maladies mitochondriales (mm) : rappels (i) · 2 80%
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1
Véronique PAQUIS-FLUCKLINGER
IRCAN, UMR 7284 / INSERM U1081 / UNS Service de Génétique Médicale, CHU de Nice
Centre de Référence des Pathologies Mitochondriales
“Diagnostic génétique des suspicions de maladies mitochondriales: exome first?”
SFEIM, Paris, 18 Novembre 2019
Centre de Référence
Maladies Mitochondriales
Maladies mitochondriales (MM) : rappels (I)
Le diagnostic positif repose
sur le diagnostic génétique
Tous les modes de transmission possibles
(Ar, AD, lié à l’X, cytoplasmique, de novo)
CII
CIII CIV CV
CI CIII CV
CII CIV
ADP + Pi ATP
L’ADNmt code pour 13 protéines sur la centaine
impliquées dans la composition et la biogénèse de la CR
Plus de 400 gènes nucléaires responsables de MM (sans « master genes »)
Un protéome mitochondrial contrôlé par 1500 gènes
Hétérogénéité génétique +++
Maladies mitochondriales (MM) : rappels (II)
Pas de corrélation phénotype/génotype Opa1
AOD
AO « plus » Atrophie optique +
atteinte neuromusculaire
myopathie mitochondriale avec
instabilité de l’ADNmt
Hudson et al., 2008, Brain Amati-Bonneau et al . 2008 Brain
Yu-Wai-Man et al, 2010, Brain
m.3243A>G
CPEO MELAS
MIDD
Plus d’un patient sur 2 en impasse diagnostique
Déficits de la CR primaires et secondaires
Expression « tissu spécifique »
Whole exome sequencing (WES)
2-3% du génome, exons et jonctions exons/introns
85% des mutations responsables de maladies monogéniques
Taux de succès pour l’ensemble des maladies mendéliennes 25 à 50%
Premier succès
d’identification d’un
gène responsable de
maladie mitochondriale
en 2010
30 à 50 000 variants par patient
Cohorte Nombre
de cas Population Méthode Rendement
Taylor et al., 2014 53 Enfants/Adultes WES 52.8%
Ohtake et al., 2014 104 Enfants WES 43.3%
Wortmann et al., 2015 109 Enfants WES 38.5%
Kohda et al., 2016 142 Début pédiatrique WES 34.5%
Pronicka et al., 2016 113 Enfants WES 59.3%
Theunissen et al., 2018 117 Enfants/Adultes
77% < 18 ans ADNmt
WES 20%
49%*
* 31% des gènes identifiés
n’étaient pas dans MitoCarta
Cohortes de patients suspects de MM et WES Les succès du WES
Taux de succès entre 35 et 59%
Nettement supérieur à celui du séquençage classique (11%) (Neveling et al., 2013)
Nombreux biais d’interprétation liés
- À l’âge de la population (enfants versus adultes)
- A l’histoire familiale et aux prélèvements disponibles, trios…
- Aux critères de sélection de la population : importance des RCP++
2
80% <18 ans au moment du diagnostic
117 patients (0-50 ans)
Mitochondrial Disease Criteria (MDC)
(Morava et al., 2006)
Groupe 1 MDC>5
Groupe 2 MDC<5
NGS ADNmt : rendement de 20%
(Sur les 23 patients+ : 9 LHON, 2
MELAS et 5 MIDD)
WES : rendement de 49%
Les limites du WES
Taux d’échec entre 41 et 65%
Différentes raisons liées
- aux critères de sélection de la population : importance des RCP++
- aux mutations localisées dans les régions non codantes => WGS
- à la problématique de hiérarchisation des variants et aux VUS (variant
of unknown signification)
Les scénarios possibles (I)
1 2 3
4 5 6
4
- Tableau néonatal de
défaillance multiviscérale
COQ2
c.437G>A (p.Ser146Asn) hmz
Total variants
Rare variants
shared by the 2 patients
NS/SS/I
Fine search (OMIM, Litterature, etc…)
Homozygous variants
II-1: 63842
II-2: 64127
4817
540
1
15
Les scénarios possibles (II)
Sélection des variations Htz
Sélection des variations
potentiellement pathogènes
(NS/SS/I)
308
1
Exclusion des polymorphismes
7058
23430
6 Gènes avec 2 variations chez le cas index
mais pas chez la sœur et la mère
Gènes codant pour des protéines mito
MDH2
c.398C>T (p.Pro133Leu)
c.620C>T (p.Pro207Leu)
Chez le cas index : 38533 variants
- Tableau très sévère dès
les premiers mois de vie
avec hypotonie, RPM, ISP,
épilepsie réfractaire,
rétinite pigmentaire
citrate
2-oxoglutarate
succinate fumarate
malate
oxaloacetate
NAD+
NADH
Lactate Pyruvate LDH
PC
MDH2 : malate déshydrogénase mitochondriale
Reference
Sequence
c.398C>T
(p.Pro133Leu)
c.620C>T
(p.Pro207Leu)
Subject
Father
Mother
Sister
S1 II
I 1 2
1 2
Family 1
c.398C>T
(p.Pro133Leu)
c.596delG
(p.Gly199Alafs*10)
c.398C>T
(p.Pro133Leu)
c.109G>A
(p.Gly37Arg)
S2 II
I 1 2
1
Family 2
S3 II
I 1 2
1
Family 3
Les scénarios possibles (II)
Les scénarios possibles (III)
Total variants
Index case
Rare variants
653
24
NS/SS/I
8 403
70786
67 Homozygous variants
?????
Genes encoding mitochondrial proteins
- Encéphalopathie de début
néonatal très sévère
(Leigh)
- Déficit en CI dans le
muscle et les fibroblastes
3
Centre de Référence
des maladies mitochondriales
CALISSON: Coordonnateur : Nice Constitutif :Marseille Compétence : Lyon, Montpellier, Toulouse
Tableau clinique évocateur
(MELAS, POLG..)
OUI Analyse ciblée
(PCR-RFLP, Sanger…)
NON
Biopsie tissulaire + fibros Prélèvement sanguin, urinaire et/ou
Histologie
Spectroscopie
+/- BN-PAGE
ADNmt: XL +/- SB, qPCR
Clinique, paraclinique (IRM, EMG…)
Suspicion de MM RCP
(hebdomadaires, bimensuelles…)
CALISSON
Négatif
WGS / PFMG2025
RNA-seq
Analyses fonctionnelles
sur gène(s) candidats
NGS ADNmt
Positif
5-15%
Négatif
WES
Positif
40% Négatif
Panel V4 (366 gènes)
Positif
10-20%
RCP
(hebdomadaires, bimensuelles…)
CALISSON
Etude sur fibre musculaire isolée pour l’analyse
des variants de l’ADNmt
COX/SDH
VUS hétéroplasmiques de l ’ADNmt
COX-négatives sur biopsie congelée 0
3000
6000
0
40
80
12
0
16
0
20
0
24
0
28
0
32
0
36
0
40
0
44
0
48
0
52
0
56
0
60
0
Fluorescent PCR-RFLP
mutant wild type
-20
0
20
40
60
80
100
120
cox+ cox-
P <0,0001
Le niveau
d’hétéroplasmie du
variant est quantifié
dans chaque fibre
isolée
Les fibres COX-négatives et
COX-positives sont isolées
par microdissection laser
m.15958A>T
40
50
60
70
80
90
100
cox+ cox-
P 0,0002
m.5703G>A
-20
0
20
40
60
80
100
120
cox+ cox-
P <0,0001
2
0
3
0
4
0
5
0
6
0
7
0
8
0
9
0
10
0
cox+ cox-
m.4935A>G
P 0,1425
10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 110
cox+ cox-
m.12293G>A
P <0,0001
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 110
cox+ cox-
m.9166T>C
P <0,0001
-20
0
20
40
60
80
100
120
cox+ cox-
m.590A>G
P <0,0001
-20
0
20
40
60
80
100
120
cox+ cox-
m.4327T>C
P <0,0001
-20
0
20
40
60
80
100
120
cox+ cox-
m.5672 T>C
P <0,0001
Significantly higher (P < 0.05) heteroplasmic level in COX-deficient fibers
compared with COX-positive fibers for 7 variants
Etude sur fibres isolées
No significant
difference
CALISSON
80 patients suspects de MM*
24 enfants – 56 adultes
NGS ADNmt 1/24 enfants (4.1%)
14/56 adultes (25%)
* Prélèvements tissulaires 63/80
Positif
Négatif
65 patients
Panel 281 gènes
5/23 enfants (21.7%)
3/42 adultes (7.1%)
Positif
125 patients (78 <1 an)
Panel 132 gènes
Positif
19 patients (15.2%)
Pas de réelle plus value à utiliser
des panels plus larges
Quels panels de gènes? Panels versus WES
4
ADNmt négatif
CALISSON
WES sur une série de patients
suspects de maladie mitochondriale
Tableaux cliniques, à début précoce ou tardif, évoquant une maladie
mitochondriale
Déficit de la chaîne respiratoire et/ou une instabilité de l’ADNmt et/ou
des anomalies histologiques (muscle et/ou foie)
53 familles (91 sujets)
Gènes candidats/panel négatifs
10 gènes sur 21 ne codent pas pour des protéines mitochondriales
CALISSON
WES sur une série de patients
suspects de maladie mitochondriale : résultats
3 mutations de novo
3 correspondent à des nouveaux gènes qui n’auraient pas permis de
confirmer le diagnostic sans transfert vers l’équipe de recherche
21 gènes différents (40%)
21 diagnostics positifs sur 53 patients (40%)
Gène(s) identifié(s) / famille Variants retrouvés Hérité ou De
Novo
BCS1L BCS1 Homolog, Ubiquinol-Cytochrome C Reductase Complex
Chaperone
c.185G>C (p.Trp62Ser) Htz Hérité
c.550C>T (p.Arg184Cys) Htz Hérité
CACNA1A Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 A c.4046G>A (p.Arg1349Gln) Htz De Novo
CHCHD10 Coiled-Coil-Helix-Coiled-Coil-Helix Domain Containing 10 c.176C>T (p.Ser59Leu) Htz Hérité
CHRND Cholinergic Receptor Nicotinic Delta Subunit c.481G>A (p.Asp161Asn) Htz Hérité
c.769T>C (p.Cys257Arg) Htz Hérité
COQ2 Coenzyme Q2, Polyprenyltransferase c.437G>A (p.Ser146Asn) Hmz Hérité
EIF2B4 Eukaryotic Translation Initiation Factor 2B Subunit Delta c.673C>G (p.Pro225Ala) Hmz Hérité
EPCAM et
SLC3A1
Epithelial Cell Adhesion Molecule et Solute Carrier Family 3
Member 1
c.347G>A (p.Cys116Tyr) Hmz Hérité
c.1870A>G (p.Thr624Ala) Hmz Hérité
GARS Glycyl-TRNA Synthetase c.1622C>G (p.Thr541Arg) Htz ?
GJB1 Gap Junction Protein Beta 1 c.688C>T (p.Arg230Cys) Htz Hérité
KIF1A Kinesin Family Member 1A c.935C>T (p.Thr312Ile) De Novo
MDH2 Malate Dehydrogenase 2 c.398C>T (p.Pro133Leu) Htz Hérité
c.620C>T (p.Pro207Leu) Htz Hérité
MTO1 Mitochondrial TRNA Translation Optimization 1 c.1390C>T (p.Arg464Cys) Hmz Hérité
NDUFA10 NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Subunit A10 c.415C>T (p.Arg139Cys) Hmz Hérité
OPA1 OPA1, Mitochondrial Dynamin Like GTPase c.1892_1893delAT (p.His631Argfs*3) Htz Hérité
PIGA Phosphatidylinositol Glycan Anchor Biosynthesis Class A c.823C>T(p.Arg275Trp) Hémiz Hérité
PLA2G6 Phospholipase A2 Group VI c.109C>T (p.Arg37*) Htz De Novo
c.1748T>C (p.Met583Thr) Htz Hérité
SERAC1 Serine Active Site Containing 1 c.1822_1828+10delTCAGCAGGTATTCACT
CinsACCAACAGG Hmz Hérité
SLC13A5 Solute Carrier Family 13 Member 5 c.148T>C (p.Cys50Arg) Hmz Hérité
ST3GAL5 ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 5 c.862C>T (p.Arg288*) Hmz Hérité
ZC4H2 Zinc Finger C4H2-Type Containing c.631C>T (p.Arg211Trp) Hémiz Hérité
Whole genome sequencing (WGS)
Hiérarchisation des variants?
Identification de
mutations dans les
régions codantes et non
codantes, incluant les
variants structuraux
=> Plan France Médecine Génomique 2025
Interprétation Identitovigilance Validation Ségrégation familiale
LABORATOIRE EXPERT
Centres de référence/compétence Prescription encadrée
NGS (ADNmt + panel nucléaire + WES)
Whole Génome
Plateforme AURAGEN PFMG 2025
Négatif
Centre de référence Prescription encadrée
RCP
Professionnels pour les RCP
• Neurologue ou neuropédiatre affilié à un Centre de Référence
• Généticien moléculaire du laboratoire expert
• Généticien clinicien • Anatomopathologiste • +/- Radiologue
Circuit de prescription et rendu des résultats
Spécialistes
Généticien
Positif
CALISSON
Conclusions
Pour le diagnostic en 2020 : WES first!
Place de la biopsie musculaire
Meilleur rendement 40% vs 10 à 20% pour les panels
Pour éviter la mise à jour régulière des panels
Importance des RCP
Attente résultats PFMG 2025 pour WGS first?
CALISSON
Etudes fonctionnelles à développer
5
Service de Génétique Médicale, CHU de Nice
Centre de Référence des Maladies Mitochondriales
Sylvie Bannwarth
Annabelle Chaussenot
Konstantina Fragaki
Samira Saadi
Gaëlle Auge
Christelle Camuso
Bernadette Chafino
Charlotte Cochaud
Sandra Foustoul
Elamine Zereg
Godelieve Morel
Morgane Plutino
Véronique Paquis-Flucklinger
IRCAN, CNRS UMR 7284/INSERM U1081/UNS Faculté de Médecine
CALISSON
Marseille Sharam Attarian
Jean Pouget
Brigitte Chabrol
Aline Cano
René Valéro
Lyon
Nathalie Guffon
Alain Fouilhoux
Cécile Acquaviva
Toulouse
Patrick Calvas
Montpellier
Pierre Labauge
Cécilia Marelli
Agathe Roubertie
Services d’anatomopathologie