie
considérable dans leurs séquences en acides aminés alors que ces séquences sont quelque peu
différentes pour le second groupe d'isoformes GLUT8 à GLUT12. Outre les isoformes
GLUT1 et GLUT4 qui sont exprimés dans les tissus insulino-sensibles, des études révèlent
que trois des nouveaux isoformes des GLUTs (GLUT8, GLUT11 et GLUT12) sont exprimés
au niveau du muscle squelettique. Plus particulièrement, il a été démontré que l'isoforme
GLUT8, connu également sous le nom de GLUTX1, est abondamment exprimé dans les
testicules, les blastocytes et à un plus faible niveau dans le muscle squelettique
(Carayannopoulos, MO, et al. 2000; Doege, H, et al. 2000; Ibberson, M, et al. 2000; Phay, JE,
et al. 2000). De plus, une de ces études révèle que GLUT8/GLUTX1 est mobilisé à la surface
cellulaire par l'insuline et contribue à l'augmentation du transport du glucose dans les
11
blastocytes (Carayannopoulos, MO, et al. 2000). Certains travaux récents ont aussi vérifié la
distribution tissulaire des isoformes GLUT9 à GLUT12 chez le rat et l'humain (Doege, H, et
al. 2000; McVie-Wylie, AJ, et al. 2001; Rogers, S, et al. 2002). Cependant, aucune de ces
études n'a vérifié le rôle de ces derniers isoformes dans la stimulation du transport du glucose
induite par l'insuline ou la contraction musculaire dans les tissus insulino-sensibles.
FIGURE 3 : Structure moléculaire d'un transporteur de glucose. (Schéma emprunté à Bell et al. 1993).
12
TABLEAU 2 :
Les transporteurs de glucose à système de transport facilité chez les mammifères : Distribution tissulaire et fonctions physiologiques.
Nom Distribution tissulaire Fonctions
GLUT1 Érythrocytes, cellules endothéliales,
cerveau, placenta, muscle et tissu adipeux
Transport du glucose basal et à travers la barrière hémato-
encéphalique
GLUT2 Foie, cellules bêta du pancréas, intestin, rein
Transport bidirectionnel du glucose dans les hépatocytes
Relâche de glucose par les cellules de l'intestin et du rein
Senseur de glucose dans les cellules bêta du pancréas
GLUT3 Humain : cerveau, tissu adipeux, rein,
foie, muscle Autres espèces : limitée au cerveau
Transporteur principal du glucose au niveau des neurones
GLUT4 Muscle squelettique et cardiaque, tissu adipeux blanc et brun
Transport du glucose régulé par l'insuline et la contraction
GLUT5 Intestin, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein Transport du fructose
GLUT6 Pseudogène --------------
GLUT8/ GLUTX1 Blastocytes, testicules, muscle squelettique
Transport du glucose insulino-sensible au niveau des blastocytes
GLUT9 Leucocytes, cerveau, foie, rein Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus
GLUT10 Foie, pancréas Proposé comme gène de susceptibilité au diabète
GLUT11 Muscle squelettique et cardiaque Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus
GLUT12 Muscle squelettique, tissu adipeux et petit intestin
Transport du glucose, mécanismes de régulation inconnus
13
2.2 GLUT1 Le transporteur de glucose GLUT1 fut le premier isoforme à être caractérisé dans les cellules
de mammifères. Son expression a été observée dans plusieurs tissus, principalement au niveau
du placenta, du cerveau, des érythrocytes, des yeux, des reins et à un moindre niveau dans les
tissus insulino-sensibles i.e. les muscles squelettique et cardiaque ainsi que les tissux adipeux
blanc et brun. De façon générale, l'expression de GLUT1 est augmentée par une variété de
stimuli qui favorisent la croissance ou la division cellulaire requérant davantage d'énergie
comme l'insuline, le PDGF, l'IGF-1, le TGF-β, les hormones thyroïdiennes et de croissance
ainsi que certains oncogènes (Birnbaum, MJ, et al. 1987; Kitagawa, T, et al. 1991; Maher, F,
et al. 1989; Rollins, BJ, et al. 1988; Tai, PK, et al. 1990; Tordjman, KM, et al. 1989;
Weinstein, SP, et al. 1990) le glucose ayant par contre un effet contraire sur l'expression de cet
isoforme (Walker, PS, et al. 1988; Wertheimer, E, et al. 1991).
Dans le muscle squelettique, GLUT1 représente environ 3 à 5 % du nombre total des
transporteurs de glucose. Il est localisé principalement à la membrane plasmique de ces
cellules et est responsable du transport de glucose basal au niveau des tissus insulino-sensibles
(Marette, A, et al. 1992; Zorzano, A, et al. 1989). Ce transporteur est également retrouvé dans
les membranes internes du tissu adipeux. Dans ce dernier tissu, il a été démontré que l'insuline
induisait une augmentation de la translocation de GLUT1 à la membrane plasmique, avec une
diminution concomitante de ce transporteur à partir d'un réservoir interne contenant environ 50
% de la totalité des GLUT1 (Czech, MP and Buxton, JM 1993; James, DE, et al. 1988; Kahn,
BB, et al. 1987; Slot, JW, et al. 1991). Toutefois, aucune translocation de GLUT1 n'a pu être
observée dans le muscle squelettique en présence d'insuline ou lors de la contraction
musculaire, sa localisation étant exclusivement associée à la membrane plasmique, et absente
au niveau des tubules transversaux et des membranes internes (Dombrowski, L, et al. 1996;
Douen, AG, et al. 1990; Marette, A, et al. 1992; Zorzano, A, et al. 1996). De plus, on a
observé un niveau d'expression supérieur de GLUT1 au niveau des fibres musculaires
oxydatives de type I comparativement aux fibres glycolytiques de type II (Goodyear, LJ, et al.
1991; Marette, A, et al. 1992).
14
2.3 GLUT4 GLUT4 constitue le principal transporteur de glucose responsable de l'augmentation de la
captation du glucose induite par l'insuline ou la contraction musculaire et représente plus de 90
% de la totalité des transporteurs de glucose exprimés dans le muscle squelettique et
cardiaque, et dans le tissu adipeux blanc et brun (Holman, GD, et al. 1990; Marette, A, et al.
1992). En effet, l'importance de cette contribution est supportée par le fait que la translocation
de GLUT4 est cinq fois supérieure à celle de GLUT1 dans les cellules adipeuses (Calderhead,
DM, et al. 1990; Holman, GD, et al. 1990). De plus, GLUT4 possède une affinité supérieure
pour le glucose que GLUT1, révélée par un Km de 2-5 mM pour GLUT4 et de 7-10 mM pour
GLUT1 (Gould, GW and Holman, GD 1993). L'expression de GLUT4 est restreinte aux tissus
insulino-sensibles (Birnbaum, MJ 1989; James, DE, et al. 1989). Au niveau du muscle
squelettique, la distribution de GLUT4 diffère selon le type de fibres musculaires. Tout
comme pour GLUT1, des études ont estimé que GLUT4 est quatre fois plus abondamment
exprimé dans les fibres musculaires oxydatives que dans les fibres glycolytiques (Goodyear,
LJ, et al. 1991; Henriksen, EJ, et al. 1990; Johannsson, E, et al. 1996; Marette, A, et al. 1992),
ce qui pourrait expliquer que les fibres oxydatives sont davantage sensibles à l'effet de
l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport du glucose que les fibres
glycolytiques (Ploug, T, et al. 1987; Song, XM, et al. 1999).
2.4 Régulation du transport du glucose : Rôle de GLUT4 Les mécanismes cellulaires qui modulent la captation du glucose au niveau du muscle
squelettique sont complexes. Afin d'être métabolisé, le glucose sanguin doit_ entre autres_
franchir plusieurs barrières cellulaires pour finalement atteindre le cytoplasme de la cellule. Il
doit notamment être transporté du sang vers l'espace interstitiel et ensuite vers l'espace
intracellulaire. Le mouvement du glucose des capillaires sanguins vers l'intérieur de la cellule
est déterminé principalement par le flot sanguin via le recrutement des capillaires, le gradient
de concentration du glucose mais aussi par le nombre et l'activité des transporteurs de glucose
GLUT4 mobilisés à la surface cellulaire des myocytes par l'insuline et la contraction
musculaire.
15
2.4.1 GLUT4 : Translocation sensible à l'insuline et à la contraction musculaire
Au début des années 80, deux groupes de chercheurs se sont intéressés à étudier les
mécanismes cellulaires contribuant à l'augmentation de la captation du glucose dans les tissus
cibles de l'organisme. Ils ont alors utilisé l'insuline comme modèle expérimental afin de
démontrer que le principal mécanisme par lequel cette hormone stimule la captation du
glucose dans les cellules adipeuses s’effectuait par la translocation de transporteurs de glucose
à partir d'un compartiment intracellulaire jusqu'à la membrane plasmique (Cushman, SW and
Wardzala, LJ 1980; Suzuki, K and Kono, T 1980). Ce processus de translocation a ensuite été
démontré dans les autres tissus insulino-sensibles comme le muscle squelettique (Klip, A, et
al. 1987) et cardiaque (Zaninetti, D, et al. 1988). Au niveau du muscle squelettique, il a été
démontré qu'en plus de la membrane plasmique, l'insuline induisait la translocation de GLUT4
au niveau d'un second compartiment de surface, les tubules-T et ce, tant au niveau des fibres
musculaires oxydatives que glycolytiques (Dohm, GL, et al. 1993; Marette, A, et al. 1992).
Parallèlement, plusieurs travaux ont également démontré que la stimulation du transport du
glucose induite par la contraction musculaire était attribuable à une augmentation du contenu
en GLUT4 au niveau de la membrane plasmique et des tubules-T des myofibres oxydatives et
glycolytiques (Douen, AG, et al. 1989; Hirshman, MF, et al. 1988; Roy, D and Marette, A
1996). Toutefois, la contraction musculaire in situ semble stimuler davantage la translocation
de GLUT4 au niveau des tubules-T des fibres musculaires glycolytiques qu’oxydatives (Roy,
D, et al. 1997). En utilisant différentes techniques de fractionnement membranaire afin d'isoler
les membranes de surface et le compartiment intracellulaire, on a de plus démontré que la
contraction musculaire in vitro, in situ, ainsi que l’exercice physiqueinduisait spécifiquement
la translocation de GLUT4, et non celle de GLUT1 (Roy, D, et al. 1997; Roy, D and Marette,
A 1996) ou de GLUT5 (Kristiansen, S, et al. 1997) à la surface cellulaire.
Puisque les tubules-T représentent 60 à 70 % de la surface cellulaire des myocytes, ces
structures ont été proposées comme étant le principal compartiment de surface contribuant à
l'augmentation du transport du glucose activé par l'insuline et la contraction musculaire. En
effet, de nombreuses études immunocytochimiques indiquent que la majorité des GLUT4
associés à la surface cellulaire sont situés au niveau des tubules-T comparativement à la
16
membrane plasmique au niveau basal (Dudek, RW, et al. 1994; Friedman, JE, et al. 1991).
Sous l'action de l'insuline et suite à la contraction musculaire, il a été démontré par
immunobuvardage que pour une même quantité de protéines purifiées à partir des différentes
fractions membranaires, le niveau de translocation de GLUT4 à la membrane plasmique et aux
tubules-T était similaire (Dombrowski, L, et al. 1996; Roy, D and Marette, A 1996).
Cependant, si l'on considère l'ensemble de la surface cellulaire du muscle composée
majoritairement de tubules-T, la quantité absolue de GLUT4 recrutés à la surface cellulaire
sous l'action de ces stimuli est plus importante au niveau des tubules-T qu'au niveau de la
membrane plasmique. Ces données ont d'ailleurs été confirmées par détection
immunocytochimique de GLUT4 dans le muscle stimulé par l'insuline chez des souris
trangéniques surexprimant GLUT4 (Dudek, RW, et al. 1994; Wang, W, et al. 1996).
2.4.2 GLUT4 : Activité intrinsèque L'activité intrinsèque des transporteurs de glucose GLUT se définit par le nombre maximal de
molécules de glucose transportées de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule par unité de
temps, impliquant un mouvement mécanique de bascule des transporteurs communément
appelé mécanisme de “flip-flop”. En plus de la translocation des transporteurs de glucose, il a
été proposé que la stimulation maximale du transport du glucose nécessite une augmentation
de l'activité intrinsèque des transporteurs mobilisés à la surface cellulaire (Moyers, JS, et al.
1996; Zierler, K 1998). En support à cette hypothèse, des travaux ont démontré une
dissociation entre la translocation des GLUTs et le transport du glucose stimulé par l'insuline
dans le muscle squelettique (Hansen, PA, et al. 1998) et le tissu adipeux (Armoni, M, et al.
1995). Cette dissociation a également été remarquée dans une étude où la leptine inhibait le
transport du glucose dépendant de l'insuline sans affecter la translocation de GLUT4myc dans
les cellules musculaires L6 en culture (Sweeney, G, et al. 2001). Ces cellules surexpriment
GLUT4 qui contient un épitope myc associé à sa partie exofaciale. Puisque la translocation de
GLUT4 est mesurée en utilisant un anticorps dirigé contre l'épitope myc exposé à la surface
cellulaire, ceci permet de s'assurer que GLUT4 est efficacement inséré à la membrane
plasmique et donc fonctionnellement apte à transporter le glucose. Plus récemment, plusieurs
évidences laissent croire que l'enzyme p38 MAPK serait impliquée dans l'activation de
17
GLUT4, contribuant ainsi à augmenter maximalement le transport du glucose stimulé par
l'insuline ou la contraction musculaire (discuté à la section 3.3).
3 Mécanismes de régulation du transport du glucose : Insuline et contraction musculaire
3.1 Translocation de GLUT4
3.1.1 Signalisation insulinique Il est maintenant reconnu que la phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3 kinase) de classe IA est
un médiateur intracellulaire clé dans l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport du glucose
et la translocation de GLUT4 dans les tissus insulino-sensibles (Clarke, JF, et al. 1994; Farese,
RV 2001; Frevert, EU and Kahn, BB 1997; Hara, K, et al. 1994; Kotani, K, et al. 1995;
Litherland, GJ, et al. 2001; Tanti, JF, et al. 1996). Le modèle simplifié de la signalisation
insulinique (voir figure 4) implique que la liaison de l'insuline au domaine extracellulaire α de
son récepteur (IR) induit une autophosphorylation sur les résidus tyrosine de la sous-unité
intracellulaire β de IR, ce qui a pour effet d'augmenter l'activité tyrosine kinase du IR. Les
résidus tyrosine phosphorylés de IR permettent la liaison des protéines IRS (IRS-1 à 4) via
leur domaine PTB, ce qui induit le recrutement des IRS à la membrane cellulaire. Le récepteur
de l'insuline activé induit alors une phosphorylation des IRS sur leurs résidus tyrosine, ceux-ci
permettant ensuite la liaison de la sous-unité régulatrice p85 de la PI-3 kinase via son domaine
SH2. Cette dernière liaison induit un changement conformationnel de la sous-unité catalytique
p110 de la PI-3 kinase ce qui a pour effet d'activer cette enzyme. La PI-3 kinase activée
phosphoryle la phophatidylinositol-4,5-phosphate (PI(4,5)P2) de la membrane cellulaire, ce
qui génère le composé lipidique PI(3,4,5)P3. Ce second messager permet ensuite le
recrutement de la serine/thréonine kinase Akt/PKB à la membrane plasmique qui se lie au
PI(3,4,5)P3 via son domaine PH. L'interaction de la kinase Akt/PKB avec PI(3,4,5)P3 n'active
pas directement l'enzyme mais permet plutôt aux protéines kinases PDK-1 et PDK-2 d'activer
l'Akt/PKB par phosphorylation des résidus thréonine 308 et sérine 473, respectivement. Suite
à son activation, l'Akt/PKB se dissocie de la membrane plasmique et peut ensuite
18
phosphoryler certains substrats cytoplasmiques et nucléaires comme l'enzyme GSK-3 (Cross,
DA, et al. 1995), la protéine mTOR (Nave, BT, et al. 1999) et l'enzyme eNOS (Montagnani,
M, et al. 2001).
La nature des différents effecteurs de la PI-3 kinase impliqués dans l'action stimulatrice de
l'insuline sur le transport du glucose et la translocation de GLUT4 demeure à ce jour encore
mal définie, mais plusieurs travaux suggèrent un rôle de l'Akt/PKB dans le métabolisme du
glucose activé par l'insuline (Cong, LN, et al. 1997; Hajduch, E, et al. 1998; Kohn, AD, et al.
1996; Wang, Q, et al. 1999). De plus, certaines études suggèrent que la protéine kinase C
(PKC), et plus particulièrement les PKC atypiques (aPKC), constitue un second effecteur
agissant en aval de la PI-3 kinase pour stimuler le transport du glucose insulino-dépendant
dans les cellules musculaires et adipeuses (Bandyopadhyay, G, et al. 2000; Kotani, K, et al.
1998; Nakanishi, H, et al. 1993; Standaert, ML, et al. 1997). Cependant, d'autres travaux sont
en désaccord avec l'implication des aPKC dans la stimulation du transport du glucose dans les
adipocytes 3T3-L1 (Tsuru, M, et al. 2002).
Des études plus récentes ont suggéré que l'insuline stimule le transport du glucose par une
autre voie de signalisation intracellulaire indépendante de la PI-3 kinase mais essentielle pour
activer maximalement la captation du glucose hormono-dépendante (Saltiel, AR and Kahn,
CR 2001). En effet, certains travaux ont démontré que le complexe CAP/Cbl et la protéine
TC10 sont activés par l'insuline et contribuent à stimuler le transport du glucose et la
translocation de GLUT4 dans les adipocytes 3T3-L1 (Baumann, CA, et al. 2000; Chiang, SH,
et al. 2001; Ribon, V and Saltiel, AR 1997; Watson, RT, et al. 2001). Il a été démontré que le
récepteur de l'insuline active la tyrosine phosphorylation de la protéine proto-oncogène, c-Cbl,
qui active à son tour la protéine TC10 en présence d'un adapteur protéique CAP liant c-Cbl
(Ribon, V and Saltiel, AR 1997). Cette voie de signalisation est également représentée à la
figure 4.
19
FIGURE 4 : Molécules de signalisation impliquées dans la stimulation du transport du glucose par l'insuline dans les tissus insulino-sensibles.
3.1.2 Signalisation associée à la contraction musculaire Depuis quelques années, des progrès considérables ont été réalisés afin de clarifier les
mécanismes intracellulaires par lesquels l'exercice ou la contraction musculaire active la
captation du glucose et la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique. Il est reconnu
que les effets de la contraction musculaire sont tout à fait indépendants de l'action de l'insuline
puisque la contraction musculaire de muscles isolés peut stimuler le transport du glucose
même en absence d'insuline (Nesher, R, et al. 1985; Ploug, T, et al. 1984; Richter, EA, et al.
1985). Contrairement à l'insuline, il a été rapporté que la PI-3 kinase n'est pas impliquée dans
la stimulation du transport du glucose et la translocation de GLUT4 par la contraction
musculaire ou par l'exercice (Voir section 4.1.1). Toutefois, certaines évidences suggèrent que
le calcium, les protéines kinases C et B, l'hypoxie, l'adénosine, l'AMPK ainsi que le monoxyde
d'azote (Voir section 6.3.2) pourraient intervenir dans le mécanisme d'action liant la
contraction musculaire et la captation de glucose. L'implication possible des MAPK dans ces
effets sera également discutée.
20
3.1.2.1 Rôle du calcium En plus d'être essentiel au processus contractile, il a été proposé que le calcium libéré par le
réticulum sarcoplasmique contribue à l'activation du transport du glucose durant l'exercice
(Holloszy, JO, et al. 1986). En absence de dépolarisation membranaire, on a observé une
augmentation du transport du glucose stimulé par la cafféine, un agent inducteur de la
contraction qui stimule la relâche de calcium par le réticulum sarcoplasmique (Holloszy, JO
and Narahara, HT 1967). D'autre part, une étude révèle que la relâche de calcium induite par le
W-7 produit une augmentation du transport du glucose même en absence de contraction
musculaire (Youn, JH, et al. 1991). Dans cette dernière étude, l'observation d'un effet additif
du W-7 et de l'insuline, mais pas du W-7 et la contraction musculaire, sur le transport du
glucose suggère que le calcium participe à l'activation du transport du glucose par la
contraction musculaire, et non à l'effet de l'insuline. De plus, le blocage de la relâche de
calcium par la dandrolène provoque une inhibition du transport du glucose induit par la
contraction (Nolte, LA, et al. 1995), le W-7 (Youn, JH, et al. 1991) et par la phospholipase C
(Henriksen, EJ, et al. 1989). À ce jour, aucune étude n'a contredit ces résultats. Ces
observations proposent donc un rôle unique au calcium dans l'effet stimulateur de la
contraction musculaire sur le transport du glucose, pouvant se traduire soit par un effet direct
du calcium sur le transport du glucose ou par l'activation de molécules intracellulaires
impliquées dans cet effet. Cependant, il a été proposé que le calcium n'active pas directement
le transport du glucose durant la contraction musculaire puisque la concentration de calcium
cytoplasmique durant l'activité contractile ne s'élève que durant quelques secondes alors que le
transport du glucose est activé et maintenu durant plusieurs minutes. De plus, des études
démontrent que des agents inducteurs de la relâche de calcium inhibent l'action stimulatrice de
l'insuline sur le transport du glucose, cet effet étant opposé à celui observé en présence
simultanée d'insuline et de contraction musculaire (Draznin, B, et al. 1987; Lee, AD, et al.
1995). L'ensemble de ces évidences suggèrent donc que le calcium initie ou facilite l'activation
des molécules de signalisation impliquées dans la stimulation du transport du glucose par la
contraction musculaire mais ne participe pas de façon directe à cet effet.
21
3.1.2.2 Rôle des protéines kinases C et B Les protéines kinases C (PKC), et plus particulièrement les PKC nouvelles (nPKC) et
conventionnelles (cPKC), comptent parmi les médiateurs intracellulaires sensibles au calcium
qui ont été proposés comme jouant un rôle dans l'effet de la contraction sur le transport du
glucose. En effet, on a rapporté une activation du transport du glucose dans le muscle
squelettique suite au traitement avec un agent activateur des PKC, le phorbol ester (Hansen,
PA, et al. 1997; Henriksen, EJ, et al. 1989). De plus, l'inhibition des PKC par la calphostine C
(Ihlemann, J, et al. 1999; Wojtaszewski, JF, et al. 1998) et la polymixine B (Henriksen, EJ, et
al. 1989; Young, JC, et al. 1991) réduit le transport du glucose stimulé par la contraction
musculaire ou l'exercice. Lors des contractions musculaires in situ et in vitro, on a également
noté une augmentation de la translocation des PKC du cytosol vers des compartiments
membranaires parallèlement à une activation des PKC associées à la fraction membranaire
(Cleland, PJ, et al. 1989; Richter, EA, et al. 1987). Ces évidences suggèrent donc que les PKC
participent à l'activation de la captation du glucose par la contraction musculaire. Toutefois,
les rôles des différents isoformes des PKC dans l'activation du transport du glucose induite par
la contraction musculaire ne sont à ce jour pas clairement définies. Plus récemment, il a été
rapporté que la contraction musculaire et un agent activateur de l'AMPK, le AICAR, stimulent
l'activité calcium-indépendante des aPKC au niveau du muscle squelettique (Chen, HC, et al.
2002). Par l'utilisation d'inhibiteurs et par l'expression d'une forme dominante négative des
aPKC, ce dernier groupe de chercheurs a démontré que le AICAR active le transport du
glucose et la translocation de GLUT4 par un mécanisme dépendant, entre autres, de
l'activation de la phospholipase D et des aPKC, mais indépendant de la PI-3 kinase, dans les
cellules musculaires L6 en culture.
Des études plus récentes proposent également un rôle pour la protéine kinase B ou Akt, et plus
particulièrement l'Akt 1 (Turinsky, J and Damrau-Abney, A 1999), dans l'effet de la
contraction musculaire sur le transport du glucose. En effet, il a été démontré que la
contraction musculaire in situ ou l'exercice augmentent de façon rapide et transitoire l'activité
de l'Akt et le transport du glucose dans les muscles EDL et soléaire et ce, indépendamment de
l'activation de la PI-3 kinase (Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002).
D'autre part, aucune activation de l'Akt n'a été notée lors de la contraction du muscle soléaire
22
in vitro (Lund, S, et al. 1998; Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002).
Cependant, plusieurs études sont en désaccord avec ces observations, ces divergences
semblant être attribuables aux types de contractions utilisées ainsi qu'au temps de stimulation
(Brozinick, JT, Jr. and Birnbaum, MJ 1998; Sherwood, DJ, et al. 1999; Widegren, U, et al.
1998; Wojtaszewski, JF, et al. 1999). Le rôle de cette kinase dans l'action de la contraction
musculaire sur le transport du glucose demeure donc encore controversé.
3.1.2.3 Rôle de l'hypoxie L'hypoxie constitue un autre facteur pouvant contribuer à l'effet stimulateur de la contraction
musculaire sur le transport du glucose. En effet, la disponibilité réduite de l'oxygène lors d'un
exercice intense peut conduire au recrutement de différentes voies de signalisation pour activer
le transport du glucose. Des études récentes révèlent un effet additif de l'hypoxie et de la
contraction dans le muscle perfusé (Derave, W and Hespel, P 1999), cet effet étant restreint
aux muscles enrichis en myofibres de type IIa (Fluckey, JD, et al. 1999). Cependant, certains
travaux contradictoires à cette conclusion ont démontré que l'hypoxie stimule le transport du
glucose de façon non additive à la contraction musculaire dans le muscle épitrochlearis isolé
(Cartee, GD, et al. 1991; Idstrom, JP, et al. 1986; Youn, JH, et al. 1994) ou dans des muscles
perfusés (Wojtaszewski, JF, et al. 1998). Par ailleurs, une étude récente démontre que la
kinase activée par l'AMP constitue le seul médiateur impliqué dans l'effet stimulateur de
l'hypoxie sur le transport du glucose, mais que l'activation de cette enzyme contribue
partiellement à l'effet de la contraction musculaire (Mu, J, et al. 2001). Par conséquent, ces
données suggèrent que la contraction musculaire utilise, du moins en partie, la même voie de
signalisation intracellulaire utilisée par l'hypoxie pour stimuler la captation du glucose, cette
voie étant dépendante de l'activation de l'AMPK.
3.1.2.4 Rôle de l'adénosine Dans la littérature, il a été décrit qu'en absence d'insuline, l'adénosine produite durant la
contraction musculaire pourrait contribuer, par un mécanisme autocrine ou en augmentant le
flot sanguin, à l'activation du transport du glucose observée dans le muscle squelettique. En
effet, l'adénosine formée dans le cytoplasme des cellules musculaires peut atteindre le milieu
23
interstitiel et possiblement exercer des effets locaux sur le transport du glucose en se liant à ses
récepteurs situés sur les cellules musculaires adjacentes (Stiles, GL 1992)_ Ainsi, il a été
observé que l'ajout d'adénosine augmente le transport du glucose durant la contraction du
muscle cardiaque et ce, en absence d'insuline (Angello, DA, et al. 1993; Wyatt, DA, et al.
1989). De plus, une étude démontre qu'en bloquant l'action de l'adénosine, on observe une
inhibition du transport du glucose stimulé par la contraction musculaire dans les muscles
épitrochlearis et soléaire isolés et ce, en absence et en présence d'insuline (Han, DH, et al.
1998). Une étude chez l'humain rapporte également que l'administration d'un antagoniste non-
spécifique du récepteur de l'adénosine, la théophylline, réduit le taux de disparition
plasmatique du glucose durant l'exercice (Raguso, CA, et al. 1996). De plus, il a été suggéré
que l'adénosine active le transport du glucose dépendant des protéines G, ou en modulant
l'activité intrinsèque des transporteurs de glucose à la membrane plasmique (Kuroda, M, et al.
1987). Toutefois, quelques travaux révèlent une absence d'inhibition du transport du glucose
musculaire en présence d'antagonistes des récepteurs de l'adénosine durant la contraction in
situ, cet effet inhibiteur étant uniquement observable qu'en présence d'insuline et au niveau des
muscles oxydatifs à contraction lente (Derave, W and Hespel, P 1999; Vergauwen, L, et al.
1994). Ceci suggère donc que l'adénosine exercerait plutôt un effet synergique dans l'action de
l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport du glucose. De façon générale, ces
observations suggèrent donc un rôle potentiel mais encore controversé de l'adénosine dans le
transport du glucose stimulé par la contraction musculaire en absence et en présence
d'insuline.
3.1.2.5 Rôle des MAP kinases Les protéines MAPK (mitogen-activated protein kinase) sont des enzymes qui ont été
proposées comme étant impliquées dans les mécanismes adaptatifs de plusieurs types
cellulaires en réponse aux stress, comme ceux qui surviennent dans le muscle squelettique
durant l'exercice (Kyriakis, JM, et al. 1994; Leppa, S, et al. 1998; Pages, G, et al. 1993). Cette
famille d'enzymes est impliquée dans trois principales voies de signalisation : la voie ERK1/2
(extracellular signal-regulated kinases), la voie p38 MAPK et la voie JNK (c-jun NH2 terminal
kinases). Des études chez les rongeurs et l'humain proposent que l'activation de ces molécules
durant l'exercice participe à la régulation de la prolifération et de la différenciation cellulaire
24
en activant certaines protéines kinases ou facteurs de transcription (Boppart, MD, et al. 2000;
Widegren, U, et al. 1998). En effet, les résultats de plusieurs travaux indiquent que l'exercice
et la contraction musculaire de muscles isolés stimulent l'activation de EKR1/2, de la p38
MAPK et des JNK (Aronson, D, et al. 1997; Goodyear, LJ, et al. 1996; Widegren, U, et al.
1998). De plus, certains travaux démontrent que l'activation des MAPK durant l'exercice est
directement associée à l'activité contractile, excluant donc la contribution de certains facteurs
systémiques ou humoraux (Boppart, MD, et al. 2001; Hayashi, T, et al. 1999). Bien que
certaines évidences suggèrent un rôle de la p38 MAPK dans l'activation du transporteur
GLUT4 par la contraction musculaire (Voir section 3.3), les MAPK ERK1/2 et les JNK ne
semblent pas impliquées dans la stimulation du transport du glucose. En effet, le traitement du
muscle soléaire isolé avec un inhibiteur des MAPK, le PD-98059, n'a induit aucune
diminution du transport du glucose stimulé par la contraction musculaire in vitro (Hayashi, T,
et al. 1999) ou dans des muscles perfusés (Wojtaszewski, JF, et al. 1999). Conjointement, ces
résultats indiquent que les MAP kinases ERK1/2 et JNK ne sont pas impliquées dans l'effet
stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose mais interviennent plutôt
dans la régulation des mécanismes adaptatifs à l'exercice, notamment sur la transcription de
certains gènes.
3.2 AMPK : un nouveau médiateur de l'effet de la contraction sur le transport du glucose
3.2.1 Rôles de l'AMPK L'AMPK ou kinase activée par l'AMP est une enzyme qui fut proposée comme étant un
médiateur clé dans les processus regénérateurs des niveaux d'ATP au niveau de plusieurs types
cellulaires. En fait, il a été démontré que la réduction du contenu intracellulaire en ATP induit
une activation de l'AMPK, ce qui a pour effet de recruter certaines voies métaboliques de
signalisation contribuant à la régénération de l'ATP. Ainsi, il a été clairement démontré que
l'AMPK active l'oxydation des acides gras dans le muscle squelettique en inhibant l'activité de
l'acétyl-CoA carboxylase et la formation de malonyl-CoA, ce qui favorise l'entrée des acides
gras à longue chaîne dans la mitochondrie (Ruderman, NB, et al. 1999; Winder, WW 2001).
25
D'autre part, il a été rapporté que l'AMPK est activée par certains événements cellulaires
pouvant causer un stress métabolique tels que le choc osmotique et thermique, l'ischémie,
l'hypoxie ainsi que la contraction musculaire (Goodyear, LJ 2000; Hayashi, T, et al. 1998). À
ce jour, plusieurs études ont donc suggéré que cette kinase pourrait être impliquée dans l'effet
stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose au niveau du muscle
squelettique afin de fournir un supplément d'ATP à la cellule musculaire en activité.
3.2.2 Structure générale L'AMPK de mammifères a été purifiée chez plusieurs espèces incluant l'humain, le rat et le
porc. Elle fut en tout premier lieu caractérisée et analysée chez les levures Saccharomyces
cerevisiae. En fait, il a été rapporté que la séquence en acides aminés de la sous-unité
catalytique hépatique de l'AMPK chez le rat s'apparentait grandement à celle de la kinase
SNF-1 retrouvée chez ces moisissures (Carling, D, et al. 1994). De plus, l'AMPK a été
fonctionnellement associée à la kinase SNF-1 puisqu'il a été démontré que les deux kinases
pouvaient phosphoryler le même type de substrats comme par exemple l'acétyl-CoA
carboxylase et la HMG-CoA réductase, et aussi être phosphorylées in vitro par le même type
de kinases telles que l'AMPK kinase (AMPKK) (Hardie, DG, et al. 1998). Chez les
mammifères, l'AMPK a ensuite été caractérisée comme un hétérotrimère composé d'une sous-
unité catalytique alpha (α), subdivisée en deux isoformes α1 et α2 ainsi que de deux sous-
unités régulatrices, bêta et gamma (β et γ), subdivisée en isoformes β1 et β2 et en γ1, γ2 et γ3
(Beri, RK, et al. 1994; Cheung, PC, et al. 2000; Hardie, DG, et al. 1998). La sous-unité
catalytique contient le domaine kinase, le site de phosphorylation de l'AMPK sur le résidu
thréonine 172 et le site de liaison de l'AMP. De plus, il fut démontré que les isoformes α2 et
γ2 seraient davantage sensibles à l'activation par l'AMP comparativement aux autres isoformes
(Cheung, PC, et al. 2000; Salt, I, et al. 1998; Wojtaszewski, J, et al. 2000). À ce jour,
seulement deux sous-unités régulatrices de l'AMPK ont été identifiées et il semble que leur
interaction avec la sous-unité catalytique soit essentielle pour conférer une activité optimale à
l'enzyme (Cheung, PC, et al. 2000) (Dyck, JR, et al. 1996) (Woods, A, et al. 1996).
26
3.2.3 Distribution tissulaire Chez le rat, l'analyse par immunobuvardage de lysats tissulaires semble indiquer que la
distribution de l'AMPK est ubiquitaire puisqu'elle est exprimée au niveau du cerveau, du
pancréas, des reins, des poumons, des testicules, du foie et dans le muscle squelettique et
cardiaque (Woods, A, et al. 1996). Par contre, le contenu relatif des différentes sous-unités et
de leurs isoformes varie selon les tissus analysés. Par exemple, l'expression des sous-unités
α1, β1 et γ1 et γ2 est ubiquitaire, les sous-unités α2 et β2 se retrouvant principalement au
niveau du muscle squelettique et cardiaque et au niveau du foie, alors que la sous-unité γ3
serait restreinte au muscle squelettique (Cheung, PC, et al. 2000; Stapleton, D, et al. 1996).
Des travaux récents concernant la sous-unité γ3 ont indiqué que seule l'expression de cet
isoforme est augmentée par l'entraînement physique et ce, uniquement au niveau du muscle
quadriceps rouge et non au niveau du quadriceps blanc et du muscle soléaire (Durante, PE, et
al. 2002). En effet, cette étude révèle que l'expression des autres isoformes de la sous-unité γ
ainsi que les isoformes des sous-unités α et β n'est pas significativement altérée par
l'entraînement physique. De plus, la mutation spécifique du gène PRKAG3 codant pour la
sous-unité γ3 de l'AMPK entraîne une diminution de l'activité de l'AMPK et une augmentation
du contenu en glycogène musculaire chez le porc Hampshire (Milan, D, et al. 2000). Il a été
suggéré que cette mutation activerait en premier lieu l'AMPK, ce qui produirait une
augmentation du transport du glucose et de la synthèse de glycogène et que l'inhibition
subséquente de l'activité de l'AMPK serait secondaire à un mécanisme de régulation négative
dû à la synthèse accrue de glycogène (Derave, W, et al. 2000; Hamilton, SR, et al. 2001).
Considérant les résultats de ces deux dernières études, il a donc été suggéré que la sous-unité
γ3 serait impliquée dans l'augmentation du contenu en glycogène musculaire dans les
myofibres oxydatives observée suite à l’entraînement physique. Par ailleurs, l'analyse par
immunobuvardage a révélé que le muscle épitrochlearis de rat était davantage enrichi en sous-
unité α1 et α2 que le muscle soléaire, celui-ci présentant un contenu en α2 supérieur à l'α1
(Ai, H, et al. 2002). De plus, seule l'association de la sous-unité β1 à la sous-unité α2 est
observée dans le muscle soléaire alors que dans le muscle EDL, la sous-unité α2 est associée à
la sous-unité β1 et β2 (Chen, Z, et al. 1999; Durante, PE, et al. 2002). Dans le muscle soléaire,
27
la sous-unité γ1 est prédominante comparativement aux autres sous-unités γ (Durante, PE, et
al. 2002).
3.2.4 Localisation cellulaire Au niveau des cellules pancréatiques INS-1, la sous-unité α1 serait localisée au niveau du
cytosol alors que la sous-unité α2 serait à la fois d'origine nucléaire et cytosolique (Salt, IP, et
al. 1998). La localisation spécifique de ces isoformes a également été confirmée au niveau du
muscle squelettique de rat (Ai, H, et al. 2002). Les divergences de ces deux sous-unités au
niveau de leur activité, distribution tissulaire, localisation cellulaire et types de substrats
impliquent qu'à un certain niveau, elles possèdent des fonctions distinctes (Woods, A, et al.
1996). Ainsi, il a été démontré que seule la sous-unité α2 de l'AMPK serait activée par
l'exercice d'intensité moyenne (Fujii, N, et al. 2000; Musi, N, et al. 2001; Musi, N, et al. 2001;
Vavvas, D, et al. 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2000). La localisation nucléaire de la sous-unité
α2 soulève donc la possibilité que l'AMPK pourrait être impliquée dans la régulation
transcriptionnelle de certains gènes durant l'exercice (MacLean, PS, et al. 2002). À ce propos,
quelques études ont indiqué que l'activation chronique de l'AMPK chez le rat contribue à
augmenter l'expression musculaire de certaines protéines impliquées dans le métabolisme du
glucose comme GLUT4 et l'hexokinase (Buhl, ES, et al. 2001; Holmes, BF, et al. 1999;
Ojuka, EO, et al. 2000).
3.2.5 Mécanismes d'activation De façon générale, le modèle d'activation de l'AMPK proposé implique que l'AMPKα serait
spécifiquement phosphorylée sur un résidu thréonine (Thr 172) par l'AMPKK (Hawley, SA, et
al. 1996) ou activée par l'AMP et la créatine selon différents mécanismes. Ceux-ci incluent
une activation allostérique directe de l'AMPK par l'AMP et la créatine. À l'inverse, l'activité de
l'AMPK est inhibée par la créatine-phosphate et l'ATP. De plus, la liaison de l'AMP à la sous-
unité alpha induirait une amplification de la phosphorylation de l'AMPK par l'AMPKK et une
diminution de l'affinité des phosphatases, notamment les PP2C et PP2A qui déphosphorylent
l'AMPK (Ruderman, NB, et al. 1999; Winder, WW 2001). Cependant, il semble que
28
l'association des sous-unités en un complexe trimérique constitue une étape préalable à
l'activation de l'AMPKα. Les modèles d'activation suggérés (Voir figure 5) impliquent qu'en
absence d'AMP, ce complexe existe dans une conformation inactive où les sous-unités α et γ
n'interagissent pas. Dans ces conditions, le site actif du domaine kinase (sous-unité α)
contenant le site de phosphorylation de l'AMPK sur le résidu thréonine est masqué par un
domaine autoinhibiteur, ce qui bloque l'accessibilité du résidu thréonine et donc la
phophorylation de l'AMPK par l'AMPKK. Dans la conformation active, l'AMP permet
l'interaction du domaine autoinhibiteur avec la sous-unité γ, ce qui démasque le site de
phosphorylation sur la sous-unité α. Plus spécifiquement, il a été proposé que la sous-unité β
pourrait induire un changement conformationnel de la sous-unité α, ce qui favoriserait ensuite
son interaction avec la sous-unité γ via l'AMP, permettant ainsi l'activation de la sous-unité α
et l'assemblage adéquat et stable du complexe (Cheung, PC, et al. 2000; Winder, WW 2001;
Woods, A, et al. 1996).
FIGURE 5 : Modèle de l'association des différentes sous-unités de la kinase activée par l'AMP en absence et en présence d'AMP. A: conformation inactive, B : conformation active. (Schéma adapté de Winder et al. 2001).
29
3.2.6 AMPK et contraction musculaire Lors de la contraction musculaire, l'augmentation accrue des besoins en énergie du muscle
favorise l'utilisation de substrats énergétiques riches en phosphate tels que l'ATP et la créatine
phosphate. À mesure que le muscle contracte, les ratios AMP/ATP ainsi que créatine/créatine
phosphate augmentent. Il a donc été proposé que la modification de l'équilibre de ces ratio
pourrait contribuer à activer l'AMPK et le transport du glucose durant la contraction
musculaire (Goodyear, LJ 2000; Winder, WW 2001; Winder, WW and Hardie, DG 1999). De
plus, il semble que l'équilibre de ces ratios varie en fonction de l'intensité et de la durée du
travail musculaire. Ainsi, il a été observé chez les rongeurs et l'humain que le transport du
glucose ainsi que l'activation de l'AMPK sont positivement corrélés à l'intensité de l'exercice
(Rasmussen, BB and Winder, WW 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2000) ainsi qu'à la force et à
la fréquence des contractions (Ihlemann, J, et al. 1999; Ihlemann, J, et al. 2000). L'exercice à
haute intensité chez l'humain et la contraction in situ chez le rat ont révélé une augmentation
sélective de l'activité de la sous-unité α2 de l'AMPK et non de la sous-unité α1 (Fujii, N, et al.
2000; Musi, N, et al. 2001; Musi, N, et al. 2001; Stephens, TJ, et al. 2002; Vavvas, D, et al.
1997; Wojtaszewski, J, et al. 2000). Lors de l'exercice à faible intensité, aucun changement de
l'activité de ces deux isoformes n'a été rapporté (Fujii, N, et al. 2000; Wojtaszewski, J, et al.
2000). De plus, des travaux ont indiqué que la contraction du muscle épitrochlearis isolé
produisait une augmentation de l'activité des sous-unités α1 et α2 de l'AMPK chez les rats
normaux alors que chez les rats insulino-résistants Zucker, seul l'AMPKα2 était activée par la
contraction (Barnes, BR, et al. 2002). Dans cette étude, la contraction stimulait le transport du
glucose de façon normale chez les rats insulino-résistants malgré l'absence d'activation de
l'AMPKα1 ce qui suggère que cette sous-unité ne joue pas un rôle essentiel dans le transport
du glucose stimulé par la contraction. Chez l'humain, deux études ont par contre démontré une
activation simultanée des deux isoformes durant un effort musculaire intense de courte durée
(Chen, Z, et al. 2000; Hayashi, T, et al. 2000). Par ailleurs, d'autres travaux ont révélé une
activation significative conjointe des sous-unités α1 et α2 dans le muscle épitrochlearis isolé
en réponse à la contraction induite par stimulation électrique (Ai, H, et al. 2002; Fryer, L, et al.
2000; Hayashi, T, et al. 2000; Musi, N, et al. 2001). Il est cependant important de considérer
que ces mesures d'activation sont effectuées in vitro et ne sont donc pas représentatives des
30
mécanismes d'activation allostérique de l'AMPK. L'ensemble de ces évidences suggèrent donc
que l'amplitude et la durée de la contraction déterminent le niveau d'activité des différents
isoformes de l'AMPK, celui-ci étant dépendant des niveaux d'AMP, d'ATP, de créatine
phosphate, mais aussi du contenu en glycogène. Un des mécanismes proposés veut que durant
les premières minutes de contraction, l'activité de l'AMPK soit régulée allostériquement par le
contenu en AMP, ATP et CP et que sa régulation subséquente soit dépendante du contenu en
glycogène (Stephens, TJ, et al. 2002).
L'implication de l'AMPK dans la stimulation du transport du glucose induite par la contraction
musculaire a été rigoureusement confirmée par une étude utilisant des souris transgéniques
exprimant une forme dominante négative de la sous-unité α-2 de l'AMPK au niveau du muscle
squelettique et cardiaque (Mu, J, et al. 2001). Chez ces souris, l'effet de la contraction
musculaire in vivo et in vitro sur la captation du glucose est réduit de moitié dans les muscles
EDL et soléaire (in vivo). De plus, l'inhibition du transport du glucose dans le muscle EDL
contracté in situ s'est vue attribuable à une diminution de la translocation de GLUT4 à la
surface cellulaire. Cette importante étude démontre d'une part que l'AMPK est impliquée dans
la cascade intracellulaire par laquelle la contraction musculaire active la captation du glucose,
mais également qu'une autre voie de signalisation, indépendante de l'AMPK, contribue à cet
effet.
3.2.7 AICAR : un activateur de l'AMPK Le 5'aminoimidazole-4-carboxamide 1 β-D-ribofuranoside, mieux connu sous le nom de
AICAR, est un analogue de l'adénosine qui a été proposé comme agent mimétique de la
contraction musculaire sur le transport du glucose au niveau du muscle squelettique. Le
AICAR est transporté à l'intérieur de la cellule par des transporteurs de nucléosides où il est
transformé dans le cytoplasme en ZMP par l'adénosine kinase. Le ZMP est un analogue de
l'AMP qui mime les effets de l'AMP en amplifiant la phosphorylation de l'AMPK par
l'AMPKK (Corton, JM, et al. 1995) et en activant allostériquement l'AMPK (Corton, JM, et al.
1995; Henin, N, et al. 1996).
31
Plusieurs études ont révélé que le AICAR, tout comme la contraction musculaire, produisait
une augmentation de l'activité de l'AMPK et du transport du glucose (Bergeron, R, et al.
1999), parallèlement à une stimulation de la translocation de GLUT4 au niveau du muscle
squelettique (Hayashi, T, et al. 1998; Kurth-Kraczek, EJ, et al. 1999) et cardiaque (Russell,
RR, 3rd, et al. 1999). Contrairement à l'insuline, ces travaux ont rapporté que la contraction
musculaire et le AICAR n'avaient pas d'effets additifs sur le transport du glucose dans le
muscle squelettique. De plus, leurs effets sont insensibles à la wortmannine, un inhibiteur de la
PI-3 kinase. Ces données suggèrent donc que ces deux stimuli utilisent une même voie de
signalisation intracellulaire, indépendante de la PI-3 kinase, pour stimuler le transport du
glucose. De plus, l'effet du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle EDL est
complètement inhibé chez des souris transgéniques exprimant la forme dominante négative de
l'AMPK α-2 dans le muscle, suggérant ainsi que le transport musculaire du glucose stimulé
par le AICAR est dépendant de l'activation de l'AMPK (Mu, J, et al. 2001).
De nombreux travaux ont démontré que le AICAR stimulait l'activité de l'AMPK et le
transport du glucose au niveau des muscles de rongeurs (Aschenbach, WG, et al. 2002;
Bergeron, R, et al. 1999; Wojtaszewski, J, et al. 2002). De plus, certaines données suggèrent
que ces effets pourraient varier selon le type de fibres musculaires étudié et selon l’utilisation
de modèles in vivo ou in vitro. Des études in vitro chez le rat ont démontré que le AICAR
induit une augmentation sélective du transport du glucose et de l'activité de l'AMPK au niveau
des myofibres glycolytiques de type II, comme l'épitrochlearis (Bergeron, R, et al. 1999;
Hajduch, E, et al. 1998; Hayashi, T, et al. 1998; Musi, N, et al. 2001) et non au niveau du
muscle soléaire enrichi en fibres oxydatives de type 1 (Ai, H, et al. 2002; Mu, J, et al. 2001;
Musi, N, et al. 2001). Néanmoins, des études semblent contradictoires à cette observation
(Fryer, L, et al. 2000; Sakoda, H, et al. 2002). Des études chez la souris ont toutefois démontré
un effet du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle soléaire (Balon, T and Jasman,
A 2001). Contrairement au rat, le muscle soléaire de souris est plus enrichi en fibres
glycolytiques de type II. De façon générale, ces observations proposent donc que les fibres
musculaires de type II sont davantage sensibles à l'effet du AICAR que les myofibres de type
I. Par ailleurs, l'absence d'activation de l'AMPK par le AICAR dans le muscle soléaire isolé
peut possiblement être attribuable à une sensibilité accrue du muscle soléaire au glycogène
comparativement au muscle EDL puisqu'il a été démontré que la contraction musculaire induit
32
une augmentation de l'activité de l'AMPK seulement dans le muscle soléaire pauvre en
glycogène (Derave, W, et al. 2000).
Contrairement aux études in vitro, il a été établi que l'infusion ou l'injection de AICAR chez
les rongeurs provoque une augmentation de la captation du glucose et de l'activité de l'AMPK
tant au niveau des muscles enrichis en fibres de type II qu'au niveau des myofibres de type I
(Bergeron, R, et al. 1999; Paulsen, SR, et al. 2001), l'activité de l'AMPK étant plus élevée au
niveau des myofibres de type II (Wojtaszewski, J, et al. 2002).
FIGURE 6 :Mécanismes d'activation de l'AMPK par la contraction musculaire et par le AICAR.
33
3.2.7.1 Spécificité d'action du AICAR Au niveau cellulaire, le AICAR est transformé en ZMP dans le cytoplasme de la cellule par
l'adénosine kinase. Puisque la dégradation du AICAR peut générer différents métabolites
comme le ZDP, le ZMP et le ZTP, et que le ZTP peut-être lui-même métabolisé en AMP,
plusieurs groupes se sont intéressés à déterminer la spécificité du ZMP associée à l'activation
de l'AMPK. Ainsi, il a été démontré que le ZMP pouvait mimer les effets de l'AMP
indépendamment de celui-ci en activant directement l'AMPK purifiée de façon allostérique en
plus de causer une réactivation de l'AMPK déphosphorylée (Corton, JM, et al. 1995; Weekes,
J, et al. 1993). D'autres travaux démontrent aussi que le degré d'activation de l'AMPK
hépatique induit par le ZMP est comparable mais non additif à celui de l'AMP dans des
conditions saturables, ce qui suggère que le ZMP et l'AMP partage__ le même site de liaison
sur l'AMPK (Henin, N, et al. 1996). De plus, on a observé que la concentration intracellulaire
de ZMP suite au traitement avec AICAR était 50 fois supérieure à celle de l'AMP dans le
muscle isolé, proposant un rôle prédominant du ZMP dans l'activation de l'AMPK dans ces
conditions (Ai, H, et al. 2002). Parallèlement, les résultats de certains travaux montrent que le
AICAR ne perturbe pas de façon importante le contenu en ATP, AMP, ADP, ZDP et ZTP
dans les hépatocytes en culture (Corton, JM, et al. 1995) et suite au traitement in vivo avec le
AICAR au niveau du muscle squelettique de rat (Bergeron, R, et al. 1999; Holmes, BF, et al.
1999; Merrill, GF, et al. 1997; Wojtaszewski, J, et al. 2002). Ces observations suggèrent donc
que l'activation de l'AMPK par le AICAR est spécifiquement régulée par le ZMP et ne peut
être tributaire de la variation dans les concentrations de nucléotides.
D'autre part, certains auteurs ont soulevé l'hypothèse que le ZMP pourrait activer d'autres
enzymes régulées par l'AMP et ainsi induire des effets non spécifiquement reliés à l'activation
de l'AMPK et à son rôle dans le transport du glucose. Ainsi, il a été démontré que le ZMP
augmente l'activité de l'enzyme glycogène phosphorylase dans le muscle et dans le foie
(Young, ME, et al. 1996) et inhibe la fructose 1-6 biphosphatase hépatique, menant
respectivement à une activation de la glycogénolyse et une inhibition de la néoglucogénèse
hépatique (Vincent, MF, et al. 1991). Cependant, une étude récente réalisée dans le muscle
squelettique s'oppose à la contribution non-spécifique du ZMP, via l'activation de la glycogène
phosphorylase, dans l'effet stimulateur du AICAR sur le transport du glucose in vivo
34
(Aschenbach, WG, et al. 2002). En effet, il a été observé que le traitement in vitro avec le
AICAR induisait une augmentation du transport du glucose et de la production de lactate mais
aucune activation de la glycogène phosphorylase. Bien que l'activité de cette enzyme soit
augmentée in vivo, ceci suggère donc que le transport du glucose et la relâche de lactate
stimulés par le AICAR sont davantage expliqués par l'entrée de glucose qui est ensuite
métabolisé par la glycolyse que par une augmentation de la glycogénolyse pouvant être causée
par le ZMP via un effet sur la glycogène phosphorylase. Ceci supporte donc l'idée que le
transport du glucose stimulé par le AICAR est peu influencé par les effets non-spécifiques du
ZMP.
Puisque le AICAR est un composé analogue de l'adénosine et que l'AMP peut être convertie
en adénosine, il a été suggéré que ce nucléotide pourrait réguler l'augmentation du transport du
glucose stimulé par le AICAR. En effet, certaines études ont démontré que l'augmentation de
la production d'adénosine durant la contraction musculaire pourrait potentialiser la stimulation
du transport du glucose induite par ce stimulus (Han, DH, et al. 1998). Cependant, des
résultats récents montrent qu'un antagoniste du récepteur de l'adénosine, la théophylline, ne
provoque aucune diminution du transport du glucose activé par le AICAR (Bergeron, R, et al.
1999). De plus, puisque les niveaux d'AMP ne semblent pas varier suite à l'infusion de
AICAR, il apparaît improbable que la concentration d'adénosine augmente (Merrill, DC, et al.
1999). Ces évidences suggèrent donc que l'adénosine ne contribue pas de façon importante à
l'augmentation du transport du glucose stimulé par le AICAR.
3.2.8 Modulation de l'activité de l'AMPK par le glycogène Des études récentes ont indiqué que le contenu en glycogène musculaire, et donc le statut
nutritionnel, pouvait réguler le transport du glucose et l'activité de l'AMPK en réponse à la
contraction musculaire. Dans une première étude, des rats ayant un contenu en glycogène
musculaire faible et élevé ont permis de démontrer qu'au niveau des fibres glycolytiques de
type II, la contraction activait le transport du glucose et l'AMPK de façon plus importante chez
les rongeurs dont le contenu en glycogène musculaire était faible comparativement au groupe
dont le contenu était élevé (Derave, W, et al. 2000). Au niveau des fibres oxydatives de type I,
la contraction a induit une augmentation de la captation du glucose et de l'activité de l'AMPK
35
seulement dans les muscles pauvres en glycogène. Toutefois, la contraction a induit une
augmentation du transport du glucose dans le muscle soléaire enrichi en glycogène sans
aucune activation de l'AMPK. Ce rôle régulateur du glycogène sur l'activité de l'AMPK a
d'ailleurs été supporté par des travaux démontrant que la contraction in vitro stimule davantage
l'activité de l'AMPK dans divers types de muscles de rats à jeun comparativement aux rats
nourris (Ai, H, et al. 2002). De plus, on a observé une atténuation de l'activation de l'AMPK
dans le muscle épitrochlearis isolé enrichi en glycogène (Kawanaka, K, et al. 2000). Ces
données ont été confirmées chez l'humain par une étude indiquant que l'abondance de
glycogène musculaire prévient l'augmentation de l'activité de l'AMPK durant un exercice
intense (Stephens, TJ, et al. 2002). De plus, l'augmentation du transport du glucose observée
en absence d'activation de l'AMPK au niveau des myofibres oxydatives de type I enrichies en
glycogène suggère que l'AMPK n'est pas essentielle à la stimulation du transport du glucose
par la contraction et qu'une voie indépendante de l'activation de l'AMPK contribue à
l'augmentation du transport du glucose dans ce type de muscle. Une étude utilisant des souris
transgéniques exprimant une forme dominante négative de l'AMPK α-2 supporte cette
dernière conclusion puisque chez ces souris, l'effet de la contraction musculaire in vivo et in
vitro sur le transport est seulement réduit de moitié dans les muscles EDL et soléaire (in vivo)
(Mu, J, et al. 2001).
Tout comme pour la contraction musculaire, la quantité de glycogène musculaire semble
dicter l'activation de l'AMPK suite au traitement par le AICAR in vivo. En effet, des résultats
démontrent qu'une quantité élevée de glycogène diminue le transport du glucose et l'activation
de l'AMPK α2 au niveau des fibres de type II et de type I chez les rats perfusés in situ au
AICAR (Wojtaszewski, J, et al. 2002). L'ensemble de ces travaux suggèrent donc que le
glycogène musculaire module l'activation de l'AMPK et le transport du glucose stimulé par la
contraction musculaire ou le AICAR, mais les mécanismes régulant ces effets demeurent
toutefois obscurs.
36
3.3 Activation de GLUT4
3.3.1 Rôle de l'insuline La serine/thréonine protéine kinase p38 MAPK, appartenant à une famille d'enzymes appelées
MAP kinases (MAPK), figure parmi les médiateurs proposés pour stimuler l'activité
intrinsèque des transporteurs de glucose en réponse à la contraction musculaire ou à l'insuline.
La p38 MAPK de mammifères possède 4 isoformes, α, β, γ, λ, et requiert une phosphorylation
simultanée de ses résidus thréonine et tyrosine pour être activée (Widmann, C, et al. 1999). Le
rôle de cette kinase dans le transport du glucose a tout d'abord été mis en évidence par
plusieurs groupes utilisant l'insuline comme agent activateur. En effet, on a observé une
réduction du transport du glucose stimulé par l'insuline en présence d'un inhibiteur spécifique
de la p38 MAPK α et β, le SB203580, mais aucune diminution parallèle de la translocation de
GLUT1 dans les adipocytes 3T3-L1 (Sweeney, G, et al. 1999) ou de la translocation de
GLUT4myc dans les cellules musculaires L6 en culture (Konrad, D, et al. 2001; Sweeney, G,
et al. 1999). De plus, il a été observé que le SB203580 ne se liait pas aux GLUT et n'induisait
aucune diminution de l'activité des différentes molécules impliquées dans la voie de
signalisation insulinique (Sweeney, G, et al. 1999), suggérant un effet inhibiteur spécifique à
la p38 MAPK. Au niveau des cellules musculaires, une autre étude révèle que la translocation
de GLUT4 activée par l'insuline précède son activation, suggérant l'existence de deux
mécanismes distincts dans la régulation du transport du glucose (Somwar, R, et al. 2001).
Cette hypothèse est confirmée par une étude récente qui révèle qu'en traitant des cellules
musculaires L6 avec une concentration élevée d'insuline et de glucose, on observe une
augmentation du transport du glucose basal mais pas de translocation de GLUT4 (Huang, C, et
al. 2002). Dans cette même étude, on a observé une absence d'activation de GLUT1, une
augmentation de la phosphorylation et de l'activité de la p38 MAPK et une inhibition du
transport du glucose basal en présence d'un autre inhibiteur de la p38 MAPK, le SB202190, ce
qui suggère que la p38 MAPK contribue à l'augmentation du transport du glucose induite par
ces traitements via l'activation de GLUT4. L'importance d'une activation de GLUT4 dans
l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport du glucose est aussi supporté par l'observation
que le traitement de cellules musculaires et adipeuses avec une faible dose de wortmannine, un
37
inhibiteur de la PI-3 kinase, inhibait le transport du glucose et l'activité de la p38 MAPK α et
β en réponse à l'insuline. Cependant, la faible dose de wortmannine utilisée n'était pas
suffisante pour inhiber l'activité de la PI-3 kinase et la translocation de GLUT4 (Hausdorff,
SF, et al. 1999; Somwar, R, et al. 2001; Somwar, R, et al. 2001). Ces derniers résultats
suggèrent donc qu'un nouveau médiateur, hautement sensible à la wortmannine, mais distinct
de la PI-3 kinase, régule l'activation de la p38MAPK et de GLUT4 induite par l'insuline. De
plus, le traitement de cellules adipeuses avec un agent activateur de la p38MAPK,
l'anisomycine, révèle une activation de la p38MAPK et du transport du glucose (Barros, LF, et
al. 1997), ce qui appuie l'implication de cette kinase dans la stimulation du transport du
glucose. Toutefois, certaines études sont en désaccord avec les données précédentes. En effet,
on observe une absence d'inhibition du transport du glucose stimulé par l'insuline en présence
de SB203580 (Kayali, A, et al. 2000) ou par la surexpression d'une forme dominante négative
de la p38 MAPK (Fujishiro, M, et al. 2001) dans les adipocytes 3T3-L1 en culture. Cependant,
une étude très récente alimente la controverse puisqu'il a été démontré qu'une forme
dominante négative de la p38MAPK ainsi que deux nouveaux inhibiteurs de cette enzyme
inhibent le transport du glucose stimulé par l'insuline sans affecter la translocation de GLUT4
(Somwar, R, et al. 2002). De façon générale, plusieurs évidences suggèrent un rôle de la p38
MAPK dans la stimulation du transport du glucose en réponse à l'insuline via l'activition
intrinsèque de GLUT4.
3.3.2 Rôle de la contraction musculaire et du AICAR Peu d'études ont vérifié le rôle de la p38MAPK dans l'effet stimulateur de l'exercice ou de la
contraction musculaire sur la captation du glucose. Certains travaux ont démontré que
l'exercice et la contraction musculaire eccentrique stimulent l'activité de la p38 MAPK
(Goodyear, LJ, et al. 1996; Hayashi, T, et al. 1999; Widegren, U, et al. 1998; Wretman, C, et
al. 2001) et ce, indépendamment de la PKC (Ryder, JW, et al. 2000). Plus spécifiquement, il a
été démontré que la contraction musculaire et l'insuline induisaient l'activation des isoformes
α et β de la p38 MAPK et que l'effet individuel de ces deux stimuli sur le transport du glucose
était réduit par le SB203580 dans le muscle extensor digitorum longus (EDL) isolé (Somwar,
R, et al. 2000). De façon générale, l'ensemble de ces évidences proposent donc que la
38
p38MAPK contribue à l'augmentation du transport du glucose stimulé par la contraction
musculaire via l'activation des transporteurs de glucose GLUT4.
Par ailleurs, certains travaux ont suggéré un rôle de la p38 MAPK dans la stimulation du
transport du glucose induite par le AICAR. Dans les cellules Clone-9 n'exprimant que
l'isoforme GLUT1, on a observé que la stimulation du transport du glucose par le AICAR est
associée à une augmentation de l'activité intrinsèque de GLUT1, aucun changement dans le
contenu en GLUT1 à la membrane plasmique n'ayant été observé (Abbud, W, et al. 2000).
Dans ce type de cellules, on a de plus constaté que le AICAR activait la p38 MAPK et que le
transport du glucose stimulé par le AICAR était inhibé par le SB203580 ou par la
surexpression d'une forme dominante négative de la p38 MAPK (Xi, X, et al. 2001). Cette
étude révèle également que la surexpression d'une forme constitutionnellement active de
l'AMPK amène une activation de la p38MAPK, l'activation de l'AMPK n'étant toutefois pas
affectée par le SB203580. Au niveau des cellules musculaires L6, on a par contre observé une
absence d'inhibition du transport du glucose stimulé par le AICAR en présence de SB203580
(Chen, HC, et al. 2002). Ces évidences témoignent donc de la controverse entourant le rôle de
la p38 MAPK dans l'augmentation du transport du glucose induite par le AICAR via
l'activation des transporteurs de glucose.
39
FIGURE 7 : Molécules de signalisation intracellulaire possiblement impliquées dans la stimulation du transport du glucose par la contraction musculaire dans le muscle squelettique. (Schéma adapté de Hayashi et al. 1997).
40
4 Effet combiné de l'insuline et de la contraction musculaire sur le métabolisme du glucose
4.1 Mécanismes additifs sur le transport du glucose Plusieurs travaux ont évoqué que l'insuline et la contraction musculaire stimulaient de façon
additive le transport du glucose au niveau du muscle squelettique (Nesher, R, et al. 1985;
Ploug, T, et al. 1987), suggérant l'implication de différentes voies de signalisation
intracellulaires dans l'effet activateur de ces deux stimuli sur le métabolisme du glucose.
D'autres évidences supportant cette hypothèse reposent d'une part sur le fait que la PI-3 kinase
n'est pas impliquée dans l'effet activateur de la contraction musculaire sur le transport
musculaire de glucose. Il a été également démontré que la contraction musculaire stimule
normalement la captation du glucose chez les modèles animaux de résistance à l'insuline et
chez les sujets humains insulino-résistants. L'existence d'un effet additif de l'insuline et de la
contraction musculaire sur le transport musculaire de glucose est également supportée par
l'observation que ces deux stimuli induisent une translocation additive de GLUT4, celui-ci
étant possiblement recruté à partir de populations de vésicules distinctes sensibles à l'insuline
ou à la contraction musculaire. Ces différentes évidences sont discutées dans les sections
suivantes.
4.1.1 Implication des molécules de signalisation insulinique dans les effets de la contraction musculaire
Chez le rat, il a été rapporté que durant l'exercice aigu sur tapis roulant et lors de la contraction
musculaire stimulée in situ et in vitro, on observait aucun changement de la phosphorylation
de IR, des protéines IRS-1/2, de l'activité de la PI-3 kinase associée à IRS-1/2 ou de l'activité
de l'Akt/PKB (Goodyear, LJ, et al. 1995; Howlett, KF, et al. 2002; Wojtaszewski, JF, et al.
1999; Zhou, Q and Dohm, GL 1997). Cependant, certaines évidences suggèrent que
l'Akt/PKB est activée par la contraction musculaire mais indépendamment de l'activation de la
PI-3 kinase (Nader, GA and Esser, KA 2001; Sakamoto, K, et al. 2002), suggérant une
convergence de la voie de signalisation insulinique et de celle activée par la contraction
41
musculaire en aval de la PI-3 kinase. De plus, certains travaux indiquent que la wortmannine
n'inhibe pas le transport du glucose stimulé par la contraction musculaire in vitro (Lee, AD, et
al. 1995; Lund, S, et al. 1995; Yeh, JI, et al. 1995), bien qu'une étude rapporte le contraire avec
la contraction musculaire stimulée in situ (Wojtaszewski, JF, et al. 1996). Cependant, étant
donné que la wortmannine est un inhibiteur de la PI-3 kinase moins sélectif que le LY294002
(Hausdorff, SF, et al. 1999; Somwar, R, et al. 2001; Somwar, R, et al. 2001), les conclusions
de cette dernière étude demeurent donc discutables.
Les mécanismes intracellulaires par lesquels l'insuline et la contraction musculaire exercent
leur effet additif sur le transport du glucose demeurent à ce jour mal définis. En effet, il a été
suggéré que l'augmentation du flot sanguin durant l'exercice contribuerait à augmenter
maximalement le transport du glucose, entre autres, en augmentant la quantité d'insuline
interagissant avec le muscle et ce, même si l'exercice induit une diminution de la sécrétion
d'insuline (Vranic, M, et al. 1976; Wasserman, DH, et al. 1992). Suivant cette optique, il
devient alors concevable qu'on observe une augmentation de l'activité des molécules de
signalisation insulinique durant l'exercice. Il semble toutefois que ce ne soit pas le cas puisque
plusieurs travaux démontrent que l'exercice n'induit aucune augmentation de l'activité de ces
molécules (Goodyear, LJ, et al. 1995; Howlett, KF, et al. 2002; Wojtaszewski, JF, et al. 1999;
Zhou, Q and Dohm, GL 1997). In vitro, les résultats sont encore plus surprenants puisque la
contraction musculaire inhibe l'activité de IR et de la PI-3 kinase associée à IRS-1/2 stimulée
par l'insuline (Goodyear, LJ, et al. 1995; Whitehead, JP, et al. 2000) alors que le transport du
glucose et la phosphorylation de l'Akt/PKB stimulés par l'insuline ne sont pas altérés, et
demeurent donc augmentés, lors de la contraction musculaire chez le rat (Whitehead, JP, et al.
2000). Ces observations suggèrent donc que durant l'exercice ou la contraction musculaire,
l'insuline mobilise des molécules ou voies de signalisation différentes de celles utilisées
habituellement en absence de contraction musculaire, du moins en amont de l'Akt/PKB, afin
de stimuler le transport du glucose de façon additive à la contraction musculaire.
4.1.2 Transport du glucose insulino-résistant vs contraction musculaire Une autre évidence suggérant une divergence signalétique dans l'action de l'insuline et de la
contraction musculaire sur le métabolisme du glucose provient de résultats démontrant que la
42
contraction musculaire stimule la captation du glucose chez l'humain et les rongeurs insulino-
résistants où l'expression de GLUT4 n'est pas altérée. Chez les rats obèses Zucker et chez
ceux nourris avec une diète riche en gras, on a démontré que la contraction musculaire activait
normalement le transport du glucose et la translocation de GLUT4 malgré une résistance
musculaire à l'insuline (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; King, PA, et al. 1993). Ces données sont
en accord avec des études chez l'humain démontrant que la captation du glucose durant
l'exercice est augmentée de façon normale chez les sujets obèses et non obèses atteints de
diabète de type 2 (Kennedy, JW, et al. 1999; Martin, IK, et al. 1995; Minuk, HL, et al. 1981).
4.1.3 Translocation additive de GLUT4 De nombreuses études utilisant différentes procédures de fractionnement membranaire de
muscles ont démontré que parallèlement à une augmentation additive du transport du glucose,
l'effet combiné de l'insuline et de la contraction musculaire induisait une augmentation
partiellement (Lund, S, et al. 1995) ou totalement (Gao, J, et al. 1994) additive de la
translocation de GLUT4 à la membrane plasmique. De plus, on a observé que ces deux
stimuli augmentaient de façon additive la translocation de GLUT4 au niveau des tubules-T
(Ploug, T, et al. 1998). Toutefois, d'autres groupes n'ont pas observé un effet additif
(Goodyear, LJ, et al. 1990) ou ont observé un effet additif partiel (Brozinick, JT, Jr., et al.
1994; Douen, AG, et al. 1990) sur le transport du glucose en présence de ces deux stimuli, et
une absence d'effet additif sur la translocation de GLUT4. Les divergences de ces résultats
semblent attribuables aux différentes techniques de fractionnement membranaire utilisées. De
façon générale, il a été proposé que l'effet additif de l'insuline et de la contraction musculaire
sur le transport du glucose pourrait être attribuable au recrutement de différentes populations
de vésicules GLUT4 par ces deux stimuli.
4.1.3.1 Caractérisation des compartiments intracellulaires de GLUT4 sensibles à l'insuline
Plusieurs évidences suggèrent qu'au niveau basal, GLUT4 réside dans plusieurs types de
vésicules intracellulaires localisées dans différentes parties de la cellule et possédant des
caractéristiques morphologiques et biochimiques différentes. De plus, il a été démontré que
43
l'insuline mobilisait spécifiquement certaines de ces vésicules à la surface cellulaire alors que
d'autres étaient insensibles à son action (Coderre, L, et al. 1995). Plusieurs études ont donc été
effectuées afin de déterminer la nature biochimique des vésicules GLUT4 spécifiquement
sensibles à l'insuline en utilisant une technique d'immunoadsorption membranaire qui permet
d'isoler les vésicules GLUT4 à partir de fractions subcellulaires d'adipocytes ou de muscle
squelettique. Il fut démontré qu'au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique, la
majeure partie de l'aminopeptidase IRAP (gp160), qui est utilisée comme marqueur des
vésicules GLUT4 spécialisées (VG), les récepteurs IGF-II/Man-6-P (gp 230) ainsi que la
protéine SCAMPs étaient colocalisés avec GLUT4 dans ces vésicules et que ces protéines
étaient mobilisées à la surface cellulaire en réponse à l'insuline (Kandror, K and Pilch, PF
1994; Kandror, KV and Pilch, PF 1994; Laurie, SM, et al. 1993; Mastick, CC, et al. 1994;
Thoidis, G, et al. 1993). D'autre part, des études ont révélé que GLUT1 et GLUT4 résident
dans différents compartiments intracellulaires insulino-sensibles ayant des densités et des
coefficients de sédimentation similaires dans les adipocytes (Kandror, KV, et al. 1995; Lee,
W, et al. 2000; Zorzano, A, et al. 1989).
Au niveau des molécules de signalisation insulinique, des travaux indiquent que l'insuline
induisait une redistribution et une activation du récepteur de l'insuline au niveau des vésicules
GLUT4 du muscle squelettique (Dombrowski, L, et al. 2000) et de l'adipocyte (Kublaoui, B, et
al. 1995), ce qui fut cependant contredit par d'autres travaux (Kandror, KV and Pilch, PF
1998). Par ailleurs, des travaux démontrent que la PI-4 kinase ainsi que l'Akt-2 sont associées
aux vésicules GLUT4 au niveau basal et que l'insuline augmente la colocalisation vésiculaire
de GLUT4 et de l'Akt-2 (Calera, MR, et al. 1998; Del Vecchio, RL and Pilch, PF 1991;
Kristiansen, S, et al. 1998; Kupriyanova, TA and Kandror, KV 1999).
Les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide Attachment protein REceptor) associées
aux compartiments vésiculaires (v-SNAREs) ou aux compartiments de surface (t-SNAREs)
ont été proposées comme jouant un rôle dans l'amarrage et la fusion des vésicules GLUT4 à la
surface cellulaire. Ainsi, on a observé que les v-SNAREs VAMP-2 et VAMP-3/cellubrevine,
et plus particulièrement VAMP-2 (Sevilla, L, et al. 1997), sont associées aux vésicules
GLUT4 sensibles à l'insuline (Cain, CC, et al. 1992; Volchuk, A, et al. 1995). Certains travaux
utilisant des toxines de clivage des VAMPs ainsi que des protéines recombinantes de fusion
44
(GST-VAMP-2/3) ont indiqué que VAMP-2, et non VAMP-3, est essentielle à la translocation
de GLUT4 stimulée par l'insuline (Cheatham, B, et al. 1996; Martin, LB, et al. 1998; Millar,
CA, et al. 1999; Randhawa, VK, et al. 2000; Yang, C, et al. 2001). D'autre part, on a démontré
que les protéines t-SNAREs Syntaxine-4 et SNAP-23, formant un complexe avec VAMP-2,
sont essentielles à la translocation de GLUT4 induite par l'insuline dans les adipocytes
(Cheatham, B, et al. 1996; Kawanishi, M, et al. 2000; Olson, AL, et al. 1997; Rea, S, et al.
1998; Tellam, JT, et al. 1997) et le muscle squelettique (St-Denis, JF and Cushman, SW
1998). En plus des protéines SNARES, des études révèlent qu'une protéine liant le GTP, Rab4,
colocalise avec GLUT4 dans les VG d'adipocytes (Cormont, M, et al. 1993) et de muscle
squelettique de rat (Aledo, JC, et al. 1995; Kessler, A, et al. 2000). De plus, l'expression d'une
forme mutante de Rab4 ainsi que l'injection d'anticorps dirigés contre Rab4 ont permis de
déterminer que cette protéine est essentiellement impliquée dans la translocation de GLUT4
insulino-sensible (Cormont, M, et al. 2001; Knight, JB, et al. 2000; Mora, S, et al. 1997;
Shibata, H, et al. 1996; Vollenweider, P, et al. 1997). De façon générale, bien que l'association
de certaines protéines avec les vésicules GLUT4 insulino-sensibles ait été démontrée, les rôles
fonctionnels de ces associations dans l'amarrage ou la fusion, la translocation, ou le
mouvement vésiculaire de GLUT4 par l'insuline sont encore peu définis.
4.1.3.2 Caractérisation du compartiment intracellulaire spécialisé de GLUT4 sensible à la contraction musculaire
Alors que de nombreuses études ont été réalisées afin de caractériser les différents
compartiments intracellulaires sensibles à l'insuline ainsi que la régulation hormonale du
mouvement intracellulaire de GLUT4, un nombre beaucoup plus restreint de travaux ont été
effectués avec la contraction musculaire. Certaines évidences suggèrent que l'insuline et la
contraction musculaire stimulent de façon additive le transport du glucose en recrutant GLUT4
à partir de deux différentes populations de vésicules GLUT4 (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994;
Coderre, L, et al. 1995; Douen, AG, et al. 1990; Etgen, GJ, Jr., et al. 1993; Ploug, T, et al.
1998; Sherman, LA, et al. 1996). En effet, certains ont observé que la contraction musculaire
n'induit aucune diminution du contenu en GLUT4 à partir d'un compartiment intracellulaire
sensible à l'insuline (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; Douen, AG, et al. 1990). De plus, des
travaux de fractionnement membranaire du muscle squelettique ont permis d'isoler deux
45
différents types de vésicules GLUT4 ayant des coefficients de sédimentation différents et étant
distinctement sensibles à l'insuline et à l'exercice (Coderre, L, et al. 1995).
L'immunoadsorption de ces vésicules a révélé une similarité dans leur composition protéique,
chacune d'elles contenant les protéines IRAP et SCAMPs, mais excluant les protéines GLUT1
et cavéoline. De plus, l'effet combiné de l'insuline et de l'exercice diminue simultanément le
contenu en GLUT4 et de IRAP à partir de leur vésicule respective. D'autre part, certaines
évidences suggèrent que contrairement à l'insuline, la contraction musculaire induit le
recrutement de GLUT4 à la membrane cellulaire à partir d'un réservoir endosomal enrichi en
récepteur de la transferrine (TfR). Par une technique d'immunofluorescence à double
marquage ainsi que par le fractionnement membranaire, il a été observé que l'insuline
mobilisait GLUT4 à partir d'un compartiment vésiculaire ne contenant pas le TfR alors que la
contraction musculaire sitmulait à la fois la translocation de GLUT4 à partir de vésicules
enrichies ou non en TfR (Ploug, T, et al. 1998). Cependant, une étude démontre que l'insuline
et la contraction musculaire activent la translocation de GLUT4 et de IRAP, et non du TfR, à
la membrane plasmique et ce, à partir d'un même réservoir intracellulaire (Tomas, E, et al.
2001). De plus, tout comme l'insuline, l'exercice recrute GLUT4 à partir d'un compartiment
associé à la v-SNAREs VAMP-2 dans le muscle squelettique humain, suggérant que ces deux
stimuli recrutent GLUT4 à partir d'un même réservoir vésiculaire (Kristiansen, S, et al. 1996).
Alternativement, des travaux révèlent que l'insuline, et non la contraction musculaire, stimule
la translocation de GLUT4 et de Rab4 à la membrane plasmique du muscle squelettique de rat
(Sherman, LA, et al. 1996). Conjointement, ces résultats suggèrent que la contraction
musculaire stimule la translocation de GLUT4 d'une part à partir d'un compartiment
vésiculaire insensible à l'insuline, et d'autre part, à partir d'un second réservoir vésiculaire
semblable ou distinct de celui mobilisé par l'insuline. Cependant, cette conclusion demeure
hypothétique et d'autres travaux seront nécessaires afin de clarifier la nature des différents
compartiments vésiculaires mobilisés par l'insuline et la contraction musculaire.
46
TABLEAU 3 :
Caractérisation biochimique distinctive des vésicules GLUT4 (VG) sensibles à l'insuline ou à la contraction musculaire dans le muscle squelettique.
Protéines associées aux VG sensibles à l'insuline
Rôles possibles dans le mouvement intracellulaire de GLUT4
IRAP (gp160) Régulation de la séquestration, du mouvement intracellulaire et de l'expression de GLUT4
SCAMPs Inconnus
VAMP-2 Amarrage et fusion des vésicules GLUT4 à la
surface cellulaire
Essentiel à la translocation de GLUT4
* Rab 4 Essentiel à la translocation de GLUT4
Protéines associées aux VG sensibles à la contraction musculaire
Rôles possibles dans le mouvement intracellulaire de GLUT4
IRAP (gp160) Régulation de la séquestration, du mouvement intracellulaire et de l'expression de GLUT4
SCAMPs Inconnus
VAMP-2 Amarrage et fusion des vésicules GLUT4 à la surface cellulaire
* TfR Inconnus * Protéines spécifiquement associées aux vésicules GLUT4 (VG) sensibles à l'insuline ou à la
contraction musculaire.
47
5 Endosomes et transport du glucose Depuis plusieurs années, le mouvement intracellulaire des transporteurs de glucose GLUT4 a
été considérablement étudié afin de clarifier les mécanismes par lesquels l'insuline et la
contraction musculaire stimulent la translocation de GLUT4 dans les cellules musculaires et
adipeuses. L'utilisation de plusieurs modèles expérimentaux visant à définir la nature des
divers compartiments ainsi que la régulation de leurs interactions suite à la stimulation
insulinique a conduit à la création de plusieurs modèles très complexes et encore mal définis
de mouvement intracellulaire de GLUT4 via le système endosomal. Un modèle hypothétique
de ces interactions est décrit à la figure 8.
5.1 Le système endosomal Chez plusieurs espèces, le maintien de l'intégrité cellulaire et de la réponse biologique est
assuré par le transport de nombreuses molécules extracellulaires vers l'intérieur de la cellule.
Ce mécanisme de transport transmembranaire est réalisé grâce à l'intervention de différents
mécanismes d'endocytose très complexes requérant la mobilisation de divers compartiments
endosomaux. Le système endosomal comporte plusieurs compartiments membranaires qui ont
été caractérisés selon des paramètres cinétiques, morphologiques, moléculaires et fonctionnels.
Ceux-ci regroupent principalement les endosomes de premier ordre subdivisés en 2 sous-
groupes i.e. les endosomes de triage et les endosomes de recyclage, ainsi que les endosomes
tardifs et les lysosomes (Clague, MJ 1998; Geuze, HJ, et al. 1983; Sachse, M, et al. 2002).
5.1.1 L'endocytose L'endocytose ou l'internalisation de diverses molécules peut s'effectuer par un mécanisme
indépendant ou dépendant de vésicules dérivées de la membrane plasmique contenant de la
clathrine (clathrin-coated pits ou CCP). L'endocytose dépendante de la clathrine, mieux
caractérisée, regroupe la voie d'internalisation via les CCP de plusieurs récepteurs
membranaires tels que celui de l'EGF ou de la transferrine ainsi que de divers transporteurs
membranaires tels que les transporteurs de glucose GLUT4 et GLUT1 (Robinson, LJ, et al.
48
1992; Slot, JW, et al. 1991). L'internalisation des récepteurs dans les CCP peut s'effectuer de
façon constitutive, comme pour le récepteur de la transferrine, ou suite à la liaison du ligand à
son récepteur comme dans le cas de l'EGF. La formation des vésicules enrichies en clathrine
(CCV) contenant la molécule d'intérêt comme GLUT4 est complétée par la scission des CCP
bourgeonnantes via l'action essentielle de la GTPase dynamine (Al-Hasani, H, et al. 1998;
Kao, AW, et al. 1998; McNiven, MA 1998; Schmid, SL, et al. 1998; Volchuk, A, et al. 1998).
5.1.2 Modèle de traffic inter-endosomal Selon le modéle simplifié, les endosomes de triage constituent la première structure
endosomale par laquelle les molécules internalisées dans les CCV transitent (Holman, GD and
Sandoval, IV 2001). À ce niveau, les éléments internalisés peuvent emprunter différentes
routes ou voies intracellulaires. En effet, ces éléments peuvent être dirigés vers les endosomes
de recyclage afin d'être recyclés constitutivement au niveau de la surface cellulaire (récepteur
de la transferrine) ou être dirigés vers un autre compartiment endosomal, les endosomes
tardifs, afin d'être ensuite dégradés dans les lysosomes. À partir des endosomes de triage, les
éléments peuvent être également mobilisés vers des vésicules sécrétoires spécialisées (e.g. de
GLUT4) (Voir figure 8).
5.2 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 au niveau basal
Au niveau du muscle squelettique et des adipocytes, il a été démontré que 99 % des
transporteurs de glucose GLUT4 sont séquestrés à l'intérieur de la cellule au niveau basal et
qu'une certaine proportion de GLUT4 est associée au système endosomal incluant les
endosomes de triage et les endosomes de recyclage (Livingstone, C, et al. 1996; Martin, S, et
al. 1996; Millar, CA, et al. 1999). Par l'ablation chimique des endosomes de cellules adipeuses
en utilisant un conjugué HRP lié à la transferrine, il a donc été démontré que 40 % des GLUT4
sont associés au système endosomal au niveau basal, alors qu'une seconde population de
vésicules spécialisées (60 % GLUT4) sont dépourvues de marqueurs endosomaux tels que le
TfR (Lampson, MA, et al. 2001; Livingstone, C, et al. 1996; Ploug, T, et al. 1998; Wei, ML, et
al. 1998). De plus, la microscopie électronique au niveau du tissu adipeux a révélé que 13 %
49
de GLUT4 appartenant à cette seconde population de vésicules est associé au réseau Trans-
Golgi (TGN) et que la proportion de GLUT4 résiduelle appartient à des structures tubulo-
vésiculaires représentant un compartiment spécialisé spécifiquement sensible à l'insuline (Slot,
JW, et al. 1991; Slot, JW, et al. 1991). La séquestration de GLUT4 au niveau basal est
supportée par le fait que le recyclage de GLUT4 à la surface cellulaire est de 5 à 10 fois
inférieur à celui du TfR dans les adipocytes (Holman, GD, et al. 1994; Tanner, LI and
Lienhard, GE 1987). De plus, des travaux utilisant des protéines chimériques et mutantes
démontrent que certains motifs spécifiques de la partie C-terminale de GLUT4 (motif
dileucine SLL) seraient responsables de sa séquestration à l'intérieur de la cellule alors que
certaines séquences de sa portion N-terminale (motif FQQI) dirigeraient son endocytose
(Araki, S, et al. 1996; Czech, MP, et al. 1993; Piper, RC, et al. 1993; Verhey, KJ, et al. 1993).
De façon générale, l'ensemble des études cinétiques visant à définir le mouvement
intracellulaire de GLUT4 suggèrent qu'au niveau basal, GLUT4 est localisé dans deux types
de compartiments intracellulaires : un compartiment endosomal associé aux endosomes de
triage et aux endosomes de recyclage assurant le recyclage constitutif de GLUT4 à la surface
cellulaire au niveau basal, et un compartiment post-endosomal spécialisé qui est
spécifiquement recruté à la surface cellulaire par l'insuline (Aledo, JC, et al. 1997; Becker, C,
et al. 2001; Hashiramoto, M and James, DE 2000; Holman, GD, et al. 1994; Kandror, KV
1999; Lee, W, et al. 2000; Martin, S, et al. 1996).
5.3 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 en présence d'insuline
Les différentes localisations intracellulaires de GLUT4 ainsi que les différentes voies de
transport intracellulaires de ce transporteur de glucose témoignent de la complexité de ce
processus visant à augmenter le contenu en GLUT4 à la surface cellulaire en réponse à
l'insuline. Plusieurs études suggèrent que l'insuline augmente le contenu en GLUT4 à la
surface cellulaire en accélérant son recyclage et son exocytose et en ralentissant son
endocytose (Jhun, BH, et al. 1992; Satoh, S, et al. 1993; Yeh, JI, et al. 1995). De plus,
certaines évidences suggèrent que l'insuline augmente l'exocytose de plusieurs protéines qui
recyclent de façon constitutive via le système endosomal comme le TfR, le IGF-II/Man-6-PR
50
et GLUT4 (Tanner, LI and Lienhard, GE 1987; Tanner, LI and Lienhard, GE 1989). Par
ailleurs, il semblerait que l'insuline accélère le recyclage de GLUT4 à la surface cellulaire en
régulant le mouvement inter-endosomal de GLUT4, ce processus étant dépendant de
l'activation de la PI-3 kinase (Foster, LJ, et al. 2001). Cependant, le recrutement de GLUT4 à
la surface cellulaire en présence d'insuline est beaucoup plus important que celui des protéines
endosomales ou de recyclage (James, DE and Piper, RC 1994; Kandror, KV and Pilch, PF
1996), suggérant que GLUT4 est principalement mobilisé à la surface cellulaire à partir d'un
compartiment non associé au système endosomal (compartiment post-endosomal). Ainsi, il a
été démontré que la majeure partie des GLUT4 mobilisés à la surface cellulaire origine de la
translocation du réservoir spécialisé de GLUT4 spécifiquement sensible à l'insuline (Malide,
D, et al. 2000; Rodnick, KJ, et al. 1992). En accord avec cette dernière observation, on a
remarqué que sous l'action de l'insuline, le contenu en GLUT4 augmente de 30 à 40 fois au
niveau de la membrane plasmique de la cellule adipeuse, mais augmente seulement de 3 fois
au niveau des endosomes de premier ordre (Slot, JW, et al. 1991; Slot, JW, et al. 1991),
suggérant qu'une certaine partie des GLUT4 transitent au niveau du système endosomal mais
qu'une proportion plus importante de GLUT4 provient d'un compartiment post-endosomal. Par
l'ablation chimique des endosomes de cellules adipeuses en utilisant un conjugué HRP lié à la
transferrine, une étude indique que cette ablation ne bloque pas la translocation de GLUT4
stimulée par l'insuline, mais ne fait que retarder son apparition à la surface cellulaire (Martin,
LB, et al. 1998). L'ensemble de ces données suggèrent donc que le système endosomal
contribue de façon indirecte, mais non essentielle, à la translocation de GLUT4 (Aledo, JC, et
al. 1997; Livingstone, C, et al. 1996; Martin, S, et al. 1996; Millar, CA, et al. 1999).
5.4 Rôle des endosomes dans le mouvement vésiculaire de GLUT4 lors de la contraction musculaire.
Bien que plusieurs travaux ont été réalisés afin de clarifier le rôle des endosomes dans le
mouvement intracellulaire de GLUT4 en présence d'insuline, un nombre très restreint
d'évidences sont actuellement disponibles pour la réponse engendrée par la contraction
musculaire. Les résultats les plus concluants proviennent d'une étude démontrant que la
contraction musculaire induit le recrutement de GLUT4 à la membrane cellulaire à partir d'un
51
réservoir endosomal enrichi en récepteur de la transferrine. Par une technique
d'immunofluorescence à double marquage ainsi que par le fractionnement membranaire, on a
observé que, contrairement à l'insuline, la contraction musculaire stimulait la translocation de
GLUT4 à partir de vésicules enrichies ou non en TfR (Ploug, T, et al. 1998). Étant donné le
nombre limité de données dans la littérature, d'autres études seront nécessaires afin de
déterminer l'implication possible des endosomes dans le mouvement intracellulaire de GLUT4
lors de la contraction musculaire.
FIGURE 8 :Modèle schématique du mouvement intracellulaire de GLUT4 au niveau basal et en présence d'insuline dans les cellules adipeuses. (Schéma adapté de Holman et al. 2001).
52
6 Monoxyde d'azote et transport du glucose Le rôle du monoxyde d'azote dans le métabolisme musculaire du glucose a premièrement été
proposé par l'observation que le monoxyde d'azote libéré durant l'incubation d'un muscle
squelettique isolé engendre une augmentation du transport du glucose à l'état basal (Balon,
TW and Nadler, JL 1994). Par la suite, il fut démontré que des donneurs de monoxyde d'azote
comme le sodium nitropusside (SNP) et la spermine nonoate induisaient une augmentation de
la captation de glucose dans le muscle squelettique isolé (Balon, TW and Nadler, JL 1997;
Higaki, Y, et al. 2001; Young, ME, et al. 1997). Puisqu'on a observé une augmentation de la
production de monoxyde d'azote durant la contraction musculaire (Balon, TW and Nadler, JL
1997), il devient donc important de clarifier le rôle possible de cette molécule dans la
stimulation du transport du glucose induite par la contraction musculaire.
6.1 Physiologie et production du monoxyde d'azote Le monoxyde d'azote (NO) est un gaz vasoactif qui a premièrement été nommé EDRF
(endothelium derived relaxing factor). En effet, ce messager biologique a tout d'abord été
décrit lors d'études effectuées au niveau du système vasculaire qui démontraient que l'action
vasodilatatrice de l'acétylcholine sur les vaisseaux sanguins nécessitait la libération d'un
facteur myorelaxant, l'EDRF, par les cellules endothéliales (Furchgott, RF and Zawadzki, JV
1980). Par sa nature biochimique lui conférant la capacité de franchir toutes les membranes
biologiques, le monoxyde d'azote a également été reconnu comme un neurotransmitteur clé au
niveau du système nerveux. Les résultats de plusieurs travaux ont également déterminé que le
monoxyde d'azote régule de nombreuses autres fonctions physiologiques comme la réponse
immunitaire, le processus inflammatoire, le choc septique, la mort neuronale au cours de
l'ischémie, la motilité intestinale, la contraction des muscles lisses, les mécanismes cellulaires
d'apprentissage et de la mémoire et l'érection via son action vasodilatatrice sur le flot sanguin
(Alderton, WK, et al. 2001; Stamler, JS and Meissner, G 2001).
Le monoxyde d'azote est produit par une famille d'enzymes appelées synthases du monoxyde
d'azote (NOS) qui compte à ce jour trois principaux isoformes. Ils ont été identifiés selon
53
l'ordre et les types cellulaires où ils ont été premièrement identifiés : l'isoforme neuronal
nNOS (NOS1), l'isoforme inductible iNOS (NOS2) exprimé entre autres chez les macrophages
et l'isoforme endothélial eNOS (NOS3). Ces isoformes sont le produit de gènes distincts et
diffèrent principalement selon leur distribution tissulaire, localisation cellulaire, mécanismes
de régulation et fonctions biologiques (Voir tableau 5). De façon simplifiée, le monoxyde
d'azote est produit suite à la conversion de la L-arginine en L-citrulline sous l'action des NOS
qui catalysent cette réaction. Celle-ci requiert une multitude de cofacteurs comme le
complexe Ca+2/calmoduline (pour les NOS dépendantes du calcium), l'oxygène, l'hème (Fe), le
NADPH, la tétrahydrobioptérine (BH4) et certaines coenzymes comme la flavine
mononucléotide (FMN) et la flavine adénine nucléotide (FAD). Comme molécule
signalétique, le monoxyde d'azote est impliqué dans certains processus biologiques via sa
liaison avec la guanylate cyclase, ce qui produit une activation de cette enzyme et une
augmentation de la concentration intracellulaire de cGMP (Murad, F 1996; Schmidt, HH and
Walter, U 1994). Il a également été démontré que le monoxyde d'azote régule l'activité de
certaines protéines en induisant une réaction de S-nitrosylation des résidus cystéines comme
au niveau de certains canaux ioniques, récepteurs, enzymes, facteurs de transcription et
protéines G (Alderton, WK, et al. 2001; Stamler, JS and Meissner, G 2001). De plus,
l'interaction du monoxyde d'azote avec certains dérivés de l'oxygène hautement réactifs (ex :
superoxide) peut conduire à la formation de peroxynitrite et ainsi augmenter la nitration des
tyrosines de certaines protéines, ce qui peut causer divers types de dommages cellulaires.
Conjointement avec le cGMP, les réactions de S-nitrosylation et de nitration constituent les
principaux mécanismes impliqués dans les réponses biologiques induites par le monoxyde
d'azote.
6.2 Expression, régulation et fonction des synthases du monoxyde d'azote
6.2.1 eNOS eNOS est abondamment exprimée, de façon constitutive, au niveau des cellules endothéliales
des vaisseaux sanguins, du muscle cardiaque (Balligand, JL and Cannon, PJ 1997) ainsi que
dans le cytoplasme des myofibres de type I et II du muscle squelettique de rat, son niveau
54
d'expression étant corrélé au contenu en mitochondries des myofibres (Kobzik, L, et al. 1995).
Il a été suggéré que eNOS soit localisée dans les mitochondries du muscle squelettique de rat
(Bates, TE, et al. 1996). Chez l'humain, certaines évidences révèlent cependant que eNOS ne
serait pas exprimée dans les fibres musculaires mais serait plutôt associée à l'endothélium des
vaisseaux irriguant le muscle squelettique (Frandsen, U, et al. 1996; Segal, SS, et al. 1999). Au
niveau de la cellule, eNOS est surtout associée à des microdomaines spécialisés de la
membrane plasmique appelés caveolae, cette localisation étant dépendante de la
myristoylation et de la palmitoylation simultanée de eNOS (Shaul, PW, et al. 1996). Dans le
muscle squelettique, l'activité de eNOS est régulée par le complexe Ca+2/calmoduline et par sa
liaison avec la protéine endogène des caveolae, la caveoline-1 alors que la cavéoline-3 régule
son activation dans le muscle cardiaque (Feron, O, et al. 1996). La liaison de la cavéoline à
eNOS entraîne une inhibition de son activité qui est renversée par le complexe
Ca+2/calmoduline (Ju, H, et al. 1997; Michel, JB, et al. 1997). La phosphorylation de eNOS
régule également son activité. En effet, il a été observé que la phosphorylation de eNOS sur le
résidu sérine 1179 induisait une augmentation de son activité (Dimmeler, S, et al. 1999;
Fulton, D, et al. 1999) alors que la phosphorylation sur le résidu thréonine 495 inhibait son
activation (Chen, ZP, et al. 1999). De plus, une étude suggère que la protéine Hsp90 agirait
comme modulateur allostérique positif de l'activité de eNOS (Garcia-Cardena, G, et al. 1998).
Physiologiquement, eNOS régule le flot sanguin et le tonus vasculaire et on a observé une
augmentation de son expression par l'entraînement physique (Balon, TW and Nadler, JL 1997;
Tidball, JG, et al. 1998) et l'exercice aigu (Roberts, CK, et al. 1999).
6.2.2 nNOS L'enzyme nNOS est principalement exprimée dans le système nerveux central et les muscles
squelettique et cardiaque, et dépend de la présence du calcium pour être activée. Chez
l'humain, cet isoforme est également exprimé au niveau du pancréas, de l'estomac, des
poumons et de l'utérus (Kingwell, BA 2000). Cette enzyme est subdivisée en quatre sous-types
soient nNOSβ, nNOSγ, nNOSµ et nNOS-2. Le sous-type nNOSµ constitue l'isoforme
prédominant du muscle cardiaque et squelettique de rat (Kobzik, L, et al. 1994; Silvagno, F, et
al. 1996; Xu, KY, et al. 1999). L'analyse par Northern blot a également révélée que l'ARNm
55
de nNOSµ est abondamment retrouvé dans le muscle squelettique humain, l'activité de cette
enzyme étant 15 fois plus élevée dans le tissu humain que dans celui des rongeurs (Nakane, M,
et al. 1993). Chez le rat, nNOS serait localisée au niveau du sarcolemme des myocytes et à la
jonction neuromusculaire et l'activité de cette enzyme serait davantage corrélée au
pourcentage de myofibres de type II (Kobzik, L, et al. 1994). Contrairement aux rongeurs, des
études immunohistochimiques indiquent que nNOSµ est localisée dans le cytoplasme des
myocytes humains et ce, autant au niveau des myofibres glycolytiques qu'oxydatives
(Frandsen, U, et al. 1996).
La partie N-terminale de nNOS contient un domaine unique à cette enzyme, le domaine PDZ,
permettant la liaison de nNOS à la protéine α1 syntrophine et la formation subséquente d'un
complexe avec la dystrophine au niveau du sarcolemme du muscle squelettique. Par analogie
à la cavéoline-1 pour eNOS, l'interaction de nNOS avec la cavéoline-3 associée au complexe
dystrophine induit une inhibition de son activité (Venema, VJ, et al. 1997). Ce type
d'interaction avec le complexe dystrophine confère donc à nNOS un rôle possible dans la
neurotransmission au niveau de la jonction neuromusculaire (Minatel, E, et al. 2001; Ribera, J,
et al. 1998). L'activité de nNOS est également contrôlée par sa phosphorylation sur le résidu
sérine 847 par la kinase dépendante de la calmoduline (CAM-K) et par l'interaction avec la
protéine Hsp90, menant respectivement à une inhibition et à une stimulation de l'activité de
nNOS (Bender, AT, et al. 1999; Komeima, K, et al. 2000). De plus, certains inhibiteurs
endogènes comme le PIN (Jaffrey, SR and Snyder, SH 1996) et le CAPON (Jaffrey, SR, et al.
1998) moduleraient l'activité de nNOS. D'autre part, l'activité de nNOS et la production de
cGMP et de monoxyde d'azote sont augmentées par la contraction musculaire in vivo et in
vitro. De plus, on a observé une augmentation de l'expression de nNOS par l'entraînement
physique (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Lau, KS, et al. 1998; Tidball, JG, et al. 1998),
l'exercice aigu (Roberts, CK, et al. 1999) et avec le vieillissement (Capanni, C, et al. 1998).
Alternativement, une inhibition de son expression est observée suite à la dénervation (Tews,
DS, et al. 1997).
Des travaux proposent que le monoxyde d'azote affecte les propriétés contractiles du muscle
squelettique en inhibant la force de contraction via un mécanisme dépendant du cGMP et de
l'activité de nNOS (Kobzik, L, et al. 1994). Cependant, les données actuelles à ce sujet sont
56
très contradictoires. De plus, l'impact de ces effets semble être peu important puisque l'activité
de la guanylate cyclase au niveau du muscle squelettique est relativement faible
comparativement aux autres tissus (Katsuki, S, et al. 1977). D'autre part, on a suggéré un rôle
de nNOS dans le contrôle du flot sanguin. Chez des souris déficientes en dystrophine (souris
mdx) où l'expression de nNOS est grandement réduite, on a remarqué une diminution de la
vasodilatation des artérioles durant la contraction musculaire chez ces souris transgéniques
comparativement aux souris contrôles (Lau, KS, et al. 1998).
6.2.3 iNOS iNOS est le seul isoforme des NOS dont l'expression tissulaire requiert l'action de certains
stimuli d'où son appellation d'isoforme inductible. Toutefois, certains travaux chez l'humain et
le rongeur ont révélé qu'une très faible quantité de iNOS serait retrouvée de façon constitutive
dans le muscle squelettique (Boczkowski, J, et al. 1996; el-Dwairi, Q, et al. 1998; Kapur, S, et
al. 1997; Park, CS, et al. 1996). L'expression de iNOS est induite par l'insuffisance cardiaque
chronique (Hambrecht, R, et al. 1999; Riede, UN, et al. 1998), le choc septique (Moncada, S,
et al. 1991) l'obésité et le diabète de type 2 (Perreault, M and Marette, A 2001) par l'entremise
de certaines molécules impliquées dans la défense immunitaire et la réaction inflammatoire
comme les cytokines TNFα, IL-1 et IL-6, interféron γ (Boczkowski, J, et al. 1996; el-Dwairi,
Q, et al. 1998) et par l'endotoxine LPS des bactéries (Bedard, S, et al. 1997; Kapur, S, et al.
2000; Liu, S, et al. 1993; Salter, M, et al. 1991). Tout comme pour nNOS, on a observé que
iNOS est localisée au niveau du sarcolemme du muscle squelettique de souris et est associée à
la cavéoline-3 (Gath, I, et al. 1999).
57
TABLEAU 4 :
Caractéristiques des principaux isoformes des synthases du monoxyde d'azote.
Caractéristiques eNOS iNOS nNOS nNOSµ
Expression constitutive inductible constitutive constitutive
Distribution tissulaire
Cellules endothéliales,
muscle squelettique et
cardiaque
Macrophages Cerveau, pancréas, estomac, poumons,
utérus
Muscle squelettique et
cardiaque
Localisation cellulaire :
muscle squelettique
Mitochondries, caveolae sarcolemme
Rongeurs : sarcolemme
Humain : cytoplasme
Réticulum sarcoplasmique
Activation dépendante du
calcium Oui Non Oui Oui
Fonctions Régulation du flot
sanguin et de la pression artérielle
Impliqué dans les réactions immunitaires
Régulation du flot sanguin
Neurotransmission Neurotransmission
6.3 Rôle du monoxyde d'azote dans le transport du glucose Plusieurs évidences ont rapporté que l'action du monoxyde d'azote sur le métabolisme du
glucose est versatile, attribuant ainsi un rôle négatif ou positif de ce médiateur qui varie en
fonction de son niveau de production. En effet, il a été rapporté qu'une production
considérable de monoxyde d'azote comme celle induite lors de l'endotoxinémie ou observée
dans les cas d'obésité et de diabète, pouvait avoir des effets délétères sur le métabolisme du
glucose en causant une résistance à l'insuline dans le muscle isolé et dans les cellules
musculaires en culture (Bedard, S, et al. 1997; Kapur, S, et al. 1997). Cependant, certaines
évidences suggèrent que lorsque produit en concentration physiologique, le monoxyde d'azote
58
peut jouer un rôle positif dans les effets métaboliques de l'insuline et de la contraction
musculaire sur la captation musculaire de glucose, particulièrement via son action vasculaire.
6.3.1 Rôle du monoxyde d'azote dans les effets de l'insuline sur le transport du glucose.
Dans le muscle squelettique, il a été suggéré que le monoxyde d'azote pourrait être impliqué
dans la modulation de l'action de l'insuline sur la captation du glucose et ce, via une
augmentation du flot sanguin (in vivo) (Baron, AD 1994). En effet, certaines études chez le
rat ont tout d'abord démontré que le traitement des muscles EDL et soléaire isolés avec des
inhibiteurs compétitifs des NOS, le L-NAME et le L-NMMA, n'induisait aucune diminution
du transport du glucose stimulé par l'insuline (Balon, TW and Nadler, JL 1997; Roy, D, et al.
1998). Ces résultats suggéreraient donc que le monoxyde d'azote ne contribue pas à
l'augmentation du transport du glucose stimulé par l'insuline in vitro. D'autre part, plusieurs
travaux ont proposé que l'effet stimulateur de l'insuline sur le transport musculaire de glucose
pourrait être en partie attribuable à une relâche de monoxyde d'azote induite par eNOS associé
à l'endothélium vasculaire. La relâche de monoxyde d'azote par eNOS induirait une
augmentation du flot sanguin ce qui contribuerait à augmenter le transport du glucose dans les
tissus insulino-sensibles en augmentant la disponibilité du glucose et de l'insuline au niveau
des muscles squelettiques (Baron, AD 1996). Ainsi, il a été démontré que l'insuline cause une
vasodilatation des artérioles et augmente le flot sanguin chez le rat et l'humain (Baron, AD
1994; Baron, AD, et al. 1995; Pitre, M, et al. 1996). Ces effets ont été démontrés comme étant
dépendants de la relâche de monoxyde d'azote par l'endothélium (Chen, YL and Messina, EJ
1996; Steinberg, HO, et al. 1994). De plus, l'insuline stimule la phosphorylation et l'activation
de eNOS et la relâche de monoxyde d'azote dans des cellules transfectées avec eNOS
(Montagnani, M, et al. 2001). Alternativement, il a été démontré par la technique du clamp
euglycémique/hyperinsulinémique que le L-NAME causait une inhibition du transport du
glucose au niveau de l'organisme entier ainsi que dans le muscle squelettique et le tissu
adipeux de rat (Roy, D, et al. 1998), et serait associé à une diminution de l'activité NOS dans
le muscle squelettique. Ces résulats ont été supportés par des études chez l'humain qui
démontrent que l'infusion intrafémorale de L-NAME cause une diminution du flot sanguin et
du transport musculaire du glucose stimulé par l'insuline durant le clamp
59
euglycémique/hyperinsulinémique (Baron, AD, et al. 1996; Baron, AD, et al. 1995). Un rôle
du monoxyde d'azote dans l'augmentation du transport du glucose stimulé par l'insuline a de
plus été confirmé par des travaux démontrant que la déficience en eNOS chez des souris
entraînait une résistance hépatique et périphérique à l'insuline (Shankar, RR, et al. 2000). De
façon générale, l'ensemble de ces données proposent un rôle du monoxyde d'azote dans les
effets hémodynamiques de l'insuline sur le transport musculaire du glucose. Toutefois, le
monoxyde d'azote, lorsque produit en concentration physiologique, ne semble pas être
impliqué de façon directe dans la voie de signalisation par laquelle l'insuline exerce son action
sur le métabolisme du glucose.
6.3.2 Rôle du monoxyde d'azote dans les effets de la contraction musculaire et du AICAR sur le transport du glucose
Plusieurs observations dans la littérature suggèrent que le monoxyde d'azote pourrait jouer un
rôle dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose dans le
muscle squelettique. Le mécanisme d'action du monoxyde d'azote peut d'une part être
attribuable à un effet direct au niveau cellulaire, par exemple via la voie de signalisation du
cGMP, ou à un effet indirect via l'augmentation du flot sanguin. En effet, on a démontré qu'au
niveau basal et durant la contraction musculaire du muscle EDL isolé, il y avait une
augmentation de la production de monoxyde d'azote et que le transport du glucose et la
production de NO était inhibé par le L-NAME ou par le L-NMMA dans ces conditions (Balon,
TW and Nadler, JL 1997). Ces données ont été confirmées par des travaux indiquant que
l'augmentation du transport du glucose induite par l'exercice sur tapis roulant était inhibée en
présence de L-NAME dans le muscle squelettique de rat (Roberts, CK, et al. 1997). Cette
dernière étude démontre également que cet effet inhibiteur du L-NAME était attribuable à une
diminution de la translocation de GLUT4 à la surface cellulaire, suggérant une implication
directe du NO dans la voie de signalisation intracellulaire par laquelle la contraction
musculaire active la translocation de GLUT4 et la captation du glucose. Chez l'humain,
l'infusion de L-NAME entraîne une diminution de la captation musculaire du glucose durant
l'exercice en absence de changement du débit sanguin fémoral (Bradley, SJ, et al. 1999). Par
l'utilisation de différentes techniques de mesure, d'autres groupes ont observé une diminution
(Dyke, CK, et al. 1995; Gilligan, DM, et al. 1994; Hickner, RC, et al. 1997) ou une absence
60
d'effet (Radegran, G and Saltin, B 1999; Wilson, JR and Kapoor, S 1993) de l'inhibition des
NOS sur le flot sanguin fémoral durant l'exercice chez l'humain. D'autre part, des études
révèlent une absence d'inhibition de la captation du glucose en présence d'inhibiteurs des NOS
en réponse à la contraction musculaire des muscles épitrochlearis (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997)
ou EDL et soléaire (Higaki, Y, et al. 2001) isolés. Ces résultats ont également été observés
dans ces mêmes muscles durant l'exercice chez la souris (Rottman, JN, et al. 2002) et le rat
(Higaki, Y, et al. 2001). De plus, aucune augmentation du cGMP n'a été notée durant la
contraction musculaire du muscle épitrochlearis isolé (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997) alors qu'une
autre étude a rapporté une augmentation du cGMP dans le muscle EDL contracté in vitro (Lau,
KS, et al. 1998). Ces données reflètent un rôle controversé du monoxyde d'azote et du cGMP
dans le transport du glucose stimulé in vivo par l'exercice ou in vitro par la contraction
musculaire de muscles isolés.
L'effet reconnu de la contraction musculaire sur l'activation des NOS a soulevé l'hypothèse
que l'AMPK, un médiateur clé de l'effet de la contraction musculaire sur le transport du
glucose, pourrait être impliquée dans cette activation. En effet, des résultats récents
démontrent que les NOS peuvent être phosphorylées et activées par l'AMPK. Ainsi, une étude
effectuée au niveau du coeur de rat indique que l'AMPK co-immunoprécipite avec eNOS et
qu'in vitro, l'AMPK phosphoryle eNOS sur le résidu sérine 1177, menant ainsi à une
activation de eNOS en présence de Ca+2/calmoduline (Chen, ZP, et al. 1999). De plus, une
seconde étude chez le rat a démontré que l'exercice aigu induit une activation parallèle de
l'AMPKα1 et α2 et de nNOS µ, suggérant que l'AMPK mène à l'activation de nNOS µ bien
qu'aucune activation directe n'ait été démontrée (Chen, Z, et al. 2000). À ce jour, une seule
étude a vérifié le rôle du monoxyde d'azote sur le transport du glucose stimulé par le AICAR,
un agent activateur de l'AMPK (Fryer, L, et al. 2000). Ainsi, il a été observé que l'AMPK
activée par le AICAR induisait la phosphorylation de eNOS et de nNOS in vitro. De plus,
l'activation de l'AMPK par le AICAR a induit une augmentation de l'activité des NOS dans les
cellules musculaires H-2Kb de souris. Cette lignée cellulaire provient de muscles de souris
transgéniques hétérozygotes pour le gène tsA58 qui permet la génération de cellules
immortelles et dont la transcription est régulée par le promoteur H2K-b. Suite au traitement
avec un inhibiteur des NOS, le L-NAME, ils ont observé une diminution du transport du
glucose activé par le AICAR dans ces cellules, mais également au niveau des muscles EDL et
61
soléaire isolés. De plus, on a observé une inhibition de l'effet du AICAR sur le transport du
glucose par un agent inhibiteur de la guanylate cyclase et de la production de cGMP, le
LY83583. Ces résultats suggèrent donc que le transport du glucose stimulé par le AICAR est
dépendant de l'activation des NOS et du cGMP dans les cellules H2K-b. Cependant, d'autres
travaux seront nécessaires afin de valider le rôle du monoxyde d'azote et du cGMP dans l'effet
activateur du AICAR sur le transport du glucose dans le muscle squelettique in vivo.
Par ailleurs, des études suggèrent que le monoxyde d'azote stimule une voie de signalisation
différente de celle activée par l'insuline ou la contraction musculaire pour augmenter la
captation musculaire de glucose. En effet, des travaux ont rapporté que des donneurs exogènes
de monoxyde d'azote comme le sodium nitroprusside (SNP) ou la spermine nonoate pouvaient
augmenter le transport basal du glucose et la translocation de GLUT4 au niveau du muscle
squelettique isolé et ce, indépendamment de l'effet de l'insuline et de la contraction musculaire
(Etgen, GJ, Jr., et al. 1997; Higaki, Y, et al. 2001; Roberts, CK, et al. 1997; Young, ME, et al.
1997). Cette affirmation se base sur des résultats démontrant que la combinaison du SNP et de
l'insuline, ou du SNP et de la contraction musculaire, stimule de façon additive le transport du
glucose dans le muscle EDL isolé (Higaki, Y, et al. 2001; Roberts, CK, et al. 1997). Ces
études révèlent également que le transport du glucose stimulé par le SNP est indépendant du
calcium et de l'activation de la PI-3 kinase mais semble dépendant de l'activation de
l'AMPKα1 et non de l'AMPKα2.
De façon générale, l'ensemble des études visant à clarifier le rôle du monoxyde d'azote dans
l'effet stimulateur de l'insuline et de la contraction musculaire sur le transport de glucose
laissent donc croire que cette molécule, lorsque produite en concentration physiologique, est
impliquée dans les effets hémodynamiques de ces stimuli sur le métabolisme du glucose in
vivo. Toutefois, le rôle du monoxyde d'azote dans les effets in vitro de l'insuline et de la
contraction musculaire reste encore à être clarifié.
62
6.3.3 iNOS et résistance à l'insuline Dans la littérature, certaines évidences suggèrent que l'expression de l'enzyme iNOS induite
dans certaines situations pathologiques module négativement le métabolisme du glucose
insulino-dépendant (Kapur, S, et al. 2000). En effet, puisque iNOS est induite dans le muscle
squelettique et le tissu adipeux de modèles humains et animaux d'obésité, de résistance à
l'insuline et de diabète, il a été suggéré que cette enzyme pourrait contribuer aux effets
délétères sur le métabolisme du glucose observés chez ces sujets via une surproduction de
monoxyde d'azote (Pilon, G, et al. 2000). Une étude récente supporte cette hypothèse puisqu'il
a été démontré que l'invalidation du gène iNOS améliorait de façon importante la résistance
musculaire à l'insuline induite par l'obésité chez des souris nourries avec une diète riche en
gras (Perreault, M and Marette, A 2001). De plus, d'autres travaux démontrent que l'induction
de iNOS et la surproduction de monoxyde d'azote observés chez des rats obèses ZDF
contribuent au développement du diabète en inhibant la sécrétion pancréatique d'insuline
(Shimabukuro, M, et al. 1997). Ces données soulignent donc l'importance de iNOS dans les
effets négatifs de la surproduction de monoxyde d'azote sur le métabolisme du glucose chez
les sujets insulino-résistants.
7 Buts et aspects méthodologiques de la thèse L'objectif général de la présente thèse consistait à étudier les mécanismes intracellulaires par
lesquels la contraction musculaire stimule la captation du glucose dans le muscle squelettique
de rat. Dans la littérature, certaines données proposent que l'insuline et la contraction
musculaire activent la translocation de GLUT4 et la captation musculaire de glucose par des
voies de signalisation intracellulaires distinctes. Puisqu'il est reconnu que l'exercice stimule
normalement le transport du glucose chez les modèles humains et animaux de résistance à
l'insuline et de diabète de type 2, il devient donc fondamental, dans un but thérapeutique, de
bien comprendre les mécanismes régulateurs de la captation du glucose en réponse à la
contraction musculaire.
Puisque certaines études démontrent que l'effet combiné de ces deux stimuli induit une
augmentation additive du transport du glucose dans le muscle squelettique, il a été proposé
63
que l'insuline et la contraction active la translocation de GLUT4 à partir de populations de
vésicules distinctes dans le muscle de rat. L'objectif de la première étude visait donc à vérifier
cette hypothèse. Ces travaux ont été réalisés à l'aide d'une technique de perfusion insulinique
couplée à un protocole de contraction par stimulation électrique in situ. À l'aide d'une
technique de fractionnement membranaire mise au point dans notre laboratoire ainsi que par
immunobuvardage, nous avons donc pu étudier la translocation de GLUT4 et du TfR aux deux
compartiments de surface, soient la membrane plasmique et les tubules-T. La technique
d'immunoadsorption membranaire nous a également permis de mieux caractériser les
différentes populations de vésicules GLUT4 sensibles à l'insuline et à la contraction
musculaire.
L'objectif principal de la seconde étude consistait à caractériser la translocation de GLUT4 et
du TfR ainsi que la régulation du transport musculaire de glucose induits par un agent
activateur de l'AMPK, le AICAR. Nous avons utilisé la technique du clamp euglycémique
ainsi que le fractionnement membranaire de muscles de rat afin de déterminer l'effet du
AICAR sur la translocation de GLUT4 et du TfR à la surface cellulaire. Le traitement de
muscles isolés au AICAR nous a également permis de déterminer le rôle de la p38 MAPK
dans la stimulation du transport du glucose en utlisant la technique de la captation du 2-
désoxyglucose (2-DG) marqué couplée à des mesures d'activités enzymatiques.
Certains travaux suggèrent que le monoxyde d'azote est impliqué dans la stimulation du
transport du glucose par la contraction musculaire, soit de façon directe au niveau de la voie
de signalisation intracellulaire, ou soit de façon indirecte par son action vasodilatatrice sur le
système vasculaire. Le dernier volet de cette thèse avait donc pour objectif de déterminer si le
monoxyde d'azote jouait un rôle dans l'effet stimulateur du AICAR sur la captation musculaire
du glucose in vitro et in vivo. Les expériences in vitro ont été effectuées par la technique de la
captation du 2-DG marqué dans les muscles glycolytiques et oxydatifs isolés traités au AICAR
et/ou au L-NAME. La technique du clamp euglycémique, le dosage de nitrites et de nitrates
plasmatiques ainsi que l'injection intrapéritonéale de AICAR ont également permis d'étudier
l'effet du AICAR et l'implication potentielle du monoxyde d'azote sur la captation musculaire
de glucose in vivo.
64
CHAPITRE 1 :
Le récepteur de la transferrine définit deux différentes populations de vésicules GLUT4 sensibles
à la contraction musculaire dans le muscle squelettique de rat.
65
RÉSUMÉ L'insuline et la contraction musculaire stimulent de façon additive le transport du glucose au
niveau du muscle squelettique. Cependant, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer cet effet
demeure(nt) encore obscur(s). Il a donc été proposé que l'insuline et la contraction musculaire
mobilisent les transporteurs de glucose GLUT4 à partir de différents réservoirs intracellulaires
afin d'augmenter de façon additive le transport du glucose. En utilisant le récepteur de la
transferrine comme marqueur des endosomes de recyclage, nous avons donc vérifié si
l'insuline et la contraction musculaire recrutaient GLUT4 spécifiquement à partir de ce
réservoir endosomal au niveau de la membrane plasmique et des tubules-T isolés par
fractionnement membranaire de muscles perfusés. Nous avons démontré qu'indépendamment,
l'insuline et la contraction musculaire stimulaient le transport du glucose en induisant la
translocation de GLUT4 à la membrane plasmique et aux tubules-T. De plus, la combinaison
de ces deux stimuli provoquait une augmentation marquée et presque complètement additive
du contenu en GLUT4 à la membrane plasmique, mais non au niveau des tubules-T. Nous
avons également observé une absence d'effet significatif de l'insuline sur la translocation du
récepteur de la transferrine aux deux types de membrane de surface. Par ailleurs, nous avons
démontré que la contraction musculaire stimule la translocation de GLUT4 et du récepteur de
la transferrine uniquement au niveau de la membrane plasmique et non au niveau des tubules-
T. L'immunoadsorption de vésicules enrichies en GLUT4 indique que la contraction
musculaire recrute GLUT4 et le récepteur de la transferrine à partir des mêmes vésicules.
Nous avons donc conclu que la contraction musculaire stimule la translocation de GLUT4 à
partir de deux réservoirs intracellulaires distincts, soit d'une part, à partir d'une population de
vésicules GLUT4 associées à un réservoir endosomal qui sont sélectivement mobilisées à la
membrane plasmique et d'autre part, à partir d'un second réservoir intracellulaire dépourvu en
récepteur de la transferrine et mobilisé à la fois à la membrane plasmique et aux tubules-T.
Dans cet ouvrage, nous avons également émis l'hypothèse que l'absence d'effet additif de
l'insuline et de la contraction musculaire sur la translocation de GLUT4 au niveau des tubules-
T pourrait être expliquée par l'inhabilité de la contraction musculaire à moduler
spécifiquement GLUT4 à partir du réservoir endosomal.
66
The transferrin receptor defines two distinct contraction-responsive GLUT4 vesicle populations in skeletal muscle.
Kathleen Lemieux1, Xiao-Xia Han2, Luce Dombrowski1, Arend Bonen2, and André Marette1*
1Department of Physiology & Lipid Research Unit, Laval University Hospital Research Center, Ste-Foy, Québec, G1V 4G2, Canada
and 2Department of Kinesiology, University of Waterloo, Waterloo,
Ontario, N2L 3G1, Canada
RUNNING TITLE : Two distinct contraction-responsive GLUT4 pools in muscle *Address for correspondence and reprint requests: André Marette, Ph.D. Department of Physiology & Lipid Research Unit Laval University Hospital Res. Center 2705, Laurier Blvd Ste-Foy, Québec, Canada G1V 4G2 Tel: (418) 656-4141 (ext. 7549) Fax: (418) 654-2176 Email: [email protected] * Diabetes 49 : 183-189, 2000
67
ABSTRACT
Insulin and contraction increase glucose transport in an additive fashion in skeletal
muscle. However, it is still unclear whether they do so by inducing the recruitment of GLUT4
transporters from the same or distinct intracellular compartments to the plasma membrane and
the T-tubules. Using the transferrin receptor as a recognized marker of recycling endosomes,
we have examined whether insulin and/or contraction recruit GLUT4 from this pool to either
the plasma membranes or T-tubules, isolated by subcellular fractionation of perfused hindlimb
muscles. Either stimulus independently increased GLUT4 translocation from an intracellular
fraction to both the plasma membrane and T-tubules. The combination of insulin and
contraction induced a marked (~3-fold) and almost fully additive increase in GLUT4 content
but only in the plasma membrane. Insulin did not stimulate transferrin receptor recruitment
from the GLUT4-containing intracellular fraction to either the plasma membrane or the T-
tubules. In contrast, contraction stimulated the recruitment of the transferrin receptor from the
same GLUT4-containing intracellular fraction to the plasma membrane but not to the T-
tubules. Contraction-induced recruitment of the transferrin receptor was also observed from
immunopurified GLUT4 vesicles. It is concluded that muscle contraction stimulates
translocation of GLUT4 from two distinct intracellular compartments: 1) a population of
recycling endosomes that is selectively recruited to the plasma membrane, and 2) from
GLUT4 storage vesicles that are also insulin-responsive, and recruited to both the plasma
membrane and the T-tubules. The lack of additive translocation of GLUT4 to the T-tubules
may be linked to the failure of GLUT4-containing recycling endosomes to be recruited to
these structures.
68
INTRODUCTION
It is known that the maximal effects of insulin and contraction on glucose transport are
additive in mammalian skeletal muscle, strongly suggesting that these stimuli act via separate
pathways (1, 2). When skeletal muscle is activated by either of these stimuli, GLUT4-enriched
vesicles are translocated from intracellular storage site(s) to the cell surface by a mechanism
that is still not fully understood. One important question that remains unclear is whether
insulin and contraction recruit GLUT4 from one or more intracellular storage compartments. It
has been suggested that these stimuli induce the translocation of GLUT4 from different
intracellular pools in skeletal muscle, based on the indirect observations made in some studies
that exercise or muscle contraction failed to reduce GLUT4 content in an insulin-sensitive
intracellular membrane fraction (3-7). However, other studies showed that exercise did
decrease GLUT4 content in intracellular membrane fractions that are also responsive to insulin
(8-11). It is possible that the latter intracellular membrane fractions contained a mixture of
distinct exercise-sensitive and insulin-sensitive GLUT4 pools which would explain their
responsiveness to both stimuli. The existence of more than one intracellular GLUT4 storage
compartments in muscle cells is also supported by the work of Coderre et al. (12), who
reported the isolation of distinct insulin- and exercise-sensitive GLUT4 intracellular pools,
based on differences in sedimentation coefficients determined by sucrose velocity gradient
analysis. Analysis of these membrane pools by SDS-PAGE and silver staining have shown
that they have a similar polypeptide composition. Thus, while there is some evidence to
suggest that there are distinct insulin- and contraction-sensitive intracellular GLUT4 pools, it
is not known whether there is a selective recruitment of GLUT4 from these pools, by either
insulin or contraction, to the plasma membrane or the T-tubules.
Immunoelectron microscopic studies have shown that GLUT4 is mainly found in
tubulo-vesicular organelles clustered in the cytoplasm of fat and muscle cells. However, a
significant proportion of GLUT4 can also be observed in several structures thought to
represent elements of the endocytic pathway (13-15). The localization of GLUT4 into
endosomal structures has been recently supported by the observation that a substantial part of
GLUT4 is co-localized with endosomal markers such as the transferrin receptor (TfR) and
69
IGF-II/mannose-6-phosphate receptor (16, 17). Accordingly, compartmental ablation of TfR-
containing endosomes, with a transferrin-horseradish peroxidase conjugate, revealed that
about 40% of intracellular GLUT4 is co-localized with the TfR in 3T3-L1 adipocytes (18).
Whether these TfR-associated GLUT4 vesicles are recruited by insulin is still unclear.
Kandror and Pilch (17) recently reported that GLUT4 recycles along with the TfR between the
endosomal compartment and the plasma membrane in rat adipose cells. On the other hand,
ablation of the TfR-positive compartment with the transferrin-horseradish peroxidase
conjugate delayed but did not block GLUT4 appearance at the plasma membrane of
adipocytes (19). This suggest that in 3T3-L1 adipocytes, insulin rapidly activates the
movement of GLUT4-containing endocytic vesicles to the cell surface, or alternatively, that
GLUT4 traffic through the endosomal system prior to its arrival at the plasma membrane.
Few studies have been conducted in skeletal muscle and the results are more
controversal. Subcellular fractionation and morphological studies have previously shown that
GLUT4 and the TfR are not (20) or partly co-localized in muscle (16, 21, 22). Whereas insulin
was found to cause a small but detectable translocation of the TfR in one study (16), it failed
to do so in other studies (21, 22). On the other hand, muscular contraction was reported to
increase TfR content in a fraction enriched with both plasma membranes and T-tubules (22). It
is therefore possible that insulin and/or contraction mobilize GLUT4 from endocytic vesicles
in skeletal muscle.
In previous studies, we have shown that insulin and contraction recruit GLUT4 to the
plasma membrane and T-tubules (10, 11, 23). Whether GLUT4 is selectively recruited from
the endocytic vesicles to either cell surface compartments is not known. Therefore, in the
present study, we have compared the independent effects of insulin and/or contraction as well
as the combined effects of these stimuli on the subcellular distribution of GLUT4 and the TfR
using a unique subcellular fractionation protocol that allows the isolation and separation of
plasma membranes, T-tubules and GLUT4-enriched intracellular membranes in distinct
fractions. Our results are consistent with the existence of two distinct contraction-sensitive
intracellular GLUT4 vesicle populations that are recruited to the plasma membrane (TfR-
70
positive) or the T-tubules (TfR-negative) in skeletal muscle. Moreover, only the TfR-negative
GLUT4 vesicles are recruited by insulin to both the plasma membrane and the T-tubules.
71
MATERIALS AND METHODS Insulin and/or contraction treatment protocols
Overnight fasted male Sprague-Dawley rats (275-325 g body weight) were used in
these studies. Rats were anaesthetized with an intraperitoneal injection of sodium
pentobarbital (65 mg/kg body wt). They were surgically prepared for hindquarter perfusion as
described previously (24) and heparinized with 1000 IU heparin injected into the inferior vena
cava. Then, catheters were inserted into their aorta and inferior vena cava. The rats were killed
by injecting 0.5 ml of 0.76 M KCl and were immediately placed in the perfusion apparatus.
Thereafter, the perfusion procedure was carried out as described by us (24). The perfusate was
a glucose free medium containing Krebs-Henseleit solution, bovine erythrocytes (obtained in a
local abattoir 1-2 days before perfusion) at a hematocrit of 30%, 0.15 mM pyruvate, and 5%
bovine serum albumin (BSA) dialysed (cutoff at 10-15 kDa) for 48 h with Krebs-Henseleit
solution. The perfusate was gassed with 95% O2 and 5% CO2 and adjusted with NaOH to pH
7.45. Perfusate temperature was maintained at 37°C. The first 25 ml of the perfusate which
passed through the preparation was discarded, and then the perfusate was delivered at a flow
of 12.5 ml/min.
In half of the experiments, hindquarters were perfused for 15 min before insulin (20
mU/ml, cell-free medium) was added for the last 25 min of perfusion. A 40 min perfusion
period was also used in the contraction experiments. However, in these groups, muscles were
perfused for 29 min in the absence of insulin. During the last 11 minutes indirect muscle
stimulation, via the sciatic nerve, was performed for 2 x 5 min bouts with 1 min rest (200 ms
trains of 100 Hz, 0.1 ms duration delivered every second at 50-100 V). To induce isometric
force production, the knee joint was fixed with a steel pin under the tibiopatellar ligament and
the achilles tendon was attached to an immovable hook. Immediatly after insulin and/or
contraction stimulation period, skeletal muscles (gactrocnemius, soleus and plantaris) were
removed, frozen in liquid nitrogen and stored at -80° C.
72
Glucose transport measurements
Glucose transport was measured as previously described (24, 25), using near-saturating
concentrations of 3-O-methyl-D-glucose (3H-3-O-MG; 40 mM, 8µCi). Extracellular space
was determined by the inclusion of sorbitol (2mM, 16 µCi 14C-sorbitol) in the perfusate. At
the end of the perfusion periods, the red and white gasctrocnemius, and soleus muscles were
removed, trimmed for connective tissue and visible blood, and frozen in liquid nitrogen.
Samples were stored at -80 °C until analysis. The muscle samples were homogenized in ice-
cold perchloric acid (0.6 N) and precipitated by centrifugation. The supernatant was used for
the determination of transport.
Glucose transport was determined in muscles (red and white gactrocnemius, and
soleus) with well known muscle fiber composition. This permitted calculation of the glucose
transport across the entire perfused muscle bed that was sampled for the membrane studies
(see below). Calculations of glucose transport were based on the mass of selected muscle
fibers within each muscle as reported in detail elsewhere (26).
Subcellular membrane fractionation
Plasma membranes, transverse tubules and intracellular membranes were isolated from
7-8 g of muscles (gactrocnemius, soleus and plantaris) using the procedure developed in our
laboratory (23, 27) . This subcellular fractionation protocol has been extensively characterized
with immunologic and enzymatic markers (10, 11, 23, 27). In brief, this technique allows the
simultaneous and separated isolation of plasma membrane and transverse tubule vesicles from
the same muscle homogenate. In addition, the use of a strong salt treatment (lithium bromide)
yields an intracellular fraction that is greatly enriched with GLUT4 but devoid of plasma
membranes and transverse tubule markers. Membrane protein concentrations were determined
by the bicinchoninic acid assay (Pierce) using bovine serum albumin as standard. 5'-
nucleotidase activity was determined as previously described (23, 27).
73
Immunoadsorption of GLUT4 containing vesicles
For each sample, 80 µl of Dynabeads M-280 sheep anti-rabbit IgG (Dynal, Lake
Success, NY) were washed twice for 5 min with 400µl of PBS (pH 7.4) containing 0.1% non-
fat milk (NFM), once with 0.2M TRIS (pH 7.4) for 4 hours at 37°C and rinsed twice with
PBS/NFM for 5 min at 4°C. The coated beads were coupled to the GLUT4 antibody as
follows: for each sample, 5 µl of GLUT4 polyclonal antibody (or pre-immune serum) were
incubated with the beads overnight at 4°C with constant rotation. The coated beads were then
washed 4 times with 400µl of PBS/NFM to remove unbound antibodies and were incubated
again overnight at 4°C with 50µg of the intracellular membrane fraction (L-IM) in a volume
adjusted to 500µl with PBS/NFM containing proteases inhibitors. The beads were washed
three times with PBS/NFM containing protease inhibitors and separated from unbound
material by attraction to the magnet (Dynal). The supernatant (unbound material) and washes
were pooled and centrifuged at 190,000 x g for 1 hour. The sedimented unbound material (Sn)
and the beads (IP) were resuspended in Laemmli sample buffer and incubated 1 hour at 37°C
before SDS-PAGE and Western blot analysis.
Western blot analysis
Membranes (10-25µg) were subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) on 7.5 or 13 % polyacrylamide gels as described by Laemmli
(28) and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) filter membranes
for 2 h. PVDF membranes were then incubated for 1 h at room temperature with buffer I (50
mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) containing 0.04% NP-40 and 0.02% Tween-20 and 3%
bovine serum albumin (fatty acid free BSA, Sigma, St -Louis, MO), followed by overnight
incubation at 4°C with primary antibodies as described in figure legends. The PVDF
membranes were then washed for 30 min, followed by a 1 h incubation with either anti-mouse
or anti-rabbit immunoglobulin G conjugated to horseradish peroxidase (NEN Life Science,
Boston, USA) in buffer I containing 1% BSA. The PVDF membranes were washed for 30 min
in buffer I, and the immunoreactive bands detected by the enhanced chemiluminescence
74
method. A muscle standard (an unrelated crude membrane fraction) was run on every gel for
comparison of samples from different immunoblots.
Antibodies
A monoclonal antibody generated against the transferrin receptor was purchased from
Zymed Laboratories inc. (San Francisco, CA). Polyclonal antibodies against the GLUT4
glucose transporter and annexin II were purchased from Biogenesis (Brentwood, NH) and
Santa Cruz Biotech. inc (Santa Cruz, CA), respectively. A monoclonal (IIF7) antibody
generated against the a1-subunit of the dihydropyridine receptor (DHPr) was kindly provided
by Dr. K. Campbell (University of Iowa). The monoclonal antibody Mck-1 against the a1-
subunit of the Na/K-ATPase was a kind gift from Dr. K. Sweadner (Massachusetts General
Hospital).
Data analysis
Autoradiographs were analysed by laser scanning densitometry using a tabletop Agfa
scanner (Arcus II, Agfa-Gavaert NV, Belgium) and quantified with the National Institutes of
Health Image program. All data are expressed as means ± SE. The effect of insulin and/or
contraction on the measured parameters were compared by a two-way analysis of variance
(ANOVA).
75
RESULTS
The individual or combined effects of insulin or electrical stimulated-contraction on
glucose transport are shown in Table 1. Consistent with previous findings, those stimuli
induced an additive increase in glucose transport in the same hindlimb muscles (i. e.
gactrocnemius, soleus and plantaris muscles) that were sampled for subcellular fractionation
experiments.
TABLE 1
Individual and combined effects of insulin and electrically-stimulated contraction on 3-O-MG transport by the perfused lower leg muscle bed.
Conditions Glucose transport (µmol 3-O-MG/g/5min)
Control 0.53 ± 0.26 a Insulin 2.79 ± 0.19 b Electrical stimulation 3.22 ± 0.37 b Insulin + electrical stimulation 5.22 ± 0.64 c
3-O-MG transport was measured and calculated as described in Material and Methods. Values not sharing a common superscript are different at p < 0.05.
We next investigated the effect of insulin and electrical stimulation on GLUT4
subcellular distribution in mixed hindlimb muscles (gactrocnemius, soleus and plantaris).
Surface and intracellular membrane compartments of resting and stimulated muscles were
isolated from several rats and the identity of the fractions were confirmed using specific
enzymatic and immunologic markers (Table 2 and Figure 1). As expected, the enzymatic
activity of 5'-nucleotidase was markedly enriched in plasma membrane fractions (Table 2).
This activity was small in T-tubule-enriched fractions and non-detectable in intracellular
membranes. The a1-subunit of the Na/K-ATPase, an immunologic marker of the plasma
membrane, was also predominantly enriched in the plasma membrane fraction in all muscle
76
groups (Figure 1). In contrast, the DHPr was mainly detected in T-tubule fractions, in
accordance with the specific localization of this protein to the tubular extensions in skeletal
muscle. Importantly, the L-IM fraction was depleted of these muscle cell surface markers. The
subcellular distribution of enzymatic and immunologic markers is in good agreement with our
previous observations (10, 11, 23, 27). The distribution or the content of the above markers
were in general not affected by insulin and/or electrical stimulation. Only very minor
differences in plasma membrane recovery and in the activity of 5'-nucleotisase activity of the
T-tubule fractions were observed.
C I E I+E C I E I+E
GLUT4C I E I+E
DHPr
α1-Na/K
PM TT L-IM
TfR
200 __
__
__
100
100
__46
FIGURE 1 : Representative Western Blots showing the effects of insulin, contraction and
their combined effects on dihydropyridine receptor (DHPr), α1-Na/K ATPase,
transferrin receptor (TfR) and GLUT4 content in plasma membranes (PM), transverse
tubules (TT) and LiBr-released intracellular menbrane (L-IM) fractions. 10-25 µg of
membrane proteins isolated from control (C), insulin (I), electrically-stimulated contraction
(E) and insulin + contraction (I + E) were used for Western Blot analysis, as described in
Methods. Immunoreactive bands were detected by the enhanced chemiluminescence method.
Molecular weight standards are shown at the left.
77
TABLE 2
Protein yield and 5' nucleotidase enzymatic activity of isolated membranes fractions .
Fractions Conditions Protein recoveries 5'-nucleotidase (µg/mg CUM) (nmol . mg-1 . min -1)
PM Control 20.07 ± 1.06 709.47 + 78.27 Insulin 16.62 ± 0.85 620.75 + 56.72 Contraction 14.68 ± 0.57 586.78 + 37.54 Insulin + contraction 13.52 ± 0.76 622.88 + 63.32
T-tubules Control 169.23 ± 15.28 84.12 + 4.77
Insulin 179.57 ± 8.02 72.83 + 5.13 Contraction 189.03 ± 10.31 55.21 + 3.42 Insulin + contraction 209.14 ± 11.86 53.94 + 8.29 Control 42.74 ± 9.56 ND
L-IM Insulin 34.13 ± 5.84 ND Contraction 44.71 ± 7.08 ND Insulin + contraction 31.64 ± 6.33 ND
Datas are means ± SE of 8 to 10 individual membrane preparations. ND : non detectable PM : plasma membranes, L-IM : LiBr-released intracellular membranes, CUM : crude unfractionated membranes
The subcellular distribution of GLUT4 and the TfR, as well as the effects of insulin
and/or contraction on the content of these proteins in surface and internal fractions are shown
in Figures 1 and 2. Representative Western blots of immunoreactive GLUT4 or TfR contents
are illustrated in Figure 1 whereas scanning data of relative concentrations of these proteins in
the different fractions from control and stimulated muscles are presented in Figure 2. As
expected, GLUT4 was mainly enriched in the L-IM fraction in resting muscle. Interestingly,
the TfR, a well-recognized marker of recycling endosomes, was also found to be enriched in
this GLUT4-enriched intracellular fraction.
78
Insulin or contraction both stimulated the recruitment of GLUT4 from the L-IM
fraction to the plasma membrane and T-tubule-enriched fractions. When used in combination,
insulin and contraction resulted in a significantly additive increase in GLUT4 content in the
plasma membranes. In that situation, GLUT4 was amost tripled in the plasma membrane as
compared to resting condition (Figure 2A, left panel). In marked contrast, the combination of
these stimuli failed to increase T-tubule GLUT4 content more than their individual effects
(Figure 2A, middle panel). Consistent with the lack of additive GLUT4 translocation to the
tubular fraction, the combination of insulin and contraction caused only a small but not
significant further reduction in GLUT4 protein amounts in the L-IM fraction (Figure 2A, right
panel).
The effects of these stimuli on TfR subcellular distribution were more selective than
those observed on GLUT4. Muscle contraction stimulated TfR translocation from the L-IM
fraction to the plasma membranes but not to the T-tubules (Figures 1 and 2B). Furthermore,
insulin failed to change the distribution of the TfR in the muscle. In accordance with the
selective effects of contraction on TfR distribution, the combined effects of insulin and
contraction was not different than that of contraction alone.
79
GLU
T4 c
onte
nt(r
el. d
ensi
t. un
its)
0
100
0
100
200
50
150
50
150
200
200
400
600
800
0
50
100
150
0
PM L-IMTT
C I E I+E C I E I+EC I E I+E
C I E I+E
PM L-IMTT
0
100
200
300
C I E I+E
400
0
200
400
600
C I E I+E
* **
*
*
+
*
*
*
**
**
TfR
con
tent
(rel
. den
sit.
units
)
A
B
FIGURE 2 : (A) GLUT4 and (B) transferrin receptor (TfR) content in plasma membrane
(PM), T-tubule (TT) and intracellular (L-IM) membrane fractions isolated from control
(C), insulin (I), contraction (E) and insulin + contraction (I + E) muscles. Densitometric
values are means ± SE of data obtained from 8-11 individual membrane preparations each
performed with muscles from 3 animals in each experimental groups. * p < 0.05 vs controls, +
p < 0.05 vs insulin or contraction values alone.
80
Contraction may stimulate GLUT4 and TfR translocation from the same or different
vesicle populations in the L-IM fraction. To address this important issue, we have purified
GLUT4 vesicles from this fraction by immunoadsorption. As can be seen in Figure 3, GLUT4
vesicles (IP fraction) were successfully purified from the L-IM fraction using this procedure.
The overall efficiency of GLUT4 vesicle immunoadsorption was 75±5%, 77±11%, and
81±16% in control, insulin-, and contraction-stimulated conditions, respectively (mean±SE,
n=3-6) in these experiments. A significant proportion (58±6%) of the TfR protein was found
to co-purify with the GLUT4 vesicles in unstimulated muscle. In contrast, annexin II, a protein
believed to be involved in endosome binding and/or fusion (29, 30), was mostly recovered in
the GLUT4-depleted vesicles of the unadsorbed supernatant fraction (Sn). Control
experiments with pre-immune serum revealed that non-specific immunoadsorption of GLUT4
was <10% (data not shown). Muscle contraction reduced TfR content in both purified GLUT4
vesicles and in the unadsorbed fraction without any detectable change in annexin II levels. In
marked contrast, insulin failed to affect the TfR content in the GLUT4 vesicles despite the fact
that it caused a significant reduction in GLUT4 in the same vesicles. A small but not
statistically significant reduction in TfR levels was observed in the GLUT4-depleted vesicles
of the unadsorbed fraction from insulin-treated muscle. Interestingly, the amount of TfR co-
isolated with GLUT4 was not changed by insulin (57±2% vs 58±6% for controls) but was
significantly augmented by contraction (83±11%, p<0.05 vs controls by ANOVA).
81
0
20
40
60
80
100
120
140ControlInsulinContraction
GLU
T4 o
r TfR
con
tent
(rel
ativ
e de
nsito
met
ric u
nits
)
IP
GLUT4 TfR
Sn SnIP
C I E
GLUT4
TfR
__46
__100
ANN-II__36
C I E
IP Sn
FIGURE 3 : Effects of insulin or contraction on GLUT4, TfR, or annexin II in
immunoadsorbed GLUT4 vesicles. (A) Representative Western Blot showing the
subcellular distribution of GLUT4, TfR, and annexin II in immunoisolated GLUT4-
containing vesicles (IP) and unadsorbed fraction (Sn) isolated from control (C), insulin
(I) or contraction (E) stimulated muscles. Immunoadsorption of GLUT4-containing
vesicles was performed as described under “Materials and Methods”. 50 µg of intracellular
membranes fraction (L-IM) were subjected to immunoadsorption using sheep anti-rabbit IgG
beads coupled to an anti-GLUT4 polyclonal antibody. IP and Sn fractions were then analysed
for GLUT4 and TfR by immunoblotting. Molecular weight standards are shown at the left. (B)
Mean±SE of 3-6 individual immunoadsorption experiments with L-IM membranes isolated
from different animals.
82
DISCUSSION
The principal objective of the present study was to determine whether insulin and
contraction induce the recruitment of GLUT4 transporters from the same or distinct
intracellular compartments to the plasma membrane and the T-tubules. Our hypothesis was
that either one or both of these stimuli might induce translocation of GLUT4 from recycling
endosomes as well as from the unique GLUT4 storage vesicular compartment that is
segregated from the endosomal system. This was based on previous studies showing that
GLUT4 and the TfR are partly co-localized in adipocytes and skeletal muscle, suggesting that
the transporter is targetted to this recycling pathway in these cells (16-18, 21). Using the TfR
as a paradigm for recycling plasma membrane receptors, we confirmed that GLUT4 recycles
at least in part through this pathway in muscle cells. Indeed, we found that GLUT4 and the
TfR are co-localized in the transporter-enriched L-IM fraction and that ~60% of the TfR could
be brought down by immunoadsorption of GLUT4 vesicles from unstimulated muscle. The
vesicular association of intracellular GLUT4 and TfR reported here is in the same range of
values reported in rat adipocytes (61%) and 3T3-L1 adipocytes (40%) (17, 18). On the other
hand, the extent of co-localization of these proteins is much greater than that previously
reported in two other studies in which intracellular membrane fractions were isolated from
skeletal muscle (~30%) (16, 21). However, it should be noted that different muscle
fractionation protocols were used in this and previous studies. Both TfR-negative and TfR-
positive GLUT4 intracellular fractions has been previously isolated by Aledo et al. (20, 21),
but the latter fraction was shown to be unresponsive to either insulin or contraction (4, 5, 20,
21), suggesting that the TfR-containing GLUT4 vesicles isolated in this and Aledo's studies
are of different nature. On the other hand, the co-localization of GLUT4 and TfR reported here
is in closer agreement with the recent observation that 52% of GLUT4 staining overlapped
with TfR staining in whole muscle fibers by confocal microscopy (22).
It was found that contraction, but not insulin, stimulates TfR translocation to the
plasma membrane. These results are in line with those of Ploug and colleagues who also
reported that contraction redistributed the TfR to the cell surface but that insulin was without
effect (22). In the latter study, however, it was not possible to determine if the TfR was
83
recruited from GLUT4-containing or GLUT4-depleted endosomal vesicles since the degree of
association between these two proteins was assessed at the light microscopy level. The
immunoadsorption experiments shown in Figure 3 indicate that the TfR is recruited both from
GLUT4-containing vesicles as well as from transporter-depleted vesicles. Thus, based on the
premise that the TfR is a representative marker of recycling endosomes, it can be concluded
that GLUT4 is localized to a subpopulation of recycling endosomes and that contraction
increases GLUT4 and the TfR at the muscle plasma membrane at least in part through a
selective mobilization of these vesicles. The endosomal compartment is known to be a
complex structure and different endosome populations have been previously identified on the
pathway of TfR recycling in CHO cells (31). The complexity of the endosomal apparatus has
also been documented in adipocytes, based on the finding that the TfR and insulin receptor are
recycled through different endosomes (17). More studies will be needed to determine whether
the GLUT4-containing and GLUT4-depleted recycling vesicles identified in the present study
represent structurally distinct endosomes that share the TfR along its recycling pathway, or if
these vesicles can be further distinguish on the basis of some functional differences. We would
favor the latter hypothesis, based on the observation that contraction recruits the TfR more
dramatically from the GLUT4-depleted recycling endosomes than from GLUT4-positive
vesicles.
Insulin failed to affect TfR distribution in the present study. Only a small but variable
decrease in TfR content was observed in the GLUT4-depleted vesicles from the supernatant of
the immunoadsorptions. This decrease was too small to be detected in the L-IM fraction and
this may explain why we could not detect an increase in TfR levels in the plasma membrane.
We found a similar lack of TfR redistribution in muscle that has been stimulated with insulin
for only 4 min (in vivo injection), ruling out the possibility that insulin may induce greater
effect on TfR recycling at earlier time points (data not shown). A lack of significant effect of
insulin on TfR recycling is consistent with recent reports that insulin failed to induce TfR
translocation (22) or only caused a marginal redistribution of the receptor in skeletal muscle
(16). and with the fact that the hormone increases cell surface appearance of endosomal
proteins several-fold less than GLUT4 in adipocytes (32, 33). This small insulin-dependent
reduction in TfR content from the GLUT4-depleted vesicles may represent the known
84
stimulation by insulin of constitutive recycling of cell surface receptors within the endosomal
system (32, 33). The endosomal nature of this GLUT4-depleted fraction is supported by the
presence of annexin II in these vesicles. The lack of effect of insulin on annexin II is
consistent with a previous study conducted in adipocytes (34). These data further underscore
the complexity of the endosomal system and they also suggest that this multicomponent
organelle has evolved differently in skeletal muscle and adipose cells.
Although GLUT4 and the TfR were recruited to the cell surface by contraction
stimulation, only the former was increased in both the plasma membrane and the T-tubules,
the two cell surface components of the myocytes. The fact that GLUT4 was still recruited to
the T-tubules in contracted muscle despite the lack of TfR mobilization indicate that a TfR-
negative GLUT4 storage pool is translocated to the tubules by contraction. The simplest
interpretation of these data is therefore that contraction mobilizes two distinct intracellular
vesicle populations: a TfR-positive population of vesicles that is only recruited to the plasma
membrane, and a TfR-negative population of vesicles that is translocated to the T-tubules.
However, we cannot rule out that the TfR-negative GLUT4 vesicles are also recruited to the
plasma membrane by contraction. It is also not possible to resolve from the present results if
contraction and insulin induce the translocation of the same or different TfR-negative GLUT4
vesicles. On the other hand, the lack of additive effect of these stimuli on GLUT4
translocation to the T-tubules suggest that the same vesicles are mobilized and that the lack of
additive translocation of GLUT4 to these structures is linked to the failure of TfR-positive
GLUT4 vesicles to be recruited to the tubules.
It was observed that the amount of TfR co-isolated with GLUT4 was significantly
augmented in contraction-stimulated muscles but not after insulin treatment. There are two
possible explanations for the finding that contraction increased GLUT4-TfR vesicular
association. First, contraction may have induced the translocation of more TfR-negative
GLUT4 vesicles (to the plasma membranes and/or to the T-tubules) as compared to its
selective effect to recruit TfR-positive recycling endosomes to the plasma membrane. Another
possibility is that contraction caused the fusion of TfR-negative GLUT4 storage vesicles with
TfR-positive recycling endosomes thereby enhancing the co-localization of these two proteins.
85
This latter possibility would be compatible with a model in which the contraction-responsive
GLUT4 vesicles that are recruited to the plasma membrane traffic through the TfR-containing
recycling endosomes.
The physiological relevance of this unique action of contraction to activate the
translocation of GLUT4 from recycling endosomes remains speculative at this time. One
possibility is that contracting myofibers need to obtain glucose very rapidly in order to cope
with the energy demands, which are suspected to increase dramatically when contraction is
initiated. Interestingly, studies in adipocytes have shown that the externalization rate of the
TfR and other recycling proteins is faster than that of GLUT4 (35, 36). Accordingly, Martin et
al. recently reported that ablation of the recycling endosomal system with a transferrin-
horseradish peroxidase conjugate delayed (but did not block) insulin-stimulated mobilization
of GLUT4 to the plasma membrane of fat cells (19). These data suggest that the GLUT4
located in this recycling compartment is likely to reach the cell surface more rapidly than
transporters not residing in it. Such a rapidly mobilizable GLUT4 pool would allow myofibers
to quickly increased glucose transport when contraction is triggered. A need for a rapid
stimulation of glucose transport is less critical when insulin is the only stimulus, presumably
because glucose is not used as an immediate substrate but is mainly stored as glycogen in this
condition.
It is interesting that a significant proportion of the TfR in the L-IM fraction is recruited
from vesicles devoid of GLUT4 in working muscle. This suggest that the effect of contraction
on TfR redistribution is not merely a consequence of moving GLUT4-containing vesicles to
the cell surface. Rather, these results may suggest that muscular contraction stimulates the
recycling of the TfR from multiple recycling endosomes, some of which also containing
GLUT4. The activation of TfR recycling in contracted muscle may be important to maintain
the levels and activities or iron-containing proteins involved in the respiratory capacity of
muscle mitochondria. Indeed, iron deficiency has been reported to impair muscle performance
and to decrease the capacity for aerobic metabolism by reducing the concentrations of
myoglobin and several iron-containing proteins (ex. cytochrome C oxidase) (37-39). Thus,
86
recycling endosomes may fulfill the dual functions of providing both glucose and transferrin
to contracting myofibers.
In summary, the present data show that contraction stimulates the translocation of
GLUT4 from at least two distinct populations of intracellular vesicles : one population of TfR-
enriched recycling vesicles that are selectively translocated to the plasma membrane, and one
population of TfR-negative vesicles that are recruited to the T-tubules (and possibly the
plasma membrane) and that may represent a specialized GLUT4 storage compartment. Insulin
failed to activate GLUT4 translocation from the TfR-containing recycling vesicles. Our data
further suggest that the lack of additive translocation of GLUT4 to the T-tubules may be
linked to the failure of TfR-positive GLUT4 vesicles to be recruited to the tubules.
87
ACKNOWLEDGMENTS
The authors wish to thank Drs Claude H. Côté and Benoît Lapointe for their assistance
with the electrical stimulation protocol, and Bruno Marcotte for expert technical assistance.
This work was supported by grants from the Canadian Diabetes Association to A. M. and A.
B. (in honour of George Goodwin) and from the Natural Sciences and Engineering Research
Council of Canada (A. B.). K. Lemieux and L. Dombrowski were supported by the Georges
Phénix foundation (K. L.), the Medical Research Council (K. L.) and FRSQ-FCAR (L. D.)
studentships. A. Marette was supported by scholarships from the Canadian Medical Research
Council and the Fonds de la Recherche en Santé du Québec.
88
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93
CHAPITRE 2 :
Un activateur de la kinase activée par l'AMP, le AICAR, ne stimule pas la translocation de GLUT4 aux tubules-T mais active la p38 MAPK α et β dans
le muscle squelettique.
94
RÉSUMÉ Il a été proposé que la kinase activéee par l'AMP (AMPK) est impliquée dans l'effet
stimulateur de l'exercice ou de la contraction musculaire sur le transport musculaire du
glucose. En effet, certains travaux ont révèlé que la stimulation du transport du glucose et de la
translocation de GLUT4 par la contraction musculaire est en partie dépendante de l'activation
de l'AMPK. D'autre part, il a été démontré que la contraction musculaire active la p38 MAPK
(p38 Mitogen Activated Protein Kinase), une enzyme possiblement impliquée dans la
régulation de l'activité intrinsèque de GLUT4. Dans cette étude, nous avons vérifié l'effet d'un
agent activateur de l'AMPK, le AICAR, sur la translocation de GLUT4 et l'activation de la p38
MAPK dans le muscle squelettique de rat. Nos résultats démontrent que l'infusion de AICAR
lors d'un clamp euglycémique active la captation de glucose au niveau de l'organisme entier et
au niveau du muscle squelettique. Le fractionnement membranaire de muscles a révélé que le
AICAR stimule sélectivement la translocation de GLUT4 au niveau de la membrane
plasmique et non au niveau des tubules-T. Le AICAR induit également le recrutement du
récepteur de la transferrine (TfR) à partir d'un réservoir interne seulement à la membrane
plasmique. Au niveau du muscle isolé, nos données démontrent que le AICAR stimule
l'activité de la p38 MAPKα et β , cette activation étant temporellement associée à l'activation
de l'AMPK et du transport du glucose. De plus, le traitement de muscles isolés avec un
inhibiteur de la p38 MAPK, le SB203580, inhibe complètement le transport du glucose
stimulé par le AICAR. Cependant, l'activation de l'AMPK par le AICAR n'est pas inhibée par
le traitement avec le SB203580. Les résultats de cette étude indiquent donc que le AICAR
augmente le transport du glucose par au moins deux types de mécanismes : d'une part, en
activant la translocation de GLUT4 sélectivement à la membrane plasmique, et d'autre part, en
stimulant l'activité de la p38 MAPK α et β, celle-ci étant possiblement impliquée dans la
stimulation de l'activité intrinsèque de GLUT4 à la surface cellulaire. Nos données révèlent
également que l'activation de l'AMPK par le AICAR précède l'activation de la p38 MAPK
dans la cascade intracellulaire par laquelle le AICAR stimule le transport du glucose dans le
muscle squelettique.
95
The AMP-activated protein kinase activator AICAR does not induce GLUT4 translocation to transverse tubules but activates p38 mitogen-activated protein kinases α and β in
skeletal muscle
Kathleen Lemieux1, Daniel Konrad2, Amira Klip2, and André Marette1*
1 Department of Anatomy and Physiology, Lipid Research Unit, Laval University Hospital Research Center, Ste-Foy, Québec, G1V 4G2, Canada
and 2 Program in Cell Biology, Hospital for Sick Children, Toronto, Ontario,
M5G 1X8, Canada RUNNING TITLE: AICAR stimulates p38 MAPK in muscle *Address for correspondence and reprint requests::
Dr. André Marette Department of Physiology & Lipid Research Unit Laval University Hospital Research Center 2705, Laurier Bld Ste-Foy, (Québec), Canada, G1V 4G2 Tel: (418) 656-4141 ext. 7549 Fax: (418) 654-2176 E-mail:[email protected]
* Submitted to FASEB Journal, 2002
96
ABSTRACT
The AMP-activated protein kinase (AMP kinase) pathway participates in the metabolic
effects of contraction on muscle glucose uptake. We have previously shown that contraction
increases both GLUT4 translocation to the cell surface and p38 mitogen-activated protein
kinase (p38 MAPK) activity. The latter pathway may be involved in the activation of GLUT4.
Here we investigated whether the AMP kinase activator AICAR increases glucose uptake by
inducing translocation of GLUT4 and/or by activating the p38 MAPK pathway. AICAR
infusion into glucose-clamped rats increased muscle glucose uptake and GLUT4 translocation
from an intracellular fraction to the plasma membrane but not to T-tubules. AICAR also
caused recruitment of the transferrin receptor to the plasma membrane and increased [125I]-
transferrin uptake in isolated muscle. In vitro kinase assays showed that AICAR activated both
p38 MAPKα and β (1.6 to 1.8-fold) with a time-course identical to that of stimulation of AMP
kinase and glucose transport. The p38 MAPK inhibitor SB203580 abrogated the stimulatory
effect of AICAR on glucose uptake. These results suggest that AICAR increases muscle
glucose uptake by two mechanisms : 1) inducing selective recruitment of GLUT4 to the
plasma membrane, and 2) activating both p38 MAPKα and β, which may be involved in the
activation of GLUT4.
97
INTRODUCTION
Muscle contraction increases glucose uptake and utilization by triggerring translocation
of GLUT4 glucose transporters from intracellular vesicles to both the plasma membrane and
T-tubule sarcolemmal domains of muscle fibers (1, 2). Recent studies have suggested a role
for AMP-activated protein kinase (AMP kinase) in the stimulatory effects of contraction on
glucose uptake. Thus, exercise (3, 4) or electrically-induced contractions (5-7) increases the
activity of AMP kinase, which is active as a heterotrimer consisting of one catalytic subunit
(α) and two noncatalytic subunits (β,γ) (8, 9). Moreover, several studies have shown that the
cell-permeable AMP kinase activator 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside
(AICAR) stimulates glucose uptake in fast-twitch muscles and that its effect is not additive to
that of contraction (5, 10-12). Further evidence for a role of AMP kinase in contraction-
induced glucose uptake came from the work of Mu et al. (13) who showed that expression of a
dominant inhibitory mutant of AMP kinase in transgenic mouse muscle reduced contraction-
induced glucose uptake by 30-40%. AICAR has been previously reported to increase GLUT4
translocation to the plasma membrane in hindlimb muscles (14). However, it is still unknown
if AICAR also triggers the recruitment of GLUT4 to the T-tubules, which represent 60 to 80%
of the total cell surface area in skeletal muscle fibers (15, 16).
Exercise and contraction also activate p38 MAPK in rat skeletal muscle (17-20). We
have recently showed that incubation of isolated extensor digitorum longus (EDL) muscles
with the p38 MAPK inhibitor SB203580 reduced contraction-induced glucose uptake by ~
50% (20). SB203580 inhibits insulin-induced glucose transport in both L6 muscle cells and
3T3-L1 adipocytes, without affecting GLUT4 exposure at the cell surface (21). We thus
proposed that activation of p38 MAPK by contraction may be involved in the intrinsic
activation of GLUT4 in rat skeletal muscle. Interestingly, it was recently reported that AICAR
increases the intrinsic activity of GLUT1 transporters in clone 9 cells (22) and that this effect
is mediated by activation of p38 MAPK (23).
98
The goal of the present study was to test whether the AMP kinase activator AICAR
increases muscle glucose uptake by inducing GLUT4 translocation to the plasma membrane
and/or the T-tubule surface domains, and/or by activating the p38 MAPK pathway. The results
show that AICAR induces GLUT4 translocation, but unlike contraction, the transporter is only
recruited to the plasma membrane and not to the T-tubules. On the other hand, AICAR mimics
the effect of contraction to activate both p38 MAPK α and β, and SB203580 fully inhibits the
ability of AICAR to stimulate glucose uptake in isolated muscle.
99
MATERIALS AND METHODS Whole-body and muscle glucose uptake measurements
This study was approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval
University. Male Sprague-Dawley rats (175-200 g) purchased from Charles River (Montreal,
Qc, Canada) were randomly assigned to AICAR or control groups and housed in individual
cages, maintained on a twelve-hour dark and light schedule and fed ad libitum with Purina rat
chow. Whole-body AICAR action was determined by the clamp procedure as detailed
previously (24) with modifications based on Bergeron et al. (10). Measurement of steady-state
AICAR-stimulated glucose uptake in muscle tissue was performed by measuring the
incorporation of radiolabeled 2-deoxy-D-glucose [2-[1,2 3H(N)]-deoxyglucose (DG)] as
previously described (24).
Subcellular membrane fractionation and Western blotting
Plasma membranes, T-tubules and intracellular membranes were isolated from 7-8 g of
muscles (tibialis, gastrocnemius and quadriceps) using a procedure developed in our
laboratory (25). This subcellular fractionation protocol has been extensively characterized
with immunologic and enzymatic markers (1, 2, 25). Membrane fractions (10 µg) were
subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
was performed as previously described (25). Immunoreactive bands were detected by the
enhanced chemiluminescence method (Renaissance ECL kit, NEN Life Science).
Incubation protocols of isolated rat skeletal muscles and 2-deoxyglucose uptake
Isolation of EDL muscles and determination of glucose uptake rates were performed as
recently described (20). Muscles were incubated with AICAR (2 mM) for the times indicated
in the figures and 2-deoxyglucose uptake was then determined. In some experiments, muscles
were preincubated with 10 µM SB203580 (or DMSO) for 20 min and then incubated for 30
min with AICAR in the absence or continued presence of SB203580. AICAR and SB203580
treatments were continued during the glucose uptake experiments if they were present during
100
the previous incubations. For in vitro stimulation of AMP kinase and p38 MAPK activity by
AICAR or insulin, EDL muscles were incubated with or without AICAR (2 mM) or insulin
(0.2 mU/ml) for the times indicated in the figures, immediately blotted at 4˚C, clamp frozen
and stored at –80 ˚C until processed as described below.
AMP-kinase activity and phosphorylation
AMPK activity was measured as described earlier (26). AMPK was immunopurified
from muscles lysates with protein A-G Sepharose beads coupled to antibody directed against
the α-2 subunit of AMPK heterotrimer (kind gift of Dr. N. B. Ruderman). The
immunocomplexes were collected and extensively washed. The AMPK was assayed against
the SAMS peptide with the sequence HMRSAMSGLHLVKRR (27). Phosphorylation of
AMPK was assessed by immunoblotting using an anti-phospho-AMPK (Thr172) (1:1000
dilution; Cell Signaling, Beverly, MA), as previously described (28).
In vitro p38 MAPK assay
p38 MAP kinase activity was measured as previously described (20, 29) with the
following modifications : p38 MAPK was immunoprecipitated from 300 µg of total protein
for 2-3 h with polyclonal anti-p38 MAPKα or anti-p38 MAPKβ antibodies (2 µg per
condition; Santa Cruz, CA) preadsorbed to protein G-Sepharose beads. Immunocomplexes
were isolated and washed four times as previously described (20), then incubated for 30 min at
30 oC with 50 µL reaction mixture (kinase buffer containing 200 µM ATP, 2 µg ATF-2 fusion
protein per condition) in the absence or in the presence of 10 µM SB203580 on a platform
shaker. The reaction was stopped by adding 25 µl 2X Laemmli sample buffer. Samples were
heated for 30 min at 65 oC, then vortexed and centrifuged for 5 min (1000 rpm). Fifty µL of
the supernatant were resolved by 10% SDS-PAGE, and immunoblotted for phospho-ATF-2
(1:500 dilution of primary antibodies). Immunoblots were scanned within the linear range and
quantitated using the computer software NIH image version 1.61 (NIH, Bethesda, MD).
101
RESULTS Effect of AICAR on skeletal muscle glucose uptake and GLUT4 translocation.
The effect of AICAR on glucose disposal and GLUT4 translocation in hindlimb
muscles was first investigated in vivo using the glucose clamp technique coupled with tracer 3H-2-DG injection and subcellular fractionation. The glucose disposal rate (GDR) was
markedly increased in AICAR-treated rats and this was associated with a 4.25-fold stimulation
of 2-deoxyglucose uptake in hindlimb muscles (Table 1).
TABLE 1
AICAR increases whole-body glucose disposal and
skeletal muscle glucose uptake in rats.
CONTROL AICAR
Body weight (g) 184.6 ± 7.9 198.0 ± 9.3
GDR (mg/Kg/min) ____ 16.5 ± 3.9
2 DG-uptake (nmol/min.g) 51.7 ± 10.8 220.9 ± 65.7 *
Data are means ± SE of 3-5 rats. GDR ; glucose disposal rate 2-deoxy-D-glucose uptake was measured in tibialis, gastrocnemius and quadriceps muscles. *P < 0.01 vs control
The effect of in vivo AICAR treatment on GLUT4 translocation is shown in Figure 1.
GLUT4-enriched intracellular membrane (IM), plasma membrane (PM) and T-tubule (TT)
fractions were isolated by subcellular fractionation of saline (vehicle control) and AICAR-
stimulated muscles. Protein recoveries of PM, TT, and IM fractions were similar between
control and AICAR-stimulated muscles (see legend to Figure 1). Figure 1A shows
immunoblots of one representative experiment whereas the mean effect of 3 to 4 independent
102
membrane preparations is represented in Figure 1B. In accordance with previous studies (1, 2,
25), the plasma membrane marker α1-Na/K-ATPase was mainly enriched in the PM fraction
whereas the α1-subunit of the dihydropyridine receptor (DHPr), a T-tubule-specific marker,
was mostly recovered in the TT fraction. AICAR treatment induced GLUT4 recruitment from
the IM fraction to the plasma membrane cell surface domain. Surprisingly, however, AICAR
failed to increase GLUT4 translocation to the T-tubules.
We recently reported that electrically-induced contractions also induces the
translocation of the transferrin receptor (TfR) from the intracellular membrane fraction to the
plasma membrane (30). We therefore tested whether AICAR stimulated the translocation of
TfR to the plasma membrane. As shown in Figure 1A and 1B, AICAR induced the recruitment
of the TfR from the GLUT4-enriched intracellular fraction to the plasma membrane but not to
the T-tubule domain of the sarcolemma. To further confirm the effect of AICAR on TfR
translocation to the plasma membrane, EDL muscles were isolated from normal rats,
incubated with [125I]-transferrin (0.02 µCi/ml) and AICAR or saline were added for 30 min. It
was found that AICAR doubled (2.0 ± 0.4-fold, p < 0.05) the uptake of [125I]-transferrin
confirming that AICAR increases TfR recycling in muscle.
103
CTR AICAR
GLUT4
DHPr
α 1-Na / K
PM TT IM
TfR
200 __
__
__
100
100
__46
CTR AICARCTR AICAR
A
GLU
T4 o
r TfR
con
tent
PM TT IM PM TT IM
CONTROLAICAR
GLUT4 TfR
(rel
.den
s.un
its)
0
0. 2
0 .4
0. 6
0. 8
1 .0
0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
1 .0
1 .1
*
**
B
FIGURE 1 : Effect of AICAR on GLUT4 translocation in rat skeletal muscle. A)
Representative Western Blots showing the subcellular distribution of the dihydropyridine
receptor (DHPr), α1-Na/K ATPase, transferrin receptor (TfR) and GLUT4 content in plasma
membranes (PM), transverse tubules (TT) and LiBr-released intracellular membrane (IM)
fractions isolated from control (CTR) and AICAR-stimulated rat muscles (tibialis,
gastrocnemius and quadriceps). Ten µg of membrane protein were used for Western Blot
analysis, as described in Materials & Methods. Molecular weight standards are shown on the
left. B) Effects of AICAR on GLUT4 and TfR translocation in hindlimb muscles.
Densitometric values are means ± SE of data obtained from 3-4 individual membrane
preparations. * p < 0.05 vs controls in each membrane fraction. Protein recoveries of isolated
PM (CTR : 67.7 ± 8.1, AICAR : 65.2 ± 11.9) , TT (CTR : 332.5 ± 69.6, AICAR : 348.6 ±
97.9) and IM (CTR : 93.5 ± 32.2, AICAR : 97.0 ± 12.8) membrane fractions were not
different between groups.
104
Role of p38 MAPK in AICAR-induced glucose uptake in muscle
In the next experiments, we tested the hypothesis that AICAR may also increase
glucose transport in muscle by activation of the p38 MAPK pathway. To rule out the possible
contribution of systemic or humoral factors in the AICAR effect on p38 MAPK, we used
isolated muscles. As depicted in Figure 2, AICAR induced a time-dependent increase in AMP
kinase activity in EDL muscle, reaching a ~ 2-fold stimulation after 30 min (Figure 2A) and a
~ 3-fold increase in AMPK phosphorylation on Thr172, a site known to activate the enzyme
(31) and a good correlate of its activation (28). Figure 2C further shows that AICAR also
increased p38 MAPK activity with a similar time-course. AICAR enhanced the kinase activity
of both p38 MAPKα and p38 MAPKβ isoforms by 1.6±0.1 and 1.8±0.2-fold after 30 min,
respectively. The stimulatory effect of AICAR on p38 MAPK was similar to that observed for
insulin in the same conditions (Figure 2C). p38 MAPK activity was also inhibited when the
p38 MAPK inhibitor SB203580 (10 µM) was directly added to the immunoprecipitates during
the kinase assay, confirming the specificity of the immunoprecipitation (data not shown).
Finally, we investigated whether AICAR-induced p38 MAPK activity is implicated in
the stimulation of muscle glucose uptake. Addition of 2 mM AICAR to isolated EDL muscles
induced a maximal 2-fold increase in glucose uptake after 40-45 min but a significant effect
was already observed after 30 min of treatment (Figure 3A). Longer exposure to AICAR did
not further increase glucose uptake (data not shown). Addition of SB203580 (10 µM)
abrogated the effect of AICAR on muscle glucose uptake but failed to affect basal glucose
uptake (Figure 3B). The p38 MAPK inhibitor did not affect AMPK activation by AICAR as
assessed by its phosphorylation on Thr172 (Figure 3C).
105
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3 .0
10 20 30Control
AM
PK a
ctiv
ity(fo
ld s
timul
atio
n)
*
p38
MA
PK a
ctiv
ity(fo
ld-s
timul
atio
n)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5p38 MAPK α p38 MAPK β
* **
AICAR (min)
ControlControl 10 20 30
AICAR (min)
INS 10 20 30
AICAR (min)
INS
A
C
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
AM
PK p
hosp
hory
latio
n (fo
ld s
timul
atio
n)
Control AICAR (30 min)
B p-AMPK
*
FIGURE 2 : Effects of AICAR on AMP kinase and p38 MAPK activity in isolated EDL
muscles. Isolated EDL muscles were incubated with 2 mM AICAR for the indicated times and
(A) AMP kinase activity, (B) AMP kinase phosphorylation on Thr172 or (C) p38 MAPKα and
p38 MAPKβ activities were assayed as described in Materials & Methods. For comparison,
the effect of insulin (0.2 mU/ml, 4 min) on p38 MAPKα and p38 MAPKβ is shown in (C).
Results are the mean ± SE of 4-6 individual experiments. Basal kinase activity was assigned a
value of 1.0 and activity values of AICAR, insulin or SB203580 samples are expressed
relative to this value.
106
Glu
cose
tran
spor
t(µ
mol
/ g/ h
)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
20 25 30 35 40 45 Control
* *
**
AICAR (min)
A
p-AMPKC
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
AM
PK p
hosp
hory
latio
n (fo
ld s
timul
atio
n) *
Control SB AICAR AICAR + SB
Glu
cose
tran
spor
t(µ
mol
/ g/ h
)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Control SB AICAR AICAR + SB
*
B
*
FIGURE 3 : AICAR-stimulated 2-deoxyglucose uptake is reduced by SB203580. (A)
Isolated EDL muscles were incubated with or without 2 mM AICAR for the indicated times
and 2-deoxyglucose uptake was then determined. In (B) and (C), muscles were pre-incubated
with 10 µM SB203580 (or DMSO) for 20 min and then incubated for 30 min with AICAR or
saline in the absence or continued presence of SB203580 (SB). 2-deoxyglucose uptake (B) or
AMP kinase phosphorylation on Thr172 (C) were then determined as described in Materials &
Methods. Results represent the mean ± SE of 3-6 individual experiments. *p < 0.05 compared
to samples not treated with AICAR.
107
DISCUSSION
The present study was designed to delineate the molecular mechanisms coupling the
AMP kinase pathway to increased glucose uptake in contracted skeletal muscle. The
stimulatory effect of contraction/exercise on glucose uptake is linked to the translocation of
GLUT4 glucose transporters to the muscle cell surface. We (1, 2, 30) and others (32) have
shown that contraction increases the amount of cell surface GLUT4 transporter proteins by
inducing the translocation of the transporter to both the plasma membrane and the T-tubules,
the two subdomains of the muscle cell surface. AICAR increases GLUT4 translocation in
skeletal muscle (14), however, GLUT4 recruitment was only observed in the plasma
membrane and not in the T-tubules, the principal component of the cell surface area in muscle
cells (15, 16). The present work provides evidence that AMP kinase activation selectively
increases GLUT4 translocation to the plasma membrane but not to the T-tubules. In this
regard, AICAR is the first stimulus known to increase muscle glucose uptake without
detectable GLUT4 recruitment to the T-tubules. These results further suggest that contraction
stimulates GLUT4 translocation to the T-tubules through an AMP kinase-independent
mechanism, which is consistent with the finding that contraction-induced glucose uptake is
only partially inhibited in skeletal muscle expressing a dominant-negative AMP kinase (13).
The biochemical nature of the AICAR-sensitive intracellular GLUT4 compartment
remains to be defined. Recent studies (30, 32) suggest that GLUT4 traffic into the recycling
endosomes is implicated in contraction-stimulated GLUT4 recruitment in muscle. Indeed,
contraction triggers GLUT4 translocation from a TfR-enriched vesicular compartment in
skeletal muscle. Furthermore, translocation of GLUT4 from the TfR-enriched compartment
was selective to the plasma membrane domain of the sarcolemma whereas GLUT4 from a
TfR-depleted pool was also recruited to the T-tubules following contraction stimulation (30).
The fact that AICAR only activated GLUT4 translocation to the plasma membrane suggests
that the transporters were mobilized from the TfR-enriched compartment. Two additional
observations are in accordance with a selective GLUT4 recruitment from the TfR-enriched
intracellular compartment. First, AICAR also induced TfR protein translocation to the plasma
membrane but not to the T-tubules. Second, the AMP kinase activator increased recycling of
108
the TfR, as revealed by measurement of [125I]-transferrin uptake in isolated muscles. Whether
this AICAR-responsive TfR-enriched GLUT4 pool represents recycling endosomes, as
previously suggested (30, 32), remains to be firmly established by immunocytochemical
studies complemented by detailed kinetics of [125I]-transferrin internalization in isolated
muscles.
Given that the plasma membrane represents only 20-40% of the sarcolemmal surface
area of muscle cells (15, 16), it is rather unlikely that the stimulatory effect of AICAR on
glucose uptake could be solely explained by its ability to induce GLUT4 translocation.
Another potential mechanism by which AICAR may increase glucose uptake into skeletal
muscle is through activation of cell surface GLUT4 transporters. In this regard, we have
previously shown that p38 MAPK functions in a signaling pathway which modulates the
catalytic activity of GLUT4 transporters in muscle and fat cells (21). In skeletal muscle, p38
MAPK is activated by insulin (20, 33, 34) and by contraction (17, 19, 20) and the p38 MAPK
inhibitor SB203580 inhibits insulin and contraction-stimulated glucose uptake in isolated EDL
muscles in vitro (20). Interestingly, AICAR increases the intrinsic activity of GLUT1
transporters in clone 9 cells (22) and this effect is mediated by activation of p38 MAPK (23).
It was therefore of marked interest to test whether AMP kinase signals through p38 MAPK for
increasing glucose transport in skeletal muscle. Our data show that both p38α MAPK and
p38β MAPK are activated by AICAR treatment of isolated muscles. The activation of p38
MAPK isoforms was temporally related to the stimulation of AMP kinase and muscle glucose
uptake by AICAR. Importantly, the effect of AICAR on glucose uptake was abrogated by 10
µM SB203580, suggesting that p38 MAPK acts downstream of AMPK to stimulate glucose
uptake. The same concentration of SB203580 reduced the effect of contraction on glucose
uptake by only 40% (20). This may be explained by the fact that contraction also stimulates
GLUT4 translocation to the T-tubules, which, as suggested in the present study, is
independent of AMP kinase activation. SB203580 was recently shown to inhibit nucleoside
transport in K562 cells (35). However, we found that SB203580 does not affect AMP kinase
activation by AICAR in EDL muscle, in line with previous studies in clone 9 cells (23). Thus,
SB203580 abolishes AICAR-induced glucose transport by inhibiting p38 MAPK and not by
inhibiting transport of AICAR and activation of AMP kinase.
109
It is presently difficult to directly assess whether activation of p38 MAPK by AICAR
increases GLUT4 catalytic activity. Current methods to assess GLUT4 translocation cannot
distinguish between transporters which are fully inserted into the plasma membrane and T-
tubules and those which are docked but not fused. The exofacial label ATB-[3H]BMPA cannot
be used because it reacts with the active site of glucose transporters and hence, does not
distinguish between changes in number vs activity of cell surface GLUT4 transporters.
Determination of cell surface GLUT4 appearance using a different exofacial marker will be
needed to resolve this important question.
In summary, the present results show that AICAR increases glucose uptake in skeletal
muscle by two distinct mechanisms : 1) inducing selective recruitment of GLUT4 to the
plasma membrane, and 2) activating both p38 MAPKα and β, which may be involved in the
activation of GLUT4 at the cell surface.
110
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from the Canadian Diabetes Association (A.M. and
A. K.). A.M. was supported by an Investigator Award from the Canadian Institutes for Health
Research. K. L. was supported by a studentship from the Canadian Institutes for Health
Research. D.K. was supported by a fellowship from the Swiss National Science Foundation
(grant # 81ZH-57433), the Research Institute of The Hospital for Sick Children (Clinician
Scientist Award), and the Zürcher Diabetes-Gesellschaft. We thank Van Diep Doan for expert
technical assistance.
111
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116
CHAPITRE 3 :
Rôle du monoxyde d'azote dans la stimulation du transport du glucose induite par la kinase activée par
l'AMP dans le muscle squelettique.
117
RÉSUMÉ Il a été démontré que l'activation de la kinase activée par l'AMP (AMPK) joue un rôle majeur
dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du glucose dans le muscle
squelettique. Cependant, les médiateurs intracellulaires intervenant en aval de l'AMPK pour
activer le transport musculaire de glucose sont encore peu connus. Les synthases de monoxyde
d'azote eNOS (isoforme endothélial) et nNOS (isoforme neuronal) ont été récemment
identifiées comme étant des cibles de l'AMPK. Nous avons donc testé l'hypothèse que
l'activation des enzymes NOS par l'AMPK pourrait contribuer à la stimulation du transport
musculaire de glucose. Nos résultats indiquent qu'un activateur de l'AMPK, le AICAR,
stimule le transport du glucose au niveau des muscles glycolytiques de type II (EDL et
épitrochléaris), mais pas au niveau des muscles oxydatifs de type I isolés (soleus). De plus,
nous avons démontré que le transport du glucose stimulé par le AICAR dans les muscles EDL
et épitrochléaris isolés n'était pas affecté par un inhibiteur des NOS, le L-NAME (2 mM). Le
traitement de cellules musculaires L6 en culture avec le AICAR a induit une augmentation
significative du transport du glucose même si ces cellules n'expriment aucun isoforme des
NOS. D'autre part, notre étude révèle que l'infusion de AICAR in vivo active la captation de
glucose au niveau des muscles EDL et épitrochlearis mais également au niveau du muscle
soléaire. Nous avons également démontré que l'infusion de AICAR augmente la production
plasmatique de monoxyde d'azote et induit la phosphorylation de eNOS dans les muscles EDL
et soleus. Globalement, notre étude révèle que le monoxyde d'azote n'est pas impliqué dans
l'effet stimulateur du AICAR sur la captation musculaire de glucose dans les muscles isolés.
Cependant, notre étude suggère que l'augmentation de la captation du glucose induite par le
AICAR in vivo dans les deux types de muscle est dépendante de l'activation de eNOS et de la
production de monoxyde d'azote par l'AMPK, ce qui augmenterait le flot sanguin et ainsi la
quantité de glucose atteignant les muscles.
118
Role of nitric oxide in the stimulation of glucose transport by activation of AMP-activated protein kinase
in skeletal muscle
Kathleen Lemieux, Geneviève Pilon, and André Marette*
Department of Physiology & Lipid Research Unit, Laval University Hospital Research Center, Ste-Foy, Québec, G1V 4G2, Canada
RUNNING TITLE : Role of NO in AMPK-induced muscle glucose uptake *Address for correspondence and reprint requests: André Marette, Ph.D. Department of Physiology & Lipid Research Unit Laval University Hospital Res. Center 2705, Laurier Blvd Ste-Foy, Québec, Canada G1V 4G2 Tel: (418) 656-4141 (ext. 7549) Fax: (418) 654-2176 Email: [email protected]
119
ABSTRACT
It has been shown that activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) in skeletal
muscle contributes to the stimulatory effect of contraction on glucose uptake. However, the
downstream target(s) of AMPK responsible for this effect remains obscure. Both the
endothelial (eNOS) and neuronal (nNOS) nitric oxide synthases have been recently shown to
be substrates of AMPK. We have therefore tested the hypothesis that activation of NOS
enzymes by AMPK may be linked to glucose uptake stimulation in muscle. The AMPK
stimulator AICAR increased glucose uptake by ~2-fold in isolated rat muscles enriched in type
II fibers such as the extensor digitorum longus (EDL) and epitrochlearis (EPI) but it did not
stimulate glucose uptake in the soleus, a type I fiber-enriched muscle. Addition of the NOS
inhibitor L-NAME (2 mM) failed to inhibit the effect of AICAR on glucose uptake in isolated
EDL and EPI muscles. Moreover, AICAR rapidly increased glucose uptake by ~1.6-fold in
cultured L6 myocytes even if these cells do not express any NOS isoforms in these conditions.
On the other hand, AICAR infusion in vivo markedly increased (4 to 5-fold) glucose uptake in
EDL, EPI but also in soleus muscles. AICAR treatment also enhanced plasma NO
concentration and activated eNOS in both the EDL and soleus muscles, as revealed by its
phosphorylation on ser1179. These results do not support a role for myocyte NOS in AICAR-
induced glucose uptake in isolated skeletal muscle. In vivo, however, AICAR markedly
stimulates glucose uptake in all muscle types and this is linked to an AMPK-dependent
activation of eNOS, which may further increase glucose uptake by augmenting blood flow to
the muscles.
120
INTRODUCTION
It is well known that exercise/contraction increases glucose uptake by promoting the
translocation of GLUT4 from intracellular storage compartments to the muscle cell surface.
Recent studies suggest that activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) may play a
role in the stimulatory effect of contraction on muscle glucose uptake (1, 2, 3 , 4). AMPK is
active as a heterotrimer consisting of one catalytic subunit (α) and two noncatalytic subunits
(β,γ). The cell-permeable AMPK activator 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside
(AICAR) has been a valuable pharmacological tool to study the role of AMPK in the
metabolic effects of muscle contraction. This adenosine analog is taken up by cells and
phosphorylated by adenosine kinase to form 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside
monophosphate (ZMP) which mimics the activation of AMPK by AMP (5). AICAR mimics
the effect of contraction on glucose uptake and its glucose enhancing action is not additive to
that of contraction, suggesting that these stimuli act through the same mechanism (1, 6). It was
further shown that AICAR stimulates glucose uptake by causing GLUT4 translocation to the
plasma membrane in a PI-3 kinase-independent fashion (7). Perhaps the most compelling
evidence for a role of AMPK in contraction-induced glucose uptake was obtained by Mu and
colleagues who reported that muscle overexpression of a dominant-negative form of AMPKα2
in transgenic mice reduces by 30-40% the effect of contraction on glucose uptake (3). Since
expression of this AMPKα2 mutant fully blocked the effect of AICAR and hypoxia on muscle
glucose uptake, this suggests that additional pathway(s) are involved in the activation of
glucose transport by contraction.
Recent studies have revealed that nitric oxide synthases (NOS) are novel targets of
AMPK. In ischemic rat cardiac endothelial cells, it was shown that AMPK can phosphorylate
eNOS on a specific serine residue which activates the enzyme in the presence of calcium (9).
Moreover, a single bout of exercise was found to increase serine phosphorylation of human
nNOSµ in parallel with an increased AMPKα2 activity (10). Both the neuronal NOS (nNOS)
and endothelial NOS (eNOS) isoforms have been shown to be expressed in human and rat
skeletal muscle (11-14). It is therefore possible that AMPK enhances glucose uptake via the
activation of NOS and the production of nitric oxide (NO). In this regard, it has been reported
121
that muscle releases NO following electrical stimulation (15) and that NO donor drugs such as
sodium nitroprusside (SNP) increase glucose transport in skeletal muscle (16-19). There is
some controversy as to the implication of NO in the effect of contraction and AMPK
activation on glucose transport. Indeed, AICAR was shown to increase NOS activity and
glucose transport in H-2Kb muscles cells and these effects could be blocked by NOS
inhibitors (20). In contrast, other studies reported that NOS inhibition failed to inhibit
contraction-induced increase in glucose transport in isolated rat muscles (16, 17). Thus, while
there is convincing evidence that AMPK is implicated in contraction-stimulated glucose
transport, it is not clear whether NO is the downstream mediator of AICAR- or contraction-
induced in glucose uptake.
In this study, we have further examined the potential role of NO in AMPK-induced
glucose transport in different muscle types following AICAR treatment in vitro as well as in
vivo. The results show that NO is not implicated in AICAR to induced glucose transport in
isolated skeletal muscles. On the other hand, our findings suggest that an AMPK-dependent
activation of eNOS and NO release in the vascular endothelium may increase glucose uptake
by augmenting blood flow to the muscles.
122
MATERIALS AND METHODS Animals and Surgery
This study was approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval
University. Male Sprague-Dawley rats (175-200 g) purchased from Charles River (Montreal,
Qc, Canada) were used in these studies. Rats were randomly assigned to AICAR or control
groups and housed in individual cages, maintained on a twelve-hour dark and light schedule
and fed ad libitum with Purina rat chow.
Whole-body and muscle glucose uptake measurements
Whole-body AICAR action was determined by the clamp procedure as detailed
previously (21) with modifications based on Bergeron et al. (6). Briefly, overnight-fasted
animals were infused either with saline or AICAR (7.5 mg/kg/min; Sigma, St. Louis, MO).
Simultaneous infusions of somatostatin (1 µg/kg/min ; Sigma, St. Louis, MO) and basal
replacement of insulin (0.1 mU/kg/min ; Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN) were performed
in both groups to avoid variations of plasma insulin concentrations. Blood glucose was
monitored at 5 min intervals using a Glucometer Elite (Bayer, Etobicoke, Ont, Canada). The
plasma glucose concentration was maintained at basal fasting levels by use of a variable-rate
D-glucose infusion (50% wt/vol). The animals were infused for a total period of 120 min and
steady-state glucose disposal rate was determined during the last 60 min of the clamp (from
60-120 min).
Measurement of steady-state AICAR-stimulated glucose uptake in individual tissues
was performed by measuring the incorporation of radiolabeled 2-deoxy-D-glucose [2-[1,2
3H(N)]-deoxyglucose (DG)] as previously described (21). Briefly, a bolus injection of 250
µCi/kg of 3H-2-DG (American radiolabeled Chemicals, Inc., St-Louis, MO) and 25 µCi/kg of
[14C]-sucrose (NEN, Boston, MA) in 0.5 ml saline solution was injected 25 min before the
end of the clamp. Blood samples were taken at regular intervals (2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15,
123
17.5, 20, 22.5 and 25 min) after the bolus injection for determination of plasma glucose and
radiolabeled 2-DG and sucrose. Twenty-five min after the bolus, the animals were rapidly
killed by decapitation and hindlimb muscles (tibialis, gastrocnemius and quadriceps) were
quickly excised and cleaned of extraneous tissues. The accumulation of [3H]-2-DG in
muscles, corrected for the extracellular space with [14C]-sucrose, was used as an index of
glucose uptake rates as previously described (21).
Glucose transport activity in isolated skeletal muscles
Isolation of epitrochlearis, extensor digitorum longus (EDL) and soleus muscles and
determination of glucose uptake rates were performed as recently described (22). Briefly,
muscles from overnight-fasted rats isolated from 40-55 g anesthetized (Ketamine/Xylazine ;
90 mg/10 mg/kg, i.p) Sprague-Dawley rats were incubated in Krebs-Ringer bicarbonate
(KRB) buffer containing variable concentrations of glucose as indicated in the Figures. After
the initial incubation, muscles were incubated for 30 min in the presence or absence of
purified insulin (10 nM) or AICAR (2 mM). At this concentration, insulin and AICAR activate
glucose transport maximally in soleus, EDL and epitrochlearis muscles (data not shown). In
some experiments, muscles were incubated with 2 mM L-NAME together with AICAR.
AICAR and L-NAME treatments were continued during the glucose uptake experiments if
they were present during the previous incubations.
Glucose transport in L6 myocytes
A line of L6 skeletal muscle cells (kind gift of Dr. A. Klip, Hospital for Sick Children,
Toronto, ON, Canada) clonally selected for high fusion potential was used in the present
study. The L6 cell line was derived from neonatal rat thigh skeletal muscle cells and retains
many morphological, biochemical and metabolic characteristics of skeletal muscle. Cells were
grown and maintained in monolayer culture in α -MEM containing 2% (v/v) fetal bovine
serum and 1% (v/v) antibiotic/antimycotic solution (10000 units/ml penicillin, 10000 µg/ml
streptomycin and 25 µg/ml amphotericin B) in an atmosphere of 5% CO2 at 37 °C. Fully
124
differentiated L6 myotubes were deprived of serum 4 h prior to experimental treatments.
Then, cells were incubated in MEM medium for 2 h with AICAR (2 mM) in the presence or in
the absence of L-NAME (2 mM). All cell culture solutions and supplements were purchased
from Gibco Life Technologies (Burlington, ON, Canada) except for FBS which was purchased
from Wisent (St-Bruno, QC, Canada).
2-deoxyglucose uptake was determined as previously described (23). Briefly,
following experimental treatments, cells were rinsed once with HEPES-buffered solution (20
mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4 and 1 mM CaCl2), and were
subsequently incubated for 8 min in HEPES-buffered solution containing 10 µM 2-
deoxyglucose and 0.3 µCi/ml 2-deoxy-[3H]glucose. After the incubation in transport medium,
cells were rinsed three times with ice-cold 0.9% NaCl solution, and then disrupted by adding
50 mM NaOH. Cell-associated radioactivity was determined by scintillation counting. Protein
concentrations were determined by the bicinchoninic acid method, and the results were
expressed in pmol/min per mg. Glucose uptake values were corrected for non-carrier-mediated
transport by measuring hexose uptake in the presence of 10 µM cytochalasin B (5–10% of
total uptake).
RNA analysis
Total cellular RNA was isolated from L6 myocytes, skeletal muscle or brain using
guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction and iNOS, eNOS, and nNOS mRNAs
were measured by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as
previously described (24, 25).
NO2/NO3 fluorometric detection
The accumulation of NO2/NO3 in the plasma of control or AICAR treated-rats was
used as an index of NO production. Blood was collected in tubes containing EDTA and
centrifuged for 10 minutes at 4000 g. Plasma obtained was then centrifuged at 5000 g (4°C)
125
overnight in a 10 000 Mr cutoff filter (Ultrafree Microcentrifuge filter unit 10 000 NMWL,
Millipore). Nitrates were reduced to nitrites using nitrate reductase and the NADPH
regenerating system (G-6-P/G-6-PDH) as described previously (26). Briefly, samples were
incubated for 90 minutes at room temperature in a 96-well microtiter plate in presence of 30
mU nitrate reductase, 3 µM NADPH, 750 µM glucose-6-phosphate, 48 mU G-6-P
dehydrogenase in a final reaction volume of 100 µL. At the end of the incubation, 30 µL DAN
reagent (2,3-diaminonaphtalene, Sigma) was added for 10 minutes and the reaction was
stopped with 30 µL of 1.4 N NaOH. The fluorescence was measured at λex 360 nm and λem
450 nm using a fluorescence microtiter plate reader. Quantitation of total NO2/NO3 was based
on external standards of sodium nitrite and sodium nitrate reduced with reductase.
eNOS phosphorylation
Overnight-fasted male Sprague Dawley rats (175-200 g) were anesthetized with
Ketamine/Xylazine (90 mg - 10 mg/kg, i.p). AICAR (0.85 mg/kg, i.p.) or saline were injected
and animals killed 5 min later by decapitation and EDL and soleus muscles were quickly
excised and frozen in liquid nitrogen. Muscles were grounded to a powder on a morter in
liquid nitrogen and then lysis buffer was added for 1 hour at 4 °C. The lysis buffer contained
50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 mM NaF, 5 mM Na3VO4, 10 %
glycerol, 1 % Triton X-100 and a protease inhibitor cocktail (Sigma, St-Louis, MO). Samples
were then centrifuged for 30 min at 10 000 g. eNOS was precipitated from the supernatant
using 2' 5' ADP-Sepharose beads (Amersham Pharmacia, Sweden) for 2 hours at 4 °C. Beads
were successively washed once with PBS pH 7.4, once with PBS pH 7.4 containing 1 %
Triton X-100, and once again with PBS pH 7.4. The beads were resuspended in SDS sample
buffer and boiled for 5 min. Precipitates were subjected to sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting was performed as previously
described (23). eNOS protein was detected using an isoform-specific monoclonal antibody
(Transduction Laboratories, Lexington, KY). eNOS phosphorylation on serine 1179 was
determined by using a polyclonal antibody raised against phosphopeptides based on the amino
acid sequence of human eNOS 9 (kind gift of Dr. B. Kemp, St-Vincent’s Institute of Medical
Sciences, Fitzroy, Australia). Immunoreactive bands were detected by the enhanced
126
chemiluminescence method (Renaissance ECL kit, NEN Life Science). The level of eNOS
phosphorylation was determined by the ratio of eNOS phosphorylation over eNOS protein
content measured in the same samples.
Statistical Analysis
Values are means ± SE. The effects of AICAR and/or L-NAME were analysed by
ANOVA. The effect of AICAR on eNOS phosphorylation and glucose uptake in L6 myocytes
was compared by unpaired Student’s t test. The level of significance was p < 0.05.
127
RESULTS Effect of NOS blocade on AICAR mediated-glucose transport in isolated muscles.
The effects of AICAR on glucose uptake in isolated muscles enriched in either type II
fibers (EDL, epitrochlearis) or type I fibers (soleus) are shown in Figure 1. Since previous
studies showed that glycogen levels can modulate AMPK activation by AICAR (27), the
effect of the drug was tested in the absence or in the presence of normal (8 mM) or high (19
mM) glucose concentrations. AICAR (2 mM) increased glucose uptake by ~2 fold in isolated
EDL and epitrochlearis muscles but this effect was blunted in muscles incubated in high
glucose. The stimulatory effects of AICAR on the EDL and epitrochlearis muscles were
smaller than that of insulin under the same conditions. On the other hand, AICAR failed to
increase glucose uptake in isolated soleus muscle, whatever the glucose concentration used,
whereas this muscle type was highly responsive to insulin. Importantly, additon of the NOS
inhibitor L-NAME (2 mM), at a concentration we have previously shown to fully inhibit
muscle NOS activity (21), failed to inhibit AICAR-stimulated glucose transport in either EDL
or epitrochlearis muscles.
128
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
B A L AL I B A L AL I B A L AL I
15
16
a
a
b
a a
b
b b
17
18
aa
bb
EDL
2-de
oxyg
luco
se u
ptak
e
(µm
ol/g
/h)
[glucose] mM 0 8 19
A
C
0
2
4
6
8
10
12
14
16
16
18
20
22
2-de
oxyg
luco
se u
ptak
e
(µm
ol/g
/h)
Soleus
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
a a
cc
aa
a a
cc
cc
EPI
B A L AL I B A L AL I B A L AL I
[glucose] mM 0 8 19
2-de
oxyg
luco
se u
ptak
e
(µm
ol/g
/h)
B
B A I B A I B
[glucose] mM 0 8 19
A I
FIGURE 1 : Effects of AICAR in the presence or absence of the NOS inhibitor L-NAME
on glucose transport in isolated EDL, epitrochlearis and soleus muscles. Isolated extensor
digitorum longus (EDL : A), epitrochlearis (EPI : B) and soleus (C) muscles were incubated in
a free glucose medium, in medium containing 8 mM or 19 mM glucose in the absence (B :
basal) or in the presence of AICAR (A, 2 mM), L-NAME (L, 2 mM) or AICAR + L-NAME
(AL). The effect of insulin (I, 10 nM) on glucose transport in the same muscles is also
depicted. Data are means ± SE of 5-15 individual experiments in each experimental group.
Bars bearing different superscripts are significantly different (p < 0.05). Insulin data, only
shown for comparison purposes, were excluded from statistical analyses.
129
Effect of AICAR on glucose uptake in L6 sleletal muscle cells
Figure 2A shows that L6 myocytes lack expression of constitutive NOS enzymes
(eNOS and nNOS) under normal incubation conditions. Neither eNOS nor nNOS mRNAs
could be detected in these cells while they were readily detected in rat skeletal muscle or
brain. The inducible NOS (iNOS) was also not detectable in L6 myocytes from control cells
but this enzyme can be induced by chronic exposure to inflammatory mediators such as the
cytokines (TNF-α and IFN-γ) and the bacterial endotoxin LPS. Expression of the NOS
enzymes was also not detectable after the acute AICAR treatment (data not shown). Despite
the fact that L6 myocytes do not express any NOS isoforms under control or AICAR-treated
conditions, incubation of these cells with AICAR for only two hours was found to increase
glucose uptake by ~1.6-fold and this effect was not prevented by the addition of L-NAME (2
mM).
130
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Basal AICAR L-NAME AICAR + L-NAME
* *
2-de
oxyg
luco
se u
ptak
e
(fold
ove
r bas
al)
A
B
iNOSeNOS
nNOS
GAPDH
L6 m
yocy
tes
Sk. m
uscl
ebr
ain
GAPDH
L6 myocytes
CTL Cyto/LPS
FIGURE 2 : Expression of NOS enzymes and AICAR-induced glucose transport in L6
skeletal muscle cells. A : Representative RT-PCR showing eNOS and nNOS mRNA levels
in L6 myocytes, skeletal muscles and in brain (positive control). iNOS mRNA in L6 myocytes
is shown in the control state (ctl) and under proinflammatory conditions (Cyto/LPS). B : L6
skeletal muscle cells were treated for 120 minutes with 2 mM AICAR in the presence or in the
absence of L-NAME (2mM). Data are means ± SE of 5-8 individual experiments in each
experimental group. * represents P < 0.05 compared with basal group .
131
Effect of in vivo AICAR infusion on glucose uptake in skeletal muscles and adipose tissues
We next tested whether AICAR infusion in vivo could increase glucose uptake in both
type I and type II fiber enriched muscles as well as in fat depots. Under steady-state and
euglycemic conditions, AICAR infusion increased glucose disposal rate (16.5 ± 3.9 mg•kg-
1•min-1) since no glucose were infused in control rats. Tissue 2-[3H]deoxyglucose uptake rates
in control (saline-infused) and AICAR-infused animals are shown in Figure 3. AICAR
markedly stimulated glucose uptake in the EDL (~4-fold), epitrochlearis (~4-fold), but also in
the soleus muscle (~4.5-fold) (Figure 3A). The AMPK activator also significantly increased
glucose uptake in tibialis, white gastrocnemius and cardiac muscles (Figure 3B) as well as in
brown adipose tissue (Figure 3C). In contrast, AICAR infusion failed to increase glucose
uptake in perirenal or epididymal white adipose tissues (Figure 3C).
132
0
50
100
150
200
250
300
EDL Epitrochlearis Soleus
CONTROLAICAR
* *
*
0
50
100
150
200
250
300
Tibialis Heart WG
*
*
*
A
B C
0
10
20
3040
50
60
70
8090
Peri WAT Epi WAT BAT
*
Glu
cose
upt
ake
(nm
ol/m
g/h)
Glu
cose
upt
ake
(nm
ol/m
g/h)
Figure 3 : Effect of AICAR on in vivo glucose uptake in different muscles and adipose
tissues during the clamp procedure. Saline (Control) or AICAR (7.5 mg/kg/min) were
infused in overnight fasted rats in the continued presence of somatostatin (1 µg/kg/min ) and
basal insulin (0.1 mU/kg/min ) during 120 min. Tissue 2-deoxyglucose uptake rates were
determined in different muscles (A, B) and adipose (C) tissues as described in Materials &
Methods. Data are means ± SE of 3-4 individual experiments in each experimental group.
WG ; white gastrocnemius, Peri WAT : perirenal white adipose tissue, Epi WAT ; epididymal
white adipose tissue, BAT : brown adipose tissue. * represents P < 0.05 compared with
control group.
133
Effect of in vivo AICAR treatment on plasma NO production and eNOS phosphorylation in
muscles
In order to test whether AICAR increased in vivo muscle glucose uptake via a NO-
dependent mechanism, both NO production during the clamp as well as the acute effect of
AICAR on eNOS phosphorylation state were measured. As depicted in Figure 4A, AICAR
infusion (120 min) augmented plasma NO production from 1.1 ± 0.2 to 3.2 ±1.3 µM (p<0.05)
compared with saline-infused animals. eNOS was purified from muscles of saline and
AICAR-injected rats and its activation was assessed by measuring its phosphorylation on
serine 1179, a good marker of eNOS activation (9). Figure 4B shows that AICAR injection
increased phosphorylation of ser-1179 on eNOS by 1.8- and 1.5-fold in soleus and EDL
muscles, respectively.
134
Saline AICAR 0
0.2
0.40.6
0.8
1.0
1.21.4
1.6
1.8
2.02.2
2.4
*
eNO
S ph
osph
oryl
atio
n on
Ser
-117
9
eNOS prot
eNOS -P
eNOS prot
eNOS -P
A
B
Soleus
Saline AICAR
*EDL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3,0
3.5
4.0
4.5
5.0
Saline
NO
pro
duct
ion
(N
itrite
+ N
itrat
e, µ
M)
AICAR
*
FIGURE 4 : Effect of in vivo AICAR treatment on plasma NO production and eNOS
phosphorylation in soleus and EDL muscles. A : NO production was measured by the
assessment of plasma concentrations of NO2/NO3 by fluorometric detection after saline or
AICAR infusion during the clamp procedure as described in Materials & Methods. B : Rats
were injected with AICAR (0.85 mg/kg, i.p.) or with saline for 5 minutes. Soleus and EDL
muscles were removed and used for determination of eNOS phosphorylation by SDS-PAGE
and Western blot analysis. Representative immunoblots of eNOS phosphorylation on Ser
1179 in soleus and EDL muscles of saline or AICAR treated rats are shown. The means ± SE
of at least 3 individual experiments are also shown as bar graphs. * represents p < 0.05
compared with control (saline-infused) group.
135
DISCUSSION
There is growing evidence that the AMP kinase pathway is involved in the activation
of glucose uptake by muscular contraction (1, 6, 28). Using a transgenic approach, Mu et al.
(8) have provided strong support for a role of AMP kinase in contraction-induced glucose
uptake. They found that complete abrogation of AMP kinase activity by expression of a
dominant inhibitory mutant of the α2-subunit of AMP kinase in skeletal muscle of transgenic
mice fully inhibited AICAR-activated glucose uptake and partially (30-40%) blocked the
stimulatory effect of contraction on glucose uptake in fast-twitch muscles. It is therefore
important to delineate the molecular mechanisms coupling the AMP kinase pathway to
increased glucose uptake in skeletal muscle.
Our results first emphasize the fiber-type specific modulation of glucose transport by
AICAR in isolated rat muscles. AICAR was found to stimulate glucose uptake in type II fiber
enriched muscles but not in the soleus, a muscle containing a large proportion of type I fibers.
This fiber-type speficity has been previously observed in studies in which AICAR was
reported to stimulate AMPK activity and glucose uptake only in fast-twitch glycolytic muscle
fibers (8, 29, 30). The lack of activation of AMPK by AICAR in oxidative muscles such as
the soleus was proposed to be related to the nutritional state of the animal. In fact, it has been
recently shown that the effect of AICAR on glucose transport in glycolytic muscles is higher
in fasted rats compared with fed rats (30). Furthermore, contraction-stimulated glucose
transport and GLUT4 translocation are negatively correlated with muscle glycogen content
(31, 32, 33). In the present study, AICAR failed to increase glucose uptake in the soleus even
when the muscle from overnight starved rats was incubated in the absence of glucose, a
situation where glycogen levels are expected to be low. However, it is possible that a more
severe depletion of glycogen is needed since activation of AMPK and glucose uptake by
AICAR was observed in soleus muscle from starved (24 hours) rats (20). Another possible
explanation for this fiber-type specificity could be related to the greater level of expression of
the α1 and α2 catalytic subunits of AMPK in type II muscle fibers (e.g. epitrochlearis) as
compared to type I (e.g. soleus) muscles (30).
136
It has been previously proposed that NO could be directly implicated in contraction
stimulated-glucose transport in isolated muscles, independently of its possible hemodynamic
action on the muscle vasculature. Indeed, we and others have shown that skeletal muscle
expresses both the neuronal (nNOS) and endothelial (eNOS) isoforms (11, 14, 18). Moreover,
contraction of isolated muscles increases NOS activity and NO release (15, 34). Previous
attempts to tackle this question has led to controversial findings since inhibition of NOS with
L-arginine analogues (e.g. L-NAME, L-NMMA) either decreased contraction-stimulated
glucose uptake (35), or failed to do so (16, 17). The reasons behind these conflicting results
remain to be elucidated since similar contraction protocols and muscle types were used in
these studies. Furthermore, stimulation of glucose transport by the NO donor SNP and
contraction is fully additive (16), suggesting that nitric oxide and contraction do not share the
same signaling pathway. More recently, activation of AMPK by AICAR was found to increase
NOS activity in H-2Kb muscle cells, and NOS inhibition blunted AICAR induced-glucose
uptake in these cells as well as in isolated muscles (20). This study thus suggested that AMPK
increases glucose uptake in muscle by activating NOS enzymes. Our findings, however, do not
support this hypothesis since L-NAME failed to inhibit AICAR-induced glucose uptake in
isolated EDL and epitrochlearis muscles. One appreciable methodological difference between
the two studies is that Fryer et al. used rats that were starved for 24 h as compared to the
animals used in our study (14 to 16 h fast). Thus it is possible that AMPK-induced NOS
activity is more coupled to glucose uptake when glycogen content is very low. More studies
are needed to test whether muscle NOS activity, like AMPK activation (31), is regulated by
the nutritional state of the animal. Nevertheless, our finding that AICAR increases glucose
transport in L6 muscle cells even if these cells do not express any NOS isoforms clearly
indicates that factors other than NO are involved in the stimulatory action of AMPK on
glucose uptake in isolated muscles.
A key observation of the present study is that that effect of AICAR on glucose uptake
depends on whether the drug was added in vitro or given in vivo. The stimulatory effects of
AICAR on glucose uptake was greater following in vivo infusion as compared to in vitro
137
stimulation of isolated muscles. Moreover, the effect of in vivo AICAR treatment was similar
in muscles enriched with type II fibers (EDL, epitrochlearis, white gastrocnemius) or muscles
containing a greater proportion of type I fibers (soleus and tibialis). In marked contrast,
AICAR failed to induce glucose uptake in isolated soleus muscles. These data are in line with
recent studies showing that AICAR treatment in vivo can stimulate AMPK activity and
glucose transport not only in glycolytic but also in oxidative muscles such as the soleus (27,
36). We further extend these studies by showing that in vivo AICAR treatment increases NO
production and eNOS phosphorylation in both the EDL and soleus muscles. Since eNOS is
mostly, if not only, found in the vascular endothelium in the muscle vasculature (37), our data
suggest that AMPK activation in vivo leads to increased eNOS activity and NO production in
the muscle vasculature thereby augmenting blood delivery to the muscles. This vascular
component may explain both the sensitivity of the soleus muscle to in vivo AICAR treatment
as well as the increased responsiveness of all muscles to AICAR-induced glucose uptake in
vivo as compared to in vitro. This is supported by observations that L-NAME infusion in
humans decreases femoral blood flow during exercise (38-40) although this is not a consistent
finding (41, 42).
In summary, the present study do not support a role for myocyte NOS in AICAR-
induced glucose uptake in isolated skeletal muscles. In vivo, however, AICAR markedly
stimulates glucose uptake in all muscle types and this is linked to an AMPK-dependent
activation of eNOS and NO production. It is proposed that NO contributes to AICAR-induced
glucose uptake in skeletal muscles in vivo through phosphorylation and activation of eNOS
and NO release in the vascular endothelium, which may increase glucose uptake by
augmenting blood flow to the muscles.
138
ACKNOWLEDGMENTS
The authors wish to thank Bruno Marcotte for expert technical assistance and Dr
Claude H. Côté for intellectual input and critical reading of the paper. This work was
supported by a grant from the Canadian Diabetes Association to A. Marette. K. Lemieux and
G. Pilon were supported by studentships from the Canadian Institutes of Health Research. A.
Marette is the recipient of a Canadian Institutes of Health Research Investigator Award.
139
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144
CONCLUSION GÉNÉRALE Un des rôles majeurs du muscle squelettique est d'assurer le maintien de l'homéostasie
glucidique durant la période postprandiale. Durant l'exercice physique, la captation musculaire
de glucose est d'autant plus capitale puisqu'elle permet de répondre aux besoins énergétiques
du muscle en activité. Il est maintenant bien établi que l'insuline et la contraction musculaire
stimulent le transport musculaire du glucose en induisant la translocation de GLUT4 à partir
d'un réservoir intracellulaire vers les membranes de surface, soit la membrane plasmique et les
tubules-T. De plus, plusieurs évidences suggèrent que ces deux stimuli activent le transport du
glucose en empruntant différentes voies de signalisation intracellulaires (Brozinick, JT, Jr., et
al. 1994; Goodyear, LJ, et al. 1995; Kennedy, JW, et al. 1999; Lee, AD, et al. 1995; Nesher, R,
et al. 1985; Ploug, T, et al. 1987; Yeh, JI, et al. 1995). Des travaux indiquent que l'effet
combiné de l'insuline et de la contraction musculaire induit une augmentation additive du
transport du glucose, possiblement attribuable au recrutement de GLUT4 à partir de
différentes populations de vésicules (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994; Coderre, L, et al. 1995;
Douen, AG, et al. 1990; Etgen, GJ, Jr., et al. 1993; Ploug, T, et al. 1998; Sherman, LA, et al.
1996). Les principaux objectifs des études composant cette thèse étaient de clarifier les
mécanismes intracellulaires par lesquels la contraction musculaire active le transport du
glucose dans le muscle squelettique de rat. L'importance de ces travaux est mise en évidence
par le fait que l'exercice stimule normalement le transport du glucose et la translocation de
GLUT4 chez les modèles humains et animaux de résistance à l'insuline et chez les patients
atteints de diabète de type 2. Il devient donc primordial de comprendre le mécanisme d'action
de la contraction musculaire sur la captation du glucose chez les sujets normaux dans l'optique
de développer de nouvelles avenues thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Certaines évidences indiquent qu'au niveau basal, GLUT4 est majoritairement localisé dans
des réservoirs internes, 40 % des GLUT4 étant associés au système endosomal alors que 60 %
serait associés à une seconde population de vésicules spécialisées dépourvues de marqueurs
endosomaux, tel que le récepteur de la transferrine (TfR) (Lampson, MA, et al. 2001;
Livingstone, C, et al. 1996; Ploug, T, et al. 1998; Wei, ML, et al. 1998). Par ailleurs, il fut
aussi observé que la contraction musculaire n'induit aucune diminution du contenu en GLUT4
à partir d'un compartiment intracellulaire sensible à l'insuline (Brozinick, JT, Jr., et al. 1994;
145
Douen, AG, et al. 1990). En accord avec ces précédentes observations, des travaux de
fractionnement membranaire du muscle squelettique ont permis d'isoler deux différents types
de vésicules GLUT4 ayant des coefficients de sédimentation différents et étant distinctement
sensibles à l'insuline et à l'exercice (Coderre, L, et al. 1995). Par microscopie confocale, il a
été observé que la contraction musculaire, et non l'insuline, induisait la translocation de
GLUT4 à partir de vésicules enrichies en TfR (Ploug, T, et al. 1998). Conjointement, ces
résultats suggèrent que la contraction musculaire stimule la translocation de GLUT4 à partir
d'un compartiment semblable ou distinct de celui mobilisé par l'insuline.
Dans notre première étude, nous nous sommes d'abord intéressés à déterminer si l'insuline et la
contraction musculaire _recrutaient GLUT4 à la surface cellulaire à partir de réservoirs
internes distincts. Nous avons démontré que l'insuline et la contraction musculaire stimulaient
de façon presque complètement additive le transport du glucose dans les muscles perfusés in
situ. Ces résultats suggèrent que l'insuline et la contraction musculaire utilisent différentes
voies de signalisation intracellulaires et/ou mobilisent différents compartiments internes
enrichis en GLUT4 afin d'augmenter la captation du glucose. Afin de vérifier cette dernière
hypothèse, nous avons utilisé une technique de fractionnement membranaire mise au point
dans notre laboratoire nous permettant d'isoler différentes fractions membranaires enrichies en
membrane plasmique, en tubules-T et en membranes internes enrichies en GLUT4. Nous
avons ainsi démontré que la contraction musculaire et l'insuline stimulaient de façon
partiellement additive la translocation de GLUT4 au niveau de la membrane plasmique, et non
au niveau des tubules-T. Parallèlement, la contraction musculaire, et non l'insuline, a activé la
translocation du TfR sélectivement au niveau de la membrane plasmique et non au niveau des
tubules-T. Par immunoadsorption membranaire de la fraction cellulaire enrichie en
membranes internes contenant GLUT4, nous avons démontré que la contraction musculaire
stimule la translocation de GLUT4 à partir de vésicules enrichies en TfR. Par contre, on note
une absence d'effet de l'insuline sur la translocation du TfR à partir des vésicules GLUT4
immunoadsorbées. Globalement, les résultats de ces travaux montrent que l'insuline et la
contraction musculaire induisent la translocation de GLUT4 à partir de vésicules distinctes. De
plus, la contraction musculaire active la translocation de GLUT4 à partir d'au moins deux
différentes populations de vésicules GLUT4 : des vésicules GLUT4 enrichies en TfR
sélectivement mobilisées à la membrane plasmique et des vésicules GLUT4 dépourvues de ce
146
marqueur endosomal recrutées aux tubules-T, et possiblement à la membrane plasmique (Voir
figure 9). Cette étude suggère également que l'absence d'effet additif de l'insuline et de la
contraction musculaire sur la translocation de GLUT4 au niveau des tubules-T est
possiblement conséquente à l'absence de translocation des vésicules GLUT4 enrichies en TfR
au niveau de ce compartiment de surface.
Certaines évidences suggèrent qu'en plus de stimuler la translocation d'un compartiment post-
endosomal spécialisé enrichi en GLUT4, l'insuline accélère le recyclage et donc l'exocytose de
GLUT4 via les endosomes de recyclage (Jhun, BH, et al. 1992; Satoh, S, et al. 1993; Yeh, JI,
et al. 1995). Dans la présente étude, on a noté une augmentation de la colocalisation
vésiculaire de GLUT4 avec le TfR suite à la contraction musculaire mais pas suite à une
stimulation insulinique. Ces données suggèrent donc que la contraction induit une
translocation plus importante de GLUT4 à partir des vésicules dépourvues en TfR à la surface
cellulaire ou que ce stimulus provoque la fusion de ces dernières vésicules avec celles
enrichies en TfR. Cette dernière possibilité peut laisser croire que les vésicules GLUT4+/TfR-
transitent au niveau des endosomes de recyclage pour atteindre la membrane plasmique durant
la contraction musculaire. D'un point de vue physiologique, il est à ce jour difficile d'expliquer
les raisons pour lesquelles la contraction musculaire mobilise sélectivement les vésicules
GLUT4+/TfR+ à la membrane plasmique et non au niveau des tubules-T. Durant la
contraction musculaire, les besoins énergétiques soudains et accrus du muscle requièrent une
mobilisation rapide des transporteurs de glucose à la surface cellulaire. Puisqu'il a été
démontré que le recyclage du TfR est beaucoup plus rapide que celui de GLUT4 au niveau
basal et que l'ablation endosomale ne fait que retarder l'apparition de GLUT4 à la surface
cellulaire suite à une stimulation insulinique, ceci suggère que les GLUT4 associés aux
endosomes de recyclage sont plus rapidement recrutés à la surface que ceux qui n'y sont pas
associés. À titre spéculatif, ces résultats soulèvent la possibilité que la mobilisation des
GLUT4 associés aux endosomes de recyclage constitue un moyen rapide et efficace pour
augmenter la captation du glucose au niveau de la membrane plasmique et ainsi répondre
adéquatement à la demande énergétique du muscle en activité.
D'autre part, bien que cette étude révèle l'existence de deux types de vésicules GLUT4
sensibles à la contraction musculaire, elle ne nous a pas permis de déterminer si la contraction
147
musculaire induisait également la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique à partir
d'un réservoir dépourvu en TfR. Une technique nous permettant de vérifier ce dernier point
consisterait à effectuer une ablation endosomale en utilisant un conjugué HRP (horseradish
peroxidase) lié à la transferrine. Il serait ainsi possible de déterminer par fractionnement
membranaire et immunobuvardage si l'ablation endosomale amène une inhibition complète ou
partielle de la translocation de GLUT4 induite par la contraction au niveau de la membrane
plasmique. Nous avons récemment effectué des expériences préliminaires dans notre
laboratoire afin de mettre au point cette technique au niveau du muscle squelettique et pour
ainsi répondre à cette question.
Brièvement, le principe de la technique d'ablation endosomale consiste à incuber un muscle
isolé en présence d'un conjugué HRP lié à la transferrine durant une période suffisante pour
permettre à ce conjugué de se lier via la transferrine au TfR. Puisque ce conjugué est
imperméable aux membranes lipidiques, il ne peut se lier qu'aux TfR présents à la surface des
myocytes mais également à ceux qui recyclent de façon constitutive à la surface cellulaire.
Cette incubation permet donc l'internalisation du complexe HRP-Tf-TfR au niveau des
endosomes de recyclage. Dans une première série d'expériences, nous avons donc optimisé la
formation du complexe HRP-Tf-TFR en ajustant la température, le temps d'incubation ainsi
que la composition du milieu d'incubation du muscle, tout ceci dans le but de reproduire des
conditions physiologiques pour assurer le recyclage du TfR et la survie du muscle tout au long
du protocole. Durant une seconde période d'incubation, on ajoute du diaminobenzidine (DAB)
en absence (muscle contrôle) ou en présence de peroxyde d'hydrogène (H2O2) aux muscles
mis en présence du conjugué. Le DAB, qui diffuse à travers les membranes lipidiques, se
retrouve alors piégé à l'intérieur des endosomes de recyclage. L'ablation endosomale s'effectue
par l'ajout de H2O2 puisque cela permet à l'enzyme HRP d'oxyder le DAB en effectuant le
transfert des électrons du H2O2 au DAB. Cette réaction conduit à la polymérisation du DAB et
donc à la formation d'un complexe de haut poids moléculaire qui empêche le recyclage du TfR
à la surface cellulaire. Puisque théoriquement, le conjugué HRP-Tf se lie uniquement aux TfR
qui ont atteint la surface cellulaire, l'ablation devrait être spécifique aux endosomes de
recyclage.
148
Les résultats de ces expériences préliminaires révèlent que l'efficacité de l'ablation endosomale
dans des conditions optimales est d'environ 50 %. En effet, nos résultats d'analyse par
immunobuvardage révèlent une diminution d'environ 50% du contenu en TfR dans le lysat
total de muscles soumis à l'ablation endosomale puisque la polymérisation du DAB empêche
l'immunodétection du TfR. Des expériences supplémentaires seront cependant nécessaires afin
de s'assurer que cette technique d'ablation est spécifique aux endosomes de recyclage. En
effet, ceci pourra être vérifié qualitativement ou de façon dynamique par microscopie
électronique en utilisant des anticorps couplés à des protéines fluorescentes dirigées contre le
TfR et GLUT4 ou en visualisant la présence de polymères de DAB à l'intérieur des endosomes
de recyclage. De plus, la spécificité de l'ablation endosomale pourra indirectement être évaluée
par immunobuvardage du lysat total de muscles en vérifiant si certaines structures
endosomales telles que le réseau Trans-Golgi ou les lysosomes sont affectées par l'ablation
endosomale. En effectuant des mesures de transport du glucose au niveau des muscles soumis
à l'ablation endosomale, il sera ainsi possible de déterminer le rôle des endosomes de
recyclage dans le transport du glucose activé par la contraction induite par stimulation
électrique dans les muscles isolés.
D'autre part, les techniques utilisées dans la première étude ne permettent pas de déterminer si
les vésicules GLUT4 dépourvues en TfR mobilisées par l'insuline et la contraction sont
distinctes. La séparation et la caractérisation biochimique de ces vésicules s'avéreraient par
contre ardues considérant la multitude de compartiments intracellulaires et les difficultés
reliées à l'isolation et la séparation de ces vésicules avec les techniques disponibles
actuellement. Une autre observation émergeant de cette étude est que la contraction
musculaire induit également la translocation du TfR à partir de vésicules dépourvues en
GLUT4. Ceci suggère que le transport de fer à l'intérieur de la cellule musculaire en activité
contribue à maintenir certains processus cellulaires fondamentaux. À ce sujet, certaines études
ont rapporté que la déficience en fer perturbait les capacités contractiles du muscle et le
métabolisme aérobie en affectant la respiration mitochondriale (Finch, CA, et al. 1976;
McLane, JA, et al. 1981). Ainsi, il serait intéressant de déterminer plus spécifiquement le rôle
du fer dans le maintien de l'intégrité contractile et sa contribution possible au niveau des
mécanismes cellulaires régulant le métabolisme du glucose durant la contraction musculaire.
149
FIGURE 9 :Modèle hypothétique de la translocation de GLUT4 stimulée par l'insuline et la contraction musculaire dans le muscle squelettique. En présence d'insuline, GLUT4 est mobilisé à la membrane plasmique et aux tubules-T à partir de vésicules dépourvues en TfR (1). Durant la contraction musculaire, GLUT4 est recruté aux deux compartiments de surface à partir de vésicules distinctes : la translocation de GLUT4 aux tubules-T s'effectue à partir de vésicules dépourvues en TfR (2) alors que la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique s'effectue à partir de vésicules enrichies en TfR (3). La contraction musculaire stimule également la translocation du TfR à partir de vésicules dépourvues en GLUT4 (4). Puisque la contraction musculaire augmente la colocalisation vésiculaire de GLUT4 et du TfR, l'hypothèse veut que les vésicules GLUT4 dépourvues en TfR fusionnent avec les endosomes de recyclage afin d'atteindre la membrane plasmique (5).
Plusieurs travaux ont proposé que la kinase activée par l'AMP, l'AMPK, constitue un nouveau
médiateur impliqué dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du
glucose. En effet, il a été démontré que l'AMPK est activée par l'exercice ou la contraction
musculaire in situ, et in vitro dans le muscle isolé (Goodyear, LJ 2000; Winder, WW and
Hardie, DG 1999). De plus, l'utilisation de souris transgéniques exprimant une forme
dominante négative de l'AMPK α-2 a permis de démontrer que l'activation de l'AMPK est en
partie responsable de l'augmentation du transport du glucose et de la translocation de GLUT4
induite par la contraction musculaire et qu'une autre voie, indépendante de l'activation de cette
150
kinase, contribue à ces effets (Mu, J, et al. 2001). Par ailleurs, il a été proposé que la
stimulation maximale du transport du glucose induite par l'insuline et la contraction
musculaire nécessite une augmentation de l'activité intrinsèque des transporteurs de glucose
GLUT4 qui sont mobilisés à la surface cellulaire par ces stimuli (Moyers, JS, et al. 1996;
Somwar, R, et al. 2001; Somwar, R, et al. 2001; Sweeney, G, et al. 1999; Zierler, K 1998). La
régulation de l'activité intrinsèque des transporteurs de glucose semble être associée à
l'activation de la p38 MAPK puisque l'inhibition de l'activité de cette kinase par le SB230580
induit une réduction du transport du glucose sans affecter la translocation de GLUT4 au
niveau des cellules adipeuses et musculaires en culture (Sweeney, G, et al. 1999).
Dans le deuxième article, nous avons voulu déterminer le rôle de l'AMPK dans la stimulation
du transport du glucose et de la translocation de GLUT4 au niveau de la membrane plasmique
et/ou des tubules-T en utilisant un agent activateur de l'AMPK, le AICAR. Puisque nous
avions préalablement démontré que la contraction mobilisait deux différentes populations de
vésicules GLUT4, dont une était associée au TfR, nous nous sommes ainsi intéressés à vérifier
l'effet du AICAR sur la translocation du TfR aux deux types de compartiments de surface. Nos
résultats démontrent que l'infusion de AICAR provoque une augmentation globale de la
captation du glucose au niveau de l'organisme ainsi qu'au niveau du muscle squelettique de rat.
Par fractionnement membranaire, nous avons observé que le AICAR stimulait la translocation
de GLUT4 spécifiquement au niveau de la membrane plasmique, mais pas au niveau des
tubules-T. Parallèlement, nous avons observé une augmentation de la translocation du TfR à la
membrane plasmique mais pas au niveau des tubules-T. La mobilisation du TfR par le AICAR
à la membrane plasmique a été confirmée par des résultats démontrant que le AICAR stimule
la captation de la transferrine marquée au niveau du muscle EDL isolé. Ces résultats
démontrent que le AICAR stimule la translocation de GLUT4 et du TfR uniquement au niveau
de la membrane plasmique et que les tubules-T ne contribue pas à l'augmentation du transport
du glucose stimulé par le AICAR. Considérant l'ensemble de ces données, nous avons donc
émis l'hypothèse que le AICAR mobilise un seul des deux types de vésicules GLUT4
sensibles à la contraction musculaire, ces vésicules étant celles enrichies en TfR
spécifiquement recrutées à la membrane plasmique. Cette hypothèse s'appuie sur l'observation
que le transport du glucose activé par le AICAR est deux fois moins important que celui de la
contraction musculaire dans le muscle EDL isolé (données non montrées). Ultérieurement, des
151
études d'immunoadsorption de la fraction membranaire enrichie en vésicules GLUT4
permettraient de vérifier si GLUT4 et le TfR colocalisent dans le même type de vésicules ou si
le AICAR stimule la translocation de GLUT4 et du TfR à partir de vésicules distinctes. Une
caractérisation biochimique plus exhaustive des vésicules GLUT4+/TfR+ recrutées par le
AICAR et la contraction musculaire permettrait ainsi de déterminer si ces deux stimuli
mobilisent le même type de vésicules.
Dans le deuxième volet de cette étude, nous nous sommes intéressés à examiner l'implication
de la p38 MAPK dans l'activation du transport de glucose induite par le AICAR in vitro. Nos
données indiquent que le AICAR provoque une augmentation de l'activité de la p38 MAPK α
et β dans le muscle EDL isolé qui est temporellement associée à l'activation de l'AMPK et du
transport du glucose. En utilisant un inhibiteur de la p38 MAPK, le SB203580, nous avons
également démontré que le transport du glucose stimulé par le AICAR était complètement
dépendant de l'activation de la p38 MAPK. L'ensemble des résultats de cette deuxième étude
révèle que l'augmentation du transport du glucose induite par le AICAR s'effectue par deux
types de mécanismes, d’une part par la translocation spécifique de GLUT4 au niveau de la
membrane plasmique et d'autre part, par l'activation de la p38 MAPK possiblement impliquée
dans l'augmentation de l'activité intrinsèque des GLUT4 recrutés à la membrane plasmique
(Voir figure 10).
En plus d'avoir permis d'identifier deux différents types de mécanismes de régulation du
transport du glucose par le AICAR, cette étude a de plus mis en évidence le rôle primordial de
la p38 MAPK dans la captation du glucose induite par cet agent pharmacologique. En effet,
nos résultats suggèrent que la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique est
essentielle mais insuffisante pour augmenter la captation du glucose puisque le transport du
glucose est complètement inhibé en présence de SB203580. Cependant, nous n'avons pas
vérifié la possibilité que le SB203580 pourrait inhiber la translocation de GLUT4 ou
l'amarrage et la fusion des vésicules GLUT4 à la membrane plasmique. Cependant, certaines
études s'opposent à cette conclusion puisque le traitement de cellules musculaires en culture
avec le SB203580 ne perturbe pas l'ensemble de ces processus (Sweeney, G, et al. 1999). À ce
jour, aucune étude n'a vérifié cette éventualité au niveau du muscle squelettique. La création
de souris transgéniques exprimant un épitope myc à la partie exofaciale de GLUT4 permettrait
152
de répondre à cette question. Puisque la translocation de GLUT4 est mesurée en utilisant un
anticorps dirigé contre l'épitope myc exposé à la surface cellulaire, cela nous permettrait de
déterminer si en présence de SB203580, GLUT4 est efficacement mobilisé et inséré à la
membrane plasmique, et donc fonctionnellement apte à transporter le glucose.
Afin de clarifier davantage les mécanismes cellulaires par lesquels la contraction musculaire et
le AICAR stimulent le transport du glucose et la translocation et l'activation de GLUT4, il
serait plus qu'intéressant de déterminer à quels niveaux l'AMPK et la p38 MAPK interagissent
dans la cascade d'événements intracellulaires. En effet, une étude a démontré qu'au niveau des
cellules Clone-9 n'exprimant que l'isoforme GLUT1, la surexpression d'une forme
constitutionnellement active de l'AMPK amène une activation de la p38MAPK, l'activation de
l'AMPK n'étant toutefois pas affectée par le SB203580 (Xi, X, et al. 2001). Ceci suggère donc
que l'AMPK agit en amont de la p38 MAPK pour stimuler le transport du glucose via GLUT1.
Nous avons vérifié cette hypothèse en traitant des muscles isolés au AICAR et au SB203580.
Nos résultats indiquent qu'en présence de SB203580, l'activation de l'AMPK par le AICAR est
préservée bien que l'activité de la p38 MAPK soit inhibée, ce qui supporte l'hypothèse que
l'AMPK agit en amont de la p38 MAPK pour stimuler le transport musculaire de glucose en
présence de AICAR. Toutefois, les médiateurs intracellulaires intervenants en aval de l'AMPK
pour stimuler l'activité de la p38 MAPK ne sont actuellement pas encore identifiés.
153
FIGURE 10 : Modèle hypothétique de la voie de signalisation par laquelle le AICAR stimule la translocation de GLUT4 dans le muscle squelettique. En présence de AICAR, GLUT4 et le TfR sont uniquement mobilisés à la membrane plasmique et non aux tubules-T par un mécanisme dépendant de l'activation de l'AMPK et de la p38 MAPK (1). Il est également possible que la translocation de GLUT4 et du TfR à la membrane plasmique s'effectue à partir de vésicules distinctes (2).
Globalement, l'ensemble des données des deux premiers articles suggère que la contraction
musculaire active différentes voies de signalisation intracellulaires ciblant spécifiquement,
d'une part, les vésicules GLUT4+/TfR+ ou GLUT4-/TfR+ à la membrane plasmique, et d'autre
part, les vésicules GLUT4+/TfR- aux tubules-T, et possiblement à la membrane plasmique. De
plus, ces résultats suggèrent que le AICAR active une seule de ces deux voies de signalisation
afin de stimuler la translocation des vésicules GLUT4+/TfR+ spécifiquement à la membrane
plasmique, et non aux tubules-T. Dans cette optique, il est intéressant de noter que les travaux
de Mu et al ont indiqué que la contraction musculaire stimulait le transport du glucose et la
translocation de GLUT4 par deux voies de signalisation distinctes : une voie dépendante de
l'AMPK et une seconde voie indépendante de l'activation de cette kinase (Mu, J, et al. 2001).
154
À titre spéculatif, il est donc légitime de penser que la translocation des vésicules
GLUT4+/TfR+ à la membrane plasmique induite par le AICAR et la contraction musculaire
soit dépendante de l'activation de l'AMPK alors que la voie indépendante de l'AMPK soit
responsable de la translocation des vésicules GLUT4+/TfR- aux tubules-T induite
spécifiquement par la contraction musculaire. Dans le but de vérifier cette hypothèse, une
perspective intéressante consisterait à utiliser des souris transgéniques exprimant une forme
dominante négative de l'AMPK et à étudier par fractionnement membranaire de muscles l'effet
de la contraction sur le transport du glucose et la translocation de GLUT4 au niveau de la
membrane plasmique et des tubules-T. Les fondements physiologiques de la sélectivité du
processus de translocation de GLUT4 à ces deux types de compartiments de surface en
réponse à la contraction musculaire demeurent encore inconnus. Cependant, puisque nos
travaux démontrent une absence d'effet additif de la translocation de GLUT4 au niveau des
tubules-T simultanément en présence d'insuline et de contraction, il est possible que la cellule
musculaire se soit munie de mécanismes adaptatifs afin de prévenir une entrée trop importante
de glucose qui pourrait lui être toxique. Puisque les tubules-T sont majoritairement
responsables de l'augmentation du transport du glucose, il devient alors concevable qu'un
mécanisme modérateur du transport du glucose soit mis en place spécifiquement au niveau de
ces structures. Cette hypothèse est d'ailleurs supportée par des travaux démontrant que le
défaut de translocation de GLUT4 chez des rats diabétiques injectés à la streptozotocine était
sélectivement observé au niveau des tubules-T en présence d'insuline (Dombrowski, L, et al.
1998).
Dans une autre perspective, des études plus approndies seraient requises afin de discerner si
les vésicules GLUT4+/TfR+ recrutées par la contraction et par le AICAR à la membrane
plasmique représentent les endosomes de recyclage ou si ces vésicules appartiennent à une
population de vésicules spécialisées non associées au système endosomal. Par la microscopie
confocale ou électronique du muscle, il serait par exemple possible de visualiser
qualitativement le mouvement intracellulaire et le niveau de colocalisation de GLUT4 et du
TfR dans le temps en effectuant un double marquage de ces protéines avec des molécules
fluorescentes ou des particules d'or.
155
Dans un autre ordre d'idées, certaines évidences dans la littérature suggèrent que le monoxyde
d'azote serait impliqué dans l'effet stimulateur de la contraction musculaire sur le transport du
glucose au niveau du muscle squelettique. L'action du monoxyde d'azote pourrait, d'une part,
être attribuable à un effet direct au niveau cellulaire, ou à un effet indirect par l'augmentation
du flot sanguin. En effet, certains travaux chez l'humain et le rongeur ont démontré qu'un
inhibiteur des NOS, le L-NAME, induisait une diminution du transport du glucose induite par
la contraction musculaire in vitro ou par l'exercice (Balon, TW and Nadler, JL 1994; Bradley,
SJ, et al. 1999; Roberts, CK, et al. 1997). Cependant, d'autres études ont contredit ces
observations (Etgen, GJ, Jr., et al. 1997; Higaki, Y, et al. 2001; Rottman, JN, et al. 2002). De
plus, les données concernant une contribution possible du flot sanguin sont tout aussi
contradictoires. Des études chez l'humain ont révélé une inhibition (Dyke, CK, et al. 1995;
Gilligan, DM, et al. 1994; Hickner, RC, et al. 1997) ou une absence d'inhibition (Radegran, G
and Saltin, B 1999; Wilson, JR and Kapoor, S 1993) du L-NAME sur le débit sanguin fémoral
lors de l'exercice. D'autre part, certains travaux ont démontré que les enzymes eNOS et nNOS
étaient activées suite à leur phosphorylation par l'AMPK in vitro (Chen, ZP, et al. 1999; Fryer,
L, et al. 2000). De plus, il a été démontré que le transport du glucose activé par le AICAR était
dépendant de l'activation des NOS dans les cellules H2K-b et dans les muscles EDL et soléaire
isolés (Fryer, L, et al. 2000).
Le principal objectif de notre troisième étude était donc de clarifier l'implication du monoxyde
d'azote dans la stimulation du transport du glucose induite par le AICAR dans différents types
de muscle de rat. Globalement, l'analyse de ces résultats nous a permis de déterminer que
l'activation du transport du glucose par le AICAR, et le rôle du monoxyde d'azote dans cet
effet, variaient, d'une part, selon le type de fibres musculaires impliquées, et d'autre part, selon
le modèle expérimental utilisé (in vitro versus in vivo). En effet, nos résultats ont d'abord mis
en évidence qu'in vitro, le AICAR stimulait uniquement le transport du glucose dans les
muscles enrichis en fibres glycolytiques comme l'EDL et l'épitrochlearis, et non au niveau d'un
muscle oxydatif comme le soleus. Par le traitement in vitro des muscles glycolytiques avec le
L-NAME, nous avons de plus observé que le monoxyde d'azote n'était pas impliqué dans la
voie de signalisation intracellulaire par laquelle le AICAR active le transport du glucose.
Toutefois, l'infusion de AICAR par la technique du clamp euglycémique a induit une
augmentation de la captation du glucose, tant au niveau des muscles glycolytiques
156
qu'oxydatifs. Ces données suggèrent donc que l'augmentation de la captation du glucose
induite par le AICAR in vivo nécessite l'intervention de certains facteurs vasculaires, à tout le
moins au niveau des muscles oxydatifs.
Notre hypothèse de travail consistait donc en second lieu à déterminer si le monoxyde d'azote
pourrait contribuer, par son action vasodilatatrice sur les vaisseaux sanguins, à l'augmentation
de la captation du glucose suite à l'infusion de AICAR dans les muscles glycolytiques et
oxydatifs. Nous avons alors observé que l'infusion de AICAR induisait une augmentation de
la concentration plasmatique de nitrates, indicateurs d'une augmentation de la production de
monoxyde d'azote. Afin de supporter ces données, nous avons ensuite démontré que le AICAR
activait la phosphorylation de eNOS sur le résidu sérine 1179, celle-ci ayant été démontrée
comme stimulant l'activité de eNOS (Chen, ZP, et al. 1999; Dimmeler, S, et al. 1999; Fulton,
D, et al. 1999; Michell, BJ, et al. 2001; Montagnani, M, et al. 2001). Cependant, cette étude ne
nous a pas permis de déterminer si eNOS était directement phosphorylée par l'AMPK comme
certains travaux le suggèrent (Chen, ZP, et al. 1999; Fryer, L, et al. 2000). De plus, les
résultats de cette étude n'ont pas permis d'exclure la possibilité que certaines composantes
vasculaires, autres que le monoxyde d'azote, pourraient être régulées par le AICAR et ainsi
participer à l'augmentation de la captation musculaire de glucose. De façon générale, ces
données proposent donc qu'in vivo, l'activation de eNOS en réponse au AICAR contribue à
l'augmentation de la captation du glucose dans le muscle squelettique via la production de
monoxyde d'azote et à son action vasodilatatrice sur le système vasculaire. Une expérience
pertinente permettant de valider cette hypothèse consisterait à traiter des souris invalidées pour
le gène de eNOS avec le AICAR.
L'absence d'activation du transport du glucose par le AICAR dans le muscle soléaire et non
dans les muscles EDL et épitrochlearis isolés suscite certaines interrogations. Il a été sugéré
que l'état nutritionnel, et plus spécifiquement la concentration musculaire de glycogène,
pourrait réguler l'activation de l'AMPK et le transport du glucose en réponse au AICAR ou à
la contraction musculaire. En effet, des travaux récents ont indiqué que le niveau d'activation
de l'AMPK et du transport du glucose en réponse au AICAR et à la contraction dans les
muscles glycolytiques isolés était plus important chez les rats à jeun que chez les rats nourris
(Ai, H, et al. 2002). De plus, il a été démontré que l'activation de l'AMPK α-2 et du transport
157
du glucose sont négativement corrélées au contenu en glycogène musculaire durant la
contraction (Derave, W, et al. 2000; Kawanaka, K, et al. 2000) ou suite à l'infusion de AICAR
(Wojtaszewski, J, et al. 2002). Dans le muscle soléaire isolé, la contraction musculaire a
produit une augmentation de l'activité de l'AMPK uniquement dans les muscles pauvres en
glycogène (Derave, W, et al. 2000). Il est ainsi concevable de spéculer que l'absence
d'activation de l'AMPK par le AICAR dans le muscle soléaire isolé est attribuable à une
concentration plus importante de glycogène dans ce type de muscle. Ainsi, il est possible que
même à l'état de jeûne, le niveau de glycogène musculaire soit trop élevé pour permettre
l'activation de l'AMPK dans ce type de fibre. Cette hypothèse pourrait également expliquer
que l'on ait observé une activation de l'AMPK dans le muscle soléaire de rat soumis à un jeûne
plus long (Fryer, L, et al. 2000). Afin de clarifier ce point, une expérience intéressante
consisterait à nourrir des rats avec un régime riche en lipides afin de diminuer le contenu
musculaire en glycogène et de mesurer l'activité de l'AMPK et le transport du glucose dans le
muscle soléaire isolé traité au AICAR. Une autre explication possible de l'absence d'activation
de l'AMPK dans le muscle soléaire isolé traité au AICAR émerge de l'observation que
l'expression des sous-unités α-1 et α-2 de l'AMPK est plus faible dans le muscle soléaire
comparativement au muscle EDL. Puisque ces sous-unités sont impliquées dans l'activation de
l'AMPK, on peut donc penser que leur expression réduite dans le muscle soléaire
comparativement au muscle EDL peut expliquer la différence de sensibilité de ces deux types
de muscle au AICAR. La mesure du transport du glucose et de l'activité de l'AMPK chez des
souris transgéniques surexprimant ces deux sous-unités dans le muscle soléaire permettrait de
vérifier cette dernière hypothèse.
De façon générale, les résultats des études présentés dans cette thèse mettent en évidence la
complexité des mécanismes intracellulaires par lesquels la contraction musculaire stimule la
translocation de GLUT4 et le transport du glucose dans le muscle squelettique de rat. En effet,
nous avons démontré que l'insuline et la contraction musculaire mobilisent GLUT4 à partir de
différentes populations de vésicules. De plus, la contraction musculaire induit la translocation
de GLUT4 à partir d'au moins deux compartiments vésiculaires différents, chacun d'eux étant
distinctement mobilisés aux deux structures de surface de la cellule musculaire, soit la
membrane plasmique et les tubules-T. De plus, nos travaux indiquent que l'activation de
l'AMPK par le AICAR induit sélectivement la translocation de GLUT4 à la membrane
158
plasmique, possiblement à partir des vésicules GLUT4 enrichies en TfR sensibles à la
contraction. Finalement, nos études ont révélé que l'activation du transport du glucose par le
AICAR est spécifiquement observable au niveau des muscles glycolytiques isolés et que cette
activation était dépendante de la p38 MAPK, mais indépendante du monoxyde d'azote.
Cependant, nos résultats suggèrent un rôle vasculaire du monoxyde d'azote dans
l'augmentation de la captation du glucose induite par le AICAR in vivo dans les muscles
glycolytiques et oxydatifs. Globalement, ces études ont contribué à l'amélioration de notre
compréhension des mécanismes de régulation du métabolisme cellulaire du glucose durant la
contraction musculaire et ne pourront que favoriser le développement de nouvelles avenues
thérapeutiques dans le traitement de la résistance à l'insuline et du diabète de type 2.
159
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