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N° ORDRE : 4114

THESE DE DOCTORAT

PRESENTEE A

L’ UNIVERSITE DE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Marion TARBE

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : CHIMIE ORGANIQUE

CONCEPTION , ETUDE STRUCTURALE ET PROPRIETES

FONCTIONNELLES DE NOUVEAUX PEPTIDOMIMES ANTIGENIQUES POUR UNE IMMUNOTHERAPIE ANTITUMORALE

Directeur de thèse : Pr Stéphane QUIDEAU

Soutenue le 26 Novembre 2010

Après avis de :

P. DUMY : Professeur, Université Joseph Fourier, Grenoble I

D. HOUSSET : Directeur de recherche (CNRS), Université Joseph Fourier, Grenoble I

Devant la commission d’examen formée de :

P. DUMY Professeur, Université Grenoble I Rapporteur

D. HOUSSET Directeur de recherche (CNRS), Université Grenoble I Rapporteur

B. PFEIFFER Les Laboratoires Servier, Croissy-sur-Seine Examinateur

J.-M. AIZPURUA Professeur, Université du Pays-Basque Examinateur

C. DOUAT-CASASSUS Chargée de recherche (CNRS), Université Bordeaux I Examinateur

S. JAVERZAT Professeur, Université Bordeaux I Président de Jury

S. QUIDEAU Professeur, Université Bordeaux I Directeur de thèse

-2010-

i

Remerciements

Cette thèse, réalisée au sein de l’Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB), est

l’aboutissement de trois années de travail de recherche dans le groupe Synthèse de l’Institut

des Sciences Moléculaires (ISM). Je tiens à remercier les directeurs de l’IECB, le Dr Jean-

Jacques Toulmé et le Dr Ivan Huc ainsi que le Dr Philippes Garrigues et le Pr Eric Fouquet,

respectivement directeurs de l’ISM et du groupe Synthèse, pour m’avoir accueillie dans leur

laboratoire. Ces travaux ont été financés par Les laboratoires Servier après sélection par la

Société Française de Chimie Thérapeutique. Je remercie chaleureusement le Dr Bruno

Pfeiffer qui a suivi ce travail avec intérêt pendant ces trois ans.

Je tiens tout d’abord à remercier le Pr Stéphane Quideau pour m’avoir accueillie dans son

équipe. Il m’a permis de vivre une expérience de thèse riche en rencontres et en

rebondissements.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Dr Céline Douat-Casassus qui m’a

encadrée et guidée depuis mon stage de master 2 et tout au long de cette thèse. Merci pour

tout le temps que tu m’as consacrée, notamment pour la relecture de ce manuscrit. Merci pour

tes précieux conseils, ta confiance, tes encouragements…et tout le reste !

Je remercie sincèrement le Pr Pascal Dumy et le Dr Dominique Housset d’avoir accepté de

juger ce travail en tant que rapporteurs ainsi que le Pr Sophie Javerzat d’avoir accepté de

présider ce jury.

Je souhaite également remercier toutes les personnes qui ont contribuées aux différents projets

présentés dans ce manuscrit : Nathalie Marchand-Geneste pour son aide en modélisation

moléculaire, l’équipe du Pr Brian M. Baker pour les résolutions de structures, l’équipe du Pr

Andrew K. Sewell pour les tests biologiques, le Pr Txusmari Aizpurua et Itxaso Azcune qui

n’ont pas hésiter à nous confier leurs molécules β-lactame. Leurs compétences, leur

motivation et leur investissement ont permis de mener à bien les différents projets qui nous

réunissaient.

ii

Bien évidemment, le quotidien de ces trois années a été rythmé par de nombreuses rencontres

et échanges avec les différents membres de l’équipe et des équipes voisines. Je tiens donc à

tous les remercier pour leurs conseils, leur bonne humeur et leur sympathie.

Je commencerai tout d’abord par les modélisateurs callées toutes la journée devant leur ordi :

Jean-mimi, à quand une petite bière sur le vieux port ?!; Clément dit "Piou", Judith, Jean; les

RMNistes, Axelle pour ton énergie contagieuse, Cécile pour ta gentillesse (alors cette

autoroute, ça roule ?) Les massistes : Katel, merci pour tes dépannages express et ton calme à

toute épreuve… Stéphane, mes après-midis de spectro de masse ne seront plus les mêmes sans

tes sifflotements! Passons au premier étage : Sabrina, Natacha, Cécile, les pauses déjeuners à

discuter recherche de champignons et vignes ; Fred merci d’avoir partagé avec moi le stress et

les galères de la JJC ; Stéph, tu m’as fait découvrir les sushis et bien d’autres choses ; tu

mérites vraiment d’être heureux, alors fais attention à toi… Je n’oublie pas les filles de

l’administration, Annie, Sandra et Stéphanie et de l’accueil, Coralie, Françoise et Samantha

pour leur gentillesse et tous les petits services rendus.

Viennent ensuite les chimistes du second : Benoit sur son petit coin de paillasse, merci d’avoir

écouté ma soutenance à la veille du jour J ; Bobby et le Swing…l’un ne va pas sans l’autre !

Jone, la voyageuse solitaire…alors ce congrès en Inde ? Simon, tes imitations et ton accent à

couper au couteau ! Neil, pour ton calme et ta sympathie ; El tranquilo Oscar, jamais

stressé…comment fais-tu ? Marissa, à quand ta prochaine visite à l’alambic ? Tiny et Stain, le

pays de l’Armagnac vous attend ! Seb et Michael, pour nos soirées passées ensemble pendant

votre trop bref séjour ; Lucille, Claire, Thomas, Elisabeth, Marc, Vania, Guillaume, Yannick,

Tracey, Claude, Gosia, Nico…

Je n’oublie pas nos voisins biologistes, Margo, Cécile, Rosina (bientôt ton tour !), Daniel,

Carmelo, Eric, Denis,…les chimistes ne sont pas toujours responsables des mauvaises

odeurs !

Je tiens également à remercier tous les membres de l’équipe que j’ai côtoyés au fil de ces trois

années, pendant une période plus ou moins longue. Tout d’abord, les personnes qui m’ont

accueillie à mon arrivée en thèse, à savoir les anciens thésards : Gigi, le vrai breton du groupe,

dix colonnes en même temps, c’est beaucoup trop ! Comme tu peux le voir, mon bouclier m’a

permis d’arriver au bout ; Mélanie, merci pour toutes nos discussions et bons moments passés

ensemble, ta simplicité et ton humanité ; Gaëlle, Sophie, Anne-Laure, Delphine, et les

iii

permanents : Rémi, merci pour tes conseils d’HPLC et pour nos discussions sur le monde et la

vie ; Laurent, Denis.

Il y a aussi eu des gens de passage : la bella Anna, ta mémorable Rose, ton grand sourire et

nos séances de gym…pleins de bons souvenirs ! Mamezelle Gueroux, je suis vraiment

heureuse que tu ais atterri en stage chez nous ; tes bonhommes ballons qui décorent le bureau,

les pauses café du matin et ta bonne humeur vont me manquer ; bon courage pour ta thèse.

Leire, merci pour ta générosité et ta simplicité…promis, à bientôt à Donostia ! Merci aussi à

Elodie que j’ai encadrée durant son stage de licence. Je pense également à Jaime, Neela,

Richard, Ada et Vanessa que n’ai pas eu l’occasion de vraiment connaître.

Ensuite, les petits nouveaux : Romain (où en sont tes couplages peptidiques ?), Cyril et

Hélène, déjà très complices dans le rangement du laboratoire, et Emilie, la dernière arrivée

dans le labo des filles (désolé Rémi…), toujours de bonne humeur; bon courage à vous tous

pour cette nouvelle aventure ! Mélanicita, un grand merci pour ton positivisme, tes

discussions pleines de bon sens et tes playlists ! Manu, bien sûr, tes cours d’italien, les pauses

café, nos discussions sur tant de choses ; j’espère que tu trouveras le job que tu mérites. Dans

la continuité des post-docs, Céline F., dernière arrivée, merci pour tes bons conseils à

quelques semaines de la soutenance…juste un peu déçu que l’on ne se soit pas connu plus tôt,

bonne continuation. Sa « prédécesseuse », Séverine et son chouchou…tout une histoire !

J’espère que ta nouvelle vie à Anger, entre carottes et étudiants, se déroule comme tu le veux.

Enfin pour finir dans la série des post-docs, Stefan, bien évidemment, merci pour tes exercices

en chimie et tes précieux conseils en la matière…mais pas « que » !

Un grand merci ensuite, et le mot est faible, à la cuvée de docteurs 2010 avec qui j’ai partagé

pendant ces trois ans l’expérience de doctorant. La miss, je n’oublierai pas nos cours de

cardio-box dantesques, nos soirées essayages, tes Pouah (que j’essaie d’exporter à Marseille)

et nos discussions mas longues sur l’avenir..., ça y est, on y est! Tony, tes cours privés de

mécanismes réactionnels, ta dévotion et tous le reste!…à quand le prochain "femmes

actuelles" ? Et est-ce que tu es disponible le 1 octobre 2007 ?...parce que je fais un petit truc

pour mon anniversaire (mieux vaut tard que jamais…) Marine, ou plutôt "madame la

collaboratrice Servier", nos trois ans (et même cinq ans) passés ensemble ont été riches en

rebondissements : depuis les attributions de bourses de thèse jusqu’à nos embauches

respectives, on en a fait du chemin ! Merci pour tes conseils avisés, ta franchise et toutes nos

soirées à papoter et potiner ; Olivier, grande année pour toi ! Je n’oublierai pas les soirées au

bar à vin et nos discussions sur le couple avec un fond de match de foot ! Tahiri garde

iv

toujours ta bonne humeur et ton calme qui te caractérise! Maria, la première de nous tous à

avoir franchi le cap ; Vanessa, Adeline, Armelle, et bientôt Jeannot. Encore une fois,

félicitations à tous et bon courage pour la suite ! Ceci n’était que le commencement…

Pour finir, un immense merci à toute ma famille : papa, maman, bien évidemment, tout ça,

c’est d’abord grâce à vous ; papa merci pour ton bon sens et tes encouragements année après

année; maman, merci pour tes précieux conseils au quotidien et les dizaines de boîtes

préparées pendant ces trois années. Cécile, ma deuxième maman, merci pour ton soutien et

nos après-midis shopping qui m’ont permis d’oublier les tracas du labo. Merci aussi à mon

club de supporters venu me soutenir le jour J : Jérôme, Elise, Nico, Monique, Francis, Marc,

Dédée, Yves, et tous ceux qui n’ont pas pu être présents : Mamie, Tonton et Tatie, Jean-

jacques, Patricia, Simon, Monique, Mathieu, Mélanie, Marlène, Bernard, Mathieu 2, Marie-

hélène, André, Manu, Vincent, Céline, Anaïs et Théo. Enfin, Cédric, merci pour ton écoute et

ta patience au quotidien…merci pour tout ce que tu m’apportes.

v

Sommaire

Introduction générale 3 Chapitre 1 : L’immunité à médiation cellulaire : 7

Action des lymphocytes T cytolytiques et modulation de leur stimulation par des antigènes peptidiques modifiés.

I. Généralités sur l’immunité à médiation cellulaire 9

II. Présentation de peptides antigéniques par le CMH-I 10

2.1 Formation des complexes binaires peptides antigéniques/CMH-I 10

2.2 Analyse structurale du complexe pCMH 13

III. Stimulation des lymphocytes T cytolytiques CD8+ 16

3.1 Reconnaissance du complexe pCMH par les récepteurs des lymphocytes T 16

3.2 Analyse structurale du complexe ternaire TCR/pCMH 18

IV. Le peptide antigénique et son utilisation en immunothérapie 20

4.1 Le principe de l’immunothérapie 20

4.2 Origine des peptides antigéniques tumoraux 21

4.3 L’utilisation de peptides antigéniques en immunothérapie 22

4.3.1 Les avantages 22

4.3.2 Les limitations 22

4.4 Vers la synthèse de peptidomimes antigéniques 23

4.4.1 Modification de la chaîne peptidique pour accroître 23 la stabilité du peptide en milieu biologique

4.4.2 Modification des résidus d’ancrage pour accroître 29 l’interaction du peptide avec le CMH-I

4.4.3 Modification de la partie centrale interagissant avec 30 les récepteurs des lymphocytes T

Conclusion 35

Références bibliographiques 36

Collaboration 43

Chapitre 2 : Etat de l’art sur la modification du peptide antigénique 45 Melan-A/MART-1 26-35 A27L

Préambule 47

I. Le peptide antigénique Melan-A/MART26-35 A27L 47

1.1 Identification des peptides antigéniques naturels et de leurs analogues 47

vi

1.2 Etude structurale des peptides présentés 48

1.3 Limitation de l’utilisation du peptide ELA en milieu biologique 50

II. Modification du peptide ELA 51

2.1 Modification des extrémités N- et C-terminales du peptide ELA 51

2.2 Modification de la partie centrale du peptide ELA 53

2.2.1 Insertion d’une molécule naturelle en partie centrale du peptide ELA 53

2.2.2 Modification du tétrapeptide GIGI en partie centrale du peptide 56

ELA : Présentation de 23 nouveaux analogues

III. Résultats récents : Etude structurale de différents 62 complexes binaires peptide/HLA-A2

3.1 Synthèse des quatre peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide 63

3.1.1 La synthèse peptidique sur support solide 63

3.1.2 Synthèse des quatre peptidomimes ciblés 64

3.2 Etude structurale des quatre complexes binaires peptide/HLA-A2 69

3.2.1 Génération des cristaux de complexes binaires 69 et acquisition des données cristallographiques

3.2.2 Discussion autour des quatre structures obtenues : 70 comparaison avec celle du complexe ELA/HLA-A2

3.2.3 Corrélation des tests biologiques 73 et des structures cristallines des peptides 6 et 21

Conclusion 75

V. Partie expérimentale 76

4.1 Généralités 76

4.1.1 Conditions expérimentales générales de synthèse en solution 76

4.1.2 Techniques d’analyse des molécules synthétisées en solution 76

4.1.3 Conditions expérimentales générales de 77 synthèse peptidique sur support solide

4.1.4 Techniques d’analyse et de purification des peptides et peptidomimes 78

4.2 Préparation des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 80

4.2.1 Préparation des différents synthons en solution 80

4.2.2 Procédure générale de synthèse des peptides sur support solide 85

4.2.3 Synthèse des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide 86


vii

Chapitre 3 : Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre 95 pour la synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide ELA

Préambule 97

I. Les réactions de « click-chemistry » : La réaction de Huisgen catalysée au cuivre 97

1.1 Les réactions de « click-chemistry» 97

1.2 La réaction de cycloaddition 2+3 alcyne/azoture : 98 La réaction de Huisgen catalysée au cuivre

1.2.1 Mécanisme de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre 99

1.2.2 Effet des conditions réactionnelles 102

1.3 Propriétés structurales des cycles 1,2,3-triazoles : Utilisation au sein de peptides 105

II. Utilisation de la réaction de Huisgen pour la synthèse de nouveaux peptidomimes 107

2.1 Présentation du projet 107

2.2 Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) 109 à la synthèse de peptidomimes de ELA

2.2.1 Synthèse du squelette peptidique sur support solide 110

2.2.2 Préparation des dérivés azotures à introduire en partie centrale 111

2.2.3 Synthèses des peptidomimes : application 116 de la réaction Huisgen catalysée au cuivre (I) sur support solide

2.3 Tests biologiques des peptidomimes issus de la « click-chemistry » 117

2.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 117 56-66 au HLA-A2

2.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 56-66 119 à stimuler des lymphocytes T

III. Modifications des extrémités N- et C-terminales du peptidomimes 58 : 121 synthèse de sept nouveaux analogues

3.1 Présentation des différentes modifications 121

3.2 Synthèse de sept nouveaux analogues du peptidomime 58 122

3.2.1 Réduction de la liaison peptidique en position P8-P9 122

3.2.2 Couplage de la (β-cyclohexyl) alanine sur support solide 123

3.2.3 Synthèse du motif phthalimide en position N-terminale 124

3.2.4 Combinaison des différentes modifications : 126 Génération des quatre analogues supplémentaires

3.3 Tests biologiques des sept nouveaux analogues du peptide 58 127

3.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 69-75 127 au HLA-A2

viii

3.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 69-75 129 à stimuler des lymphocytes T

Conclusion 130

IV. Partie expérimentale

4.1 Synthèse des azotures en solution 131

4.2 Préparation des peptidomimes 56-66 146

4.2.1 Préparation de la résine A 146

4.2.2 Réaction de Huisgen catalysée au cuivre sur support solide 147

4.2.3 Clivage des peptides du support 147

4.2.4 Synthèse et caractérisation des peptidomimes 56-66 147

4.3 Préparation des peptidomimes 69-75 151

4.3.1 Procédure générale de la synthèse de la liaison réductrice 151 en position P8-P9

4.3.2 Procédure générale de la synthèse du motif phthalimide 151

4.3.3 Caractérisation des peptidomimes 69-75 152


Chapitre 4 : Insertion de motifs ββββ-lactame en partie centrale du peptide ELA 163

Préambule 165

I. Les turns dans les peptides : Comment les mimer ? 165

1.1 Présentation et classification des turns dans les peptides 165

1.2 Introduction sur les mimes de turn : Classification 167

1.3 Présentation des mimes internes 167

1.3.1 Les cycles de taille moyenne 167

1.3.2 Les bicycles 169

1.3.3 Les macrocycles 171

1.4 Présentation des mimes externes 173

1.4.1 Les bicycles 173

1.4.2 Les lactames 174

II. Application au peptide antigénique ELA : Synthèse de nouveaux 177 peptidomimes

2.1 Design des peptidomimes 177

2.2 Description de la synthèse des motifs β-lactame 179

2.3 Première stratégie : synthèse des peptidomimes sur la résine Wang 181

2.3.1 Synthèse des peptidomimes 181

ix

2.3.2 Analyse des peptidomimes synthétisés 181

2.3.3 Comment remédier à l’ouverture de cycle ? 189

2.4 Seconde stratégie : synthèse des peptidomimes sur la résine Amino-PEGA 189

2.4.1 Synthèse des peptidomimes 190

2.4.2 Analyse et purification des peptidomimes synthétisés 191

III. Evaluations biologiques des peptidomimes 79-81 et 86-88 191

3.1 Etude des complexes binaires peptidomime/HLA-A2 192

3.1.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes au HLA-A2 192

3.1.2 Evaluation de la stabilité du complexe peptidomime 88/HLA-A2 194

3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes à stimuler des lymphocytes T 195

Conclusion 196


4.1 Synthèse et caractérisation des peptidomimes 79, 80 et 81 197

4.2 Synthèse et caractérisation des peptidomimes 86, 87 et 88 199


Chapitre 5 : Modification du peptide Tax : 209 Insertion d’un motif urée en partie centrale

Préambule 211

I. Le peptide antigénique HTLV-1 Tax 211

1.1 Identification du peptide Tax 211

1.2 Etude structurale du peptide Tax 212

1.2.1 Etude du complexe binaire Tax/HLA-A2 212

1.2.2 Etude de complexes ternaires TCR/Tax/HLA-A2 214

II. Modification de la partie centrale du peptide Tax 217

2.1 Etude bibliographique d’une modification précédemment réalisée 217 par l’équipe du Pr B. M. Baker

2.2 Présentation du projet 219

2.2.1 Design des peptidomimes du Tax 219

2.2.2 Objectif du projet 220

III. Synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide Tax 221

3.1 Etude rétrosynthétique de la partie centrale des peptidomimes ciblés 221

3.2 Synthèse de l’acide 2-(N-Fmoc) aminométhylbenzoïque 221

3.3 Synthèse de peptidomimes du Tax sur un support solide de type Wang 222

x

3.3.1 Synthèse des peptidomimes ne portant pas de motif benzylique 223 en partie centrale : Focalisation sur la synthèse du motif urée

3.3.2 Synthèse de peptidomimes portant un motif benzyle 225 ou fluorobenzyle en partie centrale

3.3.3 Synthèse de peptidomimes portant un motif hydroxybenzyle 228 en partie centrale

3.4 Synthèse sur support solide de type Amino-PEGA de peptidomimes du Tax 232

3.4.1 Présentation et validation de la nouvelle stratégie de synthèse 232

3.4.2 Synthèse de peptidomimes sur la résine H 235

Conclusion 237

IV. Partie expérimentale 238

4.1 Synthèse des différents synthons organiques en solution 238

4.2 Synthèse et caractérisations des peptidomimes 97-103, 106-107 et 110 244

4.2.1 Première stratégie : Synthèse des peptidomimes 97-103, 106 et 107 244 sur la résine Wang

4.2.2 Deuxième stratégie : Synthèse du peptidomime 110 248 sur la résine amino-PEGA


Conclusions et perspectives 253

Production scientifique 255

Publications 257

xi

Avertissements Les composés sont désignés par un chiffre arabe écrit en caractère gras. Les références

bibliographiques, désignées par un chiffre arabe placé en exposant, sont regroupées en fin de

chaque chapitre.

Abréviations

Les abréviations et notations particulières utilisées dans ce manuscrit sont explicitées ci-

dessous :

δ Déplacement chimique Ac Acétyle ACN Acétonitrile AcOEt Acétate d'éthyle ADP Acide adénosine diphosphorique Aib Acide amino-isobutyrique AIBN Azobis(isobutyronitrile) Allyl Allyle Alloc Allyloxycarbonyle aq. Aqueux ATP Adénosine triphosphate Ar Aromatique Bn Benzyle Boc tertio-Butyloxycarbonyle CLHP Chromatographie Liquide Haute Performance CL-SM Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse CMH-I ou II Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I ou II CDR « Complementarity Determining Region » d Doublet DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène DCM Dichlorométhane DIAD di-isopropylazodicarboxylate DIC di-isopropyl-carbodiimide DIEA di-isopropyl-éthylamine DMAP 4-Diméthylaminopyridine DMF Diméthylformamide DMSO Diméthylsulfoxide DPPA Diphénylphophorylazoture EDT Ethanedithiol ESI Ionisation Electrospay Et Ethyle Fmoc Fluorénylméthyloxycarbonyle HATU Hexafluorophosphate de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-

tetramethyl-uronium HBTU Hexafluorophosphate de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-

uronium HLA « Human Leucocyte Antigen » HOBt Hydroxybenzotriazole

xii

HRMS Spectrométrie de masse haute résolution HTLV-I « Human T-Lymphotropic Virus type I » IFN-γ Interféron γ IR Infra-Rouge J Constante de couplage exprimée en Hertz LR-MS Spectrométrie de masse basse résolution LTC Lymphocyte T cytotoxique m Multiplet m-AMBA Acide 3-aminométhylbenzoïque Me Méthyle Ms Mésyle MS Spectrométrie de Masse NMP N-méthyl-2-pyrrolidone o-AMBA Acide 2-aminométhylbenzoïque p Para PBL « Peripheral Bload Lymphocytes » pCMH Complexe binaire peptide/CMH-I PDB « Protein Data Bank » Ph Phényle PLC « Peptide Loading Complex » PMB para-méthoxybenzyle q Quadruplet RFI « Ratio Fluorescence Intensity » RMN 13C Résonance Magnétique Nucléaire du carbone 13 RMN 1H Résonance Magnétique Nucléaire du proton s Singulet SN Substitution nucléophile Su Succinimide t Triplet t.a. Température ambiante TAP « Transporter Associated with Antigen Processing » TBAF Fluorure de tétrabutylammonium TBS Groupe tert-butyldiméthylsilyle tBu tertio-butyle TCR « T-Cell Receptor » TFA Acide trifluoroacétique THF Tétrahydrfurane TIL « Tumor Infiltrating Lymphocytes »

TIS tri-isopropylsilane TOCSY « Total Correlation SpectroscopY » UV Ultra-Violet VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine

Acides aminés

Les acides aminés au sein de séquences peptidiques sont notés par leur code à trois lettres sur

les schémas et figures et par leur code à une lettre dans le texte. Si aucune précision n’est

xiii

donnée, l’acide aminé naturel L est désigné. Les notations des vingt acides naturels sont

rappelées ci-dessous :

Alanine A Ala Arginine R Arg Asparagine N Asn Aspartate D Asp Cystéine C Cys Glutamate E Glu Glutamine Q Gln Glycine G Gly Histidine H His Isoleucine I Ile Leucine L Leu Lysine K Lys Méthionine M Met Phénylalanine F Phe Proline P Pro Sérine S Ser Thréonine T Thr Tryptophane W Trp Tyrosine Y Tyr Valine V Val Unités

Les unités couramment utilisées sont listées ci-dessous :

°C Température en degrés Celsius équiv. Equivalent g Gramme h Heure Hz Hertz M Molaire (concentration en mole par litre) mg Milligramme MHz MégaHertz min Minute mL Millilitre mL/min Millilitre par minute mmol Millimole mol Mole nm Nanomètre ppm Partie par million µg Microgramme µL Microlitre

Bau milhou un que sap, que cent que cercon...

Introduction générale

3


Depuis plus d’un siècle, la chimie médicinale s’est énormément développée en basant

la majorité de ses recherches sur la synthèse de molécules bioactives inspirées de molécules

naturelles, notamment issues de plantes utilisées dans les médecines traditionnelles. Ainsi,

aujourd’hui, 60 à 70 % des médicaments disponibles sur le marché proviennent de cette

origine. Toutefois, cette ressource s’épuise, preuve en est le nombre décroissant de nouvelles

molécules bio-actives découvertes chaque année.

Une nouvelle approche de plus en plus envisagée par les laboratoires pharmaceutiques

est le développement de médicaments peptidiques ou peptidomimétiques. La première

découverte d’un peptide bio-actif remonte à plus de 80 ans. En effet, c’est en 1923 que

Banting et Macleod obtinrent le prix Nobel de médecine pour leur découverte de l’insuline

dont on connaît le rôle dans le traitement du diabète. Toutefois, jusque dans les années 1960,

la synthèse de peptides par voie chimique pouvait prendre jusqu’à plusieurs mois, rendant

impossible toute exploitation industrielle. Ce n’est qu’à partir de 1963, avec le développement

par Merrifield de la synthèse peptidique sur support solide mais aussi grâce à la mise au point

de nouvelles techniques de purification performantes telle que la Chromatographie Liquide

Haute Performance (CLHP) que le développement de peptides à l’échelle industrielle est

devenu possible.

Grâce à ces avancées techniques, les peptides ainsi que les protéines sont aujourd’hui

considérées comme des molécules thérapeutiques d’avenir. En 2004, plus de 20% des

médicaments appartenant au top 200 des ventes étaient basés sur des protéines et peptides,

entre 600 et 700 peptides étaient en stade de développement et plus de 150 étaient à différents

stades de phase clinique.

Les peptides présentent de nombreux avantages en comparaison des molécules de

petite taille. Ils représentent souvent la plus petite partie fonctionnelle d’une protéine, ils

offrent une efficacité, une sélectivité et surtout une spécificité que les concepteurs de petites

molécules ont du mal à atteindre.

Toutefois, du fait des inconvénients qu’ils présentent, la conception de peptide

thérapeutique soulève plusieurs challenges. Tout d’abord, les peptides ne répondent pas aux

fameuses règles de Lipinski qui régissent la capacité d’une molécule à être utilisée comme

médicament. En particulier, le haut poids moléculaire des peptides ne leur permet pas de


4

passer les parois entre le système digestif et le système circulatoire. L’administration par voie

orale n’étant donc pas envisageable, l’alternative est l’administration par voie intraveineuse

peu confortable pour le patient. De nouvelles voies d’administration sont donc actuellement

en étude, via les muqueuses nasales ou pulmonaires, ou bien par le développement de

nouveaux systèmes d’encapsulation permettant de délivrer le peptide une fois la cible atteinte.

L’autre inconvénient majeur est la biodégradabilité des peptides qui réduisent leur

temps de demi-vie à quelques minutes, au mieux quelques heures. Divers groupes travaillent

donc sur la conception de peptidomimes, molécules bio-résistantes conçues à partir de

peptides et induisant la même activité biologique que le peptide-source. Le développement de

telles molécules se fait en plusieurs étapes :

- la première étape consiste à identifier le système biologique ciblé,

- puis, l’identification de l’effecteur (peptide bioactif ou fragment de protéine

partenaire) est nécessaire.

- Ensuite, la conception et le développement d’analogues peptidiques structurellement

contraints sont réalisés jusqu’à établir une peptidomime tête de série.

- Finalement, le criblage de banques de mimes peptidiques respectant les propriétés

conformationnelles du peptidomime tête de série.

Notre projet s’inscrit dans la thématique de l’immunotérapie anti-cancéreuse qui

consiste à stimuler le système immunitaire pour qu’il agisse spécifiquement contre les cellules

cancéreuses et a pour objectif de concevoir des peptidomimes d’antigènes peptidiques

naturels. Ce manuscrit sera donc organisé en cinq parties :

- La premier chapitre présentera le système biologique ciblé mettant en jeu deux

protéines et un peptide ; puis, une vue d’ensemble sur les différentes molécules mimant ce

type de peptide sera exposée.

- Le deuxième chapitre se focalisera sur un peptide impliqué dans une réponse

immunitaire contre le cancer de la peau. Son identification puis les différentes modifications

réalisées sur ce peptide, en particulier par l’équipe du Pr S. Quideau jusqu’à l’identification

d’une structure tête de série, seront présentées.

- Le troisième chapitre sera consacré au développement d’une nouvelle famille de

peptidomimes conservant le squelette de la molécule tête de série et portant différents

haptènes sur la partie centrale qui ont été introduits par chimie « click ».


5

- Dans le quatrième chapitre, un nouveau squelette peptidique comportant de nouvelles

contraintes conformationnelles sera envisagé.

- Enfin, le cinquième chapitre illustrera une nouvelle approche consistant à développer

une plateforme centrale unique pouvant facilement être décorée par différents motifs en

fonction de la réponse immunitaire ciblée.

Chapitre 1 L’ immunité à médiation cellulaire : Action des lymphocytes T cytolytiques et modulation de leur stimulation par des antigènes peptidiques modifiés

Chapitre 1 : L’immunité à médiation cellulaire

9

I. Généralités sur l’immunité à médiation cellulaire

Le système immunitaire est un système complexe composé de différents types de

cellules et molécules ; l’interaction entre ces différents acteurs permet le maintien de

l’intégrité du soi. Parmi les différents modes de défense, la réponse immunitaire à médiation

cellulaire a pour rôle de détruire les cellules présentant des peptides antigéniques étrangers

(soient exogènes, soient issus de protéines mutées) ou issus de protéines endogènes dans le

cas de certains cancers ou de maladies auto-immunes. Son implication dans la destruction de

cellules cancéreuses a été prouvée dans les années 1980.1

Les lymphocytes T cytotoxiques (LTC) CD8+ et auxiliaires CD4+ sont les cellules

effectrices de cette réponse immunitaire. Ces cellules se développent dans le thymus où elles

acquièrent des caractéristiques particulières. On les retrouve dans le sang mais également dans

la lymphe, dans les organes lymphoïdes et parfois infiltrées dans les tumeurs. Elles

reconnaissent spécifiquement les antigènes présentés à la surface des cellules. Les avancées

dans le domaine de l’immunologie ont permis de découvrir les acteurs et les mécanismes à

l’échelle moléculaire mis en jeu dans cette reconnaissance. Ainsi, les lymphocytes T

reconnaissent, au travers de leurs récepteurs, des peptides antigéniques présentés à la surface

des cellules par le biais d’un complexe majeur d’histocompatibilité. Plus spécifiquement, les

lymphocytes T auxiliaires CD4+ reconnaissent spécifiquement les peptides antigéniques

présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) alors que les

LTC CD8+ reconnaissent spécifiquement les complexes majeurs d’histocompatibilité de

classe I (CMH-I). La différence entre ces deux systèmes dépend principalement de l’origine

des peptides antigéniques. Les peptides antigéniques présentés par les CMH-II sont en effet

issus de la dégradation de toxines et bactéries phagocytées par la cellule présentatrice. En

revanche, les peptides antigéniques présentés par les CMH-I sont issus de protéines qui se

sont développées dans le cytoplasme de la cellule présentatrice, c’est-à-dire soient des

protéines du soi (normales ou mutées), soient des protéines issues d’un pathogène ayant

infecté la cellule. Les peptides antigéniques associés au CMH-I peuvent donc être définis

comme la « carte d’identité » de la cellule. La reconnaissance de certains peptides

antigéniques par les LTC va alors déclencher une cascade de réactions dont l’objectif est la

destruction de la cellule présentatrice et la prolifération de LTC spécifiques à l’antigène

reconnu.


10

II. Présentation de peptides antigéniques par le CMH-I

2.1 Formation des complexes binaires peptides antigéniques/CMH-I

Les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I sont composés d’une

glycoprotéine transmembranaire d’environ trois cent cinquante acides aminés appelée chaîne

lourde associée de façon non-covalente à la β2-microglobuline. La chaîne lourde comprend

une courte région cytoplasmique, une région transmembranaire et une région extracellulaire

qui va présenter le peptide antigénique. La β2-microglobuline interagit de façon non-

covalente avec la région extracellulaire et joue un rôle clé dans le maintien de la conformation

structurale de la chaîne lourde (Figure 1.1).

Cellule présentatrice d’antigène

ββββ2-microglobuline

Chaîne lourde

Peptide Antigénique

Figure 1.1. Présentation schématique d’un complexe binaire peptide/CMH-I.

En effet, des cellules ne contenant pas de β2-microglobuline ne présentent pas de CMH-I sur

leur surface.2 Des études de cas de cancer du mélanome suggèrent que la déficience en β2-

microglobuline serait d’ailleurs un mode de résistance des cellules tumorales.3

La formation du complexe binaire peptide/CMH-I (pCMH) peut être divisée en trois

phases à savoir la génération des peptides antigéniques, la formation d’un complexe stable

précurseur du CMH-I et l’association de ces deux entités pour former le complexe pCMH

(Figure 1.2).


11

Membrane Cellulaire

Lymphocyte TCytolytique

Protéasome 26S

Peptides antigéniques

Protéines chaperones

Complexe Peptide/CMH-I

Appareil de Golgi

Récepteur du lymphocyte T

TAP

Protéine Endogène

Membrane Cellulaire

Lymphocyte TCytolytique

Protéasome 26S

Peptides antigéniques

Protéines chaperones

Complexe Peptide/CMH-I

Appareil de Golgi

Récepteur du lymphocyte T

TAP

Protéine Endogène

Réticulum Endoplasmique

Figure 1.2. Présentation de la formation puis de la présentation aux lymphocytes T du complexe binaire pCMH.4

D’une part, les peptides antigéniques liant les CMH-I sont issus de protéines

endogènes, virales ou mutées, qui sont principalement dégradées par le protéasome 26S. Cet

immunoprotéasome clive les protéines en peptides allant de trois à trente acides aminés, avec

un taux maximum de peptides composés de huit à onze résidus, longueur optimale pour se lier

au CMH-I (Figure 1.1).5-6 De plus, il génère préférentiellement des peptides possédant des

résidus hydrophobes ou basiques en position C-terminale, plus favorables pour les

interactions aux CMH-I. Enfin, afin d’optimiser les interactions pCMH, différents acteurs

dans le cytosol ou au sein du réticulum endoplasmique, interviennent dans la modification de

l’extrémité N-terminale du peptide.7-10

D’autre part, le bon repliement du CMH-I et sa complexation avec le peptide

antigénique ont lieu au sein du réticulum endoplasmique et nécessitent la formation d’un

complexe de macromolécules nommé PLC pour « Peptide Loading Complex » (Schéma 1.1).

Ce complexe a pour rôle de maintenir la conformation globale du CMH-I et d’amener le

peptide antigénique jusqu’à lui. Il est composé de la chaîne lourde α du CMH-I, de la β2-

microglobuline, d’une glycoprotéine transmembranaire nommée tapasin, de la thio-

oxireductase ERp57 et de deux protéines TAP 1 et 2 pour « Transporter Associated with

Antigen Processing ».


12

Schéma 1.1. Formation du complexe PLC puis du complexe pCMH dans le réticulum endoplasmique.11

La formation de ce complexe met en jeu d’autres protéines qui jouent le rôle de chaperon.

Ainsi, la chaîne lourde α du CMH-I fraichement synthétisée et non-repliée s’associe à la

calnexine (protéine chaperonne) qui initie son repliement12 et à la protéine ERp57 qui le

facilite en participant à la formation de ponts disulfures intramoléculaires (1 dans Schéma

1.1).13 La β2-microglobuline se complexe alors pour former le CMH-I ; puis la calnexine

s’échange rapidement avec la calréticuline qui stabilise le complexe et la protéine ERp57 se

détache également du complexe (2 dans Schéma 1.1). En parallèle, la glycoprotéine

transmembranaire tapasin juste synthétisée s’associe rapidement aux transporteurs de peptide

antigénique TAP 1 et TAP 2 puis à la protéine ERp57 (3 dans Schéma 1.1). Pour finir, les

deux sous-complexes chaîne α/β2-microglobuline/calréticuline et tapasin/TAP1/TAP2/ERp57

s’associent pour donner le PLC (4 dans Schéma 1.1).

Le complexe transmembranaire TAP, composé des protéines TAP1 et 2, permet alors

le transfert du peptide antigénique du cytosol dans le réticulum endoplasmique.14 Les peptides

générés se complexent rapidement au complexe TAP afin qu’ils ne soient pas dégradés par les

peptidases cytolytiques. Ensuite, le mécanisme de transfert du peptide antigénique dans le


13

lumen du réticulum endoplasmique au travers du complexe TAP s’accompagne d’une réaction

d’hydrolyse d’ATP (pour adénosine triphosphate) en ADP (pour acide adénosine

diphosphorique).15 Ce transfert est favorisé par la présence de la tapasin qui, d’une part,

stabilise le complexe TAP et relie ce complexe au complexe chaîne α/β2-

microglobuline/calréticuline afin de rapprocher le donneur et l’accepteur de peptide

antigénique et optimise la liaison du peptide au complexe chaîne α/β2-microglobuline.16 La

complexation du peptide au complexe chaîne α/β2-microglobuline/calréticuline permet de

stabiliser le complexe CMH-I qui va alors se libérer de la calréticuline et du complexe

ATP/tapasin/ERp57 (5 dans Schéma 1.1).

Finalement, le complexe pCMH, naturellement formé, est transporté à travers

l’appareil de Golgi jusqu’à la surface de la cellule pour être présenté aux récepteurs des

lymphocytes T « circulants » (Figure 1.2).

2.2 Analyse structurale du complexe pCMH

Chaque individu peut exprimer jusqu’à six CMH-I différents. Or, le nombre de

peptides susceptibles de se fixer à ceux-ci est bien supérieur (environ 10000).17 L’affinité de

liaison entre le peptide et le CMH-I doit donc être élevée mais ce dernier ne doit pas être pour

autant trop sélectif.

Afin de mieux comprendre les interactions mises en jeu entre le peptide et le CMH-I,

de nombreux travaux ont été consacrés à la résolution de structures cristallographiques de ces

complexes binaires. Les premières structures de CMH-I, publiées entre 1987 et 1992, sont

celles de CMH-I présentant un mélange de peptides,18 permettant uniquement de définir une

structure globale du CMH-I. Comme évoqué précédemment, Le CMH-I est composé d’une

chaîne lourde α complexée à une β2-microglobuline qui permet le maintien de la

conformation tridimensionnelle de cette chaîne α. La région extracellulaire de la chaîne α

peut être divisée en trois domaines α1, α2 et α3. Le domaine α3, qui interagit avec la β2-

microglobuline, ne participe pas aux interactions avec le peptide antigénique. Il a en effet été

montré qu’un CMH-I n’exprimant pas le domaine α3 peut malgré tout lier un peptide

antigénique.19 Les domaines α1 et α2 en revanche forment le site de fixation du peptide

antigénique. Chacun de ces domaines est structuré en une hélice α et 4 brins β antiparallèles.

Les hélices α forment un sillon d’environ 1 nm de largeur sur 2,5 nm de long et le feuillet β

(formé de 8 brins β) correspond au fond de ce sillon (Figure 1.3).


14


αααα1 αααα2

αααα3

αααα1

αααα2

Figure 1.3. Structure cristalline du complexe binaire pCMH Melan-A/MART-126-35/HLA-A2 (PDB 2GT9-1).

Cependant, ces premières études n’ont pas permis de définir le mode d’interaction des

peptides antigéniques avec le CMH-I. Pour tenter de répondre à cette question, au début des

années 1990, une étude de séquençage de peptides liant quatre CMH-I a été réalisée.20 Puis,

par la suite, les deux premières structures cristallines de complexe pCMH ont été publiées.21

Ces travaux ont mené les auteurs à établir des principes généraux régissant les interactions

entre peptides antigéniques et CMH-I.22 Par la suite, de nombreux autres complexes pCMH, à

la fois humains et murins ont été étudiés par diffraction des rayons X et tous montrent

d’importantes homologies structurales.23-27 Le CMH-I humain est nommé HLA pour

« Human Leucocyte Antigen ». Il en existe trois classes : A, B et C. Le CMH-I murin est

nommé H-2.

De manière générale, les CMH-I lient des peptides composés de huit à dix résidus en

conformation étendue ou légèrement arquée. La conformation globale du peptide sera

influencée par sa longueur et la profondeur du site de liaison. Six poches de liaison ont été

définies dans le sillon des CMH-I, nommées A, B, C, D, E et F. Les poches A, B, C et F sont

généralement plus profondes que les poches D et E (Figure 1.4).


15

Figure 1.4. Présentation des poches de liaisons au sein du site de fixation du CMH-I.

Les extrémités N- et C-terminales du peptide antigénique sont des éléments clés pour

stabiliser le complexe pCMH.28 Elles se fixent aux deux extrémités du sillon par un réseau de

liaisons hydrogènes dans les poches A et F. La poche A contient plusieurs (trois ou quatre)

tyrosines susceptibles de former des liaisons hydrogène avec l’amine N-terminale et le

carbonyle du premier aminoacide. Le squelette peptidique des résidus en position P2 et P3

participent également à des liaisons hydrogène avec les résidus du CMH-I. D’autre part, la

chaîne latérale du résidu P1 pointe vers l’extérieur du site de liaison et peut expliquer qu’il

n’y ait pas de résidu préférentiel en position P1. En revanche, la poche B accueille la chaîne

latérale du résidu P2. La nature du résidu en P2 est donc importante pour la fixation du

peptide sur un CMH-I donné. La poche hydrophobe C reçoit généralement la chaîne latérale

de l’acide aminé P6, mais dans le cas de peptides à huit chaînons, c’est le résidu P5 qui se

placera dans cette poche.

Côté C-terminal, le peptide interagit à la fois par un réseau de liaisons hydrogène mais

également par des interactions hydrophobes. Le fond de la poche F est en effet hydrophobe

alors que l’entrée est hydrophile. L’acide carboxylique terminal et la dernière liaison

peptidique interagissent tous deux avec des résidus hydrophiles. A la différence de la position

P1, la chaîne latérale de l’acide aminé côté C-terminal pointe dans la poche hydrophobe : la

nature de cet acide aminé est donc importante. La chaîne latérale doit être hydrophobe. Ainsi,

la valine, la leucine, l’isoleucine ou encore l’alanine sont majoritairement rencontrées.20 Les

autres poches sont plus variables en taille et en nature d’un CMH-I à un autre. Aucune règle

générale ne peut donc être établie.

La présentation des peptides antigéniques pour les CMH-I est un élément clé dans la

protection d’un organisme. Afin de générer une réponse immunitaire, ce complexe binaire

doit être reconnu par les lymphocytes T CD8+ au travers de leur récepteur.


16

III. Stimulation des lymphocytes T cytolytiques CD8+

3.1 Reconnaissance du complexe pCMH par les récepteurs des

lymphocytes T

Chaque lymphocyte présente environ 30000 récepteurs identiques à la surface ; ils sont

classiquement nommés TCR pour « T-Cell Receptors ».17 Deux types de TCR sont décrits

dans la littérature : les TCRαβ qui représentent environ 95% des TCR exprimés et les

TCRγδ29 qui ne représentent que 5%. Alors que les TCRαβ ne reconnaissent que des peptides

présentés par un CMH-I, les TCRγδ sont capables de reconnaître des protéines entières ou des

molécules non-peptidiques ne nécessitant donc pas d’être présentées par un CMH-I. Nous ne

parlerons dans ce chapitre que des récepteurs TCRαβ. Les lymphocytes T ou thymocytes sont

générés dans la moelle osseuse puis maturés dans le thymus (d’où lymphocytes T). Cette

maturation passe par plusieurs étapes dont une étape de différenciation qui permet de définir

les lymphocytes T auxiliaires, qui présentent le corécepteur CD4 en leur surface et des

lymphocytes T cytolytiques qui expriment des corécepteurs CD8. Cette étape se fait par le

biais de cellules doublement positives, c’est-à-dire qui portent à leur surface à la fois des

protéines CD4 et CD8 ; parmi ces cellules, environ 95% meurent car elles ne reconnaissent

pas les CMH du soi. Les 5% restant reconnaissent des complexes pCMH du soi, et en

fonction du corécepteur mis en jeu, déclenchent la prolifération de lymphocytes T CD4+ ou

CD8+.

Le récepteur des lymphocytes T est une protéine transmembranaire composée de deux

polypeptides nommés chaîne α et chaîne β, ancrés dans la membrane plasmique et reliés par

un pont disulfure. Chaque chaîne comporte un domaine variable (Vα et Vβ) et un domaine

constant (Cα et Cβ). La région dite variable crée la diversité et la spécificité des lymphocytes

T. Ces chaînes α et β se complexent à d’autres protéines pour faire un vrai complexe

récepteur, à savoir les protéines transmembranaires CD3 γ, δ et ε qui forment le complexe

CD3 et s’associe à un homodimère ζ principalement localisé dans le cytoplasme de la cellule.

Enfin, dans le cas des lymphocytes T cytotoxiques, le corécepteur CD8 est également associé

au récepteur T et joue deux rôles: d’une part, il stabilise de façon physique l’interaction du

TCR avec le complexe pCMH par reconnaissance d’une partie conservée du domaine α3 du

CMH-I ;30 d’autre part, il aide à la transduction du signal (Figure 1.5).31


17

CD8+CD8+

Figure 1.5. Représentation du récepteur des lymphocytes T cytotoxiques.31

Le mécanisme de reconnaissance du complexe binaire pCMH par les TCR n’a pas

encore été parfaitement établi. Il est souvent proposé qu’une réponse immunitaire efficace

repose sur la stabilité du complexe binaire formé, ou plus particulièrement sur le bon ancrage

du peptide dans le CMH-I et de sa bonne orientation pour que le TCR se fixe efficacement

dessus. Pourtant, des études récentes ont montré que certains complexes binaires, malgré leur

faible stabilité, engendraient une réponse immunitaire plus ou moins efficace, prouvant ainsi

que d’autres paramètres entraient en jeu.32-35

Krogsgaard et al. ont proposé un modèle de fixation du TCR sur le complexe pCMH

se réalisant en deux temps.32,36 Tout d’abord, le TCR viendrait se fixer sur le complexe pCMH

par reconnaissance globale de la périphérie du CMH-I. Cette hypothèse a ensuite été

confortée par les travaux de Baker et al. qui montrèrent que la substitution de certains résidus

de la chaîne β d’un CMH-I pouvait diminuer jusqu’à quarante fois l’affinité de liaison du

TCR pour le complexe pCMH.37 Le TCR s’oriente diagonalement au complexe pCMH. Dans

un second temps, la zone centrale de contact du TCR présentant une plus grande flexibilité,

s’ajusterait de façon à interagir plus spécifiquement avec le peptide antigénique. En

particulier, le TCR, qui présente une poche profonde en son centre, se positionnerait au niveau

de la région centrale du peptide. Le CMH-I aurait donc un rôle d’association, tandis que le

peptide jouerait un rôle dans la stabilité du complexe. Toutefois, la discussion reste ouverte,

plusieurs hypothèses allant à l’encontre de ce modèle ayant été récemment publiées.38

La conséquence de la formation du complexe ternaire TCR/pCMH est une réaction de

phosphorylation au sein du LTC qui va initier la transduction du signal. Les molécules CD3 γ,


18

δ, ε et ζ sont nécessaires à l’expression du TCR mais également à la transduction du signal

vers le noyau du lymphocyte. Une série d’évènements est alors déclenchée : sécrétion de

cytokines, sécrétion acide, flux de calcium et prolifération des lymphocytes T : c’est la

réponse immunitaire.

3.2 Analyse structurale du complexe ternaire TCR/pCMH

Le mode de reconnaissance du complexe pCMH par les TCR a principalement été

élucidé grâce à l’obtention dans un premier temps de structure de fragments de TCR,39-40 puis

de TCR « complets »41 et enfin de structure cristalline de complexe ternaire TCR/pCMH-I.41-

45 Toutefois, le nombre de structures de complexes ternaires disponibles dans la banque de

données de protéines (PDB pour « Protein Data Bank ») est bas (environ 50): ceci est

principalement dû à la faible stabilité des TCR solubilisés (seul le domaine extracellulaire est

produit).

Les premières résolutions structurales de complexes ternaires ont montré que le TCR

s’orientait diagonalement au site de présentation du peptide,41 confirmant les résultats d’une

étude de mutation sur le CMH-I réalisé un an plus tôt.46 Ainsi, le domaine Vα est globalement

positionné au dessus de l’extrémité N-terminale du peptide alors que le domaine Vβ est

positionné au dessus de l’extrémité C-terminale (Figure 1.6).

αααα1

αααα2

TCR Vαααα

TCR Vββββ

Figure 1.6. Présentation de l’orientation diagonale du TCR par rapport au complexe binaire pCMH.

De plus, ces analyses structurales ont permis de définir plus en détail la structure des TCR, en

particulier la zone en contact avec le complexe pCMH-I. Ainsi, les chaînes α et β du TCR

interagissent par leur domaine variable avec le complexe pCMH. Plus spécifiquement, les


19

domaines hypervariables nommés CDR1 (boucle α1 et β1), CDR2 (boucle α2 et β2) et CDR3

(boucles α3 et β3) (« Complementarity Determining Region »), sont impliqués dans la

reconnaissance du complexe pCMH. Un autre domaine hypervariable HV4 a été identifié

mais ne participe pas à la reconnaissance du complexe pCMH (Figure 1.7).

ββββ1

ββββ2αααα3

ββββ3

αααα1αααα2

HV4

ββββ1

ββββ2αααα3

ββββ3

αααα1αααα2

HV4

Figure 1.7. Structure cristalline d’un complexe ternaire TCR/pCMH et zoom sur les boucles du TCR en contact avec le complexe pCMH.

Les données structurales de complexes ternaires TCR/pCMH semblent montrer que les

boucles CDR2 interagissent principalement avec les hélices α du CMH-I alors que les

domaines CDR1 et CDR3 interagissent à la fois avec le peptide antigénique et le CMH-I. Les

boucles CDR1 sont plus particulièrement en contact avec les extrémités du peptide alors que

le domaine CDR3 interagit avec la partie centrale du peptide. Il est également établi que la

conformation structurale du peptide antigénique va directement se répercuter sur la réponse

immunitaire générée. En effet, plusieurs études ont montré que même des modifications

mineures dans la structure du peptide pouvaient avoir des conséquences importantes sur sa

conformation au sein de complexe ternaire et donc sur sa capacité à stimuler les lymphocytes

T.47-48

Toutefois, les comparaisons de la structure d’un TCR libre41 ou engagé dans des

complexes ternaires33,43 et d’un TCR engagé dans des complexes ternaires contenant


20

différents peptides45,47 montrent le maximum de variation au niveau de la région CDR3.49

Ainsi, les TCR possèdent une certaine capacité d’adaptation, les boucles CDR3 présentent

une certaine plasticité, permettant l’interaction avec les complexes pCMH.50-52

A titre d’exemple, Degano et al. comparèrent la structure cristalline du TCR 2C41 seul

avec celle de ce même TCR impliqué dans deux complexes ternaires composés du CMH-I

murin H-2Kb et soit du peptide naturel de séquence EQYKFYSV (dEV8), soit d’un

superagoniste de séquence SIYRYYGL (SIYR).33 La superposition de ces trois structures met

en avant le changement de conformation de la boucle CDR3α entre le TCR libre et les deux

structures complexées (Figure 1.8).

Figure 1.8. Superposition des structures cristallines du TCR 2C seul (boucles les plus foncées), en complexe avec le complexe SIYR/H-2Kb et le complexe dVE8/H-2Kb (boucles les plus claires).

Le peptide Tax viral est le premier peptide antigénique dont la structure cristalline en

complexe ternaire a été publiée dans la littérature et a ensuite fait l’objet de plusieurs études.

Les différents travaux sur ce peptide seront présentés dans le chapitre 5.

IV. Le peptide antigénique et son utilisation en immunothérapie

4.1 Le principe de l’immunothérapie

L’immunothérapie consiste à stimuler le système immunitaire pour qu’il agisse

spécifiquement contre un pathogène. Par extension, l’immunothérapie désigne également

toute thérapie consistant à délivrer des protéines issues du système immunitaire sans pour

autant avoir une action sur le système immunitaire. Il est maintenant acquis que le système

immunitaire joue un rôle crucial dans la surveillance du développement de tumeurs. Ainsi, les

progrès en immunologie réalisés ces dix dernières années ont permis d’identifier les effecteurs


21

de l’immunité anti-tumorale, ouvrant de nombreuses possibilités pour le développement de

nouvelles immunothérapies anticancéreuses.53

L’une des voies les plus intéressantes serait d’utiliser un système déclencheur de la

réponse immunitaire afin que celle-ci soit dirigée spécifiquement contre les cellules

tumorales, c’est-à-dire stimuler le système de reconnaissance présenté précédemment.

Comme on vient de le voir, le déclenchement de cette réponse immunitaire est un phénomène

complexe faisant intervenir trois acteurs : le complexe majeur d’histocompatibilité qui

présente un peptide antigénique et le récepteur de lymphocyte T qui est l’effecteur de la

réponse. Parmi ces trois entités, l’utilisation de peptides antigéniques associés à une tumeur

est l’une des voies les plus prometteuses car elle est la plus facile à mettre en place sur un plan

thérapeutique.54-55

4.2 Origine des peptides antigéniques tumoraux

Les peptides antigéniques présentés par des CMH-I sont issus de la dégradation de

protéines intracellulaires. Dans le cas d’infections virales, les peptides antigéniques présentés

à la surface des cellules seront issus de protéines virales. Ces protéines bien que provenant

d’une entité exogène, sont intracellulaires car elles sont synthétisées par la machinerie

cellulaire de la cellule hôte.

Dans le cas de cellules tumorales, les antigènes tumoraux peuvent être classés en

quatre catégories :56

● Les antigènes viraux peuvent être responsables de certains cancers.

● Les antigènes uniques sont issus de protéines ubiquitaires, c'est-à-dire présentes dans

de nombreux tissus de l’organisme, ayant muté dans les cellules tumorales ; leur exploitation

dans le développement d’une immunothérapie pourrait sembler très intéressant du fait qu’ils

sont spécifiquement présents chez les cellules tumorales ; toutefois, la diversité des protéines

susceptibles d’être mutées ainsi que les différentes formes de mutations potentielles limitent

considérablement leur exploitation en immunothérapie.57

● Les antigènes non mutés sont issus de protéines soient exprimées uniquement dans

les testicules et le placenta, soient dans les tissus sains en très faible quantité. Dans les deux

cas, elles sont surexprimées dans les cellules tumorales. On retrouve dans cette catégorie la

famille des MAGE pour « Melanoma Antigen-Encoding Gene ».

● Les antigènes de différenciation sont issus de protéines exprimées spécifiquement

dans un type de tissu et surexprimées dans les cellules tumorales. Les exemples les plus


22

connus sont issus de lignées mélanocytaires, peptides dérivant des protéines tyrosinase,

gp100, gp75 et Melan-A.58

4.3 L’utilisation de peptides antigéniques en immunothérapie

4.3.1 Les avantages

L’intérêt du développement de peptides antigéniques comme agent thérapeutique

repose sur le fait qu’ils sont hautement spécifiques, facilement accessibles et faiblement

toxiques car les produits de dégradation générés ne sont que des acides aminés. Ces molécules

permettraient de pallier les problèmes rencontrés en chimiothérapie, dont les molécules

hautement fonctionnalisées nécessitent souvent de nombreuses étapes de synthèse et ne sont

pas parfaitement spécifiques à une cible donnée, ce qui entraine des effets secondaires

difficiles à supporter pour le patient.

Toutefois, les peptides présentent également des limitations majeures empêchant leur

utilisation directe comme molécules thérapeutiques.

4.3.2 Les limitations

La dégradation in vivo

L’un des facteurs importants limitant l’utilisation de peptides antigéniques à des fins

thérapeutiques réside dans leur sensibilité aux peptidases. Les peptidases sont des protéines

enzymatiques qui ont pour rôle de dégrader les peptides. Pour cela, elles agissent sur les

liaisons peptidiques qu’elles clivent.

La flexibilité conformationnelle59

Les peptides sont caractérisés par une flexibilité conformationnelle dépendante de leur

environnement. Ainsi, en solution, les peptides de courtes séquences sont le plus souvent

déstructurés, alors qu’au sein d’un récepteur biologique, les peptides adoptent une

conformation spécifique qui leur confèrent une activité biologique spécifique. L’utilisation

d’un peptide non-structuré comme molécule biologique risque de diminuer sa spécificité. De

plus, un peptide adoptant préférentiellement en solution une conformation adaptée à un

récepteur biologique interagira mieux avec celui-ci, l’entropie d’interaction requise étant plus

faible.

Ainsi, dans le cas de peptides antigéniques, leur conformation est définie par le CMH-

I d’une part et le TCR d’autre part. Afin qu’un peptide soit utilisé en immunothérapie, il est

donc préférable qu’il adopte une conformation préférentielle adaptée au récepteur CMH-I


23

pour accroître son affinité de liaison et au TCR pour amplifier la réponse immunitaire (cf.

chapitre 4).

4.4 Vers la synthèse de peptidomimes antigéniques

Du fait des limitations d’utilisation des peptides antigéniques naturels comme agents

thérapeutiques, de nouveaux projets impliquant modélisateurs, chimistes, biologistes et

cristallographes ont vu le jour. Leur objectif est de concevoir, synthétiser et étudier des

peptides non-naturels, qui doivent mimer ou inhiber l’activité biologique d’un peptide naturel

tout en étant stable en milieu biologique.

4.4.1 Modification de la chaîne peptidique pour accroître la stabilité

du peptide en milieu biologique

β-aminoacides

Les β-aminoacides sont des aminoacides contenant deux carbones entre la fonction amine et

l’acide carboxylique (Figure 1.9). Différentes études ont mis en évidence leur potentiel pour

la synthèse de peptides bio-actifs,60 en particulier pour leur capacité à résister aux

peptidases.61

H2NOH

OH2N OH

O

R2

R4

R1

R3

αβ

α-aminoacide β-aminoacide

R1 R2

Figure 1.9. Comparaison de la structure d’un β-aminoacide à celle d’un α-aminoacide.

Plusieurs groupes ont introduit des β-aminoacides en substitution d’α-aminoacides

dans des peptides antigéniques se liant au CMH-I. Afin de lutter contre l’arthrite (une maladie

auto-immune), le groupe de D. Seebach synthétisa un peptide composé de deux α-

aminoacides côté C-terminal et six β-aminoacides côté N-terminal, portant les chaînes

latérales des résidus ancres du peptide naturel afin d’inhiber la stimulation des lymphocytes

T.62 Pour éviter tout repliement hélicoïdal du peptide, structuration courante dans le cas de β-

peptides,63 la chiralité de chaque acide aminé est alternée (Figure 1.10a).

En outre, Reinelt et al. substituèrent tour à tour chaque α-aminoacide par le β-

aminoacide correspondant du peptide antigénique de séquence RRFFPYYV se liant au CMH-

I HLA-B*2705 et ceci en vue d’étudier l’effet de ce changement sur son affinité de liaison.64


24

Ils montrèrent que seule la modification des deux premiers aminoacides (côté N-terminal)

diminuait considérablement l’affinité de liaison du peptide HLA-B27. De plus, la stimulation

de lymphocytes T spécifiques au peptide naturel est diminuée de façon variable en fonction

du positionnement de la modification, mais elle n’est pas complètement nulle. Ces résultats

mettent en évidence l’implication de certains résidus pour la reconnaissance par les TCR.

Enfin, le groupe de Purcell réalisa la même expérience sur un peptide antigénique

murin (de séquence SIINFEKL) dont chaque analogue fut testé in vivo.65 Il mit en évidence la

capacité de ces différents analogues à être plus résistants aux peptidases que le peptide natif

sans pour autant perdre l’activité antigénique. En particulier, l’analogue substitué en position

P5 par le β-aminoacide correspondant est cinq fois plus résistant dans le sérum biologique que

le peptide natif et déclenche une réponse immunitaire aussi forte que le peptide natif sur une

large gamme de lymphocytes T (Figure 1.10b).

H-Gln-Arg-Leu-Lys-Glu-Ala-Ala-Glu-Lys-OH

H2N

HN

O

O

NH

NH

O

NH

O

NH

OCO2H

NH

NH2HN

NH2

2

a) H-Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu-OH

NH

Glu-Lys-Leu-OH

OH-Ser-Ile-Ile-Asn

b)

Figure 1.10. Présentation d’analogues de peptides naturels contenant un ou plusieurs β-aminoacides.

D’un point de vue synthétique, les β-aminoacides monosubstitués en position α ou β

ont fait l’objet de nombreux travaux ; diverses méthodes de préparation énantiosélectives sont

disponibles dans la littérature.66-68

La liaison réduite

La réduction de la liaison amide en aminométhylène est l’une des liaisons isostères de

liaison peptidique les plus connues. La modification successive de chaque liaison peptidique a

été réalisée sur divers peptides antigéniques afin d’étudier l’effet de cette modification et de

son positionnement sur les propriétés antigéniques de chaque analogue. De l’étude du

nonapeptide GP33 se liant au CMH-I murin H-2Db est ressortie l’analogue GP33ψ6-7

possédant une liaison réduite en position P6-P7 et étant capable de se lier aussi bien au CMH-

I H-2Db que le peptide natif.69 De plus, cet analogue est reconnu par différentes lignées de


25

lymphocytes T spécifiques au peptide GP33 et il présente une résistance protéolytique plus de

dix fois supérieure à celle du peptide natif (Figure 1.11).

H-Lys-Ala-Val-Tyr-Asp-Phe-Ala-Thr-Met-OH

NH

NH2

O

HN

Ala-Thr-Met-OH

OH-Lys-Ala-Val-Tyr

HN

NH

Thr-Met-OH

OH-Lys-Ala-Val-Tyr-Asp

Perte de la reconnaissance par les lymphocytes T Bonne reconnaissance par les lymphocytes T

GP33

GP33ψψψψ5-6 GP33ψψψψ6-7

Figure 1.11. Présentation de l’insertion d’une liaison réduite en substitution de la liaison peptidique P5-P6 ou P6-P7 sur le peptide GP33. Effet sur la reconnaissance par les lymphocytes T.

Une modification itérative de chaque liaison peptidique a également été réalisée sur le

peptide CW3 se complexant au CMH-I H-2Kd afin de déterminer le rôle du squelette

peptidique dans la reconnaissance du peptide par les lymphocytes T spécifiques au peptide

CW3.70 L’affinité de liaison est conservée pour les peptidomimes CW3ψ5-6 et CW3ψ6-7

possédant respectivement une liaison réduite en position P5-P6 et P6-P7 (Figure 1.12).

Il est intéressant de noter que ce résultat est similaire aux résultats obtenus pour le

peptide GP33 puisque les peptidomimes GP33ψ5-6 et GP33ψ6-7 sont les plus affins.69 Ces

données confirment que la partie centrale du peptide n’est pas beaucoup impliquée dans la

complexation du peptide au CMH-I. En revanche, contrairement à l’analogue GP33 ψ6-7 qui

était capable de stimuler différentes lignées de lymphocytes T spécifiques au peptide natif,

dans le cas des peptidomimes CW3ψ5-6 et CW3ψ6-7, le premier n’est plus reconnu par les deux

lymphocytes T testés et le second n’est capable d’en stimuler qu’un des deux, mais de façon

trois fois plus forte que le peptide natif. Par contre, le mime CW3ψ1-2 est capable de stimuler

les deux lymphocytes T alors qu’il est très peu affin au CMH H-2Kd.

NH

NH2

O

HN

Lys-Glu-Thr-Leu-OH

O

H-Arg-Tyr-Leu-Lys

HN

NH

Glu-Thr-Leu-OH

O

H-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asp

Perte de la reconnaissance par les lymphocytes T Reconnaissance par un des deux lymphocytes T testés

H-Arg-Tyr-Leu-Lys-Asn-Gly-Lys-Glu-Thr-Leu-OH

NH2

CW3

CW3ψψψψ5-6 CW3ψψψψ6-7

Figure 1.12. Présentation de l’insertion d’une liaison réduite en substitution de la liaison peptidique P5-P6 ou P6-P7 sur le peptide CW3. Effet sur la reconnaissance par les lymphocytes T.


26

Autre exemple, un peptide antigénique issu du virus Epstein-Barr possède une très

faible affinité pour le CMH-I HLA-A2 ce qui induit un complexe binaire peu stable. Afin

d’améliorer cette stabilité, la substitution de la cystéine en position P1 par une tyrosine et

celle de la glycine en position P3 par une alanine ont été envisagées et l’affinité de liaison de

ce peptide pour le HLA-A2 a été augmentée.71 Toutefois, la biostabilité de ce nouveau peptide

de séquence YLAGLLTMV (YLA ) restant assez faible, l’introduction de diverses

modifications, dont la substitution par une liaison réduite d’une liaison peptidique sensible

aux peptidases, a permis de générer un nouvel analogue stable en milieu biologique, se liant

correctement au HLA-A2 et reconnu par les lymphocytes T spécifiques au peptide natif

(Figure 1.13).72

H2NO

HN

HO

NH

OHN

ONH

OHN

ONH

OOH

HN

O

S

NH

O

OH

H2NO

HN

HS

NH

OHN

ONH

OHN

ONH

OOH

HN

O

S

O

NH

O

OH

H2NO

HN

HO

NH

OHN

ONH

OHN

ONH

OOH

HN

O

S

NH

O

OH

Affinitéau

HLA-A2

Lyse spécifique

(%)

Temps 1/2-vie (min)

O25 40 12,7

27 45 304

14 30

Proche du

peptide YLA

Peptide natif

YLA

Peptide modifié

Figure 1.13. Présentation des modifications apportées à un peptide antigénique issu du virus Epstein-Barr et de leurs effets sur l’affinité de liaison au HLA-A2, la capacité à induire une réponse immunitaire et la biostabilité de ces analogues.

La liaison rétro-inverso

Une autre approche pour synthétiser des peptides bio-résistants est d’inverser la liaison

peptidique : on parle alors de liaison rétro-inverso.73 Goodman et Chorev furent les pionniers

dans cette discipline.74 Différents groupes synthétisèrent des peptides complètement75-78 ou

partiellement rétro-inverso79-80 afin de les utiliser comme molécules bio-résistantes pour

différentes applications biologiques. Cette modification a notamment été utilisée pour la


27

synthèse d’analogues bio-résistants du peptide antigénique M58-66 issu du virus de la

grippe.81 Elle est obtenue par la substitution de deux aminoacides consécutifs par un dérivé

malonate 2-substitué et un résidu gem-diaminoalkyle. Chaque dipeptide a donc été remplacé

par l’isostère correspondant, fournissant huit nouveaux peptidomimes qui furent testés pour

leur capacité à se lier au HLA-A2. Le peptidomime possédant une liaison rétro-inverso en

position P1-P2 présente une affinité de liaison au HLA-A2 aussi forte que le peptide natif. Ce

résultat est assez surprenant car cette liaison peptidique P1-P2 est l’une des plus impliquées

dans la fixation de peptides antigéniques au HLA-A2 (Figure 1.14). Deux hypothèses peuvent

expliquer cet effet : soit la liaison peptidique n’est pas aussi importante que ce qui est suggéré

dans les études structurales, soit cette liaison rétro-inverso permet d’établir de nouvelles

liaisons hydrogène.

H2N

HN

OLeu-Gly-Phe-Val-Phe-Thr-Leu-OH

O

H2N NH

Leu-Gly-Phe-Val-Phe-Thr-Leu-OH

OO

COHN

HOO

HN CO

OH

Glu 63

Tyr 159

Conservation de l'affinité de liaison au HLA-A2

M58-66

Figure 1.14. Représentation d’un analogue du peptide M58-66 possédant une liaison rétro-inverso en position P1-P2 et son effet sur l’affinité de liaison de cet analogue au HLA-A2.

A l’inverse, l’insertion de cette modification en position P2-P3, P3-P4, P5-P6 ou P8-P9 a pour

conséquence une importante perte d’affinité de liaison du pseudo-peptide au HLA-A2. De

plus, alors que les modifications en position P2-P3 et P8-P9 engendrent la perte de liaisons

hydrogènes entre les liaisons peptidiques initiales et les chaînes latérales des résidus à

l’intérieur du site de fixation du HLA-A2, les modifications en position P3-P4 et P5-P6 ont

plutôt des effets sur la conformation globale du peptide.

La N-méthylation et la N-hydroxylation des liaisons amidiques

L’introduction de liaisons amidiques N-méthylées ou N-hydroxylées dans les peptides

va permettre de masquer la liaison peptidique vis-à-vis des peptidases, mais va également

avoir un effet sur la conformation du squelette peptidique et sur les propriétés électroniques


28

de cette liaison. Cette modification a été introduite dans différents peptides antigéniques afin

de voir l’influence de ce motif sur leur affinité de liaison au CMH-I et leur capacité à stimuler

des lymphocytes T. Hin et al. incorporèrent une liaison peptidique N-hydroxylée en

combinaison avec une substitution tour à tour de chaque acide aminé par une glycine dans la

séquence du peptide SIINFEKL. Leur objectif était de synthétiser des antagonistes de peptides

antigéniques, c’est-à-dire des molécules qui soient de très bons ligands pour le CMH-I mais

qui ne soient plus reconnues par les TCR.82 Habituellement, ces antagonistes sont obtenus par

modification des chaînes latérales des acides aminés en contact avec les TCR. Dans ce cas, le

peptide modifié en position P6 est le meilleur antagoniste sachant que l’acide glutamique

initial n’était pas engagé dans des interactions avec les TCR (Figure 1.15). Cet analogue est

six fois plus affin au CMH-I murin H-2Kb mais ne stimule pas les lymphocytes T.

H-Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu-OH

HN

O

N

OH O

Lys-Leu-OHH-Ser-Ile-Ile-Asn

Antagoniste du peptide naturel, 6 fois plus affin au H-2Kb que le peptide natif

Figure 1.15. Représentation d’un analogue du peptide SIINFEKL possédant une glycine N-hydroxylée en position P6. Effet de cette modification sur l’activité biologique de cet analogue.

Ayyoud et al. utilisèrent une approche rationnelle pour générer des analogues du

peptide antigénique MAGE-1.A1. En se basant sur les modes d’interaction du peptide avec le

CMH-I et le TCR, le site N-méthylé a spécifiquement été introduit sur les liaisons peptidiques

sensibles à la dégradation par les peptidases. Cette modification a été réalisée en combinaison

avec la substitution d’autres résidus sensibles par leur analogue de configuration D ou par

l’acide amino-isobutyrique (Aib). Parmi les douze analogues synthétisés, celui portant un Aib

en position P2 et une sérine N-méthylée en position P8 présentent les meilleurs résultats

biologiques : son temps de demi-vie en milieu biologique est supérieur à 24 heures, c’est un

bon ligand du HLA-A1 et il est capable d’activer des lymphocytes T spécifiques à MAGE-

1.A1 et ceci dans le même ordre de concentration que le peptide natif (Figure 1.16).


29

H-Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr-OH

NH

Asp-Pro-Thr-Gly

O

H-Glu Tyr-OH

ON

OHO

HN

NNH

Affinité de liaison au HLA-A1 20 fois plus forte.Stimulation des lymphocytes T conservée.

Figure 1.16. Représentation d’un analogue du peptide MAGE-1.A1 possédant un Aib en position P2 et une sérine N-méthylée en position P8 et effet de ces modifications sur l’activité biologique de cet analogue.

4.4.2 Modification des résidus d’ancrage pour accroître l’interaction

du peptide avec le CMH-I

La spondylarthrite ankylosante est une maladie auto-immune qui se caractérise par

l’inflammation de la colonne vertébrale et du bassin. L’une des protéines impliquées dans

cette maladie est le CMH-I HLA-B27 puisqu’en présentant des antigènes peptidiques

bactériens ou du soi, il participe au développement de cette maladie. L’inhibition de la

présentation de ces antigènes représente donc une alternative immunothérapeutique. Les

structures cristallines de différents peptides complexés au HLA-B27 mettent en évidence la

présence d’une arginine en position P2 qui se positionne dans une poche profonde du HLA-

B27, le groupement guanidinium se retrouvant face à la cystéine 67 du CMH-I, à 3,7 Å

(Figure 1.17a).83 Une nouvelle approche consista à établir un lien covalent entre le peptide et

le HLA-B27 en présentant à la fonction thiol de la cystéine 67 un groupement susceptible de

réagir. Deux peptides naturels se liant au HLA-B27 ont été sélectionnés comme modèles

pouvant être modifiés. Des acides aminés présentant un groupement aziridine ont été

introduits en substitution de l’arginine en position P2.84 Les différents analogues obtenus ont

ensuite été testés pour leur capacité à se lier au HLA-B27 puis à former une liaison covalente

avec ce CMH. Ils montrèrent qu’un lien covalent avait été formé entre le groupement

aziridine et la cystéine 67, mais la stabilité des complexes covalents et non-coavlents restent

proches (Figure 1.17b). On peut toutefois penser qu’à 37°C, les complexes covalents ont un

temps de demi-vie supérieur aux complexes non-covalents.


30

H2N

HN

O

NH

O

Ala-Phe-Val-Val-Ile-Gly-Lys-OH

Liaison au HLA-B27

H2N

HN

O

NH2S

O

Ala-Phe-Val-Val-Ile-Gly-Lys-OH

NH

OCys 67

Figure 1.17. a) Structure cristalline d’un peptide antigénique au sein du HLA-B27 : Mise en évidence du positionnement de la cystéine 67 par rapport à l’arginine du peptide antigénique. b) Représentation d’un analogue peptidique portant un acide aminé contenant un motif aziridine et formation de la liaison covalente entre la cystéine visée et la fonction aziridine.

4.4.3 Modification de la partie centrale interagissant avec les

récepteurs des lymphocytes T

Comme présenté précédemment, le peptide antigénique interagit principalement par sa

partie centrale avec les TCR. Afin de moduler ces interactions, différents travaux ont porté sur

la modification de la partie centrale du peptide antigénique.

Synthèse de peptides antigéniques contenant un lien PolyEthylèneGlycol (PEG)

Pour influer sur les interactions d’un peptide antigénique avec les TCR, Bouvier et al.

proposèrent de cycliser un peptide naturel, un décamère issu de la protéine virale Tax, en

ajoutant un lien PEG pour qu’il s’extériorise du site de fixation du CMH-I et soit présenté aux

TCR.85 Pour introduire cette chaîne, ils substituèrent les aminoacides en position P4 et P8 par

des lysines sur lesquelles la chaîne PEG peut facilement être introduite (Figure 1.18).

Différents analogues cycliques furent synthétisés puis testés pour leur capacité à se lier au

HLA-A2. La stabilité des complexes binaires des analogues peptidiques avec le HLA-A2 est

comparable à celle du peptide natif. Les différentes longueurs de chaîne n’interviennent pas

sur la fixation des analogues, suggérant que ces analogues ont une liberté conformationnelle

suffisante pour interagir de la même façon que le peptide natif avec HLA-A2 et que cette

chaîne alkyle est bien située à l’extérieur du CMH-I.

a) b)


31

H-Ser-Leu-Leu-Phe-Gly-Tyr-Pro-Val-Tyr-Val-OH

NH

HN

NH

NH

Gly-Tyr-Pro-Val

O

H-Ser-Leu-Leu

O

Val-OH

OOO-(CH2CH2-O)n

Même affinité de liaison au HLA-A2 que le décamère Tax

Figure 1.18. Représentation du décamère Tax et de son analogue cyclisé par l’introduction d’un lien PEG entre les positions P4 et P8.

Synthèse de peptides antigéniques contenant un système tricyclique en partie centrale

La réponse immunitaire mettant en jeu un complexe binaire pCMH reconnu par les

lymphocytes T CD8+ a pour fonction d’identifier et de détruire les cellules tumorales ou

infectées par un corps étranger à l’organisme. Toutefois, il peut arriver que cette

reconnaissance soit inappropriée dans le cas de greffe ou de maladies auto-immunes. Afin de

lutter contre ces erreurs de reconnaissance, l’équipe de Schreiber a travaillé sur la synthèse

d’antagonistes de peptides antigéniques.86 En se basant sur la structure cristalline d’un peptide

antigénique présenté par le HLA-Aw68,87 deux liaisons clés régissant la bonne orientation des

résidus d’ancrage du peptide au sein de ce CMH furent identifiées. Via une base de données

contenant 4.105 molécules cycliques, ces deux liaisons devinrent le paramètre de référence

pour identifier des cycles susceptibles d’être introduits en partie centrale de peptides

antigéniques. Soixante-seize molécules ont été sélectionnées et après modélisation

moléculaire des différents ligands, le motif phénanthridine fut choisi. Il a été introduit en

substitution de trois acides aminés centraux dans trois nonapeptides, de quatre acides aminés

centraux dans deux décapeptides et jusqu’à cinq acides aminés centraux dans l’un des deux

décapeptides (Figure 1.19). Les différents analogues ont ensuite été testés pour leur capacité à

se lier au CMH-I ciblé. Malgré la forte contrainte conformationnelle engendrée par le motif

phénanthridine, les différents analogues ont une affinité de liaison proche de celle du peptide

natif.


32

NH

O

HN

CMH-I Séquence peptidique initiale HLA-A2 H-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val-OH

H-Gly-Leu-Leu-Gly-Phe-Val-Phe-Thr-Leu-OH

HLA-Aw68 H-Lys-Thr-Gly-Gly-Pro-Ile-Tyr-Lys-Arg-OH H-Glu-Val-Ala-Ala-Pro-Glu-Tyr-His-Lys-Lys-OH H-Glu-Val-Ala-Ala-Pro-Glu-Tyr-His-Lys-Lys-OH

HLA-B27 H-Arg-Arg-Ile-Ala-Ala-Ile-Thr-Leu-Arg-OH

Figure 1.19. Présentation des différents analogues peptidiques contenant un motif phénantridine en partie centrale.

Synthèse de peptides antigéniques contenant un espaceur aliphatique en partie centrale

Suivant la même approche d’inhibition et pour lutter contre l’arthrite, Rognan et al.

synthétisèrent des analogues peptidiques de nonapeptides bactériens dont la partie centrale est

substituée par une chaîne aliphatique.88 En particulier, ils travaillèrent sur le peptide de

séquence QRLKEAAEK. Afin de sélectionner les analogues les plus intéressants, ils

réalisèrent dans un premier temps une simulation par dynamique moléculaire à partir de la

structure cristalline du CMH-I HLA-B27. La substitution du pentamère central KEAAE par

un trimère d’acide 4-aminobutyrique ou un dimère d’acide 6-hexanoïque donna des résultats

intéressants. Chacun des ses analogues adopte une conformation basse en énergie proche de

celle du peptide de référence. Les deux analogues incluant l’une ou l’autre de ces

modifications furent donc synthétisés (Figure 1.20). L’affinité de liaison au HLA-B27 de ces

deux analogues est proche de celle du peptide de référence, ce qui souligne que l’introduction

de telles modifications n’a pas d’effet direct sur le positionnement des résidus d’ancrage pour

satisfaire une bonne liaison.

H-Gln-Arg-Leu-Lys-Glu-Ala-Ala-Glu-Lys-OH

NH

HN

O

OHN

OH

O

NH2

H-Gln-Arg

3

HN

O

OHN

OH

O

NH2

H-Gln-Arg

2

NH

Affinité de liaison au HLA-A2 conservée

Sélection des analoguespar dynamique moléculaire

Figure 1.20. Représentation des motifs aliphatiques introduits en partie centrale du peptide antigénique de séquence QRLKEAAEK.


33

Par la suite, ce même groupe développa de nouveaux substituants mimant la partie

centrale de peptides restreints au CMH-I HLA-B27. Ils ont tout d’abord introduit l’ester 11-

amino-undecanoate puis un trimère d’ester 3-hydrobutyrate (HB) en partie centrale d’un

peptide, sans succès. En revanche, l’insertion d’un tétramère d’ester 3-hydroxybutyrate s’est

avérée être l’espaceur de taille idéale pour relier les deux zones d’ancrage et a permis de

multiplier par cinq l’affinité de liaison.89 Cependant, la limitation majeure à l’utilisation de

ces analogues en milieu biologique est la faible stabilité des liaisons esters. En se basant sur la

meilleure bio-stabilité des β-peptides, ils décidèrent de substituer des β-homoalanines en

partie centrale de peptides se liant au HLA-B27.90

Cette équipe introduisit en particulier de tels espaceurs en partie centrale du peptide

gp120 issu du Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH). Malheureusement,

l’introduction d’un tétramère de β-homoalanine ou d’un dimère de β-homoalanine couplé à

l’ester 3-hydrobutyrate n’améliora pas l’affinité de liaison au HLA-B27 en comparaison du

tétramère d’ester 3-hydroxybutyrate (Figure 1.21).

H2NNH

O

HN

H2N NH

HN

OX

O

NH2O

HN

OH

O

NH2

X C50a

O

O3

O

O4

HN

O4

O

O2

O

HN

40,0

2,5

2,8

2,8

HB3

HB4

β-homoalanine4

(β-homoalanine-HB)2Peptide gp120 modifié

Figure 1.21. Présentation des différents analogues du peptide GP120 synthétisés et évalués pour leur capacité à se lier au HLA-B27. a C50 = Concentration pour laquelle la fluorescence issue de la complexation du composé avec le HLA-B27 correspond à la moitié de la fluorescence maximale atteinte pour ce même composé.

Synthèse de peptides antigéniques contenant un espaceur de type poly-amine N-acylés

Les poly-amines N-acylées sont des chaînes aliphatiques contenant des amines

secondaires. La présence de ces fonctions offre donc la possibilité d’introduire divers motifs

latéraux. Des études structurales sur l’octapeptide SIINFEKL lié au CMH-I murin H-2Kb ont

mis en évidence que les résidus en position P5 et P8 sont les résidus d’ancrage clés. En se

basant sur ces données, Bianco et al. modifièrent la moitié C-terminale de ce peptide,

contenant les résidus en position P5 et P8.91 Dans un premier temps, afin de déterminer

l’espaceur optimal, ils synthétisèrent douze analogues contenant différents espaceurs et motifs


34

en position C-terminale (P8), tout en conservant le même groupement sur l’amine secondaire

pour mimer la chaîne latérale de la phénylalanine en position P5. Ces modifications

entrainèrent une forte diminution de l’affinité de liaison pour le H-2Kb des différents

analogues générés. Afin de restaurer cette dernière, des liaisons amides capables de former

des liaisons hydrogène avec le CMH-I furent introduites au sein du squelette. Le peptide

PAA6 induisant la meilleure affinité de liaison a ensuite été modifié en mettant différents

motifs aromatiques, hétéroaromatiques ou pseudo-aromatiques en position P5 et différents

aminoacides hydrophobes en position P8 (Figure 1.22). Les tests biologiques de cette

nouvelle librairie révélèrent que l’introduction de motifs organiques flexibles en position P5

favorise une meilleure affinité de liaison et que les interactions dans cette poche P5 sont

principalement de nature hydrophobe. Toutefois, aucune réelle amélioration de l’affinité de

liaison de ces différents analogues de PAA6 pour le H-2Kb n’a été observée.

H-Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu-OH

HN N

NH

O

H-Ser-Ile-Ile

HN

OOH

OO

Peptide le plus affin au CMH H-2Kb

PAA6

Figure 1.22. Représentation de la modification d’un peptide antigénique par introduction d’un espaceur de type poly-amine N-acylées en partie centrale et effet sur l’affinité de liaison de l’analogue au H-2Kb.

A la suite de ces travaux, le peptide PAA6 fut de nouveau choisi comme tête de série

pour générer des agonistes du peptide naturel, c’est-à-dire des molécules capables de se lier

correctement au H-2Kb et d’être reconnues par les lymphocytes T 4G3.92 Ainsi, une nouvelle

librairie d’analogues modifiés sur la position mimant la chaîne latérale du résidu en position

P5 et contenant différents acides aminés aliphatiques naturels fut préparée. Les différents

analogues induisirent une réponse immunitaire six fois moins importante que le peptide

naturel, sûrement du fait d’une moins bonne présentation des analogues peptidiques aux

lymphocytes T.


35

Conclusion

Ce chapitre avait pour objectif de présenter d’une part la réponse immunitaire à

médiation cellulaire impliquant les lymphocytes T CD8+. Après avoir resitué ce processus à

sein du vaste et complexe système immunitaire, le mode de présentation du peptide

antigénique par le CMH-I a été présenté. Puis, la reconnaissance de ce complexe par les

récepteurs des lymphocytes T a été expliquée. Au travers de ces deux sous-parties, l’étude par

cristallographie a été mise en avant comme outil permettant de mieux comprendre les

mécanismes moléculaires régissant l’interaction entre les trois acteurs de ce système, le CMH-

I, le peptide antigénique et le TCR.

D’autre part, les avancées dans le domaine de l’immunologie ont permis aux

scientifiques de développer un nouveau mode de thérapie : l’immunothérapie dont l’objectif

est de moduler la réponse immunitaire à médiation cellulaire impliquant les lymphocytes T

CD8+. L’utilisation de peptides antigéniques pour influer sur cette réponse serait très

intéressante mais présente des limitations. Pour contrer principalement les problèmes de

biostabilité, la synthèse de mimes de peptides antigéniques naturels a été développée.

Différentes approches furent explorées, l’objectif final étant de générer des molécules bio-

résistantes, capables de se lier au CMH-I et de générer ou au contraire d’inhiber la stimulation

des lymphocytes T.

L’objectif des différents projets qui vont être présentés dans la suite de ce manuscrit

est d’utiliser cette réponse immunitaire comme mode de destruction des cellules cancéreuses.

Pour parvenir à ce but, le parcours consiste à concevoir, synthétiser et étudier des peptides

non-naturels, appelés peptidomimes, qui doivent générer la même activité biologique, donc

être agonistes d’un peptide naturel.


36

Références bibliographiques (1) Rosemb erg, S. A.; Mulé, J. J.; Spiess, P. J.; Reichert, C. M.; Schwarz, S. L. Regression

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43

Collaborations

Les travaux présentés dans la suite de ce manuscrit sont le fruit de nombreuses

collaborations avec des chimistes, biologistes et biophysiciens :

Le Dr John J. Miles et Mlle Emily E. Edwards travaillant dans l’équipe du Pr Andrew K.

Sewell, du Département de Biochimie Médicinale de l’Université de Médecine de Cardiff,

Henry Wellcome Building, Heath Park, Cardiff, CF14 4XN, Pays de Galles (UK), ont réalisé

les tests d’affinité de liaison au HLA-A2 et de stimulation de lymphocytes T.

Le Dr Oleg Borbulevytch et Mlle Priscilla Do travaillant dans l’équipe du Pr B. M. Baker, du

Département de Chimie et Biochimie de l’Université de Notre Dame, 251 Nieuwland Science

Hall, Notre Dame, IN 46556, Indiana (USA) ont réalisé les tests de stabilité l’étude

cristallographique de complexes binaires peptide/HLA-A2.

M lle Itxaso Azcune et le Dr Eva Balentová travaillant dans l’équipe du Pr Jesus M. Aizpurua

du Département de Chimie Organique de l’Université du Pays Basque, Institut Joxe Mari

Corta, Avenue de Toulouse, 72 20018 Saint-Sébastien, Espagne, ont réalisé la synthèse des

molécules contenant un cycle β-lactame.

Le Dr Nathalie Marchand-Geneste de l’Institut des Sciences Moléculaires de l’Université

Bordeaux 1, 351, Cours de la Libération, 33 405 Talence, a participé aux travaux de

modélisation moléculaire.

Chapitre 2

Etat de l’art sur la modification du peptide antigénique Melan-A/MART-1 26-35 A27L

Chapitre 2 : Etat de l’art sur le peptide antigénique Melan-A/MART-126-35 A27L

47

Préambule

Les traitements actuels utilisés pour lutter contre le cancer de la peau sont des

traitements de chimiothérapie. Du fait d’un manque de spécificité des molécules actives

employées, ces traitements engendrent des effets secondaires lourds pour le patient. Afin de

développer de nouveaux traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses,

l’immunothérapie représente donc une alternative intéressante. Dans cette optique, l’équipe

du Pr S. Quideau développe un axe de recherche consacré à la synthèse de molécules mimant

un antigène peptidique naturel présenté à la surface des cellules tumorales dans le cas de

mélanome primaire et métastasique.

I- Le peptide antigénique Melan-A/MART(26-35) A27L

1.1 Identification des peptides antigéniques naturels et de leurs analogues

La protéine de différentiation Melan-A/MART-1 (Melan-A) est exprimée dans 90 %

des cas de mélanomes primaires et métastasiques. Elle constitue donc une cible idéale pour

une approche d’immunothérapie. Des lymphocytes T cytolytiques spécifiques à Melan-A ont

été isolés à la fois parmi les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBL pour

« Peripheral Blood Lymphocytes ») et parmi les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL pour

« Tumor Infiltrating Lymphocytes »).1-2 Par criblage de différents fragments peptidiques,

l’équipe du Professeur Rosenberg a pu déterminer un premier peptide antigénique reconnu par

les TIL spécifiques à la protéine Melan-A : le nonamère peptidique Melan-A27-35 de séquence

AAGIGILTV (AAG ).3 Par la suite, une autre étude a permis de mettre en évidence que le

décamère Melan-A26-35 de séquence EAAGIGILTV (EAA ) était plus efficacement reconnu

par les TIL spécifiques de Melan-A que le peptide Melan-A27-35.4 Bien que les LTC

spécifiques du peptide Melan-A26-35 soient capables de reconnaître et de lyser les cellules

tumorales, une analyse biochimique directe des peptides antigéniques présents à la surface des

cellules tumorales n’a permis d’identifier que le peptide Melan-A27-35.5 Une étude détaillée du

peptide Melan-A26-35 par Ala-scan (substitution tour à tour de chaque acide aminé par une

alanine afin de mettre en évidence le rôle de chacun d’entre eux dans la liaison au CMH-I) a

montré que les résidus GIGIL sont plus particulièrement impliqués dans la reconnaissance du

peptide antigènique par les lymphocytes T (Figure 2.1).6


48

Figure 2.1. Présentation des interactions du peptide ELA avec le CMH-I et le TCR.

Ces peptides sont présentés à la surface des cellules tumorales par le CMH-I nommé

HLA-A2. Au vue des connaissances acquises sur le mode de liaison des peptides antigéniques

au HLA-A2 et de l’importance des résidus hydrophobes en P2 et P9 (P10),7 l’équipe du Pr F.

Jotereau a réalisé une étude de liaison sur le nonapeptide AAG et sur le décapeptide EAA , en

remplaçant notamment l’alanine en position P2 par une leucine.8 Les résultats obtenus ont été

plus que surprenants. Si l’affinité de liaison au HLA-A2 des deux peptides altérés a été

augmentée, la reconnaissance par différents clones de LTC spécifiques à Melan-A n’était plus

du tout la même. En comparaison du nonapeptide AAG , le peptide altéré ALGIGILTV

(ALG ) n’était plus reconnu par la majorité des clones testés (même à des concentrations

élevées). Pour le décapeptide altéré ELAGIGILTV (ELA ), il génère une réponse immunitaire

plus élevée que les peptides natifs AAG et EAA . Plus récemment, Borbulovych et al. ont

montré que deux clones de LTC, JKF6 et DMF5 reconnaissaient fortement les quatre peptides

dérivant de Melan-A (EAA , ELA , AAG et ALG ).9 Le peptide ALG reste toutefois très

faiblement voire pas du tout reconnu pour la majorité des clones testés. Une autre étude a

permis de découvrir un superagoniste du nonapeptide natif, possédant une leucine en P1 en

substitution de l’alanine en position P1 (LAGIGILTV, LAG).10-11

Ces différences de réactivité peuvent être rationnalisées par l’étude structurale de

chacun de ces peptides.

1.2 Etude structurale des peptides présentés

La première étude structurale rapportée dans la littérature a été réalisée sur le nonapeptide

modifié ALG et le décapeptide modifié ELA , tous deux complexés au CMH-I HLA-A2.12

Cette étude cristallographique a permis de mettre en évidence un changement structural sur la

partie centrale du peptide en contact avec le TCR (Figure 2.2a). Il est alors clairement apparu

que la raison de la meilleure activité antigénique de ELA en comparaison de ALG était due à

une différence géométrique importante. Dans le cas du peptide ELA , la partie centrale adopte


49

une structure en zig-zag dans laquelle la chaîne latérale de l’isoleucine en position P5

s’extériorise de la poche de liaison du HLA-A2 pour s’orienter vers le TCR. Cette différence

conformationnelle pourrait expliquer la raison pour laquelle le nonapeptide ALG n’est plus

reconnu par la majorité des clones spécifiques à Melan-A. Par la suite, les structures

cristallines des complexes binaires des peptides Melan-A26-35 et Melan-A27-35 complexé au

CMH-I HLA-A2 ont également été résolues.9 Ces travaux mettent en évidence la différence

de conformation entre ces deux peptides : le nonamère adopte une conformation étendue,

comme dans le cas du nonapeptide ALG et de nombreux nonapeptides naturels, alors que le

décapeptide adopte une conformation en zigzag, comme le décapeptide ELA . Cette étude

décrit aussi la structure du complexe binaire LAG /HLA-A2. Il est intéressant de noter que ce

nonapeptide LAG adopte le même type de conformation que les décapeptides EAA et ELA

(Figure 2.2b). On peut penser que la structure adoptée par le nonapeptide Melan-A27-35 au sein

du complexe binaire n’est pas la conformation reconnue par les TCR. A l’approche du TCR, il

semble probable que ce peptide adopte une nouvelle conformation, proche du peptide LAG.

Plus récemment, la première structure cristalline du complexe ternaire TCR

MEL5/ELA /HLA-A2 a été résolue.13 La conformation du peptide ELA au sein de ce

complexe ternaire est très proche de celle qu’il adopte au sein du complexe binaire

ELA /HLA-A2 (Figure 2.2c).

Structure en zigzagStructure en zigzagStructure en zigzagStructure en zigzaga)

c)

b)

c)

Figure 2.2. Structure cristalline a) du peptide ELA (jaune, PDB 1JF1) superposée au peptide ALG (bleu, PDB 2GTZ), tous les deux dans le complexe binaire peptide-HLA-A2, b) du peptide ELA (bleu, PDB 1JF1) superposée aux peptides EAA (violet, PDB 2GT9) et LAG (blanc, PDB 2GTW), tous les trois dans le complexe binaire peptide/HLA-A2, c) du peptide ELA au sein du complexe ternaire MEL5/ELA /HLA-A2 (PBD 3HG1).


50

Le peptide ELA présente donc une immunogénicité in vitro et in vivo augmentée par

rapport aux peptides AAG et EAA .6,14-15 Les LTC induits par ELA sont parfaitement

capables de reconnaître les peptides naturels issus de la protéine Melan-A et de lyser les

cellules tumorales. Le peptide ELA présente donc un grand intérêt pour être utilisé en

immunothérapie contre le cancer du mélanome.

1.3 Limitations de l’utilisation du peptide ELA en milieu biologique

Comme présenté dans le chapitre 1, l’un des facteurs majeurs limitant l’utilisation de

peptides antigéniques à des fins thérapeutiques réside dans leur sensibilité aux peptidases et

leurs faibles propriétés pharmacocinétiques. Ainsi, la présentation du peptide ELA par le

HLA-A2 peut être altérée à cause de la dégradation, après administration, du peptide par les

peptidases.16 La réponse immunitaire s’en trouve donc énormément réduite, voir annulée.

Un modèle de dégradation du peptide ELA dans le sérum humain a été proposé par

Blanchet et al.17 Il met en évidence que les peptidases attaquent tout d’abord les parties N- et

C- terminales, de manière successive jusqu’à arriver à un peptide de six à sept acides aminés

(Figure 2.3).

Figure 2.3. Modèle de dégradation du peptide ELA par les peptidases.17

Toutefois, des tests cliniques sur le peptide ELA ont été réalisés en présence d’autres

molécules : le peptide gp100, issu lui aussi d’une protéine de différenciation et d’une

molécule dicarbazine connue comme agent alkylant de l’ADN. Cette étude montre que cette

combinaison permet d’augmenter la durée d’activité des lymphocytes T et que ces mêmes

lymphocytes, une fois stimulés, reconnaissent les cellules tumorales présentant le peptide

natif.18


51

II. Modification du peptide ELA

2.1 Modification des extrémités N- et C-terminales du peptide ELA

Le modèle de dégradation établi pour ELA a amené de nombreux groupes à travailler

sur la modification des extrémités N- et C-terminales afin d’accroître la stabilité de ses

analogues en milieu biologique. Dans les années 1990, il était même reconnu que l’activation

des lymphocytes T était directement corrélée à la bonne présentation du peptide par le CMH-

I, et donc à la stabilité du complexe binaire pCMH.19 Il faut donc trouver le bon équilibre

entre résistance à la biodégradation et bonne présentation du peptide antigénique.

Ainsi, certaines des modifications peptidiques présentées dans le chapitre précédent

ont été utilisées pour générer des analogues bio-résistants et présentant une activité similaire à

celle du peptide ELA .17 Côté N-terminal, la fonction amine fut méthylée et acétylée, l’acide

glutamique fut substitué par différents acides aminés non-naturels, à savoir l’acide

pyroglutamique, la β-alanine, l’acide β-glutamique, l’acide β-aspartique, la N-hydroxy-

glycine. La liaison peptidique entre l’acide glutamique et la leucine en position P1-P2 fut

réduite, puis substituée par une liaison rétro-inverso. Enfin, la leucine en position P2 fut

substituée par l’(α-méthyl) leucine. Côté C-terminal, la fonction acide terminale fut

transformée en amide. La thréonine en position P9 fut substituée par son isomère, la D-

thréonine. La liaison peptidique en position P8-P9 fut N-méthylée puis réduite. Enfin, la

leucine en position P8 fut remplacée par l’(α-méthyl) leucine puis par la D-leucine (Figure

2.4). Ces modifications introduites une à une ou en combinaison sur le peptide ELA ont

permis de générer trente-six analogues de ELA . Chacun fut testé pour sa résistance aux

peptidases mais également pour sa capacité à lier le CMH-I HLA-A2 et à stimuler une lignée

de lymphocytes T spécifiques à Melan-A.


52

H2N

HN

ONH

HN

NH

HN

NH

HN

NH

HN

OHHOOC

O

O

O

O

O

O

O O

OH

NH

NH

O

MeO

O

NH

O

H2N

O

H2N

OHOOC

H2N

O

NH

HN

O

HN

O

HN

O

HN

O

NH

O

OHO

NH

N

O

O

NH2

HOOC

Figure 2.4. Présentation des différentes modifications des extrémités du peptide antigénique ELA .

D’une part, cette étude a révélé que la modification de l’une ou l’autre des extrémités

n’augmentait pas beaucoup la durée de vie du peptide dans le sérum biologique. Seule la

substitution de l’acide glutamique en position P1 par les différents β-aminoacides ou l’acide

pyroglutamique, et la réduction de la liaison leucine-thréonine (P8-P9) ont permis d’accroître

de quelques minutes, et dans le dernier cas de quelques heures, la stabilité du peptide vis-à-vis

des peptidases. En revanche, la modification simultanée des deux extrémités rend ces

analogues très résistants puisqu’ils sont stables de 10 à 24 heures au lieu de 40 minutes dans

le cas du peptide ELA.

Cependant, bien que possédant une stabilité accrue dans les fluides biologiques, ces

analogues de ELA ne se lièrent que faiblement au HLA-A2. Parmi eux, seuls les pseudo-

peptides mono-modifiés ont une capacité à se lier au HLA-A2 proche du peptide ELA . De

manière intéressante, les peptides portant un β-aminoacide en position P1 et un groupement

méthyle sur la leucine en position P8 stimulent de façon égale, voire meilleure, une lignée de

lymphocytes T spécifiques à Melan-A.


53

2.2 Modification de la partie centrale du peptide ELA

Les modifications présentées précédemment ont pour objectif de rendre les analogues

de ELA bio-résistants et d’accroître leur interaction avec le CMH-I. Cette meilleure et plus

longue présentation du peptide par le CMH-I vise à accroître la reconnaissance du complexe

binaire pCMH par les TCR.19 Toutefois, la stimulation des LTC est principalement due aux

interactions des TCR avec la partie centrale de l’antigène peptidique. Ainsi, une nouvelle

approche récemment développée par l’équipe du Pr S. Quideau consiste à modifier la partie

centrale de peptides antigéniques pour accroître les interactions de ces peptides avec les TCR

et donc activer les LTC. Le décapeptide ELA fut choisi comme modèle lors de l’introduction

des modifications au niveau de la partie centrale.

2.2.1 Insertion d’une molécule naturelle en partie centrale du peptide

ELA

Dans un premier temps, l’équipe du Pr S. Quideau choisit d’introduire une molécule

naturelle (issue d’une éponge marine),20 la puupehenone faisant partie de la famille des

sesquiterpènes et possédant diverses propriétés biologiques, dont des propriétés

immunologiques.21-23

Présentation et validation de l’outil de modélisation moléculaire

Afin de déterminer la meilleure position pour accrocher cette molécule naturelle sur le

peptide antigénique, une étude de modélisation moléculaire fut tout d’abord réalisée à l’aide

du module LigandFit du logiciel Cerius 2 de la société Accelrys. A cette époque, aucune

structure cristallographique de complexe ternaire contenant le peptide ELA n’avait été décrite

dans la littérature. Le groupe choisit donc de travailler avec l’une des structures cristallines de

complexes ternaires les mieux résolues (2,6 Å) et les plus étudiées : celle du complexe TCR

A6/Tax/HLA-A2 (PDB 1AO7).24 De plus, le TCR A6 possède un segment issu du gène

TRAV12-2 très impliqué dans l’interaction avec le peptide et le CMH, et rencontré dans de

nombreux TCR spécifique à Melan-A. En effet, environ 80 % des lymphocytes T spécifiques

à Melan-A exprime ce gène qui code pur les boucles CDR1α et CDR2α du TCR.[Eur J

Immunol2002 32, 3182 ; J Immunol2003, 170, 5203] Au sein de ce complexe ternaire, le

peptide Tax, de séquence LLFGYPVYV, interagit par ses extrémités N- et C-terminales avec

le HLA-A2 alors que la tyrosine en position P5 pointe à l’extérieur du sillon du CMH-I et est

positionnée entre les deux boucles CDR3α et CDR3β du TCR A6. La structure du peptide

ELA issue du complexe binaire ELA /HLA-A2 (PDB 1JF1)12 a été superposée à celle du


54

peptide Tax dans le complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2, par superposition des résidus

de la chaîne α des HLA-A2 de chaque structure. Cette superposition montre une conservation

remarquable du positionnement des résidus ancres, à savoir la leucine en position P2 et la

valine en position C-terminale (Figure 2.5a). De plus, l’isoleucine en position P5 se place

dans la poche entre les boucles du TCR, comme la tyrosine dans le cas du peptide Tax.

HLA-A2

CDR3 αααα

CDR3 ββββ

TCRa) b)

Figure 2.5. Présentation a) de la superposition du peptide Tax dans le complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 et du peptide ELA dans le complexe binaire ELA /HLA-A2 ; b) du docking de ligand du peptide ELA au sein du complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2. Le peptide ELA adopte des conformations très proches ; l’outil de modélisation est donc validé.

De plus, afin de valider le choix de ce complexe ternaire comme modèle d’étude pour

la réalisation des minimisations et docking des différents candidats, nous avons effectué le

docking du peptide ELA dans le site de liaison identifié à partir du peptide Tax. Ce site de

liaison correspond à l’enveloppe du peptide Tax à l’intérieur du complexe ternaire. La

conformation de plus basse énergie obtenue pour le peptide ELA au sein du site d’interaction

est identique à celle du peptide dans le complexe binaire ELA /HLA-A2 (Figure 2.5b). Ces

résultats montrent que ce complexe ternaire est un modèle plausible pour la réalisation des

études de docking. Cet outil a donc été utilisé pour déterminer quelle position de la partie

centrale GIGI du peptide ELA pouvait accueillir la molécule puupehenone.

Afin d’introduire la puupehenone en partie centrale du peptide ELA , il est nécessaire

de choisir un acide aminé possédant un groupe nucléophile sur sa chaîne latérale. Le choix de

l’équipe s’est porté sur la cystéine dont la fonction thiol peut participer à une addition

nucléophile sur la fonction quinone de la molécule naturelle. Ainsi, quatre peptides,

ELACIGILTV, ELAGCGILTV, ELAGICILTV et ELAGIGCLTV portant le motif

puupehenone sur le résidu cystéine ont été évalués par modélisation moléculaire. Le peptide

portant la molécule en position P5 présente les meilleurs résultats de docking, avec un

positionnement correct de la puupehenone dans la poche entre les boucles CDR3 α et β du

TCR (Figure 2.6).


55

Figure 2.6. Etude de docking du peptidomime ELAGCGILTV portant la puupehenone en position P5.

Synthèse et évaluation biologique du peptide sélectionné

Ce peptide a donc été synthétisé afin d’évaluer sa capacité à se lier au CMH-I HLA-

A2 et à stimuler différentes lignées lymphocytaires spécifiques à Melan-A/MART-1. La

séquence peptidique ELAGCGILTV a été construite sur support solide. Puis, la puupehenone

a été couplée en solution sur le squelette peptidique pour fournir le peptide attendu (Schéma

2.1).

O

OOH

H

H

ELAGCGILTV

CH3CN-H2O (9:1)0,1% TFA

NH

O GILTV

S

O

OHOH

ELAG H

H

H

Partieorthoquinone

ELA-Puu 13 %

Schéma 2.1. Couplage de la molécule de puupehenone avec la cystéine en position P5 du squelette peptidique. Obtention du peptide ELA-Puu .

L’évaluation biologique du peptide ELA-Puu a donné des résultats assez

surprenants (Tableau 2.1). Bien que son affinité de liaison au HLA-A2 soit très faible

(valeur ?), la stimulation de huit lymphocytes T spécifiquement à Melan-A/MART-1 a été

mesurée par cytométrie de flux. En particulier, cinq des huit clones testés ont reconnu le

peptide modifié. De plus, deux d’entre eux ont donné une réponse aussi importante que le

peptide natif EAA et très proche du peptide ELA.

Peptide M77.84 M199.3.2 MEL1-38 CDM41-ELA1 M17-29.ELA1 MEL1-37 24B7 10C10EAA 40 27 80 77 76 82 11 60ELA 53 30 86 79 78 84 24 76

ELAGCGILTV portant la

puupehenone0 28 47 26 65 82 0 0

Tableau 2.1. Présentation des résultats de stimulation de différentes lignées de lymphocytes T spécifiques à Melan-A/MART-1. Les valeurs correspondent au pourcentage de cellules sécrétant des interférons-γ.


56

Ces résultats montrent que, bien qu’étant un ligand de faible affinité pour le HLA-A2,

une réponse immunitaire aussi forte que le peptide natif a pu être observée. Ce phénomène a

déjà été observé dans d’autres travaux.25-26

Le mécanisme de reconnaissance du complexe binaire par les TCR n’étant pas

parfaitement établi, ces résultats peuvent être rationnalisés en supposant que le TCR stabilise

le complexe binaire pCMH, principalement par interaction des domaines CDR1 et 2 du TCR

avec les hélices α du CMH-I et peut-être les extrémités du peptide antigénique, puis dans un

deuxième temps, le domaine CDR3 se positionne pour interagir principalement avec la partie

centrale du peptide porteur de la puupehenone.27-29

2.2.2 Modification du tétrapeptide GIGI en partie centrale du peptide

ELA : Présentation de 23 nouveaux analogues

Synthèse et évaluation de l’affinité de liaison au HLA-A2 des 23 peptidomimes

Ces premiers résultats20 soulignent le fait que la partie centrale du peptide ELA peut

être modifiée sans pour autant que le peptide perde ses propriétés antigéniques. Suite à ces

résultats encourageants, le groupe du Pr S. Quideau réalisa de nouveaux travaux en modifiant

pas à pas la partie centrale GIGI du décapeptide ELA. 30 Il s’appuya de nouveau sur des

résultats de modélisation moléculaire en utilisant le module LigandFit présenté précédemment

afin de sélectionner les meilleurs candidats avant synthèse. Pour rappel, chaque candidat est

modélisé afin de déterminer le conformère de plus basse énergie au sein du complexe TCR

A6/candidat/HLA-A2. Puis, la conformation obtenue pour chaque candidat est comparée à

celle du peptide ELA de référence. Trois points de vérification ont été établis pour chaque

candidat : (i) le bon positionnement des acides aminés d’ancrage du mime dans le HLA-A2 en

position P2 (leucine) et P10 (valine10), (ii) la conservation de la conformation globale du

squelette peptidique et (iii) l’orientation des chaînes latérales en interaction avec le TCR.

Les meilleurs candidats ont été synthétisés et leur affinité de liaison au CMH-I HLA-

A2 a été évaluée. Pour cela, les peptides sont mis à incuber avec des cellules T2 possédant à

leur surface des HLA-A2 « vides ». Puis, après lavage, les cellules sont mises en présence

d’un anticorps spécifique au HLA-A2 : sachant que seuls les HLA-A2 complexés à un peptide

sont restés stables, l’anticorps mAb ne reconnait que les HLA-A2 contenant un peptide.

Enfin, un test de type Elisa est réalisé : les cellules sont incubées avec un anticorps anti-mAb

qui fluoresce lorsqu’il y a reconnaissance. Ainsi, la fluorescence mesurée par cytométrie de

flux est directement corrélée à la quantité de peptides candidats fixés aux HLA-A2.


57

L’augmentation de fluorescence en présence d’un candidat est comparée à la fluorescence

mesurée en l’absence de peptide (contrôle négatif) et est exprimée par le ratio d’intensité de

fluorescence (RFI pour "Ratio Fluorescence Intensity"). Ce ratio correspond au rapport de la

fluorescence moyenne mesurée pour chaque candidat sur la florescence moyenne mesurée

lors du contrôle négatif. Ce RFI est directement lié à l’affinité de liaison de chaque peptide

pour le HLA-A2. De plus, afin de mieux comparer le résultat de chaque candidat avec le

peptide tête de série ELA , chaque RFI mesuré est divisé par le RFI obtenu pour le peptide

ELA , donnant une valeur de rapport de RFI de 1 pour ELA . Toute valeur supérieure ou

inférieure à 1 signifie respectivement que le candidat est plus affin ou moins affin au HLA-A2

que le peptide ELA (Tableau 2.2).

Séquence Groupement R Rapport de RFI

ELA ELAGIGILTV 1,00

EAA EAAGIGILTV 0,63

1 ELAGYGILTV 0,80

2 ELAGFGILTV 0,97

3 ELAGWGILTV 0,73

4 ELAG(ΨCH2NH)YG(YCH2NH)ILTV 1,71

5 ELAG(ΨCH2NH)WG(YCH2NH)ILTV 1,61

6 ELAG(ΨCH2NH)W-amba-LTV 1,34

7 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-C6H4-NO2 0,85

8 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-C6H5 0,9

9 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-naphthalene 0,70

10 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-quinoline 0,79

11 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-C6H4-OH 0,83

12 ELA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-C6H11 0,86

13 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-GILTV CH2-C6H5 0,96

14 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV CH2-C6H4-NO2 0,86

15 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV CH2-quinoline 1,31

16 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV CH2-C6H5 0,95

17 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV (CH2)2-C6H5 0,25

18 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV (CH2)2-indole 0,86

19 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV (CH2)2-C6H4-OH 0,42

20 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV CO-CH2-C6H5 0,54

21 β ALA-NH-(CH2)2-(R)G-Amba-LTV CO-CH2-indole 1,02

22 β ALAG(ΨCH2NH)Tpi-Amba-LTV 0,81

23 β ALAG(ΨCH2NH)Tic-Amba-LTV 0,64

Tableau 2.2. Présentation de 23 peptidomimes modifiés en partie centrale et leur résultat d’affinité de liaison au HLA-A2 en comparaison à l’affinité de liaison du peptide ELA .

La première étude réalisée dans le groupe du Pr S. Quideau a montré qu’un motif

encombrant pouvait être introduit sur la chaîne latérale de l’acide aminé en position P5. Ainsi,

les premiers candidats synthétisés possèdent un acide aminé aromatique en position P5 à

savoir la tyrosine, la phénylalanine et le tryptophane. Leur affinité de liaison au HLA-A2 est


58

légèrement plus faible que celle du peptide ELA mais supérieure au peptide natif EAA

(Schéma 2.2).

H-Glu-Leu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-OH

Substitution del'Ile 5

Liaisons réduites

NH

HN

HN

H-ELA

R

ONH

LTV-OH

O

1-3

4-5

Xaa =H-Glu-Leu-Ala-Gly-Xaa-Gly-Ile-Leu-Thr-Val-OH

Tyr 1Phe 2Trp 3

R =

OH

4

HN

5

Schéma 2.2. Premières modifications du peptide ELA .

Par la suite, le groupe envisagea la modification du squelette peptidique. En vue de

concevoir un espaceur en partie centrale, deux liaisons réduites furent notamment introduites

après le quatrième et le sixième acide aminé des peptides portant une tyrosine (peptide 4) et

un tryptophane (peptide 5) en position P5 (Schéma 2.2). En effet, l’étude de docking montra

une conservation de la conformation en zigzag de la partie centrale de chaque peptide,

caractéristique du peptide ELA . De plus, alors que certains travaux suggèrent que l’utilisation

de ce type de modification engendre une diminution de l’affinité de liaison au CMH-I,31-33

dans ces deux cas, au contraire, l’affinité de liaison au HLA-A2 a été augmentée : elle est plus

d’une fois et demi supérieure à celle du peptide ELA et deux fois plus forte que celle du

peptide natif EAA . Il est probable que les liaisons réduites offrent une plus grande flexibilité

au système, ce qui permet au peptide de mieux se positionner au sein du CMH-I.

En corrélant ces résultats à ceux d’autres groupes qui introduisirent un espaceur poly-

amines N-acylées34-35 en partie centrale de peptide antigénique, le groupe du Pr S. Quideau

choisit de substituer le premier dipeptide GI par un espaceur de type N-(2-aminoéthyl)

glycine. Les résultats de docking de peptidomimes contenant cet espaceur montrèrent un bon

positionnement des résidus d’ancrage en position P2 (leucine) et P10 (valine) dans le sillon de

fixation du HLA-A2 avec la partie centrale du peptide qui s’arque à l’extérieur du sillon de

fixation. De plus, l’amine secondaire de l’espaceur N-(2-aminoéthyl) glycine est située dans la

même zone que l’acide aminé en position P5 dans les candidats 1-3. Or, la chaîne latérale de

cet acide aminé semble être un des éléments clés pour la reconnaissance du peptide par les

TCR. La présence de cette amine dans cette zone facilitera donc l’introduction de divers

groupements aromatiques sur la partie centrale du peptide afin qu’ils soient présentés aux


59

TCR. Les peptidomimes 7-13 possédant l’espaceur de type N-(2-aminoéthyl) glycine et

portant différents groupements aromatiques sur la partie centrale furent synthétisés puis

évalués pour leur capacité à se lier au HLA-A2 (Schéma 2.3, 1ère génération). Chacun

présente une affinité de liaison au HLA-A2 proche de celle du peptide ELA . La substitution

de l’acide glutamique en position P1 par une β-alanine fut également réalisée afin de diminuer

le caractère peptidique de l’extrémité N-terminale et ainsi augmenter la résistance du peptide

vis-à-vis des peptidases.17,36 L’analogue 13 portant à la fois l’espaceur de type N-(2-

aminoéthyl) glycine dont l’amine est substituée par un benzyle et une β-alanine en position P1

a été synthétisé. Son affinité de liaison au HLA-A2 étant très proche de celle de ELA , cette

modification a alors été conservée pour la conception de nouveaux analogues.

NNH

NH

H-Glu-Leu-AlaO

HN

Leu-Thr-Val-OH

OR

OEspaceur N-(aminoethyl)glycine

1ère génération

NNH

NH

H-βAla-Leu-AlaO

Leu-Thr-Val-OH

OR2ème génération

R =

CH2 CH2

N

CH2

CH2

NO2

CH2 CH2

OH OH

CH2

CH2

HN

CH2

HN

O

8/13/16 9 10/15

7/14 12

Peptidomimes 4-5

11 19

17 18 21 20

N

NH

NH

H-βALA

LTV-OH

O

O

N

OTic

Tip3ème génération

7-12

H-βAla-

13

O

14-21

22-23

Schéma 2.3. Stratégie de synthèse suivie par le groupe Quideau pour synthétiser les 23 peptidomimes modifiés en partie centrale.

Dans un deuxième temps, la modification du deuxième dipeptide GI en position P6-P7

a été explorée. A nouveau, l’étude par modélisation moléculaire a permis de sélectionner

l’acide 3-aminométhylbenzoïque (m-AMBA) comme mime du second dipeptide GI. De plus,

en combinaison avec la liaison réduite en position P4, le peptide 6 conserve une affinité de

liaison avec le HLA-A2 supérieure à celle du peptide ELA . En combinaison avec l’espaceur

N-(2-aminoéthyl) glycine qui substitue le premier dipeptide GI et avec la β-alanine en


60

position P1, une nouvelle famille de huit peptidomimes 14-21 a été générée, portant différents

motifs aromatiques sur la partie centrale (Schéma 2.3, 2ème génération). Les analogues 14-16

portant un motif aromatique relié à l’amine secondaire par un groupement méthylène

présentent une affinité de liaison similaire à celle du peptide ELA . En revanche, les analogues

17-21 portant un motif aromatique relié à l’amine secondaire par un groupement éthylène ou

carbonylméthylène n’ont pas donné les résultats souhaités. L’allongement du lien entre le

motif aromatique et l’amine secondaire du squelette peptidique a pour but de favoriser la

pénétration du motif aromatique à l’intérieur des boucles du TCR. Cette modification a eu un

effet néfaste sur l’affinité de liaison au HLA-A2 des peptidomimes 17, 19 et 20 qui est bien

plus faible que celle du peptide natif EAA . Il est probable que ce soit la trop grande flexibilité

de ce bras éthylène qui ait empêché un bon positionnement global de ces mimes. Seuls les

deux analogues 18 et 21 portant tous les deux un motif indole présentent une affinité de

liaison au HLA-A2 correcte. En particulier, l’analogue 21 est aussi affin que le peptide ELA .

Ces résultats combinés à ceux de modélisation moléculaire nous poussèrent à envisager un

mode de liaison similaire pour le peptidomime 21 et le peptide ELA (Figure 2.7).

Figure 2.7. Superposition des résultats de modélisation moléculaire par docking de ligand du peptide ELA (en orange) et du peptidomime 21 (en vert) au sein du complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 (PDB 1AO7).

Pour finir, l’équipe du Pr S. Quideau synthétisa les deux analogues 22 et 23, portant

des acides aminés cycliques non-naturels en substitution de l’isoleucine en position P5, en

combinaison avec la liaison réduite en position P4 et le m-AMBA en position P6-P7 (Schéma

2.3, 3ème génération). Dans ces deux peptidomimes, ces acides aminés forment des analogues

cyclisés de l’espaceur N-(2-aminoéthyl) glycine et ont pour rôle de contraindre le repliement

de la partie centrale du peptide pour qu’elle s’arque à l’extérieur du site de fixation. Toutefois,

l’affinité de liaison au HLA-A2 n’a pas été améliorée (Tableau 2.2).


61

Ces résultats montrent que de manière générale, la partie centrale des peptides

antigéniques tel que ELA peut être remplacée par des motifs non-peptidiques tout en

conservant une affinité de liaison au CMH-I correcte. Néanmoins, bien que la partie centrale

n’interagisse pas directement avec le CMH-I, sa modification influence la capacité du peptide

à se replier dans le sillon du CMH-I puisque dans certains cas, l’effet peut être dramatique.

D’autre part, l’outil de modélisation utilisé ne corrèle pas toujours avec les résultats d’affinité

mais il reste un outil fiable puisque la majorité des mimes testés ont une affinité de liaison

proche ou supérieure à celle de ELA.

Evaluation des 23 peptidomimes à stimuler sept lignées lymphocytaires spécifiques à Melan-A

Dans un deuxième temps, les analogues de ELA 1-23 ont été évalués pour leur

capacité à stimuler sept lymphocytes T spécifiques à Melan-A. Ces lymphocytes T sont soit

des cellules T infiltrant la tumeur (TIL), soit des cellules T du sang périphérique (PBL). De

cette étude, il ressort que les peptides 1, 2 et 3 stimulent cinq des sept lymphocytes testés

avec une reconnaissance comparable à celle du peptide ELA pour quatre d’entre eux,

confirmant que l’introduction d’un groupement hydrophobe en position P5 n’est pas

défavorable à la stimulation des lymphocytes T, même si l’affinité de liaison au HLA-A2 est

moindre. En revanche, les peptidomimes 4 et 5 présentant deux liaisons réduites dans leur

squelette et dont l’affinité de liaison au HLA-A2 est une fois et demi supérieure au peptide

ELA ne donnent aucun résultat positif dans la stimulation des lymphocytes T. Le peptide 6,

qui possède une liaison réduite en position P4 et le motif m-AMBA en position P6-P7, induit

une stimulation de quatre clones de LTC, deux d’une intensité similaire à ELA et deux d’une

intensité un peu plus faible. Enfin, parmi les 17 peptidomimes restant, le candidat 21,

possédant à la fois l’espaceur N-(2-aminoéthyl) glycine en position P4-P5 et le m-AMBA en

position P6-P7, un motif indole sur la partie centrale et la β-alanine en position P1, donne des

résultats très encourageants puisqu’il stimule de façon significative quatre des sept clones de

LTC. Dans le cas du clone MEL1-37, cette activation est même plus importante que celle

induite par le peptide ELA (Figure 2.8). Pour rappel, ce peptide présentait une affinité de

liaison au HLA-A2 identique au peptide ELA.


62

0

500

1000

1500

Fluo

resc

ence

Uni

t

M77.84 M199.2.7 MEL1-38 MEL1-37 CDM41-ELA1

M17-29.ELA1

EAA

ELA

cnd 161

O

NH

O

HN

O

NH

N

O

NH

O

NH

O

HN

O

NH

OHO

OHH2N

HN

O

Uni

téde

fluo

resc

ence

Analogue 21

Peptide 21

Figure 2.8. Présentation de la structure du peptidomime 21 et des résultats de stimulations de différentes lignées de lymphocytes T spécifiques à Melan-A/MART-1 par ce peptidomime, en comparaison des peptides EAA et ELA .

Ces résultats laissent à penser que le peptide 21 interagit de la même façon que le

peptide ELA avec le HLA-A2, mais, du fait de la différence de motif porté en partie centrale,

il interagirait différemment avec les récepteurs lymphocytes T. Il est intéressant de noter que

le peptide 18, analogue du peptide 21 ne portant pas de liaison carbonyle sur la chaîne

latérale, ne stimule aucun TCR. La présence de la liaison amide permet peut-être de mieux

positionner la chaîne latérale indole entre les boucles CDR3α et β du TCR.

Pour compléter ce projet et rationaliser les premiers résultats obtenus, une étude

structurale de différents complexes binaires peptidomimes/HLA-A2 a été réalisée.

III. Résultats récents : Etude structurale de différents complexes binaires

peptide/HLA-A2

Une fois publiés, ces résultats ont permis d’initier une collaboration avec l’équipe du

Pr B. M. Baker (Université Notre-Dame, Indiana, USA) afin d’étudier par cristallographie aux

rayons X la liaison de ces peptidomimes au HLA-A2. L’étude de quatre complexes binaires

peptidomimes/HLA-A2 a été réalisée. Ma contribution dans ce projet au sein du groupe du Pr

S. Quideau a consisté à synthétiser les différents peptidomimes afin qu’ils soient ensuite

envoyés à l’équipe du Pr B. M. Baker. Deux des candidats choisis pour cette étude sont les

deux peptidomimes ayant obtenu les meilleurs résultats de stimulation des lymphocytes T, à

savoir le peptide 6 et le peptide 21. Deux autres peptides ont été synthétisés pour compléter

nos recherches : le peptide 6.1 et 21.1 dont la différence avec les peptides 6 et 21 réside dans

le premier acide aminé de la séquence. En effet, le peptidomime 6.1 diffère du peptide 6 par la

substitution de l’acide glutamique en position P1 par une β-alanine et inversement, le peptide

21.1 porte un acide glutamique en position P1 en substitution de la β-alanine dans le peptide

21.


63

Après avoir présenté la synthèse de ces différents peptidomimes, l’étude structurale de

chaque complexe binaire sera détaillée.

3.1 Synthèse des quatre peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide

3.1.1 La synthèse peptidique sur support solide

Tout d’abord, rappelons brièvement les origines de la synthèse peptidique sur support

solide. Cette technique a été mise au point dans les années 60, afin de répondre au besoin des

chercheurs de synthétiser un grand nombre de peptides pour effectuer des études

biochimiques et pharmacologiques. Ainsi, R. B. Merrifield, en 1963, synthétisa le premier

peptide en phase hétérogène.37 Le principe repose sur des billes polymériques, insolubles dans

la plupart des solvants organiques et fonctionnalisées afin de pouvoir accrocher de manière

covalente un acide aminé. Ainsi, après greffage du premier acide aminé sur le support, par un

jeu de déprotection/couplage, les résidus sont additionnés séquentiellement de la partie C-

terminale vers la partie N-terminale. Après chaque étape de synthèse, le surnageant est filtré et

la résine est lavée. La dernière étape consiste à libérer le peptide de son support par utilisation

d’un agent de clivage.

Différentes sortes de résines sont actuellement commercialisées pour s’adapter à

diverses stratégies de synthèses. Elles diffèrent :

• par le type de fonctionnalisation et donc par le mode de clivage du peptide de la

résine,

• par la nature du polymère et donc par ses propriétés de gonflement,38

• et par le taux de greffage ou charge.

La robotisation de cette technique a également permis d’augmenter les quantités de peptides

synthétiques.

Cette technique a donc été choisie au détriment de la synthèse en phase homogène car

elle présente de nombreux avantages : les étapes de synthèses sont plus rapides, des peptides

de taille plus importante peuvent être synthétisés et la résine étant facilement lavable,

l’utilisation de réactifs en excès afin d’optimiser les rendements de couplage ne pose aucun

problème. Néanmoins, bien que les rendements soient plus importants en synthèse

hétérogène, la capacité à fixer des peptides par gramme de résine reste encore aujourd’hui le

facteur limitant.


64

3.1.2 Synthèse des quatre peptidomimes ciblés

La synthèse des quatre peptides a donc été réalisée de façon manuelle sur support

solide. Notre choix s’est porté sur la résine Wang, un co-polymère

polystyrène/divinylbenzène présentant à sa surface un espaceur de type 4-

hydroxyméthylphényloxyle (Figure 2.9).39 Ce support est classiquement utilisé dans la

synthèse de peptides acides et présente l’avantage d’avoir un taux de greffage correct (environ

0,7 mmol.g-1). Cette résine est acido-labile et se clive avec l’acide trifluoroacétique (TFA).

HO

HO

O

Figure 2.9. Présentation de la fonctionnalisation de la résine Wang.

La stratégie de synthèse associée à ce type de résine est une stratégie de type Fmoc, où

les acides aminés utilisés sont protégés par le groupement Fluorénylméthyloxycarbonyle

(Fmoc) sur l’amine, clivable avec une solution de pipéridine à 20% dans le

diméthylformamide (DMF). Afin de déprotéger sélectivement la fonction amine avant chaque

couplage, les chaînes latérales sont classiquement protégées par des groupements acido-

labiles comme le tertio-Butyloxycarbonyle (Boc) ou tertio-Butyle (tBu).

La difficulté majeure dans l’utilisation de cette résine réside dans l’introduction du

premier acide aminé (la valine dans notre cas) : une méthode de couplage dite aux anhydrides

symétriques doit être réalisée (Schéma 2.4).

Fmoc-HNO

OH DIC

CH2Cl2Fmoc-HN

O

O

ONH-Fmoc

DMAP

HOFmoc-HN

O

O

Schéma 2.4. Greffage du premier acide aminé (la valine) sur la résine de type Wang.

Après déprotection de l’amine terminale, les couplages des trois acides aminés

suivants, à savoir la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine, la N-Fmoc leucine et l’acide 3-(N-

Fmoc-aminométhyl) benzoïque (N-Fmoc m-AMBA) ont été réalisés pour chaque

peptidomime, en présence d’un agent de couplage, l'Hexafluorophosphate de 2-(1H-

benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium (HBTU) et de diisopropyléthylamine (DIEA).

Synthèse des peptidomimes 6 et 6.1

Dans le cas des peptides 6 et 6.1, après couplage du N-Fmoc tryptophane et

déprotection, la liaison réduite est introduite par amination réductrice entre l’amine libre


65

terminale supportée et l’aldéhyde de la glycine. L’aldéhyde de la N-Fmoc glycine est obtenu

par réduction avec de l’aluminohydrure de lithium (LiAlH4) de l’amide de morpholine

correspondante, selon les conditions développées par Douat et al.40 Cet aldéhyde fraîchement

préparé est ensuite solubilisé dans une solution de DMF 1% acide acétique, puis additionné à

la résine en présence de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN). La difficulté de cette

étape réside dans l’équilibre entre les quantités de réactifs et le temps de réaction, le produit

secondaire de cette réaction étant l’amine tertiaire issue d’une seconde amination réductrice

sur l’amine secondaire formée. On peut également noter que le solvant utilisé n’est pas le

méthanol comme dans les conditions classiques d’amination réductrice car ce solvant n’est

pas favorable au gonflement de la résine.38 Après déprotection de l’amine terminale, les trois

derniers acides aminés, à savoir la N-Fmoc alanine, la N-Fmoc leucine et l’acide N-Fmoc-O-

tert-butyle glutamique dans le cas du mime 6 ou la N-Boc β-alanine pour l’analogue 6.1 sont

couplés de façon classique sur le support (Schéma 2.5). Les peptides sont ensuite clivés du

support avec une solution de TFA/H2O/tri -isopropylsilane (TIS) (95:2,5:2,5). Après

précipitation de chaque peptide dans l’éther diéthylique (Et2O) à froid, ils sont filtrés,

lyophilisés puis purifiés par HPLC semi-préparative. Les peptides 6 et 6.1 ont été obtenus

avec des rendements respectifs de 10 et 24%.

Leu-Thr(tBu)-Val

2- DMF/Pipéridine (4:1) 3- Fmoc-aa-OH, HBTU DIEA, DMF4- TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

x 3

HN

NH

HN

NH

O

HN

HN

NH

HN

OH

O

H2N

H2N

O

HN

OH2N

NBoc

Fmoc-HNOH

O

Fmoc-HNN

O

OFmoc-HN

H

O

O NH

HBTU, DIEA, DMF

24

THF, 0°C

LiAlH4

25

1- 25, NaBH3CN DMF, 1% AcOH

Leu-Thr(tBu)-Val

O

HN

ONH

NBoc

Fmoc-HN

O O

OOH

O

HNO

O

O OH

O

6 10 %

6.1 24 %

92 %taux de

conversion = 60 %

Schéma 2.5. Synthèse des peptidomimes 6 et 6.1.


66


Les peptidomimes 21 et 21.1 possèdent un motif N-(2-aminoéthyl) glycine en partie

centrale avec un motif indole sur l’amine centrale. Deux voies de synthèse de cette plateforme

centrale ont été explorées : sa synthèse soit en solution, soit totalement sur support solide.

Dans le premier cas, alors que la stratégie de synthèse présentée dans la publication du groupe

était composée de cinq étapes, une recherche bibliographique nous a permis de réaliser la

synthèse de cet espaceur en quatre étapes.41 A partir d’un grand excès d’éthylène diamine

libre à laquelle a été ajouté très lentement du bromoacétate de tert-butyle, le 2-(N-aminoéthyl)

aminoacétate de tert-butyle 26 est obtenu par substitution nucléophile d’une amine sur le

brome ; l’excès d’éthylène diamine et la vitesse d’addition permettent d’obtenir

majoritairement le composé mono-substitué (rendement de 66%). Puis, l’amine primaire est

protégée par un groupement Fmoc pour fournir le composé 27 avec un rendement de 40%.

L’amine secondaire sous forme de sel de chlorhydrate (du fait du traitement de la réaction

précédente) est ensuite protégée par un groupement allyloxycarbonyle (Alloc), orthogonal aux

groupements Fmoc et tBu, pour donner le composé 28 avec un rendement de 82%. Enfin,

l’ester tert-butylique est clivé en milieu TFA pour fournir l’espaceur 29 sous forme de sel de

TFA (Schéma 2.6).

H2NNH2

CH2Cl2, 0°C-> t.a.

BrO

O

H2N

HN

O

26

NH

HN

OFmoc-OSu, CH2Cl2

66 %

Fmoc

27 40 %

.HCl

NH

NO

Fmoc

28 82 %

O Cl

OAllyl

DIEA, CH2Cl2

O OCH2Cl2/TFA/TIS

(60:20:1)NH

NFmoc

29 79 %

O O

.TFA

OO

O O

OH

Schéma 2.6. Synthèse en solution de l’espaceur N-(2-aminoéthyl) glycine protégé.

Cet espaceur est ensuite couplé au m-AMBA greffé sur le support. Puis, après

déprotection de la fonction amine terminale, les trois derniers acides aminés sont introduits de

façon classique. Pour finir, le groupement Alloc est clivé par catalyse au Palladium de

Tetrakis (triphénylphosphine) puis l’acide 3-indole acétique est couplé sur l’amine secondaire

libre (Schéma 2.7a).


67

Leu-Thr(tBu)-Val

O

H2N

1- 29, HBTU, DIEA, DMF

Leu-Thr(tBu)-Val

O

NH

O

N

OO

Fmoc-HN

2- DMF/Pipéridine (4:1)3- Fmoc-aa-OH, HBTU DIEA, DMF4- Pd(PPh3)4, PhSiH3 DCM5-

6- TFA/H2O/TIS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5)

x 3

x 2HN

O

OH

HATU, DIEADMF

Leu-Thr(tBu)-Val

O

NH

OHN

Fmoc-HN

1- Fmoc-Gly-OH, HBTU DIEA, DMF2- DMF/Pipéridine (4:1)3- Fmoc-Gly-H, NaBH3CN DMF 1% AcOH

4-N

O

OHHATU, DIEADMF

5- DMF/Pipéridine (4:1)6- Fmoc-aa-OH, HBTU DIEA, DMF7- TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

x 3

NH

O

HN

NH

N

OO

NH

O

NH

OHN

OOH

NH

O

OH

O

O

NH

H2N

H2N

O

HO O

21

21.1

Voie a) Voie b)

Boc

32

7%

6%

Schéma 2.7. Synthèse des peptidomimes 21 et 21.1 par deux voies de synthèse : a) couplage sur support solide de la partie centrale synthétisée en solution ou, b) synthèse de la partie centrale modifiée sur support solide.

Bien que le couplage ait initialement été réalisé en présence de di-isopropyl-carbodiimide

(DIC),30 nous avons par la suite utilisé un autre agent de couplage, l'Hexafluorophosphate de

2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium (HATU), connu pour être un bon

agent de couplage d’amine secondaire.42 En effet, alors qu’en présence de DIC, nous obtenons

un mélange de produit de départ et de produit final, en présence de HATU et DIEA, le produit

attendu est majoritaire. En comparaison du HBTU, le HATU ne diffère que d’un atome. D’un

point de vue mécanistique, il a été proposé que la présence de l’atome d’azote permet un

rapprochement par liaison hydrogène entre l’amine secondaire et l’ester activée (Figure

2.10).42


68

X

NN

N

O

PF6N N

NN

H

X= N HATU Approche de l'amine secondaire proposée

X= CH HBTU

Me2NNMe2 O NMe2

NMe2

O"RRR'N

O

Figure 2.10. Représentation des structures du HBTU et du HATU.

Après couplage du motif indole sur l’amine secondaire centrale, les peptides sont clivés avec

une solution de TFA/H2O/TIS/éthanedithiol (EDT) (92,5:2,5:2,5:2,5), lyophilisés puis purifiés

par HPLC semi-préparative. La présence d’EDT est nécessaire pour éviter des réactions

secondaires sur l’indole libre pendant le clivage du peptide du support. Les peptides 21 et 21.1

ont été obtenus avec des rendements respectifs de 7 et 6%.

Dans le second cas, la N-Fmoc glycine est couplée à l’amine libre du m-AMBA selon

les conditions classiques, puis la liaison réduite est introduite de la même façon que décrit

précédemment. L’introduction de la chaîne latérale sur la partie centrale est ensuite réalisée

par couplage entre l’amine secondaire et l’acide (N-Boc) indole 3-acétique 32 en présence de

HATU et DIEA (Schéma 2.7b). L’acide indoleacétique est protégé en trois étapes : tout

d’abord, la fonction acide est protégée en ester méthylique, puis le groupement Boc est

introduit sur l’amine de l’indole. Pour finir, l’ester méthylique est clivé pour restaurer la

fonction acide (Schéma 2.8).

HN

O

OH

HN

O

OMe

N

O

OMe

BocN

O

OH

Boc

30 94% 31 74% 32 84%

HCl, MeOH, t.a. DMAP, Boc2O

THF, t.a.

LiOH, MeOH

THF, t.a.

Schéma 2.8. Préparation de l’acide (N-Boc) indoleacétique 32 en trois étapes.

Après couplage des trois derniers acides aminés sur le support, le peptide est clivé

avec une solution de TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5). Le motif indole central étant protégé, il n’est

pas nécessaire d’ajouter d’EDT. Cette deuxième méthode n’a été appliquée qu’à la synthèse

du peptidomime 21 qui a été obtenu avec un rendement de 7 %.

Les peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 ont ensuite été envoyés à l’équipe du Pr B. M.

Baker pour qu’ils soient étudiés au sein du complexe binaire peptidomime/HLA-A2.


69

3.2 Etude structurale des quatre complexes binaires peptide/HLA-A243

La génération des cristaux et les résolutions structurales des différents complexes binaires

ont été réalisées par Oleg Borbulovych dans le groupe du professeur Brian M. Baker.

3.2.1 Génération des cristaux de complexes binaires et acquisition des

données cristallographiques

Le domaine extracellulaire du HLA-A2 et la β2-microglobuline furent exprimés au

sein de la bactérie Escherichia Coli et le repliement de ces deux unités a été provoqué en

présence d’un excès de chaque peptidomime dans le DMSO. Après purification du complexe,

sa cristallisation fut réalisée par diffusion gazeuse, en utilisant la technique de la goutte assise.

Les cristaux ont été obtenus à 4°C dans une solution précipitante. Enfin, pour réaliser

l’analyse de ces cristaux par diffraction des rayons X, les cristaux furent transférés dans une

solution afin d’être instantanément gelés à l’azote liquide.

Les données cristallographiques montrent que chaque complexe peptidomime/HLA-

A2 cristallise dans le même groupe d’espace P21 avec deux molécules par unité asymétrique

et deux unités asymétriques par maille ; ces résultats sont similaires à ceux obtenus pour le

complexe ELA/HLA-A2 (Tableau 2.3).

Protéine 6/HLA-A2 6.1/HLA-A2 21/HLA-A2 21.1/HLA-A2

Référence PDB 3O3D 3O3E 3O3A 3O3BSource de radiation (beamline) APS (BM19) APS (BM14) APS (BM19) APS (BM14)Groupe d'espace P 21 P 21 P 21 P 21

a (Å) 58,2 58,2 58,2 58,1b (Å) 84,2 84,4 84,2 84,3c (Å) 84,1 84,0 84,0 84,0β (degré) 90,1 90,1 90,0 90,0Nombre de molécule par unité asymétrique 2 2 2 2Resolution (Å) 20-1,7 20-1,9 20-1,8 20-1,9Réflexions uniques 88669 66944 74605 61720mosaicité (degré) 0,30 0,23 0,28 0,38Complétude (%) 99,4 (98,3) 96,5 (72,9) 99,5 (96,2) 96,9 (81,6)I/σ 17,7 (2,0) 14,5 (1,7 13,4 (1,7) 10,9 (2,1)Rmerge 9,1 (49,6) 10,8 (63,4) 9,2 (51,1) 14,1 (49,7)Redondance moyenne 3,6 (3,2) 3,6 (2,7) 3,6 (3,3) 3,6 (3,1)Rwork 18,0 (84177) 18,2 (63539) 17,1 (71352) 18,6 (58568)

Rfree 21,8 (4435) 22,9 (3377) 21,2 (3786) 23,8 (3116)<B> (sur tous les atomes) (Å²) 16,9 17,4 21,1 11,6Diagramme de Ramachandran Le plus favorable (%) 93,1 91,8 92,2 91,6 Autorisé (%) 6,6 7,9 7,5 8,1 Autorisé (marge plus large) (%) 0,3 0,3 0,3 0,3 rmsd par rapport à l'idéal Liaison (Å) 0,016 0,017 0,016 0,018 Angle (degré) 1,704 1,719 1,762 1,843 Erreur coordinnée (Å) 0,08 0,11 0,09 0,12

Tableau 2.3 Paramètres cristallographiques et statistiques d’affinement.


70

3.2.2 Discussion autour des quatre structures obtenues : comparaison

avec celle du complexe ELA/HLA-A2

Tout d’abord, la conformation globale du CMH-I HLA-A2, au sein des quatre

complexes 6-HLA-A2, 6.1-HLA-A2, 21-HLA-A2 et 21.1-HLA-A2, étudiés est conservée.

Pour rappel, le site de fixation du peptide au sein d’un CMH-I est un sillon formé de deux

hélices α qui correspondent à chaque côté et d’un empilement de brins β antiparallèles,

représentant son fond. Il est maintenant établi que les peptides antigéniques s’ancrent dans ce

site de fixation par leur extrémités N- et C-terminales et adoptent une conformation dite

étendue ou s’arquent à l’extérieur du site de fixation. Dans le cas du peptide ELA , la partie

centrale s’arque à l’extérieur du site de fixation et adopte une conformation en zigzag.

D’après les résultats de modélisation moléculaire des peptidomimes 6 et 21,30 nous

supposions qu’ils allaient conserver le même type de conformation, avec le motif mimant la

chaîne latérale de l’acide aminé en position P5 qui pointerait vers le TCR.

Comparaison des structures des peptidomimes 6 et 21 : Focalisation sur la partie centrale

Pourtant, les structures des complexes binaires montrent des résultats très différents.

Dans le cas du peptide 21, les prédictions de modélisation moléculaire indiquaient que

l’espaceur N-(2-aminoéthyl) glycine devait épouser la forme du premier dipeptide GI alors

que le motif m-AMBA devait s’orienter de la même manière que le second dipeptide GI,

s’insérant dans la poche hydrophobe occupée par la chaîne latérale de l’isoleucine en position

P7 dans le peptide ELA . De plus, le motif indole greffé au centre de cet espaceur se placerait

entre les boucles CDR3α et β du TCR. Or, la conformation adoptée par ce peptide au sein du

complexe binaire 21/HLA-A2 est assez éloignée des prédictions puisque, bien que sa partie

centrale s’oriente à l’extérieur du site de fixation et adopte une conformation en zigzag, le

positionnement des deux groupements aromatiques est inversé (Figure 2.11). En effet, le

motif indole, au lieu de pointer à l’extérieur du site de fixation, s’oriente vers l’hélice α1 du

HLA-A2 et le m-AMBA, plutôt que de s’ancrer dans le sillon, s’extériorise.


71

Figure 2.11. Superposition des structures cristallines du peptide ELA (en violet) et du peptidomime 21 (en vert) au sein du complexe binaire peptide/HLA-A2.

La conformation au sein du HLA-A2 adoptée par le mime 6 diffère également de celle

du peptide ELA (Figure 2.12). Pour rappel, ce peptide possède une liaison réduite en position

P4-P5, un tryptophane en position P5 et l’espaceur m-AMBA en position P6-P7, en

substitution du second dipeptide GI dans le peptide ELA . Même si la conformation de la

partie centrale est différente de celle du peptide ELA , elle diffère également du peptide 21

puisque la partie centrale du peptide 6, au lieu de zigzaguer, s’arque complètement à

l’extérieur du sillon de complexation du HLA-A2. Toutefois, comme dans le cas de la

molécule 21, le m-AMBA est la zone la plus à l’extérieur alors que l’indole pointe à nouveau

vers l’hélice α1 du CMH.

Figure 2.12. Superposition des structures cristallines des peptidomimes 6 (en jaune) et 21 (en vert) au sein du complexe binaire peptide/HLA-A2.

Contrairement au peptide 21, il est intéressant de noter que les deux complexes 6/HLA-A2

contenus dans la maille asymétrique n’ont pas les mêmes caractéristiques. En effet, le m-

AMBA peut adopter deux positions, l’une d’elles se rapprochant de celle du peptide 21


72

(Figure 2.13). Aucun effet n’est observé sur le tryptophane qui conserve la même orientation,

et qui est d’ailleurs identique à l’orientation du groupement indole chez le peptide 21. De

plus, dans l’un des deux cas, deux conformations du squelette peptidique et des chaînes

latérales de la leucine en position P8 et thréonine en P9 ont pu être élucidées.

Figure 2.13. Superposition des structures cristallines du peptidomime 6 au sein de deux complexes binaires peptidomime 6/HLA-A2 contenus dans une maille asymétrique.

Ces différences structurales entre le peptide ELA et les peptidomimes 6 et 21 mettent en

évidence la capacité de ces deux molécules à s’adapter afin de se lier correctement au HLA-

A2.

Comparaison des structures des peptidomimes 21 et 21.1 d’une part et 6 et 6.1 d’autre part

Le peptide 21.1 diffère du 21 par l’acide aminé en position N-terminale puisqu’il présente

l’acide glutamique natif en position P1 plutôt qu’une β-alanine. Cette β-alanine implique

l’introduction d’un carbone supplémentaire entre le carbonyle et l’extrémité N-terminale. Ce

changement a eu pour effet un déplacement significatif de l’extrémité N-terminale qui

s’extériorise de la poche de liaison P1 du HLA-A2, entraînant la perte de la liaison hydrogène

avec la tyrosine 171, conservée dans toutes les structures peptide/HLA-A2 répertoriées

(Figure 2.14a). Dans notre cas, ce groupement pointe hors du site, vers la lysine 66, autre

acide aminé clé pour la fixation du peptide au HLA-A2.44

Or, la lysine portant une fonction amine, les effets électroniques répulsifs entre les

deux groupements engendrent un déplacement de la chaîne latérale de la lysine, et donc la

perte des liaisons hydrogène dans lesquelles elle était impliquée. Pour vérifier que ces

changements étaient uniquement dus à la présence de la β-alanine, le peptide 21.l où l’acide

glutamique est conservé, a été étudié. L’acide glutamique se repositionne alors comme dans le

cas du peptide ELA, conservant ainsi les interactions avec la lysine 66 et la tyrosine 171.


73

b)a)

Figure 2.14. Superposition des structures cristallines de l’extrémité N-terminale a) des peptidomimes 21 (en vert) et 21.1 (en violet) et b) des peptidomimes 6 (en jaune) et 6.1 (en violet) au sein du complexe binaire peptide/HLA-A2. Mise en évidence des effets de la β-alanine sur les modifications conformationnelles de cette zone des peptidomimes.

De même, dans le cas des peptides 6 et 6.1, les mêmes observations sont faites,

confirmant que ce déplacement n’est dû qu’à la présence de la β-alanine en position P1

(Figure 2.14b).

3.2.3 Corrélation des tests biologiques et des structures cristallines des

peptides 6 et 21

Du fait de leur capacité à stimuler différentes lignées de lymphocytes T spécifiques à

Melan-A, les peptides 6 et 21 ont été cristallisés au sein du complexe binaire avec le HLA-

A2.30 Toutefois, le repliement de chacun de ces peptides est loin des prédictions faites par

modélisation moléculaire. Le lien entre ces deux résultats peut donc paraître difficile à établir.

Néanmoins, il ne faut pas oublier que ce système est dynamique, preuve en est les

deux conformations adoptées par le peptide 6. De plus, de nombreuses publications ont mis en

évidence la plasticité des boucles CDR3 des TCR45-46 et actuellement, de nombreux travaux

sont publiés sur la réactivité croisée de divers lymphocytes T, c’est-à-dire leur capacité à

reconnaître différents peptides,47-49 remettant en cause leur spécificité vis-à-vis d’un épitope

donné.50 On peut en particulier supposer que les lymphocytes stimulés par les peptides 6 et 21

sont assez flexibles puisqu’ils reconnaissent également le peptide ELA et les deux peptides

natifs EAA et AAG .9 Les récepteurs des lymphocytes T s’adaptent donc au complexe binaire

peptide/HLA-A2, mais on peut également penser que le peptide s’oriente d’une autre façon en

présence de ce nouvel acteur.


74

D’autre part, l’introduction de la β-alanine à l’extrémité N-terminale dans le cas du

peptide 21 avait pour objectif d’accroître sa bio-résistance. Or, cette modification a engendré

la perte des deux interactions clés ayant habituellement lieu entre l’extrémité N-terminale

d’un peptide antigénique et le CMH-I. Pourtant, la capacité de ce peptide à se lier au HLA-A2

s’était avérée aussi forte que le peptide ELA .30 Nous devrons donc tenir compte de ces

résultats pour réaliser de nouvelles modifications des extrémités N- et C-terminales.


75

Conclusion

Le peptide antigénique Melan-A/MART-126-35 A27L semble être un peptide idéal pour

élaborer de nouveaux peptidomimes susceptibles d’être utilisés dans une application

d’immunothérapie contre le cancer de la peau. Ce chapitre présente les principales

modifications du peptide antigénique ELA qui ont été rapportées dans la littérature. Pour cela,

les différents travaux réalisés avant mon arrivée dans le groupe du professeur S. Quideau, à

savoir d’une part l’introduction d’une molécule naturelle sur la partie centrale, et d’autre part

la modification rationnelle de la partie centrale du squelette peptidique ELA , ont été exposés.

De cette seconde étude sont ressortis deux candidats, les peptidomimes 6 et 21, qui ont alors

été engagés dans une étude plus poussée. En effet, nous avons étudié leur structure au sein du

complexe binaire peptide/HLA-A2. Les résultats obtenus mettent en avant les différences de

conformation de leur partie centrale avec celle de ELA , et soulèvent de nouvelles

interrogations concernant les interactions des peptides 6 et 21 avec le HLA-A2 d’une part et

les TCR d’autre part. En particulier, les résultats biologiques obtenus pour ces deux

peptidomimes semblent difficiles à corréler à leur conformation structurale dans le complexe

binaire peptide/HLA-A2.

Le peptidomime 21 a été choisi comme point de départ pour le développement de

nouveaux peptidomimes qui font l’objet des deux chapitres suivants. Il reste important de

noter que les structures cristallines présentées dans ce chapitre ont été obtenues a posteriori

des résultats présentés dans les chapitres 3 et 4.


76


4.1 Généralités

4.1.1 Conditions expérimentales générales de synthèse en solution

Le tétrahydrofurane (THF), dichlorométhane (DCM) et le toluène sont séchés sur

colonne d’alumine. Le tert-butanol est distillé sur magnésium. Le DMF est distillé sur hydrure

de calcium (CaH2). Le méthanol (MeOH), l’éther diéthylique (Et2O), l’acétate d’éthyle

(AcOEt), le cyclohexane et le diméthylsulfoxide (DMSO), de qualité Synthèse, ainsi que les

réactifs commerciaux sont utilisés sans purification préalable. Les réactions sensibles à l’eau

et à l’oxygène sont effectuées sous atmosphère d’azote, en utilisant un montage rampe à

vide/azote ou sous atmosphère d’argon, dans une verrerie préalablement flammée ou séchée à

l’étuve à 110 °C. La température ambiante est comprise entre 20 et 25 °C. Les réactions à

basses températures sont réalisées dans un bain de glace (0 °C à -13 °C). Les évaporations

sont conduites sous pression réduite, à des températures inférieures à 40 °C. Les purifications

sur colonne chromatographique sont effectuées sous pression positive d’air avec de la silice

Merck de granulométrie 40-63 µm. Les solvants d’élution sont indiqués en rapport de volume

et sont utilisés sans purification supplémentaire. Le suivi des réactions et des purifications est

effectué par chromatographie sur couche mince sur gel de silice 60 F254 Merck, révélée sous

UV puis par une solution alcoolique d’acide phosphomolybdique (12 g de H3[P(Mo3O10)2]

dissous dans 250 mL d’éthanol). Les rendements chimiques de produits isolés purs sont

exprimés en pourcentages molaires (%) par rapport au produit de départ en défaut.

4.1.2 Techniques d’analyse des molécules synthétisées en solution

Point de fusion

Les températures de fusion des solides recristallisés et des poudres amorphes sont mesurées

sur un appareil de fusion digital Buchi B-540 dans des tubes capillaires ouverts et ne sont pas

corrigées.

Spectroscopie Infrarouge (IR)

Les spectres IR sont enregistrés entre 4000 et 400 cm-1 au moyen d’un spectromètre Bruker

IRFT IFS55. Tous les échantillons sont dissous dans du DCM et analysés sous forme de film


77

par évaporation du solvant sur une pastille de zinc-sélénium. Toutes les valeurs de fréquence

(ṽ) sont exprimées en cm-1. Seules les bandes caractéristiques sont décrites.

Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du proton 1H

Les spectres RMN du proton (1H) sont enregistrés dans le solvant indiqué sur l’appareil

Bruker DPX-300. Les valeurs des déplacements chimiques sont exprimées en ppm (δ)

relativement au signal résiduel du solvant utilisé comme référence interne (CDCl3 : δ 7,26

ppm ; CD3OD : δ 3,49 ppm ; (CD3)2=O : 2,05 ppm). Les constantes de couplages (J) sont

données en Hertz (Hz). Les abréviations suivantes sont utilisées pour décrire la multiplicité

des signaux : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), quint (quintuplet), m (massif

complexe ou multiplet).

RMN du carbone 13C

Les spectres RMN du carbone (13C) sont enregistrés dans le solvant indiqué sur un appareil

Bruker DPX-300 (à 75,5 MHz). La multiplicité des signaux du carbone est déterminée par des

expériences DEPT 135 (CH et CH3 positifs, CH2 négatifs). Les valeurs des déplacements

chimiques sont exprimées en ppm (δ) par rapport au signal résiduel du solvant utilisé comme

référence interne (CDCl3 : 77,0 ppm ; CD3OD : 49,0 ppm ; (CD3)2=O : 206,26 ppm).

Spectrométrie de Masse (MS)

Les spectres de masse basse résolution (LR-MS) sont obtenus par électrospray (ESI) et leurs

acquisitions sont effectuées sur un spectromètre Thermo Finnigan LCQ Deca XP ion trap

mass avec une source electrospray à pression atmosphérique.

4.1.3 Conditions expérimentales générales de synthèse peptidique sur

support solide

Lors des couplages peptidiques classiques et lavages de la résine, le DMF, le MeOH et

le DCM de qualité Synthèse sont utilisés sans purification préalable. Pour toute autre réaction

sur support solide, le THF et le DCM sont séchés sur colonne d’alumine et le DMF est distillé

sur CaH2. La DIEA est également distillée sur CaH2. Les autres réactifs commerciaux (agents

de couplage, acides aminés,…) sont utilisés sans purification préalable. Les synthèses

manuelles se font dans des réacteurs en verre équipés d’un fritté. Les synthèses automatiques

sont réalisées sur un synthétiseur Chemspeed ASW100, dans des réacteurs en verre à double

paroi. La température ambiante est comprise entre 20 et 25 °C. La complétion des réactions


78

est vérifiée de manière qualitative par un test au TNBS qui révèle la présence d’amines

primaires ou par un test au chloranil qui révèle la présence d’amines secondaires :

- le test au TNBS consiste à ajouter sur un aliquote de résine quelques gouttes d’une

solution à 1 % d’acide trinitrobenzènesulfonique dans le DMF puis quelques gouttes d’une

solution de DIEA à 10% dans le DMF. Une coloration rouge des billes de résine signifie la

présence d’amines primaires.

- Le test au chloranil consiste à ajouter à un aliquote de résine quelques gouttes d’une

solution à 2 % de chloranil dans le DMF puis quelques gouttes d’une solution d’acétaldéhyde

à 2 % dans le DMF. Une coloration verte des billes signifie la présence d’amine primaires ou

secondaires. Un test au TNBS permettra de confirmer l’obtention de l’amine secondaire (test

négatif).

La complétion des réactions est vérifiée de façon quantitative par clivage de quelques

milligrammes de résine et analyse du surnageant par CLHP en phase inverse. Après clivage

des peptidomimes du support, les bruts réactionnels sont analysés par CLHP et/ou CL-SM

puis purifié par CLHP semi-préparative.

4.1.4 Techniques d’analyse et de purification des peptides et

peptidomimes

Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)

Les analyses des peptides et peptidomimes ont été réalisées par CLHP en phase inverse

sur un système Thermo équipé d’une colonne Chromolith performance RP-18e (4,6 × 100

mm, 5 µm) et d’une pompe P1000 XR. La phase mobile est composée d’H2O contenant

0,1 % de TFA (v/v, phase A) et d’acétonitrile (ACN) contenant 0,1 % de TFA (v/v), si

aucune autre précision n’est indiquée. L’ACN utilisé est de qualité analytique et l’eau est

de qualité milliQ. Un gradient d’élution est appliqué et est spécifié pour chaque composé.

L’élution des composés est suivie par détecion UV à 214 et 254 nm à l’aide d’un détecteur

à barrette de diode de type Thermo UV 6000 LP. Les purifications des peptidomimes sont

réalisées sur un système CLHP semi-préparatif Varian PrepStar équipé d’une pompe SD-1

Dynamax® et d’une colonne Microsorb C18 (21,4 mm × 250 mm, taille des pores : 100 Å,

5 µm). La phase mobile est identique à celle du système analytique si aucune autre

précision n’est indiquée. Un gradient d’élution (0-40 min: 90 % à 50 % A) est appliqué à

un débit de 20 mL.min-1. L’élution des composés est suivi par détection UV à 214 et 254


79

nm, à l’aide d’un détecteur à barrettes de diode de type Varian UV-Vis Prostar 325.

Analyse par spectrométrie de masse

Les analyses LR-MS des peptides et peptidomimes sont réalisées de la même façon

que celles des molécules synthétisées en solution.

Les spectres de masse haute résolution (HR-MS) sont également obtenus par ESI et

réalisées par les laboratoires de spectroscopie de masse de l’Institut Européen de Chimie et

Biologie (IECB) et du Centre d’Etude Structurale et d’Analyse des Molécules Organiques

(CESAMO), de l’Université Bordeaux 1.

Analyse CHLP couplée à la spectrométrie de masse

Les analyses CL-SM sont conduites sur un système Surveyor CLHP équipé d’une

pompe binaire, d’un dégazeur, d’un passeur automatique d’échantillon et d’un détecteur UV

couplé à un spectromètre LCQ Advantage équipé d’un analyseur à piège ionique. Le software

Xcalibur 1.3 est utilisé comme instrument de contrôle et d’analyse des données. Les

peptidomimes sont séparés en utilisant une colonne C18 Varian Microsorb (4,6 x 250 mm,

taille des pores : 100 Å, taille des particules 5 µm). Le volume d’échantillon injecté est de 20

µL. Les phases mobiles utilisées pour toutes les analyses CLHP sont composées d’H2O

acidifiée avec 0,1 % HCOOH et d’ACN acidifié avec 0,1 % HCOOH. Les composés sont

séparés en utilisant un gradient linéaire de 100 % de A à 100 % de B pendant 18 min avec un

débit de 1 mL.min-1 et tous les chromatogrammes sont obtenus à partir d’une détection UV de

214, 230 et 254 nm. La détection par spectrométrie de masse ionisation électrospray est

réalisée en mode positif. Le spectre complet est mesuré avec une gamme de 150 à 2000 m/z.

Analyse par RMN du proton

Les peptidomimes présentant les meilleures activités biologiques sont caractérisés par

RMN 1H. Ces spectres sont enregistrés dans le solvant indiqué sur un appareil Bruker DPX-

300 ou 400. Les valeurs des déplacements chimiques sont exprimées en ppm (δ) relativement

au signal résiduel du solvant utilisé comme référence interne (DMSOd6 : δ 2,50 ppm). Les

attributions des signaux du spectre RMN 1H sont faites par corrélation avec les spectres 2

dimensions 1H-1H de type COSY (pour « COrrelation SpectroscopY ») et TOCSY (pour

« Total COrrelation SpectroscopY »).


80

4.2 Préparation des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1

4.2.1 Préparation des différents synthons en solution

N-Fmoc glycinamide de morpholine (24)

Formule brute : C21H22N2O4

Masse molaire : 366,41 g.mol-1

Aspect : Solide blanc

A une solution de N-Fmoc glycine (2 g, 6,72 mmol) dans le DMF (8 mL) est ajouté le HBTU

(2,5 g, 6,72 mmol) et la DIEA (2,3 mL, 6,72 mmol). Après quelques min sous agitation, on

ajoute la morpholine (644 µL, 7,40 mmol). La réaction est laissée sous agitation magnétique

pendant 45 min à température ambiante. On additionne alors de l’AcOEt. La phase organique

est lavée à l’eau distillée (2 x 20 mL) et avec une solution aqueuse saturée de NaCl (NaClsat.,

2 x 20 mL), séchée sur sulfate de sodium (Na2SO4), filtrée et concentrée sous vide pour

obtenir le produit attendu 24 (1,49 g, 92 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 3,40-3,43 (m, 2H, CH2), 3,62-3,74 (m, 6H, 3 x CH2), 4,04 (d, J

= 4,2 Hz, 2H, CH2), 4,24 (t, J = 7,2 Hz, 1H, CH), 4,39 (d, J = 7,2 Hz, 2H, CH2), 5,84 (s, 1H,

NH), 7,31 (t, J = 7,8 Hz, 2H, 2 x CH), 7,40 (t, J = 7,8 Hz, 2H, 2 x CH), 7,61 ( d, J = 7,2 Hz,

2H, 2 x CH), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH);

RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3) δ 166,6 (Cq), 156,2 (Cq), 143,9 (Cq), 141,2 (Cq), 127,6 (CH),

127,0 (CH), 125,1 (CH), 119,9 (CH), 67,1 (CH2), 66,6 (CH2), 66,2 (CH2), 47,0 (CH), 44,7

(CH2), 42,4 (CH2), 42,2 (CH2);

IR (sans solvant): ṽ 3290 (Ν−Η), 2958 (Csp3-H), 2921 (Csp3-H), 2861 (Csp3-H), 1714 (C=O),

1642 (C=O), 1536 (N-H), 1267 (C-N), 1120 (C-O) cm-1;

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 366,2 [M+H]+.

N-Fmoc Glycinal (25)

Formule brute : C17H15NO3


Aspect : Huile/Pâte transparente

OHN

O

H

O

NH

O

O

N

O

O


81

A une solution de 24 (989 mg, 2,70 mmol) dans le THF anhydre (50 mL), sous azote, à 0°C,

est additionnée du LiAlH4 (128 mg, 3,38 mmol). La réaction est stoppée au bout de 20 min

par addition d’une solution aqueuse d’acide chloridrique à 1M (HClaq. 1M). La solution est

reprise dans l’AcOEt et la phase organique est lavée avec une solution saturée de carbonate

de sodium (NaHCO3sat., 2 x 20 mL) et NaClsat. (1 x 20 mL), séchée sur Na2SO4 et filtrée. Le

solvant est évaporé sous vide pour obtenir un mélange des composés 24 et 25 (567 mg). Après

analyse par RMN 1H de ce brut de réaction (taux de conversion = 60 %), il a été engagé dans

la réaction d’amination réductrice sur support solide.

2-(N-aminoéthyl) aminoacétate de tert-butyle (26)



Aspect : Liquide incolore

A une solution d’éthylène diamine (35,3 mL, 528 mmol) dans du DCM anhydre (80 mL),

refroidie à 0°C, est ajoutée goutte à goutte, sur 3 h, une solution de bromoacétate de tert-

butyle (6,0 mL, 40,6 mmol) dans du DCM anhydre. La solution est laissée sous agitation à

température ambiante pendant 22 h. Le milieu réactionnel est ensuite lavé à l’eau distillée (3 x

60 mL) et le produit est extrait de cette phase aqueuse avec du DCM (3 x 40 mL). Les phases

organiques réunies sont ensuite séchées sur Na2SO4 et le solvant est évaporé sous vide pour

fournir le produit attendu 26 (4,689 g, 66 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,46 (s, 9H, 3 x CH3), 2,64-2,70 (m, 2H, CH2), 2,77-2,80 ( m,

2H, CH2), 3,29 (s, 2H, CH2) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 171,8 (Cq), 81,0 (Cq), 52,8 (CH2), 51,5 (CH2), 41,7 (CH2),

28,0 (CH3).

2-(N-(N’ -Fmoc)aminoéthyl) aminoacétate de tert-butyle (27)

Formule brute : C23H29N2O4Cl



H2N

HN

O

O

NH

HN

O

O

. HClO

O


82

A une solution de Fmoc-succinimide (Fmoc-OSu, 2 g, 5,93 mmol) dans du DCM anhydre (10

mL) est additionné goutte à goutte, sur une période de 2 h, une solution de 26 (1,033 g, 5,93

mmol). La réaction est laissée sous agitation pendant 20 h à température ambiante. Le milieu

réactionnel est ensuite lavé avec une solution d’HClaq. 1M (3 x 10 mL) puis de NaClsat. (1 x 10

mL). La phase organique est ensuite séchée sur Na2SO4, filtrée et refroidie à -20°C pendant

18 h. Le précipité obtenu est filtré, lavé au DCM froid (0°C) et séché sous vide. Le filtrat est

retraité une seconde fois de la même façon. Ainsi, le produit attendu 27 est obtenu (1,021g, 40

%) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,45 (s, 9H, 3 x CH3), 3,30 (s large, 2H, CH2), 3,75-3,77 (m,

4H, 2 x CH2), 4,20-4,24 (m, 1H, CH), 4,32-4,34 (m, 2H, CH2), 6,87 (s large, 1H, NH), 7,29 (t,

J = 7,2 Hz, 2H, 2 x CH), 7,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H, 2 x CH), 7,66 (d, J = 7,2 Hz, 2H, 2 x CH),

7,73 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH) ;

IR (sans solvant): ṽ 2964 (Csp3-H), 2927 (Csp3-H), 2856 (Csp3-H), 1734 (C=O), 1719 (C=O),

1512 (N-H), 1254 (C-N) cm-1.

2-(N-(N’ -Fmoc)aminoéthyl) (N-allyloxy) aminoacétate de tert-butyle (28)

Formule brute : C27H32 N2O6


Aspect : Huile légèrement jaune

A une solution de 27 (1g, 2,33 mmol) dans du DCM anhydre (25 mL) est additionné de la

DIEA (800 µL, 4,65 mmol) et du chloroformate d’allyle (371 µL, 3,49 mmol). La réaction est

laissée sous agitation à température ambiante pendant 2 h. La phase organique est ensuite

lavée avec une solution d’HClaq. 1M (1 x 15mL) puis avec une solution de NaClsat. (2 x 15

mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide pour fournir le produit 28

(913 mg, 82 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,47-1,49 (m, 9H, 3 x CH3), 3,36-3,44 (m, 2H, CH2), 3,48

(large s, 2H, CH2), 3,88 (d, J = 8,4 Hz, 2H, CH2), 4,17-4,24 (m, 1H, CH), 4,36 (d, J = 6,9 Hz,

2H, CH2), 4,57 (m, 2H, CH2), 5,15-5,31 (m, 2H, CH2), 5,70-5,95 (m, 2H, 2 x CH), 7,31 (t, J =

NH

NO

O

O

OO O


83

7,2 Hz, 2H, 2 x CH ), 7,40(t, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,65 (m, 2H, 2 x CH), 7,75 (d, J = 7,5

Hz, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz) δ 171,0/170,9 (Cq), 158,9 (Cq),157,9 (Cq), 145,4 (Cq), 142,7

(Cq), 133,9-134,0 (CH), 128,8 (CH), 128,2 (CH), 126,3/126,2 (CH), 121,0 (CH), 117,9/117,7

(CH2), 83,2 (Cq), 67,8 (CH2), 67,6/67,4 (CH2), 51,3-51,5 (CH), 40,3/40,1 (CH2), 28,4 (CH2).

IR (sans solvant): ṽ 2921 (C-Hsaturé), 2850 (C-Hsaturé), 1710 (C=O), 1521(N-H), 1469 (C-

O),1451 (C-O), 1240 (C-N), 1152 (C-N) cm-1.

Acide 2-(N-(N’ -Fmoc)aminoéthyl) (N-allyloxy) aminoacétique (29)




A une solution de 28 (870 mg, 1,81 mmol) dans le DCM (30 mL) est additionné du TIS (0,5

mL) et du TFA (10 mL). La solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant

4 h. Le solvant est alors évaporé sous vide, ainsi que le TFA en faisant un azéotrope avec du

chloroforme. Le résidu obtenu est dissout dans un minimum d’AcOEt (5 mL) et de l’éther de

pétrole est ajouté jusqu’à ce que la solution se trouble (25 mL). Après recristallisation à -20°C

une nuit, filtration, lavage à l’éther de pétrole et séchage sous vide, le produit attendu 29 est

obtenu (610 mg, 79 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 3,15-3,18 (m, 1H, CH2), 3,37-3,48 (m, 3H, CH2), 3,81-3,89

(m, 1H, CH2), 4,02 (s, 1H, CH2), 4,19-4,23 (m, 1H, CH), 4,35-4,37 (m, 2H, CH2), 4,56-4,58

(m, 2H, CH2), 5,15-5,30 (m, 2H, CH2), 5,81-5,89 (m, 1H, CH), 7,27-7,32 (m, 2H, 2 x CH),

7,37-7,42 (m, 2H, 2 x CH), 7,57-7,61 (m, 2H, 2 x CH), 7,74-7,77 (m, 2H, 2 x CH);

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz) δ 173,4/173,3 (Cq), 158,8 (Cq), 158,1/157,9 (Cq), 145,4 (Cq),

142,6 (Cq), 134 (CH), 128,8 (CH), 128,2 (CH), 126,3/126,2 (CH), 121,0 (CH), 117,8/117,5

(CH2), 67,8/67,6 (CH2), 67,4 (CH2), 40,2/39,9 (CH2), 39,6/39,4 (CH2), 30,8 (CH), 28,4 (CH2).

IR (sans solvant): ṽ 3371 (O-H), 2921 (Csp3-H), 2850 (Csp3-H), 1694 (intense, C=O), 1648

(C=O), 1531 (N-H), 1469 (C-O), 1451 (C-O), 1254 (C-N), 1158 (C-N) cm-1.


NH

NOH

O

O

OO O


84

Indole 3-acétate de méthyle (30)



Aspect : Huile marron

A une solution d’acide indole 3-acétique (2 g, 11,40 mmol) dans le MeOH (50 mL) est

ajoutée une solution d’HClaq. 1M (60 mL, 60 mmol). La réaction est laissée sous agitation

magnétique pendant 65 h à température ambiante. Après évaporation, le mélange organique

est repris dans l’AcOEt (20 mL), lavé avec une solution de NaHCO3sat. (2 x 20 mL) et de

NaClsat. (1 x 20 mL), séché sur Na2SO4, filtré et concentré pour obtenir une huile marron

(1,59 g, 74 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 3,71 (s, 3H, CH3), 3,79 (s, 2H, CH2), 7,17 (m, 3H, 3 CH), 7,37

(d, J = 7,9 Hz, 1H, CH), 7,62 (d, J = 7,8 Hz, 1H, CH), 8,06 (s, 1H, NH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 172,6 (Cq), 136,1 (Cq), 127,1 (Cq), 123,1 (CH), 122,1 (CH),

119,6 (CH), 118,7 (CH), 111,2 (CH), 108,1 (Cq), 51,9 (CH3), 31,1 (CH2).

N-Boc indole 3-acétate de méthyle (31)



Aspect : Solide rouge foncé

A une solution de 30 (1,5 g, 7,94 mmol) dans 60 mL de THF est ajoutée

la DMAP (96 mg, 0,79 mmol) puis le diterbutyldicarbonate (Boc2O, 2,075 g, 9,52 mmol). La

réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 3 h 30 à température ambiante. Après

évaporation du THF, le résidu organique est repris dans l’AcOEt (20 mL) et cette phase est

lavée rapidement avec une solution de HClaq. 1M (1 x 20 mL) puis de NaHCO3sat. (2 x 20 mL)

et de NaClsat. (1 x 20 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et concentrée sous vide pour obtenir le

produit 31 (2,151 g, 94 %) :

O

O

NH

CH3

O

O

N

CH3

O

O


85

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,66 (s, 9H, 3 x CH3), 3,717 (s, 3H, CH3), 3,723 (s, 2H, CH2),

7,25 (t, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 7,33 (t, J = 10,2 Hz, 1H, CH), 7,53 (d, J = 7,2 Hz, 1H, CH), 7,57

(s, 1H, CH), 8,14 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 171,4 (Cq), 149,5 (Cq), 135,3 (Cq), 130,0 (Cq), 124,4 (CH),

124,3 (CH), 122,5 (CH), 119,0 (CH), 115,2 (CH), 113,0 (Cq), 83,5 (Cq), 52,0 (CH3),

30,8(CH2), 28,1 (CH3).

Acide N-tert-Butoxycarbonyl indole 3-acétique (32)



Aspect : Solide rouge

A une solution de 31 (2,150 g, 7,40 mmol) dans 20 mL de MeOH/THF (4:1) est ajoutée une

solution d’hydroxyde de lithium (75 mL, 14,90 mmol) dans l’eau distillée. La réaction est

laissée sous agitation à température ambiante pendant 10 h. On stoppe ensuite la réaction en

ajoutant de l’acide acétique jusqu’à atteindre un pH=4. La phase aqueuse est traitée deux fois

au DCM. Les deux phases obtenues sont ensuite rassemblées, lavées avec une solution de

NaClsat. (1 x 40 mL), séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées pour obtenir le produit pur 32

(1,703 g, 84 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,66 (s, 9H, 3 x CH3), 3,73 (s, 2H, CH2), 7,25 (t, J = 7,4 Hz,

1H, CH), 7,33 (t, J = 8,1 Hz, 1H, CH), 7,53 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 7,57 (s, 1H, CH), 8,14

(d, J = 8,1 Hz, 1H, CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 176,2 (Cq), 149,0 (Cq), 135,0 (Cq), 129,4 (Cq), 124,3 (CH),

124,2 (CH), 122,3 (CH), 118,5 (CH), 114,9 (CH), 111,9 (Cq), 83,3 (Cq), 30,3 (CH2), 27,8

(CH3).

4.2.2. Procédure générale de synthèse des peptides sur support solide

Tous les peptides ont été synthétisés sur support solide, en suivant une stratégie Fmoc

et le protocole classique de synthèse peptidique sur support solide. A une solution de N-Fmoc

valine (10 équiv. selon le taux de charge de la résine) dans le DCM anhydre sous azote

O

OH

N

O

O


86

(quelque gouttes de DMF sont ajoutées pour faciliter la solubilisation) est additionnée le DIC

(5 équiv.). La réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 20 min à 0°C. En

parallèle, la résine est placée dans du DCM anhydre pendant 20 min. Après filtration, la

solution d’anhydride symétrique de N-Fmoc valine et la DMAP (0,1 équiv.) sont

additionnées. La réaction est laissée sous agitation mécanique pendant 4 h. Après filtration, la

résine est lavée successivement au DMF (x 2), au MeOH (x 2), au DCM (x 2) et à nouveau au

DMF (x 2). Le groupement protecteur Fmoc est enlevé en additionnant deux fois de suite une

solution DMF/pipéridine (4:1), pendant 3 puis 7 min. Après filtration, la résine est lavée

comme décrit précédemment. La synthèse se poursuit en additionnant successivement les

différents acides aminés ou des aminoacides non naturels tels que le N-Fmoc m-AMBA, la N-

Boc β-alanine et la N-Fmoc (β-cyclohexyl) alanine (3 équiv.) en présence de HBTU (3

équiv.) et de DIEA (5 équiv.) dans le DMF. Chaque couplage dure 45 min à l’issue desquelles

i) la résine est rincée par une série de lavages comme décrit précédemment, ii) le groupement

Fmoc enlevé comme décrit précédemment et iii) la résine est rincée une seconde fois.

L’accomplissement de chaque couplage est suivi via le test au TNBS. Après déprotection des

chaînes latérales et clivage du peptide de la résine, tous les peptides sont analysés par CLHP

pour voir leur pureté puis purifiés par CLHP semi-préparative en phase inverse.

4.2.2 Synthèse des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide


Sur une résine Wang à 0,65 mmol.g-1, les cinq premiers aminoacides, à savoir la N-

Fmoc valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine, la N-Fmoc leucine, le N-Fmoc m-AMBA et

le N-Fmoc tryptophane sont introduits de façon classique. Sur l’amine libre du tryptophane est

additionné le N-Fmoc glycinal 25 ( 2,5 équiv.) en présence de cyanoborohydrure de sodium

(NaBH3CN) (7,5 équiv.) dans une solution de DMF à 1% en acide acétique. La réaction est

laissée sous agitation 2 h. Après filtration et lavage de la résine, l’accomplissement de la

réaction d’amination réductrice est vérifié par le test au TNBS (négatif) et le test au chloranil

(positif). Après déprotection de l’amine terminale, les trois derniers aminoacides, à savoir la

N-Fmoc alanine, la N-Fmoc leucine et l’acide N-Fmoc-O-tert-butyle glutamique dans le cas

du peptide 6 ou la N-Boc β-alanine dans le cas du peptide 6.1 sont couplés sur le support de

façon classique. Après clivage du groupement Fmoc terminal (uniquement dans le cas du

peptide 6), la résine est mise en suspension dans une solution de TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5).

Après 4 h, chaque peptide est précipité à froid dans de l’Et2O, filtré puis dissout de nouveau

avec un mélange eau/ACN. Après évaporation de ce mélange, chaque résidu est solubilisé


87

dans de l’eau MilliQ, lyophilisé puis purifié par CLHP semi-préparative pour fournir les

peptides 6 et 6.1 avec des rendements respectifs de 10 et 24 %.

Peptide 6



Rendement : 10 %

CLHP : tR= 3,47 min (Colonne Chromolith. Gradient de 100 % à 50 % A en 5 min. Débit à 5

mL/min).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1007,7 [M+H]+, 504,5 [M+2H]2+.

Peptide 6.1



Rendement : 24 %

CLHP.: tR= 3,25 min (Colonne Chromolith. Gradient de 100 % à 50 % A en 5 min. Débit à 5

mL/min).


Synthèse des peptidomimes 21 et 21.1 selon la première stratégie de synthèse : Préparation

de l’espaceur en solution

Sur une résine Wang à 0,65 mmol.g-1, les quatre premiers aminoacides, à savoir la N-

Fmoc valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine, la N-Fmoc leucine et le N-Fmoc m-AMBA

sont introduits de façon classique. Puis, l’espaceur 29 synthétisé en solution est couplé sur

l’amine libre du m-AMBA. Après déprotection de l’amine terminale, les trois derniers

aminoacides, à savoir la N-Fmoc alanine, la N-Fmoc leucine et la N-Boc β-alanine dans le cas

du peptide 21 ou l’acide N-Fmoc-O-tert-butyle glutamique dans le cas du peptide 21.1 sont

couplés sur le support de façon classique. Cette résine est ensuite traitée avec du Pd(PPh3)4

H-Glu-Leu-Ala

HN

NH

HN

HN

O O

Leu-Thr-Val-OH

HN

NH

HN

HN

O O

Leu-Thr-Val-OHH-βAla-Leu-Ala


88

(0,1 équiv.) et de phénylsillane (20 équiv.) dans du DCM anhydre à température ambiante

pendant 20 min. Cette étape de déprotection du groupement Alloc est répétée une seconde

fois. L’obtention de l’amine secondaire est alors vérifiée par un test au TNBS (négatif) et un

test au chloranil (positif). Après lavage au DCM (x 2), au MeOH (x 2) puis à nouveau au

DCM (x 2), cette nouvelle amine secondaire est acétylée par l’acide indole 3-acétique (3

équiv.) en présence de HATU (3 équiv.) et de DIEA (3 équiv.). La réaction est laissée sous

agitation mécanique toute la nuit (13 h). Après filtration et lavage de la résine, le clivage et la

déprotection des chaines latérales se fait à l’aide d’une solution de TFA/H2O/TIS/EDT

(92,5:2,5:2,5:2,5). Après 4 h, chaque peptide est précipité à froid dans de l’Et2O, filtré puis

dissout de nouveau avec un mélange eau/ACN. Après évaporation de ce mélange, chaque

résidu est solubilisé dans de l’eau MilliQ, lyophilisé puis purifié par CLHP semi-préparative,

pour fournir les peptides 21 et 21.1 avec des rendements respectifs de 7 et 6 %.

Synthèse du peptidomime 21 selon la seconde stratégie de synthèse : Synthèse de l’espaceur

sur support solide

Sur une résine Wang à 0,65 mmol.g-1, les cinq premiers aminoacides, à savoir la N-

Fmoc valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine, la N-Fmoc leucine, le N-Fmoc m-AMBA et

la N-Fmoc glycine sont introduits de façon classique. Sur l’amine libre de la glycine est

additionné le N-Fmoc glycinal 25 (2,5 équiv.) en présence de NaBH3CN (7,5 équiv.) dans une

solution de DMF à 1% en acide acétique. La réaction est laissée sous agitation 2 h. Après

filtration et lavage de la résine, l’accomplissement de la réaction d’amination réductrice est

vérifié par le test au TNBS (négatif) et le test au chloranil (positif). Cette nouvelle amine

secondaire est ensuite acétylée par l’acide N-Boc indole 3-acétique 32 (3 équiv.) en présence

de HATU (3 équiv.) et de DIEA (3 équiv.). La réaction est laissée sous agitation mécanique

toute la nuit (14 h). Après lavage et déprotection de l’amine terminale, les trois derniers

aminoacides, à savoir la N-Fmoc alanine, la N-Fmoc leucine et la N-Boc β-alanine dans le cas

du peptide 21 ou l’acide N-Fmoc-O-tert-butyle glutamique dans le cas du peptide 21.1 sont

couplés sur le support de façon classique. Après filtration et lavage de la résine, le clivage et

la déprotection des chaines latérales se fait à l’aide d’une solution de TFA/H2O/TIS

(95:2,5:2,5). Après 4 h, le peptide est précipité à froid dans de l’Et2O, filtré puis dissout de

nouveau avec un mélange eau/ACN. Après évaporation de ce mélange, le résidu est solubilisé

dans de l’eau MilliQ, lyophilisé puis purifié par CLHP semi-préparative pour fournir le

peptide 21 avec un rendement de 7 %.


89

Peptide 21



Rendement : 7 %

CLHP : tR= 6,73 min. (Colonne Chromolith. Gradient de 100 % à 50 % A en 5 min. Débit à 5

mL/min).


Peptide 21.1



Rendement : 6 %


mL/min).


NH

NNH

O OO

NH

Leu-Thr-Val-OHH-βAla-Leu-Ala

NH

NNH

O OO

NH

Leu-Thr-Val-OHH-Glu-Leu-Ala


90

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Chapitre 3

Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre pour la synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide ELA

Chapitre 3 : Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre dans la synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide ELA

97

Préambule

Avant de commencer ce chapitre, il est important de rappeler qu’au moment où ce

projet a été réalisé, les structures cristallines présentées dans le chapitre précédent n’avaient

pas encore été réalisées.1 L’approche de cette nouvelle étude repose donc sur les travaux

antérieurs réalisés au sein de l’équipe par le Dr C. Douat-Casassus,2 qui ont montré que la

partie centrale d’un peptide antigénique pouvait être modifiée tout en conservant ses

propriétés antigéniques. Afin de mieux comprendre les interactions régissant la

reconnaissance des peptidomimes par les TCR, nous avons décidé d’introduire divers motifs

sur la partie centrale de peptide en utilisant la réaction de Huisgen catalysée au cuivre.

I. Les réactions de « click-chemistry » : La réaction de Huisgen catalysée au

cuivre

1.1 Les réactions de « click-chemistry»

En 2001, le groupe de Sharpless décrivit un nouveau concept de chimie organique, la

«click-chemistry»,3 qui rassemble diverses réactions chimiques quasi parfaites. L’objectif de

cette chimie est de lier rapidement et efficacement deux unités par un lien covalent. Pour cela,

la réaction chimique mise en jeu doit répondre à plusieurs critères : elle doit générer le produit

désiré avec un excellent rendement, donc sans sous-produit de réaction ou avec des sous-

produits facilement séparables sans passer par une méthode chromatographique. Ce premier

principe implique que la réaction soit régio- et stéréo-spécifique, insensible à l’oxygène et à

l’eau, et orthogonale à d’autres réactions organiques classiques. De plus, elle doit être simple

à mettre en œuvre, les réactifs devant être facilement accessibles. Enfin, elle doit être

aisément adaptable à une large gamme de substrats.

Pour répondre à ces critères, les réactions « click » nécessitent une grande force

motrice thermodynamique, souvent supérieure à 20 kcal.mol-1. Quatre familles de réactions

peuvent répondre à cette sélection :

- Les réactions de cycloadditions : en particulier, les cycloadditions 1,3-dipolaires et

les réactions de Diels-Alder.

- Les ouvertures de cycles par substitution nucléophile : en particulier, sur de petits

hétérocycles tels que les époxides, les aziridines, les sulfates et sulfamidates cycliques et les

ions aziridium ou episulfonium.


98

- Certaines réactions chimiques impliquant des carbonyles telles que les synthèses

d’éthers d’oxime, d’hydrazones et d’hétérocycles aromatiques.

- Les additions sur des liaisons carbone-carbone insaturées : d’une part, des réactions

d’oxydation telles que les epoxydations, dihydroxylations, aziridinations, l’addition

d’halogénures et de thiols, et d’autre part certaines réactions de Michael (Figure 3.1).

R2Y

XN

N XY

R1

R2

X

R1R2

XOS

OO

R1R2

R2

Nu R1

X

X

R2 Nu

R1 Nu

Nu

R2

R1

R1 R2

ou[Ox]

[Ox]R1

OH

NHR3

R2

R1

OH

OH

R2 O

R1 R2

[Ox]

R1

R1

R2 SH

R2S

R1

R2

O

R1

R3X

NH2

R2

N

R1

XR3

N

O

O

N

O

O

R1

R1

SR2

R2 SH

R2

N

O

O

R1R2

La Chimie"CLICK"

Figure 3.1. Présentation de différentes réactions incluses dans le concept de « click-chemistry ».

L’une des réactions « click » les plus populaires est la réaction de cycloaddition 3+2

alcyne/azoture catalysée au cuivre. La suite de ce chapitre sera consacrée à cette réaction.

1.2 La réaction de cycloaddition 2+3 alcyne/azoture : La réaction de

Huisgen catalysée au cuivre

La réaction de cycloaddition 2+3 alcyne/azoture a été découverte au début du XXème

siècle, mais étudiée et valorisée dans les années 1960 par Huisgen et al. Toutefois, cette

réaction nécessite un long temps de réaction et une température élevée, pour fournir deux

régioisomères : les 1,2,3-triazole 1,4- et 1,5-disubstitués, difficiles à séparer par

chromatographie (Schéma 3.1). Ce résultat a été rationnalisé par une étude de calcul de

minimisation d’énergie des deux états de transition menant à chacun des isomères.4 Les

énergies calculées sont de 25,7 et 26 kcal.mol-1, donc très proches, ce qui explique qu’il n’y

ait pas d’isomère préférentiel.


99

R1 R2N

∆

1,2,3-triazole 1,4-disubstituéNN [Cu(I)] N N

N

R1

R2

N NN

R1

R2 N NN

R1

R2

[Ru]

N NN

R1

R21,2,3-triazole 1,5-disubstitué

Schéma 3.1. Présentation des différentes versions de la réaction de Huisgen.

Afin de favoriser l’un ou l’autre des isomères, différents catalyseurs ont été développés pour

orienter la réaction (Schéma 3.1). Le triazole 1,5-disubstitué peut être obtenu sélectivement

par catalyse avec certains complexes de ruthénium,5 alors que le triazole 1,4-disubstitué est

obtenu sélectivement par catalyse au cuivre. En effet, en 2002, les groupes de Sharpless6 et

Meldal7 rapportèrent indépendamment que la réaction de Huisgen pouvait être catalysée par

des sels de cuivre (I), ne fournissant alors qu’un seul des deux isomères, à savoir l’isomère

1,2,3-triazole-1,4-disubstitué.

Le principal avantage de cette réaction est son efficacité. De plus, la synthèse de

substrat portant un groupement alcyne ou azoture est facilement accessible à partir de diverses

fonctionnalités. Ainsi, elle a été utilisée pour diverses applications à la fois en chimie

médicinale8-9 avec la préparation de librairies de molécules de petite taille bio-actives,

d’oligonucléotides,10 en chimie des matériaux11-12 avec la synthèse de dendrimères13 et de

nouveaux polymères,14 pour la synthèse ou fonctionnalisation de surface de divers nano-

objets tels que des rotaxanes,15 des nano-tubes de carbones,16 des nano-fibres,17-18 la

préparation de nouvelles électrodes,19 mais également à travers des applications

bioconjuguées20 telles que le piégeage de ligand au sein d’une protéine,21 la fonctionnalisation

de surface de cellules22 et même de dos de zebrafishs!23-24

1.2.1 Mécanisme de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre

Afin de comprendre l’implication du catalyseur dans la régiosélectivité et évidemment

dans sa capacité à accélérer cette réaction, un mécanisme réactionnel, se basant sur des études

de calculs4,25 et cinétique,26 fut proposé. Bien que la réaction de cycloaddition 3+2

alcyne/azoture par activation thermique suive un mécanisme concerté, c'est-à-dire que tous les

échanges électroniques ont lieu en même temps, il n’en est pas de même dans le cas de sa


100

version catalysée au cuivre. En effet, une première étude de calcul par modélisation

moléculaire montre qu’un mécanisme par étape permet de baisser la barrière énergétique de

11 kcal.mol-1 par rapport à celle de la réaction non-catalysée, et de 9 kcal.mol-1 par rapport à

celle d’un mécanisme concerté en présence de cuivre (I).4

[LCu]

HR1

HR1

[CuL] B B-H

[CuL]R1

I I' II

Schéma 3.2. Formation de l’acétylure de cuivre.

La première étape de ce mécanisme est l’addition du cuivre (I) sur l’alcyne pour

fournir l’acétylure correspondant II , en passant par la complexation du métal sur la triple

liaison (Schéma 3.2). Cette hypothèse est corrélée par une étude mettant en évidence la

formation d’acétylure de cuivre lorsqu’un alcyne terminal est en présence de sel de cuivre

(I).27 De plus, lorsque les conditions réactionnelles classiques de cette cycloaddition sont

appliquées à un alcyne interne, aucune évolution n’est observée. On pourrait alors supposer

que le complexe I’ plus réactif serait directement engagé dans l’étape suivante du mécanisme.

Toutefois, plusieurs résultats de l’étude computationnelle4 vont à l’encontre de cette

possibilité. D’une part, la complexation du cuivre sur la triple liaison génère une forte baisse

du pKa du proton de l’alcyne et d’autre part, la barrière énergétique calculée pour accéder à

différents intermédiaires réactionnels de la cycloaddition de ce complexe est trop élevée. Il

semble donc plus probable que l’espèce engagée dans l’étape suivante soit l’acétylure neutre

II plutôt que le complexe de cuivre I’.

La suite du mécanisme proposé dans l’étude de calcul ne met en jeu qu’un atome de

cuivre (Schéma 3.3, Voie A). Or, l’étude cinétique26 indique que deux atomes de cuivre sont

impliqués dans le mécanisme. Deux hypothèses peuvent alors être émises pour expliquer ce

second atome : soit l’azoture est activé de la même façon que l’alcyne, soit le second atome

de cuivre (I) se complexe sur l’acétylure II . Les acétylures composés de plusieurs atomes de

cuivre étant rencontrés assez fréquemment,28 la seconde proposition a été retenue. Une

nouvelle étude computationnelle a donc été réalisée pour mieux comprendre le rôle de ce

second atome de cuivre (I) (Schéma 3.3, Voie B).25 D’après la première étude,4 l’étape

limitante était la formation du cycle à six chaînons II’’’ , composé des trois azotes du

groupements azoture et des trois principaux atomes de l’acétylure de cuivre : la barrière

énergétique entre l’état de transition II’’ et l’acétylure II était de 18,7 kcal.mol-1 (17 kcal.mol-

1 dans la seconde étude25) (Schéma 3.3, Voie A). Sur l’état de transition I I’ permettant


101

d’obtenir ce cycle, le carbone C1 présente une densité électronique très faible. Un nouvel état

de transition IV , où un atome de cuivre est placé à proximité de ce carbone C1, a donc été

minimisé (Schéma 3.3, Voie B).25 Plus précisément, deux nouveaux états de transition,

différant uniquement par le ligand porté par l’atome de cuivre, à savoir un acétylure ou un

chlorure, ont été minimisés. Les deux résultats montrent la formation d’une liaison entre le

carbone C1 et l’atome de cuivre, qui mesure 1,93 Å dans le cas où le ligand est un acétylure et

1,90 Å dans le cas où le ligand est un chlorure. Cette courte distance indique une forte

interaction entre les deux atomes, et confirme l’implication d’un second atome de cuivre dans

l’étape clé du mécanisme.

CuLR1

II

N NNR2

[CuL]R1

NN N

R2

[CuL]R1

N NR2

N

[CuL]R1

[CuL]

N N NR2

NN

NR2

II'

II"

III

[CuL]R1

N NR2

N

[CuL]

NN

NR2

IV'

IV

[CuL]R1

NN NR2

[CuL]

N

CuL

NN

R1

R2

[CuL]V

N

CuL

NN

R1

R2

II'''

Voie A Voie B

C1

Schéma 3.3. Représentation des deux propositions de mécanisme de formation du cycle triazole engageant : Voie A) un atome de cuivre ; Voie B) deux atomes de cuivre.

Finalement, l’énergie de cet état de transition IV’ fut comparée à celle de l’acétylure II

afin de calculer la barrière énergétique à franchir et pouvoir la comparer à celle du mécanisme

n’impliquant qu’un atome de cuivre (calculé à 17 kcal.mol-1). Le résultat donne une valeur de

12,9 et 10,5 kcal.mol-1 correspondant respectivement au ligand acétylure ou chlorure. Enfin,

la comparaison des énergies du cycle à six chaînons clé impliquant un seul (II’’’ ) ou deux

atomes (V) de cuivre conforte l’implication du deuxième atome de cuivre puisque cette

énergie était de 11,2 kcal.mol-1 dans le premier cas mais n’est plus que de 6 kcal.mol-1

(ligand acétylure) et 3,6 kcal.mol-1 (ligand chlorure) dans le second cas.


102

Pour résumer, la cycloaddition 3+2 alcyne/azide catalysée au cuivre permet de générer

sélectivement des cycles 1,2,3-triazole 1,4-disubstitués en suivant un mécanisme par étape. En

présence de cuivre, l’alcyne I forme l’acétylure de cuivre II correspondant. Une seconde

espèce cuivrée se complexe alors sur cet acétylure pour stabiliser le carbone C1, formant

l’espèce III . Ensuite, l’azoture se lie à l’atome de cuivre (IV ) pour former une espèce

cyclique à six chaînons V. Pour finir, ce cycle se rétracte en un cycle à cinq chaînons (VI ),

avec perte d’un complexe de cuivre puis reprotonation du carbone C1 entraînant la perte du

second complexe cuivré (Schéma 3.4).

La régiosélectivité peut être expliquée à partir de ce mécanisme par étape. Dans les

différents complexes, le cuivre est électropositif ; lors de l’approche de l’azoture, l’azote le

plus électronégatif va venir se complexer sur le cuivre et ainsi, favoriser la formation d’un

seul cycle à six chaînons, puis un seul isomère 1,2,3-triazole, soit le 1,2,3-triazole-1,4-

disubstitué.

[LCu]

HR1

HR1

CuLB

B-H

[CuL]R1

I I '

II

[CuL]R1

[CuL]

III

[CuL]R1

N NR2

N

[CuL]

IV' IV

[CuL]R1

NN N

R2

[CuL]

NCuLN

N

R1

R2

[CuL]V

N NN R2

R1 [CuL]VI

N NN R2

R1

[LCu]I

[CuL]

B-H

B +

Schéma 3.4. Mécanisme de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I).

1.2.2 Effet des conditions réactionnelles

La réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) peut être mise en œuvre dans de

nombreuses conditions, selon le substrat impliqué. Toutefois, de nombreux travaux ont porté

sur l’optimisation de cette réaction en jouant sur les effets de solvants, les ligands du cuivre,

etc...


103

Effets de solvant et pH

D’un point de vue expérimental, il a été observé que cette réaction est plus rapide en

milieu aqueux. Ceci a été confirmé par les calculs de minimisation d’énergie,4 qui montrent

que la formation de l’acétylure de cuivre II est exothermique en milieu aqueux (-11,7

kcal.mol-1) alors qu’elle est légèrement endothermique dans l’acétonitrile (0,6 kcal.mol-1)

(Schéma 3.4). De plus, la complexation initiale du cuivre sur l’alcyne terminal (I’ ) diminuant

fortement son pKa (9,8 unités), il n’est pas nécessaire d’utiliser de base ; la forme déprotonée

est suffisamment présente pour que l’acétylure de cuivre II soit généré. Ainsi, cette réaction

est généralement menée dans un mélange eau-alcool afin de pouvoir solubiliser une grande

variété de substrats tout en conservant les avantages du milieu aqueux. Toutefois, il n’est pas

toujours possible, en particulier lorsque la réaction est réalisée sur support solide, d’utiliser

des conditions aqueuses. Des solvants organiques tels que le THF,29-30 le dichlorométhane31

ou l’acétonitrile,32 parfaitement compatibles avec cette réaction, sont alors choisis. Dans ce

cas, il est nécessaire d’ajouter une base au milieu réactionnel pour faciliter la formation de

l’acétylure de cuivre II . Par exemple, l’optimisation de cette réaction entre un dérivé de

galactose portant la fonction azoture et une longue chaîne carbonée sur laquelle a été

introduite la fonction alcyne par un lien amide a été réalisée (Schéma 3.5) : sans aucun base,

avec 0,1 équivalent d’iodure de cuivre dans le toluène à température ambiante, le rendement

est de 61% en sept jours, alors qu’avec 1 équivalent de DIEA, un rendement de 85% est

obtenu en 18 h.33 De plus, au cours de cette étude, il a été montré que la DIEA était une

meilleure base que la triéthylamine, puisque, dans les mêmes conditions, en présence de cette

base, le rendement chute à 65%. Enfin, un excès de base permet une conversion totale que ce

soit en solution34 ou sur support solide.7

OAcO

AcO

OAcOAc

ON3 N

H

OC14H29

CuI (0,1 équiv)

Toluène, t. a.

OAcO

AcO

OAcOAc

ON N

H

OC14H29

N N

Base (1 équiv)

Nature du catalyseur

Afin de catalyser cette réaction avec du cuivre (I), une méthode classiquement utilisée

est de générer cette espèce in situ à partir de cuivre (II) et d’un excès de réducteur (environ

Base Temps de réaction Rendement

Aucune 7 jours 61%

Et3N 18 h 65%

DIEA 18 h 85%

Schéma 3.5. Effet de la base sur la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I).


104

dix fois plus que le catalyseur). Les systèmes les plus rencontrés sont un mélange de sulfate

de cuivre pentahydrate et d’ascorbate de sodium6,35 ou d’acide ascorbique,36 en milieu

aqueux. Plusieurs groupes ont également rapporté l’utilisation d’hydrochlorure de tris(2-

carboxyethyl)phosphane (TCEP) comme réducteur dans les systèmes biologiques.37-38

L’oxydation de cuivre (0) en cuivre (I) représente une autre alternative pour les

réactions menées dans des milieux sensibles tels que les systèmes biologiques. Pour cela,

différentes combinaisons sont proposées : soit l’utilisation de cuivre métallique en quantité

catalytique et d’un excès de sulfate de cuivre,39-40 ou bien de nanoparticules de cuivre (0) en

présence de sel d’ammonium.41 Il a été noté que cette méthode, bien plus coûteuse que la

première présentée, n’est utilisée que pour des applications spécifiques.

La réduction de cuivre (II) et l’oxydation de cuivre (0) permettent de maintenir en

permanence un taux élevé d’espèces actives dans le milieu. En milieu organique, le cuivre (I)

est souvent introduit directement dans la réaction sous forme de sels tels que de l’iodure (CuI)

ou du bromure de cuivre combiné avec un excès de base.

En vue d’optimiser cette réaction, différents complexes de cuivre ont été développés.

En effet, bien que cette réaction soit connue pour ne nécessiter aucun ligand spécifique, il a

été montré que l’utilisation de certains agents de chélation pouvait diminuer la dégradation

d’espèce cuivrée (I). Ces agents sont principalement inspirés des protéines possédant des ions

cuivre.42 L’exemple le plus rencontré est le tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (Figure

3.2). Ce ligand tétradentate est supposé parfaitement envelopper le cuivre (I), ne laissant

aucun site libre pour qu’un agent déstabilisant puisse se complexer. De plus, l’amine tertiaire

portant des groupements électrodonneurs apporte une densité électronique supplémentaire au

cuivre (I). Les applications bioconjuguées étant très demandeuses d’agents de stabilisation,

des essais ont été réalisés avec le TBTA. La biotinilation de la bactérie Eschericia Coli

portant un groupement azoture a été réalisée par cycloaddition 3+2 azoture/alcyne avec un

système sulfate de cuivre (II) et ascorbate de sodium en présence de TBTA.43 Un autre essai

réalisé dans un complexe protéique fonctionnalisé par un groupement azoture a appuyé les

propriétés stabilisantes du TBTA qui,44 utilisé en présence de cuivre (II) permet de mener la

réaction à terme sans agent réducteur. Il semblerait que la faible quantité de cuivre I généré in

situ stabilisée par le TBTA soit suffisante pour que la réaction ait lieu. D’autres ligands, tels

que la famille des bis(oxazolinyl) pyridine (pybox) (Figure 3.2) furent également étudiés.31 En

particulier, un dérivé tétradentate chiral fut développé et étudié pour sa capacité à induire une

certaine énantiosélectivité à cette réaction. Leur effet catalytique a été prouvé. En revanche,

les résultats d’énantiosélectivité restent modestes.45


105

N NBnNN

BnNN

N

BnN NN

TBTA

NN

OO

N

HNNH

Dérivé pybox

Figure 3.2. Présentation des structures du TBTA et d’un dérivé pybox.

Plus récemment, de nouveaux catalyseurs portant des ligands originaux ont été décrits

pour diverses applications, que ce soit un complexe de cuivre en cage (Figure 3.3a) utilisé

pour la synthèse de dendrimères,46 ou un atome de cuivre portant des ligands carbènes dans

des réactions en solution plus classiques (Figure 3.3b).47

N

Cu NN

NC18H37

C18H37

C18H37

C18H37

C18H37 C18H37

Br N N

Cu

N N

PF6a) b)

Figure 3.3. Présentation de la structure de deux catalyseurs originaux.

Aucune méthode n’est préférentielle, les substrats et le milieu dans lequel se fait la

réaction vont déterminer le choix du catalyseur. En effet, en milieu biologique, on préfèrera

un mélange de Cu(0) et de sulfate de cuivre afin d’éviter des conditions réductrices.

1.3 Propriétés structurales des cycles 1,2,3-triazoles : Utilisation au sein de

peptides

La réaction de Huisgen catalysée au cuivre a été fortement développée, non seulement

pour ses propriétés « click », mais également pour les propriétés intrinsèques aux cycles 1,2,3-

triazoles 1,4-disubstitués. Le cycle triazole est utilisé au sein de peptide comme lien isostère

de la liaison peptidique (Figure 3.4). D’un point de vue structural, il permet un

positionnement des substituants similaire à celui induit par une liaison peptidique tout en étant

plus rigide qu’une liaison peptidique classique. Toutefois, la distance entre les deux

substituants est de 5 Å dans le cas du cycle, au lieu de 3,9 Å dans le cas de la liaison

peptidique classique. D’un point de vue électronique, le cycle triazole est accepteur de

liaisons hydrogène, mais également donneur. En effet, il possède un moment dipolaire bien

plus fort que la liaison amide, ce qui favorise la formation de liaisons hydrogène entre le


106

proton porté par le carbone C5 et un potentiel accepteur. Bien évidemment, il présente en plus

l’avantage de ne pas être hydrolysable en milieu biologique.

R1 NR2

O

H

NNN R2R1

H

Accepteur de liaison hydrogène

Accepteur de liaison hydrogène

Donneur de liaison hydrogène

Donneur de liaison hydrogène

Carbone électrophile

Carbone électrophile

Distance R1-R23,9 Å

Distance R1-R25,0 Å

1

23

45

Figure 3.4. Comparaison du cycle 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué avec la liaison peptidique.

La réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) a été mise en œuvre pour différentes

synthèses de mimes de peptides, les fonctions alcyne et azoture étant complètement

orthogonales aux fonctions engagées en chimie peptidique (Figure 3.5). Afin de générer des

peptides plus résistants en milieu biologique, l’une des possibilités est de synthétiser des

peptides cycliques. La réaction de « click-chemistry » a donc été utilisée comme moyen de

cyclisation. Les fonctions alcynes et azotures sont introduites aux deux extrémités de la

séquence peptidique afin de cycliser le peptide dans la dernière étape de synthèse.48 De plus,

étant donné les similitudes entre une liaison peptidique et un cycle 1,2,3-triazole 1,4-

disubstitués, plusieurs groupes ont introduit ce cycle dans des chaînes peptidiques linéaires

afin d’étudier leurs effets sur la structure globale du peptide.

N3

N N

N

N3N3

N N

NN N

N

N3 +

N N

N

N3 +N3N3 +

N N

NN N

N

N3

R+

NN

N

R

N3

R+

N3N3

RR+

NN

N

R

NN

N

R

Cyclisation

Insertion dans lesquelette peptidique:

Repliement

Insertion sur le squelette peptidique

Figure 3.5. Représentation de l’utilisation de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) dans la synthèse de peptidomimes.


107

Utilisés au sein de peptides, les cycles 1,2,3-triazoles 1,4-disubstitués induisent le repliement

du peptide.49 En particulier, Oh et al. montrèrent que ce motif entraînait un repliement de type

β-turn (défini dans le chapitre 4).50 De même, le groupe de Burgess inséra ce cycle dans des

peptides cycliques et mit en évidence les similitudes de structure avec un β-turn.51 Enfin, cette

réaction a été utilisée pour introduire différents motifs plus ou moins complexes sur le

squelette de peptides. Gopi et al. accrochèrent différents motifs aromatiques sur un peptide

antigénique.52 D’autres travaux rapportent l’introduction de sucres sur différents peptides.53-54

Enfin, cette réaction fut utilisée pour introduire des peptides RGD cycliques, connus pour

cibler les tissus tumoraux, à la surface d’un décapeptide cyclique pouvant être appliqué à

l’imagerie médicale ou pour la vectorisation de substances actives.55-56

II. Utilisation de la réaction de Huisgen pour la synthèse de nouveaux

peptidomimes

2.1 Présentation du projet

Comme évoqué dans le chapitre 2, les travaux menés au sein du groupe ont permis

d’identifier un mime du peptide ELA . L’affinité du peptide 21 au CMH-I humain HLA-A2

est aussi élevée que celle du peptide ciblé. De plus, les tests de stimulation de lymphocytes T

spécifiques à Melan-A par des complexes 21/HLA-A2 ont donné des résultats très

encourageants puisqu’une réponse immunitaire significative est obtenue pour quatre des sept

lignées lymphocytaires testées.

De plus, au moment où nous avons développé ce projet, nous n’avions pas encore

obtenus la structure cristalline du peptidomime 21 en complexe avec le HLA-A2. La partie

centrale du peptide antigénique interagit essentiellement avec les TCR alors que les

extrémités N- et C-terminales sont principalement orientées vers le CMH-I. Afin de mieux

comprendre les interactions ayant lieu entre le peptide antigénique et les TCR, nous

souhaitions conserver le squelette peptidique du mime 21 et introduire divers motifs sur la

partie centrale. Notre choix s’est donc porté sur la réaction de Huisgen catalysée au cuivre, du

fait de l’efficacité, la facilité de mise en œuvre et des nombreux autres avantages exposés

précédemment (Figure 3.6).

Nous avons choisi de synthétiser cette nouvelle série de peptidomimes sur support

solide, comme dans le cas du peptidomime 21. Dans le but d’introduire les divers haptènes en

partie centrale, deux voies de synthèses peuvent être envisagées :


108

- soit l’introduction de la fonction azoture sur le squelette peptidique et la synthèse de

divers alcynes en solution.

- soit l’inverse, c’est-à-dire l’introduction de la fonction alcyne sur le squelette

peptidique et la synthèse de divers azotures en solution.

Nous avons choisi de faire varier l’azoture car plusieurs protocoles menant à ce type de

composés ont été proposés dans la littérature.

NH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

OH-βAla-Leu-Ala

NN

N

R

NH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

OH-βAla-Leu-Ala

O

NH

Nouvelle génération

Peptidomime 21

Figure 3.6. Modification de la partie centrale du peptide 21 par introduction de divers motifs benzyliques introduit par « click-chemistry ».

Pour valider cette nouvelle stratégie d’incorporation de motifs haptènes sur le squelette

du peptide 21, une étude préliminaire de modélisation moléculaire a été réalisée. Au moment

où nous avons initié cette étude, aucune structure cristalline de complexe ternaire impliquant

le peptide ELA n’avait été publiée. Nous nous sommes donc appuyés sur les travaux de

Gagnon et al. décrivant deux structures cristallines de complexes ternaires A6/peptide/HLA-

A2.57 Le premier complexe contient le peptide antigénique naturel Tax de séquence

LLFGYPVYV (PDB 1AO7), sur lequel ont été basées les études de modélisation moléculaire

précédentes; le second contient un analogue du Tax, que l’on nommera Tax-5IBA, où la

tyrosine en position P5 a été substituée par une lysine sur laquelle a été couplé l’acide 4-

indolebutyrique (PDB 2GJ6). Les différences entre ces deux structures illustrent les

modifications conformationnelles que peuvent adopter les TCR (évoqué dans le premier

chapitre) afin de s’adapter à la partie centrale du peptide antigénique. Plus récemment, la

première structure d’un complexe ternaire contenant le peptide ELA , à savoir le complexe

TCR MEL-5/ELA /HLA-A2, a été publiée (PDB 3HG1).58 Comme souligné précédemment, le

gène codant pour les boucles CDR1α et CDR2α des deux TCR engagés dans chacun des

complexes ternaires est le même, ce qui laisse envisager un mode de reconnaissance similaire.


109

De plus, la glutamine 30 présente dans la boucle CDR1 de ces deux TCR interagit dans les

deux cas avec les positions P1 et P4 des peptides ELA et Tax-5IBA.

A posteriori, ces similitudes valident donc l’utilisation du complexe ternaire TCR

A6/Tax-5IBA/HLA-A2 comme modèle pour réaliser une étude de docking de différents

peptidomimes dans son site de liaison.

Figure 3.7. Résultat de modélisation moléculaire d’un peptidomime portant le motif 4-nitrobenzyle en partie centrale minimisé dans le site de liaison du complexe ternaire TCR A6/Tax-5IBA /HLA-A2.

Les résultats montrent une conservation de la conformation globale du peptide, les résidus

ancres sont orientés entre les deux hélices du HLA-A2 et la partie centrale qui se positionne

entre les boucles du TCR (Figure 3.7). Là encore, les interactions de la glutamine 30 avec la

leucine en position P2 et l’amine de la position P4 sont conservées.

2.2 Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) à la

synthèse de peptidomimes de ELA

La synthèse des différents peptidomimes a été réalisée sur support solide. Après

synthèse du squelette peptidique sur support solide, la réaction de Huisgen catalysée au cuivre

est réalisée et enfin le peptide est clivé du support puis purifié par CLHP semi-préparative. La

synthèse du squelette peptidique d’une part et la synthèse des dérivés azotures d’autre part

vont donc être présentées avant d’aborder la réaction « click » à proprement parlé.


110

2.2.1 Synthèse du squelette peptidique sur support solide

Comme dans le cas du peptidomime 21, la synthèse du squelette peptidique a été

réalisée sur un support solide de type Wang et en stratégie Fmoc. Les quatre premiers acides

aminés sont introduits sur le support comme décrit dans le chapitre 2. Puis, l’acide

bromoacétique est rapidement (5 minutes) couplé sur l’amine libre du m-AMBA afin d’éviter

toute réaction secondaire de substitution du brome. Pour introduire le groupement alcyne sur

la partie centrale du squelette, la propargylamine est accrochée sur le support par substitution

nucléophile du brome. L’amine secondaire formée est ensuite engagée dans une réaction

d’amination réductrice avec le N-Fmoc glycinal 25 en présence de NaBH3CN dans une

solution de DMF à 1% d’acide acétique. Contrairement au peptide 21, ici, aucune sur-

alkylation n’est possible ; la réaction a donc pu être réalisée avec un plus grand excès de

réactifs et plus longtemps. Enfin, les trois derniers acides aminés, c’est-à-dire la N-Fmoc

alanine, la N-Fmoc leucine et la N-Boc β-alanine sont couplés de façon classique sur le

support (Schéma 3.6). Afin de vérifier la pureté du squelette peptidique synthétisé, quelques

milligrammes de résine A furent clivés pour être analysés par CLHP. Le chromatogramme

présente un pic majoritaire, validant ainsi cette synthèse.

HO FmocNH

NH

HN

NH

OO

O

O

OO-tBu Br

O

OH

DIC, DMF, 5 min

1- DMF/Pipéridine (4:1)

2-

Leu-Thr(tBu)-ValNH

OOBr

H2N

DMSO, 60 min

NaBH3CN, DMF, 1% AcOH

Fmoc-HNO

H

NH

HN

NH

NNH

O

O O

NH

HN

NH

OO

O

O

OO-tBu

O

NH

Boc

25

Résine A

Wang

Détails:Chapitre 2

Leu-Thr(tBu)-ValNH

OOHN

Leu-Thr(tBu)-ValNH

OON

Fmoc-HN

5- Idem 16- Fmoc-Ala-OH, HBTU, DIEA, DMF

8- Fmoc-Leu-OH, HBTU, DIEA, DMF

3-

4-

7- Idem 1

10- Boc-βAla-OH, HBTU, DIEA, DMF

9- Idem 1Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

-200

0

200

400

600

800

1000

mA

U

-200

0

200

400

600

800

1000

Schéma 3.6. Synthèse sur support solide du squelette peptidique portant une liaison alcyne sur la partie centrale.


111

Cette résine A synthétisée, il fallait préparer divers dérivés azotures afin de réaliser la réaction

« click » sur support solide et générer une première série de peptidomimes.

2.2.2 Préparation des dérivés azotures à introduire en partie centrale

Une recherche bibliographique nous a permis d’identifier quatre familles de molécules

pouvant être utilisées comme précurseurs d’azotures alkylés. Ils peuvent être obtenus à partir

d’halogénures, d’alcools primaires, d’amines primaires ou d’alcènes (Schéma 3.7).59

NRN

N

BrR

NH2ROHR

R

Schéma 3.7. Représentation des précurseurs classiques pour accéder à un dérivé azoture.

Etant donné le nombre d’alcools (ou d’aldéhydes) et d’halogénures de benzyles

disponibles dans le commerce, nous nous sommes focalisés sur la transformation de ces deux

fonctions en azoture.

Synthèse de quatre dérivés azotures à partir de bromures

La synthèse d’azotures à partir d’halogénures se base sur un mécanisme de

substitution nucléophile d’ordre 2 de l’halogène par un ion azoture. La source d’azoture la

plus couramment utilisée est l’azoture de sodium (NaN3), mais d’autres réactifs tels que des

azotures de tetra-alkylammonium, l’azoture de cuivre utilisé initialement par Curtius

(hautement explosif) ou des résines sources d’azotures60 peuvent également être utilisés. De

plus, une étude sur la nucléophilicité des ions azotures dans divers solvants organiques

souligne l’intérêt de mener notre réaction dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).61

Dans le cadre de notre projet, nous avons travaillé avec quatre dérivés bromés : le

bromure de benzyle, le 2-(bromométhyl)naphtalène, le 1-(bromométhyl)-4-nitrobenzène et le

bromure de 4-(bromométhyl)pyridinium. Pour chaque réaction, nous avons préparé une

solution de NaN3 dans du DMSO à laquelle est ensuite ajouté le dérivé bromé. Dans les trois


112

premier cas, la réaction fournit en trois heures le composé attendu avec un rendement quasi

quantitatif après une simple extraction à l’éther diéthylique et lavage à l’eau (Schéma 3.8).

N3RBrR NaN3, DMSO

puis H2O

R=

NO2

35 96%34 91%33 90%

Schéma 3.8. Synthèse des trois dérivés azotures 33-35 à partir d’un dérivé bromé.

Dans le cas du bromure de 4-(bromométhyl)pyridinium, la réaction dure toute une nuit

(Schéma 3.9). En fin de réaction, le sel de pyridinium permettant de bloquer la nucléophilicité

de l’azote endo-cyclique est déplacé par addition de DIEA. Le produit souhaité est obtenu en

mélange avec le dérivé bromé initial, dans une proportion azoture/brome 10 :1. Ce mélange

est utilisé tel quel, la réaction de Huisgen étant parfaitement chimiosélective.

N

Br

HBr

NaN3, DMSO

puis DIEA

N

N3

N

Br36

(10:1)

Schéma 3.9. Synthèse du dérivé azoture 36.

Synthèse de deux dérivés azotures à partir de composés hydroxylés

Les composés hydroxylés que nous avons utilisés sont soient commerciaux, soient

issus de la réduction de l’aldéhyde correspondant. Cette réduction se fait en présence de

NaBH4 dans le méthanol et fournit, après simple traitement, le produit attendu avec un

rendement supérieur à 75 %. Dans la suite de ce paragraphe, l’étape de réduction sera

simplement évoquée le cas échéant.

La synthèse de dérivés azotures à partir d’alcool benzylique peut se faire par deux

méthodes. La première est une synthèse en deux étapes qui consiste, dans un premier temps, à

transformer le composé hydroxylé en son dérivé méthylsulfonate ou mésylate (Ms). Ce

groupement étant un bon groupe partant, il suffit ensuite de suivre le même protocole que

dans le cas des dérivés bromés pour obtenir les espèces azotures souhaitées. Seul le dérivé 4-

(azidométhyl) quinoline 39 fut généré suivant cette méthode (Schéma 3.10).


113

N

OH

N

O-Ms

Ms-Cl, Et3NEt2O, 0°C-> t. a. NaN3, DMF

N

N3

38 42% 39 21%

N

OH

NaBH4, MeOH

37 99%


La seconde réaction est une réaction de Mitsunobu adaptée à la synthèse d’azoture.

Ainsi, elle permet de passer directement de l’alcool à la fonction souhaitée dans des

conditions douces. Les conditions initialement développées nécessitent l’utilisation d’acide

azothydrique comme source d’azoture, de triphenylphosphine et de diethyl azodicarboxylate

(DEAD).62 Par la suite, le diphenyl diphosphoryl azoture (DPPA) remplaça l’acide

azothydrique explosif,63-64 et le DEAD fut substitué par sa version plus encombrée, le di-iso-

propyl azodicarboxylate (DIAD), dont la susceptibilité à former des dérivés hydrazides est

plus faible. Dans le cadre de notre étude, nous avons donc suivi les conditions suivantes : à

une solution de triphenylphosphine et de substrat hydroxylé dans le THF à 0°C furent ajoutés

goutte à goutte le DIAD puis le DPPA. Grâce à cette méthode, nous avons généré quatre

dérivés azotures, dont trois ont directement été transformés à partir du dérivé hydroxylé

commercial (Schéma 3.11).

OHR PPh3, DIAD, DPPATHF anhydre, 0°C->t.a.

N3R R=

F NO2

NO2

40 16% 41 33% 42 42%

Schéma 3.11. Synthèse des trois dérivés azotures 40-42 à partir de l’alcool benzylique commercial correspondant.

Le faible rendement du dérivé fluoré s’explique par la difficulté à séparer ce composé de la

DIAD (utilisée en excès) par chromatographie flash sur gel de silice. En effet, ces deux

produits sont très apolaires. Leur analyse par chromatographie sur couche mince présentent

donc des rapports frontaux très proches (éluant : 100% cyclohexane). Toutefois, le spectre

RMN du brut réactionnel montre que le produit initial est complètement consommé et il ne

présente pas de produit de dégradation.

Dans le cas du dérivé indole, afin d’éviter toute réaction secondaire ainsi que

l’utilisation d’éthanedithiol durant le clivage final du peptide du support, nous avons choisi de

protéger l’amine endo-cyclique (Schéma 3.12). L’indole carboxaldéhyde est donc protégé par


114

un groupement Boc. Puis, après réduction de l’aldéhyde 43, l’alcool benzylique 44 est engagé

dans la réaction de Mitsunobu pour fournir l’azoture 45 correspondant.

HN

HO

N

HO

Boc2O, DMAPTHF, 0°C->t.a. NaBH4, MeOH

Boc

43 96%

NBoc

OH

44 99%

NBoc

N3

PPh3, DIAD, DPPATHF, 0°C->t.a.

45 58%


Le groupement protecteur est conservé pour la réaction click sur support solide puis clivé en

milieu acide, lors du clivage final du peptide du support.

Cas particulier des azotures d’hydroxybenzyles

Enfin, nous souhaitions introduire deux groupements phénoliques, le 4-

hydroxybenzyle et le 3,4-dihydroxybenzyle, à la fois donneurs et accepteurs de liaisons

hydrogène, en partie centrale de notre peptide.

Deux méthodes de synthèse de l’azoture de 4-hydroxybenzyle sans protection du

phénol ont été explorées (Schéma 3.13). Nous avons tout d’abord essayé la méthode décrite

par Sampah Kumar et al.,65 où l’alcool 4-hydroxybenzyle 46 est chauffé en présence

d’éthérate de trifluoroborane et d’azoture de sodium. L’éthérate de trifluoroborane se

complexe à la fois sur le phénol ce qui permet de masquer sa nucléophilie, et sur l’alcool

benzylique, ce qui en fait un meilleur groupe partant. Toutefois, le produit attendu 47 n’a été

obtenu qu’avec un rendement très faible (6 %). Puis, nous avons essayé d’utiliser la méthode

passant par le dérivé mésylate. Sachant que l’alcool benzylique est plus nucléophile que le

phénol, nous pensions pouvoir générer le composé mono-mésylé en position benzylique. De

plus, étant donné que cette réaction est menée en milieu basique afin de générer le sulfène à

partir du chlorure de méthanesulfonyle, le phénol devient phénolate. La charge négative de ce

phénolate peut se délocaliser sur tout le cycle aromatique, masquant alors la nucléophilie de

l’oxygène. Toutefois, le suivi réactionnel par RMN 1H montre la formation du dérivé mono-

mésylé sur le phénol et du dérivé di-mésylé ; en effet, alors que le signal du CH2 benzylique

dans le dérivé di-mésylé se déplace de 1,3 ppm par rapport au composé de départ, il n’est plus

déplacé que de 0,3 ppm dans le cas du dérivé mono-mesylé, suggérant que le groupement

mésyle se trouve sur le phénol. Nous avons donc essayé de jouer sur la nature de la base et sur

la température de réaction afin de favoriser la formation du produit souhaité. Dans tous les

essais réalisés, nous obtenons au mieux un mélange de deux composés : la molécule 48’


115

portant uniquement un groupement mésyle sur le phénol et la molécule 48, ayant été modifiée

sur les deux positions. Nous avons donc engagé le mélange dans la formation du dérivé

azoture et obtenu le composé 49 avec un rendement de 32% sur les deux étapes.

OH

OH

NaBH4, THF

OH

OH

Ms-Cl, BaseEt2O, température

O-Ms

OH

O-Ms

O-Ms

NaN3, BF3.Et2O

6 %71 %

OH

N3

THF, 80°C

O-Ms

N3

32% sur deux étapes

46 47

48'4849

NaN3, DMF

Schéma 3.13. Présentation des différentes voies de synthèse explorées pour essayer d’obtenir l’azoture 4-hydroxybenzyle non-protégé.

Ce composé a ensuite été engagé dans la réaction de Huisgen sur support solide avant

de cliver le groupement mésylate. Pour cela, la résine fut mise en suspension dans de

l’acétonitrile en présence de triméthylsilanolate de potassium.66 Le peptide a finalement été

clivé du support selon les conditions classiques.

En parallèle de ces essais, nous avons synthétisé le 4-(tert-butyldiméthylsilyloxy)

benzaldéhyde 50, qui a ensuite été réduit en alcool 51 pour subir une réaction de Mitsunobu et

fournir l’azoture protégé 52 (Schéma 3.14).

OH

OH

TBDMS-Cl, imidazoleNaBH4, EtOH

DPPA, PPh3,DIAD THF, 0°C->rt

O-TBDMS

OH

75 %

O-TBDMS

OH

DMF, 0°C -> t.a.

50 82%51

O-TBDMS

N3

78%52


Après couplage de cet azoture sur le support solide, le groupement silylé est clivé avec une

solution de fluorure de tétrabutylammonium (TBAF) et d’acide acétique dans du THF sur

deux cycles de 2h et 2h30.

Dans le cas du 3,4-dihydroxybenzaldéhyde, nous avons décidé de protéger le

groupement catéchol avec un groupement acidolabile, un orthoformate, pouvant facilement

être clivé lors de la libération du peptide du support. Le produit 53 a ensuite été réduit en

Base utilisée Température Produits

0°C Et3N

-40°C

48 (majoritaire)

+ 48’

DMAP+Et3N 0°C 48’


116

alcool benzylique 54. Enfin, le dérivé azoture correspondant 55 a été généré par application

de la réaction de Mitsunobu précédemment présentée (Schéma 3.15).

OHOH

OH

OO

OH

O

OO

OH

O

NaBH4, EtOHCH(OEt)3, toluèneAmberlyst A15, reflux

OO

N3

O

DPPA, DIAD, PPh3

THF, 0°C -> t.a.

46%53 95%54 69%55


Le groupement orthoformate peut être enlevé simultanément lors du clivage du peptide du

support en milieu acide.

2.2.3 Synthèses des peptidomimes : application de la réaction de

Huisgen catalysée au cuivre (I) sur support solide

Nous disposions de onze dérivés azotures pouvant être introduits sur le squelette

peptidique supporté A. L’alcyne introduit sur la chaîne peptidique va réagir avec les différents

dérivés azotures en présence de cuivre (I) et de la base de Hünig, dans un mélange THF/DMF

(1:1), le DMF permettant un gonflement optimal de la résine (Schéma 3.16).

NH

NNH

O

NH

O

Leu-Thr(tBu)-Val

R N3

NH

NNH

O

NH

O

NN

N

Boc−βAla-Leu-Ala

1- CuI, DIEA, DMF/THF (1:1)

( 2- Déprotection) 3- TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

Leu-Thr-Val-OHH−βAla-Leu-Ala

R

R =

NO2

58 16%

N

N

F NO2

NO2

HN

OH

56 15% 57 13% 59 10%

60 7% 61 10% 62 6%

63 15% 64 9%

OH

65 8% 66 4%

56-66

OH

Résine A

Schéma 3.16. Représentation de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) sur support solide permettant l’obtention des peptidomimes 56-66.


117

En fonction des dérivés benzyliques couplés, une étape de déprotection (décrite

précédemment lors de la synthèse des azotures) peut être nécessaire avant de cliver le peptide

du support avec une solution de TFA/H2O/TIS (95 :2,5 :2,5). L’analyse des bruts réactionnels

par CLHP analytique montre des taux de conversion de l’alcyne en triazole très élevés (Figure

3.8).

Figure 3.8. Profil CLHP du brut réactionnel du peptidomime 58.

Ces peptidomimes « click » furent ensuite purifiés par CLHP semi-préparative et obtenus

avec des rendements variant de 4 à 16 %. Le faible rendement du peptide 66 est

principalement dû à un problème de séparation du peptidomime avec les produits secondaires,

sachant que la pureté du produit final doit être supérieure à 95 %.

2.3 Tests biologiques des peptidomimes issus de la « click-chemistry »

Ces travaux ont été réalisés par John J. Miles et Emily E. Edwards travaillant dans l’équipe

du professeur Andrew Sewell (Université de Cardiff, Pays de Galles) .

2.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 56-66 au

HLA-A2

Dans ce projet, nous avons synthétisé onze mimes du peptide antigénique ELA. Le

squelette des différents mimes reprend les modifications du peptidomime 21, et est décoré de

divers motifs aromatiques introduits par chimie « click » sur la partie centrale. Dans le

premier chapitre de ce manuscrit, nous avons vu que le peptide antigénique joue un rôle clé

dans la stimulation des LTC. Toutefois, une bonne reconnaissance du complexe binaire

pCMH par les TCR passe par une bonne présentation du peptide antigénique par le CMH-I.


118

La première étape de l’évaluation biologique des différents peptidomimes synthétisés consiste

donc à évaluer la capacité de chaque candidat à se lier au CMH-I. L’équipe d’Andrew Sewell

(Université de Cardiff, Pays de Galles) a développé un test permettant de déterminer cette

affinité de liaison pour le CMH-I HLA-A2.

Ce test est réalisé à partir de cellules T-lymphoblastoïdes mutées nommées cellules

T2. Ces cellules ont la capacité d’exprimer des CMH-I HLA-A2 stables en leur surface

lorsqu’elles sont mises en présence de peptides antigéniques capables de se lier au HLA-A2.67

Dans le cas où le peptide n’a pas d’affinité, le HLA-A2 n’est pas stable et la cellule n’est pas

viable. Chaque peptidomime 56-66 a été mis à incuber avec ces cellules mutées dans un

sérum approprié. De plus, le peptide ELA a été utilisé comme contrôle positif. Après 16

heures d’incubation à 26°C, puis 2 heures à 37°C, les cellules sont mises en présence de

l’anticorps BB7.2 spécifique à HLA-A2 qui fluoresce lorsqu’il se complexe au HLA-A2.68

Ainsi, la quantité de fluorescence mesurée par cytométrie de flux est directement liée à la

quantité de HLA-A2 exprimés, elle-même liée à la capacité du peptide testé à se lier au CMH-

I HLA-A2.

De façon générale, les résultats d’affinité de liaison des onze peptidomimes au CMH-I

HLA-A2 sont assez décevants (Figure 3.9). En effet, alors que les peptidomimes 1-232

présentaient une affinité de liaison au HLA-A2 proche de celle du peptide ELA , dans la

majorité des cas, cette nouvelle génération d’analogues se lie beaucoup moins bien au HLA-

A2. Les résidus d’ancrage en position P2 et P10 étant identiques, la modification de la partie

centrale par « click-chemistry » a eu un effet défavorable sur la conformation globale des

peptides. En comparaison de la première série, l’haptène triazole est beaucoup plus gros et

plus long. De plus, les données structurales du peptide 21 dans le complexe binaire peptide

21/HLA-A2 obtenues après le démarrage de ce projet montrent clairement un positionnement

différent du peptide 21 dans le site de fixation du HLA-A2 en comparaison de celui du

peptide ELA . Ces résultats structuraux peuvent expliquer a posteriori la faible affinité de

liaison observée pour ces analogues « click » du peptide 21.


119

15

4036

5259 62

22

5748

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ELA EAA 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

Peptidomimes

Affi

nité

rel

ativ

e

Figure 3.9. Résultats d’affinité de liaison des peptidomimes 56-66 au CMH-I HLA-A2 en comparaison des peptides ELA et EAA .

Enfin, on peut noter que cette affinité de liaison est corrélée avec l’hydrophobicité des

groupements aromatiques. En effet, les peptides 56, 57, 60 et de façon moins flagrante 64,

présentant respectivement un motif benzyle, naphthalène, quinoline et indole ont une affinité

de liaison au HLA-A2 très faible en comparaison des autres candidats (Figure 3.10).

NH

NNH

O

NH

O

NN

N

Leu-Thr-Val-OHH−βAla-Leu-Ala

RR =

N HN

56 15% 57 13%

60 7% 64 9%

Figure 3.10. Rappel de la structure des peptidomimes 56, 57, 60 et 64.

Les peptides 56, 57 et 60 étant inefficaces en terme de liaison au HLA-A2, ces mimes n’ont

pas été retenus pour l’étude d’évaluation de leur capacité à stimuler une lignée de cellules T

lymphocytaires spécifiques à Melan-A.

2.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 56-66 à stimuler des

lymphocytes T

L’équipe d’Andrew K. Sewell (Université de Cardiff, Pays de Galles) a évalué la

capacité de cellules T spécifiques au peptide natif EAA à reconnaître nos mimes par

cytométrie de flux au travers de la sécrétion de deux marqueurs biologiques : la cytokine

d’inflammation interféron γ et la protéine CD107a, une glycoprotéine lysosomale


120

membranaire (LAMP pour « Lysosomal-Associated Membrane Protein ») marqueur de la

dégranulation des lymphocytes T.

Pour ce faire, une lignée cellulaire de lymphocytes T spécifiques au décapeptide natif

EAA a été produite puis fractionnée en plusieurs lots similaires. Chaque lot a été mis en

présence de cellules présentatrices d’antigènes portant des HLA-A2 contenant soit le peptide

EAA comme contrôle positif, soit l’un des peptidomimes 58, 59 et 61-66. Après lavage,

chaque lot de lymphocytes T a été mis en présence d’anticorps anti-interférons γ et anti-

CD107a marqués par une sonde fluorescente afin de pouvoir être détectés par cytométrie de

flux. La quantité de fluorescence mesurée est alors directement corrélée à la quantité

d’interférons γ et de protéines CD107a produites lors de la stimulation des lymphocytes T. De

façon générale, la sécrétion d’interférons γ est plus importante que la sécrétion de protéines

CD107a.

Malheureusement, la plupart des peptidomimes testés ne sont pas reconnus par les

lymphocytes T spécifiques à Melan-A. On peut supposer que les peptidomimes ont adapté

leur conformation afin de se lier correctement au HLA-A2, ce qui a entraîné un mauvais

positionnement de l’haptène en partie centrale pour pouvoir être reconnu par les lymphocytes

T. Toutefois, deux peptidomimes, les candidats 58 et 61, portant respectivement un motif 4-

nitro et 4-fluorobenzyle ont généré une faible réponse immunitaire (Figure 3.11). L’affinité de

liaison au HLA-A2 du peptide 61 (affinité relative de 48) est proche de celle du peptide EAA

(affinité relative de 57). Par contre, le mime 58 a une affinité de liaison au HLA-A2 plus de

deux fois plus faible que les peptides 61 et EAA , alors que sa capacité à stimuler les

lymphocytes T est plus élevé que le peptide 61. De plus, il est intéressant de noter que les

deux autres mimes portant un dérivé nitro-benzyle 62 et 63 ne sont pas du tout reconnus par

les lymphocytes T. En particulier, le candidat 62 ne diffère que par un méthyle

supplémentaire en ortho du substituant nitro et possède une affinité de liaison au HLA-A2

aussi forte que le peptide natif EAA.


121

CD107a

0

500

1000

1500

EAA 58 61 62 63

Peptidomimes

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

moy

enne

IFN-γγγγ

0

100

200

300

400

EAA 58 61 62 63

Peptidomimes

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

moy

enne

Figure 3.11. Détection par cytométrie de flux de la sécrétion de la protéine CD107a et de la cytokine interféronγ par une lignée cellulaire spécifique à Melan-A/MART-1, après stimualtion par le peptide EAA (contrôle positif), et les peptidomimes 58 et 61-63.

Ces résultats suggèrent que le peptide 58 adopte une conformation lui permettant

d’être partiellement reconnu par les lymphocytes T, mais que sa faible affinité de liaison au

HLA-A2 est en partie responsable de ce manque de reconnaissance. Afin d’améliorer les

propriétés antigéniques de ce peptide, nous avons décidé de modifier les extrémités N- et C-

terminales afin de stabiliser le complexe binaire peptide 58/HLA-A2 et ainsi améliorer la

présentation du peptide 58 aux TCR.

III. Modifications des extrémités N- et C-terminales du peptidomime 58 :

synthèse de sept nouveaux analogues

3.1 Présentation des différentes modifications

Bien qu’il soit un ligand de faible affinité pour le HLA-A2, le peptidomime 58 portant

un groupement 4-nitrobenzyle sur sa partie centrale est le meilleur candidat dans cette série

pour la stimulation de lymphocytes T. Afin d’améliorer son affinité de liaison au HLA-A2,

nous avons donc décidé de modifier les résidus ancres en position P1, P2 et d’ajouter de la

flexibilité côté C-terminal pour favoriser un bon positionnement des résidus en positions P9,

P10. En effet, comme évoqué dans les deux premiers chapitres de ce manuscrit, ces positions

sont principalement impliquées dans les interactions avec le CMH-I.

Trois modifications ont été envisagées. Tout d’abord, une étude par modélisation

moléculaire a révélé que le motif phthalimide pouvait substituer la β-alanine en position P1.

Du fait de son caractère accepteur de liaisons hydrogène, il se positionne parfaitement pour

interagir avec la lysine 66 et l’acide glutamique 63, deux aminoacides positionnés sur l’hélice


122

α1 du HLA-A2 et fortement impliqués dans la complexation des peptides au HLA-A2 (Figure

3.12).

Figure 3.12. Image du motif phthalimide issue de la minimisation dans le site de fixation TCR A6/Tax-5IBA /HLA-A2 du peptidomime modifié en position N-terminale. Mise en évidence des liaisons hydrogène prédites.

Ensuite, la leucine en position P2 a été substituée par un acide aminé non-naturel, la

(β-cyclohexyl)alanine afin de pénétrer plus profondément dans la poche hydrophobe du HLA-

A2. Cet aminoacide a été inclus dans diverses séquences de peptides se liant à différents

CMH-II, ce qui a permis d’accroître leur affinité de liaison.69-70 Enfin, en nous basant sur les

travaux de Blanchard et al. qui ont travaillé sur la modification des extrémités N- et C-

terminales du peptide ELA pour accroître sa bio-résistance,71 nous avons réduit la liaison

peptidique en position P8-P9. Ce changement offre une plus grande flexibilité au peptide et

devrait permettre aux résidus ancres de mieux se positionner dans le sillon de fixation du

HLA-A2.

3.2 Synthèse de sept nouveaux analogues du peptidomime 58

Ces trois modifications ont été introduites tour à tour, puis simultanément sur le

squelette peptidique de l’analogue 58 afin d’accroître son affinité de liaison pour le HLA-A2.

3.2.1 Réduction de la liaison peptidique en position P8-P9

L’introduction d’une liaison réduite entre la leucine en position P8 et la thréonine en

position P9 apporte de la flexibilité au peptide et devrait améliorer le positionnement de la

partie C-terminale.

Pour réaliser cette modification, nous avons appliqué la réaction d’amination

réductrice entre l’amine libre de la thréonine sur support solide et le N-Fmoc leucinal 68. La

formation de cet aldéhyde 68 a été réalisée par réduction de l’amide de morpholine issue de la

N-Fmoc leucine en présence de LiAlH4.72 Ainsi, à partir de la N-Fmoc leucine, l’amide de

morpholine 67 est généré par couplage peptidique classique de la morpholine sur l’acide

carboxylique de la leucine (Schéma 3.17). Ce produit est ensuite soumis aux conditions de


123

réduction, c’est-à-dire en présence de LiAlH4 dans du THF anhydre à 0°C, pendant vingt

minutes avant d’être neutralisé.

Fmoc-HNOH

OFmoc-HN

N

O

O

Fmoc-HNH

O

HBTU, DIEA, DMF

HNO

LiAlH4, THF, 0°C

67 90% 68

Le brut est engagé dans la réaction sur

support solide

Schéma 3.17. Synthèse du N-Fmoc leucinal 68.

Le brut obtenu contenant majoritairement l’aldéhyde 68 est directement engagé dans la

réaction d’amination réductrice avec l’amine de la thréonine (Schéma 3.18).

68, NaBH3CN, DMF 1%AcOHH2N

O-tBuHN

OO

O

NH

O-tBuHN

OO

OFmoc-HN

Schéma 3.18. Réaction d’amination réductrice de l’aldéhyde 68 avec l’amine libre de la thréonine supportée.

Par cette méthode, le peptidomime 69 a été obtenu avec un rendement global de 8 % après

purification par CLHP semi-préparative (Figure 3.13).

H2N NH

OHN

ONH

ON

NH

O

NH

OHN

OH

NH

OOH

O

NN

N

O2N

Peptidomime 69

Figure 3.13. Structure du peptidomime 69.

3.2.2 Couplage de la (ββββ-cyclohexyl) alanine sur support solide

La substitution de la leucine en position P2 par la (β-cyclohexyl) alanine se fait par

simple couplage peptidique. Son insertion dans la séquence du peptide 55 a fourni le mime 70

avec un rendement de 12% (Figure 3.14).


124

H2N NH

OHN

ONH

ON

NH

O

NH

OHN

OOH

NH

OOH

O

NN

N

O2N

Peptidomime 70


3.2.3 Synthèse du motif phthalimide en position N-terminale

Enfin, nous souhaitions introduire le motif phthalimide à la place de la β-alanine en

position N-terminale. Pour cela, le squelette peptidique est synthétisé sur le support solide de

façon classique puis, la méthode de préparation du phthalimide est appliquée à l’amine

terminale libre de la leucine.

La synthèse du motif phthalimide est principalement décrite à partir de l’anhydride

phthalique et d’une amine primaire, par chauffage à plus de 100°C.73-74 Or, dans le cas de

synthèse avec des substrats chiraux et donc en synthèse peptidique, ces conditions sont trop

dures du fait du risque de racémisation. Des méthodes alternatives ont donc été développées.

Nous avons tout d’abord essayé de travailler avec le dichlorure de phthalyle, qui, en

présence de triéthylamine dans du dichlorométhane (DCM) à température ambiante est décrit

pour fournir le phthalimide correspondant avec un très bon rendement.75 Dans notre cas, après

clivage du peptide du support solide, nous n’obtenons que l’acide phthalique (Schéma 3.19,

Voie A).

Nous avons donc choisi une nouvelle méthode utilisant le phthalate de méthyle.

Plusieurs travaux ont montré que la saponification76 ou l’hydrolyse77 de l’ester méthylique

entraîne la formation du motif phthalimide attendu. Ainsi, après couplage du mono-phthalate

de méthyle sur le support solide selon les conditions classiques de couplage peptidique, le

peptide est clivé du support en milieu acide. L’analyse du brut par spectrométrie de masse

confirme l’obtention du peptide avec l’ester méthylique. Ce brut est dissous dans du

méthanol, puis mis en présence d’hydroxyde de lithium. Le motif phthalimide est alors obtenu

(Schéma 3.19, Voie B).

Enfin, une dernière méthode utilisant l’anhydride phthalique fut explorée afin de

compléter cette étude méthodologique.78 A la leucine terminale sur support solide est ajouté

l’anhydride phthalique en présence de DIEA. Après 1 heure de réaction, le surnageant est

filtré. La résine est ensuite mise en présence de HBTU, de HOBt et de DIEA dans le DMF


125

(Schéma 3.19, Voie C). Après clivage du peptide du support, l’analyse du peptide par

spectrométrie de masse confirme l’insertion du motif phthalimide en position N-terminale.

H2NO

Cl

O

Cl

OEt3N, CH2Cl2

NH

O

NO

O

O

NO

O

OO

O

OH

2- HBTU, HOBt, DIEA, DMF

O

O

O

OMe

O

OH

OHBTU, DIEA, DMF

NH

O

O

O

OMe2. MeOH, LiOH.H2O

VOIE A VOIE C

VOIE B

1. TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

1-

Schéma 3.19. Présentation des différents essais de synthèse du motif phthalimide sur support solide.

Parmi les deux dernières méthodes proposées, nous avons préféré retenir l’utilisation

d’anhydride phthalique qui permet de réaliser toute la synthèse du peptidomime sur support

solide.

Ainsi, le peptide 71 portant cette modification structurale a été obtenu après une

double purification par CLHP semi-préparative avec un rendement de 3% (Figure 3.15).

N

HN

O

NH

ON

NH

O

NH

OHN

OOH

NH

OOH

O

NN

N

O2N

O

O

Peptidomime 71


Ce faible rendement s’explique par l’obtention de deux principaux produits

secondaires dont un qui a un temps de rétention très proche du peptidomime 71 (d’où la

nécessité d’une double purification par CLHP semi-préparative) (Figure 3.16). L’analyse par

spectrométrie de masse de ce produit secondaire présente un excès de 85 Da par rapport au


126

peptide attendu. Après réflexion, il apparaît que le produit secondaire obtenu correspond à un

adduit de pipéridine résiduelle sur la fonction acide.

Figure 3.16. Brut réactionnel du peptide71.

3.2.4 Combinaison des différentes modifications : Génération des

quatre analogues supplémentaires

L’application de ces trois modifications sur le squelette du peptidomime 58 a fourni

trois nouveaux analogues 69, 70 et 71. L’évaluation des propriétés antigèniques de ces trois

analogues va permettre de comparer les effets de chaque modification. Toutefois, afin de

compléter cette étude et d’obtenir une molécule ayant un faible caractère peptidique, ces

modifications ont été combinées deux à deux, puis toutes les trois pour fournir les

peptidomimes 72-75 avec des rendements respectifs de 13, 10, 6 et 5 % (Figure 3.17).

Peptide 71

Produit secondaire [M+H]+= 1180


127

H2N NH

OHN

ONH

ON

NH

O

NH

OHN

OH

NH

OOH

O

NN

N

O2N

Peptidomime 72

Peptidomime 73

Peptidomime 74

NH

HN

OH

NH

OOH

O

N

HN

O

OO

O

NH

HN

OH

NH

OOH

OO

N

HN

O

OO

O

N

HN

O

OO

O

NH

HN

OH

NH

OOH

O

Peptidomime 75

Figure 3.17. Structure des peptidomimes 72-75.

3.3 Tests biologiques des sept nouveaux analogues du peptide 58


du professeur Andrew Sewell.

Afin de déterminer l’effet de chaque modification sur l’activité du peptide, la capacité

de chaque peptidomime 69-75 à se lier au CMH HLA-A2 puis à stimuler les lymphocytes T a

été évaluée.

3.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 69-75

Les expériences d’affinité de liaison de chaque peptidomime au HLA-A2 ont été

menées de la même façon que précédemment. L’affinité de chacun d’eux, relative au peptide

ELA a ensuite été calculée (Figure 3.18).


128

0

25

50

75

100

ELA EAA 58 69 70 71 72 73 74 75

Peptidomimes

Affi

nité

rel

ativ

e

Figure 3.18. Résultats d’affinité de liaison des peptidomimes 69-75 au CMH-I HLA-A2 en comparaison des peptides ELA et EAA , et du peptidomime 58.

Les modifications insérées en position P1, P2 et P8-P9 du peptide 58 ont permis de

multiplier par plus de deux sa capacité à se lier au HLA-A2. Ainsi, l’introduction d’une seule

modification, en particulier du motif phthalimide en position P1 pour le mime 71 ou de la (β-

cylohexyl) alanine pour le 70, suffit pour accroître significativement l’affinité de liaison et

être aussi affin que le peptide natif EAA ; seul le peptidomime 69 possédant une liaison

réduite en P8-P9 est un peu moins bon ligand. Par contre, en combinaison avec l’une

(analogue 72 et 73) ou les deux autres modifications (analogue 75), cette liaison réduite est

très bien tolérée. D’autre part, on peut noter que la combinaison de plusieurs modifications

n’augmente pas l’affinité de liaison sans pour autant la diminuer.

Ces résultats soulignent l’importance de l’extrémité C-terminale dans l’affinité de

liaison d’un peptide au HLA-A2. De plus, à l’époque où ces synthèses ont été réalisées, les

données cristallographiques du complexe binaire peptidomime 21/HLA-A2 présentées dans le

chapitre 2 n’avaient pas encore été obtenues. Dans cette structure, la β-alanine en position N-

terminale ne s’oriente pas du tout comme l’acide glutamique dans le peptide tête de série

ELA et génère la perte des trois interactions clés rencontrées dans la plupart des complexes

binaires peptide/HLA-A2, à savoir la liaison hydrogène entre l’amine terminale du peptide

avec la tyrosine 171, et les liaisons hydrogène entre la liaison peptidique en P2-P3 et l’acide

glutamique 63 et la lysine 66. L’introduction du phthalimide dans le cas des peptides 71, 73,

74 et 75 semble restaurer en partie les interactions avec la lysine 66 et l’acide glutamique 63.

Dans le cas de la (β-cyclohexyl) alanine en position P2 combinée à la β-alanine en position

P1, l’ancrage du cyclohexyle dans la poche hydrophobe P2 force peut-être l’amine terminale

de la β-alanine à se repositionner comme dans le cas du peptide ELA , et ainsi restaurer toutes

les interactions. Pour confirmer ces hypothèses, une étude cristallographique serait nécessaire.


129

3.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 69-75 à stimuler des lymphocytes T

Les sept peptidomimes 69-75 ont ensuite été testés pour leur capacité à stimuler les

lymphocytes T. La méthode décrite précédemment, à savoir le suivi de la reconnaissance des

différents complexes binaires par les TCR par mesure de la quantité de protéines CD107a et

de cytokines INF-γ sécrétées, a été appliquée.

CD107a

0

250

500

750

1000

1250

1500

EAA 58 69

Peptidomimes

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

moy

enne

IFN-γγγγ

0

100

200

300

400

EAA 58 69

Peptidomimes

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

moy

enne

Figure 3.19. Détection par cytométrie de flux de la sécrétion de la protéine CD107a et de la cytokine interféron γ par une lignée cellulaire spécifique à Melan-A/MART-1 après stimualtion par le peptide EAA (contrôle positif) et les peptidomimes 58 et 69.

Parmi les sept peptides testés, seul le mime 69 ressort de ces essais (Figure 3.19). Il

génère la sécrétion de deux fois plus de protéines CD107a que le peptide 58 et quasiment une

fois et demi plus d’interférons γ. Il est assez surprenant d’observer à nouveau que dans cette

série de peptidomimes 69-75, le peptide le moins affin au HLA-A2, à savoir le peptidomime

69, engendre la meilleure réponse immunitaire. Une explication de ce résultat repose peut-être

sur la flexibilité du peptide 69. En effet, sa différence par rapport au peptide 58 est la

réduction de la liaison peptidique en position P8-P9, ce qui implique une plus grande liberté

conformationnelle et donc une meilleure adaptabilité du système à l’approche des récepteurs

des lymphocytes T.


130

Conclusion

La « click-chemistry » est un concept novateur qui englobe des réactions quasi

parfaites. Leurs applications dans la littérature sont donc nombreuses. La réaction de Huisgen

catalysée au cuivre (I) est l’un des exemples les plus développés. Suite aux premiers résultats

obtenus dans le groupe, le peptidomime 21 a été utilisé comme tête de série pour réaliser de

nouvelles modifications. Nous avons choisi d’utiliser la réaction de Huisgen catalysée au

cuivre (I) pour introduire rapidement et efficacement différents groupements benzyliques en

partie centrale.

Onze nouveaux peptidomimes ont été synthétisés puis testés pour leurs propriétés

antigèniques. Les résultats de leur affinité de liaison au HLA-A2 sont décevants mais les tests

de stimulations d’une lignée de lymphocytes T spécifiques à Melan-A permettent de faire

ressortir un peptidomime intéressant. En effet, la sécrétion d’interféron γ et celle de protéines

CD107a sont décelées dans le cas du peptide 58, alors que son affinité de liaison au HLA-A2

est l’une des plus faibles. Ce peptide porte un groupement 4-nitrobenzyle en partie centrale

qui a été introduit par « click-chemistry ». Afin d’accroître son interaction avec le HLA-A2, la

deuxième partie de ce projet a consisté à modifier les parties N- et C-terminales du mime 58

afin de restaurer une affinité de liaison au HLA-A2 convenable. Trois modifications,

introduites tour à tour puis en combinaison, ont conduit à sept nouveaux peptidomimes. Leur

affinité de liaison au HLA-A2 est bien plus élevée que celle du peptidomime 58. En revanche,

un seul de ces sept nouveaux analogues s’est avéré être capable de stimuler une lignée

cellulaire spécifique à Melan-A. Le peptide 69, portant une liaison réduite en position P8-P9

se lie correctement au HLA-A2 et stimule partiellement la lignée de lymphocytes T (mieux

que le peptide 58).


131


4.1 Synthèses des azotures en solution

Azoture de benzyle (33)

Formule brute : C7H7N3


Aspect : Huile jaune

A une solution de NaN3 (81 mg, 1,25 mmol) dans le DMSO (700 µL) sous agitation depuis 15

min est additionné le bromure de benzyle (142 mg, 0,83 mmol). Après 5 h sous agitation à

température ambiante, la réaction est stoppée par addition d’eau distillée (5 mL). Lorsque le

mélange est revenu à température ambiante, le produit est extrait avec de l’Et2O (15 mL) et

cette phase organique est lavée à l’eau distillée (1 x 20 mL) puis avec une solution de NaClsat.

(1 x 20 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide. On obtient alors le

composé 33 (95 mg, 86 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,41 (s, 2H, CH2), 7,08-7,23 (m, 5H, 5 x CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 132, (Cq), 127,9 (CH), 127,3 (CH), 126,3 (CH), 55,4 (CH2).

2-(azoturométhyl)naphthalene (34)




A une solution de NaN3 (44 mg, 0,68 mmol) dans le DMSO (680 µL) sous agitation depuis 15

min est additionné le 2-bromométhylnaphtalène (100 mg, 0,45 mmol). Au bout de 5 h sous

agitation à température ambiante, la réaction est stoppée par addition d’eau distillée (5 mL).

Lorsque le mélange est revenu à température ambiante, le produit est extrait avec de l’Et2O

(15 mL) et cette phase organique est lavée à l’eau distillée (1 x 20 mL) puis avec une solution

de NaClsat. (1 x 20 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide. On

obtient alors le composé 34 (82 mg, 91 %) :

N3

N3


132

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,51 (s, 2H, CH2), 7,42-7,53 (m, 3H, 3 x CH), 7,78-7,89 (m,

4H, 4 x CH) ;


127,7 (CH), 127,2 (CH), 126,5 (CH), 126,3 (CH), 125,8 (CH), 55,2 (CH2) ;

IR (sans solvant): ṽ 3060 (Csp2-H), 2927 (Csp3-H), 2099 (N=N=N), 1369 (C=C), 1332 (C=C)

cm-1.

Azoture de 4-nitrobenzyle (35)

Formule brute : C7H6O2N4



A une solution de NaN3 (90 mg, 1,39 mmol) dans le DMSO (1,39 mL) sous agitation depuis

15 min est additionné le 1-bromométhyl-4-nitro benzène (200 mg, 0,93 mmol). Après 3 h

sous agitation à température ambiante, la réaction est stoppée par addition d’eau distillée (5

mL). Lorsque le mélange est revenu à température ambiante, le produit est extrait à l’Et2O (15

mL) et cette phase organique est lavée à l’eau distillée (1 x 20 mL) puis avec une solution de

NaClsat. (1 x 20 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide. On obtient

alors le produit attendu 35 (158 mg, 96 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,52 (s, 2H, CH2), 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH), 8,21 (d, J

= 8,7 Hz, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 147,8 (Cq), 142,7 (Cq), 128,6 (CH), 124,1 (CH) 53,8 (CH2) ;

IR (sans solvant): ṽ 2922 (Csp3-H), 2099 (N=N=N), 1519 (N=O), 1343 (N=O), 737 (C-H)

cm-1.

NO2

N3


133

4-(Azoturométhyl) pyridine (36)




A une solution de NaN3 (116 mg, 1,78 mmol) dans le DMSO (3 mL) sous agitation depuis 15

min est additionné le bromure de 4-bromométhyl pyridinium (300 mg, 1,19 mmol). La

réaction est laissée sous agitation toute la nuit. On additionne ensuite de la DIEA (204 µL,

1,19 mmol) ce qui engendre une coloration noire. De l’eau distillée (30 mL) est ensuite

ajoutée au milieu réactionnel et le produit est extrait à l’Et2O (2 x 15 mL). Les phases

organiques sont ensuite lavées avec une solution de NaClsat. (2 x 20 mL) pour fournir notre

produit dans un mélange de 36/4-bromométhyl pyridine (15 :1) qui a été directement engagé

sur le support solide :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,43 (s, 2H, CH2), 7,28 (d, J = 4,5 Hz, 2H, 2 x CH), 8,63 (d, J

= 4,5 Hz, 2H, 2 x CH).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 150,5 (CH), 147,9 (Cq), 124,3 (CH), 54,0 (CH2) ;

IR (sans solvant): ṽ 2959 (Csp3-H), 2106 (N=N=N) cm-1.

4-(Méthylhydroxy) quinoline (37)

Formule brute : C10H9NO


Aspect : Solide Orange. Point fusion : 121-122 °C

A une solution de 4-quinolinecarboxaldéhyde (500 mg, 3,18 mmol) dans le MeOH (20 mL),

sous argon, est additionnée du tetrahydroborate de sodium (NaBH4) (150 mg, 3,98 mmol). La

réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 30 min. Après concentration du milieu

N

N3

N

OH


134

par évaporation sous vide, cette phase organique est reprise avec une solution aqueuse saturée

de chlorure d’ammonium (NH4Clsat.) puis l’alcool est extrait par ajout de DCM (3 x 30mL).

La phase organique est séchée sur Na2SO4 et filtrée. Le solvant est évaporé sous vide pour

obtenir le composé 37 (502 mg, 99 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 5,26 (s, 2H, CH2), 7,58-7,63 (m, 2H, 2 x CH), 7,75 (dt, J =

7,5-7,8 Hz, 1H, CH), 7,98 (d, J = 8,7 Hz, 1H, CH), 8,19 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH), 8,90 (d, J =

4,5 Hz, 1H, CH).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 149,8 (CH), 147,6 (Cq), 146,9 (Cq), 129,3 (CH), 129,0 (CH),

126,6 (CH), 125,7 (Cq), 122,8 (CH), 117,9 (CH), 60,7 (CH2).

IR (sans solvant): ṽ 3192 (broad, O-H), 2927 (Csp3-H) cm-1.

4-(Méthylsolfonateméthyl) quinoline (38)

Formule brute : C11H11O3NS


Aspect : Solide jaune

A une solution d’alcool 37 (200 mg, 1,25 mmol) dans l’Et2O (4 mL) sous atmosphère inerte

est ajouté la triéthylamine (262 µL, 1,88 mmol). Après abaissement de la température à 0°C,

une solution de chlorure de mesyle (145 µL, 1,88 mmol) dans l’Et2O (2 mL) est ajoutée

goutte à goutte. Après 2 h de réaction, de l’eau distillée est ajoutée au milieu réactionnel (5

mL). La phase organique est lavée une seconde fois à l’eau distillée (5 mL), séchée sur

Na2SO4 et le solvant est évaporé sous vide. On obtient alors le produit 38 (124 mg, 42 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 3,03 (s, 3H, CH3), 5,73 (s, 2H, CH2), 7,53 (d, J = 3,9 Hz, 1H,

CH), 7,67 (t, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 7,80 (t, J = 7,2 Hz, 1H, CH) 8,01 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH),

8,21 (d, J = 8,4 Hz, 1H, CH), 8,97 (d, J = 4,5 Hz, 1H, CH);

IR (sans solvant): ṽ 3214 (broad), 2896 (Csp3-H), 2843 (Csp3-H), 1075 (S=O), 754, 670 (C-S)

cm-1.

N

OS

O

O


135

4-(Azoturométhyl) quinoline (39)




A une solution de 38 (124 mg, 0,52 mmol) dans du DMF anhydre (3 mL) est ajouté le NaN3

(85 mg, 1,31 mmol). La réaction est laissée sous agitation toute la nuit. De l’eau distillée est

ajoutée au milieu réactionnel (10 mL) puis le produit organique est extrait à l’Et2O (2 x 15

mL). Cette phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide.

Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un

mélange d’AcOEt/cyclohexane (1:1) pour obtenir le produit 39 (20 mg, 21 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,83 (s, 2H, CH2), 7,42 (d, J = 4,2 Hz, 1H, CH), 7,62 (t, J = 8,1

Hz, 1H, CH), 7,76 (t, J = 6,9 Hz, 1H, CH), 7,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH), 8,17 (d, J = 8,4 Hz,

1H, CH), 8,92 (d, J = 4,2 Hz, 1H, CH).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 150,2 (CH), 148,3 (Cq), 140,5 (Cq), 130,6 (CH), 129,7 (CH),

127,2 (CH), 126,0 (Cq), 122,9 (CH), 120,3 (CH), 51,5 (CH2).

IR (sans solvant): ṽ 3060 (Csp2-H), 2927 (Csp3-H), 2099 (N=N=N), 818 (Csp2-H), 752 (Csp2-

H) cm-1.

Azoture de 4-fluorobenzyle (40) :

Formule brute : C7H6N3F



A une solution d’alcool 4-fluorobenzylique (128 µL, 0,99 mmol) dans du THF anhydre (5

mL) est additionnée la PPh3 (417 mg, 1,59 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis sont

N

N3

F

N3


136

additionnés le DIAD (308 µL, 1,59 mmol) puis le DPPA (342 µL, 1,59 mmol) goutte à

goutte. La réaction est laissée sous agitation pendant 24 h à température ambiante. Après

évaporation du solvant sous vide, le résidu organique est repris dans l’Et2O (20 ml), lavé à

l’eau distillée (1 x 30 ml) et avec une solution de NaClsat. (1 x 30 ml), puis séché sur Na2SO4,

filtré et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié par

chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un mélange AcOEt/cyclohexane

(0:1 puis 5:95) pour obtenir le produit 40 (27 mg, 18 %) :

1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4,32 (s, 2H, CH2), 7,05-7,11 (m, 2H, 2 × CH), 7,27-7,32 (m,

2H, 2 × CH).

13C NMR (75,5 MHz, CDCl3) δ 164,3 (Cq), 161,0 (Cq), 130,0 (CH), 129,9 (CH), 115,9 (CH),

115,6 (CH), 54,0 (CH2);

IR (sans solvant): ṽ 2955 (Csp3-H), 2361 (C-N+), 2039 (N=N), 1510 (C=C), 1461 (C-F) cm-1.

Azoture 3-méthyl-4-nitrobenzyle (41):




A une solution d’alcool 3-méthyl-4-nitrobenzyle (305 mg, 1,80 mmol) dans du THF anhydre

(10 mL) est additionnée la PPh3 (755 mg, 2,87 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis

sont additionnés le DIAD (560 µL, 2,87 mmol) puis le DPPA (312 µL, 2,87 mmol) goutte à


évaporation du solvant sous vide, le mélange organique est repris dans l’Et2O (20 mL), lavé à

l’eau distillée (1 x 30 mL) et avec une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séché sur

Na2SO4, filtré et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié par


(0:1 puis 2:98) pour obtenir le produit attendu 41 (115 mg, 33 %):

1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2,63 (s, 3H, CH3), 4,42 (s, 2H, CH2), 7,28-7,30 (m, 2H, 2 ×

CH), 7,98-8,01 ppm (m, 1H, CH).

NO2

CH3

N3


137

Azoture de 2-nitrobenzyle (42)




A une solution d’alcool de 2-nitrobenzyle (150 mg, 0,98 mmol) dans du THF anhydre (8 mL)

est additionnée la PPh3 (462 mg, 1,76 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis sont

additionnés le DIAD (304 µL, 1,57 mmol) puis le DPPA (338 µL, 1,57 mmol) goutte à


évaporation du solvant sous vide, le mélange organique est repris dans l’Et2O (20 mL), lavé à

l’eau distillée (1 x 30 mL) et avec une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séché sur

Na2SO4, filtré et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié par


(0:1 puis 5:95) pour obtenir le produit attendu 42 (74 mg, 42 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,85 (s, 2H, CH2), 7,49-7,54 (m, 1H, CH), 7,67-7,72 (m, 2H, 2

x CH), 8,12 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 147,7 (Cq), 134,0 (CH), 131,6 (Cq), 130,1 (CH), 129,0 (CH),

125,3 (CH), 52,0 (CH2).

IR (sans solvant): ṽ 3501 (C-N), 2982 (Csp3-H), 2361 (C-N+), 2105 (N=N) cm-1.

N-Boc indole 3-carboxaldéhyde (43)

Formule brute : C14H15O3N


Aspect : Solide blanc; Point de fusion : 127-128°C

A une solution d’indole 3-carboxaldéhyde (1 g, 6,89 mmol) dans le THF anhydre (25 mL) à

0°C, sous argon, est additionnée une solution de Boc2O (1,81 g, 8,30 mmol) dans 5 mL de

N

O

OO

H

N3

NO2


138

THF anhydre puis la DMAP (16 mg, 0,13 mmol). La réaction est laissée sous agitation

magnétique pendant 4 h. Après concentration du milieu par évaporation, le résidu organique

est repris avec de l’AcOEt. La phase organique est alors lavée avec une solution d’HClaq. 1M

(2 x 30 mL) et une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est

évaporé sous vide pour obtenir le composé 43 (1,62 g, 96 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,71 (s, 9H, 3 x CH3), 4,85 (s, 2H, CH2), 7,40 (quintd, J1 = 7,5

Hz, J2 = 1,8 Hz, 2H, 2 x CH), 8,15 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 8,24 (s, 1H, CH), 8,29 (d, J = 7,5

Hz, 1H, CH), 10,11 (s, 1H, CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 185,7 (CH), 148,8 (Cq), 136,4 (CH), 136,0 (Cq) 126,2 (Cq),

126,1 (CH), 124,6 (CH), 122,2 (CH), 121,6 (Cq), 115,2 (CH), 85,6 (Cq), 28,1 (3 x CH3).

N-Boc 3-(hydroxyméthyl) indole (44)



Aspect : Solide roux/brun; Point de fusion : 63-64°C

A une solution de 43 (1 g, 4,08 mmol) dans du MeOH (100 mL), sous argon, est additionné

du NaBH4 (193 mg, 5,10 mmol). La réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 1

h 30. Après concentration du milieu par évaporation, cette phase organique est reprise avec

une solution saturée de NH4Clsat., puis l’alcool est extrait par ajout de DCM (3 x 30 mL). La

phase organique est séchée sur Na2SO4 et filtrée. Le solvant est évaporé sous vide pour

obtenir le composé attendu 44 (1 g, 99 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,67 (s, 9H, 3 x CH3), 4,85 (s, 2H, CH2), 7,24-7,27 (m, 1H,

CH), 7,34 (td, J1 = 7,2, J2 = 8,1 Hz, 1H, CH), 7,59 (s, 1H, CH), 7,65 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH),

8,16 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH);


122,3 (CH), 120,4 (Cq), 119,2 (CH), 114,9 (CH), 83,4 (Cq), 56,4 (CH2), 27,8 (CH3).

IR (ZnSe): ṽ 3374 (O-H), 3053 (Csp2-H), 2979(Csp3-H), 1700 (C=O), 1454 (C-O) cm-1.

N

OH

OO


139

N-Boc 3-(Azoturométhyl) indole (45)




A une solution de 44 (505 mg, 2,04 mmol) dans du THF anhydre (15 mL) est additionnée de

la PPh3 (778 mg, 2,97 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis sont additionnés le DIAD

(577 µL, 2,97 mmol) puis le DPPA (639 µL, 2,97 mmol) goutte à goutte. La réaction est

laissée sous agitation pendant 24 h à température ambiante. Après évaporation du solvant sous

vide, le mélange organique est repris dans l’Et2O, lavé à l’eau distillée (1 x 30 mL) et avec

une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séché sur Na2SO4, filtré et le solvant est évaporé

sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié par chromatographie flash sur gel de silice

avec comme éluant un mélange AcOEt/cyclohexane (0:1 puis 5:95) pour obtenir le produit

attendu 45 (322 mg, 58 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,67 (s, 9H, 3 x 3H), 4,47 (s, 2H, CH2), 7,26-7,39 (m, 2H, 2 x

CH), 7,59-7,62 (m, 2H, 2 x CH), 8,16 (d, J = 8,1 Hz, 1H, CH);


122,9 (CH), 119,0 (CH), 115,4 (CH), 114,8 (Cq), 84,1 (Cq), 46,1 (CH2), 28,2 (CH3).

IR (sans solvant): ṽ 2927 (Csp3-H), 2101 (N=N), 1736 (C=O), 1454 (C-O) cm-1.

Alcool 4-hydroxybenzylique (46)

Formule brute : C7H8O2


Aspect : Solide crème

A une solution de 4-hydroxybenzaldéhyde (200 mg, 1,64 mmol) dans du THF anhydre (4 mL)

est ajouté du NaBH4 (124 mg, 3,28 mmol). Après quelques minutes d’agitation, le milieu

N

N3

OO

OH

OH


140

réaction est plongé dans un bain à ultra-sons pendant 20 min. De l’eau distillée (4 mL) est

ensuite ajoutée au milieu réactionnel qui est laissé sous agitation pendant 5 min. Afin de

complètement neutraliser cette solution, une solution d’HClaq. 1M (6 mL) est ajouté et le

milieu est laissé sous agitation 5 min. Le produit est ensuite extrait au DCM (3 x 10 mL). Les

phases organiques sont séchées sur Na2SO4, filtrées et le solvant est évaporé sous vide pour

fournir le produit attendu 46 (144 mg, 71 %) :

RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) δ 4,48 (s, 2H, CH2), 6,76 (d, J = 8,7 Hz, 2H, 2 x CH), 7,17 (d,

J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH);

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz) δ 157,8 (Cq), 133,5 (Cq), 129,9 (CH), 116,1 (CH), 65,1 (CH2).

Azoture de 4-mésyloxybenzyle (49)

Formule brute : C8H9O3N3S


Aspect: Huile brune

A une solution d’alcool 4-hydroxybenzylique (300 mg, 2,42 mmol) dans du THF anhydre (10

mL) est ajouté de la triéthylamine (842 µL, 6,04 mmol). Après refroidissement à 0°C, du

chlorure de mesyle (411 µL, 5,32 mmol) est ajouté goutte-à-goutte au milieu réactionnel. La

réaction est ensuite laissée sous agitation à température ambiante toute la nuit. De l’eau

distillée (30 mL) est alors additionnée puis le produit est extrait au DCM (3 x 40 mL). Les

phases organiques sont ensuite rassemblées, lavées avec une solution de NaClsat., séchées sur

Na2SO4, filtrées et le solvant est évaporé sous vide pour fournir un mélange de deux produits

correspondants aux dérivés mono- et di-mésylé. Le brut réactionnel, contenant le mésyle 4-

mésyloxybenzylique 48 et l’alcool 4-mésyloxybenzylique 48’, est dissout dans du DMF

anhydre (4 mL), puis du NaN3 (393 mg, 6,04 mmol) est ajouté. La réaction est laissée sous

agitation pendant 3 h à température ambiante. De l’eau distillée (20 mL) est alors ajoutée au

milieu réactionnel puis le produit est extrait à l’Et2O (3 x 10 mL). Les phases organiques sont

rassemblées et lavées à l’eau distillée (4 x 60 mL), séchées sur Na2SO4, filtrées et le solvant

est évaporé sous vide pour fournir le produit 49 (174 mg, 32 %) :

O

N3

SO

O


141

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 3,16 (s, 3H, CH3), 4,38 (s, 2H, CH2), 7,31 (d, J = 8,7 Hz, 2H,

2 x CH), 7,38 (d, J = 8,7 Hz, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 148,8 (Cq), 134,8 (Cq), 129,6 (CH), 122,3 (CH), 53,7 (CH2),

37,3 (CH3).

4-(tert-butyldiméthylsilyloxy) benzaldéhyde (50)

Formule brute : C13H20O2Si


Aspect : Liquide jaune

A une solution de 4-hydroxybenzaldéhyde (500 mg, 4,09 mmol) dans du DMF (3 mL) est

additionné l’imidazole (279 mg, 6,14 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis est

additionné le chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (741 mg, 4,91 mmol). Après 16 h

d’agitation à température ambiante est additionné de l’Et2O (40 mL). Cette phase organique

est lavée à l’eau distillée (4 x 30 mL) et avec une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séchée

sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié

par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un mélange

AcOEt/cyclohexane (0:1 puis 1:9) pour obtenir le produit 50 (1,025 g, 75 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 0,25 (s, 6H, 2 x CH3), 0,99 (s, 9H, 3 x CH3), 6,94 (d, J = 8,4

Hz, 2H, 2 x CH), 7,79 (d, J = 9,0 Hz, 2H, 2 x CH), 9,89 (s, 1H, CHO) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 191,1 (CH), 161,5 (Cq), 131,9 (CH), 130,3 (Cq), 120,5 (CH),

25,6-25,5 (CH3), 18,2 (Cq), -3,6 ;-4,4 (CH3) ;

IR (sans solvant): ṽ 2958 (Csp3-H), 2933 (Csp3-H), 2859 (C-Haldéhyde), 1700 (C=O) cm-1.

O

OSi

H


142

Alcool (4-(tert-butyldiméthylsilyloxy)benzylique (51)

Formule brute : C13H22O2Si


Aspect : Huile incolore

A une solution de 50 (700 mg, 2,80 mmol) dans l’éthanol absolu (7 mL) est ajouté du NaBH4

(132 mg, 3,49 mmol). La réaction est laissée sous agitation pendant 1 h 30. Après évaporation

du solvant sous vide, de l’eau distillée (30 mL) est ajoutée au mélange et l’alcool est extrait

avec du DCM (3 x 20 mL), séché sur Na2SO4, filtré et le solvant est évaporé sous vide. On

obtient alors le produit attendu 51 (548 mg, 82 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 0,19 (s, 6H, 2 x CH3), 0,98 (s, 9H, 3 x CH3), 4,61 (s, 2H,

CH2), 6,83 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH) 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) : 155,3 (Cq), 133,7 (Cq), 128,5 (CH), 120,2 (CH), 65,1 (CH2),

25,7 (CH3), 18,2 (Cq), -4,4 (CH3) ;

IR (sans solvant): ṽ 3334 (O-H), 2958 (Csp3-H), 2933 (Csp3-H) cm-1.

4-(azidométhyl) O-(tert-butyldiméthylsilyl) phénol (52)

Formule brute : C13H21O1N3Si


Aspect : liquide jaune

A une solution de 51 (300 mg, 1,26 mmol) dans du THF anhydre (15 mL) est additionnée la

PPh3 (660 mg, 2,52 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis sont additionnés le DIAD



vide, le mélange organique est repris dans l’Et2O et cette phase organique est lavée à l’eau

distillée (1 x 30 mL) et avec une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séchée sur Na2SO4,

filtrée et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu organique est ensuite purifié par

OH

OSi

N3

OSi


143


(0:1 puis 3:97) pour obtenir le produit 52 (259 mg, 78 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 0,20 (s, 6H, 2 x CH3), 0,99 (s, 9H, 3 x CH3), 4,26 (s, 2H, CH2),

6,84 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH), 7,17 ( d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) : 155,8 (Cq), 129,6 (CH), 128,0 (Cq), 120,4 (CH), 54,4 (CH2),

25,6 (CH3), 18,2 (Cq), -4,4 (CH3);

IR (sans solvant): ṽ 2956 (Csp3-H), 2930 (Csp3-H) 2097 (N=N) cm-1.

3,4-(éthoxyméthylènedioxy) benzaldéhyde (53)



Aspect : huile jaune

A une solution de 3,4-dihydroxybenzaldéhyde (1 g, 14,48 mmol) dans le toluène (100 mL) est

ajoutée une quantité catalytique de résine Amberlyste A15 (70 mg) et du triethylorthoformate

(3,613 mL, 21,72 mmol). La réaction est mise à reflux pendant 6 h avec un Dean Stark afin

d’enlever l’éthanol généré lors de la réaction. Après retour du mélange à température

ambiante, il est filtré et la résine est rincée à l’AcOEt. Après évaporation du solvant, le résidu

est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un mélange

AcOEt/cyclohexane (1:9 puis 1:4) pour obtenir le produit 53 (1,278 g, 46 %):

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH3) ; 3,62 (q, J = 6,9 Hz, 2H, CH2) ;

6,84- 6,88 (m, 3H, 3 x CH) ; 7,33 (d, J = 7,8 Hz, 1H, CH) ; 9,71 (s, 1H, CHO).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 190,2 (CH), 151,2 (Cq), 146,9 (Cq), 131,7 (Cq), 128,0 (CH),

119,8 (CH), 108,0 (CH), 106,7 (CH), 59,7 (CH2), 14,6 (CH3).

OO

O

O

H


144

Alcool 3,4-(éthoxyméthylènedioxy) benzylique (54)


Masse molaire: 196,20 g.mol-1


A une solution de 53 (778 mg, 4,01 mmol) dans l’éthanol absolu (7 mL) est ajouté du NaBH4

(190 mg, 5,01 mmol). La réaction est laissée sous agitation pendant 1 h. Après évaporation du

solvant sous vide, de l’eau distillée (30 mL) est ajoutée au mélange et l’alcool est extrait au

DCM (3 x 20 mL). La phase organique est ensuite séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est

évaporé sous vide. On obtient alors le produit attendu 54 (749 mg, 95 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,26 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH3), 3,72 (q, J = 7,2 Hz, 2H, CH2),

4,60 (s, 2H, CH2), 6,84-6,87 (m, 3H, 3 x CH), 6,92 (s, 1H, CH) ;


107,5 (CH), 107,2 (CH), 64,4 (CH2), 59,0 (CH2), 14,5 (CH3).

Azoture de 3,4-(éthoxyméthylènedioxy) benzyle (55)



Aspect : Liquide jaune

A une solution de 54 (320 mg, 1,63 mmol) dans du THF anhydre (15 mL) est additionnée la

PPh3 (856 mg, 3,26 mmol). Cette solution est refroidie à 0°C puis sont additionnés le DIAD



vide, le résidu organique est repris dans l’Et2O, lavé à l’eau distillée (1 x 30 mL) et avec une

solution de NaClsat. (1 x 30 mL), puis séché sur Na2SO4, filtré et le solvant est évaporé sous

vide. Le résidu organique est ensuite purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec

OO

OH

O

OO

N3

O


145

comme éluant un mélange AcOEt/cyclohexane (0:1 puis 3:97) pour obtenir le produit 55 (250

mg, 69 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH3), 3,74 (q, J = 7,2 Hz, 2H, CH2),

4,25 (s, 2H, CH2), 6,84-6,89 (m, 4H, 4 x CH);


108,4 (CH), 108,1 (CH), 59,5 (CH2), 54,8 (CH2), 14,8 (CH3);

IR (sans solvant) ṽ 3058 (Csp2-H), 2982 (Csp3-H), 2936 (Csp3-H), 2098 (N=N), 1733 (C-O)

cm-1.

N-Fmoc leucinamide de morpholine (67)



Aspect : Pâte transparence

A une solution de N-Fmoc leucine (1 g, 2,80 mmol) dans le DMF (15 mL) est ajouté le HBTU

(1,06 g, 2,80 mmol) et la DIEA (1,44 mL, 8,40 mmol). Après quelques minutes sous

agitation, on ajoute la morpholine (268 µL, 3,08 mmol). La réaction est laissée sous agitation

magnétique pendant 50 min à température ambiante. On additionne alors de l’AcOEt (60 mL).

La phase organique est lavée avec une solution de NaHCO3sat. (2 x 40 mL), puis d’HClaq. 1M

(1 x 40 mL) et enfin de NaClsat. (1 x 40 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est

évaporé sous vide. Le résidu obtenu est ensuite purifié par chromatographie flash sur gel silice

avec comme éluant un gradient de solvant AcOEt/Cyclohexane (9:1, 15:5 puis 1:1), pour

obtenir, après évaporation des solvants, le produit 67 (1,060 g, 90 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 0,94 (d, J = 6,6 Hz, 3H, CH3), 0,99 (d, J = 6,3 Hz, 3H, CH3),

1,36-1,44 (m, 1H, CH), 1,50-1,60 (m, 1H, CH), 1,68-1,76 (m, 1H, CH), 3,47-3,61 (m, 4H, 2 x

CH2), 3,70-3,74 (m, 4H, 2 x CH2), 4,21 (t, J = 6,9 Hz, 1H, CH), 4,32-4,43 (m, 2H, CH2), 4,70

(td, J1 = 9 Hz, J2 = 3,6 Hz, 1H, CH), 5,57 (d, J = 8,7 Hz, NH), 7,39-7,33 (m, 2H, 2 x CH),

7,38-7,42 (m, 2H, 2 x CH), 7,60 (d, J = 6,9 Hz, 2H, 2 x CH), 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x

CH) ;

NH

O

O

N

O

O


146

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) : 171,1 (Cq), 156,1 (Cq), 143,9 (Cq), 141,2 (Cq), 127,6 (CH),

127,0 (CH), 125,1 (CH), 119,9 (CH), 66,9 (CH2), 66,7 (CH2), 66,5 (CH2), 48,8 (CH), 47,1

(CH), 45,9 (CH2), 42,7 (CH2), 42,4 (CH2), 24,5 (CH), 23,3 (CH3), 21,8 (CH3).

N-Fmoc leucinal (68)



Aspect : Pâte translucide

A une solution de 67 (170 mg, 0,40 mmol) dans le THF anhydre (10 mL), sous argon, à 0°C,

est additionnée du LiAlH4 (19 mg, 0,50 mmol). La réaction est stoppée au bout de 20 min par

addition de HClaq. 1M. La solution est reprise dans l’AcOEt (50 mL) et la phase organique est

lavée avec une solution de NaHCO3sat. (2 x 30 mL) et NaClsat. (1 x 30 mL), séchée sur Na2SO4

et filtrée. Le solvant est évaporé sous vide pour obtenir un mélange des composés 64 et 65.

Après analyse par RMN 1H de ce brut de réaction (taux de conversion de 52 %), celui-ci a été

engagé dans la réaction d’amination réductrice.

4.2 Préparation des peptidomimes 56-66

4.2.1 Préparation de la résine A

Sur une résine Wang à 0,65 mmol.g-1, les quatre premiers aminoacides (N-Fmoc

valine, N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine, N-Fmoc leucine et N-Fmoc m-AMBA) du côté C-

terminal sont introduits de façon classique. Après déprotection de l’amine du m-AMBA, une

solution d’acide bromoacétique (7 équiv.) dans le DMF (0,4 M) puis de DIC (8 équiv.) dans le

DMF (2 M) sont ajoutées à la résine libre. La réaction est laissée sous agitation 5 min puis la

résine est filtrée et lavée de façon classique. Une solution de propargylamine (10 équiv.) dans

le DMSO (1 M) est additionnée à la résine et la réaction est laissée sous agitation pendant 1 h.

Après filtration et lavage de la résine, l’accomplissement de la réaction de substitution

nucléophile est vérifié par le test au TNBS (négatif) et le test au chloranil (positif). Sur

l’amine secondaire formée est additionné le N-Fmoc glycinal 25 (6 équiv.) en présence de

NaBH3CN (15 équiv.) dans une solution de DMF à 1% en acide acétique. Après filtration et

lavage de la résine, l’accomplissement de la réaction d’amination réductrice est vérifié par le

NH

O

O

O

H


147

test au chloranil (négatif). L’introduction des trois derniers acides aminés se fait de façon

classique.

4.2.2 Réaction de Huisgen catalysée au cuivre sur support solide

A la résine portant un groupement alcyne en suspension dans un mélange THF/DMF

(1:1, 900 µL) est additionnée du CuI (5 % molaire) puis une solution d’azoture (10 équiv.)

dans un mélange THF/DMF (1:1, 100 µL) et enfin la DIEA (5 équiv.). La réaction est laissée

sous agitation pendant 16 h.

4.2.3 Clivage des peptides du support

La déprotection des chaînes latérales et le clivage du peptide de la résine ont été

réalisés dans un mélange TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5, v/v/v) pendant 4 h. Tous les

peptidomimes sont ensuite précipités dans de l’Et2O à 0°C, filtrés, dissout de nouveau dans un

mélange eau distillée/ACN et lyophilisés. Ils sont ensuite purifiés par CLHP semi-préparative

en phase inverse.

4.2.4 Synthèse et caractérisation des peptidomimes 56-66

A la résine A a été appliquée la réaction de Huisgen catalysée au cuivre en présence

d’un des différents azotures 33-36, 39-42, 45, 52 ou 55. Après clivage de chaque peptide du

support selon la procédure générale et purification par CLHP semi-préparative, les peptide 56-

66 ont été obtenus.

Peptide 56



Rendement : 15 %

CLHP : tR= 6,45 min. (Colonne Chromolith. Gradient de 100 % à 50 % A en 10 min. Débit à

3 mL.min-1).


H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N


148

Peptide 57



Rendement : 13 %


3 mL.min-1).


Peptide 58



Masse exacte : 1035,5502 g.mol-1

Rendement : 16 %


3 mL.min-1).


Peptide 59



Rendement : 10 %

CLHP : tR= 5,62min. (Colonne Chromolith. Gradient de 100 % à 50 % A en 10 min. Débit à 3

mL.min-1).


H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

N

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

O2N


149

Peptide 60



Rendement : 7 %


3 mL.min-1).


Peptide 61

Formule brute : C49H73FN12O10


Rendement : 10 %


3 mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1009,5 [M+H]+, 505,5 [M+2H]2+, 1031,5 [M+Na]+.

Peptide 62

Formule brute : C50H75FN13O12


Rendement : 6 %

CLHP : tR= 7,41 min. (Colonne

Chromolith. Gradient de 100 % à 50

% A en 10 min. Débit à 3 mL.min-1).


H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

N

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

F

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

O2N


150

Peptide 63



Rendement : 15 %


3 mL.min-1).


Peptide 64



Rendement : 9 %


3 mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1030,5 [M+H]+, 516,6 [M+2H]2+, 1052,6 [M+Na]+.

Peptide 65



Rendement : 8 %


3 mL.min-1).


H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

NO2

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

HN

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

HO


151

Peptide 66



Rendement : 4 %


3 mL.min-1).


4.3 Préparation des peptidomimes 69-75

4.3.1 Procédure générale de la synthèse de la liaison réduite en

position P8-P9 : Synthèse des peptides

Après le couplage de la N-Fmoc valine et de la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine sur le

support solide, puis déprotection de l’amine terminale, le N-Fmoc leucinal 68 (3 équiv.) est

additionné sur l’amine libre en présence de NaBH3CN (7 équiv.), dans une solution de DMF à

1% en acide acétique, pendant 2 h. Après vérification de la formation de l’amine secondaire

avec le test au chloranil et la suite de la synthèse se fait comme décrit pour la synthèse de la

résine A.

4.3.2 Procédure générale de la synthèse du motif phthalimide

Après préparation du squelette peptidique selon les conditions décrites pour la résine

A jusqu’à l’introduction de l’avant dernier acide aminé (la N-Fmoc leucine ou la N-Fmoc (β-

cyclohexyl) alanine en position P2), cet acide aminé terminal est déprotégé. A la résine en

suspension dans le DMF est additionné de l’anhydride phthalique (5 équiv.) et de la DIEA (5

équiv.). La réaction est laissée sous agitation mécanique pendant 1 h. Après filtration et

lavage de la résine selon la procédure classique, l’acide formé est activé en présence de

HBTU/HOBt (1,5 équiv./1,5 équiv.) et de DIEA (3 équiv.). La cyclisation se fait toute une

nuit.

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

HO

HO


152

4.3.3 Caractérisation des peptidomimes 69-75

Peptide 69



Rendement : 8 %


3 mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1022,6 [M+H]+, 1044,6 [M+H]+, 512,0 [M+2H]2+.

HRMS (ESI) calcd pour C47H80N9O12: 1022,5787, mesuré 1022,5781.

RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz)

NH

δ (ppm)

Hα

δ (ppm)

Hβ

δ (ppm)

Hγ

δ (ppm)

Hδ

δ (ppm)

Hε/ others

δ (ppm)

β-Ala - 3,14 ; sous l’H2O - - -

Leu (2) 8,06-

8,18

4,21 1,56 1,41 0,89 -

Ala 8,30 4,36 1,21 - - -

Partie centrale - - - -

Haromatic: 7,47 et

7,71

1,2,3-triazole: 7,10

Hbenzyl: 5,80 (NH)

Squelette

peptidique

central +

m-AMBA

7,85 CH2: sous H2O

Haromatic: 7,47 and

7,71

Leu (7) 8,06-

8,18

3,78/3,92 1,56 1,41 0,89 CH2: 4,21

Thr 8,06-

8,18

3,78/3,92 3,78/3,9

2

1,21 - -

Val 8,06-

8,18

4,21 2,04 0,89 - -

H-βAla-Leu-AlaNH

NNH

O

NH

O

NN

N

O2N

HN

OH

Val-OH

O


153

Peptide 70



Rendement : 12 %


3 mL.min-1).


Peptide 71



Rendement : 3 %


3 mL.min-1).


Peptide 72



Rendement : 13 %


3 mL.min-1).

NH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

O2N

OHN

ONH

O

H2N

NH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

O2N

OHN

ON

O

O

NH

NNH

O

NH

O

NN

N

O2N

HN

OH

NH

OOH

O

OHN

ONH

O

H2N


154


Peptide 73



Rendement : 10 %


3 mL.min-1).


Peptide 74



Rendement : 6 %


3 mL.min-1).


NH

NNH

O

NH

O

NN

N

O2N

HN

OH

NH

OOH

O

OHN

ON

O

O

NH

NNH

O

Leu-Thr-Val-OH

O

NN

N

O2N

OHN

ON

O

O


155

Peptide 75



Rendement : 5 %


mL.min-1).


NH

NNH

O

NH

O

NN

N

O2N

HN

OH

NH

OOH

O

OHN

ON

O

O


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Chapitre 4

Insertion de motifs β-lactame en partie centrale du peptide ELA

Chapitre 4 : Insertion de motifs β-lactame en partie centrale du peptide ELA

165

Préambule

Les peptides sont des molécules flexibles dont la conformation dépend principalement

de leur environnement. Au sein d’un récepteur, un peptide adopte une certaine conformation

qui lui confère une activité biologique spécifique. Afin d’utiliser un peptide comme molécule

bioactive, il est préférable de limiter le nombre de conformères pour i) qu’il interagisse

spécifiquement avec la cible choisie ; ii) accroître son activité biologique en ne sélectionnant

que le conformère le plus actif.

Pour cela, chimistes et cristallographes ont travaillé sur la conception de motifs

susceptibles de mimer les repliements adoptés par les peptides afin de rigidifier leurs

squelettes et ainsi pouvoir les utiliser comme molécules thérapeutiques.

I . Les turns dans les peptides : Comment les mimer ?

1.1 Présentation et classification des turns dans les peptides

Il existe trois types de structures secondaires dans les peptides et protéines : les hélices

α, les feuillets β et les coudes couramment nommés « turns ». De façon globale, un turn

correspond à une inversion de direction de la chaîne peptidique. Ils peuvent être classifiés en

quatre catégories, correspondant au nombre de résidus impliqués dans l’inversion de chaîne :

les γ-turn,1 β-turn,2 α-turn3 et π-turn4 impliquant respectivement trois, quatre, cinq et six

résidus (Figure 4.1).

Figure 4.1. Présentation des différents types de repliements présents dans la nature.

L’un des plus courants dans la nature est le β-turn. Le premier a été découvert par

Venkatachalam en 1968 ; il était stabilisé par une liaison hydrogène entre le résidu i et i+3.

Toutefois, par la suite, Lewis et al. ont montré l’existence de β-turn dit « ouvert ».5 Ainsi, de


166

façon générale, un β-turn est défini comme un repliement, autre qu’une hélice, amenant

l’acide aminé i+3 à une distance maximale de 7 Å par rapport au résidu i (Figure 4.2).

O H NO

Ri+3

Ri+2

NH

ORi+1

HN

Ri

β-turn selon Venkatachalam

OHN

O

Ri+3

Ri+2

NH

ORi+1

HN

Ri

ψi+1

ψi+2φi+1φi+2

d < 7 A°

β-turns dit "ouverts"

12

34 5 6

7

8

910

Figure 4.2. Présentation des deux grandes classes de β-turns.

Onze types de β-turns ont été répertoriés et définis par une distance entre les acides

aminés i et i+3 et des angles ϕi+1 et ψi+1 et ϕi+2 et ψi+2 spécifiques, correspondant

respectivement aux angles NH-CαR et CαR-CO des acides aminés i+1 et i+2 (Tableau 4.1).6

Parmi ces onze types de repliement, ceux de type I sont les plus couramment retrouvés dans la

nature, suivis de ceux de type III puis II. Ces trois repliements présentent tous une liaison

hydrogène entre les résidus i et i+3. Ainsi, plus de 60 % des β-turns sont constitués d’une

liaison hydrogène intramoléculaire.

Type de repliement ϕi+1 (deg) ψi+1 (deg) ϕi+2 (deg) ψi+2 (deg)

I -60 -30 -90 0

I’ 60 30 90 0

II -60 120 80 0

II’ 60 -120 -80 0

III -60 -30 -60 -30

III’ 60 30 60 30

IV -61 10 -53 17

VIa1 -60 120 -90 0

VIa2 -120 120 -60 0

VIb 35 -135 135 -75

VIII -60 -30 -120 120

Tableau 4.1. Représentation des paramètres structuraux permettant de différencier chaque β-turn.


167

1.2 Introduction sur les mimes de turns : Classification

La conformation d’un peptide joue un rôle clé dans les systèmes de reconnaissance

entre un peptide et un récepteur.7 La chimie médicinale s’intéresse à identifier des motifs non-

naturels permettant de reproduire ces repliements et de générer des mimes peptidiques

(peptidomimes) bio-actifs et résistant aux peptidases. Depuis le début des années 1980, de

nombreux chimistes ont travaillé sur le développement de méthodes permettant de mimer ces

repliements, d’une part pour étudier leurs propriétés structurales, et d’autre part pour

reproduire l’activité biologique de peptides naturels.8 Ces mimes peuvent être classés en deux

catégories : des mimes internes ou externes (Figure 4.3). Les mimes internes sont construits

sur la base du pseudo-cycle à dix chaînons : l’idée est de créer un lien entre deux positions

plus ou moins éloignées au sein du squelette peptidique afin de contraindre le repliement.

Cette catégorie est principalement illustrée par des cycles de taille moyenne, des bicycles et

des macrocycles. Les mimes externes sont souvent représentés par des cycles de petite taille

externes au peptide du fait qu’il ne porte aucune chaîne latérale. Insérés dans les peptides, ces

structures permettent de limiter le nombre de conformations possibles et d’orienter de façon

globale le repliement du squelette peptidique.

HNO

HN

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

Cycles de taille moyenne et bicycles

Macrocycles

HNO

HN

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

Mime interne Mime externe

Cycles de petite taille

Figure 4.3. Présentation des deux catégories de mimes de repliement, dits internes ou externes.

1.3 Présentation des mimes internes

1.3.1. Les cycles de taille moyenne

Les β-turns qui contiennent une liaison hydrogène forment des pseudo-cycles à dix

chaînons ; de nombreux groupes ont donc travaillé sur la synthèse de cycles à dix chaînons

afin de les introduire en substitution du squelette peptidique. Kahn et al. réalisèrent la

synthèse de cycles conservant tous les liens (Figure 4.4a); la présence de l’hétéroatome X

permet de moduler l’orientation des chaînes latérales, la longueur de liaison et la valeur des

angles ϕ et ψ pour adapter la molécule à divers systèmes.


168

O

HN

ONX

OO

Ri+3

Ri+2Ri+1

RiNH

H

HNO

HN

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

β-turn

NH

OHN

ROR'

a) b)

Figure 4.4. Présentation des similitudes structurales entre un β-turn possédant une liaison hydrogène et des cycles à dix chaînons.

En particulier, ils mimèrent la séquence Gln-Gly-Ser-Phe, tetrapeptide formant un β-turn dans

la protéine CD4 (présente à la surface des lymphocytes T auxiliaires) afin d’inhiber une

protéine du HIV se liant à CD4.9

Fink et al. ont plus récemment utilisé des lactames à dix chaînons contenant une

oléfine en position P6 afin de mimer les β-turns de type I (Figure 4.4b).10 Peu de motifs

mimant ces repliements ont été développés alors qu’ils représentent plus de 40 % des β-turns

identifiés. Toutefois, la méthode de synthèse proposée ne permet pas d’introduire les chaînes

latérales des résidus i+1 et i+2, très souvent impliquées dans les interactions peptides-

protéines.

Enfin, une méthode de synthèse sur support solide fut développée par Ellman et

Virgilio. Ils réalisèrent la synthèse de onze peptidomimes contenant un cycle à dix chaînons

tout en conservant les chaînes latérales des acides aminés i+1 et i+2 (Figure 4.5a).11 Ils

appliquèrent ensuite cette méthode pour générer une librairie de 1152 mimes de β-turns.12

Dans un deuxième temps, ils développèrent une seconde génération de composés possédant

également la chaîne latérale de l’acide aminé i+3 (Figure 4.5b).13

NH

N

O

ONH2

O Ri+2

S

Ri+1

n

NH

N

O

O Ri+2

S

Ri+1

n Ri+3

1ère génération 2ème génération

a) b)

Figure 4.5. Représentation des mimes développés par Ellman et Virgilio a) de première et b) de deuxième générations.


169

Les cycles à dix chaînons présentent l’inconvénient d’être relativement flexibles en

solution. Pour diminuer cette flexibilité, le groupe d’Olson proposa au début des années 1990

de remplacer le squelette peptidique par un cycle de type lactame à neuf chaînons plus rigide

(Figure 4.6).14 De plus, la voie de synthèse développée leur a permis d’introduire les chaînes

latérales des acides aminés i+1 et i+2.

HN

O

Figure 4.6. Rerésentation d’une alternative aux mimes à dix chaînons trop flexibles : le cycle à neuf chaînons.

Une autre alternative aux cycles à dix chaînons trop flexibles est l’utilisation d’entités

bicycliques.

1.3.2. Les bicycles

Parmi les bicycles, l’une des familles les plus étudiées est celle des 1-aza-2-

oxobicycloalcanes à huit, neuf ou dix chaînons correspondant à la fusion de deux

cyclopentanes, la fusion d’un cyclopentane et d’un cyclohexane ou de deux cyclohexanes

respectivement.15

L’un des challenges dans la synthèse de mimes internes de peptides est d’introduire les

chaînes latérales des acides aminés i+1 et i+2 afin de mimer leurs propriétés biologiques.

Dans le cas des bicycles à neuf chaînons, Lubell et al. décrivirent l’une des premières

synthèses stéréosélectives d’acides aminés contenant un cycle 1-aza-2-

oxobicyclo[4,3,0]nonane nommé plus communément indolizidinone.16 Après synthèse de la

cétone intermédiaire par une condensation de Claisen, le cycle pyrrole est formé par

amination réductrice puis la deuxième cyclisation est réalisée en milieu acide. Par la suite, ils

modifièrent leur stratégie de synthèse en ajoutant une étape d’alkylation sur la cétone

intermédiaire pour introduire les substituants R1 et R2.17-18 En parallèle, ils travaillèrent sur la

taille des deux cycles et, dans la synthèse de quinolizidinone et pyrroloazepinone,

remplacèrent la première étape de condensation par une étape d’oléfination.19-21


170

RO2C

OR1

CO2R

PhFNH

NHP

n

m

Cétone intermédiaire

NBocHN

CO2HO

N

N

O

O

CO2HBocHN

BocHN

CO2H

N

OFmocHN CO2H

N

O CO2H

BocHN

N

O CO2H

BocHN

H OH

NBocHN

CO2HO

R1

NBocHN

CO2HO

R1= Bn, CH2OH, CH2N3, CO2H ou COH

NBocHN

CO2HO

R2

R2= Bn, CH2OH, CH2N3 (CH2)3N3, (CH2)3OH

Ph Ph

Indolizidinone Pyrrolizidinone

PyrroloazepinoneQuinolizidinone

Figure 4.7. Représentation de la voie de synthèse développée par Lubell pour accéder à divers 1-aza-2-oxobicycloalcanes.

Les synthèses de divers acides aminés bicycliques ont été décrites par le groupe de Lubell

(Figure 4.7),22-24 et leur introduction au sein de peptidomimes antagonistes de peptides

naturels donnent des résultats structuraux et biologiques très prometteurs.25-26 D’autres

groupes proposèrent d’autres voies de synthèse d’indolizidinone et de pyrroloazépinone toutes

aussi efficaces.27-28

Dans la lignée des travaux de Lubell, le groupe de Kahn réalisa la synthèse de

tetrahydro-2-H-pyrazino[1,2-a]pyrimidine-4,7-diones 1,3,6,8-substitués comme contraintes

conformationnelles au sein de peptidomimes. L’étape clé de cette synthèse est une cyclisation

tandem, permettant donc de former en une seule étape les deux cycles à partir d’une molécule

linéaire.29 De plus, cette cyclisation tandem fut développée sur support solide en réalisant la

cyclisation lors du clivage du peptide du support.30-31 Pour prouver la capacité de ces

molécules à mimer l’activité biologique de peptides, Kahn et al. évaluèrent la capacité de

quatorze dérivés à lier les récepteurs opioïdes δ, κ et µ et identifièrent ainsi deux molécules

comme ligands spécifiques au récepteur µ (Schéma 4.1).32

Ri

HN

HN

HN

NO

OEtO O

O

Ri+3

Ri+2N

NN

Ri+3

OO

HN O

Ri H

Ri+2

Acide formique

Schéma 4.1. Dernière étape de synthèse de tetrahydro-2Hpyrazino[1,2-a]pyrimidine-4,7-diones 1,3,6,8-substitués développée par Kahn. Représentation des deux molécules liant spécifiquement le récepteur opioïde µ.


171

Cette même cyclisation tandem fut appliquée en solution pour préparer des

dicétopipérazines.33

Golebiowski et al. synthétisèrent également des dicétopipérazines mais, cette fois, par

une approche sur support solide. La première synthèse décrite a été réalisée à partir de l’ester

2-pipérazinate supporté mais ne permet pas d’introduire de chaîne latérale en position i+2.34

Ainsi, en parallèle, cette équipe publia une deuxième voie de synthèse à partir de l’ester R-N-

Boc-β-N-Fmoc-L-diaminopropionate supporté. Une réaction d’Ugi permet d’introduire

simultanément les groupements Ri+2, Ri+3 et Ri+4 ; puis, une première cyclisation est réalisée

en milieu basique. Un couplage peptidique sur l’amine secondaire générée permet

d’introduire le groupement Ri+1. Enfin, le peptide est clivé du support générant en même

temps le second cycle (Schéma 4.2).35

O

O

P1G-HNNH-GP2

NN NHRi+3

O NHRi+4

O

ORi+1

O

O

NNH-GP2

OBr

Ri+2 O

O

NH

Ri+4-HN

N

Ri+2

O

Ri+2

Réaction de Ugi SN2 intramoléculaire

Couplage peptidiqueClivage/Cyclisation

Ri+3O

Ri+4-HNRi+3

O

Schéma 4.2. Stratégie de synthèse sur support solide de dicétopiperazines développée par Golebiowski.

Enfin, le groupe de Hruby proposa une voie de synthèse énantiosélective de bicycles à

huit (avec X= S ou X= O) ou neuf chaînons en quatre étapes,36 puis en deux étapes à partir

d’un acide aminé δ,ε-insaturé et d’un acide aminé β-thiol chiraux (Schéma 4.3).37 Enfin, il

décrivit la synthèse sur support solide d’un peptide portant un motif indolizidinone.38

N

S

O

Ri+2

Ri+1

NH

ONO H Ri+3

Ri

N

X

O

Ri+1

Ri+2HN

O ONH

Ri+1

O

OMeGPHN

Ri+2

CO2HH2N

HS

Schéma 4.3. Rétrosynthèse de bicycles à huit et neuf chaînons.

1.3.3. Les macrocycles

Plus récemment, une autre voie d’accès pour contraindre la conformation de peptides a

été explorée : la macrocyclisation. L’avantage de ce mode de contrainte réside dans la facilité

à synthétiser ces peptidomimes. De façon générale, les peptides sont construits de façon


172

linéaire, le plus souvent sur support solide, puis une réaction de cyclisation permet de former

des cycles allant de quatorze à vingt chaînons.

Les premières synthèses de macrocycles ont été inspirées par la nature puisque la

cyclisation a été réalisée par formation d’un pont disulfure39 ou d’une liaison peptidique

intramoléculaire.40 D’autres groupes ont synthétisé des macrocycles par substitution

nucléophile pour former des ponts thioéthers41-42 ou des amines secondaires.43 L’un des

groupes de recherche les plus impliqués dans ce domaine est le groupe de Burgess8 qui étudia

intensivement la formation de macrocycles via une substitution aromatique nucléophile

(SNAr) sur support solide ; la présence du cycle aromatique dans les peptidomimes permet un

repliement du système pouvant mimer les β-turns (Figure 4.8).44

HNO

HN

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

β-turn

HNO

HN

ONHO

Ri+2Ri+1

X CONH2

nY

HNO

HN

ONHO

Ri+2Ri+1

X

O2N

COY

1ère génération 2ème génération

Figure 4.8. Présentation des similitudes structurales entre un β-turn possédant une liaison hydrogène et des macrocycles obtenus par substitution aromatique nucléophile.

L’une des difficultés dans la synthèse de ces motifs réside dans le choix des groupements

protecteurs et du support dont les modes de clivage doivent être orthogonaux les uns par

rapport aux autres. Ainsi, après avoir optimisé la synthèse de ces motifs pour X= N, O ou S,45-

46 Burgess et al. montrèrent que les structures pour X=N47 et X= SO248

miment les β-turns de

type I alors que pour X=S, les résultats sont beaucoup moins bons (Figure 4.8, 1ère

génération).49 Une seconde génération de motifs contenant un second groupement aromatique

fut développée pour accroître la contrainte structurale (Figure 4.8, 2ème génération).50-51 Une

application d’un tel motif est l’obtention d’une molécule capable de lier les récepteurs TrkC,

impliqués dans la sécrétion de facteur de croissance de cellules nerveuses.52 Le groupe de

Kiselyov travailla sur le même type de réaction, mais en introduisant les chaînes latérales Ri+1

et Ri+2 sur l’azote de chaque liaison peptidique.53

Enfin, plus récemment, des réactions chimiosélectives, permettant de s’affranchir de

l’utilisation de multiples groupements protecteurs, ont également été appliquées à la synthèse

de ces macrocycles. D’une part, la réaction de métathèse a été utilisée par Prabhakaran et al. Il

est intéressant de noter que leur réaction de cyclisation a lieu uniquement lorsque la liaison


173

hydrogène, représentée en rouge, est initialement présente (Figure 4.9a).54 Ce même groupe a

synthétisé une molécule issue d’une réaction de métathèse suivie de la réduction de l’oléfine,

capable de mimer le β-turn de type VI (Figure 4.9b).55

NAr

OO

HNN

ONHO

Ph

H NHO

O

O

NH

O NO

NH

OPh

NO

NHO

NH O

NO

HN O

HN

O

N

O

HNO

HNBoc-HN

O

R

CO2Me

H

H

a) b) c) d)

Figure 4.9. Présentation de différents macrocyles par réaction de métathèse.

Ijsselstijn et al. appliquèrent la réaction de métathèse entre deux alcynes terminaux (Figure

4.9c).56 En outre, Giovannoni et al. synthétisèrent un hexapeptide bicyclique dont la structure

cristalline montre la présence de deux β-turns, l’un de type I et l’autre de type II (Figure

4.9d).57 Enfin, le groupe de Blandin a développé une méthode de synthèse permettant

d’introduire les chaînes insaturées lors de la dernière étape de synthèse, permettant de

modifier facilement la taille du cycle.58

D’autre part, la réaction de Huisgen catalysée au cuivre a également été utilisée pour la

synthèse de macrocycles,59-61 mais aucune donnée structurale de ce type de mime cyclique n’a

été publiée à ce jour.

De nombreux mimes internes ont été développés pour rigidifier les structures

peptidiques dont certains se sont avérés être efficaces dans des applications biologiques. Dans

la partie suivante, les mimes dits externes seront présentés.

1.4 Présentation de mimes externes

1.4.1. Les bicycles

Nous venons de présenter différents systèmes pouvant parfaitement être utilisés

comme mimes externes. Toutefois, dans le cas par exemple des motifs bicycliques de type 1-

aza-2-oxobicyclohexane, la stéréochimie du carbone à la jonction des deux cycles n’est pas

bien contrôlée. Pour pallier ce problème, Rigo et al. proposèrent d’introduire une oléfine en

position 5 (Figure 4.10a).62 D’autres publications décrivirent la synthèse de 1-aza-2-

oxobicyclo[4, 3, 0]nonane contenant un hétéroatome en α de la jonction de cycle afin de

faciliter le contrôle de la stéréochimie du centre C6. Ainsi, des dérivés soufrés63 (Figure


174

4.10b) et oxygénés64 (Figure 4.10c) ont également été étudiés pour leur capacité à inverser la

direction de chaînes peptidiques.

N

S

O

H

HN

O

N

OHN

O

N

O

OHN

OOR'

ORO

a) b) c)

1

54

3 2

Figure 4.10. Présentation de différents mimes externes de β-turn bicycliques.

1.4.2. Les lactames

Pour rappel, les lactames sont une famille de composés organiques caractérisée par la

présence d’une liaison amide incluse dans un cycle carboné. Selon la règle IUPAC, leur nom

est celui de l’alcane cyclique correspondant, précédé du préfixe aza- et suivi du suffixe –one.

Dans ce cas, l’azote est numéroté 1 et le carbonyle 2. Toutefois, une autre nomenclature plus

usuelle est utilisée pour définir les cycles à quatre, cinq, six et sept chaînons de ce type; ils

sont respectivement nommés β-, γ-, δ- et ε-lactame (Figure 4.11).

NHO N

HO NH

O

aza-cyclobutanoneou

β-lactame

aza-cyclopentanoneou

γ-lactame

aza-cyclohexanoneou

δ-lactame

12

34

NH

Oaza-cycloheptanone

ouε-lactame

Figure 4.11. Nomenclature des lactames.

Parmi les cycles utilisés pour mimer les repliements de peptides, les lactames en

représentent une grande majorité. Les premiers travaux dans ce domaine ont été rapportés par

R. M. Freidinger, dans les années 80. Il s’appuya sur les travaux de D. B. Boyd qui étudia par

modélisation moléculaire les similitudes structurales entre le dipeptide Gly-Gly et différentes

molécules antibactériennes contenant un cycle β-lactame : les pénicillines et les

céphalosporines.65 Ainsi, Freidinger synthétisa un mime peptidique de l’hormone responsable

de la libération de l’hormone lutéinisante de séquence : Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2 en substituant la glycine en P6 par un γ-lactame (Figure 4.12a).66 L’analogue

obtenu se révéla être neuf fois plus efficace que l’hormone naturelle pour induire la libération

d’hormone lutéinisante. Par la suite, il publia les synthèses de lactames à cinq,67 six et sept

chaînons.68


175

NNH

O

CO2H

HN

H2N NH2

ONH

SO

O

N

O

O

HN

WHLWLQLKQP[Nle]Y

Inhibiteur de la thrombine

Analogue d'un facteur α chez Saccharomyces cereVisiae

Arg-Pro-Gly-NH2N

O

O

NH

Glu-His-Trp-Ser-Tyr

Analogue de l' hormone lutéinisante

a)

b) c)

Figure 4.12. Présentation de différents analogues peptidiques contenant un cycle lactame.

Ces travaux incitèrent plusieurs groupes de recherche à développer de nouveaux cycles

lactames. Tout d’abord, Zhang et al. introduisirent une γ-lactame au sein d’un tridecapeptide

engagé dans le contrôle de la reproduction de la levure Saccharomyces cerevisiae afin de

mimer un γ-turn; l’analogue obtenu présente la même activité biologique que le peptide natif

et les mêmes propriétés structurales (Figure 4.12b).69 Le groupe de Semple synthétisa des

inhibiteurs de la thrombine, enzyme intervenant dans la coagulation sanguine, contenant des

δ- et ε-lactames70 puis développa une méthode pour synthétiser des lactames quaternaires

(Figure 4.12c).71 Kamoune et al. développèrent également une stratégie de synthèse de

lactame quaternaire par synthèse de bis-lactame suivi du clivage d’une des deux liaisons

amides pour fournir la δ-lactame correspondante (Schéma 4.4).72

NH

NPMB

O

O

HMeOH/HCl

HNH

MeO2C

NH3+ Cl-

O

Schéma 4.4. Synthèse développée par Kamoune d’une δ-lactame quaternaire.

Le groupe de Piscopio, pour sa part, développa la synthèse sur support solide d’ε-

lactame73 où l’étape clé consiste en une réaction tandem de cyclisation par métathèse et

clivage de la molécule du support (Schéma 4.5).74

N

O

Ph

MeO2C

Boc-HN (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh 5%molDCE, 80°C, 16h

H

N O

CO2Me

NH-Boc

Ph

H

Schéma 4.5. Synthèse par réaction tandem sur support solide d’ε-lactame développée par Piscopio.


176

L’équipe d’O’Donnell proposa également une méthode de synthèse supportée de γ- et δ-

lactames qui présente l’avantage de se réaliser au cours de la synthèse peptidique (Schéma

4.6).75

O

OHN

R1ON

BrCH2CH2Cl, nBu4NI, NMP

O

ON

R1

NO

THF, HClO

ON

R1

+H3NO

Schéma 4.6. Synthèse sur support solide de γ-lactame au sein d’une séquence peptidique.

Enfin, dans les années 2000, le groupe de C. Palomo, travaillant déjà sur la synthèse

de β-lactame,76-78 proposa d’utiliser ces motifs comme mime de β-turn au sein de

peptidomimes.79 Leur approche consiste à introduire un groupement aussi petit que possible,

soit des β-lactames, au sein de peptides natifs afin de contraindre leur conformation sans

altérer les interactions biologiques dans lesquelles ils sont impliqués (Figure 4.13). Ainsi, ils

montrèrent, par plusieurs techniques d’analyse structurale (RMN, dynamique moléculaire et

diffraction des rayons X), que ce motif mimait parfaitement les β-turns de type II et II’.

HNO

N

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

β-turn

H H

HNO

N

ONHO

ORi+3

Ri+2Ri+1

RiNH

Figure 4.13. Stratégie développée par les professeurs C. Palomo et J.-M. Aizpurua pour mimer certains β-turns.

Ces travaux illustrent les efforts réalisés pour générer de nouvelles molécules

thérapeutiques. Dans le cadre de notre projet de recherche, à savoir la synthèse de mimes de

peptides antigéniques, nous avons choisi d’introduire un motif β-lactame en partie centrale du

peptide ELA.


177

II. Application au peptide antigénique ELA : Synthèse de nouveaux

peptidomimes

2.1 Design des peptidomimes

Dans le cadre de notre projet de recherche, nous avons cherché à concevoir de

nouveaux mimes de ELA et l’introduction d’une contrainte conformationnelle nous est

apparue très intéressante à étudier (Figure 4.14).80-81

Figure 4.14. Structure cristalline du peptide ELA dans le complexe ternaire TCR Mel5/ELA /HLA-A2 (PDB 3HG1).

Nous avons donc choisi d’incorporer un motif β-lactame en partie centrale du peptide

antigénique ELA . Grâce à une collaboration avec l’équipe du professeur J.-M. Aizpurua

(Université du Pays-Basque, Saint Sébastien),79 trois mimes 76, 77 et 78 contenant un motif

β-lactame nous ont été fournis (Figure 4.15). Ces trois molécules possèdent un cycle β-

lactame substitué en C3 par un benzyle et une fonction amine sur laquelle est couplée une N-

Fmoc alanine. Leur différence réside dans la chaîne carbonée portée par l’azote N1 du cycle :

ainsi, alors que les molécules 76 et 77 dérivent respectivement de la β-alanine et de la glycine,

amenant une certaine flexibilité au système, la molécule 78 porte une chaîne isobutyrique

connue pour contraindre le repliement du système.82 Toutefois, on peut noter que les chaînes

choisies sont achirales afin de prévenir tout problème d’épimérisation lors de la synthèse des

motifs 76, 77 et 78.


178

COOHN

HN

OFmoc-HN

NCOOH

HN

OFmoc-HN

COOHN

HN

OFmoc-HN

OO O

H2N

NH

O

O

HN

NH

O N

O

XNH

OHN

O

NH

O

OH

HN

O

OH

O

X = CH2-CH2 CH2 CH(CH3)2

76 77 78

798081

Figure 4.15. Présentation de trois peptidomimes de ELA envisagés.

Nous avons souhaité introduire ces trois motifs β-lactames dans la séquence du

peptide ELA à la place du tripeptide GIG central pour conserver une longueur de chaîne

proche du peptide natif et un bon positionnement des ancres au niveau du CMH-I. Une étude

préliminaire par modélisation moléculaire a montré qu’il était nécessaire d’introduire une D-

isoleucine en position P7 afin de conserver une conformation en adéquation avec le site de

liaison au CMH-I. Cette différence de stéréochimie peut s’expliquer par le fait que les motifs

β-lactames dérivent de la D-benzylserine (Figure 4.15 et 4.16).

Figure 4.16. Superposition du peptide ELA et du peptide portant le motif β-lactame après docking dans le site de liaison du complexe TCR A6/Tax/HLA-A2 (PDB 1AO7).

Enfin, suite aux résultats obtenus précédemment dans le groupe, nous avons choisi de

conserver la β-alanine en position P1, augmentant de ce fait la biostabilité du peptide sans

pour autant altérés son interaction avec le CMH-I.83


179

Ainsi, après avoir présenté la synthèse des molécules 76, 77 et 78, la synthèse des trois

peptidomimes souhaités 79, 80 et 81 (Figure 4.15) sera développée. Les résultats biologiques,

à savoir d’une part la mesure de l’affinité de liaison de chaque molécule obtenue au CMH-I

HLA-A2 et d’autre part leur capacité à stimuler une lignée de LTC spécifiques à Melan-A,

seront ensuite exposés.

2.2 Description de la synthèse des motifs ββββ-lactames

La synthèse des trois dérivés β-lactames a été réalisée par Itxaso Azcune, doctorante

travaillant dans le groupe du professeur C. Palomo, sous la direction du professeur J. M.

Aizpurua.

Les trois dérivés β-lactames ont été synthétisés suivant une seule et même stratégie. Le

D-α-benzylsérinate de méthyle 82 mis en présence de deux équivalents de chlorure de nosyle

(Ns-Cl) et d’un excès de bicarbonate de potassium (KHCO3) conduit à la formation d’un

intermédiaire aziridine 82’ parfaitement isolable. L’addition d’une amine primaire sur celui-ci

conduit à la formation de l’α-benzyl azaserine N-substituée 83 correspondante. Puis, le cycle

β-lactame est formé par attaque nucléophile de l’amine sur l’ester méthylique, en présence de

bis(trimethylsillyl)amide de lithium (LiHMDS) (schéma 4.7). Dans le cas des molécules 84a

et 84b, la homo-allylamine et l’allylamine ont été choisies comme acides carboxyliques

masqués. Cette méthode permet de diminuer le nombre d’étapes de synthèse en

s’affranchissant d’une protection puis déprotection. De plus, les groupements allyliques ne

sont réactifs à aucune des étapes de synthèse. Ainsi, après avoir synthétisé le cycle β-lactame

et couplé la N-Fmoc-alanine, l’oléfine sera finalement oxydée pour fournir la fonction acide

souhaitée.

H2N

CO2MeOH

a- Ns-Cl (2 équiv), KHCO3, CH3CN, refluxb- R-NH2, K2CO3, 50°C

MeO2CN-Ns

Intermédiaire aziridine 82'

N

Ns-HN

O R

COOMe

Ns-HN

CO2MeNH

RLiHMDS (2,5 équiv)THF, -10°C

R= * nn= 2 62% 84an= 1 65% 84b

70% 84c

Rendement sur les deux étapes

82 83a-c 84a-c

NO2

SO

ONs =

Schéma 4.7. Synthèse du motif β-lactame.


180

Dans le cas de la molécule 84c, l’ester dérivant de l’acide amino-isobutrique (Aib) a été choisi

comme nucléophile pour générer l’ouverture de l’aziridine. Il est ensuite nécessaire de

changer de groupement protecteur afin qu’il puisse être déprotégé sélectivement en fin de

synthèse. En effet, comme la synthèse des peptides sur support solide se fait en stratégie

Fmoc, il est nécessaire d’introduire un groupement orthogonal au Fmoc pour protéger l’acide

carboxylique. Ainsi, après déprotection de l’ester méthylique, l’acide est activé sous forme de

chlorure d’acide puis, l’addition-élimination de l’alcool benzylique sur le carbonyle permet

d’introduire un groupement protecteur benzyle (Schéma 4.8).

NsHN

NO OMe

ONsHN

NO OH

ONsHN

NO OBn

O2- (COCl)2, CH2Cl2

3- BnOH, Et3N, CH2Cl2

84c 84c' 84d R = 88%

1- LiOH

Schéma 4.8. Changement de groupement protecteur du dérivé Aib.

D’autre part, le couplage peptidique sur un acide aminé disubstitué (c'est-à-dire que le

carbone α porte deux substituants) est assez difficile à réaliser sur support solide. Il est donc

préférable de coupler la N-Fmoc-alanine sur le motif β-lactame en solution (Schéma 4.9).

Ainsi, après clivage du groupement nosyle (Ns) en présence de thiophénol, l’amine primaire

obtenue a été couplée à la N-Fmoc-alanine par activation avec du 2-éthoxy-1-éthoxycarbonyl-

1,2-dihydroquinoline (EEDQ) pour fournir les molécules 85a, 85b et 85d avec de bons

rendements.

1- PhSH, K2CO3, ACN, t.a.

N

Ns-HN

O R2- N-Fmoc Ala-OH, EEDQ, DCM, de -10°C à t.a. N

Fmoc-Ala-HN

O RCOOBn

R= * nn= 2 87% 85an= 1 66% 85b

80% 85d84a, b ou d 85a, b ou d

H2, Pd/C MeOH COOH

99% 78

Schéma 4.9. Couplage de la N-Fmoc-alanine en solution.

Enfin, dans le cas des deux dérivés allylés, l’acide carboxylique est obtenu par

oxydation de l’oléfine par du periodate de sodium (NaIO4) en présence d’un complexe de

ruthénium pour catalyser la réaction (Schéma 4.10) tandis que le dérivé de l’Aib est obtenu

par hydrogénolyse de l’ester benzylique 85d. Nous obtenons donc les molécules 76, 77 et 78 à

introduire sur le support.


181

N

Fmoc-Ala-HN

On

RuCl3, NaIO4, CCl4-CH3CN-H2O (2:2:3)

de 0°C à taN

Fmoc-Ala-HN

O COOHn

n= 2 87% 76n= 1 68% 77

85a-b

Schéma 4.10. Oxydation des oléfines 85a et 85b fournissant les molécules 76 et 77.

2.3 Première stratégie : synthèse des peptidomimes sur la résine Wang

2.3.1. Synthèse des peptidomimes

La synthèse des trois peptides a été réalisée en parallèle sur un synthétiseur, sur trois

lots de résine portant la N-Fmoc-valine initiale. Après déprotection de l’amine terminale, le

couplage de chaque acide aminé a été réalisé en présence d’HBTU et de DIEA. Après

répétition de six étapes de déprotection/couplage, chaque peptide a été clivé du support en

milieu acide, dans une solution de TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5) (Schéma 4.11).

Fmoc-Val

2- Fmoc-aan-OH, HBTU, DIEA, DMF

1- DMF/Pipéridine (80:20)

XN

HN

OFmoc-HN

4- HBTU, DIEA, DMF

3- Idem 1

7- TFA/ H2O/ TIS (95:2.5:2.5)

O OH

O

XN

HN

OFmoc-HN

O

O

résine Wang

Fmoc-(D)Ile-Leu-Thr(tBu)-Val

x 3

6- Fmoc-aan-OH, HBTU, DIEA, DMF

5- Idem 1x 2

(D)Ile-Leu-Thr(tBu)-Val Obtention de trois peptides86, 87 et 88

(CH2)2, CH2, C(CH3)2X =

Schéma 4.11. Synthèse sur support solide des peptidomimes souhaités : première stratégie sur résine Wang.

2.3.2. Analyse des peptidomimes synthétisés

Les analyses par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) des trois

peptides présentent deux pics : le pic majoritaire correspond, en termes de temps de rétention,

au peptide attendu tandis que l’autre correspond au peptide tronqué résultant de l’acétylation

après le couplage des β-lactames. En effet, afin de faciliter la purification des peptidomimes,

une étape d’acétylation a été ajoutée dans le cas où il resterait des amines libres après le

couplage des molécules 76, 77 et 78.


182

Par contre, à notre grande surprise, l’analyse par spectrométrie de masse de chaque

peptidomime présente un excès de masse de 18 Da par rapport à la masse attendue,

correspondant à l’addition d’une molécule d’eau sur nos molécules. Notre réflexion nous a

rapidement amenés à penser que les cycles β-lactames s’étaient ouverts lors du clivage du

peptide de la résine en milieu acide. Toutefois, deux modes d’ouverture sont possibles ; en

effet, en milieu acide, l’azote N1 se protone, devenant ainsi un bon groupe partant. Ensuite,

deux voies d’ouverture sont possibles : soit une réaction d’addition-élimination sur le

carbonyle (clivage de la liaison N1-C2) (Schéma 4.12, voie A), soit une réaction de

substitution nucléophile sur le carbone C4 (clivage de la liaison N1-C4) (Schéma 4.12, voie B).

Dans les deux cas, l’ouverture du cycle passe par la protonation de l’azote N1. En effet,

contrairement aux liaisons amides classiques dont le site le plus basique est l’oxygène, dans le

cas des β-lactames, cet oxygène est moins basique et permet donc la protonation de l’azote.84

NH

N

O

βA-L-A

(D)I-L-T-V

H3O+

NH

N

O

βA-L-A

(D)I-L-T-V

H

OH

H

OH

H

NH

HN

O

βA-L-A

(D)I-L-T-V

OH

NH

NH

O

βA-L-A (D)I-L-T-V

OH

Clivage N1-C4

Clivage N1-C2

O

O

O

O

76

VOIE A

VOIE B

Schéma 4.12. Présentation des deux modes d’ouverture du cycle β-lactame en milieu acide.

Afin d’identifier les peptidomimes 86, 87 et 88 obtenus (respectivement issus de

l’ouverture du cycle β-lactame porté par les peptides 79, 80 et 81) nous avons réalisé une

étude bibliographique et des analyses par RMN.

Tout d’abord, une recherche bibliographique nous a menés vers le clivage de la liaison

amide. D’une part, le mode d’action des antibiotiques de type β-lactamine est basé sur le

clivage de cette liaison. Les β-lactamines inhibent la dernière étape de synthèse du

peptidoglycane (paroi bactérienne) en se liant à l’enzyme catalysant cette réaction, empêchant

ainsi la formation du peptidoglycane et entrainant la lyse de la bactérie (Schéma 4.13).


183

NH

HN

OOH

OChaine 1

HO-Transpeptidase

H+

NH

O

O

Chaine 1 Transpeptidase

Chaine 2

NH2

HO-TranspeptidaseD-Ala

NH

O

Chaine 1

NO

S

HOO

HN

O

R

HN

S

HOO

NH

O

RO

OTranspeptidase

NH

Chaine 2

a)

b)

H+

Schéma 4.13. a) Mécanisme de catalyse de la transpeptidation par les transpeptidases ; b) Mécanisme

d’inhibition des transpeptidases par les penicillines.

D’autre part, de nombreuses publications rapportent l’hydrolyse de cette liaison en

milieu acide ou basique.85 Plusieurs équipes ont rapporté l’ouverture de cycles β-lactames par

hydrolyse en présence d’acide chlorhydrique à différentes concentrations, menant à différents

types de β-aminoacides. Fülöp développa ainsi la synthèse d’acide alicyclique β-

aminocarboxylique par ouverture de cycle β-lactame en milieu acide aqueux ou alcoolique

afin d’obtenir l’acide ou l’ester correspondant (Schéma 4.14).86-87

N

HO

O

EtOH/HCl

HCl aq.

NH2.HCl

COOH

NH2.HCl

COOEt

+ MeOH

Schéma 4.14. Synthèse d’alicycle β-aminocarboxylique par ouverture de cycle β-lactame.

Kobayachi, quant à lui, réalisa le même clivage pour obtenir, après hydrogénolyse du

groupement benzyle, des dérivés d’acide α-hydroxy β-aminé (Schéma 4.15).88

NO

BnO

Ph

1- HCl, iso-propanol0° à t.a.

2- H2, Pd/C, t.a.

99%

PriOOCNH2

OH

Schéma 4.15. Synthèse d’acide α-hydroxy β-aminé par ouverture de cycle β-lactame.


184

Enfin, Ojima proposa la synthèse d’acide α,β-aminé en utilisant le même type de condition

sur des dérivés 3-amino β-lactame (Schéma 4.16).89

NHO

H2N

H

Ph

HCl 6N

100% HOOCPh

H2N CH3

H2N H

Schéma 4.16. Synthèse d’un acide α-β-aminé par ouverture de cycle β-lactame.

Le clivage de la liaison N1-C4 a également été étudié et observé par plusieurs groupes

de recherche. L’une des méthodes les plus connues, développée par le groupe d’Ojima, pour

la synthèse d’α-aminoacides à partir de β-lactame substitué en C4 par un aryle consiste à

cliver cette liaison N1-C4 par hydrogénolyse (Schéma 4.17).89

NO

ArN3

R

HH

H

1- H2/Pd-C

2- H3O+ H2N

HN

O

CO2tBu

H R

HAr

CO2tBu

Schéma 4.17. Synthèse d’un dipeptide H-Phe-aa-OtBu par clivage de la liaison N1-C4 d’un cycle β-lactame.

De plus, Kita et al. proposent la synthèse de β-amino cyanide passant par le clivage de cette

liaison (Schéma 4.18).90 L’oxygène en position C4 qui est un élément électro-donneur

favorise cette ouverture.

NHO

OR1R2HN

O

OR1R2

SiMe3

N

R3

ONN

OR1R2

R3

ONHN

OR1R2

R3

Me3Si-OTf

H

Schéma 4.18. Synthèse d’un β-amino cyanide par clivage de la liaison N1-C4 d’un cycle β-lactame.

Enfin, dans les années 2000, plusieurs réactions d’expansion de cycle se basant sur le clivage

de la liaison N1-C4 ont été rapportées. Le groupe d’Alcaide présente la synthèse de γ-lactame

à partir de β-lactame par clivage de cette liaison (Schéma 4.19).91-92


185

NO R3

R1R2 O

NO R3

R1R2

O

S

NBn

NR3O

O

S

NR1R2

NO O

R3

R1R2

S

NBn Cl

DBU

S

NBn

NO R3

R1R2

OH

S

NBn

NR3O

OH

S

NR1R2

S

NBn

Schéma 4.19. Synthèse de γ-lactames par clivage de la liaison N1-C4 d’un cycle β-lactame.

Le groupe de McMurray a réussi à introduire deux carbones à un cycle β-lactame par

ouverture de ce cycle en présence de TFA et fermeture par une réaction de Friedel-Crafts

(Schéma 4.20).93 La présence du para-phenol en position C4 stabilise la charge positive de

l’intermédiaire et permet la cyclisation intramoléculaire.

N

R

O

OMe

OH

TFAN

R

HO

OMe

OH

NH

O

OMeHO

Schéma 4.20. Synthèse de δ-lactames par clivage de la liaison N1-C4 d’un cycle β-lactame.

On peut noter que dans tous ces exemples, le carbone C4 porte un substituant nécessaire à

l’ouverture du cycle β-lactame.

En parallèle de cette étude bibliographique, nous avons réalisé différentes expériences

RMN sur le peptide 86. En particulier, une expérience 2D 1H-1H de type TOCSY pour Total

COrrelation SpectroscopY permet de voir la corrélation d’un proton Hi jusqu’à un proton Hi+4

par transfert magnétique par les protons intermédiaires. Ainsi, l’analyse de peptides par cette

méthode permet de voir les corrélations entre un proton amidique et les protons de la chaîne

latérale de l’acide aminé correspondant. Ainsi, en corrélant les résultats de RMN 1H classique

et ceux de RMN TOCSY, nous avons mis en évidence la présence d’un proton amidique

supplémentaire (zone au-delà de 7 ppm) à 7,76 ppm corrélé à un proton de la chaîne β-alanine

porté par celui-ci, à 2,97 ppm (Figure 4.17). Cette observation révèle que le cycle β-lactame a

été ouvert par clivage de la liaison N1-C4, générant une D-α-(benzyl) serine.


186

Figure 4.17. Zone du spectre TOCSY du peptide 86 montrant les corrélations entre les protons amidiques et les protons aliphatiques (enregistré dans le DMSO-d6 sur un spectromètre 400 MHz).

D’autre part, nous avons appliqué les mêmes conditions d’ouverture du cycle

(TFA/H2O ; 97,5:2,5) en solution sur le tripeptide 78 (Schéma 4.21).

HN

N

O

O

OFmoc-HN

OH

TFA/H2O

(97:2,5:2,5)

NH NH

OO

OFmoc-HN

OHOH

Rendement

quantitatif

3,38-3,52 3,62-3,75

78 78'

Schéma 4.21. Application des conditions d’ouverture du cycle β-lactame sur le tripeptide 78 : Effet de l’ouverture du cycle sur les déplacements chimiques des protons en C4.

Comme précédemment, l’analyse par spectrométrie de masse du produit 78’ présente un excès

de 18 Da par rapport au produit de départ. De plus, en comparaison du spectre RMN 1H du

tripeptide 78, celui du produit 78’ présente un déplacement vers les bas champs (down field),

significatif des protons portés par le carbone C4 de l’unité hydroxyméthyle (Figure 4.18).


187

Protons C4

Protons Benzyliques

N

HN

OOH

OO

Fmoc-HN

11

HN

HN

OOH

O

OFmoc-HN

OH

78

78’

Figure 4.18. Zones spectrales RMN 1H des molécules 78 et 78’ (enregistrés dans le CD3CN sur un spectromètre 300 MHz).

En comparant cette observation à diverses molécules portant un cycle β-lactame fermé ou

ouvert en position N1-C4 ou N1-C2, le mode d’ouverture de la molécule 78 en 78’ a été

confirmé (Tableau 4.2).

Références Forme ouverte N1-C4 Forme fermée

94 M. J. Miller et al. J. Am. Chem. Soc., 1980 N

H

OO

OH

3,50.

N

OO

3,08.

95 P. G. Mattingly et al. J. Org. Chem., 1980.

NH

OO

OH4,67-3,65H

Boc-HN.

N

OO

Boc-HN

H 3,33-3,18.

96 G. M. Salito et al. J. Am. Chem. Soc., 1990. N

HO

OH4,21-4,12H

NO

O

PhPh

COOtBu

O-Bn

.

N

O

N

H 3,75-3,42

COOtBu

O-Bn

O

O

PhPh .

97 L. R. Broadrup et al. Tetrahedron, 2005.

NH

NO

O-Bn

OH4,61-3,78.

O

Ph

Boc-HN

N

ON O-Bn

Boc-HN

3,83-3,61. O

Ph

78 C. Palomo et al. Tetrahedron, 2000.

NH-BocBoc-HN

Ph

O NH

MeOOC

. 3,49-3,44

N-BocO

Boc-HN 3,68-3,48.Ph

87 F. Fülöp et al. Tetrahedron : Assymetry,

2000.

NH2

COOH

5,01.

HN

O.5,03

Tableau 4.2. Comparaison des déplacements chimiques des protons sur le carbone C4 entre différentes molécules portant un cycle β-lactame et leur analogues ouverts.


188

De plus, l’analyse par RMN du carbone de ces deux molécules 78 et 78’ ne montre pas

de différences majeures entre le déplacement chimique du carbonyle du β-lactame et celui de

la liaison amide linéaire. On peut également remarquer dans le cas du spectre carbone de 78’

la présence d’un nouveau pic autour de 62 ppm et la disparition d’un pic autour de 50 ppm en

comparaison avec le spectre de la molécule 78 ; cette différence peut correspondre à la

différence de substituant porté par le CH2 de la β-lactame (Figure 4.19).

78 78’78 78’

Figure 4.19. Zones spectrales RMN 13C des molécules 78 et 78’ (enregistrés dans le CD3CN sur un spectromètre 300 MHz).

Pour finir, l’équipe du professeur J. M. Aizpurua a soumis la molécule 84c aux mêmes

conditions d’ouverture, soit en condition TFA/H2O. Même en prolongeant les temps de

réaction jusqu’à 12h (au lieu de 2h dans le cas de la molécule 78), aucune trace du produit

d’ouverture n’est observé (Schéma 4.22).

S

HN

N

O

O

OO

O

O2N

TFA/H2O/TIS

(95:2.5:2.5) S

HN

N

O

O

OO

O

O2N

84c 84c

Schéma 4.22. Tests des conditions d’ouverture sur la molécule 84c.

Il apparait que la substitution du β-lactame par une fonction amide est nécessaire pour que le

clivage de la liaison N1-C4 ait lieu.


189

2.3.3. Comment remédier à l’ouverture de cycle ?

Nous avons ainsi obtenu les trois peptidomimes 86, 87 et 88, portant une D-α-(benzyl)

serine en partie centrale. Leur affinité de liaison au CMH-I et la stimulation des TCR ont

ensuite été testés ; les résultats obtenus seront présentés en dernière partie de ce chapitre.

Cette ouverture de cycle, bien qu’inattendue, nous a permis de découvrir une méthode pour

introduire facilement des motifs D-α-(benzyl) serine sur support solide.

Afin de répondre à notre objectif initial, à savoir introduire un motif β-lactame pour

rigidifier le repliement du peptide au niveau de la partie centrale, une nouvelle stratégie de

synthèse a été développée. En effet, afin d’empêcher l’ouverture du cycle β-lactame, il nous

faut éviter des conditions acides. Nous avons donc travaillé sur une résine amino-PEGA

modifiée afin qu’elle soit baso-labile.

2.4 Seconde stratégie : Synthèse des peptidomimes sur la résine Amino-

PEGA

Dans cette seconde stratégie de synthèse, nous avons choisi de travailler avec une

résine de type PolyEthylèneGlycolAcrylamide ou PEGA, c’est-à-dire un polymère de

diméthyl acrylamide et mono-2-acrylamidoprop-1-yl[2-aminoprop-1-yl] polyéthylène glycol

réticulé avec du bis 2-acrylamidoprop-1-yl polyéthylène glycol, portant des fonctions amines

en surface (Figure 4.20).98

H2N

résine PEGA

H2NO

ONH

O

NH

OO

O

HN

On

n

NH2O

O

HN

On

Figure 4.20. Structure de la résine Amino-PEGA.

Afin de pouvoir cliver le peptide de la résine en fin de synthèse, il nous est nécessaire

d’introduire un espaceur ou « linker » baso-labile. Le groupe de Morten Meldal a développé

une méthode permettant d’utiliser cette résine pour synthétiser des peptides acides.99 Il

introduit un linker, l’acide para-hydroxyméthylbenzoïque sur le support par un couplage


190

peptidique classique, pour ensuite accrocher le premier acide aminé par un lien ester clivable

par saponification.

Avant de réaliser cette nouvelle synthèse, nous avons testé et confirmé la stabilité du

motif β-lactame dans les conditions de clivage du peptide de la résine, soit dans une solution

de soude à 0,1 mol.L-1 dans l’eau. Le choix de la résine étant validé, nous nous sommes

penchés sur la sélection d’un nouveau groupement protecteur pour la chaîne latérale de la

thréonine. En effet, dans notre premier essai, la thréonine était protégée par un groupement

tert-butyle clivable en milieu acide fort. Afin de cliver ce groupement dans les mêmes

conditions que les conditions de clivage du peptide du support, nous avons choisi de protéger

la thréonine avec un acétate.

2.4.1. Synthèse des peptidomimes

Tout d’abord, nous avons réalisé manuellement l’introduction de l’espaceur et du

premier acide aminé en suivant les conditions décrites par Meldal.99 Ainsi, après couplage

d’une N-Fmoc-glycine afin d’éloigner le peptide du support, nous avons introduit dans des

conditions de couplage classiques l’acide para-hydroxyméthylbenzoïque. Puis, par la méthode

des anhydrides symétriques, nous avons introduit la N-Fmoc-valine (Schéma 4.23).

H2NFmoc-Gly-OH

HBTU, DIEA, DMF

HBTU, DIEA, DMF

OH

O

HOFmoc-Val-OH

DMAP, DMF

2)

1) DMF/Piperidine (80:20)

HN

NH

O

O

O

OFmoc-HN

HN

NH

O

O

HO

HN

Fmoc-HNO

O

OFmoc-HN

Espaceur

DIC, CH2Cl2, 0°C

Schéma 4.23. Introduction d’un espaceur type acide para-hydroxyméthylbenzoïque et du premier acide aminé sur la résine Amino-PEGA.

Nous avons ensuite divisé ce lot de résine en trois fractions afin de travailler sur le

synthétiseur ChemSpeed ASW 100. Après déprotection de la valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle

thréonine a été couplée sur le support en conditions classiques. La résine a été traitée avec du

TFA puis avec une solution d’anhydride acétique et pyridine (1:1) afin de remplacer le

groupement tert-butyle par un acétate. Par un jeu de déprotection/couplage, les acides aminés

suivants ainsi que le tripeptide portant le motif β-lactame ont été accrochés pour finaliser la


191

synthèse. Après déprotection du Fmoc porté par la β-alanine terminale, une solution aqueuse

de soude à 0,1 mol.L-1 a été additionnée à chaque lot de résine (Schéma 4.24).

1. Déprotection2. Fmoc-Thr(tBu)-OH, HBTU, DIEA, DMF

1. Déprotection2. aan, HBTU, DIEA, DMF4. Déprotection3. NaOHaqueux 0,1M

O

OFmoc-HN

Espaceur3. TFA/DCM (1:1)4. Ac2O/Pyridine (1:1)

O

ONH

EspaceurO

Fmoc-HN

O-Ac

Déprotection : DMF/Pipéridine (4:1) aa1= Fmoc-Leu-OH; aa2= Fmoc-(D)Ile-OH; aa3= 76, 77 ou 78; aa4= Fmoc-Leu-OH; aa5= Fmoc-β-Ala-OH

x 5

HN

NH

HN

O NX N

H

O

O

HN

ONH

OOH

HN

OOH

O

O

O

H2N


79 3%80 3%81 10%

Schéma 4.24. Synthèse des trois peptidomimes ciblés sur la résine Amino-PEGA

Le surnageant a ensuite été acidifié avec de l’acide acétique jusqu’à neutralisation puis

lyophilisé.

2.4.2. Analyse et purification des peptidomimes synthétisés

L’analyse par spectrométrie de masse présente la masse attendue pour chaque

peptidomime. Par contre, l’analyse et la purification par CLHP se sont avérées plus

complexes car les peptides ont été difficiles à détecter du fait de leur faible absorption en UV

et de leur caractère hydrophobe, générant probablement un phénomène d’agrégation. Ainsi,

nous avons obtenu les peptides 79, 80 et 81 avec des rendements faibles de 3, 3 et 10%

respectivement.

III. Evaluations biologiques des peptidomimes 79-81 et 86-89

Au travers de ce projet, nous avons synthétisé six mimes potentiels du peptide ELA :

trois portent un motif β-lactame et trois portent une D-α-(benzyl) serine en partie centrale

(Figure 4.21).Comme dans le chapitre précédent, les tests et résultats d’affinité de liaison au


192

CMH-I HLA-A2 des six différents peptidomimes et leur capacité à stimuler les cellules T

produites contre le peptide natif EAA seront présentés.

HN

NH

HN

O NX N

H

O

O

HN

ONH

OOH

HN

OOH

O

O

O

H2N X = CH2-CH2 CH2 CH(CH3)2

798081


868788H2N N

H

OHN

ONH

OHN

OX N

H

OHN

ONH

OOH

HN

OOH

OOH

Figure 4.21. Récapitulatifs des peptidomimes obtenus.

3.1 Etude des complexes binaire peptidomime/HLA-A2


du professeur Andrew Sewell et par Priscilla Do travaillant dans l’équipe du professeur B. M.

Baker.

Dans le cadre de notre étude, l’affinité de liaison de chaque peptidomime au HLA-A2

a été évaluée par deux méthodes complémentaires. D’une part, l’équipe d’Andrew Sewell

(Université de Cardiff, Pays de Galles) a évalué la capacité de chaque peptidomime à se lier

au HLA-A2 de la même façon que dans le chapitre précédent. D’autre part, l’équipe de Brian

M. Baker (Université de Notre-Dame, Indiana) a évalué la stabilité du complexe

peptidomime-HLA-A2. Pour ce faire, il a mesuré, par dichroïsme circulaire, la dénaturation

du complexe pCMH sous l’effet de la température, qui est directement corrélée à la constante

de dissociation de ce même complexe.100

3.1.1. Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes au HLA-A2

Chaque peptidomime 79, 80, 81, 86, 87 et 88 a été testé pour sa capacité à se lier au

HLA-A2. De plus, le peptide ELA a été utilisé comme contrôle positif et le peptide de

séquence GAGAGAGAG (GAG) comme contrôle négatif ; en effet, ce peptide GAG ne

contient pas de résidu ancre lui permettant de se lier au HLA-A2.


193

Les résultats de cette évaluation présentés ci-dessous montrent tout d’abord que les

mimes possédant un cycle β-lactame « ouvert » se lient mieux au HLA-A2 que ceux

contenant un β-lactame fermé (Figure 4.22). En effet, en comparant les mimes 79-81 au

peptide GAG, il est clair que ces trois molécules sont de très mauvais ligands pour le HLA-

A2 ; par contre, les mimes 86-88 ont des affinités de liaison plus importantes que le peptide

GAG. En outre, le peptidomime 88 ressort comme un très bon ligand puisque son affinité de

liaison est légèrement supérieure à celle du peptide ELA.

Figure 4.22. Résultats d’affinité de liaison des peptidomimes 79-81 et 86-88 au HLA-A2 en comparaison du peptide ELA (contrôle positif) du peptide GAG (contrôle négatif).

Nous pouvons corréler ces résultats d’affinité à la flexibilité de chaque molécule.

Ainsi, le cycle β-lactame dans les molécules 79-81 génère une contrainte conformationnelle

probablement trop importante, empêchant alors les résidus ancres de se positionner

correctement dans le sillon du HLA-A2. Par contre, l’ouverture de cycle observée sur les

mimes 86-88 semble apporter suffisamment de flexibilité pour que ces peptidomimes se lient

au HLA-A2.

De plus, si on compare ces trois mimes 86, 87 et 88, leur flexibilité est décroissante :

en effet, le mime 86 qui possède une chaîne CH2-CH2 en partie centrale est plus flexible que

les peptides 87 et 88, possédant respectivement un seul CH2 et un résidu isobutyrique

C(CH3)2. Ce dernier contraint plus fortement le repliement du peptide 88 par rapport au 87.

En parallèle de cette décroissance de flexibilité, leur affinité de liaison au HLA-A2 est

croissante. Il semble donc que la contrainte engendrée par le résidu isobutyrique induise un

bon positionnement des ancres et donc une affinité accrue du mime 88 pour le CMH-I HLA-

A2.


194

3.1.2. Evaluation de la stabilité du complexe peptidomime 88/ HLA-

A2

Ce test de stabilité de complexe pCMH se base sur le fait qu’un CMH-I ne possédant

pas de peptide n’est pas stable à température physiologique ; il perd sa conformation

tridimentionnelle, il se déplie. La dénaturation thermique de complexes binaires pCMH peut

ainsi être suivie par dichroïsme circulaire : le chauffage du complexe va entraîner la

dissociation du peptide et du CMH-I, qui va alors se déplier. De plus, il a été montré que la

température de dénaturation est corrélée à la constante de dissociation du complexe binaire.100

Ainsi, la température de dissociation a été mesurée pour le complexe 88/HLA-A2 : les

complexes contenant le peptide natif EAA , celui contenant le peptide muté en P2 ELA et

enfin le peptidomime 88. Dans le diagramme ci-dessous (Figure 4.23) sont représentées les

températures de dénaturation obtenues.

Figure 4.23. Diagramme présentant la stabilité du complexe 88/HLA-A2.

Ces résultats montrent que la stabilité du complexe formé avec le peptidomime 88 est

meilleure que celle du complexe formé avec le décapeptide naturel EAA. Par contre, en

comparaison avec le complexe contenant le peptide altéré ELA , la stabilité du complexe

peptidomime 88/HLA-A2 est plus faible. Néanmoins, les trois températures de mélange

restent du même ordre de grandeur. En considérant le nombre de modifications structurales

introduites sur nos peptidomimes, ces résultats de stabilité sont très encourageants.


195

3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes à stimuler des lymphocytes T


du professeur Andrew Sewell.

Comme décrit dans le chapitre précédent, l’évaluation de la capacité des peptidomimes

86, 87 ou 88 à stimuler une lignée de LTC spécifique au peptide natif EAA a été réalisée par

suivi par cytométrie de flux de la sécrétion de deux espèces : la cytokine interferon γ et la

protéine CD107a.

Les résultats obtenus pour chaque lignée sont représentés dans les deux diagrammes

ci-dessous (Figure 4.24). De façon générale, la sécrétion d’interferon γ est plus forte que celle

des CD107a.

Figure 4.24. Détection par cytométrie de flux de la sécrétion de la protéine CD107a et de la cytokine interferon γ par une lignée cellulaire spécifique à Melan-A/MART-1 après stimualtion par le peptide EAA (contrôle positif), et les peptidomimes 86, 87 et 88.

Dans les deux modes d’évaluation, le peptide 88 donne les meilleurs résultats puisqu’il génère

la sécrétion d’autant d’interferon γ que le contrôle positif ; dans le cas de la protéine CD107a,

la réponse est moitié moins forte que le contrôle positif. D’autre part, il est intéressant de

noter que le peptide 86, dont l’affinité de liaison au HLA-A2 est plus faible que le peptide 87,

génère une réponse immunitaire plus forte que le peptide 87.


196

Conclusion

Au travers de ce chapitre, nous avons vu que la conformation adoptée par un peptide

est très importante pour son activité biologique. Ainsi, de nombreux groupes de recherche ont

travaillé sur la synthèse de motifs permettant de bloquer la conformation des peptides, de

rigidifier leur squelette peptidique.

Dans le cadre de la synthèse de mimes du peptide antigénique mélanocytaire ELA ,

nous avons choisi d’introduire un motif β-lactame en partie centrale afin de mimer l’arc formé

par ce peptide au sein du complexe binaire ELA -HLA-A2. Les problèmes rencontrés lors de

la synthèse de ces peptides nous ont conduits à l’obtention de six mimes : trois contenant un

motif β-lactame et trois contenant un motif D-α-(benzyl) sérine en partie centrale.

L’évaluation de ces six peptidomimes à se lier au CMH-I HLA-A2 et à stimuler une

lignée de LTC CD8+ spécifiques à l’antigène Melan-A/MART-1 a permis de découvrir un

analogue du peptide ELA, le peptide 88 (Figure 4.25).

HN

HN

ONH

O HN

O

NH

OOH

HN

O

OH

O

ONH

OHN

O

H2N OH

Peptidomime 88

Figure 4.25. Structure du peptide 88 ayant donné les meilleurs résultats biologiques.

Dans la suite de ces travaux, nous souhaitons étudier le complexe binaire peptide 88-

HLA-A2 par cristallographie afin de développer de nouveaux analogues en fonction des

résultats obtenus. En particulier, si le groupement benzylique en partie centrale est bien

orienté vers les TCR, l’introduction de groupements donneur et/ou accepteur de liaisons

hydrogènes pourrait être envisagée pour accroître les interactions avec ces récepteurs.


197

IV- Partie expérimentale

La synthèse des trois dérivés β-lactames ayant été réalisée par Itxaso Azcune, doctorante

travaillant dans le groupe du professeur J. M. Aizpurua, elle ne sera pas présentée dans cette

partie expérimentale.

4.1 Synthèse des peptidomimes 79, 80 et 81

La synthèse de ces peptides a été réalisée sur une résine de type Amino-PEGA (0,4

mmol.g-1). La N-Fmoc glycine puis l’acide para-hydroxymethylbenzoïque suivi des deux

premiers acides aminés (la N-Fmoc valine et la N-Fmoc-O-tert-butyle thréonine) ont été

introduit sur le support selon la procédure générale. La résine est ensuite mise en suspension

dans une solution de DCM/TFA (1:1, v/v) pendant 2 h. Après filtration, la résine est lavée au

DCM, MeOH puis DCM. Une solution de pyridine/anhydride acétique (1:1, v/v) est ensuite

ajoutée et la résine est agitée pendant 30 min. Après filtration, la résine est lavée comme

décrit dans la procédure générale. Après couplages des deux aminoacides suivants, (la N-

Fmoc leucine, la N-Fmoc D-isoleucine), la résine est partagée en trois lots qui sont placés sur

le synthétiseur automatique. Après déprotection de l’amine terminale, une solution de β-

lactame 79, 80 ou 81 (1,5 équiv.) dans le DMF (2 mL) est additionnée à chaque lot de résine,

suivie d’une solution d’HBTU (1,5 équiv.) dans le DMF (1,5 mL) et d’une solution de DIEA

(3 équiv.) dans le DMF (500 µL). La réaction est laissée sous agitation mécanique toute la

nuit (14 h). Après lavage de chaque lot de résine selon la procédure générale et déprotection

de l’amine terminale, les deux derniers acides aminés (N-Fmoc leucine et N-Boc β-alanine)

sont introduits selon la procédure générale.

Après lavage et séchage de chaque résine, la déprotection des chaînes latérales et le

clivage des peptides de la résine ont été réalisés avec une solution de soude à 0,1 mol.L-1.

Après filtration, chaque résine a de nouveau été lavée avec une solution de soude à 0,1 mol.L- 1. Les filtrats furent acidifiés jusqu’à pH=4 et lyophilisés. Après purification par CLHP semi-

préparative sans présence de TFA dans le système d’élution pour éviter toute ouverture du

cycle β-lactame, nous avons obtenu les peptides 79, 80 et 81 avec des rendements globaux

respectifs de 3, 3 et 10 %.


198

Peptide 79



Rendement : 3 %


3 mL.min-1).




NH

δ (ppm)

Hα

δ (ppm)

Hβ

δ (ppm)

Hγ

δ (ppm)

Hδ

δ (ppm)

Hε/ autres

δ (ppm)

β-Ala(1) - - - -

Leu (1) 8,21-8,28 4,35 1,55 1,45 0,85 -

Ala 8,11 4,28 1,17 - - -

β-lactame

8,21-8,28 - - - -

Haromatique: 7,20-

7,30

(D)Ile 7,93 4,22 1,70 1,65 0,85 0,79

Leu (2) 8,21-8,28 4,35 1,55 1,45 0,85 -

Thr 7,82 4,24 3,98 1,04 - -

Val 7,57 4,35 2,03 0,86 - -

Peptide 80



Rendement : 10 %


3 mL.min-1).


HN

NH

O

O

N (D)Ile-Leu-Thr-Val-OH

O

H-βAla-Leu

HN

NH

O

O

NH-βAla-Leu

O

(D)Ile-Leu-Thr-Val-OH


199

Peptide 81



Rendement : 3 %


3 mL.min-1).


4.2 Synthèse des peptidomimes 86, 87 et 88

La synthèse de ces peptides a été réalisée sur une résine de type Wang (0,65 mmol.g-

1). Après introduction des quatre premiers aminoacides (N-Fmoc valine, N-Fmoc-O-tert-

butyle thréonine, N-Fmoc leucine, N-Fmoc D-isoleucine) en mode manuel suivant le

protocole classique, la résine est partagée en 3 lots qui sont placés sur le synthétiseur

automatique. Après déprotection de l’amine terminale, une solution de β-lactame 76, 77 ou 78

(1,5 équiv.) dans le DMF (2 mL) est additionnée à chaque lot de résine suivie d’une solution

d’HBTU (1,5 équiv.) dans le DMF (1,5 mL) et d’une solution de DIEA (3 équiv.) dans le

DMF (500 µL). La réaction est laissée sous agitation mécanique toute la nuit (14 h). Après

lavage de chaque résine selon la procédure générale et déprotection de l’amine terminale, les

deux derniers acides aminés (N-Fmoc leucine et N-Boc β-alanine) sont introduits selon la

procédure générale.

Après lavage et séchage de la résine, la déprotection des chaînes latérales et le clivage

des peptides de la résine sont réalisés dans un mélange TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5, v/v/v)

pendant 4 h. Tous les peptidomimes sont ensuite précipités dans de l’Et2O à 0°C, filtrés,

dissout de nouveau dans un mélange eau/ACN et lyophilisés. Après purification par CLHP

semi-préparative, nous avons obtenu les peptides 86, 87 et 88 avec des rendements globaux

respectifs de 31, 8 et 32 %.

HN

NH

O

O

NH-βAla-Leu

O



200

Peptide 86



Rendement : 31 %


mL.min-1).




NH

δ (ppm)

Hα

δ (ppm)

Hβ

δ (ppm)

Hγ

δ (ppm)

Hδ

δ (ppm)

Hε/ autres

δ (ppm)

β-Ala(1) - 3,14;sous H2O pic - - -

Leu (2) 8,01 4,26 1,49 1,40 0,85 -

Ala 8,48 4,26 1,23 - - -

β-lactame 7,76 - - - -

Haromatique: 7,16-7,27

β-Ala(5): 7,76 (NH)

2,97 / 2,50 (CH2)

Ile 8,23 4,36 1,83 1,40 1,08 0,85

Leu (7) 8,23 4,43 1,49 1,40 0,85 -

Thr 7,96 4,26 3,96 1,01 - -

Val 7,68 4,16 2,04 0,85 - -

H-βAla-Leu NH N

O

OHN


O


201

Peptide 87



Rendement : 8 %


mL.min-1).


Peptide 88



Rendement : 32 %


3 mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 962,7 [M+H]+

HRMS (ESI) calcd pour C47H80N9O12: 962,5926, mesuré 962,5906

HN

NH

O

O

HN

H-βAla-Leu

O


OH

HN

NH

O

O

HN

H-βAla-Leu

O


OH


202

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Chapitre 5 Modification du peptide Tax : Insertion d’un motif urée en partie centrale

Chapitre 5 : Modification du peptide Tax : Insertion d’un motif urée en partie centrale

211

Préambule

La finalité de ce projet de recherche concernant la synthèse de peptidomimes

d’antigènes peptidiques naturels serait d’obtenir, à terme, un squelette central unique qui

pourrait très facilement être adapté à diverses cibles. En conservant les résidus ancres du

peptide naturel, nous pourrions introduire cette plateforme centrale entièrement organique et

l’orner de différents motifs afin qu’ils soient présentés aux récepteurs des lymphocytes T.

Les différents projets développés autour du peptide ELA ont eu pour but d’initier cette

approche ambitieuse. Dans ce chapitre, une nouvelle étape est franchie puisqu’il traite de la

synthèse de peptidomimes du peptide Tax, un antigène viral présenté par le même CMH-I

HLA-A2 que le peptide ELA .

I. Le peptide antigénique HTLV-1 Tax

1.1 Identification du peptide Tax

Les virus sont des parasites qui intègrent des cellules saines afin d’utiliser leur

machinerie pour se développer dans un organisme. Le virus T-lymphotropique Humain de

type I (HTLV-I pour « Human T-Lymphotropic Virus type I ») est un rétro-virus, c’est-à-dire

un virus à ARN qui utilise l’enzyme transcriptase inverse pour se répliquer en ADN. Cet

ADN viral intègre alors l’ADN de la cellule hôte afin d’être répliqué jusqu’à la mort de la

cellule. Ce virus est responsable de leucémie lymphoïde T chez l’adulte mais serait également

responsable de la neuromyélopathie, une maladie générant des troubles neurologiques et

neuro-inflammatoires chroniques.1

Il a été démontré que des lymphocytes T cytotoxiques CD8+, issus de patients porteurs

de ce virus, agissaient sur des cellules exprimant différentes protéines du virus HTLV-I.

Parmi ces protéines, la protéine Tax, responsable de la régulation de l’expression du virus, a

été étudiée afin d’identifier des fragments peptidiques pouvant être présenté à la surface des

cellules par un CMH-I.

Par la suite, des travaux ont permis d’identifier de potentiels fragments peptidiques,

épitopes de cette protéine. Dans le cas de peptides spécifiques au CMH-I HLA-A2, Utz et al.

ont montré que l’octamère LFGYPVYV était la séquence minimale pour induire une réponse

immunitaire.2 Une étude plus développée de la moitié N-terminale de la protéine Tax a été

réalisée.3 Cette moitié de protéine a été fragmentée en plusieurs peptides de vingt-quatre

résidus. Les cellules présentant l’épitope Tax1-24 en leur surface sont les cellules


212

principalement détruites. On peut noter que cette séquence contient l’octamère cité

précédemment. Dans un deuxième temps, un criblage de cet épitope Tax1-24 a été réalisé en

synthétisant des peptides répondant le mieux aux critères de « bon peptide » liant le CMH

HLA-A2, c’est-à-dire possédant un acide aminé hydrophobe en position P2 et P9 et d’une

longueur ne dépassant pas une dizaine d’acides aminés. Différents nonamères et un octamère

furent évalués pour leur capacité à générer une réponse immunitaire. Deux nonamères Tax10-18

et Tax11-19 (Tax) de séquence respective SLLFGYPVY et LLFGYPVYV ont été identifiés, le

second générant une réponse un peu plus forte que le premier. Pour finir, une troisième étude

comparant l’octamère LFGYPVYV de la première étude2 au nonamère LLFGYPVYV a mis

en évidence la plus grande efficacité du nonamère à déclencher une réponse immunitaire des

lymphocytes T CD8+ (Figure 5.1).4

H2NHN

O

NH

O HN

HN

O

O

OH

N

O NHO

HN

O

OH

NHO

OH

O

Peptide Tax

Figure 5.1. Structure du peptide antigénique Tax.

1.2 Etude structurale du peptide Tax

1.2.1 Etude du complexe binaire Tax/HLA-A2

La première étude du complexe binaire Tax/HLA-A2 a été réalisée en parallèle avec

quatre autres complexes de peptides viraux.5 Comme de nombreux peptides antigéniques, le

peptide Tax adopte une conformation étendue, avec la partie centrale qui s’extériorise du

sillon de liaison du CMH-I (Figure 5.2). Ce peptide présente naturellement les deux résidus

ancres favorables à une bonne interaction du peptide avec le HLA-A2, à savoir une leucine en

position P2 et une valine en position P9.


213

Figure 5.2. Structure cristalline du peptide Tax en complexe avec le CMH-I HLA-A2 (PDB 1HHK).

Les données cristallographiques (PDB 1HHK) obtenues avec le peptide Tax complexé au

HLA-A2 montrent un réseau de liaisons hydrogène similaire à celui de ELA avec l’acide

glutamique 63 et la lysine 66. On peut également noter une liaison hydrogène entre la tyrosine

159 et le carbonyle de l’acide glutamique. Côté C-terminal, la liaison hydrogène entre l’acide

aspartique 77 et le groupement NH de la liaison amide P8-P9 est également présente. De plus,

la phénylalanine en position P3 et la valine en position P7 sont des résidus ancres dits

secondaires. Le positionnement de la phénylalanine permet la formation d’une liaison

hydrogène entre la tyrosine 99 et l’azote de la fonction amine de la phénylalanine et des

interactions de stacking entre le cycle aromatique de la phénylalanine et les tyrosines 99 et

159 (Figure 5.3).

Figure 5.3. Zoom sur les extrémités N- et C- terminales de la structure cristalline du peptide Tax : mise en évidence des liaisons hydrogènes entre le peptide Tax et les chaînes latérales des résidus du site de fixation du HLA-A2.


214

La valine en position P7 participe à des interactions hydrophobes avec les différents résidus

qui l’entourent. Les résidus de la partie centrale s’extériorisent du sillon de fixation. En

particulier, la tyrosine en position P5 pointe vers l’extérieur du site de fixation afin d’être

reconnue par les récepteurs des lymphocytes T.

1.2.2 Etude de complexes ternaires TCR/Tax/HLA-A2

Deux structures de complexe ternaire TCR/Tax/HLA-A2, possédant différents TCR, ont été

rapportées dans la littérature : le complexe TCR A6/Tax/HLA-A2 6 et le complexe TCR

B7/Tax/HLA-A2.7

Comparaison globale des TCR A6 et B7

Le domaine Vβ de ces deux TCR est issu du même gène alors que le domaine Vα ne

l’est pas. Cette différence va avoir des conséquences sur la reconnaissance du complexe

binaire Tax/HLA-A2.

Lorsque la superposition des deux complexes s’effectue à partir de la chaîne α du

HLA-A2, on peut voir que, globalement, chaque TCR s’oriente diagonalement sur le

complexe Tax/HLA-A2 (Figure 5.4a). En revanche, les domaines Vα d’une part et Vβ d’autre

part (Figure 5.4b), sont superposables d’un TCR à l’autre, mais ils ne le sont pas lorsque les

HLA-A2 sont alignés (rotation des deux domaines). En particulier, dans le cas du TCR B7, le

domaine Vβ est plus proche du CMH-I que dans le cas du TCR A6, ce qui entraîne de

nouvelles interactions entre le HLA-A2 et le TCR B7.

Figure 5.4. a) Superposition des structures cristallines des complexes ternaires TCRA6/Tax/HLA-A2 (PDB 1AO7) et TCR B7/Tax/HLA-A2 (PDB 1BD2) par rapport à la chaîne α du HLA-A2. b) Superposition des domaines VβA6 et VβB7.

VββββB7

VααααA6

HLA-A2 superposé

VββββA6

VααααB7

VααααB7

VααααA6

VββββB7

VββββA6

a) b)


215

Bien que les deux TCR présentent des différences significatives, que ce soit dans leur

séquence ou dans leur structure, ils reconnaissent le même complexe binaire Tax/HLA-A2.

Dix-sept résidus du TCR B7 sont impliqués dans la reconnaissance du complexe binaire

contre vingt dans le cas du TCR A6. Treize positions similaires sont impliquées dans cette

reconnaissance mais un seul résidu interagissant avec le complexe binaire est commun au

deux TCR.7

Focalisation sur le complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A26

La structure cristalline du complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 est la première

structure de complexe ternaire impliquant un TCR, un peptide et un CMH-I à avoir été

résolue (Figure 5.5).

Figure 5.5. Structure cristalline du complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 : mise en évidence du positionnement diagonal du TCR sur le site de fixation du HLA-A2 (pdb 1AO7).

Le TCR A6 s’oriente diagonalement par rapport au site de liaison du HLA-A2 (Figure 5.5):

les boucles CDR2α et β sont respectivement en contact avec les hélices α2 et α1 alors que les

boucles CDR1 et CDR3 des domaines α et β interagissent principalement avec le peptide

antigénique. Plus spécifiquement, la boucle CDR1α se positionne sur la partie N-terminale du

peptide (de l’amine terminale à la tyrosine en position P5) et la boucle CDR1β est située au

dessus de la partie C-terminale jusqu’à la tyrosine en position P8. Les boucles CDR3α et β

englobent la tyrosine en position P5 du peptide Tax (Figure 5.6).

90°

Vββββ

Vαααα

Vαααα

Vββββ

Chaîne lourde α α α α


HLA-A2

TCR

Peptide antigénique

αααα2

αααα1


216

Figure 5.6. Positionnement des différentes boucles du TCR A6 au-dessus du site de fixation du complexe binaire peptide Tax/HLA-A2.

Comparaison de la structure du peptide Tax dans le complexe binaire Tax/HLA-A2 avec celle

dans le complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 6

Globalement, les conformations du peptide Tax dans le complexe binaire ou ternaire

sont proches : les parties N- et C-terminales interagissent avec le HLA-A2 alors que la

tyrosine centrale pointe vers le TCR A6. Toutefois, la présence du TCR induit des

changements significatifs dans le positionnement du peptide Tax. D’une part, le peptide est

poussé plus en profondeur dans le sillon de liaison au HLA-A2. D’autre part, la proline en

position P6 subit ce même effet d’écrasement, ce qui entraîne un changement d’orientation de

la chaîne latérale de la valine en position P7. Plutôt que de s’orienter vers le « plancher » du

sillon de liaison du HLA-A2, cette chaîne s’oriente vers l’extérieur du site de liaison du HLA-

A2 (Figure 5.7).

Figure 5.7. Comparaison de la structure cristalline du peptide Tax dans le complexe binaire Tax/HLA-A2(PDB 1HHK) dans le complexe ternaire TCR A6/Tax/HLA-A2 (PDB 1AO7).


217

II. Modification de la partie centrale du peptide Tax

2.1 Etude bibliographique des modifications précédemment réalisées par

l’équipe du Pr B. M. Baker

Comme présenté précédemment, le peptide Tax a fait l’objet de nombreuses études

structurales. Par la suite, du fait des nombreuses données accessibles sur ce peptide et de sa

capacité à lier le HLA-A2, ce peptide fut modifié afin d’étudier la réactivité croisée des

lymphocytes T, c’est-à-dire la capacité d’un lymphocyte T, au travers de son récepteur, à

reconnaître un peptide antigénique différent du peptide naturel.8 Les modifications furent

apportées au niveau de la partie centrale. La tyrosine en position P5 fut substituée par une

lysine dont la chaîne latérale sert de point d’ancrage de différents haptènes. Chaque peptide

portant un haptène fut capable de stimuler au moins un clone de lymphocyte T restreints au

CMH-I HLA-A2, alors que le peptide modifié mais ne portant pas d’haptène n’a engendré

aucun réponse immunitaire. Parmi les candidats étudiés, le peptide Tax-5IBA portant une

lysine en position P5 (Figure 5.8) sur laquelle est couplé l’acide indolyl-butyrique (IBA) a

ensuite été cristallisé en complexe avec le TCR A6 et le CMH-I HLA-A2.9

NH

NHO

Pro-Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe-Gly

NH

Tax-5IBA

Figure 5.8. Structure du peptide Tax-5IBA .

Bien que ce peptide porte un motif aromatique en partie centrale comme dans le cas du

peptide natif, le bras séparant le motif indole du carbone Cα est bien plus long. Ceci va avoir

des conséquences sur l’approche des TCR. En effet, le peptide modifié est capable de stimuler

le clone RS56 mais de façon dix à cent fois moins efficace que le peptide natif Tax. La

structure cristalline du complexe binaire peptide Tax-5IBA/HLA-A2 a été obtenue avec une

résolution à 1,7 Å et montre une conservation correcte du squelette peptidique par rapport au

peptide Tax natif puisque le RMSD est de 0,1 Å (Figure 5.9). En revanche, alors que le

positionnement de la tyrosine du peptide Tax est parfaitement défini, dans le cas du peptide

Tax-5IBA, aucune densité électronique n’est détectée pour le groupement IBA, la densité de


218

la chaîne latérale Lys-IBA s’arrêtant à la position ε. Ces observations indiquent que la chaîne

portée en position P5 est soit trop mobile, soit adopte plusieurs conformations distinctes.

Figure 5.9. Superposition des structures cristallines des peptides Tax (en jaune) et Tax-5IBA (en bleu) dans le complexe peptide /HLA-A2 (PDB 1HHK et 2GIT).

La structure cristalline du complexe ternaire TCR A6/Tax-5IBA/HLA-A2 a

également été élucidée avec une résolution à 2,6 Å (Figure 5.10). A l’opposé du complexe

Tax-5IBA/HLA-A2, ici, la chaîne latérale Lys-IBA est parfaitement définie. En effet, la

reconnaissance par le complexe ternaire permet de stabiliser sa conformation. Au niveau de la

liaison peptidique entre la lysine et le motif IBA, cette chaîne se replie de telle sorte que le

motif indole pointe vers l’hélice α2 du HLA-A2. Cette chaîne permet de créer de nouvelles

liaisons hydrogène à la fois avec le récepteur A6 et avec le HLA-A2. D’une part, la liaison

peptidique liant la lysine et le motif IBA est engagée dans trois liaisons hydrogène avec le

TCR A6. Une liaison hydrogène est également présente entre l’azote du motif indole et la

glutamine 155 de l’hélice α2 du HLA-A2.

Figure 5.10. Structure cristalline du peptide Tax-5IBA au sein du complexe ternaire TCR A6/Tax-5IBA /HLA-

A2 (PDB 2GJ6).


219

La structure du complexe ternaire a permis de mettre en évidence la flexibilité ou plasticité du

TCR A6. Tel un soufflet, les boucles CDR3α et β du TCR s’étirent pour laisser suffisamment

de place à la chaîne latérale centrale du peptide.

La capacité de ce peptide Tax modifié à se lier au HLA-A2 ainsi que la capacité des

TCR à s’adapter à la partie centrale d’un peptide antigénique nous ont poussés à réaliser des

modifications plus importantes de la partie centrale de ce peptide Tax.

2.2 Présentation du projet

2.2.1 Design des peptidomimes du Tax

Afin de compléter ces travaux, nous avons choisi de modifier la partie centrale de ce

peptide pour étudier les complexes binaires, voire ternaires contenant les différents

peptidomimes synthétisés. Plus particulièrement, nous nous sommes intéressés à la

modification du tripeptide GYP central. Sur la base des résultats obtenus avec le peptide

ELA , nous avons imaginé introduire un motif urée en partie centrale du peptide Tax pour

rigidifier la conformation globale du peptide. La combinaison de ce motif au motif ortho-

aminométhylbenzyle mime correctement le repliement adopté par le peptide Tax au sein du

complexe ternaire TCR A6/Tax-5IBA/HLA-A2. Du fait du positionnement en ortho de la

fonction acide et du groupement aminométhyle, cet espaceur mime parfaitement le repliement

du squelette peptidique induit par la proline dans le cas du peptide natif. Nous avons

également voulu déterminer l’influence de cette fonction urée sur le repliement du peptide en

introduisant un motif meta-aminométhylbenzyle plutôt que ortho- aminométhylbenzyle.

D’autre part, nous avons vu que la chaîne latérale de la tyrosine en position P5

participe à de nombreuses liaisons hydrogène avec les récepteurs des lymphocytes T. Nous

souhaitons donc introduire divers motifs benzyliques portant des groupements hydroxyle ou

fluor en position para ou en position meta, car les résultats de modélisation moléculaire

mettent en évidence une bonne orientation de cette fonction entre les boucles CDR3α et β du

TCR (Figure 5.11).


220

H2N

HN

O

NH

O HN

O

NH

ON

O ONH

HN

O

NH

OOH

O

OH

OH

HN

O

N

O

HN

NH

O

HN

O OH

ONH

OHN

ONH

O

H2N

OH

X

Figure 5.11. Présentation des premières modifications envisagées sur la partie centrale du peptide Tax.

2.2.2 Objectif du projet

La réalisation de ce projet nécessitait la synthèse de différents peptidomimes du Tax

pour ensuite les étudier par cristallographie aux rayons X, en collaboration avec l’équipe du

Pr B. M. Baker. La synthèse de peptidomimes ne portant aucun groupement sur la partie

centrale du peptide permettrait de voir d’une part l’effet du motif urée et de l’AMBA (ortho

ou meta) sur la conformation globale du peptide et d’autre part, en comparaison des

peptidomimes portant un groupement sur la partie centrale, les modifications structurales que

ces motifs entrainent. De plus, en introduisant l’acide 2-aminométhylbenzoïque (o-AMBA)

ou le m-AMBA précédemment utilisé, nous souhaitions déterminer leur influence sur le

repliement du peptide. Enfin, la présentation de différents motifs benzyliques sur la partie

centrale permettrait de mieux comprendre les effets du motif sur les interactions avec les

récepteurs des lymphocytes T. Au total, quatorze peptidomimes du peptide Tax ont donc été

envisagés, chacun comportant le motif urée et alternativement le o-AMBA ou le m-AMBA

(Figure 5.12).

OH

F OH OHOHF

H

H-Leu-Leu-PheNH

HN N

O

RVal-Tyr(tBu)-Val-OH

O

R =

Urée simple

o-AMBAou

AMBA

Figure 5.12. Présentation des différentes structures ciblées.


221

III. Synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide Tax

3.1 Etude rétrosynthétique de la partie centrale des peptidomimes ciblés

La synthèse de ces différents peptidomimes est réalisée sur support solide. D’un point

de vue rétrosynthétique, le motif urée est formé à partir d’un dérivé N-

carboxyléthylènediamine et de l’amine secondaire supportée, elle-même issue d’une réaction

d’amination réductrice entre un aldéhyde en solution et une amine primaire supportée

(Schéma 5.1).

O

N

O

HN

NH

Fmoc

O

O

OH

X

X

Dérivé N-Fmoc-N'-(carboxy)éthylènediamine

Fmoc-HN

HN R

OAmine secondaire

supportée

Amine primaire supportée

X

H2N

NH

Schéma 5.1. Rétrosynthèse du squelette peptidomimétique envisagé.

Avant de présenter la synthèse des peptidomimes à proprement parler, la synthèse de

l’acide 2-(N-Fmoc) aminométhylbenzoïque (N-Fmoc o-AMBA) sera détaillée. Puis les

méthodes permettant d’accéder au différents peptidomimes seront explorées.

3.2 Synthèse de l’acide 2-(N-Fmoc) aminométhylbenzoïque

La synthèse de cet acide aminé 89 a été réalisée en sept étapes à partir de l’acide

ortho-toluïque (Schéma 5.2). Dans un premier temps, nous avons protégé la fonction acide

par un ester tert-butylique. Pour cela, le chlorure d’acide 90 a été préparé puis engagé avec du

tert-butanol en milieu basique, pour fournir l’ester tert-butyrique 91 correspondant avec un

rendement de 60 %. Ensuite, nous avons réalisé une bromation radicalaire afin d’introduire

sélectivement le brome sur la position benzylique. Le produit attendu 92 a été obtenu en

majorité en mélange avec le produit de départ 91, les rapports frontaux de ces deux produits

étant trop proches pour qu’ils puissent être séparés par chromatographie flash sur gel de silice.

Toutefois, en se basant sur le spectre RMN 1H de ce mélange et la quantité obtenue, un taux

de conversion de 61 % a été calculé. Ce mélange a ensuite été mis en solution avec de

l’azoture de sodium pour réaliser une substitution nucléophile d’ordre 2 sur le brome et


222

fournir le produit 93, toujours en mélange avec le produit 91. La fonction azoture a ensuite été

réduite par réaction de Staudinger en présence de méthanol. L’isolement de cette amine étant

assez difficile, nous avons directement traité le brut réactionnel avec du Fmoc-OSu en milieu

basique pour obtenir l’amine protégée 94, qui a pu être purifiée et séparée du produit 91.

Enfin, par traitement au TFA et recristalisation dans de l’éther de pétrole, le N-Fmoc o-

AMBA 89 a été obtenu sous forme de solide blanc avec un rendement global de 16 % sur sept

étapes.

O OH O Cl O O-tBu O O-tBu

Br

O O-tBu

N3

O O-tBu

NH-Fmoc

O OH

NH-Fmoc

Cl

OO

Cl

toluène anhydre

tBu-OH, Py NBS, AIBN, CHCl3

NaN3, DMSO

1- PPh3, MeOH anhydre

2- Fmoc-OSu, DIEA, THF anhydreTFA

93%90 91 60 % 92

88

88

939489

61 %

( )

( )

quantitatif86 % 56 %

Schéma 5.2. Synthèse de l’acide ortho-(N-Fmoc) aminométhylbenzoïque 89 en sept étapes.

3.3 Synthèse de peptidomimes du Tax sur un support solide de type Wang

Afin de modifier la partie centrale du peptide Tax, nous avons choisi de synthétiser les

différents peptidomimes sur un support solide de type Wang, en stratégie Fmoc.

L’introduction du premier aminoacide (la valine) se fait selon la méthode des anhydrides

symétriques. Puis, les deux aminoacides suivants, la N-Fmoc-O-tert-butyl-tyrosine et la N-

Fmoc-valine sont introduits selon les conditions de couplage classique. Puis, le o-AMBA ou

m-AMBA est couplé de la même façon. Nous obtenons alors deux résines B et C qui vont être

engagées dans la réaction d’amination réductrice (Figure 5.13).

Val-Tyr(tBu)-ValFmoc-HN

O

Val-Tyr(tBu)-Val

OFmoc-HN

Résine B Résine C

Figure 5.13. Présentation des deux résines à notre disposition : les résines B et C.


223

Afin de mieux comprendre la spécificité réactionnelle de chaque motif porté en partie

centrale, la suite de cette partie est articulée autour de la synthèse des différents peptidomimes

ciblés.

3.3.1 Synthèse des peptidomimes ne portant pas de motif benzylique

en partie centrale : Focalisation sur la synthèse du motif urée

Synthèse du précurseur d’urée : le carbamate de succinimide

Il existe différentes méthodes de synthèse de motif urée rapportées dans la littérature.

Le schéma 5.3 présente deux voies de synthèse mettant en jeu une amine secondaire et un

précurseur d’urée.

N N

OR3

R4

R1

R2

N C OR1 R3

HN

R4

Isocyanates

R2 = HN O

OR1

R2

RR3

HN

R4

Carbamates

Schéma 5.3. Présentation de deux voies de rétrosynthèse permettant d’accéder au motif urée souhaité.

Les isocyanates sont des molécules organiques portant une fonction N=C=O

généralement très réactive. En effet, le carbone d’hybridation sp de cette fonction étant un très

bon électrophile, un nucléophile peut très rapidement s’additionner sur celui-ci. En particulier,

l’addition d’une amine primaire ou secondaire sur cette espèce permet d’aboutir à l’urée di-

ou tri-substituée correspondante avec de très bons rendements. Toutefois, étant très réactive

vis-à-vis de nombreux nucléophiles, et donc peu stable, il est préférable de générer cette

espèce in situ. Le phosgène (ou dichlorure de méthanoyle) est un gaz qui a longtemps été

utilisé du fait de son efficacité et de sa facilité de production pour la synthèse d’isocyanate.

Toutefois, ses propriétés toxiques ont mené les chimistes à mettre au point d’autres sources de

phosgène, dont le triphosgène à l’état cristallin à température ambiante. Leur efficacité pour la

synthèse d’urées di- et tri-substituées a fait ses preuves.10

Les isocyanates peuvent également être générés in situ par le réarrangement de Curtius

et d’Hofmann. Le réarrangement de Curtius correspond à une dégradation thermique

d’azotures carboxyliques fournissant directement l’isocyanate correspondant (Schéma 5.4).


224

R N

ON

N ∆-N2

O C N RR'R''NH

HNN

ORR'

R''

Schéma 5.4. Mécanisme du réarrangement de Curtius.

Le réarrangement d’Hofmann permet de convertir une amide en isocyanate. Puis, l’aminolyse

de cette espèce permet d’obtenir l’urée disymmétrique di- ou tri-substituée (Schéma 5.5).

R NH2

OBr2 O C N R R'R''NH

HNN

ORR'

R''

R NHBr

ONaOH

NaOHR N-Br

O

Schéma 5.5. Présentation du réarragement d’Hofmann.

La faible stabilité des isocyanates ne les rend pas très intéressant pour être utilisé sur support

solide. Alors qu’en solution l’addition de l’amine sur l’isocyanate se fait in situ et en

conditions inertes, dans le cas de la synthèse sur support solide, cette addition demande plus

de manipulations de cette molécule. En revanche, ils peuvent être utilisés pour la synthèse de

précurseurs d’urée plus stables, tel que des carbamates.

Dans le cadre de notre projet, nous avons choisi de travailler à partir de carbamates de

4-nitrobenzène. La préparation de ce carbamate a été réalisée en quatre étapes à partir de la N-

Fmoc β-alanine. En présence d’éthylchloroformate et de N-méthylmorpholine (NMM) dans le

THF à -13°C, l’anhydride mixte correspondant est formé. L’addition de sel d’azoture permet

alors de générer l’azoture 3-(N-Fmoc) aminopropanoïque 95. Le chauffage à 70°C du brut de

cet azoture carboxylique 95 fournit, par un réarrangement de Curtius, l’isocyanate qui est

alors piégé in situ par le 4-nitrophénol pour fournir le carbamate 96 (Schéma 5.6).

Fmoc-HN OH

Oa)

b) NaN3, H2OFmoc-HN N3

O

Fmoc-HN

HN O

O

c) Toluène, 70°C d) NMM, t.a.

59 %95 96

EtO Cl

O

NMM, THF, -13°C

97 % NO2HO NO2

Schéma 5.6. Synthèse du dérivé 3-(N-Fmoc) aminoéthyl carbamate de 4-nitrobenzène 96.

Synthèse du peptidomime 94 : Validation de la synthèse d’urée sur support solide

La résine B, après déprotection de l’amine terminale, a été engagée dans la synthèse

du motif urée en présence du motif 93. Les trois derniers aminoacides sont couplés tour à tour

de façon classique. Enfin, le peptide est clivé du support dans un milieu TFA/H2O/TIS

(95:2,5:2,5 v/v/v). Après purification par CLHP semi-préparative, le peptidomime 97 est


225

obtenu avec un rendement de 4 % (Figure 5.14). Ce faible rendement est principalement dû à

des problèmes de purification.

H2NNH

O

O

HN

O

NH

HN

HN

O

HN

O

NH

OHN

O

OH

O

OH

97 4%

Figure 5.14. Structure du peptide 97.

3.3.2 Synthèse de peptidomimes portant un motif benzyle ou

fluorobenzyle en partie centrale

La réaction d’amination réductrice

Le groupement benzylique est introduit sur l’amine primaire supportée par réaction

d’amination réductrice, fournissant l’amine secondaire correspondante. Afin d’éviter la

formation de l’amine tertiaire qui serait issue d’une seconde réaction d’amination réductrice

sur l’amine secondaire, nous avons réalisé cette synthèse en deux temps. Tout d’abord,

l’amine libre supportée est mise en présence d’une solution d’aldéhyde contenant 2% d’acide

acétique afin de former l’iminium correspondant sur le support. Après filtration, une solution

de triacétoxyborohydrure de sodium est ajoutée pour fournir l’amine secondaire souhaitée.

Cette réaction a tout d’abord été réalisée sur la résine B avec le benzaldéhyde, le 3-

fluorobenzaldéhyde et le 4-fluorobenzaldéhyde. Quelques milligrammes de chaque résine ont

été clivés puis chaque brut a été analysé par CLHP. Les trois essais fournissent le produit

attendu avec un taux de conversion de 80 à 90 % (Schéma 5.7).


226

H2N Val-Tyr(tBu)-Val

O OHDMF, 2%AcOH

B

X

2- NaBH(OAc)3, DMF

1-

NH

Val-Tyr(tBu)-Val

O

X

X = H ou F

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

13

.05

3

86

.94

7

Schéma 5.7. Réaction d’amination réductrice sur support solide, réalisée en deux temps et profil CLHP du brut obtenu pour X = H (Remarque : le dédoublement des pics est dû à l’usure de la colonne utilisée).

Nous avons ensuite réalisé cette réaction sur la résine C avec le 4-fluorobenzaldéhyde.

A notre grande surprise, le produit obtenu correspond à l’amine primaire initiale. Cette

différence de réactivité est due au changement de position du groupement aminométhyle sur

le cycle aromatique. Cette diminution de réactivité ne peut donc être due qu’à une perte de

nucléophilicité de l’amine primaire. Nous avons donc pensé qu’une liaison hydrogène pouvait

éventuellement se former entre cette amine primaire et le carbonyle, malgré la formation d’un

cycle à sept chaînons. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons testé l’addition de chlorure

de lithium dans le milieu réactionnel, connu comme agent de dissociation de liaisons

hydrogène.11 Dans ces conditions, l’amine secondaire porteuse d’un motif 4-fluorobenzyle a

été obtenue majoritairement (Schéma 5.8).

Amine secondaire 87 %

Amine primaire 13 %


227

Val-Tyr(tBu)-Val

OH2N

Val-Tyr(tBu)-Val

Produit de départ majoritaire

OH

HN

C

Liaison hydrogène désactivant la réactivité de l'amine primaire

O

H

DMF, 2%AcOH

2- NaBH(OAc)3, DMF

1- F

O

H

DMF, 2%AcOH,2- NaBH(OAc)3, DMF

1- F

LiCl Val-Tyr(tBu)-Val

O

HN

F

Schéma 5.8. a) Présentation des différents essais de réaction d’amination réductrice sur la résine C et b) profil CLHP de la réaction sans LiCl (en rouge) ou avec LiCl (en violet). (Remarque : le dédoublement des pics est dû à l’usure de la colonne utilisée).

Ces conditions ont ensuite été appliquées à la réaction d’amination réductrice en présence de

benzaldéhyde et le 3-fluorobenzaldéhyde.

Pour conclure, la réaction d’amination réductrice, bien que triviale, s’est avérée plus

compliquée que prévu dans le cas de la résine C.

La synthèse du motif urée

Chaque résine a ensuite été engagée dans la synthèse du motif urée en présence du

carbamate de 4-nitrobenzène 96 et de DIEA dans la N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP). Dans le

cas de la résine C, il s’est avéré que l’utilisation de LiCl n’était pas nécessaire.

Pour finir, les trois derniers aminoacides ont été couplés pour fournir, après clivage du

peptide du support et purification par CLHP préparative, les peptides 98-103 avec des

rendements variant de 5 à 15 % (Figure 5.15). La conversion de la réaction d’amination

Amine secondaire [M+H]+ = 621,5

Amine primaire [M+H]+ = 513,5

a)

b)


228

réductrice et la formation du motif urée n’étant efficace « qu’à » 80/90 %, cela entraîne une

diminution du rendement. De plus, les variations de rendement d’un peptidomime à l’autre

sont principalement dues à des purifications plus ou moins efficaces.

H-Leu-Leu-Phe-NH

HN

O

N

O

Val-Tyr-Val-OH

R

O

Val-Tyr-Val-OH

N

R

O

HN

NH

H-Leu-Leu-Phe- R =

F

F

98 5% 99 10% 100 15%

101 13% 102 6% 103 8%

Figure 5.15. Structures des peptidomimes 98-103 obtenus.

3.3.3 Synthèse de peptidomimes portant un motif hydroxybenzyle en

partie centrale

Protection des différents motifs hydroxylés

Afin de synthétiser des analogues portant un motif 3-hydroxybenzyle, 4-

hydroxybenzyle et 3,4- dihydroxybenzyle sur la partie centrale, nous avons dans un premier

premier temps protégé les fonctions hydroxyles. Les deux phénols ont préalablement été

protégés par un groupement tert-butyle à partir de tert-butyltrichloroacétimidate et d’éthérate

de trifluoroborane tandis que le catéchol a été protégé par un groupement éthylorthoformate

pour fournir l’aldéhyde 53 comme décrit dans le chapitre 3. Le 3-tert-butoxybenzaldéhyde

104, le 4-tert-butoxybenzaldéhyde 105 ont respectivement été obtenus avec des rendements

de 74, 56 % (Schéma 5.9).

OH

OHHN

O

CCl3

tBu

OH

O tBu

BF3.Et2OTHF/Hexane

(1:1)

104(O-tBu en meta) 74%

105 (O-tBu en para) 56%

Schéma 5.9. Protection du 3- et du 4-hydroxybenzaldéhyde par un groupement tert-butyle.

Réaction d’amination réductrice sur support solide

Nous avons dans un premier temps travaillé avec la résine B portant le motif 3-

aminométhylbenzylamide côté N-terminal. Nous avons réalisé les mêmes étapes que dans le

cas des peptidomimes portant un groupement benzyle et fluorobenzyle sur la partie centrale.


229

Dans un premier temps, les aldéhydes 104, 105 et 53 ont été engagés dans la réaction

d’amination réductrice selon les conditions présentées précédemment, c'est-à-dire en deux

temps. Quelques milligrammes de résine ont été clivés dans une solution de TFA/H2O/TIS

(95 :2,5 :2,5) puis le surnageant a été analysé par CLHP et spectrométrie de masse pour

vérifier la complétion de cette étape : dans le cas des trois aldéhydes, l’amine secondaire est

majoritairement obtenue (Schéma 5.10).

H2N Val-Tyr(tBu)-Val

O

NH

Val-Tyr(tBu)Val

O

NH

Val-Tyr(tBu-Val

O

NH

Val-Tyr(tBu)-Val

O

O-tBu

O-tBu OO

O

a- 104, DMF, 2% AcOHb- NaBH(OAc)3, DMF



Résine B

Résine D

Résine E

Résine F

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

Schéma 5.10. a) Réaction d’amination réductrice entre la résine B et les aldéhydes protégés 104, 105 et 53 et b) profil CLHP du peptide après clivage de la résine E.

Synthèse du motif urée sur support solide

La réaction de synthèse du motif urée a donc été réalisée. Nous obtenons l’urée tri-

substituée dans le cas de la résine D, portant le motif 3-hydroxybenzyle sur la partie centrale,

c’est-à-dire avec la fonction phénol en meta par rapport à l’accrochage. Les trois derniers

aminoacides ont donc été couplés sur le support. Puis, après clivage du peptidomime de la

Amine secondaire 79 %

Amine primaire 21 %

a)

b)


230

résine et purification par CLHP semi-préparative, le peptidomime 106 a été obtenu avec un

rendement de 8 % (Schéma 5.11)

H-Leu-Leu-Phe-HN

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

OH

NH

Val-Tyr(tBu)-Val

O

O-tBu

Résine D

1- Fmoc-HN

HN O

ONO2

DIEA, NMP

2- DMF/Pipéridine (80:20)3- Fmoc-aa-OH, HBTU, DIEA, DMF4- TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

96

x 3

106 8%

Schéma 5.11. Synthèse du peptidomime 106.

La même stratégie de synthèse a été utilisée pour générer le peptidomime 107 à partir

de la résine C avec à nouveau le motif 3-hydroxybenzyle, à la seule différence que du

chlorure de lithium a été ajouté au milieu durant la réaction d’amination réductrice. Cet

analogue a été obtenu avec un rendement de 16 % (Figure 5.16).

N

Val-Tyr-Val-OH

O

HN

O

NH

H-Leu-Leu-Phe

OH

107 16%


Les deux autres résines E et F ont subi les mêmes conditions de préparation de l’urée

que la résine D. Pourtant, le surnageant issu du clivage de quelques milligrammes de résine ne

contient pas le produit attendu mais un produit dont l’analyse par spectrométrie de masse

électrospray donne une valeur de [M+H]+ = 821,2. Ceci correspond à l’urée di-substituée 108

qui ne porte pas de motif benzylique en partie centrale (Schéma 5.12). Après réflexion et

étude bibliographique, nous sommes arrivés à la conclusion que, bien qu’étant


231

temporairement protégés, ces motifs se comportent comme des groupements para-

méthoxybenzyle, utilisés comme protection d’amide. Ceci a été confirmé par d’autres essais

avec un motif 4-méthoxybenzyle ou 4- allyloxybenzyle.

Fmoc-HN

HN

HN

O

Val-Tyr-Val-OH

O

1- Fmoc-HN

HN O

ONO2

DIEA, NMP

2- TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5)

96

NH

Val-Tyr(tBu)-Val

O

O-tBu

Résine E

NH

Val-Tyr(tBu)-Val

O

OO

O

Résine F

108

Schéma 5.12. a) Essais de synthèse de l’urée tri-substituée sur les résines E et F et b) profil CLHP de l’urée 108.

Dans la littérature, ce type de clivage a été observé et utilisé pour la protection

d’amide par des groupements 4-méthoxybenzyle (PMB). Chida et al. utilisèrent ce mode de

protection dans la synthèse totale de la (+)-lycoricidine (Schéma 5.13a),12 et Smith et al. pour

la synthèse totale de la (+)-hytachimicine (Schéma 5.13b).13 Dans ces deux exemples, ce

groupement est conservé tout au long de la synthèse de la molécule.

O

O N

O

OAc

OAc

OAc

O-Me

1- TFA-CHCl3 (1:1), t.a., 15h

O

O NH

O

OH

OH

OH

N

OH

MeO

OH O OH

PhH H

N

OH

MeO

OH O OH

PhH

MeO

TFA, t.a. 2h30

a)

b)

(+)- hytachimicine

2- MeONa, MeOH, t.a.

(+)-lycoricidine

Schéma 5.13. Exemples de clivage du groupement PMB sur une liaison amide, en présence de TFA.

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

Urée 108 [M+H]+ = 821,4

b)

a)


232

La sensibilité à des conditions acides d’urées substituées a également été observée par

Claudon et al.14 Ils voulurent synthétiser sur support solide un oligomère d’urées possédant un

motif urée côté C-terminal. Ils choisirent de travailler en stratégie Boc avec la résine 4-

méthylbenzhydrylamine (MBHA) qui se clive classiquement en présence d’ion fluorure.

Après accrochage du premier synthon et donc formation d’un lien urée entre la résine et le

substrat, la déprotection du groupement Boc par du TFA ou de l’acide chlorhydrique 3M dans

le dioxane a mené dans les deux cas au clivage de la résine (Schéma 5.14a).

Dans notre cas, nous travaillons avec un motif urée (comme dans le second cas)

substitué par un motif alkyloxybenzyle (comme dans le cas des PMB). Un mécanisme du

clivage a donc été proposé (Schéma 5.14b).

NH

HN N

O O

OR

H+

NH

HN

HN

O O

TFA

b)

Me

NH

O

R-HN

Motif urée sur la résine MBHA

a)

TFAR-HN NH2

O

Schéma 5.14. Mécanisme de clivage en présence de TFA a) d’un motif urée sur une résine MBHA, b) de nos motifs urées portant un groupement alkyloxybenzyle.

Afin de pallier le clivage du groupement 4-alkyloxybenzyle dans le cas des résines E

et F, une nouvelle stratégie a été envisagée, évitant toute condition acide forte. Nous avons

donc changé de support solide et de groupement protecteur.

3.4 Synthèse sur support solide de type Amino-PEGA de peptidomimes du

Tax

3.4.1 Présentation et validation de la nouvelle stratégie de synthèse

Afin d’éviter l’instabilité de la fonction urée substituée par un groupement 4-alkyloxy

benzyle en milieu acide, nous avons décidé d’utiliser une résine amino-PEGA fonctionnalisée

avec le motif 4-hydrométhylbenzoate. Le choix de cette résine nécessitait l’utilisation de

nouveaux agents de protection de la chaîne latérale de la tyrosine en P8 et des différents

haptènes phénoliques ou catécholique que nous souhaitions introduire. Notre choix s’est


233

rapidement porté sur le groupement allyle dont la déprotection sur support solide était

maitrisée.

Le premier acide aminé, la valine, a donc été introduit en suivant la méthode de

couplage aux anhydrides symétriques. Puis les deux aminoacides suivants, à savoir la

thréonine protégée par un groupement allyle et la valine ont été couplées pour fournir la résine

G (Schéma 5.15).

NH

HN

O

O

O

OFmoc-HN

1- DMF/Pipéridine (4:1)2- N-Fmoc-Tyr(All)-OH, HBTU, DIEA, DMF3- DMF/Pipéridine (4:1)4- N-Fmoc-Val-OH, HBTU, DIEA, DMF

Fmoc-Val-Tyr(All)-Val-espaceurRésine G

H2N Val-Tyr(All)-Val-espaceur

O

Val-Tyr(All)-Val-espaceur

OH2N

Résine IRésine H

1- DMF/Pipéridine (4:1) 2- N-Fmoc m-AMBA-OH, HBTU, DIEA, DMF

1- DMF/Pipéridine (4:1) 2- 86, HBTU, DIEA, DMF

Fmoc -Val -espaceur

Schéma 5.15. Préparation de la résine Amino-PEGA modifiée G, puis des résines H et I .

Sur la résine G ont été ensuite accrochés soit l’acide 3-aminométylbenzoïque générant la

résine H, soit l’acide 2-aminométhylbenzoïque générant la résine I (Schéma 5.15). Ces

résines seront ensuite soumises aux conditions d’amination réductrice précédemment

présentée. Préalablement, il est nécessaire de protéger avec un groupement allyle les

aldéhydes à introduire sur le support puis de vérifier les conditions de déprotection de ce

groupement.

Protection des aldéhydes pour la réaction d’amination réductrice

De même que la tyrosine en P2, les deux aldéhydes impliqués dans la réaction

d’amination réductrice ont préalablement été protégés par un groupement allyle qui est

introduit sur le phénol et le catéchol à partir de bromure d’allyle en milieu basique. Cette

réaction de Williamson permet d’obtenir les aldéhydes 109 et 110 avec des rendements de 95

et 94 % respectivement (Schéma 5.16).


234

OH

H O

OH

H O

OH

Br

K2CO3, 60°CAcétone

O

H O

O

H O

O

109 95%

110 94%

Schéma 5.16. Protection du 4-hydroxybenzaldéhyde et du 3,4-dihydroxybenzaldéhyde par un groupement allyle.

Conditions de déprotection du groupement allyle

Trois conditions de clivage des groupements allyle sur support solide décrites dans la

littérature ont été envisagées. Ces trois conditions se basent sur le même mécanisme de

déprotection avec du palladium de degré d’oxydation zéro et un agent nucléophile capable de

piéger le carbocation allylique généré lors de la réaction de clivage (Schéma 5.17).15

Pd(PPh3)4 Y

Y(Ph3P)4Pd

Y

PdPh3P PPh3

Nu

Nu

Schéma 5.17. Mécanisme de clivage du groupement allyle avec du palladium tetrakis.

L’utilisation de tributylstannane16 comme agent nucléophile a été testé en parallèle de la

morpholine17 et du borohydrure de sodium.18 Les meilleurs résultats, à savoir la complétion de

la réaction et l’obtention du brut le plus propre, ont été obtenus avec la morpholine (Schéma

5.18).

Fmoc-HNNH

O

O

HN

O

O

O

1- DMF/Pipéridine (4:1)2- Pd(PPh3)4, morpholine, THF3- NaOH 0,1M

Résine G

H2NNH

O

OH

HN

O

O

OH

Taux de conversion = 61%

Schéma 5.18. Déprotection du groupement allyle sur support solide.


235

Ces conditions ont donc été utilisées pour la synthèse des différents peptidomimes. Afin de

vérifier les différentes conditions réactionnelles, les premiers essais de synthèse ont été

réalisés sur la résine H et avec l’aldéhyde 109.

3.4.2 Synthèse de peptidomimes sur la résine H

Synthèse du peptidomime portant un motif 4-hydroxybenzyle en partie centrale

En suivant l’exemple de la synthèse des peptidomimes sur la résine Wang, nous avons

initié la réaction d’amination réductrice en deux temps. Après déprotection de l’extrémité N-

terminale de la résine, l’aldéhyde en solution dans du DMF contenant 2% d’acide acétique est

additionné. Après deux heures d’agitation, la résine est rapidement filtrée puis une solution de

cyanoborohydrure de sodium dans du DMF est ajoutée et agitée toute la nuit. Quelques

milligrammes de résine ont ensuite été clivés pour vérifier la complétion de la réaction. Le

brut réactionnel présente deux pics majoritaires par CLHP. L’analyse de ce même échantillon

par LC/MS montre que le premier pic correspond à l’amine primaire initiale tandis que le

second correspond à l’amine secondaire souhaitée (Schéma 5.19).

H2N Val-Tyr(All)-Val

O

1- a) 108, DMF, 2% AcOH b) NaBH3CN, DMF, 2% AcOH2- NaOH (0,1M)

H2N NH

OHN

ONH

OOH

O

O-Allyl

NH

NH

OHN

ONH

OOH

O

O-Allyl

O-Allyl

Résine H déprotégée

Minutes

0 2 4 6 8 10 12

mA

U

-100

0

100

200

300

400

mA

U

-100

0

100

200

300

400

Amine primaireAmine secondaire

Schéma 5.19. Essai de réaction d’amination réductrice en deux temps.

Afin d’augmenter la proportion d’amine secondaire, nous avons réalisé cette réaction

en une seule étape. Pour cela, l’aldéhyde 109 et le cyanoborohydrure de sodium sont ajoutés

en même temps sur la résine H déprotégée. Après deux heures de réaction, la résine est filtrée

et lavée. Après clivage de quelques milligrammes de résine, l’analyse de brut révèle une


236

proportion de 70% d’amine secondaire pour 30% d’amine primaire. Cette deuxième méthode

a donc été conservée pour la suite de nos essais.

Le motif urée est ensuite synthétisé avec le carbamate 96 utilisé précédemment. Après

introduction des trois derniers aminoacides, le peptide est clivé du support avec une solution

de soude à 0,1M. Après neutralisation du surnageant et purification par CLHP semi-

préparative, le peptide 110 est obtenu avec un rendement de 6% (Figure 5.17).

NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

HO

110 6 %


A propos de la synthèse du peptidomime portant un motif 3,4-dihydroxybenzyle en partie

centrale

La même stratégie de synthèse sera prochainement appliquée pour obtenir le

peptidomime portant le motif catéchol à partir de la résine H, puis sur la résine I en tenant

compte des conditions utilisées dans la stratégie de synthèse sur résine Wang, c’est-à-dire en

utilisant du chlorure de lithium pour éviter toute liaison hydrogène.

Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà préparé une dizaine de dérivé du peptide

Tax incorporant en leur centre un espaceur de type urée fonctionnalisé par différents motifs

benzyliques. Une étude cristallographique est en cours de réalisation par l’équipe du Pr B. M.

Baker.


237

Conclusion

Au travers de ce chapitre, un nouveau peptide antigénique, le peptide viral Tax, a été

présenté. Après une introduction sur le peptide Tax et les différentes études

cristallographiques de complexe binaire et ternaire contenant ce peptide, les modifications

structurales envisagées pour ce peptide ont été exposées. Un motif urée associé à un synthon

de type 2- ou 3-aminométhylbenzyle sont introduits en partie centrale de ce peptide pour

rigidifier la conformation du squelette peptidique. De plus, différents motifs benzyliques ont

été introduits sur cette plateforme pour mimer la chaîne latérale de la tyrosine, acide aminé clé

pour la reconnaissance du peptide Tax par les TCR. De la première stratégie de synthèse

utilisant une résine acidolabile de type Wang, neuf peptidomimes 98-103, 106 et 107 ont été

générés, possédant un groupement benzyle, 3- ou 4-fluorobenzyle ou 3-hydroxybenzyle sur le

partie centrale. Puis, du fait des problèmes de clivage rencontrés dans le cas de groupements

benzyliques possédant une fonction hydroxyle sur le motif urée en milieu acide, une

deuxième stratégie de synthèse a été étudiée. Dans ce second cas, une résine basolabile

Amino-PEGA modifiée a été utilisée. Par cette deuxième stratégie, un nouveau peptidomime,

le 110 a été obtenu.

Grâce à la collaboration établie avec l’équipe de cristallographes du Pr B. M. Baker,

l’objectif de ce projet est d’obtenir la structure cristalline de ces différents peptidomimes en

complexe avec le CMH-I HLA-A2, voire en complexe ternaire avec le TCR A6. Aucune

étude d’affinité de liaison au HLA-A2 ni de stimulation de lymphocytes T spécifiques au Tax

n’a encore été réalisée. Les dix peptidomimes synthétisés sont actuellement en cours d’étude.


238

IV. Partie expérimentale 4.1 Synthèse des différents synthons organiques en solution

Chlorure d’acide ortho-toluïque (90)

Formule brute : C8H7OCl



A une solution d’acide ortho-toluïque (5 g, 36,72 mmol) dans le toluène anhydre (40 mL) est ajouté du chlorure d’oxalyle (6,407 mL, 73,45 mmol). La réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 4 h à température ambiante. Le solvant est ensuite évaporé sous vide pour fournir le chlorure d’acide 90 (5,290 g, 93 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 2,58 (s, 3H, CH3), 7,30 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 7,36 (t, J = 7,8 Hz, 1H, CH), 7,51 (t, J = 7,5 Hz, 1H, CH), 8,22 (d, J = 7,8 Hz, 1H, CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) 167,5 (Cq), 141,4 (Cq), 134,0 (CH), 133,9 (CH), 132,4 (Cq), 131,9 (CH), 126,3 (CH), 22,0 (CH3).

Ortho-méthylbenzoate de tert-butyle (91)




Au chlorure d’acide 90 (5,250 g, 33,96 mmol) est additionné de la pyridine (8,207 mL, 101,88 mmol) et le tert-butanol (9,669 mL, 101,88 mmol). La réaction est laissée sous agitation magnétique toute la nuit. Du DCM (20 mL) est ensuite additionné au milieu réactionnel et cette phase organique est lavée à l’eau distillée (2 x 30 mL), puis rapidement avec une solution de HClaq. 1M (1 x 30 mL), séchée sur Na2SO4 et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu obtenu est élué à l’éther de pétrole sur colonne d’alumine, puis après évaporation du solvant, nous obtenons le produit attendu 91 (3,895 g, 60 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,60 (s, 9H, 3 x CH3), 2,57 (s, 3H, CH3), 7,19-7,24 (m, 2H, 2 x CH), 7,33-7,38 (m, 1H, CH), 7,81 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 167,2 (Cq), 139,2 (Cq), 131,8 (Cq), 131,5 (CH), 131,3 (CH), 130,2 (CH), 125,6 (CH), 81,0 (Cq), 28,2 (CH3), 21,7 (CH3) ;

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 192,7 [M+H]+; 214,9 [M+Na]+; 384,9 [2M+H]+; 407,0 [2M+Na]+.

O Cl

O O-tBu


239

Ortho-bromométhylbenzoate de tert-butyle (92)

Formule brute : C12H15O2Br



A une solution de 91 (3 g, 15,60 mmol) dans du chloroforme de qualité CLHP (50 mL) sous argon est additionné le N-bromosuccinimide (2,916 g, 16,38 mmol) puis, avec précaution, l’AIBN (256 mg, 1,56 mmol). La réaction est chauffée à 65°C et laissée sous agitation magnétique pendant 4 h. La réaction est alors ramenée à température ambiante, ce qui génère la précipitation du dérivé succinimide. La solution est filtrée puis le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est ensuite purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec pour éluant un mélange AcOEt/cyclohexane (1:9) pour fournir le produit attendu 92 pur en faible quantité (220 mg) et un mélange du produit de départ 91 et du produit attendu 92 (2,347 g, 88/89, 6:94) (taux de conversion = 61 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,63 (s, 9H, 3 x CH3), 4,92 (s, 2H, CH2), 7,32-7,37 (m, 1H, CH), 7,40-7,45 (m, 2H, 2 x CH), 7,87 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 166,1 (Cq), 138,4 (Cq), 131,8 (CH), 131,5 (Cq), 131,4 (CH), 131,1 (CH), 128,4 (CH), 82,1 (Cq), 31,7 (CH2), 28,2 (CH3).

Ortho-azoturométhylbenzoate de tert-butyle (93)




A une solution de NaN3 (79 mg, 1,22 mmol) dans du DMSO (1 mL) sous agitation depuis 15 min est ajouté une solution de dérivé bromé 92 (220 mg, 0,81 mmol) dans le DMSO (4 mL). La réaction est laissée sous agitation pendant 3 h à température ambiante. De l’eau distillée est ensuite ajoutée au milieu réactionnel et cette phase aqueuse est extraite avec de l’Et2O (2 x 30 mL). Les phases organiques sont rassemblées, lavées successivement à l’eau distillée (3 x 30 mL) puis avec une solution de NaClsat. (1 x 30 mL), séchées sur Na2SO4 et le solvant est évaporé sous vide pour fournir le produit attendu 93 (284 mg, 99 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,61 (s, 9H, 3 x CH3), 4,79 (s, 2H, CH2), 7,36-7,41 (m, 1H, CH), 7,44-7,54 (m, 2H, 2 x CH), 7,93 (dd, J1 = 7,8 Hz, J2 = 1,2 Hz, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 166,1 (Cq), 136,5 (Cq), 132,0 (CH), 131,0 (Cq+CH), 129,7 (CH), 128,0 (CH), 81,9 (Cq), 53,1 (CH2), 28,2 (3 x CH3).

O O-tBu

Br

O O-tBu

N3


240

Ortho-(N-Fmoc)aminométhylbenzoate de tert-butyle (94)




A une solution d’azoture 93 en mélange avec l’ortho-méthylbenzoate de tert-butyle 91 (93/91, 94:6) (110 mg, 0,47 mmol) dans du tert-butanol distillé (6,1 mL) sous argon est additionné de la PPh3 (123 mg, 0,47 mmol). La solution est chauffée à 70°C pendant 1 h 30. Après retour à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide pour fournir une huile marron. Ce résidu, mis sous argon, est ensuite solubilisé dans du THF anhydre (7 mL). De la DIEA est

ajouté à la solution jusqu’à atteindre un pH=8 (243 µL, 1,41 mmol). On additionne alors le Fmoc-OSu (158 mg, 0,47 mmol) et la réaction est laissée sous agitation magnétique à température ambiante toute la nuit. Le solvant est ensuite évaporé sous vide, le résidu est repris dans l’AcOEt (70 mL) et cette phase organique est rapidement lavée avec une solution d’HClaq. 1M (1 x 50 mL), puis à l’eau distillée (2 x 50 mL) et avec une solution de NaClsat. (1 x 40 mL). Le solvant est évaporé sous vide pour fournir un résidu marron qui est ensuite purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec pour éluant un gradient de solvant AcOEt/cyclohexane (0:1 à 5:95). Après évaporation du solvant, nous obtenons une huile légèrement jaune correspondant à notre produit 94 (113 mg, 56 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,63 (s, 9H, 3 x CH3), 4,19-4,23 (m, 1H, CH), 4,36 (d, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 4,57 (d, J = 6,6 Hz, 2H, CH2), 5,92-5,96 (m, 1H, NH), 7,28-7,31 (m, 2H, 2 x CH), 7,36-7,41 (m, 3H, 3 x CH), 7,45-7,51 (m, 2H, 2 x CH), 7,57 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,75 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,91 (d, J = 7,91 Hz, 1H, CH);

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 166,9 (Cq), 156,4 (Cq), 144,0 (4 x Cq), 141,2 (Cq), 139,7 (Cq), 132,2 (CH), 131,1 (CH+Cq), 130,8 (CH), 130,5 (CH), 127,6 (2 x CH), 127,0 (2 x CH), 125,1 (2 x CH), 119,9 (2 x CH), 81,8 (Cq), 66,7 (CH2), 47,2 (CH), 44,3 (CH2), 28,2 (3 x CH3).

Acide Ortho-(N-Fmoc) aminométhylbenzoïque (89)




A l’ester tert-butylique 94 (1,229 g, 2,86 mmol) est additionné du TFA (7 mL). Le mélange est laissé 40 min sans agitation. Le TFA est ensuite évaporé sous vide. Le résidu obtenu est repris dans un minimum d’AcOEt, puis un grand volume d’éther de pétrole est ajouté. Le ballon est placé à -20°C toute la nuit. Le précipité obtenu est filtré, lavé avec de l’éther de pétrole glacé puis séché sous vide pour obtenir l’acide 89 pur (922 mg, 86 %) :

O O-tBu

NH-Fmoc

O OH

NH-Fmoc


241

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,22 (t, J = 6,9 Hz, 1H, CH), 4,39 (d, J = 6,9 Hz, CH2), 4,65 (s, 2H, CH2), 7,28-7,34 (m, 2H, 2 x CH), 4,37-4,42 (m, 4H, 4 x CH), 7,50-7,55 (m, 1H, CH), 7,66 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,81 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,99 (d, J = 7,8 Hz, 1H, CH) ;

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz) δ 177,8 (Cq), 165,9 (Cq), 153,4 (Cq), 150,4/150,3 (Cq), 141,6 (CH), 139,9 (CH), 138,6 (Cq), 137,1 (CH), 136,7 (CH), 136,6 (CH), 136,2 (CH), 134,9 (CH), 129,6 (CH), 74,8 (CH2), 56,4 (CH2), 51,8 (CH).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 396,2 [M+Na]+, 768,9 [2M+Na]+, 1141,4 [3M+Na]+. Azoture de -2-( N-Fmoc)aminoéthanoyle (95)

Formule brute: C18H16O3N47



Une solution, sous azote, de N-Fmoc β-Alanine (500 mg, 1,61 mmol) dans du THF anhydre

(5 mL) est refroidie à -13°C. Sont alors additionnés l’éthylchloroformate (167 µL, 1,77

mmol) et la N-méthylmorpholine (194 µL, 1,77 mmol). Ce mélange est agité pendant 20 min, à -13°C, puis le milieu est réchauffé jusqu’à -5°C. Une solution aqueuse (1 mL) de NaN3 (261 mg, 4,02 mmol) est ensuite additionnée et la réaction est laissée sous agitation pendant 15 min. La suspension blanche est alors solubilisée dans de l’AcOEt (20 mL) et cette phase organique est lavée avec une solution de NaClsat. (30 mL), séchée sur Na2SO4, filtrée et le solvant est évaporé sous vide. On obtient le produit 95 (524 mg, 97 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 2,60 (t, J = 5,7 Hz, 2H, CH2), 3,48 (q, J = 5,7 Hz, 2H, CH2), 4,21 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 4,41 (d, J = 6,6 Hz, 2H, CH2), 5,22 (m, 1H, NH), 7,32 (t, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,41 (t, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 179,2 (Cq), 156,2 (Cq), 143,6 (Cq), 141,2 (Cq), 127,6 (CH), 126,9 (CH), 124,9 (CH), 119,8 (CH), 66,7 (CH2), 47,0 (CH), 36,7 (CH2), 36,1 (CH2). 3-(N-Fmoc)aminoéthylcarbamate de 4-nitrobenzène (96)

Formule brute: C26H21O6N3



Une solution, sous azote, d’azoture acyle 95 (549 mg, 1,63 mmol) dans du toluène anhydre (15 mL) est chauffée à 70°C pendant 40 min ; on observe alors un dégagement gazeux. Après

NH

N3

O

O

O

NH

O

OHNO

O

NO2


242

refroidissement à température ambiante, le para-nitrophénol (227 mg, 1,63 mmol) puis la

triethylamine (68 µL, 0,49 mmol) sont ajoutés au milieu réactionnel ; on observe instantanément un précipité. La réaction est laissée sous agitation 20 min, puis le solide formé est filtré, lavé plusieurs fois au cyclohexane (5 x 30 mL) puis séché sous vide, fournissant ainsi le produit 96 (429 mg, 59 %) :

RMN 1H ((CD3)2CO, 300 MHz) δ 3,37-3,39 (m, 4H, 2 x CH2), 4,23 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 4,35 (d, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 6,69 (large d, J = 0,6 Hz, 1H, NH), 7,13-7,16 (m, 1H, NH), 7,29-7,34 (m, 2H, 2 x CH), 7,39-7,43 (m 4H, 4 x CH), 7,69 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 7,86 (d, J = 7,5 Hz, 2H, 2 x CH), 8,22-8,27 (m, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C ((CD3)2CO, 75,5 MHz) δ 158,5 (Cq), 155,3 (Cq), 155,3 (Cq), 146,5 (Cq), 149,1 (Cq), 143,1 (Cq), 129,5 (CH), 128,9 (CH), 127,0 (CH), 126,7 (CH), 124,0 (CH), 121,8 (CH), 68,0 (CH2), 49,1 (CH), 43,1-43 (CH2), 42,2 (CH2).

3-tert-butoxybenzaldéhyde (104)



Aspect : Huile jaune/brune

A une solution, sous azote, de 4-hydroxybenzaldéhyde (400 mg, 3,28 mmol) dans un mélange THF anhydre/cyclohexane (1:2, 15 mL) est additionné le tert-butyltrichloroacétimidate (1,461 mL, 9,19 mmol). Après 10 min d’agitation, de l’éthérate de trifluoroborane en quantité

catalytique (63 µL, 0,51 mmol) est ajouté. Après 6 h 30 d’agitation à température ambiante, la réaction est stoppée par addition de carbonate de sodium solide (3 équiv.). Le mélange est ensuite filtré et le filtrat est concentré sous vide. Le résidu obtenu est repris dans du cyclohexane (30 mL) et filtré de nouveau. Le filtrat est à nouveau concentré sous vide et le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec pour éluant un gradient de solvant AcOEt/cyclohexane (0:1 à 5:95). Après évaporation du solvant, nous obtenons le produit attendu 104 (584 mg, 74 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,38 (s, 9H, 3 x CH3), 7,25 (ddd, J1 = 1,2 Hz, J2 = 2 Hz, J3 = 7,8 Hz, 1H, CH), 7,43 (t, J = 7,8 Hz, 1H, CH), 7,49-7,50 (m, 1H, CH), 7,59 (dt, J1 = 1,2 Hz, J2 = 7,5 Hz, 1H, CH), 9,97 (s, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 300 MHz) δ 192,0 (CH), 156,2 (Cq), 137,5 (Cq), 130,3 (CH), 129,6 (CH), 125,1 (CH), 123,8 (CH), 79,3 (Cq), 28,8 (CH3).

O

OH


243

4-tert-butoxybenzaldéhyde (105)




A une solution, sous azote, de 4-hydroxybenzaldéhyde (500 mg, 4,09 mmol) dans un mélange THF anhydre/cyclohexane (1:2, 15 mL) est additionné le tert-butyltrichloroacétimidate (1,825 mL, 10,23 mmol). Après 15 min d’agitation, de l’éthérate de trifluoroborane en quantité

catalytique (78 µL, 0,61 mmol) est ajouté. Après 2 h 15 d’agitation à température ambiante, la réaction est stoppée par addition de carbonate de sodium solide (3 équiv.). Le mélange est ensuite filtré et le filtrat est concentré sous vide. Le résidu obtenu est repris dans du cyclohexane (30 mL) et filtré de nouveau. Le filtrat est à nouveau concentré sous vide et le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec pour éluant un gradient de solvant AcOEt/cyclohexane allant de 0:1 à 5:95. Après évaporation du solvant, nous obtenons le produit attendu 105 (407 mg, 56 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 1,44 (s, 9H, 3 x CH3), 7,09 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 x CH), 7,80 (d, J = 8,7 Hz, 2H, 2 x CH), 9,91 (s, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) δ 191,0 (CH), 161,7 (Cq), 131,2 (CH), 131,0 (Cq), 122,3 (CH), 79,9 (Cq), 28,9 (CH3).

4-allyloxybenzaldéhyde (109)




A une solution de 4-hydroxybenzaldéhyde (3544 mg, 2,90 mmol) dans l’acétone (50 mL) est

additionné du bromure d’allyle (502 µL, 5,80 mmol) et du carbonate de potassium (K2CO3, 801 mg, 5,80 mmol). Ce mélange est chauffé à 60°C pendant 2 h. Après être redescendu à température ambiante, le K2CO3, qui a précipité, est filtré et le filtrat est évaporé sous vide. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un mélange AcOEt/cyclohexane (1:9) pour fournir le produit attendu 109 (448 mg, 95 %) :

OH

O

O

OH


244

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,63 (dt, J1 = 5,4 Hz, J2 = 1,5 Hz, 2H, CH2), 5,33 (dq, J1 = 12 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H, CH2), 5,43 (dq, J1 = 17,1 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H, CH2), 5,99-6,12 (m, 1H, CH), 7,00-7,04 (m, 2H, 2 x CH), 7,81-7,85 (m, 2H, 2 x CH), 9,88 (s, 1H, CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 300 MHz) δ 190,7 (CH), 163,5 (Cq), 132,2 (CH), 131,9 (CH), 130,0 (Cq), 118,3 (CH2), 114,9 (CH), 68,9 (CH2);

LR-MS (ESI mode positif) m/z 163,3 [M+H]+, 325 [2M+H]+.

3,4-diallyloxybenzaldéhyde (110)




A une solution de 3,4-hydroxybenzaldéhyde (404 mg, 2,93 mmol) dans l’acétone (50 mL) est

additionné du bromure d’allyle (753 µL, 8,78 mmol) et du K2CO3 (1,213 g, 8,78 mmol). Ce mélange est chauffé à 60°C pendant 2 h. La réaction est laissée sous agitation toute la nuit puis le K2CO3, qui a précipité, est filtré et le filtrat est évaporé sous vide. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice avec comme éluant un mélange AcOEt/cyclohexane (1:9) pour fournir le produit attendu 110 (599 mg, 94 %) :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 4,67 (dt, J1 = 5,1 Hz, J2 = 1,5 Hz, 2H, CH2), 4,70 (dt, J1 = 5,1 Hz, J2 = 1,5 Hz, 2H, CH2), 5,31 (dq, J1 = 10,5 Hz, J2 = 1,2-1,5 Hz, 1H, CH2), 5,33 (dq, J1 = 10,7 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H, CH2), 5,45 (dq, J1 = 17,3 Hz, J2 = 1,5 Hz, 2 x 1H, 2 x CH2), 6,02-6,15 (m, 2H, 2 x CH), 6,98 (d, J = 8,4 Hz, 1H, CH), 7,42-7,45 (m, 2H, 2 x CH) ;

RMN 13C (CDCl3, 300 MHz) : 190,8 (CH), 153,9 (Cq), 148,8 (Cq), 132,7 (CH), 132,4 (CH), 130,1 (Cq), 126,5 (CH), 118,3 (CH2), 118,1 (CH2), 112,4 (CH), 111,5 (CH), 69,7 (CH2).

4.2 Synthèse des peptidomimes 97-103, 106-107 et 110

4.2.1 Première stratégie : Synthèse des peptidomimes 97-103, 106 et

107 sur la résine Wang

La synthèse a été réalisée sur une résine Wang chargée à 0,65 mmol.g-1. Le protocole

mis en oeuvre est le protocole classique de synthèse peptidique sur support solide. La N-Fmoc

glycine puis l’acide para-hydroxymethylboïque suivi des trois premiers acides aminés (la N-

Fmoc valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle tyrosine et à nouveau la N-Fmoc valine) ont été

introduits sur le support selon la procédure générale.

O

OH

O


245

Le N-Fmoc m-AMBA ou o-AMBA est ensuite couplé sur le support de la même façon

que décrit précédemment. Après déprotection du groupement Fmoc de l’amine terminale et

les lavages classiques, une solution à 0,25 M d’aldéhyde dans du DMF, 2 % AcOH est

additionnée à la résine. La réaction est laissée sous agitation 1 h 30 puis la résine est filtrée et

lavée rapidement avec une solution de DMF, 2 % AcOH (x 1). Une solution de NaBH(OAc)3

à 0,25 M dans du DMF est ensuite additionnée à la résine et cette réaction est laissée sous

agitation 3 h. L’excédent de réducteur est quenché par des lavages au MeOH (x 3), puis les

lavages classiques sont réalisés. La formation de l’amine secondaire est contrôlée par un test

au chloranil positif et un test au TNBS négatif. Une solution de carbamate 96 dans la N-

méthylpyrolidine anhydre à laquelle a été préalablement ajoutée une solution de DIEA dans le

même solvant est ensuite ajoutée à la résine et cette réaction est laissée sous agitation toute la

nuit. La formation du motif urée est controlée par un test au chloranil négatif. Après

déprotection de l’amine terminale, les trois derniers aminoacides (N-Fmoc phénylalanine, N-

Fmoc leucine x 2, 3 équiv.) sont couplés de façon classique. Après déprotection du dernier

acide aminé, le peptide est clivé du support en milieu TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5, v/v/v)

pendant 4 h, puis précipité dans l’éther à 0°C, filtré, dissout de nouveau dans un mélange

eau/ACN, 0,1%TFA et lyophilisé.

Peptide 97



Rendement : 4 %


mL.min-1).


Peptide 98



NH

HN

HN

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe


246

Rendement : 10 %


mL.min-1).


Peptide 99

Formule brute : C58H78N9O10F


Rendement : 10 %


mL.min-1).


Peptide 100



Rendement : 15 %


mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1080,4 [M+H]+, 1102,5 [M+Na] +.

Peptide 101



Rendement : 13 %

NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

F

NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

F

NH

HN N

O

HO-Leu-Leu-Phe

O Val-Tyr-Val-OH


247


mL.min-1).


Peptide 102



Rendement : 6 %


mL.min-1).


Peptide 103



Rendement : 8 %


3 mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1080,4 [M+H]+, 1102,4 [M+Na] +.

Peptide 106



NH

HN N

O

HO-Leu-Leu-Phe

O Val-Tyr-Val-OH

F

NH

HN N

O

HO-Leu-Leu-Phe

O Val-Tyr-Val-OH

F

NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

OH


248

Rendement : 8 %


mL.min-1).

LR-MS (ESI mode positif) : m/z 1078,4 [M+H]+, 1100,3 [M+Na]+, 540,3 [M+2H]2+.

Peptide 107



Rendement : 16 %


mL.min-1).


4.2.2 Deuxième stratégie : Synthèse du peptidomime 110 sur la résine

amino-PEGA

La synthèse de ces peptides a été réalisée sur une résine de type Amino-PEGA (0,4

mmol.g-1). La N-Fmoc glycine puis l’acide para-hydroxymethylboïque suivi des trois

premiers acides aminés (la N-Fmoc valine, la N-Fmoc-O-tert-butyle tyrosine et à nouveau la

N-Fmoc valine) ont été introduits sur le support selon la procédure générale. Le N-Fmoc m-

AMBA ou o-AMBA est ensuite couplé sur le support de la même façon que décrit

précédemment. Après déprotection du groupement Fmoc de l’amine terminale et lavages

classiques, une solution à 0,25 M d’aldéhyde dans de la DMF, 2 % AcOH est additionnée à la

résine. La réaction est laissée sous agitation 1 h 30 puis la résine est filtrée et lavée

rapidement avec une solution de DMF, 2 % AcOH (x 1). Une solution de NaBH(OAc)3 à 0,25

M dans de la DMF est ensuite additionnée à la résine et cette réaction est laissée sous

agitation 3 h. L’excédent de réducteur est quenché par des lavages au MeOH (x 3), puis les

lavages classiques sont réalisés. La formation de l’amine secondaire est contrôlée par un test

au chloranil positif et un test au TNBS négatif. Une solution de carbamate 96 dans la N-

méthylpyrolidine anhydre à laquelle a été préalablement ajoutée une solution de DIEA dans le

même solvant a ensuite été ajoutée à la résine et cette réaction est laissée sous agitation toute

la nuit. La formation du motif urée est controlée par un test au chloranil négatif. Après

NH

HN N

O

HO-Leu-Leu-Phe

O Val-Tyr-Val-OH

OH


249

déprotection de l’amine terminale, les trois derniers amino-acides (N-Fmoc phénylalanine, N-

Fmoc leucine x 2, 3 équiv.) sont couplés de façon classique. Après déprotection du dernier

acide aminé, le peptide est clivé du support en milieu NaOH aqueux 0,1M pendant 3 h. Après

filtration et neutralisation avec de l’acide acétique, le filtrat est lyophilisé.

Peptide 110



Rendement : 6 %

CLHP : tR= 13,56 min. (Colonne Microsorb. Gradient de 100 % à 0 % A en 10 min. Débit à 1

mL.min-1).


NH

HN N

O

Val-Tyr-Val-OH

O

H-Leu-Leu-Phe

HO


250

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Conclusions et perspectives

253

Conclusions et Perspectives

L’ensemble de ces travaux concerne la synthèse de peptidomimes dérivant de peptides

antigéniques naturels ou altérés. Après une présentation de la réponse immunitaire à

médiation cellulaire engageant un CMH-I, un peptide antigénique et un récepteur de

lymphocytes T, le principe de l’immunothérapie ainsi que les principales modifications de

peptides antigéniques rapportées dans la littérature ont été exposées. Le peptide ELA a

ensuite été défini. Les principales modifications réalisées sur ce peptide ont mené le groupe

du Pr S. Quideau à la découverte du peptidomime 21 qui a été choisi comme tête de série

pour le développement d’une nouvelle famille de molécules portant différents motifs

aromatiques en partie centrale.

Ces peptidomimes possèdent le même squelette peptidique que le peptide 21 et

présentent différents motifs aromatiques introduits par réaction de chimie « click » sur leur

partie centrale. Le peptidomime 69 présentant un motif para-nitrobenzyle et une liaison

réduite en position P8-P9 a donné les meilleurs résultats de stimulation des lymphocytes T,

mais dans une moindre mesure par rapport au peptide EAA. Ces résultats sont le fruit d’une

collaboration avec l’équipe du Pr A. Sewell de l’Université de Cardiff (Pays de Galles).

En parallèle de ce projet et en collaboration avec l’équipe du Pr B. M. Baker de

l’Université de Notre-Dame (Indiana), le peptidomime tête de série 21 a été étudié par

cristallographie aux rayons X au sein du complexe binaire peptide 21/HLA-A2. Les données

structurales obtenues a posteriori montrent que ce peptide 21 n’adopte pas le même mode de

liaison que le peptide ELA. Ces données peuvent expliquer les résultats décevants obtenus

pour les peptides « click ».

En collaboration avec l’équipe du Pr J.-M. Aizpurua de l’Université du Pays Basque

(Saint-Sébastien), l’introduction en partie centrale du peptide ΕΕΕΕLA muté en position N-

terminale par une β-Ala, d’un motif β-lactame ou d’un motif D-α-(benzyl) serine (inattendu),

couplé à trois différents aminoacides variant par leur flexibilité a également été étudiée. Il

s’est avéré que la contrainte conformationnelle générée par la présence du motif β-lactame

était trop importante et ne permettait pas un bon repliement du mime dans le sillon du HLA-

A2 alors que le dérivé porteur d’une D-α-(benzyl) sérine combinée au motif Aib se révéla être

un ligand de haute affinité pour le HLA-A2. De plus, ce peptide 88 montra une bonne


254

capacité à stimuler une lignée lymphocytaire spécifique à Melan-A. Une étude structurale de

ce peptidomime en complexe avec le HLA-A2 permettra de voir quel mode de liaison adopte

ce peptide. En particulier, la présence de la β-alanine en position P1, qui engendre la perte de

trois liaisons hydrogène clés avec le HLA-A2 dans le cas du peptide 21, pourra à nouveau être

discutée.

Enfin, les derniers travaux présentés dans ce manuscrit s’inscrivent dans un projet

ambitieux dont l’objectif serait, à terme, de créer une plateforme unique pouvant être

introduite en partie centrale de divers peptides antigéniques, ornée d’un motif spécifique en

fonction de la cible choisi. Le peptide Tax dont l’équipe du Pr B. M. Baker a l’expertise, a

donc été sélectionné pour réaliser de nouvelles modifications. Des analogues du peptide Tax

possédant, en partie centrale, une plateforme composée d’un motif urée couplé à l’ortho- ou

au meta-AMBA et ornée de différents motifs benzyliques ont été synthétisés puis envoyés à

l’équipe du Pr B. M. Baker. Les derniers analogues seront prochainement synthétisés.

Avec les résultats actuels obtenus sur les modifications du peptide ELA, de nouveaux

analogues peuvent être envisagés. Les meilleurs résultats biologiques ayant été obtenus pour

le peptidomime 88 portant un motif D-α-(benzyl) serine couplé à un motif Aib, cette structure

pourrait être choisie comme nouveau squelette et modifiée selon les données obtenues pour

les autres projets : au lieu d’un simple benzyle, un para-nitrobenzyle (qui a donné les

meilleurs résultats biologiques parmi les analogues « click ») pourrait être introduit en partie

centrale ainsi qu’une liaison réduite en position P8-P9. Côté N-terminal, des acides aminés

non-naturels pourraient être testés, en particulier un acide β-glutamique.

HN

NH

O

HN

NH

OHN

O

H2NHN

ONH

HN

OH

OOH

OO

OH

NO2

OHO

O


253

Production Scientifique

Ces différents projets ont fait l’objet de plusieurs communications orales, posters et

publications.

Communications Orales

• “Synthesis and biological evaluation of β-lactam antigenic peptide hybrids: Unusual

opening of the β-lactam ring in acidic media” : Journée de l’Institut des Sciences

Moléculaires, Juillet 2010, Talence (33).

• “Vaccins de Synthèse contre le Cancer : Synthèse de Nouveaux Peptidomimes Antigéniques

Possédant un Motif β-lactame en Partie Centrale” : Journées Franco-Espagnoles de Chimie

Organique, Juin 2008, Boussens (65).

Posters

• M. Tarbe, I. Ascune Tolosa, Jesus Maria Aizpurua, A. Sewell, E. Balentová, J. Miles, E. Edwards, P. Do, B. M. Baker, C. Douat-Casassus, S. Quideau. “Anticancer Vaccine Against

Melanoma: Synthesis and Biological Evaluation of Antigenic Peptide Mimetics Containing β-

lactam Moieties in the Central Part β-lactam” : Journées Jeunes Chercheurs-IECB, Mai 2010, Pessac (33) ; Foldamer Symposium, Février 2010, Pessac (33).

• M. Tarbe, C. Douat-Casassus, S. Quideau. “Application de la Chimie “CLICK” à la Conception de Nouveaux Peptidomimes Antigéniques” : Journée de l’Ecole Doctorale des

Sciences Chimiques, Avril 2009, Talence (33).

• C. Chalumeau, T. Garnier, G. Malik, M. Tarbe. “Synthesis and Activity of Natural Substances” : Journée Jeunes Chercheurs-IECB, Mai 2008, Pessac (33).

Publications

• C. Douat-Casassus, O. Borbulevych, M. Tarbe, N. Gervois, F. Jotereau, B. M. Baker, S. Quideau. “Crystal structures of HLA-A*0201 complexed with Melan-A/MART-126(27L)-35

peptidomimetics reveal conformational heterogeneity and highlight degeneracy of T cell recognition”. J. Med. Chem. 2010, 53 (19), 7061-7066.

• M. Tarbe, I. Azcune, E. Balentová, J. J. Miles, E. E. Edwards, K. M. Miles, P. Do, B. M. Baker, A. K. Sewell, J. M. Aizpurua, C. Douat-Casassus, S. Quideau. “Design, synthesis and

evaluation of β-lactam antigenic peptide hybrids; unusual ring opening of the β-lactam ring in acidic media”. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 5345-5353.

pubs.acs.org/jmcPublished on Web 08/31/2010r 2010 American Chemical Society

J. Med. Chem. 2010, 53, 7061–7066 7061

DOI: 10.1021/jm100683p

Crystal Structures of HLA-A*0201 Complexed with Melan-A/MART-126(27L)-35 Peptidomimetics

Reveal Conformational Heterogeneity and Highlight Degeneracy of T Cell Recognition†

C�eline Douat-Casassus,‡,^ Oleg Borbulevych, ),^ Marion Tarbe,‡ Nadine Gervois,§ Francine Jotereau,§

Brian M. Baker,*, ) and St�ephane Quideau*,‡

‡Institut des Sciences Mol�eculaires (UMR-CNRS 5255) and Institut Europ�een de Chimie et Biologie (IECB),Universit�e de Bordeaux, 2 Rue Robert Escarpit, 33607 Pessac, France, §INSERM, U601, Universit�e de Nantes, 44322 Nantes, France, and

)Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 251 Nieuwland Science Hall, Notre Dame Indiana 46556.^These authors have contributed equally to the work.

Received June 7, 2010

There is growing interest in using tumor associated antigens presented by class I major histocompat-ibility complex (MHC-I) proteins as cancer vaccines. As native peptides are poorly stable in biologicalfluids, researchers have sought to engineer synthetic peptidomimetics with greater biostability. Here, wedemonstrate that antigenic peptidomimetics of the Melan-A/MART-126(27L)-35 melanoma antigenadopt strikingly different conformations when bound to MHC-I, highlighting the degeneracy of T cellrecognition and revealing the challenges associated with mimicking native peptide conformation.

Introduction

Class I major histocompatibility complex (MHC-I) pro-teins play a central role in immune surveillance by selectivelybinding antigenic peptides derived from intracellular ex-pressed proteins.1 After transport of the peptide-MHC-Icomplex (peptide-MHC-I) to the cell membrane, the cellsurface is surveyed by circulating CD8þ cytotoxic T lympho-cytes (CTLsa) through their T cell receptors (TCRs). When aT cell specifically recognizes peptide-MHC-I together withcostimulatory signals, a T-cell-mediated immune response isinitiated, resulting in lysis of the antigen-presenting cell andinitiation and propagation of an immune response. MHC-Imolecules are heterodimers and comprise a membrane-linkedheavy chain, a soluble light chain (β2-microglobulin), and ashort peptide, typically 8-10 amino acids in length. Thepeptide binding site is constructed as a groove formed bythe R1 and R2 helices supported by a β sheet of the heavychain. Peptide specificity for MHC-I is conferred by twodominant anchor residues (P2 and PΩ for the C-terminalposition),2 while TCRantigen specificity is largely determinedby the solvent-exposed side chains of the peptide central core.3

Generally, antigenic peptides bind to MHC-I proteins in anextended conformation with the peptide central core bulgingout or even zigzagging within the binding groove.

Since their first identification in the early 1990s, tumor-associated antigenic (TAA) peptides have been considered aspromising candidates for the development of cancer vaccines.However, their weak immunogenicity and their high sensitiv-ity to proteases have limited the success of synthetic TAApeptides as immunotherapeutic agents. Effort has thereforebeen devoted to modifying naturally occurring TAA peptidesto designmore biologically stable analogues for immunother-apeutic applications.The Melan-A/MART-1 protein antigen (hereafter referred

to as Melan-A) is up-regulated in about 89% melanoma celllines4 and elicits natural CD8þ T cell responses.5 Screening ofpeptides derived fromMelan-A led to the identification of theimmunodominant peptide epitope comprising residues 26-35(EAAGIGILTV), for which T cell recognition is restricted bythe human leukocyte antigen (HLA)-A*0201 (HLA-A2). Adrawback of this epitope is its moderate HLA-A2 bindingaffinity due to the absence of an optimal residue at the secondanchor residue (P2). Replacement of the P2 alanine by leucineto yield the alteredMelan-A26(27L)-35 peptide (ELAGIGILTV,referred to as ELA-0)6 resulted in enhanced HLA-A2-bindingaffinity and improved immunogenicity with T cells specific forthe native EAA decamer. Consequently, the ELA-0 peptidehas been and continues to be used in numerous clinical trialsfor the immunological treatment of melanoma.7 Unfortu-nately, as with most peptides used in immunological treat-ments, the ELA-0 peptide exhibits poor stability in biologicalfluids.8 In this context, the design of new synthetic, bioresistantELA-0 analogues presents anopportunity for thedevelopmentof more effective immunologically based therapies targetingmelanoma.Over the past few years, attempts have beenmade to replace

protease-susceptible peptide bonds in the ELA-0 peptide withtheir corresponding isosteres or non-natural amino acids.8,9

We recently investigated a strategy involving substitutionof the TCR-contacting central amino acids with protease

†The crystal structures of HLA-A*0201 complexed with Melan-A/MART-126(27L)-35 peptidomimetics have been deposited (PDB codes3O3A, 3O3B, 3O3D, and 3O3E, respectively).

*To whom correspondence should be addressed. For B.M.B.: phone,(574) 631 9810; fax, (574) 631 6652; e-mail, [email protected]. ForS.Q.: phone, þ33 (0) 540 00 30 10; fax, þ33 (0) 540 00 22 15; e-mail,[email protected].

aAbbreviations: AMBA, 3-aminomethylbenzoic acid; CTL, cyto-toxic T lymphocyte; DMSO, dimethyl sulfoxide; HLA, human leuko-cyte antigen; MES, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; MHC, majorhistocompatibility complex; PEG, polyethylene glycol; rmsd, root-mean-square deviation; RP-HPLC, reverse phase high performanceliquid chromatography; TAA, tumor associated antigen; TLS, transla-tion, libration, and screw; TCR, T cell receptor.

7062 Journal of Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 53, No. 19 Douat-Casassus et al.

resistant, nonpeptidic motifs potentially capable of makingimproved interactions with the TCR.10 Through an in silicodesign approach, the centralGIGI tetrapeptide of ELA-0wasreplaced with pseudopeptidic units equipped with differentorganic haptens. To further enhance biostability, some of ouranalogues also had a β-alanine at P1 in place of the nativeglutamate (Figure 1).8

Notably, despite the drastic modifications made to theELA-0 central core, the majority of our synthetic analogueshad similar or even improved binding affinity with the HLA-A2 molecule. Moreover, some of our peptidomimetics re-tained reactivity with Melan-A-specific T cell clones.10

Here, we sought to identify how chemical modifications ofELA-0 alter its presentation by the HLA-A2 molecule withthe aim of gaining further insight into the potential use ofpeptidomimetics as immunotherapeutic agents. Toward thisend, we determined the crystallographic structures of our twomost successful ELA-0 based peptidomimetics bound toHLA-A2 (ELA-1 and ELA-2 in Figure 1). We also exploredthe structural consequences of the modifications madeto the N-terminal part as a means to enhance exoproteaseresistance.8

The structures revealed (1) variations in the presentation of

the peptidomimetics, both with respect to each other andwith

respect to the native ELA-0 peptide, highlighting the chal-

lenges associated withmimicking the conformations of native

peptides in MHC-I binding grooves, (2) the capacity for

antigen-specific T cell receptors to cross-react with structu-

rally diverse ligands. The structures also revealed that the

modification of peptide N-termini made to enhance protease

resistance can have unintended structural consequences. Be-

yond unveiling the complexity of these structural modula-

tions, our results provide a concrete starting point for

structure-based enhancement of synthetic mimics of natural

antigenic peptides.

Results

The four ELA-0-based peptidomimetics examined areshown in Figure 1 and termed ELA-1, ELA-1.1, ELA-2,and ELA-2.1. ELA-1 was referred to as compound 21 inour previous work, whereas ELA-2 was referred to as com-pound 6.10 Both ELA-1 and ELA-2 strongly activated twoELA-0 specific T cell clones. ELA-1.1 and ELA-2.1 arederivatives of ELA-1 and ELA-2 that either retain the nativeglutamate at the N-terminus (ELA-1.1) or include a β-alanine(ELA-2.1) at this position.All four peptidomimetic/HLA-A2 complexes crystallized

in the same P21 space group with two molecules per asym-metric unit, as seen with other HLA-A2 complexes, includingthe complex with the native ELA-0 peptide.11,12 The four newcomplexes maintained the typical peptide/HLA-A2 architec-ture, with no perturbation to the secondary structure thatforms the HLA-A2 peptide binding groove. However, im-portant structural differences were seen in the various struc-tures as described below. Diffraction data and refinementstatistics for all four structures are shown in Table 1.

Structures of ELA-1 and ELA-1.1 Bound to HLA-A2. InELA-1, the central GIGI tetrapeptide is replaced with a3-aminomethylbenzoic acid (AMBA) spacer combined withN-(2-aminoethyl)glycine unit bearing a tryptophan-like sidechain that extends away from the backbone by an additionalcarbonyl unit. The N-terminal glutamate is also replacedwith a protease-resistant β-alanine. The structure of ELA-1bound to HLA-A2 was solved to 1.8 A (Table 1). The twomolecules in the unit cell were essentially identical, with allatoms of the two copies of the constructs superimposingwithan rmsd of 0.3 A.In the initial in silico design of ELA-1, the AMBA spacer

was predicted to be buried in the base of the peptide bindinggroove and the indole acetyl side chainwas predicted to pointaway from the groove, facilitating interactions with incoming

Figure 1. Chemical structures of the four ELA analogues showing the chemical differences in the central TCR-contacting andN-terminal parts.

http://pubs.acs.org/action/showImage?doi=10.1021/jm100683p&iName=master.img-000.jpg&w=336&h=259

Article Journal of Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 53, No. 19 7063

T cell receptors.10 However, the ELA-1/HLA-A2 structurerevealed almost the opposite: the AMBA spacer insteadbulges up and out of the groove, and the indole unit, ratherthan pointing away from the peptide binding groove, pointstoward the HLA-A2 R1 helix and lies partially underneaththe AMBA spacer (Figure 2a).As a decameric peptide, the center of the ELA-0 peptide

zigzags throughout the HLA-A2 peptide binding groove. Thecenter of ELA-1 also zigzags but does so in the oppositedirection, bending toward andabove theR1helix at theAMBAspacer (Figure 2a). Overall, the path adopted by ELA-1through the HLA-A2 peptide binding groove diverges sub-stantially from that of ELA-0, especially in the region replacedby the synthetic spacer. For example, the distance between thenitrogen of the AMBA spacer of ELA-1 and that of Gly6 ofELA-0, intended to occupy similar positions, is 6.7 A.The replacement of the native glutamate with a β-alanine

at the N-terminus had significant structural consequences.Compared to a standard amino acid, β-alanine introduces anadditional carbon-carbon bond between the first carbonyloxygen and the peptidomimetic N-terminus (Figure 1). Asshown in Figure 2b, in the ELA-1/HLA-A2 structure, thisadditional bond forces the N-terminus out of the HLA-A2P1 pocket, resulting in the loss of a hydrogen bond to Tyr171of the HLA-A2 heavy chain that is conserved in all peptide/HLA-A2 structures in which the P1 pocket is occupied. TheN-terminus instead points up out of the pocket, displacingthe side chain of Lys66 by 3.2 A because of charge and stericrepulsions. This remarkable movement of Lys66 results inthe loss of another conserved peptide-HLA-A2 hydrogenbond, from Lys66 to the carbonyl oxygen of the leucine atpeptide position 2. The shift in Lys66 also removes a saltbridge made with Glu63 that is conserved in the majority ofpeptide/HLA-A2 complexes.13,14

Although ELA-1 bound well to HLA-A2 and was recog-nized by Melan-A specific T cell clones, the alterations in

conserved hydrogen bonds and salt bridges around thepeptidomimetic N-terminus could significantly impact pep-tide and TCR binding for other systems.13,15 We thus askedwhether the alterations could be reversed by reverting to anative glutamate at the first position. The resulting ELA-1.1peptide is identical to ELA-1 except that the β-alanine at P1is replaced with glutamate (Figure 1).The structure of ELA-1.1, determined at 1.9 A (Table 1),

was identical to that of ELA-1 except for the region aroundtheN-terminus, which indeed showed a return to a “normal”N-terminal environment, with the hydrogen bond betweenthe N-terminus and Tyr171, the hydrogen bond between theLeu2 oxygen and Lys66, and the salt bridge between Lys66and Glu63 all formed (Figure 2c). Thus, the N-terminalstructural alterations in the ELA-1 structure are all attribu-table to the presence of the β-alanine.

Structures of ELA-2 and ELA-2.2 Bound to HLA-A2. TheELA-2 peptidomimetic also included the AMBA spacer butcombined it with a reduced peptide bond introduced betweenthe glycine at P4 and a standard tryptophan at P5 (Figure 1).Unlike ELA-1, ELA-2 retained the native glutamate at theN-terminus as it was designed earlier.10 As with ELA-1,ELA-2 adopted a different path through the HLA-A2 pep-tide binding groove compared to the ELA-0 peptide. Ratherthan zigzagging, the center of ELA-2 simply bulged out suchthat the conformation of the ELA-2 central part was some-what between that ofELA-0 andELA-1 (Figure 3a). The twomolecules in the ELA-2 asymmetric unit positioned theAMBA spacer and the preceding peptide bond unit indifferent conformations, and in one of the molecules in theasymmetric unit, the side chains and backbones of Leu8 andThr9 could be refined in two conformations (Figure 3b).Together, this represents a degree of conformational hetero-geneity present with ELA-2 but not with ELA-1. One of theAMBApositions inELA-2 closely (within 2 A)mimicked theposition of theAMBAspacer inELA-1 (shown inFigure 3a).

Table 1. X-ray Data and Refinement Statistics

protein ELA-1/HLA-A2 ELA-1.1/HLA-A2 ELA-2/HLA-A2 ELA-2.1/HLA-A2

PDB entry 3O3A 3O3B 3O3D 3O3E

radiation source (beamline) APS (19BM) APS (14BM) APS (19BM) APS (14BM)

space group P21 P21 P21 P21a (A) 58.2 58.1 58.2 58.2

b (A) 84.2 84.3 84.2 84.4

c (A) 84.0 84.0 84.1 84.0

β (deg) 90.0 90.0 90.1 90.1

molecules/asymmetric unit 2 2 2 2

resolution (A) 20-1.8 20-1.9 20-1.7 20-1.9

total no. of reflections 74605 61720 88669 66944

mosaicity (deg) 0.28 0.38 0.30 0.23

completenessa (%) 99.5 (96.2) 96.9 (81.6) 99.4 (98.3) 96.5 (72.9)

I/σ 13.4 (1.7) 10.9 (2.1) 17.7 (2.0) 14.5 (1.7)

Rmerge (%) 9.2 (51.1) 14.1 (49.7) 9.1 (49.6) 10.8 (63.4)

average redundancy 3.6 (3.3) 3.6 (3.1) 3.6 (3.2) 3.6 (2.7)

Rwork (%) (no. reflections) 17.1 (71352) 18.6 (58568) 18.0 (84177) 18.2 (63539)

Rfree (%) (no. reflections) 21.2 (3786) 23.8 (3116) 21.8 (4435) 22.9 (3377)

ÆBæ (all atoms) (A2) 21.1 11.6 16.9 17.4

Ramachandran plot

most favored (%) 92.2 91.6 93.1 91.8

allowed (%) 7.5 8.1 6.6 7.9

generously allowed (%) 0.3 0.3 0.3 0.3

RMS deviations from ideality

bond (A) 0.016 0.018 0.016 0.017

angle (deg) 1.762 1.843 1.704 1.719

coordinate errorb (A) 0.09 0.12 0.08 0.11aNumbers in parentheses refer to the highest resolution shell. bMean estimate based on maximum likelihood methods.


Interestingly, the side chain of Trp5 angled into the sameposition as the indole ring in ELA-1, reflecting a preferencefor an aromatic side chain at the position 5 pocket in HLA-A2.16

Unlike ELA-1, ELA-2 retained the native glutamate at theN-terminus. As anticipated from the results with ELA-1 andELA-1.1, the normal position of Lys66 and the hydrogenbonding/salt-bridge network around the N-terminus wereretained in the ELA-2 structure. To verify conclusively thatthe rearrangements seen in ELA-1 were due to the use ofβ-alanine and not influenced by other modifications, weexamined a version of ELA-2 that replaced the nativeglutamate with a β-alanine (ELA-2.1 in Figure 1). Thestructure of ELA-2.1 bound to HLA-A2 revealed structuralconsequences identical to those seen with ELA-1: loss of theN-terminal hydrogen bond to Tyr171 and a rearrangementof Lys66, resulting in the loss of the hydrogen bond toposition 2 and the salt bridge with Glu63 (Figure 3c).

Discussion

With the growing use of tumor associated antigens as thebasis for the development of vaccines for cancer and infectiousdiseases,17 there has been a concomitant interest in the deve-lopment of synthetic analogues or peptidomimetics withgreater biological stability or immunological potency. Ourmimetics of the Melan-A26(27L)-35 tumor antigen (ELA-0)bound well to HLA-A2 and activated Melan-A-specific Tcells,10 demonstrating an important proof of principle andproviding a platform on which further development can bebased.

Surprisingly, the structures of our two most promisingpeptidomimetics (ELA-1 and ELA-2) bound to HLA-A2determined here revealed crucial differences in the centralAMBA-substituted portion of the peptide when compared tothe structure with the ELA-0 peptide, after which they weremodeled. These differences highlight the capacity of ourAMBA-based mimetics to alter their conformation to cor-rectly position their primary anchors to achieve tight bindingto HLA-A2.But given the different structures for ELA-1 and ELA-2,

how is it that they are able to stimulate ELA-0-specific T cells?One important clue may lie in the conformational diversityobserved in the ELA-2/HLA-A2 crystal structure. Severalstudies have shown that the adaptability of antigenic peptidescan lead to the formation of stable TCR-pMHC interfaces,most recently with ligands with little structural homology inthe TCR-free state.18 Alternatively, the TCRs responsible forcross-recognition between ELA-0 and ELA-1/ELA-2 maypossess flexible CDR loops that permit recognition of dis-parate structures.19 Indeed, cross-reactivity with structurallydisparate ligands is a hallmark of Melan-A26-35-specificTCRs, as they readily cross-react with the 27-35 epitope,which as a nonamer adopts a different path through theHLA-A2 peptide binding groove as does the 26-35 decamer.20 It ispossible that cross-reactivity between ELA-0 and ELA-1/ELA-2 proceeds via a combination of peptide and TCRconformational adaptability, as recently demonstrated withvariants and mimics of the HTLV-1 Tax11-19 peptide.

21,22 Amore complete understanding of the mechanism by whichELA-1 and ELA-2 are recognized will require solution

Figure 2. Structural comparison of the ELA-1 and ELA-1.1 mimetics with the native ELA-0 peptide. (a) Cross-eyed stereo comparison ofELA-1with ELA-0 in theHLA-A2 peptide binding groove. ELA-1 diverges substantially fromELA-0, particularly in the central portion of themolecule. ELA-0 is purple andELA-1 is green. (b) The nitrogen of the β-alanine inELA-1 points out of the P1 pocket, forcing a repositioning ofLys66 and disrupting the traditional N-terminal hydrogen bonding arrangement. Hydrogen bonds are purple, and the clash between β-alanineand Lys66 is illustrated in red. A hydrogen bond between Lys66 and Glu1 in the ELA-1.1 structure is not shown for clarity. (c) The ELA-1.1compound, which replaces the β-alanine of ELA-1with glutamate, restores the normal position of Lys66 and the traditional hydrogen bondingarrangement. Superimpositions for all panels are through the backbones of the peptide binding domains.


Article Journal of Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 53, No. 19 7065

of crystal structures of the TCR-peptide-MHC ternarycomplexes.A second key result revealed by the crystallographic struc-

tures is the structural consequences of using a β-alanine at theN-terminus. β-Alanine was used to enhance resistance toexoproteases. However, the structures showed unambigu-ously that β-alanine disrupted the conformation at theN-terminus, resulting in the loss of hydrogen bonds andaltering the position of Lys66. Although this did not appearto negatively affect the bindingof our compounds toHLA-A2,nor did it disrupt recognition by twodifferentT cell clones, thisshould not be expected in all cases. Lys66 is a key amino acid inseveral interfaces that TCRs form with HLA-A2, and altera-tions toLys66 have been linked to a loss in recognition in othercases.14 Thus, caution should be used when consideringβ-alanine or similar non-native amino acids at the N-terminusof peptidomimetics.

Conclusions

In summary, we have determined the crystallographicstructures of two promising peptidomimetics of the Melan-A26-35 tumor antigen to HLA-A2. Although the conforma-tions in the peptide binding groove diverged from that of thenative peptide, HLA-A2 binding and, for at least two T cellclones, TCR recognition were maintained.10 This structuralanalysis underscores the degeneracy present in TCR recogni-tionof ligand.Furthermore, suchdegeneracybeingdifficult topredict, this work highlights the difficulties in designing close

structural mimics of antigenic peptides. Nonetheless, ourresults provide a concrete starting point for the structure-based enhancement of syntheticmimics ofMelan-A/MART-1epitopes capable of being recognized by human TCRs in aHLA-A2-restricted context.23

Experimental Methods

Synthesis. We have reported the synthesis of ELA-1 andELA-2 in a previous publication.10 The compounds were de-termined to be >95% pure by RP-HPLC. Detailed procedurefor the solid phase synthesis of their derivatives ELA-1.1 andELA-2.2 is described in the Supporting Information. Bothpeptidomimetics were obtained with purities of >95%.

Protein Expression, Purification, and Crystallization. Theextracellular domains of HLA-A2 and β2-microglobulin wereexpressed in Escherichia coli as inclusion bodies, refolded withexcess peptidomimetic dissolved in DMSO, and chromatogra-phically purified as described previously.24 The HLA-A2 com-plexes were crystallized at 4 �C from a precipitant solution of24%PEG3350, 0.1MKCl orNaF, buffered with 0.025MMESat pH6.5 using sitting drop/vapor diffusion. Seedingwas used toobtain higher quality single crystals.

Data Collection, Structure Solution, and Refinement.For datacollection, crystals were transferred to mother liquor supple-mentedwith 20%of glycerol and flash-frozen in liquid nitrogen.Diffraction data were collected at the indicated beamlines(Table 1). Data collection statistics are given in Table 1. Oscilla-tion frames were integrated and scaled with HKL2000.25 Struc-tures were solved by molecular replacement with MOLREP26

using PDB code 2GT919 as a search model with the coordinatesfor the peptide excluded. Rigid body refinement, TLS refinement,

Figure 3. Structural comparison of the ELA-1 and ELA-2 peptidomimetics. (a) Cross-eyed stereocomparison of ELA-1 and ELA-2 in theHLA-A2 peptide binding groove. Unlike ELA-1, ELA-2 does not zigzag but instead bulges straight from the center of the groove. ELA-2 isyellow and ELA-1 is green. (b) ELA-2 shows conformational heterogeneity in the HLA-A2 binding groove. The AMBA spacer occupies twodifferent conformations in the two molecules in the asymmetric unit (yellow and cyan). The first molecule in the asymmetric unit (cyan)displayed alternative conformations for the backbones and side chains of Leu8 and Thr9. (c) The structure with the ELA-2.1mimetic, whichreplaced the N-terminal glutamate of ELA-2 with β-alanine, revealed an altered position for Lys66 and disrupted N-terminal hydrogenbonding arrangement, similar to that seen in the structure with ELA-1. ELA-2 is yellow, and ELA-2.1 is pink. Hydrogen bonds are purple, andthe clash between β-alanine and Lys66 is illustrated in red. A hydrogen bond between Lys66 and Glu1 in the ELA-2 structure is not shown forclarity. Superimpositions for all panels are through the backbones of the peptide binding domains.



and restrained refinement were performed with Refmac527 asincorporated in CCP4-6.0.2. The TLS groups for refinement werechosen as previously described.21 Once refined, TLS parameterswere included in all subsequent refinement steps. Anisotropic andbulk solvent corrections were performed throughout refinement.Water was added using ARP/wARP.28 Graphical evaluation ofthe model and fitting to maps were performed using Coot29 andXtalView.30 The quality of the structures during refinement wasmonitored with the Coot validation engine and Procheck.31

Structure factors and coordinates have been submitted to theProtein Data Bank; PDB codes are listed in Table 1.

Acknowledgment. The authors thank the Servier Labora-tories and the Soci�et�e Franc-aise de Chimie Th�erapeutique forfinancial support and M.T.’s research assistantship. O.Y.B.was supported by theWalther Cancer Foundation. This workwas supported by Grant GM067079 fromNIGMS, NIH (U.S.)and Grant RSG-05-202-01-GMC from the American CancerSociety. Results shown in this report are derived from workperformed at Argonne National Laboratory, Structural BiologyCenter at the Advanced Photon Source. Argonne is operated byUChicago Argonne, LLC, for the U.S. Department of Energy,OfficeofBiological andEnvironmentalResearchunderContractDE-AC02-06CH11357. Use of the BioCARS Sector 14 wassupported by the NCRR, NIH, U.S., under Grant RR007707.

Supporting Information Available: Detailed procedure of thesolid phase synthesis of the four peptidomimetics and X-rayelectron density images. This material is available free of chargevia the Internet at http://pubs.acs.org.

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PAPER www.rsc.org/obc | Organic & Biomolecular Chemistry

Design, synthesis and evaluation of b-lactam antigenic peptide hybrids;unusual opening of the b-lactam ring in acidic media†

Marion Tarbe,a Itxaso Azcune,b Eva Balentova,b John J. Miles,c Emily E. Edwards,c Kim M. Miles,c

Priscilla Do,d Brian M. Baker,d Andrew K. Sewell,c Jesus M. Aizpurua,b Celine Douat-Casassus*a andStephane Quideau*a

Received 5th March 2010, Accepted 2nd September 2010DOI: 10.1039/c003877f

b-Lactam peptides were envisioned as conformational constraints in antigenic peptides (APs). Threedifferent b-lactam tripeptides of varying flexibility were prepared in solution and incorporated in placeof the central part of the altered melanoma associated antigenic peptide Leu27-Melan-A26–35 using solidphase synthesis techniques. Upon TFA cleavage from the solid support, an unexpected opening of theb-lactam ring occurred with conservation of the amide bond. After adaptation of the solid phasesynthesis strategy, b-lactam peptides were successfully obtained and both opened and closed formswere evaluated for their capacity to bind to the antigen-presenting class-I MHC HLA-A2 proteinsystem. None of the closed b-lactam peptides bound to HLA-A2, but their opened variants were shownto be moderate to good HLA-A2 ligands, one of them being even capable of stimulating aMelan-A-specific T cell line.

Introduction

The incorporation of conformationally constrained b-turn mimet-ics in therapeutically relevant peptide structures has long beenconsidered as a valuable approach in the design of peptidomimet-ics with enhanced affinity and/or improved metabolic stabilitycompared to those of their peptide parents.1 In particular, sincetheir first utilization by Freidinger in 1980, dipeptide lactams areamong the most popular b-turn mimetics.2,3 In this context, ourcurrent efforts towards the design of antigenic peptidomimeticsled us to envision the use of the b-lactam scaffolds I–III4,5

(Fig. 1) as surrogates of the central part of a tumor-associatedantigenic peptide (AP) and to assess the consequences of suchstructural modifications on the immunogenicity of the resultingpeptidomimetics.

Tumor-associated APs, usually 8 to 10 amino acids long,6 aregenerated in cancer cells by proteolysis of self over-expressedproteins in the proteasome and are then exposed to the cellsurface by class-I major histocompatibility (MHC-I) complexesto be screened by circulating CD8+ cytotoxic T lymphocytes.7

Recognition of these peptide-MHC-I (pMHC-I) complexes by Tcell receptors (TCRs) is the causal event in the triggering of Tcell-mediated immune responses that result in the destruction of

aUniversite de Bordeaux, Institut des Sciences Moleculaires (UMR-CNRS5255) and Institut Europeen de Chimie et Biologie (IECB), 2 rue RobertEscarpit, 33607 Pessac, France. E-mail: [email protected];Fax: (+33) 5-4000-2215; Tel: (+33) 5-4000-3010bDepartamento de Quımica Organica-I, Universidad del Paıs Vasco, JoxeMari Korta R&D Center, Apdo. Tolosa-72, 20018 San Sebastian, SpaincDepartment of Medical Biochemistry and Immunology, Henry WellcomeBuilding, Cardiff University School of Medicine, Heath Park, Cardiff, CF144XN, UKdDepartment of Chemistry and Biochemistry, 251 Nieuwland Science Hall,University of Notre Dame, Notre Dame, IN 46556, USA† Electronic supplementary information (ESI) available: NMR spectra ofb-lactam scaffolds and intermediates, and HPLC traces, mass spectra andNMR TOCSY maps of b-lactam–peptide hybrids and opened variants.See DOI: 10.1039/c003877f

Fig. 1 b-lactam scaffolds envisioned as conformationally constrainedsurrogates of antigenic peptide central segments.

antigen-presenting cells. Given the pivotal role played by APs inlaunching this cellular defense mechanism, it is not surprising thatthese small peptides have been considered by immunologists aspromising leads in the development of immunotherapeutic drugs,as well as synthetic vaccines. Unfortunately, the poor biostabilityand globally unsatisfactory pharmacokinetic properties inherentto their peptidic nature have precluded the general use of APsas therapeutic agents. Thus, designing bioresistant antigenicpeptidomimetics capable of engaging both MHC-I and TCRproteins in the formation of complexes inducing enhanced immuneresponses remains at the forefront of modern immunology.

The structural data that have been gathered by biophysicists inthis field over the last decade have provided us with a preciousunderstanding of the mode of binding of APs to MHC-I proteinsand of their molecular recognition by TCRs.8 APs that efficientlybind onto and in between the a-helical units of the MHC-I proteincleft usually present anchoring amino acid residues at position2 (P2) and at their C-terminus, whereas their central portion(P4–P7) bulges out of the peptide binding cleft, sometimes evenzigzaging to interact with the TCR components (Fig. 2). Mostprevious attempts in designing heteroclitic APs were essentiallyaimed at developing MHC-I high affinity ligands so as to improveimmunogenicity.9 Based on the X-ray structure of the MHC-I human leucocyte antigen (HLA)-A2 protein complex bearing

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2010 Org. Biomol. Chem., 2010, 8, 5345–5353 | 5345

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Fig. 2 (a) ELA peptide sequence showing HLA-A2 anchor and TCR-interacting residues, superimposed with its HLA-A2-bound X-ray structure.10,11

(b) Sequence of the envisioned b-lactam-containing peptidomimetics (1–3).

the altered melanoma-associated peptide epitope Leu27-Melan-A26–35 (ELAGIGILTV, hereafter referred to as ELA),10 we recentlyreported the successful replacement of the central segment GIGI(i.e., P4–P7) of this AP by a nonpeptidic functionalizable scaffoldwithout compromising HLA-A2 binding.11 Some of the ELA pep-tidomimetics thus designed even managed to efficiently stimulateMelan-A-specific T cell clones.11 On the basis of these results, wesurmise that the replacement of the ELA central residues by ab-lactam motif such as I, II or III (Fig. 1) thus incorporated inELA pseudopeptides 1–3 (Fig. 2) could advantageously serve thepurpose of mimicking their hydrophobic bulge.

Herein, we disclose the design and solid-phase synthesis ofthese b-lactam-containing ELA mimetics, together with an un-expected opening of the b-lactam ring during the release of thepeptidomimetics from the solid support. The three b-lactam-containing peptidomimetics thus generated, as well as their openedvariants, were then evaluated for their binding affinity to the HLA-A2 molecule and for their capacity to activate Melan-A-specific Tcells.

Results and discussion

Design of b-lactam scaffolds

Three different amino acids (Xaa) were selected to occupy theb-turn (i+2) position in the central -(b-lactam)-Xaa- scaffoldsI–III of pseudopeptides 1–3 (Fig. 1 and 2). On the basis ofprevious investigations stressing that TCR loops are sufficientlyflexible to accommodate rather bulky and hydrophobic centralside-chains on hapten-modified peptides12 and of results from ourpreliminary in silico docking study (data not shown), a benzylgroup was selected in place of the sec-butyl central isoleucineside-chain to equip the b-lactam motif of the three scaffolds

I–III. The methylene-composed b-alanine (in 1) and glycine (in2) were chosen to maintain some degree of flexibility in thepeptidic backbone in order to allow the resulting constructs to bestorient themselves within the HLA-A2 binding cleft. Alternatively,the inclusion of a constrained aminoisobutyric acid (Aib) unit,known to be an efficient inducer of 310 helix,13 was also examined(in 3). Moreover, our previous results11 prompted us to installthese b-lactam segments in place of the G29I30G31 tripeptide ofELA so as to best mimic the zigzag conformation of its centralportion (Fig. 2),10 while maintaining adequate interactions of theanchoring residue side chains at P2 and P10 within the HLA-A2 binding cleft. Furthermore, our preliminary in silico dockingstudy of the three envisaged D-a-benzylserine-derived b-lactam–peptide hybrids (Scheme 1)2,14 indicated that a substitution by theD-enantiomer of isoleucine at P7 would be necessary to enablethe appropriate orientation of the N-terminal part of these b-lactam pseudopeptides (data not shown). Finally, the N-terminalglutamate residue (P1) was replaced by a b-alanine, as sucha substitution has previously been shown to be beneficial forbiostability without compromising neither the binding to theHLA-A2 protein nor the recognition by Melan-A specific T-cellclones.11,15

Solid-phase synthesis of b-lactam pseudopeptides

The b-lactam cores 5, 6 and 9 were prepared from methylD-a-benzylserinate 4 following previously described procedures(Scheme 1).5 In the case of tripeptide scaffolds 7 and 8, allylic andhomoallylic amine moieties were respectively chosen as precursorsof the glycine and b-alanine residues. The oxidative cleavage oftheir double bond by NaIO4 conveniently afforded the desiredcarboxylic acid functions. All three N-Fmoc-protected tripeptidescaffolds 7, 8 and 11 were installed on a D-Ile-Leu-Thr-Val peptide

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Scheme 1 Synthesis of Fmoc-Ala-b-lactam-Xaa-OH tripeptide scaffoldswith C-terminal b-alanine (7), glycine (8) and Aib (11) residues. All yieldsquoted correspond to overall transformations.

construct supported on a Wang resin by following standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS) protocols. Removal ofthe Fmoc-protecting group, addition of the two remaining aminoacids (i.e., leucine and b-alanine) and release of the expected b-lactam–peptide hybrids from the resin with concomitant removalof all protecting groups completed the syntheses (Scheme 2a).

Much to our surprise, a structural analysis of the resultingcompounds (i.e., 12–14) by electrospray ionization mass spec-trometry (ESIMS) indicated molecular masses exceeding by 18 Da

those expected for the desired b-lactam pseudopeptides 1–3. Werapidly concluded that these observations were likely due toa conventional hydrolysis of the b-lactam N1–C2 amide bondduring the final aqueous TFA cleavage step (Scheme 2a), whichwould then furnish b-amino acid-containing peptides such as15 from 1 (Scheme 3, path A). However, a careful examinationof the data we collected from standard 1D 1H and 2D 1H–1HTOCSY NMR experiments performed on compound 12 clearlyindicated that 8 amidic protons were present in the molecule(and not 7 as in 15), and that the “extra” amidic proton wascorrelated with one of the methylene protons of the endo-b-alanineresidue (see ESI† for details). These data strongly suggest thatit is instead the N1–C4 bond of the b-lactam ring that sufferedhydrolytic cleavage (Scheme 3, path B), hence leading to the D-a-benzylserine-containing peptides 12–14 shown in Scheme 2.Cleavage of the N1–C4 bond has been previously observed orforced in b-lactam systems bearing an electron-donating groupat C4.16–19 For example, the hydrogenolysis of 4-arylazetidin-2-ones is a very well know methodology developed by Ojima forthe preparation of a-amino acids and peptidomimetics.17 Morerecently, McMurray and co-workers described the N1–C4 bondopening of 4-(4¢-hydroxyphenyl)-2-azetidinones under basic oracidic conditions.18 In parallel, Alcaide and co-workers reportednovel N1–C4 bond breakages on b-lactams equipped with non-arylcarbanionic moieties at C4.19 Moreover, according to the resultsof detailed studies of acid-catalyzed hydrolyses,20 N-protonatedb-lactams intermediates undergo nucleophilic addition (AdN) ofa water molecule at the carbonyl sp2 carbon atom along aclassical Burgi–Dunitz trajectory,21 followed by rupture of theN1–C2 bond by elimination (E). In the case of our b-lactams,however, the Burgi–Dunitz trajectory of approach is hindered bythe a,a-substituents on both sides of the azetidinone ring, thusenergetically penalizing the AdN-E pathway (see path A in Scheme3). Conversely, the unsubstituted b-methylene sp3 C4 atom hencebecomes more vulnerable to an SN2 attack by a water molecule that

Scheme 2 Solid-phase synthesis of b-lactam–peptide hybrids 1–3 (b) and their opened variants 12–14 (a).


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Scheme 3 Proposed mechanism (path B) for the unusual N1–C4 b-lactamring opening observed during aqueous TFA treatment.

thus opens up the b-lactam ring with conservation of the amidebond (see path B in Scheme 3). To the best of our knowledge, thering opening reactions we thus observed leading to 12–14 are thefirst examples of nucleophilic N1–C4 bond cleavage occurring atan unsubstituted C4 center of b-lactam rings.22

To gather additional information about this unusual N1–C4 bond breakage, we also exposed the non-immobilized Aib-containing tripeptide scaffold 11 and the methyl ester of itsnosylated precursor 95 to the same aqueous acidic conditions(see ESI† for details). Interestingly, whereas the C3-amidatedb-lactam 11 was also rapidly converted into its N1–C4-openedvariant in quantitative yield, as confirmed by 1H NMR analysisshowing notably a characteristic downfield shift for the methyleneprotons at C4,23 its C3-nosylated analogue 9 remained intact. Theseobservations raise the question of whether the presence of anamide substitutent at C3 is compulsory for mediating the N1–C4

bond breakage. The significance of such a “peptide-like” factorin favoring this unusual b-lactam ring opening will be assessedin future studies aimed at delineating further the scope of thereaction.

At this stage and for the sake of the continuation of thisstudy, other conditions of release of our pseudopeptide targetsfrom the solid support had thus to be found to avoid thisunprecedented b-lactam ring opening. A solution was found byreplacing the Wang resin by an amino PEGA resin bearing abase-labile hydroxymethylbenzoic acid (HMBA) linker (Scheme2b).24 The tert-butyl protection of the threonine (Thr) side-chainwas removed by a TFA treatment, and immediately followedby an acetylation step. The rest of the synthesis, including theinstallation of the b-lactam scaffolds 7, 8 and 11, was carried outby standard SPPS techniques. After removal of the N-terminalb-Ala Fmoc protecting group, pseudopeptides were released bytreating the resin for 3 h with a 0.1 M aqueous solution of NaOH,which also enabled cleavage of the Thr acetate protecting group.

The high hydrophobicity of the resulting crude pseudopeptidescaused us some difficulties during their purification by HPLC,notably because of their tendency to aggregate. Consequently, thethree targeted pseudopeptides 1–3 were obtained in pure formsin relatively poor yields (Scheme 2b), but nevertheless in largelysufficient quantities to handle their immunological evaluation.

HLA-A2 binding

Having thus in hand both the b-lactam-containing ELA mimetics1–3 and their opened variants 12–14, we investigated their relativecapacity to bind to the HLA-A2 protein via the T2 surfacebinding assay (see Experimental section). Two peptides were usedas references: ELA as a positive control and a nonapeptide ofsequence GAGAGAGAG (termed GAG) containing no HLA-A2anchor residues as a negative control. Hence, any peptide with abinding affinity equal to or lower than GAG can be consideredas a very weak ligand or non-binding entity. The T2 bindingexperiments revealed that the opened pseudopeptides 12–14 bindrelatively well to HLA-A2, whereas no binding was surprisinglyobserved with the b-lactam-bearing peptidomimetics 1–3 (Fig. 3).Importantly, compound 14 emerged as an extremely strong HLA-A2 ligand, showing an apparent binding strength superior to thatof ELA.

Fig. 3 Normalized HLA-A2 binding affinities for b-lactam-containingELA mimetics 1–3 and their opened variants 12–14 relative to thatof ELA (100) expressed as relative fluorescence intensities (RFI) fromHLA-A2-binding surface antibodies.

One possible explanation for the lack of binding of the b-lactam-bearing constructs 1–3 is that their built-in conformational con-straints in fact altered the orientation of the anchor residues withinthe HLA-A2 binding pockets. In contrast, the opened b-lactam–peptide hybrids 12–14, which possess a D-a-benzylserinate at theircore, appeared to fold well inside the HLA-A2 groove. These HLA-A2 binding data also reveal that the substitution by a D-isoleucineresidue at P7 does not affect the binding efficiency of these openedpseudopeptides, since all three compounds expressed affinity inthe same range as that of the ELA control. Moreover, the fact thatthe best HLA-A2 ligand 14 possesses an Aib residue suggests thatthe rotational restriction this residue likely imposes contributes toa proper positioning of the pseudopeptide to best match the HLA-A2 binding requirements. The structure–affinity relationship trendobserved with the three pseudopeptides 12–14 is in agreementwith this hypothesis, since their binding affinity decreases with anincrease of their flexibility. Thus, compound 12, which possessesa more flexible sequence-embedded b-alanine residue in place of


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the more constrained Aib next to the D-a-benzylserine, exerts atwo-fold weaker binding affinity compared to that of 14.

Given the remarkably good binding affinity 14 for HLA-A2, wethen decided to evaluate the thermal stability of the resulting com-plex, since it is now well established that a highly stable pMHC-Icomplex is more likely to productively interact with circulatingT cells.25 Measurements of thermal stability based upon circulardichroism-monitored protein denaturation have previously beenperformed for a number of pMHC-I complexes,26 and in general,a higher melting temperature (Tm) correlates with tighter peptidebinding. As shown in Fig. 4, 14 forms a complex with HLA-A2 thatis more stable at physiological temperatures than that formed withthe native Melan-A26–35 decapeptide (EAAGIGILTV), but some-what less stable than that formed with ELA. The thermal stabilitiesthus measured have globally a good concordance with the bindingaffinities measured by the T2 surface binding assay. Notwithstand-ing the disappointing behavior of our initially designed b-lactam-ELA mimetics vis-a-vis the HLA-A2 protein, the good bindingresults obtained with pseudopeptides 12–14 then prompted us toinvestigate their capacity to specifically activate T cells.

Fig. 4 Thermal stability measurements of complexes of HLA-A2 withEAA, ELA, and 14.

ELA-specific T cell stimulation

The capacity of T cells to functionally recognize pseudopeptides12–14 in a HLA-A2-restricted context was determined by per-forming an intracellular cytokine stain (ICS) to measure the levelof cytokines secreted by activated T cells via flow cytometry. Thus,briefly, a Melan-A-specific T cell line was generated by stimulatingHLA-A2+ peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with10 mM of the native Melan-A26–35 epitope (i.e., EAA). The PBMCwere cultured for 10 days in T cell media, which resulted inapproximately 15% of the total T cell population staining witha Melan-A-HLA-A2 tetramer (data not shown). The T cellline was then divided into 1 ¥ 105 cell samples, pulsed with500 mM of either EAA used as a positive control or 12–14,washed and incubated overnight in an ICS assay. The T cellline was then examined by flow cytometry for expression of thelysosomal-associated membrane protein (LAMP) CD107a27 andthe stimulatory cytokine interferon-g (INFg); both produced bythe tetramer gated T cells (Fig. 5). Once again, 14 emerged asthe most interesting compound, as it was the only one to elicit

Fig. 5 Flow cytometry detection of secretion of the stimulatory cytokineINF-g and the LAMP CD107a after stimulation of Melan-A-specific Tcells with EAA (native peptide used as positive control) or peptides 12–14at 500 mM.

a CD107a response in tetramer gated T cells, albeit in weakeramounts in comparison to the response elicited by the nativepeptide EAA. Furthermore, 14 elicited an IFNg response in thesame range as that of EAA. These data clearly indicate that apeptidomimetic structure such as 14 can specifically stimulate Tcells in a MHC-I-restricted context.

Conclusion

None of the designed b-lactam-ELA peptidomimetics displayedHLA-A2 binding affinity, but the unprecedented acid-catalyzedopening of their b-lactam ring led to the serendipitous discoveryof the HLA-A2 binding and T cell stimulation capacities oftheir opened variants. Taken together, the results described hereinprovide us with highly informative insights into the possibilitiesoffered to medicinal chemists to modify the structures of MHC-I-restricted antigenic peptides with the aim of better stimulatingT cells. The simple fact that the T cell stimulating pseudopeptide14 exhibits binding properties similar to those of ELA suggeststhat the same type of molecular interactions upon binding tothe HLA-A2 protein are at play. Future work will address theseissues through X-ray crystallographic studies of the 14–HLA-A2complex.

Experimental

General

All reagents were purchased from either Aldrich, Acros, or Fluka.Amino acids, Wang resin, amino-PEGA resin, and HBTU werepurchased from Novabiochem (Switzerland). Tetrahydrofuran(THF) and diethyl ether (Et2O) were dried through PS-MD-2columns. Extra pure dichloromethane (CH2Cl2), hexane (Hex) andethyl acetate (EtOAc) were bought from Sharlau. All other organicsolvents were of analytical quality and Milli-Q (Millipore) waterwas used for reverse phase (RP) HPLC analyses and purifications.

All solution-phase reactions were carried out under nitrogenatmosphere in oven- or flame-dried glassware with magneticstirring and dry solvents were used. Solid-phase peptide syntheseswere performed on a Chemspeed ASW100 automated synthesizer,in double-jacket glass reactors.

RP-HPLC analyses were performed on a Thermo system usinga Chromolith performance RP-18e column (4.6 ¥ 100 mm, 5 mm)with P1000 XR pumps. The mobile phase was composed of 0.1%


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(v/v) TFA-H2O (Solvent A) and 0.1% TFA-CH3CN (Solvent B),unless otherwise noted. A gradient elution (0–10 min: 100% to50% A) was applied at a flow rate of 3 mL min-1. Column effluentwas monitored by UV detection at 214 and 254 nm using a ThermoUV 6000 LP diode array detector. Semi-preparative purificationsof peptides were performed on a Varian PrepStar system with SD-1 Dynamax R© pumps, using a Microsorb C18 column (21.4 mm ¥250 mm, 100 A pore size, 5 mm). The mobile phase was similaras for the analytic system, unless otherwise notified. A gradientelution (0–40 min: 90% to 50% A) was applied at a flow rate of20 mL min-1. Column effluent was monitored by UV detection at214 and 254 nm using a Varian UV-Vis Prostar 325 diode arraydetector.

Purification of reaction products was carried out by flashchromatography using silica gel 60 (230–400 mesh) and theindicated solvents. Optical rotation were obtained using a Perkin-Elmer 243B polarimeter. 1H NMR and 13C NMR spectra wererecorded using Bruker Avance spectrometers DPX-400 and DPX-500. Chemical shifts (d) are given in ppm and J values are givenin Hz. Mass spectra were obtained either under electron impact(EI, 70 eV) or electrospray ionization (ESI) conditions after directinjection (HRMS) or using GC-MS coupling (column: fusedsilica gel, 15 m, 0.25 mm, 0.25 nm phase SPB-5). Peptides werecharacterized by electrospray ionization low- and high-resolution(ESI, HRMS) obtained from the Mass Spectrometry Laboratoryat the European Institute of Chemistry and Biology (IECB),Pessac, France.

(R)-3-Benzyl-1-(but-3-enyl)-3-(2-nitrophenylsulfonamido)-azeti-din-2-one (5). To a solution of methyl (R)-2-benzylserinate45 (1.05 mmol, 219 mg) in CH3CN (40 mL) were added 2-nitrobenzenesulfonyl chloride (NsCl, 2.31 mmol, 511 mg) andKHCO3 (5.25 mmol, 525 mg). The reaction mixture was stirredovernight under reflux. The temperature was decreased to 50 ◦C,then homoallylic amine hydrochloride (1.57 mmol, 169 mg) andKHCO3 (1.57 mmol, 157 mg) were added and the solutionwas allowed to stir at 50 ◦C until full consumption of the N-nosyl aziridine. The reaction mixture was concentrated and theresidue was purified by flash chromatography, eluting with EtOAc–Hex (3 : 1), to furnish the expected methyl (R)-2-benzyl-3-(but-3-enylamino)-2-(2-nitrophenylsulfonamido)-propanoate (340 mg,73%) as a yellow solid, mp 55–56 ◦C. [a]25

D -23.8 (c 1.05 inCH2Cl2); nmax(KBr)/cm-1 3339 (NH), 1738 (C O), 1540 (NO2);dH(500 MHz; CDCl3) 1.98–2.03 (2 H, m, NCH2CH2), 2.33–2.38(1 H, m, NCH2CH2), 2.43–2.48 (1 H, m, NCH2CH2), 3.00 (1 H, d,J 12.5, CH2Ph), 3.07 (1 H, d, J 12.5, CH2Ph), 3.31 (1 H, d, J 13.4,CCH2NH), 3.43 (1 H, d, J 3.4, CCH2NH), 3.61 (3 H, s, OCH3),4.95–4.98 (2 H, m, CH CH2), 5.56–5.65 (1 H, m, CH CH2),7.25–7.29 (5 H, m, Ph), 7.70–7.77 (2 H, m, Ns), 7.94 (1 H, d, J 7.5,Ns), 8.17 (1 H, d, J 7.5, Ns); dC(125 MHz; CDCl3) 171.7, 147.4,136.7, 135.9, 134.8, 133.0, 132.7, 130.3, 129.9, 128.3, 127.2, 125.3,116.3, 68.2, 53.5, 52.5, 48.5, 41.3, 34.1; HRMS (ESI) calcd. forC18H20N3O6S [M - C3H5]+ 406.1073, found 406.1071.

This sulfonamide (0.62 mmol, 279 mg) was dissolved in THF(15 mL) at -10 ◦C and a 1 M solution of LiHMDS (1.55 mmol,1.6 mL) in THF was slowly added. The resulting solution wasstirred for 20 min, quenched with a saturated solution of NaHCO3

(15 mL) and extracted with CH2Cl2 (3 ¥ 30 mL). The combinedorganic layers were dried over MgSO4 and evaporated to give a

residue, which was purified by flash chromatography, eluting withEtOAc–Hex (2 : 1), to furnish 5 (220 mg, 85%) as a yellow oil. [a]25

D

-100.6 (c 0.6 in CH2Cl2); nmax(KBr)/cm-1 3421 (NH), 1750 (C O),1556 (NO2); dH(500 MHz, CDCl3) 2.08–2.12 (2 H, m, NCH2CH2),3.12 (2 H, s, CH2Ph), 3.12–3.21 (2 H, m, NCH2CH2), 3.44 (1 H,d, J 5.5, lactam CH2), 3.72 (1 H, d, J 5.5, lactam CH2), 5.00–5.05(2 H, m, CH CH2), 5.59–5.67 (1 H, m, CH CH2), 5.89 (1 H,s, NH), 7.23–7.29 (5 H, m, Ph), 7.70–7.78 (2 H, m, Ns), 7.88 (1H, d, J 8.0, Ns), 8.17 (1 H, d, J 7.5, Ns); dC(125 MHz, CDCl3)166.0, 147.4, 135.4, 134.6, 133.5, 132.9, 131.0, 130.0, 128.8, 127.7,125.3, 117.1, 70.0, 52.8, 40.8, 40.7, 31.5; HRMS (ESI) calcd. forC20H22N3O5S [M+H]+ 416.1280, found 416.1296.

N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-b-Ala-OH (7). To a solution of 5(0.38 mmol, 157 mg) in CH3CN (20 mL) were added K2CO3

(0.38 mmol, 52 mg) and thiophenol (PhSH, 0.75 mmol, 0.077 mL).The mixture was allowed to stir for 3 h at room temperature. Thesuspension was filtered through a celite pad and the mixture wasconcentrated to dryness. The residue was used without furtherpurification. It was dissolved in CH2Cl2 (20 mL) at -10 ◦C. N-Fmoc-Ala-OH (0.44 mmol, 138 mg) and N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ, 0.67 mmol, 164 mg) wereadded successively and the suspension was allowed to warmup to room temperature overnight. The reaction mixture wasthen diluted with CH2Cl2, washed with 1 M HCl, dried overMgSO4, and evaporated to give a residue, which was purified byflash chromatography, eluting with EtOAc–Hex (1 : 2), to furnishthe expected N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-but-3-ene (172 mg, 87%)as a white solid, mp 65–67 ◦C. [a]25

D -20.4 (c 1.18 in CH2Cl2);nmax(KBr)/cm-1 3298 (NH), 1745, 1666 (C O); dH(500 MHz,CDCl3) 1.35 (3 H, br s, CH3), 2.04 (2 H, s, NCH2CH2), 3.03–3.09 (1 H, m, NCH2CH2), 3.13–3.20 (2 H, m, CH2Ph), 3.22–3.26(1 H, m, NCH2CH2), 3.38 (1 H, d, J 5.2, lactam CH2), 3.54 (1H, br s, lactam CH2), 4.19–4.21 (2 H, m, Ala CH + Fmoc CH),4.37–4.42 (2 H, m, Fmoc CH2), 4.96–4.99 (2 H, m, CH CH2),5.21 (1 H, br s, NH), 5.51–5.59 (1 H, m, CH CH2), 6.64 (1 H, s,NH), 7.23–7.77 (13 H, m, Fmoc, Ph); dC(125 MHz, CDCl3) 172.4,167.4, 155.8, 143.7, 141.3, 134.7, 134.6, 130.2, 128.5, 127.7, 127.2,127.0, 125.0, 120.0, 116.9, 67.6, 67.1, 50.8, 47.1, 40.8, 38.8, 31.4,18.6; HRMS (ESI) calcd. for C32H33N3O4Na [M+Na]+ 546.2369,found 546.2365.

This compound (0.20 mmol, 103 mg) was then dissolved in amixture of CCl4–CH3CN–H2O (2 : 2 : 3 (v/v/v), 28 mL) at 0 ◦C.NaIO4 (2.95 mmol, 634 mg) and RuCl3 (3.94 mmol, 1 mg) wereadded. The resulting emulsion was stirred at room temperaturefor 2 h, after which time the organic phase of this reactionmixture was diluted with CH2Cl2 and separated, and the aqueousphase was acidified using 1 M HCl. After extraction of theaqueous phase with CH2Cl2, the combined organic layers wereevaporated to dryness to give a residue, which was purified by flashchromatography, eluting with MeOH–CH2Cl2 (1 : 10), to furnish 7(92 mg, 87%) as a white solid, mp 116–117 ◦C. [a]25

D -0.2 (c 1.25 inCH3OH); (Found: C, 68.26; H, 6.01; N, 7.76. C31H31N3O6 requiresC, 68.75; H, 5.77; N, 7.76%); nmax(KBr)/cm-1 3301 (NH), 1743(C O); dH(500 MHz, CD3OD) 1.30 (3 H, d, J 7.0, CH3), 2.08 (2H, br s, CH2COOH), 3.10–3.16 (2 H, m, CH2Ph), 3.22–3.28 (2 H,m, NCH2), 3.38 (1 H, d, J 4.5, lactam CH2), 3.53 (1 H, br s, lactamCH2), 4.14 (1 H, q, J 7.0, Ala CH), 4.20 (1 H, t, J 6.7, Fmoc CH),4.36 (2 H, d, J 6.7, Fmoc CH2), 7.22–7.30 (5 H, m, Ph), 7.31 (2


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H, t, J 7.5, Fmoc), 7.39 (2 H, t, J 7.5, Fmoc), 7.65 (2 H, d, J 6.0,Fmoc), 7.79 (2 H, d, J 7.5, Fmoc); dC(125 MHz, CD3OD) 175.4,174.7, 170.1, 158.2, 145.2, 142.6, 135.7, 131.4, 129.4, 128.8, 128.3,128.1, 126.2, 120.9, 68.7, 67.9, 51.7, 51.5, 48.4, 39.3, 38.0, 32.7,18.2; HRMS (ESI) calcd. for C31H31N3O6Na [M+Na]+ 564.2111,found 564.2128.

(R)-3-Benzyl-1-(prop-2-enyl)-3-(2-nitrophenylsulfonamido)-aze-tidin-2-one (6). To a solution of methyl (R)-2-benzylserinate45 (1.9 mmol, 398 mg) in CH3CN (40 mL) were added NsCl(4.18 mmol, 926 mg) and KHCO3 (9.50 mmol, 951 mg), andthe reaction mixture was stirred overnight under reflux. Thetemperature was decreased to 50 ◦C, allylic amine hydrochloride(2.87 mmol, 0.215 mL) and KHCO3 (2.87 mmol, 287 mg)were added and the solution was allowed to stir at the sametemperature until full consumption of the N-nosyl aziridine. Thereaction mixture was concentrated and the residue was purifiedby flash chromatography, eluting with Hex–EtOAc (3 : 1), tofurnish the expected methyl (R)-2-benzyl-3-(prop-2-enylamino)-2-(2-nitrophenylsulfonamido)-propanoate (570 mg, 69%) as a yellowsolid, mp 53–55 ◦C. [a]25

D -21.8 (c 1.00 in CH2Cl2); (Found:C, 55.72; H, 5.29; N, 9.42. C20H23N3O6S requires C, 55.42; H,5.35; N, 9.69%); nmax(KBr)/cm-1 3340 (NH), 1738 (C O), (NO2);dH(500 MHz, CDCl3) 2.92–2.98 (2H, m, CH2CHCH2), 3.05–3.08(2H, m, NCH2C), 3.39 (2H, dd, J 13.8 and 30.2, CCH2Ph), 3.62(3H, s, OCH3), 4.95–5.03 (2H, m, CH2CHCH2), 5.54–5.73 (1H,m, CH2CHCH2), 7.14–7.26 (5H, m, Ph), 7.66–8.17 (4H, m, Ns);dC(125 MHz, CDCl3) 171.6, 147.3, 136.2, 136.0, 134.6, 133.1,132.7, 130.2, 129.8, 128.2, 127.1, 125.3, 115.8, 68.4, 52.9, 52.6,51.7, 41.4; m/z (ESI) 434 (MH+, 100%).

This sulfonamide (1.31 mmol, 570 mg) was dissolved in THF(15 mL) at -10 ◦C and a 1 M solution of LiHMDS (3.3 mmol,3.3 mL) in THF was slowly added. The resulting solution wasstirred for 20 min, quenched with a saturated solution of NaHCO3

(15 mL) and extracted with CH2Cl2 (3 ¥ 30 mL). The combinedorganic layers were dried over MgSO4 and evaporated to give aresidue, which was purified by flash chromatography, eluting withHex–EtOAc (2 : 1), to furnish 6 (493 mg, 94%) as a yellow oil.[a]25

D -88.6 (c 0.75 in CH2Cl2); nmax(KBr)/cm-1 3350 (NH), 1745(C O), 2922 (NO2); dH(500 MHz, CDCl3) 3.12 (2H, s, CH2Ph),3.38 (1H, d, J 5.6, lactam CH2), 3.68 (1H, d, J 5.4, lactam CH2),3.68–3.70 (2H, m, CH2CHCH2), 5.02–5.09 (2H, m, CH2CHCH2),5.39–5.45 (1H, m, CH2CHCH2), 5.90 (1H, s, NH), 7.22–7.27 (5H,m, Ph), 7.69–8.17 (4H, m, Ns); dC(75 MHz, CDCl3) 166.0, 147.4,135.4, 133.5, 133.4, 133.0, 131.0, 130.9, 130.1, 128.8, 127.7, 125.3,118.7, 70.1, 52.3, 44.2, 40.7; m/z (ESI) 402 (MH+, 100%).

N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-Gly-OH (8). To a solution of 6(0.30 mmol, 120 mg) in CH3CN (10 mL) were added K2CO3

(0.30 mmol, 41 mg) and PhSH (0.60 mmol, 0.06 mL). The mixturewas allowed to stir overnight at room temperature. The suspensionwas filtered through a celite pad and the filtrate was concentratedto dryness. The residue was used without further purification.It was dissolved in CH2Cl2 (10 mL) at -10 ◦C. N-Fmoc-Ala-OH (0.45 mmol, 140 mg) and EEDQ (0.54 mmol, 134 mg) weresuccessively added. The solution was then allowed to warm upto room temperature and stirring was maintained overnight. Thereaction mixture was then diluted with CH2Cl2, washed with 1 MHCl, dried over MgSO4 and evaporated to give a residue, whichwas purified by flash chromatography, eluting with MeOH–DCM

(1 : 10), to furnish the expected N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-prop-2-ene (101 mg, 66%) as a white solid, mp 75–76 ◦C. [a]25

D -19.3 (c2.3 in CH2Cl2); (Found: C, 72.82; H, 6.14; N, 8.66. C31H31N3O4

requires C, 73.06; H, 6.13; N, 8.25%); nmax(KBr)/cm-1 3298 (NH),1748, 1720, 1672 (C O); dH(500 MHz, CDCl3) 1.37 (3H, d, J 6.0,CH3), 3.16 (2H, s, CH2Ph), 3.33 (1H, d, J 5.7, lactam CH2), 3.50(d, 1H, J 4.9, lactam CH2), 3.55 (1H, dd, J 15.5 and 6.2, CH2),3.76 (1H, dd, J 15.4 and 4.5, CH2), 4.16–4.21 (1H, m, Ala CH),4.27–4.36 (1H, m, Fmoc CH), 4.39 (2H, d, J 3.0, Fmoc CH2), 4.90(1H, dd, J 28.5 and 2.0, CH2), 5.00 (1H, dd, J 15.5 and 1.5, CH2),5.28–5.35 (1H, m, CH), 5.44 (1H, d, J 7.6, NH), 6.99 (1H, s, NH),7.22–7.32 (7H, m, Fmoc Ph), 7.39 (2H, t, J 12.0, Fmoc), 7.57 (2H,d, J 12.0, Fmoc), 7.75 (2H, d, J 12.5, Fmoc); dC(125 MHz, CDCl3)172.4, 167.3, 155.9, 143.7, 141.3, 134.5, 130.9, 130.2, 128.5, 127.7,127.2, 127.0, 125.0, 120.0, 118.4, 67.7, 67.1, 50.4, 50.2, 47.1, 44.1,38.8, 18.6; HRMS (ESI) calcd. for C27H26N2O3 [M–C4H5NO]+

426.1943, found 426.1948.This compound (0.098 mmol, 50 mg) was then dissolved in a

mixture of CCl4–CH3CN–H2O (2 : 2 : 3 (v/v/v), 14 mL) at 0 ◦C;NaIO4 (0.98 mmol, 210 mg) and RuCl3 (2 mmol, 0.4 mg) wereadded. The resulting emulsion was stirred at room temperaturefor 2 h, after which time the organic phase of this reaction mixturewas diluted with CH2Cl2 and separated, and the aqueous phasewas acidified with 1 M HCl. After extraction with CH2Cl2 andEtOAc, the combined organic layers were evaporated to give aresidue, which was purified by flash chromatography, eluting withMeOH–CH2Cl2 (1 : 7), to furnish 8 (35 mg, 68%) as a white solid,mp 120–121 ◦C. [a]25

D -7.4 (c 1.5 in CH3OH); nmax(KBr)/cm-1 3391(NH, OH), 1743, 1614 (C O). dH(500 MHz, CD3OD) 1.28 (3H,d, J 7.0, CH3), 3.31 (2H, m, PhCH2), 3.60 (1H, d, J 5.5, lactamCH2), 3.62–3.71 (3H, m, lactam CH2 + NCH2), 4.14 (1H, q, J 6.8,Ala CH), 4.21 (1H, t, J 6.0, Fmoc CH), 4.31–4.38 (2H, m, FmocCH2), 7.15–7.33 (7H, m, Fmoc + Ph), 7.39 (2H, t, J 7.5, Fmoc),7.67 (2H, d, J 7.0, Fmoc), 7.80 (2H, d, J 7.5, Fmoc); dC(125 MHz,CD3OD) 175.3, 170.0, 158.1, 145.2, 142.6, 136.7, 131.2, 129.3,128.8, 128.2, 128.0, 126.2, 120.9, 69.1, 67.9, 53.5, 51.7, 39.4, 18.2;HRMS (ESI) calcd. for C30H29N3O6Na [M+Na]+ 550.1954, found550.1942.

Ns-(b-Lactam)-Aib-OBn (10). To a solution of Ns-(b-lactam)-Aib-OH 95 (1.07 mmol, 479 mg) in CH2Cl2 (15 mL) at 0 ◦Cwere added oxalyl chloride (1.60 mmol, 140 mL) and a catalyticamount of DMF. The solution was stirred at 0 ◦C for 1 h, thenat room temperature for another 1 h. The reaction mixture wasconcentrated and kept under vacuum for 1 h. This freshly preparedacyl chloride was then diluted with CH2Cl2 (15 mL) and benzylalcohol (3.21 mmol, 0.34 mL) and triethylamine (6.43 mmol,0.9 mL) were added at 0 ◦C. The mixture was allowed to warmup to room temperature and stirring was maintained overnight.The mixture was then acidified with 1 M HCl, extracted withCH2Cl2, dried over MgSO4 and evaporated to give a residue,which was purified by flash chromatography, eluting with EtOAc–Hex (1 : 3), to furnish 10 (506 mg, 88%) as a white solid, mp92–93 ◦C. [a]25

D -77.1 (c 0.99 in CH2Cl2); (Found: C, 60.01; H,4.58; N, 7.95. C27H27N3O7S requires C, 60.32; H, 5.06; N, 7.82%);nmax(KBr)/cm-1 3357 (NH), 1759, 1738 (C O), 1540 (NO2);dH(500 MHz, CDCl3) 1.45 (3H, s, CH3), 1.46 (3H, s, CH3), 3.05(1H, d, J 14.0, CHPh), 3.09 (1H, d, J 14.0, CHPh), 3.48 (1H, d,J 5.3, lactam CH2), 3.75 (1H, d, J 5.3, lactam CH2), 5.15 (1H, d,


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J 12.3, OCHPh), 5.17 (1H, d, J 12.3, OCHPh), 5.85 (1H, s, NH),7.17–7.34 (10H, m, 2Ph), 7.67–8.12 (4H, m, Ns); dC(125 MHz,CDCl3) 172.2, 165.1, 147.3, 135.3, 133.5, 133.4, 132.9, 131.0, 130.0,128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 128.1, 127.6, 125.2, 68.1, 67.3, 59.0, 51.5,40.4, 23.7, 23.5; m/z (ESI) 538 (MH+, 100%).

N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-Aib-OH (11). To a solution of 10(0.75 mmol, 403 mg) in CH3CN (10 mL) were added K2CO3

(0.75 mmol, 103.6 mg) and PhSH (1.5 mmol, 0.15 mL). Themixture was allowed to stir for 3 h at room temperature. Thesuspension was filtered through a celite pad and the filtrate wasconcentrated to give a residue, which was used without furtherpurification. It was dissolved in CH2Cl2 (50 mL) at -10 ◦C. N-Fmoc-Ala-OH (0.90 mmol, 280 mg) and EEDQ (1.35 mmol,333 mg) were successively added. The solution was then allowedto warm up to room temperature and stirring was maintainedovernight. The reaction mixture was then diluted with CH2Cl2,washed with 1M HCl, dried over MgSO4 and evaporated to give aresidue, which was purified by flash chromatography, eluting withMeOH–CH2Cl2 (1 : 10), to furnish the expected N-Fmoc-Ala-(b-lactam)-Aib-OBn (390 mg, 80%) as a white solid, mp 98–99 ◦C.[a]25

D -20.1 (c 1.01 in CH2Cl2); (Found: C, 72.73; H, 6.306; N, 6.56.C39H39N3O6 requires C, 72.54; H, 6.09; N, 6.51%); nmax(KBr)/cm-1

3292 (NH), 1734, 1717 (C O); dH(500 MHz, CDCl3) 1.26–1.33(3H, m, Ala CH3), 1.38 (3H, s, Aib CH3), 1.46 (3H, s, Aib CH3),3.12–3.17 (2H, m, CH2Ph), 3.42 (1H, d, J 5.0, lactam CH2), 3.59(1H, br d, J 3.0, lactam CH2), 4.14–4.21 (2H, m, Fmoc CH + AlaCH), 4.35–4.41 (2H, m, Fmoc CH2), 5.09–5.14 (3H, m, OCH2Ph +Ala NH), 6.47 (1H, s, NH), 7.22–7.25 (5H, m, Ph), 7.31–7.33 (7H,m, Ph, Fmoc), 7.40 (2H, t, J 7.5, Fmoc), 7.57 (2H, d, J 7.0,Fmoc), 7.77 (2H, d, J 7.5, Fmoc); dC(125 MHz, CDCl3) 172.4,172.2, 166.6, 155.8, 143.8, 141.3, 135.4, 134.9, 130.2, 128.6, 128.4,128.3, 128.1, 127.7, 127.2, 127.1, 125.0, 120.0, 67.2, 67.1, 65.8,59.0, 49.7, 47.1, 38.7, 23.6, 23.55, 18.5; HRMS (ESI) calcd. forC39H40N3O6 [M+H]+ 646.2917, found 646.2938.

This benzyl ester (0.14 mmol, 90 mg) was added to a suspensionof 10% Pd/C in MeOH under H2, which was stirred for 1 h.After filtration through a celite pad and evaporation of thefiltrates, the b-lactam 11 (77 mg, 100%) was obtained as a whitesolid, degradation at 101 ◦C. [a]25

D -0.3 (c 0.49 in CH3OH);nmax(KBr)/cm-1 3404 (OH, NH), 1728, 1710, 1690, 1679 (C O);dH(500 MHz, CD3OD) 1.22 (3H, s, Aib CH3), 1.32 (3H, d, J 6.8,Ala-CH3), 1.36 (3H, s, Aib CH3), 3.16 (2H, s, CH2Ph), 3.44 (1H,d, J 5.0, lactam CH2), 3.60 (1H, d, J 5.0, lactam CH2), 4.16 (1H,q, J 6.8, Ala CH), 4.21 (1H, t, J 6.2, Fmoc-CH), 4.36 (2H, d,J 6.2, Fmoc-CHCH2), 7.21–7.33 (7H, m, Fmoc+Ph), 7.39 (2H,t, J 7.5, Fmoc), 7.66–7.67 (2H, m, Fmoc), 7.80 (2H, d, J 7.5,Fmoc); dC(125 MHz, CD3OD) 176.1, 175.5, 168.9, 158.2, 145.2,142.6, 136.2, 131.5, 129.4, 128.8, 128.2, 126.2, 120.9, 68.0, 67.1,60.1, 51.7, 50.3, 48.5, 48.4, 39.4, 24.0, 18.3; HRMS (ESI) calcd.for C32H33N3O6Na [M+Na]+ 578.2267, found 578.2258.

General procedure for solid-phase peptide synthesis (SPPS).The synthesis of all peptides was carried out on solid phase, fol-lowing a Fmoc strategy and standard SPPS protocols. Briefly, to asolution of N-Fmoc-Val-OH (10 equiv. relatively to resin loading)in CH2Cl2 (a few drops of DMF were required to ensure completedissolution) under N2 was added di-iso-propylcarbodiimide (DIC,5 equiv.). The reaction mixture was stirred for 20 min at 0 ◦C. Atthe same time, the resin was suspended in CH2Cl2 and allowed

to swell for 20 min. After filtration, the N-Fmoc-Val anhydridesolution and DMAP (0.1 equiv. relatively to the anhydride) wereadded, and the resin was shaken 4 h. After filtration, the resinwas successively washed twice with DMF, MeOH, and CH2Cl2

and again with DMF. The Fmoc protecting group was removedby using twice a solution of piperidine in DMF (1 : 4, v/v) for3 min, then for 7 min. After filtration, the resin was successivelywashed as before. The SPPS was continued using N-Fmoc aminoacids (3 equiv.) in the presence of HBTU (3 equiv.) and DIEA (5equiv.) in DMF. Each coupling reaction was performed for 45 min,after which time the resin was washed as described above. Afterfinal deprotection and cleavage from the resin, all peptides werechecked for purity by RP-HPLC and purified by semi-preparativeRP-HPLC.

Solid-phase synthesis of peptides 12–14. The H-(D)ILTV pep-tide construct on Wang resin (300 mg, 0.054 mmol) was split intothree equal fractions that were pre-swelled in DMF and to whichwere respectively added a solution of the b-lactam scaffolds 7, 8 or11 (1.5 equiv. relatively to the resin loading) in DMF, a solution ofDIEA (2.2 equiv.) in DMF and a solution of HBTU (1.5 equiv.)in DMF. The resins were shaken overnight and were washed asdescribed in the general procedure. After standard removal of theFmoc-protecting group and introduction of the two last aminoacids (N-Fmoc-Leu-OH and N-Boc-bAla-OH), final deprotectionand cleavage from the resins was carried out using a TFA-H2O-TISmixture (95 : 2.5 : 2.5, v/v/v) for 4 h. Peptides were precipitatedusing cold Et2O and then lyophilized. After purification by semi-preparative RP-HPLC, peptides 12, 13 and 14 were obtainedin correct yields: 31%, 8% and 32%, respectively (see ESI† forcharacterization data).

Solid-phase synthesis of b-lactam peptide hybrids 1–3. Thesepeptidomimetics were synthesized on an amino-PEGA resin(0.4 mmol g-1). Briefly, N-Fmoc-Gly-OH (3 equiv.) and para-hydroxymethylbenzoic acid (3 equiv.) were successively intro-duced, followed by the two first amino-acids (N-Fmoc-Val-OHand N-Fmoc-Thr(tBu)-OH) as described above. The resin wasthen suspended in a solution of DCM-TFA (50 : 50, v/v) for2 h. After filtration, the resin was washed with DCM, MeOHand again with DCM. A solution of pyridine–acetic anhydride(1 : 1, v/v) was then added and the resin was shaken for 30 min.After filtration, the resin was washed as described in the generalprocedure. After introduction of the two next amino acids (N-Fmoc-Leu-OH and N-Fmoc-(D)-Ile-OH), the resin was split intothree equal fractions. Again, after Fmoc protecting group removal,solutions of 7, 8 or 11 (1.2 equiv.) in DMF (3 mL), HBTU (1.2equiv.) and DIEA (3 equiv.) were added to each resin and letreact overnight. After washings, the two last amino acids weresuccessively introduced (N-Fmoc-Leu-OH and N-Fmoc-b-Ala-OH). The last Fmoc protecting group was finally removed andcleavage from the resins was carried out using a 0.1 M NaOHaqueous solution for 3 h. Each resin was filtrated off and washedonce with 0.1 M NaOH. The filtrates were then acidified withacetic acid until pH = 4 and lyophilized. After purification bysemi-preparative RP-HPLC without any acid in the eluent systemto prevent b-lactam ring opening, peptidomimetics 1–3 wererespectively obtained in 3%, 3% and 10% yields (see ESI† forcharacterization data).


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Peptide-MHC binding assay

The mutant LCL T-lymphoblastoid hybrid cell line 174xCEM.T2(referred to as T2 cells) is an antigen-presentation mutant line.The cells express stable HLA-A2 molecules on their surface uponaddition of an exogenous HLA-A2-binding peptide. T2 cells wereincubated with pseudopeptides 1–3 or 12–14 in AIM V serummedia (Invitrogen Co., Carlsbad, California) at 26 ◦C for 16 h,followed by incubation at 37 ◦C for 2 h. Quantification of stablesurface HLA was analysed by surface staining using the HLA-A2-specific BB7.2 antibody (from the ATCC hybridoma HB-82),and measured as mean fluorescent intensity on a FACSCanto IIapparatus (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

T cell stimulation

A Melan-A T cell line was pulsed with the endogenous peptideEAAGIGILTV (EAA) and combined with 1 mL mL-1 of brefeldinA (Becton Dickinson, Mountain View, CA) to inhibit ER trans-port. The cells were then incubated for 14 h at 37 ◦C, washedtwice with PBS and stained with 1 mg of antigen presenting cell(APC)-labelled Melan-A-HLA-A2 tetramer for 30 min at 4 ◦C.The cells were then washed twice using PBS and resuspended in 100mL of Cytofix/Cytoperm solution (Becton Dickinson, MountainView, CA). 2mL of anti-INFg PE-labeled mAb, 2mL anti-CD107aFITC-labeled mAb and 2mL of anti-CD8 PCP-labeled mAb(Becton Dickinson, Mountain View, CA) were added to the cellsand incubated for 20 min at 4 ◦C. The cells were then washedtwice with Perm/Wash (Becton Dickinson, Mountain View, CA),resuspended in 100 mL of Cytofix/Cytoperm solution and run onthe FACSCantoII (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Thermal stability measurement

Circular dichroism measurements of thermal stability were per-formed using an Aviv 62DS instrument, monitoring a wavelengthof 218 nm as previously described.28 Solution conditions were20 mM phosphate and 75 mM NaCl (pH 7.4). Protein con-centrations were approximately 10 micromolar. The temperatureincrement was approximately 0.3 ◦C min-1. As unfolding of HLA-A2 is irreversible, CD data were fit to a six order polynomial, andthe apparent Tm was taken from the first derivative of the fittedcurve.

Acknowledgements

The authors thank the Servier laboratories and the SocieteFrancaise de Chimie Therapeutique for financial support andM.T.’s research assistantship, the Ministerio de Educacion yCiencia (MEC, Spain) (Grant CTQ2006-13891/BQU) and Go-bierno Vasco (ETORTEK inanoGUNE IE-08/225) for financialsupport and I.A.’s research assistantship. J.J.M is supported by anNHMRC Biomedical Fellowship. Mathew Clement and KristinLadell are gratefully acknowledged for their contribution to theproduction of T cell lines and FACS analysis.

References

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