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THESE
pour obtenir le grade de
IDOETISUR ]D]g I9UN]IV]SRSIIT]U ]Dtr MWTT"
Mention "Toxicologie de I'Environnement"
soutenue le 9 Juillet 1993
TRANSFORMATTON MORPHOLOGTqUE
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DES CELLULES SHE ETI COMMUNICATIoN INTERCELLULAIRE DES v7g
APPLIqUEES A LA DETECTION DEII
CANCEROGENES NON GENOTOXIQUES
THalima BESSI
II MEMBRE' DU JURY
I Prol'esseur P. VASSEUR - Université de Mgtz - Directeur de thèseI Docreur G . NcuYnN-BA - CNRS- Vllejuif - rapporreur
I Professeur B. RgfffER- Université de Strasbourg - rapport€ur
- Docæur Z. E,LILS - INRS Vandoeuvre les Nancy
I Professeur E. M. BUXIIIDIR - DoyendelaFacultédesSciencesdeMeknès-
DocteurJ. F. Fnnlnn - Université de Metz
II
\b ?85t{6UNIVERSITE DEII,/ÏETZ
1993
THESE
pour obtenir le grade de
]DOET]UUR ]D]B ]I9UNIIV]SIRS]IT]B ]D]g afiWTT,'
Mention "Toxicologie de l'Environnement"
soutenue le 9 Juillet lW3
TRANSFORMATION MORPHOLOGIQUEDES CELLULES SHE ET
COMMUNICATION INTERCELLULAIRE DES V79APPLIqUEES A LA DETECTION DE
CANCEROGENES NON GENOTOXIqUES
Halima BESSI
MEMBR,ES DU JURY
Professeur P. VI,SSBUR - Université de Meu - Drecteur de thèse
DocrÊur G . Ncuynx-BA - cNRs- villejuif - rapporreur
Profqsseur B. RETHER - Univenité de Strasbourg - rapporteur
Docbur Z. E;LIAS - INRS Vandoeuwe les Nancy
Professeur E. lVf, BnlfHlDIR - DoyeQde la Faculté des Scienoes de Meknès
Docteur J. F. Fnnano - Université de Metz
s/b$Fa
Ce travail a été réalisé
au Laboratoire de Tbxicologie,
du Centre des Sciences de l'Environnement,
sous la Direction du Professeur P. VASSEUR.
C'est le montent pour moi de rendre hommnge
au Professeur I. CHOUROULINKOV
qui m'a soutenue tout au long de cette érude.
Fasse que ce travail soitfidèle à sa pensée.
Remerciements
De simples mots ne peuvent exprimer ma profonde reconnaissance, mon
admiration et mon rcspect pour le Professeur P. VASSEaR, qui m'a accueillie
dens son laboratoire pour laréalisation de ce travail.
Votre bienveillance à mon égard, votre soutien et la confrance que vous m'avez
accordée sur le plan de la reclrcrche, resteront inoubliables pour moL
Grâce à vous, mon séjour en France a été fructueux, tant sur le plan
professionnel que sur le plan hunwin.
Mes sincères remerciements sont adressés au Docteur G. NGUYEN-BA,
chercheur au CNRS (Villejuifl pour le soutien et l'intérêt qu'il a toujours
accordé à cette étude.
Je vous remercie d'avoir accepté d'être rapporteur de ce travail.
Je voudrais témoigner mn reconnnisscurce pour sa collaboration, au Professeur
B. RETHER du Iaboratoire de Biologie Végétale Appliquée à |'I.U.T. de
Strasbourg, qui, malgrê ses nombreuses occupations, a accepté de juger ce
travail en tant que rapporteur.
Je désire vivement remercier le Professeur Z. ELIAS pour son accueil dans
son unitê et ses préciew conseils. Je lui suis recormaissante d'anir accepté de
participer à ce jury,
fe souhaite remercier le Professeur J.F. FEnnnO pour ses conseils et l'intérêt
constant qu'il a murilesté à l'égard de ryon travail ; je lui suis recorunaissante
dc participer à ce jury.
Att terme de ce trauil, je tiens à expritner mo gratitude au Professeur
E. BELKHADIR, Doyen de la Faculté de Meknès, qui a étë à l'origine dc rna
verute en France et qui me fait I'luttncur dc figurer parmi lcs membres de cejury-
Merci à Claudine RAST j'ai apprécié la qualité de ton travail et ton sincèreannur pour la reclærchc. J'ai apprécié également ton amitié.
Un grand merci à Maryline et Nathalie qui, par leur gentillesse et leur
efficacité,ont grandement contribué à l'élaboration de cette thèse.
Je soulnite témoigner mo reconrwissance à Anne-Marie, Marie-Cécile, Carole,
Vércnique, Lucie, Sophie, Chnntal, Jean-Christophe, Ali et Fabrice. Je leurafuesse mes plus vifs remerciements pour leur aide, le soutien et l'amitié qu'ils
m'ont apportés.
Enfi,n une pensée toute particulière pour Claude et Omaf ma "petite famille"dc Metz, je suis fière d'anir connu des gens aussi "grailds".
Un grand merci à tous les amis de Metz.
Ce moment important rne semble idéal pour témoigner à mes parents, à
Taouftq, toute mon affection et ma recotmaissance pour l'arnoun la confiance
et le soutien sarc faille qu'ils m'ont accordés ; je leur dcdie ce travail.
Iz financement de ces travawc a été assuré par le Ministère fu l'Environnerncnt et par uneburse du Gouvermetnenl Français darrs lc cadre de l'Action Inlégrée entre I'Université dc Metzet b Facuhé de Meloùs.
L'aide financière de Ia CEE (contrat STEP-CT9I-016-DTEE) a contribué égalcment à rmencrcette étudc àtcnru.
Quc les resporcables dc ces organisrnes en soient rernerciés.
ADN
AMPc
ARN
ATP
B(a)Pt,la)r i
cHo :
DFMO
DG:
DMEM
DMSO
DXME
EC:
HGPRT
LTSTE DES ABREVIATIONS
Acide désoxyribonucléique
Adénosine monophosphate cyclique
Acide ribonucléique
Adénosine triphosphate
Benzo(a)pyrène
Ovaires d'hamster chinois
d-D ifl uo rométhylornithine
Diacylglycérol
Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Dulbecco's modified Eaglemedium)
Diméthyl sulfoxide
Dexaméthasone
Effïcacité de clonage
Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase
Hydrocarbures polycycliques aromatiques
Inositol triphosphate
Kilobecquerel
Ornithine décarboxylase
Phosphate buffered saline : Tampon phosphate
Phosphatidylinositol-4, 5-diphosphate
Proteine Kinase C
Echange de chromatides soeurs (sister chromatides exchange)
Sodium dodecyl hydrogénosulfate
Embryons d'Hamster syrien
6-thioguanine
I 2-0-tétradécanoyl-phorbol- I 3-acétate
Synthèse non programmée de I'ADN (unsheduled Synthesis DNA)
HPA
IP3 :
KBq
oDc
PBS
PIP2
PKc
SCE
SDS
SHE
6-TG
TPA
UDS
SOMMAIRE
INTB,ODUCTION
Elf]DE BIBLTOGRAPIIIQUE
I - Historique de la cancérogénèseil - Concepts des mécanismes de la cancérogénèseIII - Mécanismes génétiques de la cancérogénèse chimique
A - Dommages et réparation de I'ADNB - Principaux types de mutationsC - Systèmes de réparationD - Méthodes d'étude des altérations de I'ADN
D.l - Essais relatifs aux mutations géniquesD.2 - Essais relatifs aux mutations chromosomiquesD.3 - Essais relatifs aux effets sur I'ADND.4 - Méthodes de détection des adduits à I'ADN
IV - Mécanismes épigénétiques : implications dans la cancérogénèse
A - Mécanismes de transmission du signal mitotiqueB - Inhibition de la communication intercellulaireC - Propriétés de I'ester de phorbol, 12-0-tétradécanoyl-
phorbol-l3-acétate ou TPA
C.l - Action sur la protéine kinase C et la mobilisation du Ca++C.2 - TPA et inflammationC.3 - Génération de radicaux libres et des formes actives
de l'oxygèneC.4 - Induction de I'activité ODC et de la biosynthèse des
polyaminesC.5 - Inhibition de la communication intercellulaireC.6 - Inhibiteurs des effets du TPA
D - Propriétés des cancérogènes non génotoxiques autres queles esters de phorbol
D.l - Les promoteurs type TPAD.2 - Les promoteurs type non TPA
V - Transformation cellulaire in vitro, rôle dans la cancérogénèse
VI - Chlordane
A - Production et utilisationB - Métabolisme, résidus et toxicitéC - Données sur la cancérogénicité du chlordane
VII - CNorothalonil
A - Production et utilisationB - MétabolismeC - Effets toxiquesD - Données sur la concérogénicité du cilorothalonil
Page
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46
689
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l3t4r7
24
26
293030
33343535
MATERIEL et METHODES
I - Les produits chimiques 3T
A - Benzo(a)pyrène (B(a)P)B - I 2-0-tétradécanoyl-phorbol- 1 3- acêtate (TPA)C - Dexaméthasone
-
D - 2 Amino-6-mercaptopurine ou G-thioguanine (6-TG)
II - Substances et échantillons étudiés 38
A - ChlordaneB - ChlorothalonilC - Extraits organiques d'un lixiviat de déchet B et d'un
percolat de décharge T4
III - Le test d'Ames 39
A - Réactifs biologiquesB - Protocole et expression des résultats
IV - Test d'inhibition de la coopération métabolique sur cellules V79 4r
A - Réactifs biologiquesB - PrincipeC - Protocole du testD - Expression des résultats
v - Essai de transformation cellulaire sur cellules d'embryons de 43Hamster syrien (SHE)
A - Réactifs biologiques
A,_1 - Préparation des cellules primaires d'embryons deHamstei syrien (SHE)
X?;iîliilton préliminaire de sérum, cellules et milieu
B - PrincipeC - Protocoles
C.l - Effet transformant completC.2 - Effet initiateurC.3 - Effet promoteur
D - Expression des résultats
VI - Etude de l'activité ODC sur cellules SIIE +8
A - PrincipeB - ProtocoleC - Expression des résultats
YII - Mesure du Ca2+ cytoplasmique libre en cytométrie de fluxpar utilisation du
-'Flùo I'
A - Réactifs biologiquesB - PrincipeC - Protocole
VIII - Recherche des adduits à I'ADN du chlordane par la méthodede post-marquage sur les cellules SHE
A - Préparation et traitement des cellulesB - Isolement et purifïcation de I'ADNC - Détection des adduits
C.l - Etapes enzymatiquesC.2 - Etapes chromatographiquesC.3 - Autoradiographie des plaques et
comptage de la radioactivité des spots
D - Calcul du nombre d'adduits
RESI]LTATS
Partie I
Etude de la mutagénicité du chlordane, du chlorothalonilet des extraits organiques du percolat T4 et du lixiviat B
I - ChlordaneII - ChlorothalonilIII - Percolat de décharge et lixiviat de déchet
A - Percolat T4B - Lixiviat B
Partie II
Etude de I'inhibition de la coopération métabolique entredes cellules fibroblastiques de la lignée V79 par le chlordane,le chlorothalonil et des extraits organiques du percolat T4et du lixiviat B
I - Inhibition de la coopération métabolique par le chlordane
II - Inhibition de la coopération métabolique par le chlorothalonil
III - Inhibition de la coopération métabolique par les extraitsorganiques du percolat T4 et du lixiviat B
Partie III
Etude des effets du chlordane, du chlorothalonil et des extraitsorganiques du percolat T4 et du lixiviats B, sur la transformationdes cellules d'embryon de Hamster syrien (SHE)
I - Chlordane
A - Traitement par le chlordane seulB - Traitement séquentiel par le chlordane et le TPAC - Traitement sériuentiel
-par le B(a)P et le chlordane
D - Action de la dexaméthasone sur les effets combinésdu chlordane et du TPA
II - Chlorothalonil
A - Traitement par le chlorothalonil seulB - Traitement ôéquentiel par le chlorothalonil et le TpAC - Traitement séquentiel par le B(a)P et le chlorothalonil
5 l
5656
57S8
6 l
6z
62
64
6+6566
666767
III - Transformation morphologique des cellules (SHE) par lesextraits organiques de T4 et B
A - Extrait organique du percolat de décharge T4
4.1 - Traitement par l'extrait organique T4 seul4.2 - Traitement séquentiel par I'extrait organique
du percolat T4 et le TPA4.3 - Traitement séquentiel par le B(a)P et I'extrait
organique du percolat T4
B - Extrait organique du lixiviat B
8.1 - Traitement par l'extrait organique du lixiviat B seul8.2 - Traitement séquentiel par l'extrait organique
du lixiviat B et le TPA8.3 - Traitement séquentiel par le B(a)P et l'extrait
organique du lixiviat B
PaÉie fV
Effet du chlordane sur l'activité ODC des cellules SHE
A - Cinétique d'induction de I'ODC par le chlordaneB - Effets du chlordane sur l'activité ODC induite par le
TPA
Partie V
Effet du chlordane sur le taux CaZ+ intracellulaire des cellules SHE
A - Modulation du Ca2+ libre intracellulaire parl'ionomycine
B - Effet du chlordane sur le taux du Ca2+ intracellulairelibre des cellules SHE
C - Effets du TPA sur le taux de Ca2+ intracellulaire libredes cellules SHE prétraitées au chlordane
D - Effets du chlorothalonil sur le taux de Ca2+intracellulaire libre des cellules SHE
Pa"rtle VI
Mise en évidence d'adduits sur I'ADN des cellules SHE en présenceet en absence du chlordane
DISCUSSION GENERAI,E
CONCLUSION
7777
68
70
79
8o
8:
87
93
INTRODUCTION
La cancérogénicité est l'une des formes de toxicité des polluants lesplus redoutables de par le caractère complexe, souvent inéluctable ducancer, et ses manifestations tardives. Hygiénistes etenvironnementalistes se sentent désarmés pour prévenir et combattreun processus dont la plupart des mécanismes leur échappe.La stratégie de prévention, au niveau environnemental, consisteactuellement à réglementer voire interdire, sur la base de donnéesexpérimentales ou épidémiologiques, l'usage des substances àpropriétés cancérogènes susceptibles de se retrouver à terme dansI'environnement.
La détection des potentialités cancérogènes avant commercialisationd'une substance repose sur deux approches : la première estI'expérimentation animale avec la réalisation d'essais à long terme ; ladeuxième, complémentaire ou alternative à la précédente, estI'approche uin 7/ùtro' basée sur la mise en oeuvre d'essais à court termesur cultures de cellules procaryotes et eucaryotes.Les essais stantardisés et préconisés par la législation dans ce but ont,pour principe, de détecter des effets sur I'ADN, par exemple desmodifÏcations structurales ou des altérations du caryotype. Ces essaispermettent d'identifier des substances "génotoxiques' ; mais lescancérogènes agissant sur des cibles autres que le génome échapperontà un tel screening.Le caractère néoplasique de cancérogènes agissant par desmécanismes épigénétiques ne peut être détecté dans le cadre de laréglementation actuelle, qu'à la suite d'expérimentation à long termechez l'animal. Il n'existe pas d'essais in ui,tTT stantardisés quirépondent à cet objectif. Conscientes des lacunes de la réglementationactuelle, les instances internationales, CEE, OCDE ont incitérécemment au développement de ces méthodes.
Notre travail s'inscrit dans ce contexte et concerne la détection inui'trr des cancérogènes non génotoxiques. Cette détection est basée surles propriétés de ces substances d'activer la prolifération cellulaire, deperturber le contrôle de la croissance et de la différenciation descellules et de potentialiser l'action des agents génotoxiques enfavorisant la multiplication des cellules initiées.
Les essais mis en oeuvre étudient :- la transformation morphologiqued'Hamster syrien SHE selon Berwald(1969), Chouroulinkov et Lasne (1978),- la communication intercellulaire dechinois V79 selon Trosko (1979),
des cellules embryonnaireset Sachs (1963), DiPaolo et al.
- l'activité de l'ornithine décarboxylase.
lignées de cellules de Hamster
Ces essais, intégrant différents schémas d'application pour latransformation cellulaire, ont été étudiés pour leur capacité à détecterdes potentialités cancérogènes de contaminants de l'environnement età apporter des informations sur le profil d'action probable.Deux pesticides chlorés, le chlordane et le chlorothalonil, reconnuseomme étant cancérogènes chez I'animal mais non mutagènes, ont ététestés à I'aide de cette batterie d'essais.Des lixiviats de déchets et percolats de décharge ultimes ont étéétudiés dans les mêmes conditions.L'ensemble de cette étude permettra de discuter d'une stratégieapplicable à l'évaluation de la cancérogénicité des substanceschimiques, à celle des milieux environnementaux et de Ieurs sourcesde contamination.
La première partie de ce travail est une sSrnthèse bibliographique desprincipes de la cancérogénèse chimique impliquant des mécanismesgénétiques et épigénétiques. Certains mécanismes d'action decancérogènes non génotoxiques et leur cibles potentielles serontprésentés afin de justifÏer du choix des méthodes utilisées dans cetteétude ; ils seront illustrés à l'aide du TPA (12-O-tétradécanoyl-phorbol-13-acétate) qui est I'un des promoteurs de tumeurs les mieuxconnus.
Les deuxième et troisième parties seront consacrées respectivementaux matériel et méthodes et aux résultats obtenus avec la batteried'essais mis en oeuvre.Des investigations complémentaires ont été nécessaires pour expliquerles profils d'action observés avec le chlordane et ont concerné :
- la mesure des adduits à I'ADN qui a été réalisêe par leProfesseur B.Rether du laboratoire de biologie végétale appliquée àl'ruT de l'Université de Strasbourg
- la mesure des flux calciques réalisée, avec la collaboration duDocteur G. Nguyen-Ba, sous la direction du Docteur Z. Mishal dans leservice de cytofluomètrie, IRSC-CNRS de Villejuif.
Une étude des potentialités mutagènes de ces échantillons a étéréalisée, au prêalable, à l'aide du test d'Ames qui est, classiquement,le premier essai in vitro mis en oeuvre permettant de juger d'uneréaction sur I'ADN, afin de vérifier les données bibliographiquesconcernant les deux pesticides conformément au schéma classiqued'évaluation.
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
f. Historique de la cancérogénèse
Le cancer est une maladie très ancienne. Des paléopathologistes ontobservé des lésions néoplasiques sur des os de dinosaures ; de même,l'autopsie de momies a révélé l'existence de tumeurs osseuses(Zimmerman, L977).L'association entre les facteurs environnementaux et le cancer, n'estpas nouvelle : dès 1700, Ramazzini relevait la fréquence élevée decancers de sein chez les religieuses, en liaison avec leur style de vie. En1761, le physicien John Hill soulignait la fréquence des polypes nasauxchez des sqiets habitués à priser le tabac. Quelques années plus tard,en 1775, Percival Pott décrivait pour, la première fois un cas demaladie professionnelle et faisait le lien entre I'exposition des jeunesramoneurs à la suie des cheminées et le développement des cancers duscrotum chez ces sqjets, une fois parvenus à l'âge adulte (Miller, 1978).En 1918, Yamagiwa et Ichikawa réalisaient la première épreuve decancérogénèse chimique en laboratoire, en induisant des tumeurscutanées de l'oreille de lapin par applications répétées de goudrons.En L924, Kennaway isolait des hydrocarbures aromatiquespolycycliques (HAP), des goudrons de houille et réussissait à identifieret à synthétiser l'un des composés les plus actifs, le benzo(a)pyrène(B(a)P).
Depuis, de nombreux travaux ont permis de déceler le pouvoircancérogène de plusieurs familles chimiques (Kennaway, L924 ;Hueper, 1966 ; Sugimura et aI., L977 ; Kasai et al., 1980 ; Bartsh etTomatis, 1983 ; Gold et aI., 1984 ; Merletti et a,1., 1984 ; Vainio et aI.,1985).
Parallèlement à la cancérogénèse expérimentale, les étudesépidémiologiques soulignaient que la plupart des cancers humains (60à 90 %) serait liée à des facteurs environnementaux incluant aussi bienle tabac, les aliments, les produits pharmaceutiques, les polluantsatmosphériques, que le mode de vie des individus (Higginson et Muir,L977 ; Doll et Peto 1981 ; Johnson, 1982 ; Cullen, 1986).
De l'ensemble de ces travaux, il apparaît que la cancérogénèse résulted'une interaction complexe et dynamique entre I'individu et sonenvironnement.
If. Concepts des mécanismes de la cancéroEénèse
Le concept selon lequel la mutagénicité est une propriété intrinsèquedes cancérogènes, est maintenant admis depuis de nombreuses années.Dès 1914, Boveri rapportait que la présence d'anomalieschromosomiques serait à I'origine de la formation de tumeurs malignes.Plus tard, Miller et Miller (1947) mettaient l'accent sur le rôle deI'activation métabolique dans I'expression de la cancérogénicité desHAP. Brookes et Lawley (1964) montraient que certains cancérogèneschimiques présentaient la propriété de se lier à I'ADN. Miller (1970),Miller et Miller (L977) mettaient en évidence que la propriétécommune de cancérogènes de structure très diverse était leurcaractère électrophile : l'électrophilie leur confère la propriété de selier par covalence aux sites nucléophiles des macromoléculescellulaires, en particulier à ceux de I'ADN qui constitue la cible la pluscritique des cancérogènes.Une altération de I'ADN, si elle n'est pas réparée avant la divisoncellulaire, peut constituer l'un des premiers événements du processusde cancérogénèse, désigné sous le terme d'"initiation".
La mutation, est un élément initiateur du cancer d'autant plusprobable qu'elle touche des gènes essentiels au contrôle de la divisioncellulaire, comme des protooncogènes ou encore des gènessuppresseurs de tumeurs.L'activation anormale des protooncogènes en oncogènes est à l'originedu dérèglement des voies présidant à Ia croissance et à ladifférenciation cellulaire et peut augmenter la probabilité detransformation néoplasique et de cancérisation des cellules. Lestravaux de Brown et al. (1990) et de Sukumar (1990) démontrentI'implication des protooncogènes en cancérogénèse et en particuliercelle d'une mutation spécifique du protooncogène Ha-ras dansl'initiation des cancers mammaires chez les rongeurs. Par ailleurs, latransfection d'animaux par I'oncogène viral a-Ha-ra,s qui permet desauter l'étape d'initiation dans l'induction expêrimentale des tumeurscutanées chez la souris, illustre encore le rôle de cet oncogène encancérogénèse (Bailleul et a1.,1989).Les gènes suppresseurs de tumeurs entraînent un dérèglement de lacroissance et de la différenciation cellulaire, s'ils sont inactivés,contrairement aux protooncogènes qui perturbent ces mécanismes unefois activés. L'inactivation de ces gènes essentiels peut résulter deplusieurs mécanismes : soit les deux allèles du gène sont inactivés parsuite de mutations (Cavenee et aI., 1983), soit seul I'allèle dominant estmutê (Sapienza, 1990) ; ou encore, la dégradation protéolytique duproduit de ces gènes est accélérée, ainsi qu'il a été avancé pourexpliquer l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs (Scheffneret a1.,1990) dans le cas du rétinoblastome (Knudson, 1971 ; 1985).
Le concept du processus multiétape dans la cancérogênèse a êtêintroduit par Berenblum et Shubik (1947) ; ces auteurs ont montréqu'un traitement séquentiel de la peau de souris par le benzo(a)pyrèneappliqué une seule fois et à faible dose, suivi d'applications répétéesd'huile de croton, potentialisait l'action cancérogène du B(a)P enaugmentant fortement la production de tumeurs cutanées et enraccourcissant leur délai d'apparition. Ces travaux sont à l'origine duconcept de la cancérogénèse chimique en deux étapes : initiation etpromotion.
L'étape de la uprogression" a été introduite ensuite par plusieursauteurs (Nowell, 1976) ; cette étape est caractérisée par uneaugmentation de I'instabilité génétique se manifestant par desanomalies du nombre et de la structure des chromosomes. Cesanomalies ont été constatées aussi bien in tfitro, dans les cellules enculture, qu'in viao dans les cellules de tumeurs solides, au cours deleur évolution vers la malignité.
Cette subdivision de la cancérogénèse en trois étapes, initiation,promotion et progression, est utilisée pour des raisons desimplification ; elle est fondamentalement discutable, puisque chaqueétape pourrait, elle-même, être subdivisêe en plusieurs événementsmoléculaires (Bishop, 198? ; Weinberg , 1989). Ceci est d'autant plusévident que six événements génétiques et épigénétiques indépendantsont été très tôt distingués dans certains types de cancers tel que lecancer colorectal (Cairns, 1975).
L'initiation, la promotion et la progression sont, néanmoins, les étapesles mieux définies en cancérogénèse expérimentale :
- l'iftùtintinn aboutit à I'altération structurale et persistante deI'ADN ; cette atteinte peut résulter de I'exposition cellulaire à desfacteurs chimiques, physiques (radiations), ou biologiques (virus,...), oud'erreurs au cours de la rêplication de I'ADN.Les cellules 'initiées' réagiraient moins aux signaux inter et intracellulaires qui régulent la croissance et I'homéostasie cellulaire, telsque les facteurs 'négatifs' de croissance qui induisent la différenciationterminale ou programment la mort d'une cellule normale (Yuspa etHarris, 1982 ; Wiley et aI., 1984 ; Yuspa et Poirier, 1988 ; Rotello et aI.,1991).Les dérivés dits génotoxiques qui produisent des dommages au niveaude I'ADN, contribuent en partie ou en totalitê à I'initiation cellulaire.Ces dêrivés sont donc des ùnitûntarrs potentiels et sont utilisés commetels en cancêrogénèse expérimentale i'n vi'uo oa in ui'tTo.
- la Trromotion est l'étape généralement associée à la phase deprolifération cellulaire des cellules initiées. Elle correspond à unepériode de latence plus ou moins prolongée qui prêcède I'expressiondu cancer sous forme de tumeurs. Cette étape implique la sélection etl'expansion clonale des cellules initiées (Harris, 1991). La proliférationcellulaire dérégulée, augmenterait la probabilité d'erreurs et dedommages génétiques, qui, en s'accumulant dans les cellules, peuventfavoriser l'évolution du processus de cancérogénèse.L'ester de phorbol, TPA (12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate) est lepromoteur de référence : c'est I'un des principes actifs de I'huile decroton. Cette substance a été et reste très utilisée en cancérogénèseexpérimentale afin d'élucider les mécanismes dits 'épigénétiques' de lapromotion tumorale.
- la grrogressi'on, qui est aussi une étape mal élucidée,correspond à l'ensemble des événements qui induisent la conversiond'une tumeur bénigne en une tumeur maligne et participent à leurévolution. La progression tumorale se caractérise par uneaugmentation de l'instabilité génétique des cellules et par leurcapacité progressive à échapper aux contrôles cellulaires et à évoluertrès activement vers I'autonomie. Ces cellules finiront par envahir lestissus voisins en développant des métastases : c'est l'étape ultime etsouvent irrémédiable du processus cancéreux.
III - Mécanismes Aénétiques de la cancéroqénèse chimique
A - I)ommaqes et réparation de I'ADN
Au fur et à mesure de l'étude des mécanismes d'action descancérogènes, il est apparu que la propriété d'endommager lastructure et,/ou les fonctions de I'ADN était partagée par une grandevariété de cancérogènes, qui ont de ce fait été qualifiés de'génotoxiques'. Cette capacité à endommager I'ADN résulte souvent dela fixation covalente de Ia substance gênotoxique à I'ADN, en formantdes 'adduits' ; la réactivitê vis-à vis de I'ADN peut être évaluêe à I'aidede produits marquês par la mesure d'un indice, le 'Covalent BindingIndex' ou CBI, selon la méthode de Lutz (1979). Le caractère réactif ouélectrophile a ainsi été déterminé pour différentes classes decancêrogènes.
Les conséquences biologiques de la formation d'adduits, dépendent de
la nature de ces adduits et de leur localisation sur la molécule d'ADN.Par exemple, la méthylation de la guanine sur I'azote 7 est moinsmutagène que sur I'oxygène 6, puisque dans le premier cas' l'azoteméthylé peut encore participer à l'établissement de liaisons
hydrogènes avec la cytosine, tandis que le deuxième cas entraÎne unmésappariement avec la thymine : au terme de deux cycles réplicatifs,I'erreur est fixée sous la forme d'une transition GG:>AT (Loveless,
1969 ; Bartsch et aL,1983).
Certains adduits provoquent une importante distorsion de la moléculed'ADN et sont hautement mutagènes, tels que les adduits desmétabolites de I'aflatoxine 81 sur 7N-G (Venitt et Parry, 1984).D'autres entraînent des mutations ponctuelles par substitution,délétion ou addition de bases. Des mutations chromosomiques peuvent
aussi en résulter, comme dans le cas où l'alkylation de I'ADN entralneune dêpurination suivie d'un clivage hydrolytique.
Toutefois certaines substances sont capables d'induire des mutations,sans que I'on puisse mettre en évidence de liaison covalente à I'ADN :les intercalants qui s'insèrent entre deux plans de bases en sont un
exemple. Des mutations génomiques peuvent aussi résulter del'interaction avec d'autres cibles que I'ADN, telles que le fuseaumitotique.
La cellule a la capacité de réparer son ADN lésé ; schématiquement,trois situations peuvent se présenter suite à I'activation desmécanismes de réparation:
- la rêparation est parfaite, et la molécule d'ADN est ramenêe à
son état initial sans laisser de mutations.- les capacités de réparation sont insuffrsantes pour remédier
aux altérations trop importantes ; le blocage de la réplication de I'ADNqui en résulte, peut provoquer la mort de la cellule, auquel cas lamutation n'a aucun risque de se manifester.
- la réparation est imparfaite et I'ADN lésé n'est pas restituédans son état initial : ce processus peut conduire à des altérationsstables génêtiquement transmissibles. Ce troisième type de réponseaboutit donc à la fixation de la lêsion, qui sera transmise auxgénérations ultérieures de cellules sous forme d'une mutation.
En torinolqte génÉttqrrc, il est classiqtn de con'sidêrvr qrc tou't Wenterogènc ou endogène Wi end,otnmnge I:ADN et/ou indui't une réapti'on deréparatinn ind:im,triæ dc furnmages prêeristants au nùaeau du gÉrwmn,
est un cannêrcgènp potanttcl.
Ashby et Tennant (1990) ont étudié la corrélation entre la réactivitévis-à vis de I'ADN, la mutagénicité évaluée sur Salmonellntgphimurùu,m lui,s- et la cancérogénicité in vi,uo sur des rongeurs, pour301 substances appartenant à des catégories chimiques très diverses.Ils ont trouvé une étroite corrélation entre la réactivité d'une moléculevis-à-vis de I'ADN exprimée par sa structure chimique et son potentielmutagène ; mais la relation de ces deux caractères avec lacancérogénicité chez l'animal est loin d'être aussi bonne.
Ainsi, l'essai sur Salmonella apparaît très sensible aux composés destructure électrophile et conclut à la mutagénicité de 84% de cescomposés ; mais il donne aussi 33% de faux positifs dans la mesure oùil classera "génotoxique" 33% des substances non cancérogènes dont lastructure présente un caractère réactif. Une autre limite de ce test demutagénèse est son incapacité à détecter des cancérogènes "inertesnvis-à-vis de I'ADN.
Ces travaux soulignent le fait qu'actuellement les essais degênotoxicitê in rlilrr ne peuvent refléter tous les stades du processusde la cancérogénèse et que le principal intérêt de ces méthodes résidedans l'identification des substances capables d'altérer I'ADN etd'induire la phase initiale du processus de cancérisation. Mais d'autresévénements génétiques etlou épigénétiques seront nécessaires avant lestade de tumeur et de malignité.
Etant donné la complexité du processus cancérogène par rapport à lasimplicité relative des essais à court terme, il apparaÎt que, même sil'intérêt de ces essais est indéniable en terme de potentialitégénotoxique, leur interprétation en terme de risque cancérogènenécessite par contre, la plus grande prudence.
B - Principaux trmes de mutations
Le terme de mutation désigne tout changement du contenu informatifdu matériel génétique, qui est transmis aux générations suivantes decellules ou d'individus. Les altérations du contenu informatif de I'ADNet de son organisation peuvent revêtir des degrés divers et aller de lasimple modification d'un nucléotide dans un codon, à celle du nombrede chromosomes dans le génome.On peut donc distinguer 3 grandes classes de mutations : les mutationsponctuelles ou géniques, les mutations chromosomiques et lesmutations génomiques.
. Les muta,tions ponctuelles ou gêniqu,es portent sur une ou quelquesséquences de nucléotides au niveau d'un ou de plusieurs codons d'ungène. Ce type de mutation peut être le résultat de :
- substitution de paires de bases (c.à.d. remplacement d'unebase par une autre),
- délétion ou insertion d'une ou de plusieurs bases au sein d'unou de plusieurs codons : ceci entraîne un décalage du cadre de lecturedu code génétique de I'ADN ; ce type de mutation est appelé'frameshift-.
Les mutations 'directesu résultent dans la perte de la fonctionnormale d'un produit génique, contrairement aux mutations 'reverses"
qui restaurent la fonction d'un gène ayant subi une mutationpréalable.
. Les muta,tinns chromnsanwiques se caractérisent par des altérationsmorphologiques de la structure de I'ADN, détectables par l'examen descellules au stade de la mêtaphase pendant la mitose. Les mutationschromosomiques résultent de la cassure et de la recombinaison dumatériel chromosomique durant le cycle cellulaire ; elles incluent desinversions et des translocations de chromosome.
Les mutati,ons génonai,qu,es se caractérisent par un changement dunombre de chromosomes. Le génome haploïde est multiplié par 2 dansles cellules diploïdes ou euploïde ; lorsqu'il est multiplié par un facteurdifférent de 2, il y a polyploïdie. L'aneuploidie se caractérise par laperte ou le gain d'un chromosome au cours de la division cellulaire.
C - Svstèmes de réparatlon
L'ADN n'est pas une cible passive, la réponse de la cellule vis-à-vis desagressions se manifeste par l'activation de différents systèmes deréparation, ainsi qu'il a dêjà été dit plus haut.Les rêparations dites fidèles telles que la réparation par excision-resynthèse de base ou de nuclêotide, par réponse adaptative ou parphotoréactivation, restituent généralement un ADN identique à sonétat initial : aucune mutation ne s'exprime chez la descendance.D'autres systèmes de réparation erronée comme la réparation SOS,permettent à la cellule de survivre et de se diviser mais au risqued'acquérir des mutations supplêmentaires. La réparation erronée estune source m4jeure de mutation.
l 0
D - Méthodes d'étude des altérations de I'AI)N
D.l - Essais relatifs aux mutations qénioues
Les essais les plus largement utilisés sont ceux effectués desorganismes simples procaryotes (bactéries) ou eucaryotes, réalisés surdes levures, des cellules d'insectes, des cellules de mammifères(cellules fibroblastiques d'origine ovarienne CHO, ou pulmonaire V79de Hamster chinois ).
Essais sur Procarvotes : Test d/Amps
Le test d'Ames est un test de mutation réverse, développé par Ames eta,1., (1975) . C'est le test bactérien le plus utilisé pour la détection despropriétés génotoxiques des produits chimiques et d'échantillonsenvironnementaux complexes.Ce test utilise plusieurs souches de Salmnnella tgphimurium, portant
chacune un type de mutation différent dans l'opéron codant pour labiosynthèse de l'histidine. Ces bactéries auxotrophes pour cet acideaminé sont donc incapables de se multiplier en milieu déficient enhistidine.L'exposition de ces mutants his- à des mutagènes, entraÎne laréversion du gène muté : les bactéries redevenues prototrophes pour
l'histidine (révertants his+) récupèrent simultanément la capacité decroître et de former des colonies en milieu dépourvu d'histidine. Lepouvoir mutagène est évalué par I'augmentation du taux de mutantsreverses his+ induits par I'exposition à la substance testée.
Contrairement aux mammifères, les bactéries sont déficientes ensystème enzymatique pour la mêtabolisation de pro-mutagènes enmétabolites électrophiles capables d'interagir avec I'ADN. Pour pallier
à cette défïcience, le milieu d'essai est supplémenté par une fractioncytoplasmique d'hépatocytes de mammifères (Sg mix) riche enmonooxygénases et en cofacteurs enzJrmatiques. L'essai est effectuésans et avec 39 mix afin de détecter les mutagènes respectivementactifs directement ou après métabolisation.
Un autre essai de mutation réverse sur des mutants E. coÙiauxotrophes pour le tryptophane est également utilisé en toxicologiegénétique.
Test de mutation qénique sur cellules eucaryotes
Des souches mutants de la levure Sanclwrcmyæs cewvisiae ont étédéveloppées pour la détection des mutations directes ou réverses, de
Wpe substitutions de paires de bases et décalage du cadre de lecture.
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Les essais sur cellules de mammifères CHO ou V79 sont actuellementles plus utilisés après le test d'Ames, pour la détection des mutationsgéniques. Ils utilisent des mutants défTcients pour I'enzymehypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HGPRT-).
D.2 - Essais relatifs aux mutations chromosomiques
La détection des aberrations chromosomiques et des effetsclastogènes se traduisant par la présence de micronoyau(x) dans lecytoplasme fait appel à des essais sur cultures de cellules demammifères ou à des expérimentations in tviuo sur vertébrés, le plussouvent sur mammifères.
D.3 - Essais relatifs aux effets sur I'AI)N
La détection de la synthèse d'ADN hors réplication constitue la basede tests de génotoxicité sur cellules de mammifères en culture et i'nutuo. L'activité des systèmes de réparation est mesurée par le tauxd'incorporation d'un nucléotide tritié dans I'ADN des cellules dont lecycle cellulaire est bloqué.L'étude de l'échange de chromatides soeurs (SCE) dans I'ADN descellules de mammifères rentre également dans cette catégorie d'essais .Les SCE sont des échanges réciproques de matériel gênétique auniveau de loci apparemment homologues ; on en connaÎt encore mal lesmécanismes, mais ils sont considérês comme des indicateurs sensiblesde I'exposition à des substances génotoxiques.
D.4 - Méthodes de détection des addults à I'AI)N
La mesure des adduits à I'ADN permet d'évaluer l'électrophilie d'unesubstance et son degré de réactivité vis-à vis de I'ADN.Différentes méthodes ont été successivement proposées pourquantifier et identifier ces adduits : la mesure du CqYalent Bindingmaex (Lutz, 1979) , la mêthode de post-marquage
"n 32P (Randerath
et al., 1981), les méthodes immunochimiques (Wild, 1990) les méthodeschromatographiques (Shuker et â1., 1991) et les méthodesfluorimétriques (Tffeston et Bowman, 1991).
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IV - Mécanismes énieén
Si le cancer est au stade final une maladie des gènes des cellulesnéoplasiques, la genèse de la maladie et sa progression semblent êtregouvernés par un principe moteur qui est un déséquilibre entresignaux de régulation. C'est en provoquant ce déséquilibre à un niveaugénétique ou épigénétique, que les agents cancérogènes de toutenature font basculer certaines cellules de l'état normal vers un étatcancéreux.
Si I'impact des agents génotoxiques sur le génome peut être assezaisément détecté ; il est, par contre, très difficile d'identifrer celui descancérogènes non génotoxiques d'autant que les cibles sont multipleset varient d'une classe de promoteurs à I'autre ; Ies mêcanismesépigénétiques sont complexes et loin d'être élucidés.Totts les Trromnteurs id,enti.fi,és partagent cependant In prcpriétéd ind'uire In prolùJëratinn cerlulaire, autrsment dit di ind,uiret hgperylnsi,e.
La croissance cellulaire est régulée par un ensemble d'agentsextracellulaires polypeptidiques, stimulateurs comme les faeteurs decroissance et les hormones, et d'agents inhibiteurs, dont l'équilibreconcourt à maintenir l'état normal de la cellule. La proliférationcellulaire est aussi rêglée par la différenciation qui restreint la divisioncellulaire, en modifiant le statut de la cellule.
Dans ces processus, les signaux que la cellule reçoit de sonenvironnement, sont essentiels. Des stimuli touchant la transmissiondes signaux mitogènes de l'extérieur de la cellule jusqu'au noyau, oualtérant les échanges entre la cellule et son environnement, peuventcréer un déséquilibre susceptible d'engendrer une proliférationanarchique. Tant que I'origine du dêséquilibre est exogène,I'hyperplasie est réversible ; par contre, dès que le déséquilibre estd'origine endogène et inscrit génétiquement, il peut aboutir à unnéoplasme.
L'importance des voies de signalisation intracellulaires et de lacommunication intercellulaire, dans le maintien de l'homéostasie descellules, est apparue à la suite des études sur le mécanisme d'action depromoteurs connus, comme les esters de phorbol ; ces études ontmontré que ces promoteurs affectaient pour la plupart, les voies de lacroissance etlou de la diffêrenciation cellulaire.Ces voies de signalisation et de communication seront rappelêesbrièvement, alin de situer I'impact potentiel des cancêrogènes non$énotoxiques et celui des promoteurs connus, dont l'action s'inscrit àleur niveau.
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A - Mécanismes de transmission du siqnal mitotique
La transmission des signauxjusqu'au noyau, quelle que soitmis en jeu, suit un schémasuccessivement:
mitogènes de I'extérieur de la cellulela voie empruntée et les intermédiairesgénéral dont les étapes impliquent
. In fination dlun facteu.r dp croissance sur son récepteurmem,Urann:ire, ce qui induit un chnngement de la cor4for-mntinn d'e laparti,e intprne du rêcepteu,r et déclennhe Ia suùte des rëont;inns,
. f antiaa,tinn dlune ou de plusi,eurs protêi,nes kina,ses, à, laqtnllemncède urrp cascad,e dlonti,ua,tinn dlautres lsi'na'ses et dpphosphorylntinns,
. ï antiaati,on par plnsph,oryla,tinn des fantnurs transcri,ptipnnekd, Iior@ne dp In réplinatinn d,e AADN et de In ùi,ai,sinn cellul,aire.
Deux voies de transmission du signal mitotique sont bien décrites : lavoie des phosphatidylinositols et celle de la tyrosine kinase (figure 1).
In uoi,e d,es plnsphatid,glinnsùtnls est celle empruntée par des facteursde croissance comme le PDGF (platelet derived growth factor) dont lavoie de signalisation implique la phospholipase C à l'intérieur de lamembrane et les phosphatidylinositols. L'activation de la lipasehydrolyse le phosphatidylinositol-4,5-diphosphate (PIP2) endiacylglycérol (DG) et inositol triphosphate (IP3). , ,
L'IP3 induit la libération des ions Ca-- stockés dans leréticulum àndoplasmique, ainsi qu'un influx d'ions Ca++ à partir dumilieu extracellulaire.
Le diacylglycérol (DG) au sein de la membrane, active laprotéine kinase C (PKC) ; cette activation, dépendante de laconcentration en Ca++ et en phospholipides entraînera (i) laphosphorylation de protéines à sérine et thréonine, (ii) l'activation deI'antiport Na+/H+ qui gouverne I'entrée de Na+ et la sortie des protonsde la cellule.L'élévation du pH et du calcium intracellulaire, la phosphorylation demolécules cibles constitueront les éléments clé du signal mitotique.
Le TPA, par analogie structurale au diacylglycérol et d'autrespromoteurs apparentés à l'ester de phorbol peuvent activerdirectement la PKC et donc déclencher les étapes suivantesaboutissant à la réponse mitotique. Cette interaction est unedémonstration directe qu'un cancérogène non génotoxique peutinterférer directement dans le circuit de stimulation de la proliférationcellulaire.
La asip des tgrosi,nes lsi,nases wiuie par f EGF (epidermal growthfactor) fait intervenir le récepteur de I'EGF, une protéine kinasespécilique des résidus tyrosine ; cette kinase activerait I'antiportNa+/fl+ et participerait à I'ouverture des canaux calciques.
r4
L'activation du récepteur d'EGF est suivie également d'uneaugmentation de la concentration de I'adénosine monophosphatecyclique (AMPc), par activation de l'adényl cyclase.
Quels qu,e soient les fantetrs d,e croi,ssance et les aoiesemTrrttntêes, les réponses imm,ëdiates dp la cellule à' la sti'mulatipn d) unmùtogènte sont les mêntes : Le pH du egtnplnsme déIèue, la connqntra'tinnintranellula:i,re en ipns CaÎ+ atqrm,entc ; ces êaènsments se trad'uisent a,urai,aea,u dp f ADN par lierTrressian instantnnêe d,e protnonnogùtes corIvIttÊc-fos, c-rnuc et c-jun, qui aboutû d f inducùinn d,e la di,tvi,si'on cellulai're.
L'identifïcation des cibles de promoteurs de tumeurs "type", etune meilleure connaissance des mécanismes de la croissance et de laprolifération eellulaire ont permis de définir des points d'impactpotentiels des cancérogènes.non génotoxiques, ce sont:
- les voies de transmission du signal mitotique,- la protéine kinase C,- I'activation de protooncogènes ou I'inactivation de $ènes
suppresseurs de tumeurs,- I'activation d'enzyrnes clés dans la cha-rne de biosynthèse des
polyamines, par exemple I'activation de I'ornithine décarboxylase(oDc),
- la synthèse des phospholipides et leur conversion enmédiateurs de I'inflammation tels que les prostaglandines,
- la génération de radicaux libres,- I'altération structurale et fonctionnelle de la membrane
cytoplasmique.
Cette liste est loin d'être exhaustive mais illustre la multiplicitédes mécanismes épigénétiques potentiels de la cancérogénèse. Lacomplexité et la diversité de ces processus expliquent la diffTcultéd'identifier les événements responsables du processus tumoral.
B - Inhibition de la communication intercellulaire
La communication intercellulaire est essehtielle pour le maintien del'homoéostasie des tissus. Dans la majorité des tissus, les cellules sontliêes par des canaux transmembranaires : Gap junctions (Gis), Quipermettent le passage direct d'une cellule à I'autre, d'ions et demolécules de faible poids molêculaire (< 1000 daltons), (Loewenstein,1979; Hertzberg et Johnson, 1988).Ces molécules pouvant être des nuclêotides, des nuclêotides cycliques,des acides aminés, du glutathion, de l'inositol triphosphate et des ionsde calcium ( Lawrence et al., 1978 ; Saez et aI., 1989).
CELLTILE NO I
CELLULE NO2
CYTOPLASI-,IE
tn *Ja*nlajeue
EXTR.ACELLiJIAIRE
Èlernbrane
plasrnique
ESPACE
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c0ttEItilE
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IOPOLOGIE DE IÂCOIfNEJIL\]E
CYTOPI-A-qYE+II
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ESPTCEEXTR,ACELLLILAIRE
rdentiq'e por:r res d.ifférrentes connerines$rface hydrophobe
Figure 2: Vue schémarique des Crapjunctions dans la membrane et topologie des connexines.(Yamasaki et a!., l99O).
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COC!.'r
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Les Gap junctions n'ont pas une structure globale identique d'un tissuà I'autre mais possèdent une structure de base similaire. Elles sontformées par un ensemble de protéines membranaires, les connexines,dont certaines ont été clonées (Paul, 1986 ; Kumar et Gilula, 1986 ;Beyer et aI., 1988 ; Zhang et Nicholson, 1989). Le groupement de sixconnexines forme un connexon qui constitue un demi canal danschaque membrane cytoplasmique et prend place en face du connexonde la cellule opposée pour établir un canal complet (Figure 2).
La topologie des connexines au sein de la membrane étudiée parplusieurs groupes de chercheurs (Goodenough et ot., lg88 ; Milks et a,1.,1988 ; Zhang et Nicholson, 1989) montre que la protéine serait pliée endeux au sein de la membrane sous forme de M et présenterait deuxzones extracellulaires et trois zones cytoplasmiques où seraientlocalisées les terminaisons amines et carboxyles.Les zones cytoplasmiques correspondent aux régions variables d'uneconnexine à I'autre et renferment des séquences qui peuvent êtrephosphorylées par la tyrosine kinase, la kinase dépendante de I'AMPcyclique et la PKC (Hertzberg et Johnson, lg88).
Le degré de Ia communication intercellulaire par les Gap junctions estrégulé par le nombre de canaux présents au sein de la membrane, ainsique par le nombre de canaux ouverts et donc fonctionnels.
Le caractère fonctionnel des Gap junctions serait soumis à un doublesystème de contrôle par I'AMP cyclique qui augmente la pérméabilitémembranaire et la PKC qui la diminue par phosphorylation desprotéines (Gainer et Murray, 1986 ; Saez et aI., 1986 ; Takeda et aI.,1987 ; Saez et a1.,1990).
L'inhibition de la communication intercellulaire à travers les Gapjunctions par des promoteurs a été mise en évidence par plusieursauteurs (Murray et Fitzgerald, 1979 ; Trosko et al., IgSz ; Fitzgerald etMurray, 1980 ; Williams, 1980 ; Yamasaki et aI., lgSS). Le tableau 1,présenté ci-contre résume les résultats obtenus par I'LARC (Yamasaki,1990) sur l'inhibition de la communication intercellulaire, par une sériede promoteurs, in vtuo, sur des systèmes cellulaires différents.
Un effet suppresseur de la transformation est exercé par des cellulesnormales sur des cellules transformées, lorsque ces deux typescellulaires établissent des junctions fonctionnels. (Meh ta et ot , lg86 ;Dotto et al., 1988 ; Bigmani et al., lg88).
Tab leau I : Compara i son des e f fe t s p romoteu rs' l a commun lca t l on l n te r ce l ' l u l a l r e v i a ' l es gap
m ' i c ro i nJec t i on de Jaune de l uc l f e r d ' une sé r l eYamasak i , 1990 ) .
i n v i vo e t des e f fe t s d ' i nh i b l t l onJunc t l ons (GJ IC ) pa r l a mé thode
de subs tances ch im iques (F i t zge ra ld
subs tance ( a )
TPA
PDDPDBuMezere i n0 iacy lg l yce ro lPRADL-ZAMI 1305DDTBHAPhenoba rb i t a ' l
P romot i oni n
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E l eva ted pHAs co rba teUrac i ITGF-B ( i n v i t r o )Human p lacen ta ex t rac t3 ,3 " 4 ,4 ' - PCB? ,z ' , , 4 . 4 ' , 5 . 5 ' , - PCB2 ,3 ,4 .4 "5 , - PCg2.z ' , ,5 , 5 ' - PCB
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( b ) I nh ib i t l onde
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+c o c u ' l t u r e ) +c o c u l t u r e )
:
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++++
+++?+++
( a ) PDD, Pho rbo ' l - 12 ,13 d i decanoa te ; PDBu , pho rbo ' l - 12 .13 -d ibu t y ra te ; DL -ZAMI 1305 ,DL -1 - (2n i t r o -3 -me thy l - phenoxy ) -3 - t e r t - bu t y ' l - am ino -p ropan -2 -oL ; DDT ,d i ch ' l o rod i pheny l t r i ch l o roe thane : BHA, bu ty l hyd roxyan l so ' l e ; BHT, bu ty l a tedhyd roxy to ' l uene ; TGF-p , t rans fo rm ing g rowth fac to r B ; pCB, po ' l ych l o r i na ted b ipheny l .
( b ) 3T3 , Ba lb / c 3T3 : SH t , ce l l u l es d ' embryon d ' hams te r sy r i en : RLE , ce l l u l esép i t hé l i a l es de f o i e de ra t ; HLE . ce l l u l es ép l t hé l l a l es de f o l e huma in , V lg ,ce l ' f u l es f i b rob las t l ques , U79 d ' ams te r ch lno l s ; I {HEK , Ke ra t l nocy tes ép lde rm lquesnorma les d 'ho rune , I {MEK. Ke ra t l nocy tes ép lde rm iques de sou r l s no rma làs ; HHb , ce l l u lesmeso thé l I a l es huma lnes .
( c ) cancé rogène pou r I ' home .
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La co-culture de cellules C3H10TL/2 normales et transformées aboutità la suppression de la prolifération de cellules transformées lorsquedes Gap junctions sont présents et fonctionnels (Mehta et aI., f 986).
L'existence de Gap junctions hétérologues entre des cellules NIH 3Tgnormales et des cellules Balb/c3T3 transfectées par myc s'accompagned'une suppression de ta prolifération clonale des cellules transfectées.Dans le cas d'une absence de Gap juhctions entre les NIH 3T3 normaleset des cellules transfectées par ras et src, la prolifération de cesdernières est maintenue (Bigmani et al., 1988).
In vitso, la tumorigênicité de cellules épidermiques transforméesgreffées sur un animal isologue est supprimée quand ces dernières sontassociêes à un nombre important de cellules normales (Dotto et a'1.,1988).
Cette corréIation n'est cependant pas systèmatique, des agentspromoteurs comme l'acide lithocholique et des acides déo:rycholiquesn'inhibent pas la communication intercellulaire sur les cellules de lalignêe V79. Ces exceptions soulignent le fait que I'inhibition de Iacommunication intercellulaire n'est pas un mécanisme d'actionintrinsèque de tous les promoteurs.
L'ensemble de ces travaux soulignent I'importance de l'inhibition de lacommunication intercellulaire dans Ia cancérogénèse.
La. sui,te de cettp êtrù,e bibùi,ographiqtæ traite des aspects dnsmécani,s.mes êpigênêtùqrcs lps naieur connus impÙtqtÉs dans lesphénornè,nes d,e cannûrogênèse. Liester dp plwrbol, 12-0-tëffon'écnaUlplnrbol-lgqnétnte ou 7?A, a été clni,si convtnp mpdèle dn promntnurturnsral ; I,e TPA est le plrats putssant promoteur conml, i,I a fait Ii obietauec dl autres promnteurs id,enti,fi,ês plus rêcam:mnnt, de nambreuntraaaur qui, ont contri,buÉ à. éIu,cidsr certn:ins des mÉcani,s-mes dB lacan c Srog ên è s e épig én ëtùqu,e.
Dans un deu,rièmp temps, nto?ts prêsmterons d autres promotnurstumtra,u.r, en souùignant les partinulari,tês de leur mêca,ni,sne d antinnet leurs carontères Wûrenti,els êuentuels par rapport au TPA.
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Figure 3 : St ructure développéeet du TpA
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C - Propriétés de I'ester de phorbol. lZ-0-tétradécanovluhorbol-l 3-acétate ou TPA
Les esters de phorbol constituent la famille la mieux étudiée despromoteurs connus.
Flashentranger en 1930 isola pour la première fois le phorbol à partirde l'huile de croton, extraite des graines d'une euphorbiaccae : crot'ontiglium.
La molécule du phorbol de formule chimique C29H2BO6, renferme unnoyau d.iterpène et des groupements hydroxyles (figure 3). Le phorbolen lui même est inactif mais ses diesters possèdent un pouvoircancérogène ; ces derniers ont été bien définis chimiquement (Hecker,
1968), en particulier le TPA formé par estérification de I'hydro:ryde enL2 par l'acide myristique et de I'hydroxyle en 13 par l'acide acétique.Certaines modifications structurales telles que l'estérification deI'hydroxyle en position 20, une liaison ester en position 13, I'ouverturedu noyau cyclopropane et la substitution de I'acide gras par unacétate en position L2, réduisent fortement ou détruisentcomplètement I'activité biologique des diesters de phorbol (Rochette-
Egly, 1978).Le passage en position q de I'hydroxyle en 4, ou sa méthylation rendla molêcule complètement inactive.
Une autre voie d'inactivation du TPA est sa conjugaison avec un acidegras de longue chaine pour donner le TPA-2O-acylate ; ce dernier estplus lipophile que le TPA mais inactif quant à I'induction de tumeurssur la peau de souris, dans un schéma initiation-promotion.La métabolisation du TPA se fait par déacylation du groupement esterà la position LZ et 13, qui résulte en la formation de mono esters :phorbol-l3-acétate (PA) et l2-0-tétradécanoyl phorbol (TP) ; cesmétabolites, plus hydrophiles que le TPA, sont inactifs ou peu actifscomme promoteurs (Hecker, 1968).
Le TPA n'est pas mutagène sur bactéries et cellules de mammifères(Weinstein, 1980).
Il est caractérisé par son potentiel à induire des tumeurs sur la peaude souris, préalablement exposée à des doses subcancêrogènes decancérogènes connus. Le TPA induit les mêmes effets sur d'autrestissus (ovaires, estomac, intestin) aussi bien chez le rat que chez lasouris, lorsqu'il est appliqué selon un schéma initiation- promotion, telque celui utilisé par Berenblum.
TPA :
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Figure 4 : strucrures développées du TpA et du diacylglycérol
l 8
L'application répétée du TPA sur la peau de différentes souches desouris entraûre, également, la génération de tumeurs malignes à lasuite d'une période de latence très prolongée (Chouroulinkov etLazar,1974); ces études ont souligné la sensibilité spécifique des différentessouches vis-à-vis du TPA, attribuée à une certaine prédispositon deI'animal hôte due à la présence constitutive de cellules initiées.
L'application topique du TPA sur la peau de souris est à l'origined'une multitude de réponses biochimiques et morphologiques. Parmiles effets observés, 3 évènements apparaissent corrélés le plus avecI'action promotrice du TPA :
- I'induction rapide d'une réaction inflammatoire au niveau du derme,- I'induction de I'activité de I'ornithine décarboxylase (ODC), enz5rmeclé de la voie des polyamines,- I'apparition d'une hyperplasie par multiplication aetive des cellulesépidermiques (Weinstein, 1988 ; Fisher et aI., 1989).
Ces effets sont souvent associés à I'activation de la protéine kinase C(Castagna et al., L982 ; Nishizuka, 1984) et sont accompagnés de lagénération de radicaux libres et de formes actives de I'o>rygène (Fqiitaet a,1., 1984).
C.l - Aetion sur la protéine kinase C etl*titltior d., c"++
Le TPA, de part son analogie partielle avec le diacylglycérol (figure 4) ,active la PKC aussi bien in vi,uo qu'in tfitro (Castagna et a,1., 1982 iNishizuka, 1984).La capacité des esters de phorbol à activer la PKC est bien corrèléeavec leur potentiel tumorigène (Nishizuka, 1984). La distribution de laPKC à travers plusieurs tissus est sirnilaire à celle des sites de liaisondes esters de phorbol (Ashendal et aI., 1983).
Les esters de phorbol, à la différence du diaeylglycérol et desactivateurs endogènes de la PKC, ne sont pas mêtabolisés rapidement :ils restent actifs longtemps, une fois intercalés au sein de la membranecellulaire. (Castagna et al., 1982).
Le TPA agit en synergie avec,les ionophores de Ca2+ (42318?) pourI'activation de la PKC. Le Caz+ provoquerait une rapide redistributionde la protéine kinase C du cytoplasme vers la membrane plasmique etrendrait ainsi les cellules plus sensibles aux effets des esters dephorbol (May et al., 1985 ; Wolf et a,1., 1985).
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La PKC exercerait un contrôle de 'feed back' négatif sur plusieurs
étapes participant à son activation : elle induirait une diminution dutaux de I'IP3, en stimulant son hydrolyse par activation de laphosphatase IP3, ou en bloquant l'hydrolyse des phospholipidesinositol_ en DG et IP3. Alternativement, la PKC stimulerait l'éliminationdu CaZ+ intracellulaire par activation du transport Caz* ATPase(Nishizuka, 1988).
Le TFA peut donc stimuler I'action double de la PKC ; néanmoins, nese dégradant pas rapidement, son action persiste et la liaisonprolongée de la PKC avec la membrane peut initier la dégradation dela PKC et sa disparition de la cellule (Nishizuka, 1988).
L'élimination de la PKC par cette voie, supprimerait le contrôle exercépar cet en4rme dans la régulation des fonctions cellulaires etentraînerait une prolifération ineontrôlée en présence de stimulimitogènes.
C.2 - TPA et inflammation
Les études sur le rôle des prostaglandines et le métabolisme de l'acidearachidonique dans la tumorigénicité ont été menées suite à la mise enévidence d'infiltrations et de modifications de la perméabilitévasculaire induites par le TPA, sur la peau de souris.Des taux élevés de prostaglandines ont été détectés dans les urinesd'animaux développant des néoplasies, ainsi que dans des cellulestransformées en culture.L'acide arachidonique et ses métabolites n'existent pas à l'état libredans le milieu intra ou extra-cellulaire en I'absence de stimulationphysique, chimique ou hormonale. Il est stocké sous forme d'acidesgras liés d'une façon covalente au second carbone desphosphoglycérides membranaires. Le TPA provoque le relargage deI'acide arachidonique à partir des phospholipides membranaires paractivation de la phospholipase A2, figure 5.L'acide arachidonique libre est le substrat d'enzymes qui conduisent àla synthèse des acides gras médiateurs de I'inflammation par deuxvoies distinctes :
- la voie des prostaglandines synthétases incluant lescycloo:rygénases et prostaglandines endoperoxidases ; cette voieproduit une prostaglandine intermêdiaire, PGA2, qui constitue lesubstrat d'autres enz5rmes impliquês dans la synthèse desprotaglandines : PGE, PGF et PFD,
- la voie des lipooxygénases qui résulte en la formation d'acidesgras hydroperoxydes. Elle est à I'origine de la production deleucotriènes (Flower et Blackwell, 1979 ; Weinstein, 1980 ; Fisher etol., 1989).
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Figure 6 : Voies de biosl'nthèse des por;'amines dans res tissus de mammifères.(Jiinne et oI.,l97g).
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20
C.3 - Génération de radicaux libres et des formesactives de I'ornrqène
L'implication de radicaux libres, particulièrement ceux dérivés de lamolécule d'oxygène dans la cancérogénèse chimique, a fait l'objet deplusieurs revues (Cerutti, 1985 ; Troll et Wiesner, 1985).En réponse à des promoteurs, les neutrophiles et les macrophagesaugmentent leur consommation en oxygène, oxydent le glucose etgénèrent 02'- et H202 (De Chatelet et aI., L976 ; Kensler et Trush,1981). L'int-eraction An TPA avec la PKC est suivie par I'activationd'une oxydase pyridine dépendante localisée dans la membraneplasmique (Patriarca et al., 1970 ; Fqjita et a'1., 1984).Le TPA module également les systèmes de défense de la cellule contreles agents oxydants en inactivant la superoxyde dismutase (SOD) et lacatalase. (Solanki et aI., 1981).
Le traitement par des antioxydants phénoliques ou par des enzyrnesde détoxification tels que la SOD ou la catalase, inhibe plusieursactions des promoteurs aussi bien sur la peau de souris que sur descellules transformées en culture (Kozumbo et al., 1985 ; Weitzman etol., 1985).Ainsi, la génêration de radicaux libres actifs par des cancérogènes nongénotoxiques, doit jouer un rôle dans les phénomènes de promotion.Les mécanismes moléculaires exacts de leur participation, restentencore obscurs.
c.4 - Induction de I'activité.oDC et de la biosvnthèsedilolo"ttit"t
Les polyamines jouent un rôle important dans la croissance et ladifférenciation cellulaire ; toute interférence dans leur biosynthèsepeut perturber ces processus (Heby, 1981).
Les principaux précurseurs des polyamines sont : I'ornithine et Ia S-adénosyl-L-methionine. La putrescine; précurseur de la spermidine etde la spermine, est formée directement par décarboxylation directe deI'ornithine, cette réaction est catalysée par l'onai,tlairæ &ærbougla^se(ODC), figure 6.
L'ODC serait I'enz5rme clé de la biosynthèse des polyamines et jouerait
un rôle modulateur sur toutes les fonctions cellulaires qu'ellecontrôlent, en particulier la croissance et la différenciation.
L'ODC est largement distribué dans tous les tissus de mammifères, sonactivité basale est relativement faible (Scalabrino et Feridi, t981). Laplus grande partie de cette activité ODC est localisée dans le c5rtosol,une faible fraction est détectée dans certains organites cellulaires etdans le noyau (Morgan, 1987).
2 l
L'intérêt accordé à cet enzyme, comme marqueur biochimique de la
transformation tumorale, est dû à la détection d'une activité ODC
importante dans des cellules tumorales de cancers humains, tels que le
cancer de colon (sumiyoto et al., 1991) et le cancer de I'estomac(Okuzumi et al., 1991).
De même, I'application du TPA, sur la peau de souris, induit une
augmentation rapide et transitoire du taux de I'ODC, suivie par une
acèumulation de polyamines dans les cellules épidermiques (Astrup et
Boutwell , Ig82; Takigawa et al., L982; Coffino et al., 1988 ; Nguyen-Baet a,1., 1988).
L,activité ODC peut être stimulée par des facteurs de croissances, des
hormones de croissance, la teneur en acides aminés et en ions dans le
milieu (Jânne et al., 1978 ; Tabor et Tabor' 1984).La stimulation de I'activité oDc peut être obtenue également par
renouvellement du milieu (Glimour et al., 1985) et I'addition du sérum
dans le milieu (Nguyen-Ba et ol., 1989).
Le TPA agit en synergie avec des facteurs de croissance, pour
I'induction de l'activité ODC dans des cellules néoplasiques de
Hamster mais pas sur des cellules normales (O'Btren et ol.' 1988).
L'utilisation d'un inhibiteur spécifÏque de I'ODC, cx-difluoro-methyl-ornithine (DFMO), inhibe la promotion de tumeurs induites par le TPA
sur la peau de souris (Takigawa, 1982).
De même, I'application de la dexaméthasone sur la peau de souris,préalablement traitée par le TPA, montre à la fois une inhibition de la
réaction inflammatoire dans le derme et une inhibition de I'ODC
épidermique (Nguyen-Ba et Chouroulinkov, 1989 ; Nguyen-Ba et al',
1992).
L'ODC est caractérisée par une demi-vie très courte de 10 à 30
minutes (Rûssel et Snyder, 1969), liée à une dégradation de la protêine
enzymatique par des protéases. (Isomaa et a,1., 1983 ; Seely et aI',
1e82).
O'Brien et aI (198?), ont identifié une nouvelle forme d'ODC de poids
moléculaire plus élevé, produite dans des cellules épidermiques de
tumeurs induites par des esters de phorbol ; cette forme d'ODC
échapperait à la régulation qui contrôle Ie taux d'ODC dans les cellules
normâes, et confèrerait aux cellules transformées une croissance
sélective.La régulation de I'activité ODC cytoplasmique induite par le TPA se
ferait en phase post-transcriptionnelle, essentiellement par des
métallo-protéases ; I'action protéolytique intervenant dans la
dêgradation rapide de I'enzyme peut être modulée par la
dexaméthasone, mais elle varie êgalement selon l'étape de la
transformation cellulaire (Robert, 1991).
22
I
Ces travaux sont confirmés par ceux de Murakami et aI. (1992), quiidentifient la 265 proteasome, qui serait I'enzyme responsable de ladégradation du I'ODC. La modulation de I'activité ODC au niveau de sadégradation protéolytique masque peut-être un autre mécanismed'action du TPA.
C.5 - Inhibition de la eommunication intercellulaire
La communication intercellulaire qui s'établit normalement à traversles 'Gap junctions' empêcherait I'expression de l'état initié d'unecellule, si elle est entourée de cellules normales ; par contre si cettecommunication est inhibée, le phénotype initié apparaît.
L'induction de la prolifération clonale de cellules initiées est unecaractêristique de la majorité des promoteurs ; l'inhibition de lacommunication intercellulaire par ces derniers est I'un des mécanismesépigénétiques invoqués dans la cancérogénèse (Lowenstein, 1979 ;Murray et Fitzgerald, 1979 ; Yotti et al., 1979 ; Yamasaki et aI., L985 ;Sugie et aI., 1987).Le lPA inhibe la communication intercellulaire des cellules (V79)d'Hamster chinois, des cellules épidermiques de souris, des cellules delignée Balb/CBT3 et des hépatocytes de rat (Murray et Fitzgerald,1979 ; Williams, 1980 ; Fitzgerald et ol., 1989).Une bonne corrélation existe entre la capacité des esters de phorbol àinhiber la communication intercellulaire et I'induction de tumeurs inviao ; en effet, le phorbol et le 4-c-phorbol-12-13-didecanoate, connuscomme non promoteurs de tumeurs sur la peau in viuo, n'inhibent pasla communication intercellulaire (Yotti et al., 1979).
Les mécanismes d'inhibition de la communication intercellulaire par leTPA, impliqueraient la phosphorylation des protéines des Gapjunctions (Takeda et al., 1987). La libération de I'acide arachidoniqueinduite par le TPA donnerait des composês actifs au niveau des Gapjunctions incluant les métabolites de la voie des lipooxygénases, lesradicaux libres, les produits de pero:rydation de lipides et l'acidearachidonique lui-même.(Saez et al,L990).
L'inhibition de la communication intercellulaire par le TPA est réduitesous I'effet d'agents anti-promoteurs tels que I'acide rétinoique(Rogers et al., 1990) et I'AMP cyclique (Roseng et a,1., f 992).Néanmoins, le TPA n'inhibe pas la communication intercellulaire descellules épidermiques de la peau de souris in vi,ao et in uùt?p (Kam etPitts, f 988 ; Pasti et al., 1988).
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23
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C.6 - Inhibiteurs des effets du TPA.
Compte-tenu de la multitude des effets du TPA in ui,ao et in uttrr, ilest difficile de déterminer lesquelles de ces rêponses induitesparticipent à l'effet promoteur du TPA.
L'utilisation d'un grand nombre d'inhibiteurs et de modulateurs desévénements observés, a permis d'élucider I'irnportance de chaqueévénement dans le processus de formation de tumeurs.
Les inhibiteurs étudiés sont des inhibiteurs de l'hgperytlnsi,e, del'apti,ui.tê ODC et la syntlÈse des Tnlga,rni,nes, dê la sgnth,èse desptostaglandines et des inhibiteurs de In Trrotêi,ne Ri,nase C. LesantiorEdants et les inhibiteurs de ptntêases ont été également utiliséscomme inhibiteurs de la promotion (tableau 2).
Des antï,-inflammntoires stéroîd;i,ens tels que : le cortisol, ladexaméthasone et la fluocinolone acétonide, inhibent la promotion detumeurs par le TPA (Schwartz et al., 1977, Slaga, 1980).Les effets inhibiteurs de la dexaméthasone s'accompagnent d'unediminution de l'activité oDc dans le compartiment épidermique(Belman et Troll, L972; Nguyen-Ba et Chouroulinkov, 1989 ).
Le DFMO, les rétinoides, la quercétine ainsi que des complexants deradicaux libres tels que le butyl hydroxyanisole (BIIA), inhibentégalement l'activité de I'ornithine décarboxylase (Verma et Boutwell,1977 ; Slaga et aI., 1978).
Le phénidone, dibromoacétophénone, quércetine et curcumin exercentune action inhibitrice sur I'effet promoteur du TPA, aux niveaux de laphospholipase A2, les lipooxygénases etlou cyclooxygénases (Levin etal., L977 ; Gschwendt et ol., 1983 ; Hughes et aI., lgSg ; Fischer et al.,1989 ; Huang et aI., 1991)
La staurosporine, inhibiteur puissant de la protéine kinase C (Tamaokiet al., 1986 ; Kiyoto et al. 1987), inhibe la phosphorylation de protéinesinduite par le TPA (Yamamoto et ol., 1989); elle supprime également lagénération de supero)qFdes à partir de leucocytes polynucléaires (Sakoet o,1., 1988 ; Yamamoto et ol., 1989)
Des agents inhibiteurs de protéases se révèlent être des inhibiteurs dela promotion induite par le TPA ; il en est de même pour des agents,tel que la forskoline, qui entraînent I'augmentation du taux de I'AI\{Pcyclique intracellulaire (Slaga, 1980, Roseng et aI., lgg2).
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24
D - Propriétés des cancéroqènes non Éénotoxiques autres que
les esters de phorbol.
Plusieurs classes de promoteurs qui diffèrent structurellement desesters de phorbol ont êtê identifiées au cours des vingt dernièresannées. Fqiiki et aI. (1989). se sont intéressés spécialement à despromoteurs appartenant à des classes de toxines marines. Leursrésultats sur les mécanismes d'action de ces promoteurs leur ontpermis de distinguer : des promoteurs type TPA et des promoteurstype non TPA selon leur capacité à se lier ou non au récepteurmembranaire des esters de phorbol : la PKC (tableau 3).
D.l - tes nromoteurs tvpe TPA
Les promoteurs type TPA incluent les téléocidines et aplysiatoxinesqui sont des toxines marines, isolées respectivement du mycélium deStreptonryces m,ed;i,osid,us et d'une algue bleue marine.
Le TPA, téléocidines et aplysiatoxines ont des structures trèsdifférentes, mais se lient au même récepteur membranaire, la PKC,avec des affinités différentes liées à la lipophilie de chaque classe(Fqiiki et al. 1989 ; Nishizuka, 1984).
L'activation de la Protéine Kinase C par les promoteurs type TPA,entraûne la phosphorylation de la tyrosine des récepteurs des facteursde croissance épidermiques (EGF) et I'inhibition de la liaisonspécifique de I'EGF à ses récepteurs membranaires.
L'induction de I'adhêsion des cellules HL60, en suspension à l'étatnormale, a été observée pour tous les promoteurs type TPA (FÛiki etSugimura, 1987).
D.2 - Les promoteurs tvoe non TPA
La classe des promoteurs type non TPA comprend la palytoxine, lathapsigargine, I'acide okadaTque, la staurosporine ; ces promoteurs nese lient pas aux récepteurs membranaires des esters de phorbols etn'activent pas la PKC (tableau. 3).
La palgtorinn est une toxine hydrophile, dont la structure a. êtêdéterminée en 1981, par Moore et Hirota.D'une pâfr, la palytoxine n'inhibe pas la liaison spécifique 3H-TPA duTPA à ses récepteurs, n'active pas la PKC, n'inhibe pas lacommunication intercellulaire et n'induit pas I'activation de I'ODC.
25
D'autre part, elle induit ou agit en synergie avec le TPA pour lerelargage de prostaglandines à partir de macrophages (Levine et al.,1990), elle stimule également la génération d'anions superoxydes àpartir de neutrophiles (Fuiiki et aI., 1989).
L'inhibition de la liaison des EGF à leurs récepteurs par la palytoxinese fait par une voie différente de celle des promoteurs type TPA, elleest indépendante de la PKC et du taux intra et extracellulaire des ionsCaZ+, elie apparaît facititer l'influx du Na+ à travers la pompe Na+/H+.
La thnpsi,gargine, isolêe des racines de Thapstn garganina. induit uncertain nombre de réponses cellulaires (tableau. 3) qui seraientactivées par Hrl seul événement commun : l'augmentation prononcée etrapide du Caz- cytolosique libre.lJ tnapsigargine provoque une décharge directe du CaZ+ stocké dansles compartiments intracellulaires sans l'hydrolyse desinositolphospholipides membranaires, mais en o . agissant commeinhibiteur spécifique et puissant de I'ATPase Caz- dépendante, duréticulum endoplasmique (Thastrup et aI., 1990).
L'a,cide olcada:tryn est un composé polyether, isolé d'une éponge noireHal:inhondrin olmdn:t,, sa structure chimique a. été déterminée parTashibana et al., (1981) ; il est le promoteur, type non TPA, le pluspuissant et induit notamment une forte augmentation de l'activitéODC dans les tissus gastriques des rongeurs (Suganuma et al., 1988).L'acide okadaique inhibe la phosphatase 2A (Sassa et al., 1989) ; ilinduit ainsi une activation indirecte de la PKC, en favorisant lescascades de phosphorylation impliquées dans la réponse mitotique(Haystead, et aI., 1989).
La stau;rcsprinn est un alcaloïde microbien, qui exerce une actiondouble dans le phénomène de la promotion :Elle agit comme inhibiteur puissant de plusieurs protéines kinases enparticulier la PKC, en entraînant ainsi I'inhibition des effets despromoteurs type TPA (Tamaoki et al., 1986 ; Kiyoto et a,1., 1987).Maisla staurosporine agit êgalement comme irritant et induit des effetscaractéristiques de promoteurs tels que : le relargage deprostaglandines et l'induction de l'activité ODC (Jiang et aI., 1992).11 est sûr que la liste des promoteurs, cités dans cette étudebibliographique, est loin d'être exhaustive ; néanmoins, elle illustre lavariabilité des mécanismes épigénêtiques qui peuvent être impliquêsdans le processus de la cancérogénèse. Cette variabilité peut être àl'origine des effets de synergisme qui peuvent être observés entredifférents promoteurs.
26
I
V - La transformation cellulaire iz zùtro. rôle dans la cancérogénèse
On appelle transformatinn cellulnire le processus de conversion decellules normales cultivées irz uitro en cellules qui prêsentent despropriétés morphologiquement propres aux cellules néoplasiques etqui, inoculées à des animaux isologues, développent des tumeurs(Elias, 1993).Comrne le processus de cancérogénèse in ui,ao, la transformationnéoplasique iz uitro est un processus progressif qui implique plusieursétapes qualitativement différentes depuis I'initiation jusqu'au stadetumorigène (Barrett et Ts'o, 1978 ; Kakunaga et Yamasaki, 1985 ;Thomassen et al., 1985).
L'essai de la transformation morphologique de cellules en culture,occupe une place importante et particulière parmi les différentssystèmes d'étude de la cancérogénèse. Le phénotype transformé est leeritère étudié qui exprime les modifications morphologiques résultantde I'ensemble des altérations génotoxiques etlou épigénétiques quipeuvent s'opérer au cours de plusieurs cycles de division des cellulescultivées en présence d'un agent environnemental à risque.
La transformation cellulaire sur cellules mime in trùtro, les différentesétapes de la tumorigénicité in aiao et répond ainsi au but recherché :la détection d'une activité cancérogène.
Cet essai est effectué sur des systémes cellulaires de mammifères,gênéralement des cellules fibroblastiques ; il offre I'avantage d'avoirdes voies métaboliques d'activation et de détoxification plus prochesdes conditions in uiuo (en particulier les systèmes utilisant desprimocultures).
Ces systèmes offrent également les avantages d'être relativementsimples, rapides et moins coûteux que les expérimentations animales.
La transformation cellulaire ùn llùtro a été réalisêe pour la premièrefois par Berwald et Sachs (1963), sur des cultures primaires etsecondaires de cellules d'embryon de Hamster syrien (SHE), traitéesau benzo(a)pyrène et au méthylcholanthrène et repiquéesrégulièrement quand elles atteignaient la confluence.
I
TÂBLEAU 3Bis, Transformation des fibroblastes.struslu rales el f onctionnelles.
Principales caracléristigues
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Ccraaët-tit,qæs d,e sux!æe' ruodiûcatioas dc glycoprotéiaes et glycotipidcs; dimiautioa ou disparhioa dc ta âbrcaæiioe. pc",c d'ratigàes, epperirioa ou ràpperitioa da néoaatigèaes' Peîr':'bssioes de lr peraàbiiité, des uirDsporu ectifs er des c!,.ryes cleæiqueso au8Ecrtt-r.ton de trr luidité acæbrzaairc. nod,iôcedoas des cczlzies de srufacc. raodûcadoes du cltosquclcnc iste=rc associé â !a roeab:arc. augracautioa dc I'agglutinabiiiré cclir:laire per dcs lcs:iocs.
.4utrcs rnodiica;orz, iiochimiguar diqirurisa du ter:r d,.âJ{p cycliquc. augaeata.joa de la glycolyse a.naérobie' aug=teaudoa de ta production de !'ca:1me acij'arcu riu plasrinqèae : acjriré :ibrieoiltigue accru.
tll odificaions chronosomigua
Caræ;ëristigtlr dc c:dssarl;c
' a'oolitioo dc I'i'rhibiijoa de la motiliré ccltu;ajre au cûn:,: , Mo.Tboiogic tic la ciltruc crllu]a;re a1é-. pÊric de rinhi!;6on de croissancc dcnsiré-riépen,r,pre . : t :îj,ËitiilîgiHïj.;g*È*' sénr:n-dépeadaace pour coissarcc, ciiraioué.
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27
Les cellules témoins avaient une durée de vie limitée (à peu près 4passages), alors que les cultures traitées ont développé des foyers decellules capables de protiférer d'une façon continue : cellulestransformées. L'inoculation subcutanée de ces cellules transforméessur des hamsters adultes, a produit progressivement la croissance detumeurs au point d'injection. Ce résultat est d'une importance majeureet met en évidence le critère transformation cellulaire in tti'tro commeoutil prédictif de la cancérogénèse in tri'ao.En 1965, les mêmes auteurs ont développé un essai quantitatif detransformation par le traitement de cellules SHE à une densitéclonale. L'examen des colonies formées permet de distinguer lescolonies normales des colonies morphologiquement transformées. Unegrande proportion de colonies transformées (3-14 %) a été observéechez les cellules traitées mais pas chez les cellules témoins.
D'autres tests de transformation cellulaire ont été développés sur desligm,êes établi,es de cellules fibroblastiques. Les deux seuls systèmes quiont été utilisés au niveau international, avec le test sur SHE, et qui ontfait I'objet d'études inter-laboratoires en vue d'une validationutilisent :
* la lignée CBH10T1/2 développée et clonée à partir de laprostate de souris adulte CBH par Chen et Heidelberger (1969) etReznikoff et al, (1973),
* la lignée de fibrobtastes de souris, Balb/cBT3, développée àpartir de Balb/c (Aaronson et Todaro, 1968), et reclonée par Di Paoloet aI. (L972) ainsi que par Kakunaga(1973).
Les principales modifications structurales, biochimiquesfonctionnelles des fibroblastes au cours du processustransformation néoplasique induit par les cancérogènesprésentées dans le tableau 3 bis.
Les fibroblastes transformés présentent des modifications cytologiquestouchant toute l'architecture cellulaire auxquelles sont associées desperturbations fonctionnelles de croissance : les cellules échappent auxmécanismes norrnaux de contrôle de la croissance, continuent à sediviser, s'enchevêtrent et s'empilent. La transformation morphologiqueest prise en compte comme critère de I'effet transformant dans lessystèmes fibroblastiques utilisês pour la détection des cancêrogènes :les colonies transformées pour les cellules SHE (figure 6 bis) et lesfoyers de transformation pour les cellules des lignées établiesC3H10T1 /2 et Balb/cBT3.
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28
Chouroulinkov et Lasne (1978) ont reproduit in uitro, sur des SHE, lacancérogénèse en deux phases pour étudier les mécanismes de lacancérogénèse non génotoxique et de détecter les cancérogènesépigénétiques. Ils ont été, avec Mondal et Heidelberg (1976) sur lalignée C3H10T1 /2,les premiers à démontrer I'augmentation du taux detransformation cellulaire lors de I'association d'un initiateur (typeB(a)P) et d'un promoteur, le TPA et l'analogie avec la cancérogénèseen deux étapes décritg in zriuo, par Berenblum (1941).
Un grand nombre de substances a été testé sur le système SHE,incluant des agents alkylants, des hydrocarbures aromatiquespolycycliques, nitrosamines et nitrosamides, amines aromatiques,colorants aminoazo, hormones, sels de métaux et divers autrescomposés (Barrett et a1.,1984 ; Di paolo et al., 1969, L972; Pienta etâ1., L977, 1981 ; Riverdal et Sanner, 1982, 1985 ; Lasne et al., L974 ;Elias et al., 1989 ; Roseng et al., 1992).
Cet essai s'est montré très sensible à la détection de cancérogènespour I'homme qui restaient non actifs dans des tests de génotoxicitéclassiques : I'amiante (Hesterberg et Barrett, 1984), l'arsenic (Lee etâ1, 1985), Le benzène (Amacher et Zel[adt, L973 ; Barrett et Lamb,1985), le diéthylstilboestrol (Barrett et al, 1981).
Ce système a cependant, quelques limites qui entravent son utilisationcomme un test de routine, qui sont :
* la sensibilité variable des différents lots de cellules à latransformation, en fonction de l'embryon dont elles dérivent et de laqualité du sérum utilisé, qui implique la réalisation d'essaispréliminaires pour le choix de lots appropriés. Ceux-ci doivent donnerune efficacité de clonage adéquate pour I'interprétation des résultatset la meilleure réponse transformante pour des cancérogènes connus.
* la lecture est subjective, mais cette difficulté est atténuée parune expérience avancée du lecteur ainsi que par des lectureseffectuées indépendamment par plusieurs personnes.
Les tests de transformation cellulaire sont les plus aptes, parmi lestests de cancérogénèse à court terme, à détecter in ui,trr le potentielcancérogène d'une substance tant génotoxique que non génotoxique(épigénétique).
29
VI - Chlordane
A - Proauction et utitisæ
Le chlordane est un insecticide organochloré utilisé dès 1950 ; il a êtêlargement produit aux Etats-Unis où sa production atteignait 9500tonnes en L974 0ryHO, 1988). Ses usages agricoles concernaient laprotection des cultures de maïs et de pommes de terre, le traitement desarbres ornementaux et des pelouses .
Son utilisation en agriculture a êtê interdite assez tôt, mais il est restéautorisé jusqu'à ces dernières années pour la protection du bois contreles termites. La quantité de chlordane utilisée pour la lutte contre lestermites aux Etats-Unis est passée de 4500 t en 1980 (Eswortly, 1985) à1800 t en 1986 (US-Environmental Protection Agency, 1987). Le Japon en1986 (Takamiya, 1990), puis les Etats-Unis et la CEE ont successivementinterdit le chlordane en tant que termicide.
La teneur maximale de résidus de chlordane est de 0,02 mg/Kg dans lescéréales (J.O. du 25/2/ 1989), elle est fixée à 0,05 mg/Kg pour les fruits etlégumes (J.O. du 22/9/ t99Z).La DL50 du chlordane, administré par voie orale sur le rat, est de 460mg/Kg de poids corporel (J.O. du2B/B/1989).
La forte liposolubilité et la stabilité du chlordane expliquent sarémanence élevêe, exprimée par un temps de demi-vie dansI'environnement d'une dizaine d'annêes (Conway, 1g8z). Malgré cesineonvénients qui sont à l'origine de sa limitation d'emploi, le chlordanereste encore utilisé dans plusieurs pays où la réglementation est moinsstricte voire inexistante.
30
B - Métabotisme. résid
Le chlordane technique contient des isomères cis et trans ainsi que desimpuretés mineures d'heptachlore et de nonachlore.Le chlordane est rapidement absorbé au niveau de la partiegastrointestinale et à travers la peau des rongeurs.
La voie majeure de métabolisation du chlordane cis et trans se fait parépoxydation en oxychlordane.L'heptachlore, formé par déhydrochlorination, constitue un métabolitemineur des isomères du chlordane. Cette voie génère l'époxyded'heptachlore et d'autres produits d'hydroxylation.D'autres voies de métabolisation sont proposées telles que ladéchlorination du chlordane en monochlorodihydrochlordène ou leremplacement d'atomes de chlore par des groupements hydroxyles pourformer des métabolites hydroxylés éliminés dans les selles.
Aucune augmentation du chlordane trans et cis n'a été notée dans lesang de souris traitées par le chlordane (0,48 mglanimal) pendant 2gjours. Le chlordane induirait son propre métabolisme.
Des résidus de chlordane ont été trouvés dans le sang d'opérateurs et desqiets humains non directement exposés à ce pesticide (Wariishi et al.,1986) ainsi que dans le lait de nourrices (Miyazaki et al. 1980).De par sa lipophilie, le chlordane s'accumule dans les tissus adipeux etles organes riches en graisse comme le tissu hépatique (Nogushi, lgSb).
Le chlordane comme les autres pesticides organochlorés a des effetsexcitants sur le système nerveux central, se traduisant par desconrrulsions ; il induirait des ulcères gastriques selon Boyd et Taylor(f969). Au niveau cellulaire, le chlordane à 0,5 mM entraûrerait desaltérations de la membrane mitochondriale, une inhibition du transportd'électrons et de la phosphorylation oxydative (ogata et aI., lggg).
C - Caneeroqénictté et q
Des cas de neuroblastomes chez des enfants ont êtê associés à uneexposition pré et post natale au chlordane utilisé comme termicide.; descas de leucémies ont été reliées également à l'exposition de sqietsadultes au cilordane et à I'heptachlore (Infante et Freeman, lgzg ;Infante et a1.,L978) ; mais la part de chacun de ces deux dérivés dans leseffets observés n'est pas connue.
31
Aucune corrélation claire n'a été établie entre I'exposition au chlordaneet l'augmentation de l'incidence d'hépatocarcinomes ou d'autres cancerschez l'homme (Hayes et al., lg6b ; Hayes, lgSZ).
Les données sur I'hépatocancérogénicité du chlordane chez les rongeurssont controversées : la plupart des travaux montrent une induction detumeurs par le chlordane chez la souris (Epstein L976 ; World HealthOrganisation, 1984). Les effets sur le rat sont moins évidents : lechlordane induit en effet une augmentation de l'incidence des noduleshépatiques chez des rats mâles et femelles après 80 semaines detraitement à des doses de l'ordre de 200 à 400 mg/Kg pour les mâles etl2o à 240 mg/kg pour les femelles, mais n'augmente pas le taux detumeurs (National Cancer Institute, L977). Cette variabilité apparente dela cancérogénicité du chlordane in vi,uo chez les rongeurs pourraîts'expliquer par des caractères de spécifTcité d'espèce et le niveau desconcentrations testées.
In tritro, le chlordane n'induit pas de mutation reverse sur les souchesT4100 et TA98 de salmnnella fuphimurium his-. (simmon et aI. rgrr ;Mortelmans et al, Lg86). Il n'induirait pas de mutations géniques sur lescellules eucaryotes : les essais de mutation reverse sur des cellulesépithéliales de foie de rat, mutants au locus HGPRT, sont restés négatifs(Telang et aI., 1982a) ; il en est de même des essais sur les lignéés decellules fibroblastiques D.bbO d'origine humaine (Tong et a,r,lggt) et vzgde hamster (Tsushimito et aI., lgSg).Le chlordane serait également dénué d'activité clastogène sur I'ADN deplasmides isolés à partir d,E. coti (Griffin et al.,lg7g)Les seuls travaux faisant état d'une activité génotoxique du chlordanesont ceux de Ahmed et aI. (Lg77a, 1,977b) qui rapportent des résultatspositifs de deux essais de mutagénèse : essai de mutation reverse sur descellules V79 au niveau du locus de l'ouabaine et essai d'induction de lasynthèse non programmée de I'ADN (uDS) sur des cellulesfibroblastiques humaines transformées SV40. Ces résultats peuvent êtreliés à une contamination du chlordane testé, par des impuietés, telqueI'heptachlore, et doivent être considérés avec prudence.
Le chlordane a été rapporté comme pouvant induire une augmentationdes échanges de chromatides soeurs (scE), in vi,uo sur des poissonsmudminnow et in vitrp sur lignées de cellules de lymphome humain(Sobti et al., 1983 ; Vigfusson et aI.,1ggg)L'hépatocancérogénicitê du chlordane et l'absence en général d,effetsgénotoxiques ont conduit certains auteurs à suggéier que cettesubstance exercerait ses effets cancérogènes par ,rn mécanismeépigénétique (Williams, 1980).
3z
L'administration de chlordane, à des concentrations de 25 mg/kg dansl'alimentation pendant 25 semaines à un groupe de souris traitéespréalablement à la N-nitrosodiéthylamine (20 mg/l d'eau de boissonpendant L4 jours), a êtê suivie d'une augmentation de I'incidenced'adénomes et de carcinomes hépatiques ; le chlordane apparaît doncagir comme un promoteur, qui potentialiserait les effets des initiateurs(Williams et Numoto, 1984).
Le chlordane s'est montré être un inhibiteur de la communicationintercellulaire sur des primocultures d'hépatocytes de souris et de rat,ainsi que sur des lignées de cellules épithéliales de foie de rat (ARL), etde lignées v79 (Telang et al, 1982b ; Tsushimoto et at, l98B ; Ruch et al,1990). cet effet serait dû au chlordane lui-même et non à sesmétabolites, ainsi que I'ont montré Ruch et aI., (1990), en utilisant desinhibiteurs des monooxygénases de type cytochrome p4b0 (le SKF - 528A, monoxyde de carbone ou butoxyde de piperonyl). Ils ont aussi montréque l'inhibition était moindre en présence d'AMP cyclique.
Le chlordane, à la concentration de I pM, stimule la protéine kinase C,d'une manière similaire au TPA (Moser et Smart, 1989). La stimulation dela PKC par le chlordane est dépendante du calcium ; en présence de CaZ+exogène, la stimulation de la PKC par le chlordane est cinq foissupérieure à celle induite par le TPA. L'activation de la pKC par lechlordane est dépendante des phospholipides et peut être inhibée par laquercétine.Suzaki et aI. (1988) ont montré que le chlordane augmente laconcentration de calcium intracellulaire dans des leucocSrtespolynucléaires.
Cette étude suggère que le mécanisme des effets de promoteur tumoraldu chlordane, impliquerait une modifîcation des concentrations decalcium intracellulaire, couplée avec une activation de la pKc.
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J . J
VII - Chlorothalonil
Noms chimiques : Tétrachloroisophtalonitrile ; 2,4-5,G tétrachloro 1-3-benzendicarbonitrite
A - Production et utilisation
Le chlorothalonil est un pesticide organochloré utilisé pour sespropriétés fongicides ; il est commercialisé sous diffêrents noms,Daconil 2787, Bravo, Nopocide,... Ses utilisations agricoles concernentle traitement des fruits et légumes, des céréales, des arachides enparticulier et aussi celui des pelouses et des plantes ornementales ; lechlorothalonil est aussi utilisé pour la conservation des peintures etdes colles.
La production commerciale a débuté aux Etats-Unis en lg6g, avec uneproduction annuelle de b000 tonnes (u.s. Tariff. commission, lgzl).Au Japon, le taux de production annuelle est estimé à gO00 tonnes. Lasubstance n'est pas produite en Europe, où elle serait importée desUSA.
La teneur maximale de résidus de chlorothalonildans les céréales (J.O. du 25/2/89) ; elle est fixée àbananes et à I mg/kg pour les tomates, melons et22/e/92).La dose journalière acceptable de chlorothalonil chez I'hommerecommandée par le Comité mixte OMS/FAO pesticides (1g90) est de0,03 mg/ke/i.
est de 0,02 mg/kg0,2 mg/kg pour les
cornichons (J.O. du
CN
34
Le chlorothalonil, à la différence de la majorité des dérivésorganochlorés est biodégradable, son temps de demi-vie dans les solsserait d,e 2,5 à 3 mois (Stallard et wolf, 196z). Les voies oxydatives debiotransformation conduisent à la formation de dérivés hydroxylés,notamment en 4 (Szalkowski et stallard, lg26) ; le dérivé 4-hydroxyléest aussi formé après hydrolyse. Le chlorothalonil serait égalementpeu bioaccumulable, ainsi qu'il a été montré chez les poissons parDavies (1988).
B - MétanoDsme
Suite à I'administration de chlorothalonil marqué (14C) à une dose de 1mg/kg p.c. à des rats Sprague Dawley, moins d,e 6 % de la radioactivitéserait retrouvée dans le sang ou les urines dans les 48 heures quisuivent le traitement (chin et al, lgsl). Après un traitement pargavage à l'aide d'une dose de b0 mg/kg à des rats, B % de laradioactivité était retrouvée en g6 heures dans les urines, plus de g0 %étant éliminé par les fécès.Le chlorothalonil serait éliminé par voie urinaire sous forme de thiols.La quantité de thiols métabolisés serait liée à l'activité de lamicroflore intestinale ; elle serait plus importante chez le rat que chezle chien ou le singe . O,5 % de la radioactivité serait fixée au niveau destissus, 0,05 % au niveau rénal (Rapport Ministère de I'Environnement,1991) .Après administration orale chez le rat, la distribution du chlorothalonilserait maximale au niveau des reins, eui renferment 0,2b % de la doseadministrée par gramme de tissu, avec gl % de la radioactivitérépartie dans le cytosol et 54 % dans les mitochondries ; aucune liaisoncovalente à I'ADN des cellules rénales n,a été rapportée(Chouroulinkov, 1990).
Le chlorothalonil réagit avec les composés sulfhydryles ; il a été trouvélié aux histones de cellules de thymus de veau et au noyau de cellulesde foie de rat, mais pas à I'ADN in vitro (Rosanoff et siegel, lggl).
La métabolisation du chlorothalonil impliquerait la formation decoqiugués au glutathion qui seraient convertis au niveau du rein enthiols sous I'action de l'enzSrme b-lyase . une partie de ces thiols estexcrétée par voie urinaire après méthylation. Une autre partie aprèsune réaction avec des groupes 'sulfhydryles', pourrait entraîner undysfonctionnement des mitochondries, se traduisant par une réductiondes teneur en ATP, une inhibition de l'activité Nâ+/r+ AT?asiquesuivie d'une entrée passive d'eau et la formation de vacuoles ; 1",cellules finissent soit par mourir, soit par développer une hyperplasieentraînant la formation de tumeurs (chouroulinkov, lggo).
3s
C - Effets toxiques
Le chlorothalonil est sensibilisant ; des dermatites sévères ont étéobservées chez le personnel agricole manipulant ce fongicide (Horiuchiet Ando, 1980) et les travailleurs exposés à des produits deconservation du bois (Bach et pederson, Lg77 ; spindeldreier etDeichmann, 1980).
l,a fLpO_ du chlorothalonil chez la souris femelle ICR est de 6000 mg/kget de 2,5 mg/kg lors d'administrations respectivement par voie orale etintrapéritonéale (Yoshikawa et Kawai, 1966). Chez le rat, la DL5g estsupérieure à 10 g/kg (Spencer, lgZB).
Le chlorothalonil se montre très toxique pour le poisson, avec unecl5g-96_h de 10 à 30 pg/\, chez sarma spp et Gatarins spp (Davies,1985a). Des valeurs de clso à 8 jours de 280 pg/l et +so pgtt onr éréenregistrées respectivement chez la truite arc-en-ciel et le poissonchat. La toxicité élevée du chlorothalonil chez les poissons serait liée àsa métabolisation rapide en conjugués du glutathion (Davies et aI.,1985b).
Le chlorothalonil n'induit pas de mutation réverse chez lessouches TA98 et T4100 de salmnnetln tgphimuri,um luis-, en présenceet en absence d'activation métabolique (Kawachi et al., r-ggo). Lechlorothalonil ne s'est pas non plus révélé mutagène chez deuxmicroorganismes eucaryotes : SocclnrvrnEces cerevi,si,ae et Aspergri,Itusaid,ulans (De Bertoldi et aJ, 1980).Des études de mutagénèse sur des cellules de mammifères (VZg etBalb/cBT3) ont confirmé I'inactivité du chlorothalonil à induire desmutations géniques (MEV, lgg0).Kawachi et al., (1980) n'ont pas observé d'aberrations chromosomiquessur des cellules fibroblastiques de poumons d'hamster traitées auchlorothalonil. Cette substance n'induit pas de micronoyaux chez lerat, la souris et le hamster chinois (MEV, lgg0).
Plusieurs études de cancérogénèse in vi,ao ont été réalisées. Lechlorothalonil n'a pas entraîné d'induction de tumeurs, administrédans l'alimentation à des souris femelles et mâles durant 80 semaines,à doses élevées de 2688 et 5375 ppm en moyenne dans la nourriturepour les mâles (soit 385 et TT0 mg/k9/i p.c.), et pour les femelles de3000 et 6000 ppm (soir 480 er 860 mg/kglj p.c.) . La durée de cefteétude a été jugée insuffisante.
D-
36
Par contre, admistré à des rats mâles et femelles durant 80 semaines,à des concentrations de 5063 ppm et de 10126 ppm en moyenne dansles aliments (soit 250 et 500 mg/kg/i p.c.),le chlorothalonil a induitdes adénomes et des adénocarcinomes de l'épithélium tubulaire rénal(NCI, 1978).Sur la base de ces résultats et par suite de l'absence de données chezI'homme liée à la commercialisation récente du chlorothalonil (1969),I'IARC avait conclu en 1983 que les données disponibles étaientinsuffisantes pour évaluer la cancérogénicité du chlorothalonil chezl'homme et les animaux d'expérience.
D'autres études ont ultérieurement confirmé le pouvoir cancérogèneexpérimental du chlorothalonil.
Une étude de deux ans sur des souris mâles Charles River (CD1) recevant une alimentation renfermant r5, 40, LTl et zbO ppm dechlorothalonil a montré que les doses sans effet étaient de :
. 40 ppm pour les lésions rénales au niveau des tubulesproximaux, soit une dose sans effet de 4,b mg/kg/j p.c.
. L75 ppm pour les effets tumorigènes au niveau des reins, soit2L mg/kg p.c.
. 15 ppm pour ce qui concerne l'hyperplasie et I'hyperkératoseau niveau stomachal, soit 1,8 mglkg/j p.c.
Dans une autre étude, des rats Fischer 344 ont reçu par le biaisde l'alimentation, pendant 2z mois pour les mâles et B0 mois pour lesfemelles, des teneurs en chlorothalonil de 40, g0 et LTl mg/kg p.c. parjour : des tumeurs rénales, de I'hyperplasie rénale et des tumeurs dupré-estomac ont été observées.
L'étude a êtê renouvelée dans des conditions quasimentidentiques avec des doses de 1,8 9,8 lb et L75mg/kgp.c.parjour, aconfirmé ces résultats, en évaluant le niveau des doses sans effet à :
. 3,8 mglkglj p.c. pour l,effet tumorigène au niveau rénal,1,8 mg/kgli p-c. pour l'hyperplasie rénale et pré-stomachale
Ces résultats soulignent la sensibilité plus élevée du rat aux effetstumorigènes du chlorothalonil par rapport à la souris.
Les rapports de la Commission d'évaluation du Ministère deI'Environnement (Paris) sur l'écotoxicité du chlorothalonil (lgg0-lggl),concluent que la substance serait cancérogène chez le rat et plusfaiblement chez la souris, avec une spécificité d'organes : rein et pré-estomac ; les tumeurs du pré-estomac seraient des 'séquelles'de l,effetirritant.
funryte tsnu de ses effets ca!rcArgèræs chez Ie rwt et Ia sùu:ris, semarui,festant aaec une spéeif,i,ciÉ ûorgann marqrtêe, de son æ,rrctèreinri'tant a,u wiueau des m,uqueuses et d,e ïa,bsenne de popriétês mutngèræet gênotnti'que, Ie chl'otpthntanit peut être classê par.rfti, tns cannûrcgènnsnnn gérwtnri,qu,es qû agiraient pa,r des mécarai^crnas @gêrÉti,wps.
37
MATERIEL ET METHODES
I - Les produits chimiques
A - Benzo(a)pwène ( B(a)P )
Formule brute : C2oH*Poids moléculaire : 252,3Cristaux jaunesInsoluble dans I'eauSoluble dans le benzène, toluène, xylène, I'acétone et le DMSO.(Sigma.B.1760)
B - 12-0-tétradécanovl-Phorbol-13-acétate (TpA)
Formule brute : C3.H56O,Poids moléculaire : 616,8Corps gras soluble dans l'acétone et dans le DMSO.(Sigma.P.8139)
C - Dexaméthasone (D)OVIE)
StéroTde de synthèse, de la famille des glucorticoîdesFormule brute : C2rH,a,FOuPoids moléculaire : 392,5Poudre blanche, légèrement soluble dans l,eauSoluble dans I'acétone, l'éthanol et le chloroforme(Sigma.D.4902)
D - 2 Amlno-6-Mercaptonurine ou 6-thloguanine (6-TG)
La G-thioguanine est un analogue de la purineFormule bmte : CuHuNuSPoids moléculaire : L67,2Poudre blancheSoluble dans I'eau légèrement basique(Sigma.A.*,82)
38
u-
A - Chlordane
Insecticide organochloréFormule bmte : CrgH6ClgPoids moléculaire I
-409,2-8.
Liquide visqueux, de couleur ambréeInsoluble dans l'eauSoluble dans I'acétone et le DMSOLe chlordane technique est constitué souvent d'un mélange d'isomères dechlordane et peut contenir aussi une proportion minime de composés liésstmcturellement tels que des isomères d'heptachlor.Pureté :97%(Riedel-de Haën. 3bb35. lots 08200 & f0g70)
B - Chlorothalonil
Formule brute : CrClnN2Poids moléculaire : ZdS,lggCristaux blancsInsoluble dans I'eausoluble dans le xylène, le cyclohexane, l,acétone et le kérosènePureté :99%(Interchim. Chem. Service.ps.lO20.Lot 69.6A)
C - E:rtraits orqanioues d'un lixiviat de déchet Bet d'un percolat de décharqe T4
Les extraits organiques de z lixiviats de déchets T4 et B, ontétudiés :
T4 : correspond au percolat recueilu à la sortie d'une alvéoled'un centre d'enfouissement technique,
B : est le lixiviat obtenu par extraction aqueuse d'un déchetde boue d'hydro:ryde métallique d,industrie chimique.
L'extraction a été réalisée selon le protocole AFNoR-xgl-2lo :grammes ont été extraits à 2 reprises par agitation pendantheures à I'aide de O,Zb litre d'eau.
750 ml de chaque lixiviat ont été épuisés par 3 extractions successivesau dichlorométhane (rapport Lllo, à pH basique, neutre et acide. Lesfractions organiques sont ensuite réùnies et séchées sur sulfate desodium anhydre. Après élimination du dichlorométhane sous vide à bassetempérature, le résidu est repris dans g ml de DMS9. Le facteur deconcentration est de 83.
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39
III - Le test d'Ames.
A - Réactifs bioloqiques
Les souches bactériennes utilisées dérivent de la souche : Sa,trnnrùeltntgpluinrurium LT2 et sont porteuses de plusieurs mutations. Les quatresouches bactériennes TA97a, TAg8, TA100 et TA102 utilisées nous onrété fournies par le laboratoire de B. Ames.
En plus des mutations his-, les souches possèdent des mutationssupplémentaires qui augmentent leurs capacités à détecter les agentsmutagènes (tableau 4) :
- la mutati'on rfa affecte le lipopolysaccharide de la membrane externede la bactérie et augmente la perméabilité des souches aux molécules degrande taille.
- la muta,tinn utr B entraîne une déficience du processus de réparationpar excision, de sorte qu'un grand nombre de lésions primitives de I'ADNne sont pas réparées. Cette mutation confère aux souches une sensibilitéplus grande à des agents susceptibles d'endommager I'ADN. Cettemutation résulte d'une délétion qui touche le gène biotine, ces souchessont donc auxotrophes pour la biotine.
- le fanteur R : l'introduction dans les bactéries du plasmide PKM101augmente le taux de mutations induites par accroissement notabled'erreurs au cours de la réplication.
- le pln'smid,e PAQI : seule TA102 possède ce plasmide qui porte le gènehistidine muté. Le plasmide étant présent en un grand nombred'exemplaires (n = 30), le nombre de cibles pour les agents génotoxiquesest considérablement augmenté. Ceci permet de détecter les agentsmutagènes à des doses beaucoup plus faibles, sans avoir à fragiliser lessouches par des mutations de type uvrB dont TAl0z est exempte.
Les caractères génétiques sont contrôlés tous les 6 mois, ou lors dechaque renouvellement du stock des souches, selon la technique deMaron et Ames (1983). Les souches sont stockées à -80.C.La transformation métabolique est assurée par I'ajout dans le milieud'essai, d'un homogénat de foie de rat eontenant des enzyrnesmonooxygénases type cytochrome P450 et d'un système générateur deNADPH (mix1.
40
les enzymes sont obtenus à partir de rats mâles (200 g environ) traités àI'Aroclor L254 injecté par voie intrapéritonéale à la dose de 500 mg/kgde rat. Après broyage du foie mélangé à du Kcl (0,15 M), I'homogénat estcentrifugé à 9000 g pendant 10 min à + 4oC. Le surnageant post-mitochondrial Sg est alors prélevé et réparti stérilement en cryotubesconservés à - 80'C.
L'activité métabolisante du Sg doit être évaluée, afin de définir lerapport Sg/mix optimal à utiliser dans les essais. A cet effet, nous avonsmesuré l'activité du Sg aux concentrations (0 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,1 ; O,lb ;0,20 et 0,3 ml sg/ml mix) sur T498, en présence d'un cancérogèneindirect : le benzo(a)pyrène à 0.5 et I pglml. La concentration de0,025 ml Sg/ml mix, nous a donné le meilleur taux de réversion et a êtêretenue pour la suite des essais.
B - Protoeole
Le test consiste à dénombrer le nombre de révertants obtenus sur unmilieu dépounm d'histidine, après 48 heures d'incubation à 37"C d'uneculture de bactéries (de 109 bactéries/ml) en présence de la substance àtester à concentration donnée.Deux séries d'essais sont réalisées avec ou sans Sg mix, chaque sêried'essai portant sur 4 concentrations et un témoin ; ces essais sonteffectués en triplicats.Les contrôles positifs et les témoins solvants éventuels, sont testés enparallèle. Les contrôles positifs ne nécéssitant pas d'activationmétabolique sont : l'azide de sodium (10 pglbte) pour TA 100,9-aminoacridine (40 pg/bte) pour TA 97a , 2-nitrofluorène (0,b pg/bte)pour TA 102.Les mutagènes indirects de référence sont le benzo(a)pyrène (0,5 pglbte)pour les souches TA 100, TA 98 et TA 97a et le danthron (b0 pglbte)pour TA 102.
Le mode opératoire et la procédure suivie sont ceux préconisées parAmes et a,l. (1983).
Le résultat du test d'Ames est considéré positif si pour I'une au moinsdes concentrations testées, le nombre de révertants induits est égal ousupérieur au double du nombre de révertants spontanés, sur une ouplusieurs souches, avec etlou sans Sg mix.La validité du test est assurée par la rêponse positive obtenue avec lescontrôles positifs.Le taux de révertants spontanés de chacune des souches est donné parAmes et al. (1975) (tableau 4).
GAPJUNCTIOII
T
Tvoe sauvaqe (HGPRT=) Tvoe mui, a nt ( HG PRT -
)
Figure 7 : Illustration du mécanisme par lequel se fait la coot'ration métabolique sur des cellules
fibroblastiques de la lignée V79, au locus HGPKL (Irosko et a1.,1982).
6 . THIOGUÀNCSINEMONOPHOSPHATE
4t
fv - Test d'inhibitiotr de la coonération métaboliq.re s.rrcellules VZ9
A - Réactifs biologiques
n s'agit de la lignée v7g de cellules fibroblastiques pulmonaires dehamster chinois. Deux types de cellules v79, normales et mutées au locus(HGPRT), sont utilisés.ces 2 types de cellules, nous ont été donnés par le Dr z. Elias de I,INRSde Nancy.
Les cellules sont stockées dans de l'azote liquide à raison de B millionsde cellules par tube dans du milieu DMEM modifié de pH T,g5 etadditionné de 20 % de sérum de veau foetal (SVF) et de L0 % de DMSO.
B - Princine
Cet essai, développé par Trosko et al. (1979) utilise des cellules VZg.Lorsque des cellules mutantes déficientes en hypoxanthine guaninephosphoribosyl transférase (HGPRT-), sont cocultivées avec des cellulesde type sauvage (HGPRTI, dans un milieu contenant la 6-thioguanine,les cellules de type sauvage capable de phosphoryler la 6-thioguanineforment un métabolite toxique t ta 6-tt iogrràr,orir,e monophosphate.
Le transfert de ce métabolite toxique vers les cellules HGpRT- n,a lieuque s'il y a un contact entre les deux types cellulaires. Ce transfertassuré par les Gap junctions (figure ?) vers ies cellules HGpRT- entraînela mort de ces cellules.
Ce test d'inhibitiol !e la coopération métabolique consiste à évaluer letaux de cellules v7g, HGPRT- capable de développer des eolonieslorsqu'elles sont cocultivées avec des cellules vzg, HôËRi. en prcsencede G-thioguanine.
C - Protocole du test
Le milieu utilisé pour les essais est lesérum de veau foetal (SI/F).Les essais sont réalisés en boite de 60boites par série d'essai.
DMEM modifïé pH Z,Bb à lO%
mm de diamètre, à raison de
de
I
10
f,i
42
Le protocole peut être résumé comme suit,
* srùsgrngncqnent en boîtp :
Série A : 100 cellules V79 résistantes, apportées dans 4 mlde milieu complet (I0% SVF),
Série B : 100 cellules V79 résistantes et 7 x 105 cellules sensibles,chaque type de cellules est apporté par 2 ml de milieu,
* a,jout d,e ln 6-tlyingnnine et traitem,ent :
- quatre heures après I'ensemencement, 4 ml de 6-TG à 10 pglml dans lemilieu sont ajoutés par boîte (concentration finale 5 pglml),
- la substance à tester est ajoutée aux 8 ml de milieu d'essai, parl'intermédiaire de 16pt de solvant ; la teneur du solvant utilisé est de0,2 96,
- les témoins négatif (solvant) et positif (TPA à 0,001 pglml) sont testéspour chaque série d'essai,
- incubation 3 jours à 37"C dans une atmosphère humidifiêe ù 5% COZ,
- changement de milieu et remplacement par 4 ml de milieu contenantuniquement la 6-TG à 5 pglml,
- après une nouvelle période d'incubation de 5 jours, les boîtes sontlavées avec une solution tampon phosphate (PBS), les colonies cellulairesfixées au méthanol absolu et colorées avec Giemsa (10 %). Le comptagedes colonies de la série A détermine I'efficience de clonage et celui de lasérie B, le pourcentage des cellules résistantes récupérées.
Pour qu'une expérience soit retenue, il faut qu'elle remplisse les critèressuivants :
- l'efficience de clonage du témoin est > 75 %,- la récupération des cellules résistantes chez le têmoin négatif de
la série B est (-35 %,- la récupêration des cellules résistantes dans la série B TPA
(témoin positif) est > 80 %.
43
R/T =
D - Exnression des résultats
% de récupération de la série traitée à la concentration x
Pourcentage de récupération du témoin négatif
Un résul tat est considéré : -+
+++++
++++
sis lsis is i
2<34
R/TR/TR/TR/TR/T
Un produit est considéré comme inhibiteur de la coopérationmétabolique, entre les cellules V?9, si un résultat positif a été obtenupour au moins deux concentrations successives au cours de deuxexpériences indépendantes. Une relation dose-effet n,est pas exigée.
A - Réactifs bioloqiques
A.l - Préparation des cellules nrimaires d'embnronsd'hamster Swien (SHE)
- Des femelles âgées de 2 mois et demi à 3 mois sont accouplées enpériode d'oestrus pendant 12 heures, avec un mâle de B à 4 mois. Lepremier jour de gestation correspond au jour où l,on retire le mâle.
- Les femelles gestantes de 12-fB jours sont anesthésiées à l'éther,saignêes par les carotides, et les embryons sont prélevés stérilement.Après deux lavages au PBS, les organes différenciés à ce stade (yeux,coeur et viscères) sont retirés.
A partir de cette êtape, chaque embryon sera préparé séparément ouavec un autre embryon et découpé finement avant de subir 3 digestionssuccessives par la dispase :- 10 ml de dispase à. L,2 unité sont additionnés à chaque embryon etl'ensemble est transvasé dans un erlenmeyer. La digesti,on se fait sousagitation magnétique pendant 10 minutes à g?"C.
- Le surnageant de la première digestion est éliminé, la fraction tissulaireest reprise et soumise à 2 digestions successives par 2b ml de dispasependant l5 min à 87'C.
d'hamster swien (SI{E)
44
- Les surnageants de la 2ème et 3ème digestion sont récupérés aprèsfiltration sur gaze stérile afin d'éliminer les petits fragments etagglomérats cellulaires. L'action de la dispase est inactivée par ajout dusérum de veau foetal.
- Les surnageants sont centrifugés à 1000 t/min pendant 10 minutes. Lesculots sont remis en suspension dans un milieu complet, c'est-à-direadditionné de 15 % de sérum de veau foetal. Les cellules sontdé4ombrées dans du bleu de trypan et sont ensemencées à raison de 4 x106 cellules par boîte de pétri de 100 mm de diamètre et incubées à 37'Cdans une étuve à 10 % COZ.
- Le changement de milieu se fait 24 heures après l'ensemencement.
- Après 48 heures, les cellules sont presque confluentes, elles sonttrypsinées (0,25 %) et congelées dans du milieu à 10 % SVF et 10 % DMSO(1,5 x 10o cellules/tube). La congélation se fait par paliers successifs, 3heures à - 20"C, 1 nuit à - 80'C et ensuite dans l'azote liquide.
- Chaque lot de cellules provenant d'un ou de deux embryons sera testépour l'effTcacité de clonage et la transformation par le B(a)P à 1 pglml.Le lot de cellules qui donnera les meilleurs résultats, pour les deuxcritères cités, sera retenu pour servir de stock de cellules cibles dans lestests de transformation.
- Les lots de cellules qui donnent des rêsultats moins satisfaisants,seront cultivés et utilisés comme cellules nourricières, après irradiation à5000 rads et conservation dans l'azote liquide (à raison de 5 millions decellules par cryotube).
45
lL.Z - Sélection préIiminaire de sérum. cellules@
Lots de cellules cibles : L, G, AI, AT, AZ, AB, A8, Ag, Al0,A4/5,
Lots de cellules nourricières : B, A4/5, Ale,
Lots de sérum : - Labsystems ZgG4, Z5Og, BZTT, g2gg- Boehringer : 291, 316- J-Bio 47,L04,9-463- Eurobio : 685831- Gibco : 06290H
Concentrations de sérum : L2 %, L5 %, ZO %.
Milieux de culture : - Milieu DMEM modifié pH Z.3b (Gibco oZ4 1600)
Les différents facteurs énumérés ci-dessus, sont aussi importants les unsque les autres pour I'obtention d'une efficacité de clonage élevée etd'une grande sensibilité des eellules vis-à-vis de Ia transformàtion induitepar le B(a)P. Les éléments soulignés ont été utilisés pour l'ensemble desessais.
B - Princine
Le test consiste à cloner un faible nombre de cellules, dites cellulescibles, en présence d'une substance donnée. L'observation de l,aspectmorphologique des colonies, formées après g jours d,incubation, peimetde mettre en évidence la capacité de la substance testée à induire latransformation morphologique des cellules.
L'efficacité de clonage des cellules SHE étant faible, des cellulesnourricières leurs sont associées pendant le test. Les cellules nourricièresqui ont gardé leur capacité de métabolisation, et permettent aux cellulescibles de se multiplier et de former des colonies.
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46
C - Protocoles
Le test est effectué selon la procédure développée par Di Paolo (1980) etmodifïée par Lu (1983). Nous avons utilisé 300 cellules cibles et 60000cellules irradiées.Les essais sont réalisés en boîtes de 60 mm de diamètre, à raison de 10boîtes par concentration. Pour les traitements, la concentration dusolvant est de 0,2 % dans le milieu.Chaque expérience est répétée au moins deux fois
J-2 : Les cellules cibles sont décongelées et mises en culture dans 5 ml demilieu à 15 % d,e sérum de veau foetal (SVF) après élimination du milieude congélation, contenant le DMSO, par centrifugation à 700 t/minutespendant 5 minutes,
J-l : - Changement de milieu pour les cellules cibles,- répartition des cellules nourricières à raison de 60000 cellules
nourricières par boîte, dans 2 ml de milieu complet,
J0 : Ensemencement de 300 cellules cibles, sur les mêmes boÎtescontenant la couche nourricière, dans 2 ml de milieu complet.
A partir de cette étape, le protocole de traitement diffère selon que lasubstance est testée comme cancérogène complet, initiateur oupromoteur (figure 8).
C.l - Effet transformant complet
La capacité d'une substance à induire la transformation des cellules SHEest testée après 1, 2 ou 3 applications selon les modalités suivantes :
* pour 1 application, la substance est 4joutêe à Jl dans 4 ml de milieucomplet, le milieu reste inchangé pendant les I jours d'essai (I1).
* pour 2 applications, le ler traitement à Jl.appliqué dans les mêmesconditions que précédemment est suivi d'un 2eme traitement à J5, dans20 pl, sans changement de milieu (I2).
* pour 3 applications, le ler traitement à Jl est suivi d'un 2èmetraitement à J3, dans 20 Ul de solvant, sans changement de milieu. Le3ème ffaitement est effectué à J5 avec renouvellement de milieu.A J8, pour les 3 modalités de traitement, les cellules sont fixées àl'éthanol absolu pendant 10 minutes et colorées au Giemsa à LO%pendant 20 minutes (I3).
47
C.2 - Effet initiateur
La substance à tester est ajoutée à Jl et laissée 24 heures au contactdes cellules. A J2, le milieu est éliminé puis remplacé par g ml de milieucontenant le promoteur de référence, le TpA, â ,rr" concentration de0,1 p8lml' A J5, une seconde application de TPA est effectuée sanschangement de milieu ; au 8ème lorrr, les cellules sont fixées à l,éthanolabsolu et colorées au Giemsa (II).
C.g - Effet nromoteur
24 -heures après I'ensemencement, les cellules sont traitées par uninitiateur connu, le benzo(a)pyrène à la dose de 0,1 tq/mr (dose nontransformante). Le B(a)P est laissé au contact des cellules pendant 24heures puis Ie milieu est changé à Jz par un milieu contenant lasubstance à tester à la concentration désirée ; à J5, un deuxièmetraitement est effectué sans changement de milieu, par introduction dela substance dans 15 ul de solvânt. A J8, les cellules sont fixées etcolorées comme précédemment (IID.
o-
Deux critères sont évalués :
- I'efficacité de clonage (en %) qui est le nombre de coloniesformgeg par rapport au nombre de cellules mises en culture, détermine latoxicité de la substance étudiée.
EC 1967 =Nombre total de colonies formées
Nombre de cellules ensemencéesx 100
- le taux de transformation (en %) exprimé par le nombre de coloniestransformées par apport au nombre dè colonies présentes (plus de b0cellules par colonie), détermine le potentiel transformant de la (ou les)substance(s) étudiée(s).
T(%)=Nombre de colonies transformées
x 100
II
Nombre total de colonies formées
48
VI - Etude de I'activité ODC sur cellules SHE
Les cellules SHE proviennent du même lot que celles utilisées pour lesessais de transformation cellulaire.L'activité ODC a êtê étudié uniquement, sur des cellules SHE traitées auchlordane, seul ou associé au TPA.Cette partie de notre étude a êtê réalisée dans le laboratoire du DocteurG. Nguyen-Ba du CNRS de Villejuif.
A - Princine
Le dosage de* l'activité ornithine décarboxylase (ODC) se fait par mesuredu taux de CO2 dégagé, après clivage de l'ornithine-substrat marquée.n 14c (Lichri et-al.,lg83).
NHZ-(CH2)B-CH-NHZ
*cooHoDc
Ornithine Putrescine
Il s'agit donc de piéger le CO2 d,êgagê par un filtre de cellulose imprégnéde 50 pl de KOH 2N et le quantifïer par mesure de la radioactivité dufiltre en scintillation liquide.
B - Protocole
' snsgmpnsemgnt des SHE :les cellules SHE sont ensemencées dans des boîtes Costar à LZ puits, àraison de 20000 cellules/ml.
* trv;i,tsmsnt des cellules :le traitement débute quand les cellules ont atteint la confluence. Lemilieu de traitement est : DMEM modifié à pH 6,7 additionné de 5 % SVF.Ces conditions de traitement permettent d'avoir des valeurs d'ODC plusélevées et plus régulières. Elles facilitent ainsi la détection de toutemodilication de I'activité ODC par une substance cNmique (Robert,1990).
- chaque puits contenant un tapis de cellules confluentesest lavé 2 fois avec du PBS.
- le produit (ou les produits) à tester est introduit dans 2 mlde milieu à,5% SrfF; la concentration en DMSO est de 0,2%.
- après le temps de traitement (37'C, L0%AO2), les puits sontlavés au PBS et les boîtes Costar congelées à -80"C pour ledosage biochimique de I'ODC.
49
* décl,ennh,em,ent d,e ln rêa,cti,on enzgmatiqu,e :Les essais sont réalisés à la température de 4oC, jusqu'au déclenchementde la réaction enzymatique à 37'C.- les cellules sont traitéés successivement par les substances suivantes :
200 u l d 'H20 d i s t i I I é50 u l d 'une so lu t ion de Tr is HCL pH = 7 ,5 à 400 mt '1
(concent ra t ion f ina le 50 mM)50 p l d 'une so lu t ' ion de Pyr idoxa l phosphate à 320 uM
(concent ra t ion f ina le 40 uM)50 u l d 'une so lu t ion de Di th io t ré i to l à 20 mM
(concent ra t ion f ina le 2 ,5 mM)50 u l d ' une so l u t i on d 'Orn i th i ne + ( 14C ) Orn à 3 , 2 n l4
(concent ra t ' ion f ina le 0 ,4 mM)
la concentration "t
l4O-L-ornithine est de 0.1 uCi (3.7 KBq).
- La boÎte Costar à LZ puits est ensuite recouverte d'un parafilm perforéau niveau de chaque puits sur lequel est déposé un filtre de cellulose(GF/C Whatman) imprégné de 50 ul KOH 2N pour piéger le CO2 dêgagêlors de la réaction enzymatique. Un second parafilm est ajouté de façonà fermer hermétiquement la boîte.- l'incubation s'effectue dans un bain-marie à 37"C sous agitationpendant 60 min.- la réaction est stoppée par i4jection de 50 pl d'acide perchlorique 2Npar puits, suivie d'une nouvelle incubation à 37"C, 60 min pourpermettre l'adsorption totale de CO2.- les protéines sont dissoutes par 50 pl de NAOH 5N par puits.
* la mesare d,e ln rad:ipaptiuité incorporée dans chaque filtre est mesuréepar scintillation liquide.
* la mesure dp ln qtanti,É des ptntêfues est dêterminée en présence debleu de Coomassie, selon la méthode de Bradford (1976).
C - Expression des résultats
L'activité oDc est exprimée en nmoles de Co2 relarguées par mg deprotéine en 60 minutes.
50
vlr - Mesure du caZ* cvtoplasmique libre en cvtométrie de fluxnar utilisation du FIuo 3
A - Réactif bioloeique
La mesure du Ca2+ cytoplasmique libre a êtê effectuée uniquement surdes cellules traitées au chlordane, chrorothalonil et TpA.Les cellules SHE sont ensemencées à raison de 20000 cellules/ml dans dumilieu DMEM à pH 7,35 et L0 % svF en boîtes de pétri de B0 mm dediamètre.
B - Principe
il est basé sur I'utilisation d'un chromophore fluorescent, le Fluo g,capable de se lier aux ions de calcium libre.La liaison du Fluo 3 avec des ions CaZ+ entraîne une augmentation de lafluorescence, qui est fonction de la quantité de calcium lié. Cetteintensité de fluorescence est mesurée à I'aide d'un cytomètre de fluxéquipé d'une source laser d'excitation et d'un filtre correspondant à lalongueur d'onde de la fluorescnece émise (Minta et at., 1989) ; elle traduitindirectement le taux d'ions de calcium libre intracellulaire.
C - Protocole
Quand les cellules sont à 60 % d,e confluence, le milieu est éliminé etremplacé par 2 ml de tampon Hanks contenant le Fluo B à 4,5 pg/ml ; letampon Hanks contient également du pluronic F-Lzr à T5 vg/ml, quifacilite la pénétration du Fluo B dans les cellules.
- après 20 minutes de contact, le milieu contenant le Fluo 3 est enlevé etremplacé par 2 ml de Hanks à, r % svF, pendant B0 minutes.
- les cellules sont lavées et mises dans I ml de tampon Hepes salinpendant 10 minutes.
- les cellules sont traitées par 4jout de 10 à 50 pl de la substance à testersous microscope relié à la source laser.L'ionomycine, un ionophore de calcium, est utilisé comme contrôlepositif.Les mesures de fluorescence des cellules observées sous microscope, sontenregistrées, traitées par ordinateur et représentées graphiquement(confocal system Laser scanning Microscope-Meridian ACAs6z0).-
- le tracé obtenu, reflète les niveaux de concentration en calcium libreintracytoplasmique et ses variations lors d,un traitement.
vm - kcherche des adduits à l'â..,DN du chlordane roar Ia méthod" d"
en collaboration avec le professeur B.biologie végérale appliquéé. IUT Louis
a-
La détection d'adduits a êtê réalisée uniquement sur des cellules SHEtraitées par le chlordane. Le chlorothalonil et les extraits des déchetsT4 et B n'ont pas été étudiés dans cette partie.
- Les cellules sont ensemencées à raison de l,b millions de cellules parboîte de 100 mm de diamètre, dans l0 ml de milieu complet (DMEMmodifié pH 7,gS à f5% SVF). 4 boîtes sont préparées par série detraitement.
* 0,2 % de DMSO pour la série Témoin.* chlordane à I0 pg/ml pour la série Essai l.* chlordane à l0 pglml pour la série Essai Z.le traitement est de 24 heures pour les séries Témoin et Essai I et de48 heures pour la série Essai 2.- Après trypsination et centrifugation, B tubes de 2b0 mg de biomassecellulaire ont été préparés par série de traitement et congelés dans del'azote liquide.
n-
Après décongélation et élimination du milieu, I'isolement de I,ADN aété effectué sur 220 mg de culot cellulaire. pour chaque traitement,I'essai est répété B fois.
La composition des tampons et réactifs utilisés figure dans l,annexe II.
L'eætrantian des yides nuclêiques a été réalisée, selon la technique deDunn et al. (1988) en lysant le! cellules par digestion à la protéinase K(1 mg/ml) dans un tampon SET pH g à O,S % SDS
La puri,fim'tinn des a,cides mrclêiqucs est assurée par g extraetionssuccessives au phénol, phénol/ehloroform e + 4 % d,àleool isoamylique(v/v) puis au chloroform e à 4% d'alcool isoamylique effectuées sur lelysat. Les acides - nucléiques ainsi extraits sont précipités àl'éthoxyéthanol à -20.C.
effectué 24 heures après
remplacé par l0 ml de milieu
5r
Ces essais ont été réalisésRether, du laboratoire dePasteur. Strasbourg.
- Un changement de milieu estI'ensemencement,- A 48 heures, le milieu est éliminé etcontenant:
A T G G-addu i t
^, . | | | I ADNmodir ié"\l'-.F+'J-o"I nuc léase de s taphy l l ocoque
I Ohosnhodiestérase de r .a te
.A T Y c G-addui t
llrloirL oH L oH I o". t\\, \t, \t' \',
Pl nuclease
G- adduitIII
OH '1.
\ l \\P
pol-vnucleot ide k inase+ 3 2p . lTp
G'adduit
J ' - phosphodésoxy -r i bonuc léos ides
désoxyr ibonuc 1éos i de s
+
J ' -phosphodésoxy-r i bonuc léos idenod i f i é
3 i -5 ' d iphosphodésoxy -r i bonuc léos idenodi f ié marqué
VG
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II
Yautorad iograph ie du chromatogramme
pol .yé thy lene imine ce l l r r lose
T.A
llo\\"o\\*
" { \ " " { . "
GII
o\\,
YTA
32P
32r -pos t -marquageFigure g I Procédure s inp l i f iée de la méthode de
des nuc léo t i des d run hyd ro l ysa t d rADN(Rande ra th e t a l : , 1981 )
52
I
I
La purifinatinn d,e VADN a êtê faite par digestion enz5rmatique desARN par une solution de ribonucléases ( RNase A à 0,1 mg/ml + 1000unités/ml RNase Tl) dans le tampon SET. L'ajout de la protéinase K à10 mg/ml dans le tampon SET permet ensuite l'hydrolyse des RNases.L'ADN est ensuite extrait par 3 traitements successifs au phénol,phénol/chloroforme + 4 % d'alcool isoamylique (v/v) puis auchloroforme à 4 % d'alcool isoamylique. L'ADN est précipité parl'éthoxyéthanol, centrifugé, dissous dans 100 pl d'eau distillée etconservé à - 20"C.
Le dnsage d,e VADN est effectuê par la mesure des absorbances à 260et 280 nm. Sa pureté est estimêe après calcul du rapport R.
DozooR=
Dozgo
= 1,8 I'ADN est pur> 1,8 I'ADN est contaminé par des ARNs< 1,8 I'ADN est contaminé par des protéines
Pour le calcul de la concentration en ADN, on utilise la formulesuivante établie à partir du coefficient d'absorption molaire :
Une valeur de DOZOO nm de I correspond à 50 ug d'ADN/ml de ladilution.
L'intégrité de I'ADN est vérifiée par électrophorèse horizontale sur geld'agarose (0,8 %).
C - Déteetion des adduits
La détection des adduits à I'ADN sur des cellules SHE en présence ouen absence de chlordane a été réalisée par la technique de post-marquage au 32P (Randerath et al., lg81 ; Reddy et Randlrath, f-SaO ;Rether et al., 1990).
C.1 - Etapes enzvmatiques (figure 9)
Après sèchage d'aliquots de 10 pg d'ADN, une hgdrolgse enzgmntiqted'e I|.ADN en 3'phosphodésoxyribonucléosides est assurée par deuxenz)zmes : la phosphodiestérase de rate (10,7 unités/ul) et la nucléasede staphyllocoque (47 unités/pl).La' rutnlêase PI possède une activité 3'-phosphatasique, elle va doncdéphosphoryler essentiellement les phosphates en 3' des nucléotidesnormaux et non Ies nucléotides hypermodifiés à cause de leurencombrement stérique.
s iRs iRs iR
s3
I
Le mnrqunge d,es adduits se fait par traitement à la T4 polynucléotidekinase (30 unités/ul), qui catalyse le transfert du phosphate terminal3zG)atP à la terminaison OH en 5, des3'phosphodésoxyribonucléosides. Le marquage est suivi par untraitement à l'apyrase qui permet I'hydrolyse de l,ATp en AMp + ppi.
C.2 - Etapes chromatographiques
Migratinn DI :Les échantillons sont déposés à z cm du bas d'une plaque depolyéthylénéimine(PEl)-cellulose et sont espacés entre eux dè Z cm. Unpapier Whatman est agrafé à I'extrémité supérieure de la plaque afind'"aspirer" le solvant au delà de la limite supérieure de la- couche etd'éluer les nucléotides normaux, le 32 (p)ATp résiduel et le
*ppi ho*
de la zone de migration des adduits. Du phosphate monosodique à L,TM pH 5,6 est utilisé comme solvant.Après migration de 16 à 20 heures, re bord supérieur de la praque avecle papier Whatman est découpé et éliminê. La plaque est làvée à l,eaudistillée afTn d'enlever les solvants salins.
Emgreinte, d,êcoupage et transfert :Après avoir autoradiographié la plaque, l,empreinte obtenue estquadrillée. un rectangle de lb mm x 2b mm est dècoupé dans la partieinférieure de la plaque au niveau de chaque dépôt p.ri, trur,sféré surune nouvelle plaque. Cette découpe est maintenuè sur la nouvelleplaque par de petits aimants durant la 2ème migration (Dzy.
La migrratinn D2, se fait dans 75 ml de tampon de formiate de lithium5,3 M et d'urée 8,5 M pH B,b. La durée de là migration est d'environ bheures.
La migratinn Dg, se fait dans le sens perpendiculaire à la précédentedonnant ainsi la séparation bidimentionnelle des adduits.Le solvant utilisé est un tampon phosphate monosodique 0,2 M pH 6,gdilué à 85 %. La migration dure B heurès.
Lamigratinn D4, se fait dans le même sens que la dimension B. Il s,agitessentiellement d'un 'lavage' permettant d'éluer la radioactivité nonliée à la présence d'adduits, le solvant utilisé est le phosphatemonosodique 1,7 M pH6. La migration est d,environ B heures.
Après chaque migration, les pt"qrr", sont lavées deux fois à l,eaupendant 7 minutes pour enlever le solvant absorbé sur les plaques.
54
I
C.3 - Autoradiographie des plaques et comptagede la radioactivité des spots
Les plaques sont autoradiographiées en présence d,un écranintensificateur de rayonnements à - 80'c de 6 à g6 heures, suivant lecas.Après révélation, les spots sont repérés sur les plaques grâce auxempreintes sur les films. La PEl-cellulose correspondant à chaque spotest grattée et récupérée pour un comptage de radioactivité enCerenkov dans un spectromètre à scintillation (SL32, Intertechnique).
D - Calcul du nombre d'adduits
Le calcul du nombre d'adduits a êtê effectué à partir du comptage dela radioactivité des spots et de l'activité spécifique de l'ATp radioactifutilisé.Nous savons que I Ci correspond à z,z.Lolz DpM (désintégrations parminute) et que I'ATP* utilisé est à 3000 Cilmmole. Ainsi le calculmontre que 6600 DPM correspond à 1 fmore (101b mole) d,ATp*.D'autre;lart, il a êtê montré que 1 fmole correspond à 0,BB adduitpour 10Y nucléotides (Dunn, 1g8g).
55
PARTIE I : Etude de la mutagénicité du chlordane, du chlorothalonilet des e>rtraits organiques du percolat T4 et du lixiviat B.
Le test le plus connu et le plus largement utilisé pour la détection dela mutagénèse de produits chimiques et d'échantillonsenvironnementaux complexes est le test d,Ames qui mesure leurcapacité à induire des altérations génétiques (mutations géniques).Malgré les limites de ce test bactérien (ex : faux positifÀ et fauxnégatifs), il est généralement reconnu comme un important outil dedétection de potentialités mutagènes et éventuellement cancérogènes.Nous avons choisi le test d'Ames, dans un premier temps, pour évaluerla mutagénicité de deux pesticides organochlorés (chlordane etchlorothalonil) et d'extraits organiques de deux fractions aqueuses dedéchets solides (T4 et B). Les résultats obtenus, par le biais àe ce test,constitueront une première information sur la génotoxicité de cesproduits, complétée par les données des autres tests decaneérogénicité effectués au cours de ce travail ; ces résultats serontexploités également pour comprendre les mécanismes d,action desproduits testés.
T
56
I - Chlordane
Une gamme assez large de concentrations du chlordane a été testée :0; 40 ; 64 ; I28 ; 160 et 320 pg/bte. Le chlordane est inrroduir dans100 pl de DMSO par boîre.Le chlordane, à ces concentrations, n'induit pas d'augmentation derévertants his+ sur aucune des souches testées t tR gg, iA g7^, TA 100et TA 102 (tableau 1, annexe II).
Aucune augmentation significative du nombre de révertants n,a étéobservée, que le test ait été conduit en présence ou en absence de Snmix. Ceci suggère que le chlordane ou ses métabolites formés in vi,tripar les monooxygénases du Sg, reste inactif quant à I'induction demutations par substitution de paires de bases (TA 100 et TA 102) oupar décalage de cadre de lecture de code (TA g7a et TA 9g).Aucune des concentrations testées ne s'est révélée toxique pour les 4souches utilisées.
@s résu,ltats confir.m,ent lrinanttvttê d,u chlordane à ind,uire d,esmuto,tinns sur TA100 et TASB, uinsi, quit auait êtë m,ontrê par dautresauteurs (simmnn et a,1., 1977 ; fuobst et al., 1gg1 ; knti,l,e it oI., 1gg2 etMortplman et aL, 1986), et dâm,ontrent ïabsence d,e mutngéni,cLtÉ sur lessounhes TA97a et M102.
II - Chlorothalonil
La gamme de concentrations de chlorothalonil testée est : 0,4 i 0,g ;1,6 ; 2,4 et 4 pg/bte. Le chlorothalonil est introduit par 100 uld'acétone par boîte.Les résultats obtenus montrent que le chlorothalonil n'augmente pasle nombre de mutants reverses his+, sur les souches iestées, enprésence ou en absence de sn mix (tableau 2, annexe II).Les concentrations testées nê présentent pas de toxicité vis-à-vis des 4souches bactériennes utilisées.
Peu d'études ont été faites ou du moins publiées concernant lepotentiel mutagène du chlorothalonil. cependant, les quelquesréférences bibliographiques existantes, limitées à un rapport duMinistère de l'Environnement, évaluant les risques mutàgènes etcancérogènes du chlorothalonil et un bref monographe de I'IARC deLyon, convergent pour classer ce produit comme non mutagène.
&s rêsaltats coffirment ceu^û obtenus par Kautanhi et al., (Iggo),corlÆerrùclnt ll absen'ce de potentiel mutagène d,u chlorotlnlanit ûsà4nsdes sou'ch,es M 98 et M 100, et mantrent qu"e ee demi,q est êgalemnntinonti,f sur M 97a et TA l0Z.
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57
IIf - Lixiviats de décharqe
L'évaluation du potentiel mutagène de lixiviats de décharges'inscrivait dans le cadre d'une étude générale qui visait à définir ladémarche à adopter pour évaluer le potentiel génbtoxique des déchetssolides destinés à l'enfouissement technique (c,est a àire la mise endécharge contrôlée) et leur impact à court et long terme au niveauenvironnemental.
Une analyse chimique a été réalisée pour chacun des échantillons ; lestableaux 3a et 4a de l'annexe II, résument les résultats obtenus.
Le test d'Ames effectué sur les extraitsdu lixiviat B, a êtê réalisé au seinLambolez.
A - Percolat T4
L'extrait organique T4 a été testéconcentrations qui correspondent àet 6,2 ml de lixiviat par boîte.
organiques du percolat T4 etde notre laboratoire par L.
pour son potentiel mutagène à Bun volume équivalent à L,25 ; 2,8
Les 4 souches bactériennes répondent différemment (figure l0) ;aucune induction d'augmentation de révertants his{ n'a êtêenregistrée sur TA 100 et TA 102 en présence ou en absence de s, mix.une-réponse positive a par contre été observée en présence de Ën ,,r1.TA 98 à la concentration équivalente à L,25 ml de lixiviat par boîte,avec un facteur d'induction égal à 2. Une légère induction du nombrede révertants d'un facteur 1,6 en prè..t
"e d'une activation
métaboligu€, a êtê observée également Jur TA gZa, pour la mêmeconcentration.
Le facteur d'induction diminue respectivement à une valeur de l,4g etde 1,4 pour TA 98 et TA g7a lorsque les souches sont traitées par uneconcentration plus élevée de 2,b ml ; ceci peut être expliquê parI'inhibition de la croissance bactérienne par suite d,un efrèt bxiquequi masquerait l,expression de la mutagénicité.
Pour Ia concentration d'extrait organique, équivalente à 6,2 ml delixiviat par boîte, une toxicité de rÔ0 %- a êtê observée sur toutes lessouches utilisées. La souche TA 102 se montre plus sensible vis-à-visde cet échantillon puisqu'une toxicité de I'ordre de 60 % est observéequand 14 est testé à 2,5 ml par boîte en présence de s9 mix.
Air*L ln mutngênî,eùté dp ï ertrait organi4un d,u ti^riùint T+ quig eowùme uniqu,ement aTrrès actiaation -ànoott4rr.e, tÉmaignp desptppri'ëtés prttnutagè,nes de cettp fraction com,plcte ind,uisant desmutations par ùnsertinn ou d,éLêtian & gmires de bases.
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E
58
L'analyse chimique réalisée sur le lixiviat T4 dans le but d,établir unerelation possible entre la composition chimique et I'activité mutagènede l'échantillon, est présentée dans le tableau Ba, annexe II.Cette analyse a révélé la présence d'hydrocarbures (12 uglml) et dephénols (4 vg/ml) qui se retrouveraient respectivement à des teneursde L5,25 pglboîte et 5 uglboîte quand l'équivalent de L,z5 ml depercolat est incorporé par boîte.
La réponse positive enregistrée pour l'extrait organique de ce lixiviatserait due, théoriquement, aux teneurs de l'échantillon enhydrocarbures et phénols ; une identification des hydrocarbures et desphénols présents, nous aurait permis de discuter d,une façon plusprécise la nature des produits responsables de la réponse positive etd'établir une corrélation entre la composition chimique et l,impactbiologique.
B - Lixiviat B
L'extrait organique du lixiviat B a été testé à une gamme deconcentrations correspondant à des volumes équivalents à 0,6 ; 2,5 i6,2 et 12,5 ml de lixiviat par boîte.L'extrait organique induit une réponse positive très nette avec TA g7a,TA 98 et TA 100 avec et sans activation métabolique. Une relationdose-effet a été obtenue pour les B souches ; par exemple, le facteurd'induction pour TA 98 est de 2,6T et de lg lorsque l,extrait estincorporé respectivement à des volumes correspondant à 0,6 et I2,5ml de lixiviat par boîte (fïgure 11).
Si on compare la sensibilité des différentes souches vis-à-vis dupouvoir mutagène de cet échantillon, on peut conclure que la soucheTA 98 est la plus sensible, avec un facteur d'induction de 1g pour laconcentration maximale testée, suivie par la souche TA gza avec unfacteur d'induction de 3,63 et la souche TA 100 dont le facteurd'induction est de 2,58 pour la même concentration.une légère toxicité a été observée sur la souche TA Loz à laconcentration maximale testée en présence de 59.Après activation métabolique, on observe généràlement une diminutionde l'activité mutagène ; ainsi, le facteur d,induction passe de 1g sansactivation métabolique à 10 avec activation métabolique pour TA g8 et12,5 ml équivalent de lixiviat par boîte.
ces résultats témoignent de la présence de mutagènes directs, nenécessitant pas d'activation métabolique pour s'exprimer.
59
I
Si l'on exclut I'hypothèse d'une adsorption de mutagènes indirects parle Sg, I'activité des mutagènes directs dans cet échantillon serait plusélevée que celle des mutagènes indirects, si I'on en juge par ladiminution du facteur d'induction, en présence d,activationmétabolique.
La diminution de l'activité mutagène en présence de Sn mix, pourraits'expliquer par la génotoxicité plus faible des mutagènes indirects parrapport aux mutagènes directs.La réponse positive, après activation métabolique, peut être liée auxmétabolites formés, mais aussi aux mutagènes directs non métabolisés.
L'analyse effectuée sur le lixiviat B, n'apporte aucune informationquant à la nature éventuelle du ou des produits responsables de cetteréponse positive (tableau 4a, annexe II).Ce cas souligne la difficulté rencontrée souvent par de nombreuxauteurs pour établir une corrélation entre l'analyse chimique réaliséeconformément à la réglementation et la réponse biologique de milieuxenvironnementaux complexes.
6o
TARTIE= g : Etude de I'inhibition de la eoopération métabolique entredes cellures libroblastiques de la lignée vzg par Ie chlor-dan"; i;chlorothalonil et des extrâits organiquis du percolat T4 et du lixiviat B.
L'absence de génotoxicité du chlordane et du chlorothalonil, et leurcaractère tumorigène in vi'uo, militeraient en faveur d'une activitéeancérogène par des mécanismes épigénétiques. c,est cette hypothèseque nous testerons dans la suite.Nous avons don-c étudié, dans cette deuxième partie, l,effet du chlordaneet du chlorothalonil sur I'inhibition de la coopération metabolique entredes cellules fibroblastiques (VZg) résistàntes et sensibles à la6-thioguanine, selon- le protocole de Trosko-ài-at., (Igg2).Nous avons testé_, êgarement, I'inhibition de la communicationintercellulaire par les èxtraits organiques des échantillons T4 et B,sachant qu'ils se sont révélés muhgénes dans le test d,Ames.
Tab ]eau 5 : Résu l t a t s des essa i s d ' INH IB IT I0N DE LA C00PERATIO i l METAEOLIQUEsu r ' l es ce l l u l es v79 cu l t ' l vées en p résence de cHLoRDANE.
CH LORDAN Epg/m' l
0 10 L2 15 18 20* ?5J, TPA0 ,001
nbre co ] /10 b tesér ie Asér i e B
1027264
986691
85495?
8941032
899LL2A
6531 181
258804
9821190
T (%) 25,7
R ( % ) 70 110 115 r25 t78 3r2 L2t
BT
1 2.7? 4 ,28 4 ,47 4 ,85 6 . 93 L2 .14 4 ,71
R éponse + +++ +++ ++++ ++++ +++
Tox i c i té % 0 4 16 13 12.5 5 3 75 4
T % - - Taux de récupéra t ion des ce1 lu les rés is tan tes chez ' l e Témoin .
R % = Taux de récupéra 'u i on des ce ] l u ]es rés i s tan tes chez ' l es t ra i tées
* Tox ic i té supér ' i eu re â 30 %
Tab ' l eau E : Résu l t a t s des essa i s d ' iNH IB IT IO I { DE LA C00PERATI0 } tMETAB0L IQUE su r I es ce l I u ' l es V79 cu1 t i vées en p résencede CHLOROTHALOI{ T L.
ESSAI 2
CH LOROTHALON I L
pg lm l
0 0.05 0 ,08 0 ,1 0 .15 0 ,2 0 .5 TPA0 .001
nbre co ] /10 b tessér ie Asér i e B
843288
727272
1076270
680247
722242
810347
763371
749897
T (%) 34,2
R (%) 37 ,4 25.L 36 .3 33 ,5 42.8 48 ,6 119 ,8
BT
1 ,1 0.7 1 ,1 1 1,3 L ,4 2 ,67
Répon s e
6r
r - rnhibition de la coopération métabolique nar le chlordane
La gamme de concentration choisie, à I'issue d'essais de toxicité, est lasuivante :9, 10,- L2, 15, 18, 20 et 2s pg/ml de milieu de culture. Le chlordane estinlr-o.auit par I'intermédiaire du DMSO, utilisé à la concentration de0,2 %.
L'effet du chlordane sur I'inhibition de la coopêration métabolique entredes cellules V79 résistantes et sensibles a la'O-tnioguanin", "rt
présentédans Ie tableau 5.A la plus faible concentration testée (10 pglml), le chlordane inhibe lacoopération métabolique entre les celluleJ résistantes et les cellulessensibles, 9e qyi permet aux cellules résistantes d'échapper à la toxicitéde la 6-TG métabolisée par les V79 sensibles. Le nom'Ure de coloniesf-ormé_es à-partir de ces cellules résistantes est 2,7 fois pius éteve quàdans le milieu témoin.Ce nombre augmente au fur et à mesure que les concentrations encNordane s'accroissent.
A la concentration de 18 pglml en chlordane, la récupération des cellulesrésistantes est_ presque totâle : le rapport (d/T) ae i,go esi équivareni àcelui obsenré l_q:sqge lg coopération métaùolique
"ntte ces cettules est
inhibée par le TPA à 0,001 vgtml.La toxicité enregistrée augmente avec la concentration en chlordanetestée , elle atteint respectivement 35 % et 75 % pour les concentrations20 et 25 pg/ml
Ces résultats suggèrent que le chlordane non mutagène, exercerait seseffets cancérogènes in vi,uo, entre autre par l,inhibitiol de lacommunication intercellulaire. Il se révèle, en celâ, comparable à d'autrespes-ticides organochlorés (heptachlor, DDT, dieldrin), q,ii se sont montrésinhibiteurs de la communicafion intercellulaire tWitiiârirs, lgSl ; telanj eidl-, 1982 ; Tsushimoto et al., lggg). Les effets d'inhibition des GJIoexercés par des organochlorés sur la membrane plasmique, semblent êtreune caractéristique de cette classe de produits.
Nos résultats sont en accord avec ceux de Kurata et al. (lg82) sur lalignée V79 et cglï.de Telang et at. (tgg2) sur des cettUes eiitnena"s defoie de rat (ARL) qui avâient mis en évidence une iriniuition desconrmunications intercellulaires par des concentrations en chlordanecomprises entre 0,4 à 20 pg/ml.
Tab leau 7 : R ,ésu l t a t s d ' essa l s d 'su r t es ce l l u l es V79 cu l t l vées en. I 'EXTRAIT ORGANIOUT COIICE}ITRE DU
I I IH IS IT IO} I DE LA COOPERATIOI I METABOLIQUEprésence de d l f f é ren ts vo lumes de
PIRCOLAT DE DECHARGE T4.
I
Tab ' l eau E : Résu ' l t a t s d ' essa i s d ' I l {H IB IT I0 t { DEce I I u l es V79 cu l t i vées en p résence de d l f f é ren tsCONCENTRE DU L IX IV IAT DE DECHET B .
LA C00PERATI0I I METABOLIQUE sur ' les
vo ]umes de l 'EXTRAIT ORGAi I IQUE T
ESSAI 2
Vo l ume équ i va1 en tde pe rco l a t T4
p l /m l
0 3.2 r5,2 32 8t TPA0 .001
nbre co ] / 10 b tessér ' i e Asér i e B
65826L
640305
643263
68828?
678315
749897
T (%) 39 ,1
R (%) 47 , 7 40,9 41 46.5 119 ,8
BT
L.2 I 1 L,2 3 ,06
Rêponse +
Vo' l ume êqui va l entde I i x i v i a t B
pl /ml
0 0,16 1 .6 3,2 16 .2 L62 TPA
nbre co l . /10 b tes
sér ' i e Asér l e B
789t26
73L91
78?131
570118
713102
779159
737655
T% 16
R% L2 L7 18 14 20 89
R/T 0 .75 1 .06 1 .13 0 . 88 1,25 5 ,56
Réponse +++++
62
Yl9 p."o1ère.gamme de concentrat ions a étê testée :0,025;0,0b; 0,1 ;0,15 et 0,2 pg/ml.
Les résultats obtenus montrent qu'aucune des concentrations testées nes'est révélée positive, le taux de récupération des cellules résistantesr9s!9 identique à celui du témoin, ce qui indique que le chlorothaloniln'affecte pas la formation et le fonctionnement des Gap junctions entreles cellules v79 sensibles et résistantes à la 6-thioguaninô.
-
Un deuxième essai a êtê effectué avec une gamme de concentrations unpeu plus large : 0,05 ; 0,08 ; 0,1 ; 0,15 ; 0,2 et 0,5 p'/ml de chlorothalonil.
I I -
Les résultats obtenus (Tableau 6)l'absence d'inhibition de lachlorothalonil.
confirment les précédents concernantcoopération métabolique par le
m
On peut conclure a,lors que ln chlorothalnnil, ni altère p@s ln cqrnmuni,ca,tinnintercellulaire, du moins sur lps cellules fifuroblastiquns de In ùignée VZg etda,ns nos conditinns erpffi,m,en tntes.
La gamme de concentrations testée, pour les 2 extraits, correspond à desvolumes équivalents à 0,16 ; 1,6 ; 3,2-; 16,2 et 162 pl de lixiviat par ml demilieu.
L'extrait T4 n'entr1în9 nas d'inhibition de la coopération métaboliquesur les cellules V79. Le nombre de colonies formées, en présence del'échantillon aux concentrations non toxiques, est comparablè à celui destémoins.Une toxicité totale a été enregistrée pour la concentration maximaletestée, correspondant à IOZ pl de lixiviat par ml.
Un deuxième essai a été effectué avec la gamme de concentrationsc-orrespondant aux volumes équivalents à 0 ; B,Z ; L6,Z ; 82 et g1 pl delixiviat par ml. Aucune toxicité n'a été enregistreé a ées'concentrations.Les résultats confirment que les micropo[uânb prêsents dans I'extraitT4 n'inhibent pas la communication intercellulaiie sur les cellules VZg(tableau 7).
L'extrait du lixiviat B n'inhibe pas la communication intercellulaire descellules fibroblastiques de la hghée V79 aux concentrations testées, cesdernières sont exemptes de toxicité (tableau g).
L'e-xtrait_organique T4 s'avère plus toxique que I'extrait B vis-à-vis descellules V79, cette différence de toxicitéâvaiî été déjà constatée sur lessouches bactériennes de Sa,lm,onetla tgplyimuri,um, utilisées pour le testd'Ames.
63
ParÉie Irr : Etude des effets du chrordane, du chlorothalonild'extraits organriques du percolat T4 et du lixiviat B, surtransformation des cellules d'embryons d.'hamster s5rien (srrE).
La transformation morphologique est un critère de cancérogénèse izuttro, intégrant I'ensemble des altérations génétiques et épigénéfiquesau niveau cellulaire, susceptibles de conduire in vùao à un cancer.EIle peut être observée :
1) après une seule application d'une substance caneérogène,2) après plusieurs applications répétées dans le cas d'ùne substance àprofil d'activité de promoteur,3) ou lors de I'application séquentielle d'un initiateur (substancegénotoxique) et d'un promoteur appliqué par la suite, une ou plusieursfois selon le schéma classique Initiation-promotion.
Dans ces essais réalisés sur les cellules SHE, plusieurs protocolescalquant ces différents schémas d'application, ont été mis en oeuvreafin de discerner le profil d'activité dominant de l'échantillon et voirs'il pouvait assurer la transformation à lui seul ou lors de I'activitéconjointe d'un initiateur (B(a)p) ou d'un promoteur (TpA).Chacun des êchantillons testés a donc été étudié selon différentesmodalités de traitement par :- l'êchantillon seul appliqué une et plusieurs fois,- B(a)P (0,1 pglml) pendant 24 heures, suivi de l'échantillon,- l'échantillon (pendant 24 heures) suivi du TpA (2 applications de 0,1p8lml).
etla
800
700
600
s00
400
300
200
r00
O - É t U ) € OO e û t U t c C
N O - r n - U t € fNCh lordane
0n/mt)
(\,1
Figure 12 : Transformation morphologique des SHEaPTès une, deux ou trois applications de
chlordane.
803.(l,
tr70E
;60F
) u a ,-e
40:l,
30€o
20Êoz
r0
64
I - Chlordane.
A - Traitement par le chlordane seul
Deux séries de concentrations de chlordane (0 ; L ; 2,5; b ; 8 uglml et0 ; 5 ; 8 ; 20 ; 4o pg/ml) ont été restées au cours de deux expériencesindépendantes ; trois modalités de traitement : une application, deuxapplications et 3 applications, correspondant à l, 2 ou B ajouts dechlordane ont été étudiées.
Les résultats présentés dans le tableau 9 , montrent que la fréquencede transformation morphologique des cellules SHE n'est pas augmentéeaprès 1 ou 2 applications de chlordane.Une augmentation du pourcentage de transformation est observéeaprès 3 applications de chlordane à la concentration de 8 pglml. Lepourcentage de transformation passe, en effet, de 0 à g,Z % lors de lapremière expérience (figure L2) et de 0,4 à L,z% àra seconde.
Une toxicité du chlordane, après I application, est notée dès laconcentration de 20 vg/ml, l'efficacité de clonage n,est alors que deL4% alors qu'elle atteint 19 % chez les témoins.Après 2 applications, une toxicité est enregistrée à la mêmeconcentration mais elle est plus élevée : l'efficacité de clonage passe de23 % chez les témoins à 8 %.La toxicité n'apparaît à la concentration de g pglml qu'après gapplications.
B - Traitement séouentiel par le chlordane et le TpA
L'effet transformant du chlordane appliqué pendant 24 heures avantle traitement par le TPA, a été étudié au cours de g expériencesconduites séparément. Les résultats sont présentés dans le tableau I0.
Au cours de la première expérience, on observe une augmentation dupourcentage de colonies transformées pour la concentration enchlordane de 8 ;rglml, appliqué avant les deux traitements au TpA à0,1 pglml. Le taux de transformation induit par le TPA seul est de 4,7%, il passe à 1L % en présence du chlordane (figure IB).
Ces effets de synergie entre le chlordane et le TPA sont retrouvés lorsde la deuxième et la troisième expérience, pour des concentrations enchlordane de 20 et 16 pglml respectivement.Le taux de transformation du TpA augmente de g,g % à l9,g % enprésence de 20 uglml de chlordane au Zème essai ; it augmente de g à13 % avec 16 pglml de chlordane au Bème essai.
900800700600500400300200100
0
[îgure 13 : Transformation morphologique des SHE après le traitement séquentiel Par le
chlodane et le TPA.
700
7C'
6o50
40
30
20
r0
0
600
s00
400
200
100
I z,sChlordanc Qf.lmll
Hgure 14 : Transformæion morphologlque des SHEaprès le traiæmenr séquentiel parle B(a)Pet le chlordane.
9080
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6S
Si l'on considère les taux de transformation obtenus avec le chlordaneet le TPA, appliqués séparément, on peut conclure que ces résultats nerésultent pas d'une simple additivité de leurs efféts respectifs maisd'une interaction entre les effets du TpA et du chlordane.
Nous avons effectués des essais supplémentaires en appliquant lechlordane (1) simultanément au TPA ou (2) à la suite d'un-traitementau TPA, afin de voir si I'ordre de la séquence de traitement influençaitles résultats.L'application simultanée du chlordane et du TPA, deux et trois fois,entraîne comme précédemment une augmentation du taux detransformation qui s'élève de 4,3 % pour deux applications en présencedu TPA seul, à l l ,5 g6 en présence de chlordanl à 16 p,/ml. pour Bapplications de TPA, le taux de transformation passe ae ro % à g6 %en présence du pesticide (tableau b, annexe II).Par contre, l'effet de synergie est quasiment inexistant lorsque lechlordane est appliqué 2 fois après un traitement par Ie TpA.
IJ effet dp potcntial:ùsatian des effets transfor.mants d,u TpA par Ipchlordane semblc danc iopérer uniquem,ertt ltrsqu.e les p Trod,uits sonta'ppliqu.ês en simulfuû, ou l,orsque le trai,tem,ent au chl,ordal,e précèdnun traitsm,ent rêpétê au TPA.
Si on se réfêre au mod'èl,e (Initiatton-homotinn), uti,Iisê in uiuo pourr étud'e dp In cannérogénèse en d,eus étapes, ï augrmnntation d,e tatransformation des cellul.es SHE, prouoqtêe par un tra1tepent séqu,enti,etpar le ch,lnrdane et Le TPA, peut cond.uire à, assimilæ l,e chl,ordane à, uninitiatpu.r.& rësultat rernet sn ca,use le caraptère 'non gênotnri,qun" du, chlardann,mais iI peut anÆsi, trai'ui,re lieristence d)une sArterg1e TpA-Chlûdnnp nefaisant appel qrà d,es mécani,snes épigénëtùqu,es ; ce qùir tt;1,tts faud,raéclnirci,r par la suite.
c - Tïaitement séqnentiel nar l" B(a)p et le "hlordane
Les effets du chlordane sur la transformation des cellules SHEprétraitées par le B(a)P à 0,1 pglml pendant 24 heures, ont été étudiésaux concentrations de : 0 ; 1 ; 2,5 ; b et g pglml et 0 ; b ; g ; 20 et,4o pg/ml, au cours de deux séries d'essais (tableau l0).Les résultats obtenus, montrent que.les fréquences de transformation,L,L % et 2,8 %, induites respectivement par le B(a)p seul au cours de lapremière et la seconde expérience, ne sont pas augmentées suite autraitement par le chlordane (figure 14).rn ehlordane rtagi,t dann pas conunæ unInwnloteur de type TpA, da,ns tescltëma espêri,m,entnl de la cannêrogênèse sn daÆ ëapei, appti4yê à, lntransfor.nwtion morTtlwlogi,qup dcs cellut es SHE.
Fcurc 15 : [ f fet de la DEXAHETHASOI{E sur IET DU TPA sur la t rans formr t lon(3 p ro toco les ) .
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66
D - Action de la dexaméthasone sur les effets combinés duchlordane et du TPA
La dexaméthasone (DXME), donnée comme un inhibiteur des effetsépigénétiques du TPA et d'autres promoteurs, a été utilisée à laconcentration de 11 pE/ml, afin d'évaluer la part des mécanismesépigénétiques dans la transformation morphologique observée sur descellules SHE traitées successivement par le chlordane et le TPA.Les résultats obtenus montrent que le traitement à la dexaméthasoneentraûre une inhibition complète des effets de synergie chlordane-TPA,qui peut s'expliquer par I'inhibition des effets transformant du TPAseul par DXME.Les pourcentages de transformation pour 16 uglml de chlordanes'abaissent de Lg % sans DXME à 2,2 96, 1,9 % et 2,4 % en présence ducorticoide appliqué selon les protocoles A, B et C respectivement.Que la DXME soit appliquée :- à Jt quatre heures après le chlordane (protocole A),- à JZ et J5 quatre heures après les deux traitements au TPA
(protocole B)- ou à JL, JZ et Jg quatre heures après tous les traitements
(protocole C).elle entraîne I'inhibition de la transformation observée lors d'untraitement séquentiel par le chlordane et le TPA.
Les pourcentages de transformation correspondant aux 3 modalitésd'application de la DXME sont respectivement 2,2 yo, I,9 o/o et 2,4 %comparés à Lg % lorsque le test de déroule sans application de laDXME en présence de 16 rrglml de chlordane. (figure 15)
II. Chlorothalonil
A - Traitement par le chlorothalonil seul
Le chlorothalonil a êtê testé dans un premier temps auxconcentrations de 0 ; 0,2; 0,3 ; 0,4, 0,5 ; 0,6 pglml. Ces concentrationsse sont révêlées trop toxiques comme en têmoignent l'êfficacité declonage qui passe de 24 % chez les témoins à 5 % èL la concentration de0,5 pglml en chlorothalonil (tableau l1).Une gamme de concentrations plus faibles a été utilisée dans unedeuxième étape : 0 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,5 pglml.Les résultats présentés dans le tableau 11, montrent que lechlorothalonil appliqué 1, 2 ou 3 fois, n'induit aucune augmentationsignificative de la transformation morphologique des cellules SHE(figure 16).
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Chlorothaloni I (rrglml)
Figure 16 : Transformation morphologtque des SHE après une, deux ou trrois applications de
chlorothalonil.
67
Le chlorothalonil s'avère toxique à partir de 0,2 uglml après z etapplications, l'efficacité de clonage diminue respectivement de zz %I3%etde22%à6%.Après 3 applications, les faibles augmentations des pourcentage detransformation de r % et L,g % enregistrées respectivement à o,z et0,3 p8lml, peuvent difficilement être prises en considération du fait dela toxicité élevée de ces concentrations.&s essozs perm,ettent d,e conchrre qrc Le chl,orotlnlpnil d desconnsntratinns ïton tort4tns rtinduit pcts In transformntinnmotphnlagiqun des cellules sHE, torsqtit est appliquÉ seut.
B - Tlaitement séquenti"l na" le chlo"oth"Ioril "t
IeTPA
Lorsque le chlorothalonil est appliqué pendant les 24 heures quiprécèdent la phase de traitement par le TpA selon le schémaexpérimental initiation-promotion, aucune augmentation significativen'a été observée arxK concentrations testées (tableau 6, anneie II).Aucune toxicité du chlorothalonil n'a été enregistrée dans cesconditions.
chlorothalonil
Le B(a)P a été utilisé en tant qu'initiateur aux concentrations 0,1 et0,2 pg/ml.Le chlorothalonil a êté testé comme promoteur aux concentrations de0,0,2,0,3, 0,4, 0,5 et 0,6 pglml avec I ou 2 traitements.
Lorsque le B(a)P est utilisê à 0,1 vg/mt et suivi d,une appt:inatùon dechlorothaloni,l à 0,5 uglml , le pourcentage de transformation est de2,6 % au lieu de 1,6 % chez les témoins B(a)p ; une faible toxicité estobservée à cette concentration.
Après daltfr appl:inatians de chlorotlnlonir à 0,b pglml, on obsenre uneaugmentation significative du taux de transformation qui s'élève de8% chez les témoins B(a)p 0,1 pglml, àz,T g6 en présence du pesticide; néanmoins, la toxicité observée à cette concentration nous a amené àconfirmer ce résultat (expérience 2).
La deuxième expérience, effectuée dans les mêmes conditions,confirme I'augmentation du taux de transformation lors d'untraitement séquentiel par le B(a)p suivi de deux applications auchlorothalonil. Le pourcentage de transformation de l,g ù lié au B(a)pseul, passe à 4,3 % pour 0,2 pglml de chlorothalonil et à lg % pour0,6 pg/ml de chlorothalonil (tableau l2).
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Figure l8 : Transformation morphologique des SHE par une, deux ou trois applications deI'extrait organique du peroolar T4.
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68
Lorsque les cellules sont prétraitées au B(a)P d 0,2 Vg/rnl, et qu'unseul traitement de chlorotlnl,ortùl est effectué, une faible augmentationde la fréquence de transformation est notée pour les concentrations de0,5 et 0,6 pglml du pesticide. Le nombre absolu de coloniestransformées s'élève de L4 chez les témoins B(a)P à 2L pour ces deuxconcentrations.Après 2 appl:inatinns de chlnrotlnlonil, I'augmentation du taux detransformation est nettement plus importante : la fréquence passe deL,6 % chez les têmoins B(a)P (0,2 pglml) à 19,5 % après les deuxapplications supplémentaires de chlorothalonil à 0,6 vglml (tableaul9). Mais I'augmentation du taux de transformation est déjà notable à0,2 pg/ml du fongicide (figure l7).La concentration de 0,2 pç/ml de B(a)P, donne une réponsequantitativement plus importante que celle obtenue avec 0,1 pglml.Cette différence peut être expliquée par un degré d'altération dugénome plus important à 0,2 vq/ml.DaTrrès ces résttltats, Ip chlnrotlwln?rùl sembl,e agrir cam:rnn un prornoteurclassi,qun da,ns Ie schêmn erpffi,mentnl ùnitintian-prcmntinn.Li applination rëpëtée du chlorotlnlnfti,t est nêcessaire pour obsenser uïtprëponse posùtùue aTtrès quc lns cellules ai,ent êté prêtraitées à, 0,1 pg/mlou d, 0,2 pg/ml d,e benzo(a)pVrène.
III - Tlansformation morphologique des cellules (SHE) par lese>rtraits orsaniques de T4 et B
A - Extrait orqanique du pereolat de décharEe T4
4.1 - Tlaitement par I'extrait orqanique T4 seul
La gamme de concentrations testée correspond àéquivalents à 0 ; 1,6 ; 3,2 ; 16,2 et L62 pl de percolat deml de milieu ; l'extrait est en solution dans le DMSOconcentration de 0.2 % dans le milieu.
des volumesdécharge parprésent à la
Les résultats obtenus après une, deux et trois applications de I'extraitorganique T4, sont présentés par la figure 18. (tableau 7a, annexe II).
Un seul traitement par cet échantillon appliqué même à faibleconcentration suffit à induire la transformation des cellules SHE ; parexemple, la concentration équivalente à un volume de L6,2 pl depercolat par frI, entraîne une augmentation de la fréquence detransformation de 3,5 %.
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Fgure l9 : Transformarion morpirologique des SHE après le uaitement s{uentiel par
l'échantillon T4 et le TPA.
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Fi-eure 20 : Transformation morphologique des SHE après le rraitemenr séqpenriel par le B(a)p erI'echanrillon T4.
69
Le taux de transformation est augmenté également après 2 et 3applications dès la concentration équivalente à 1,6 pl de percolat parml, il est respectivement de 4,6 % et de 7,7 %. Mais aucune relationdose-effet n'est notée lorsque les concentrations augmentent.
Une toxicité est observée pour une concentration d'extrait équivalentà L62 pl de percolat par ml, après 1 ou 2 applications ; elle s'exprimedès 16,2 pl après 3 applications.
A.Z - Traitement séquentiel par I'extrait
""-""i""" a" T4 .
La même gamme de concentrations a êtê utilisée pour étudier leseffets transformants lors d'un traitement séquentiel par I'extraitorganique du percolat T4 pendant 24 heures, suivi par le TPA.Les résultats présentés, figure 19, montrent qu'une application deI'extrait organique, précédant deux applications de TPA de 0,1 pglml àJ2 et J5, augmente la transformation morphologique des cellules SHEdès une concentration équivalent au volume de 3,2 pl de percolat parml ; un taux de transformation de I5 %, soit 3 fois supérieur à celuiinduit par le TPA seul (5,9 %), a été observê à la concentrationcorrespondant à un volume de 16,2 ul de percolat par ml de milieu,(tableau 7a bis, annexe II).
Li ertrait organique du li^riuint T4 agtt donc cornmp iraùtintelff dnns leproeesszls d,e In transformntian cellulnire des SHE.
4.3 - Traitement séquentiel par Ie B(a)P ett'"*ia
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Une gamme de concentrations identique à la précédente, a êtê utiliséepour évaluer les effets transformants du percolat T4 sur des cellulesprétraitées 24 heures par 0,1 pglml de B(a)P.
Aucune des concentrations testées n'a augmenté nettement lafréquence de transformation des cellules. La plus forte concentrationinduit un pourcentage de transformation de L,5 % alors que le taux detransformation induit par le B(a)P seul est de 0,4 % (figure 20).
Dercemble des essois mpntre quc ïettrai,t organi4u,e T4 se curnportncùmrnp inittnteu,r daræ le pnoæssus diinduntinn de ln transformattnnællùlni,re des SHE in aitTp ; il ind,ui,t êgalsm,ent une augrmantntinn dutau,s d'e transformntion lorsqùil est app@uë seul sur les æIlules SHE.Mais il n:ùnduùt pas daugrmentatinn nptte dp ln transformatinn sur descellulps gnëtraitÉes au B(a)P.
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Fi-eure 2l : Transformation morphologique des SHE après une, deux ou rrois appiicarions deI'extrait oganique du lixiriat B.
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B - Extrait oreanique de lixiviat B
8.1 - Traitement rrar I'extrait orqanique dulixiviat B.
Les concentrations testées correspondent à des volumes équivalents à0 ; 1 ,6 ; 3,2 ; 16,2 et L62;rl de lixiviat par ml de milieu.
Après I application, seule la concentration correspondant à un volumede L6,2 ul de lixiviat par Rl, augmente la fréquence detransformation ; celle ci est de 2,4 % alors que celle des témoins estnulle (frgure 21).
Aucune concentration de l'extrait organique du lixiviat appliquée deuxou trois fois, n'entraîne d'augmentation de la transformationmorphologique des cellules SHE.Aucune toxicité n'a été observêe sur les SHE, lors d'un traitementunique ou multiple par cet échantillon (tableau 8, annexe II).
L'extrait organique de ce lixiviat semble n'avoir qu'un faible potentielà induire la transformation cellulaire sur les cellules SHE ; cet effets'est manifesté uniquement lors d'un seul traitement par uneconcentration correspondant au volume de 16,2 pl de lixiviat par ml.
8.2 - Tïaitement séquentiel par I'extrait
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L'effet initiateur des micropolluants de l'échantillon B a étê testé surla même gamme de concentrations que précédemment.
Les résultats obtenus montrent une augmentation nette de latransformation des SHE, aprés un traitement séquentiel par
.Ilêchantillon à une concentration équivalent à 162 ul de lixiviat par mlpendant 24 heures, suivi par un tratement répété au TPA. Lafréquence de transformation est de 9,7 96 comparée à 5 g6 chez lescellules exposées au TPA seul (figure 22).
I'es micropollunnts de li ertruit organiqrrc du lifitlltnt B agrissent eninitiatetns pour ln transformntinn marplnlagi,qun d,es ceilules SHE.
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Figure 23 : Transformation morpbologigue des SHE après le rraiæment sequentiel par le B(a)p etl'échantillon B.
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8.3 - Traitement séquentiel par le B(a)P ett'"-t*tt
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La même gamme de concentrations a êtê testée pour étudier I'effetpromoteur de cet échantillon.Les résultats obtenus montrent une très légère augmentation del'ordre de 0,4 % à L,2 % de la transformation morphologique, sur lescellules prétraitées par le B(a)P et exposées ensuite à l'échantillon(figure 23). Les taux d'augmentation observés restent néanmoinscomparables à ceux notés avec I'extrait B, appliqué seul, aux mêmesconcentrations (tableau 8bis, annexe II).
Comme T4, I'extrait organique du lixiviat B agit comme initiateur de latransformation induite sur les SHE par le TPA, il induit faiblement latransformation lorsqu'il est appliqué seul ou sur des cellulesprétraitées par le B(a)P.
Ces résultnts coqfirmnnt l,e caraptùre gêrntotiqu.e des ertrq,itsorganiquns d,es l,:i,ri,uints T4 et B, déjà,nais en êvidenne sur les sounh,es d'eSalmonella typhimurium utùlisêes dnns Le test diAm'es.
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76
PARîIE IV : Effet du chlordane sur I'activité ODC des cellules SHE
Dans le but d'éclaircir quelques aspects du mécanisme d'action duchlordane dans Ia potentialisation des effets transformants induits parle TPA sur les cellules'SHE ; les effets du chlordane ont été testés sur :
- I'activité ODC sur les cellules SHE (Parrie IV),- le flux de calcium intracellulaire libre (Partie V),- la formation d'adduits sur les SHE (Partie W).
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77
I - Cinétique d'induction de I'ODC nar le chlordane
Lorsque le chlordane est ajouté aux cellules SHE à la concentrationfinale de 4 vq/ml, I'activité ODC diminue légèrement après 2 heuresavec une valeur minimale à 4 h,une reprise d'augmentation deI'activité ODC est constatée après 6 heures de traitement (figure 24).
L'étude de la cinétique d'induction de I'ODC par le TPA (0,1 pglml)dans les mêmes conditions expérimentales, a montré que I'activitéODC augmente rapidement atteignant un pic 5 heures après le débutdu traitement (Robert, 1991). Le temps t = 5 heures est retenu commetemps d'incubation, temps nécessaire pour étudier la modulation parle chlordane de I'activité ODC induite par le TPA.
II - Effets du ehlordane sur I'activité ODC induite nar le TPA
Dans un premier temps, les cellules SHE sont traitées en simultanéepar le chlordane (4 pg/ml) et le TPA (0,1 pglml), pendant 5 heures, onobserve une augmentation de I'activité ODC égale à Ia somme del'activité ODC induite séparément par le TPA et le chlordane.
Pour simuler les conditions dans lesquelles le chlordane potentialisaitI'effet transformant du TPA, les cellules ont été traitéessuccessivement par le chlordane et le TPA. On constate alors que letraitement au chlordane pendant I heure suivi d'un traitement au TPApendant 4 heures, augmente l'activité ODC déjà induite par le TPA.
Cet effet de synergie est accentué si le chlordane est laissé dans lemilieu pendant le traitement au TPA.
Si le chlordane est appliqué pendantpréalablement traitées au TPA pendantdiminution de l'activité ODC comparé au(figure 25).
2 heures sur des cellules3 heures, on assiste à unetaux d'induction par le TPA
L'êtude de I'activité protéolytique montre une augmentation du tauxde protéases, induit par le chlordane, atteignant un pic à t = 2 heures,suivie par une diminution progressive vers le taux basal aprês 5 heuresde traitement (figure 26).
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Tcmps (hcurc)
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Figurc 26 . McxJulation dc f'activité rlc la prottrsc 70 KDa <lcs ccllulcs Sl{E par tc chlordanc ct lcTpA.
78
L'activité de la protéase 70 KDa est responsable de la dégradation desARNm du gène de I'ODC. L'augmentation de I'activité protéolytiqueinduite par le chlordane et le TPA, explique la diminution de l'activitéODC enregistrée avec chacune de ces substances ; les périodes detraitement nécessaires à la modulation de ces deux activitéscoincident.
Des études plus approfondies, sur les propriétés protéolytiques duchlordane, seraient nécessaire pour démontrer la régulation post-transcriptionelle par le chlordane de l'activité ODC induite par le TPA.
79
PARTIE V : Effet du chlordane sur le taux CaZ+ intracellulaire descellules SHE
I - Modulation du Ca2* libre intracellulaire par I'fonomvcine
L'Ionomycine (Sigma 10634), un ionophore de calcium, a êtê utilisécomme témoin poqitif au cours de cette expérience. Il facilite Iapénétration du Caz+ extracellulaire dans le milieu intracellulaire etpermet de vérifier que la complexation du fluo 3 par les ions de Ca2+résulte en une augmentation de la fluorescence.
Après application de 10 pl d'ionomycine, le taux de fluorescenceaugmente progressivement pour atteindre,un plateau à t = 100 secondes.Ce type d'évolution du taux de Caâ- intracellulaire typique OS?ionophores de CaZ+ traduit une penétration progressive des ions de CaZ+libre du milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaire.
Ce résultat témoigne de la validité des conditions expérimentales et de laqualité des cellules SHE.
Il est à noter, si l'on en juge par le taux de fluorescence des différentescellules à t = 0 que le taux d'incorporation du fluo 3 est variable d'unecellule à I'autre ; la normalisation des données permet de prendre enconsidération cette variabilité.
II - Effet du chlordane sur le taux du Ca2t intracellulaire libredes cellules SIIE
Le traitement des cellules SHE par le chlordane à 8 uglml entraîne unelégère augmentation de la fluorescence avec un flash ù 270 secondestraduisant une montée rapide de Ca2+ libre dans le milieu intracellulaire(figure 27).
Ces fluctuations de la fluorescence traduisent deux événements:
- de t = 0 à t = 230 secondes, la légère augmentation du taux deCaZ+ intracellulaire correspondrait à un faible influx de calciumextracellulaire,
- de t = 230 à t = 310 secondes, le pic de fllrorescence observé, dûà une augmentation rapide et importantô du Ca2+ libre intracellulaire,traduirait une libération des ions Caz' à partir d'un stock intracellulaire,probablement le réticulum endoplasmique.
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Figure 27 : Modulation du tarrx de C-22+ [bne intracellulaire des cellules SHE traitées par le
chlordane seul (8 yglml).
Breas Setected
a l oZ
*3
8r
III - Effets du TPA sur le taux de CaZ* intracellulaire libre descellules SHE prétraitées au chlordane
L'application du TPA à 0,1 Uglml sur des cellules SHE non traitéesauparavant, nous a permis de constater que le TPA n'induit aucunchangement de fluorescence dans les 800 secondes qui suivent letraitement.
Si cette application de TPA à 0,1 pglml réalisée sur des cellulesprétraitées au chlordane à 8 Vg/ml pendant 24 heures, on assiste à uneaugmentation spectaculaire du taux du Caât intracellulaire se traduisantpar un flash dans les cinquantes premières secondes qui suiventI'application.
Une deuxième application au TPA à la même concentration, a permisd'observer un deuxième flash dans le même laps de temps (50 secondes)(Fig 28).
Si l'on substitue le TPA par le chlordane, aucune réponse n'est observée.
Le prétraitement des cellules SHE par le chlordane à 8 p$/ml pendant 24heures semble affecter des structures ou des fonctions cellulaires. Suite-àces modifÏcations, le TPA semble moduler le taux intracellulaire du Ca2+lible d'une façon rapide qui peut traduire une libération des ions deCaZ+ stockés dans le milieu intracellulaire. Ces observations peuventconstituer des données importantes pour expliquer la potentialisationdes effets transformants du TPA par le chlordane observée auparavantsur les mêmes cellules.
Ces essais ont été répétés plusieurs fois lors d'expériences séparées. l,S?résultats confirment I'augmentation des concentrations en Caé-intracytoplasmiques à la suite d'une première exposition au chlordane.L'augmentation des flux d,e Caz+ à l'intérieur de la cellule qui suit l'ajoutde TPA n'a lieu que si les cellules ont été prétraitées au chlordane. Cesrésultats militent en faveur d'une implication des flux calciques dans leseffets de synergie chlordane-TPA observés.
IV - Effets du chlorothalonil sur le taux de Ca2+ intracellulaire libredes cellules SHE
Le traitement des cellules par le chlorothalonil à 0,2 uglml dans lç:smêmes conditions n'entraîne aucune modulation du taux de CaZ+intracellulaire.
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Figure 28 : Augmentation du taux de C&+ libre intracellulaire des cellules SHE prétraitées auchlordane @ yglml) puis traitées par une seconde application deTPA (0,1 pglml).
8 :
PARTIE VI : Mise en évidence d'adduits sur I'ADN des cellules SIIEen présence et en absence de chlordane
La figure 29t _,montremarquage au 32p desappar tenan tàS lo tsde
les autoradiogrammes obtenus après post-hydrolysats d'ADN isolés à partir de cellulestraitement :
a - Cellules témoin (DMSO 0,2 %)b - Cellules SHE traitées au chlordane à 10 pglml pendant
24 heuresc - Cellules SHE traitées au chlordane à 10 pglml pendant
48 heures.
Sur les autoradiogrammes apparaît un certain nombre de tâches ouspots correspondant aux bases hypermodifiées sur I'ADN. on peutvisualiser, sur chacun des autoradiogrammes (a, b et c), lz tachesmajeures et 10 taches mineures. Les spots majeurs et mineursvisualisés sur les 3 essais ont le même site de migration, ce qui permetde dire qu'il n'y a pas de différences qualitatives entre les spotsobtenus sur les 3 autoradiogrammes.
Ces observations indiquent que le chlordane appliqué aux cellulessHE, à la concentration de 10 uglml pendant 24 heures ou 48 heures,n'induit pas d'adduits supplémentaires sur I'ADN.
Sur le plan quantitatif, les comptages de la radioactivité de l'ensemblede.,spots, ont permis de déterminer le nombre d'adduits totaux pour10Y nucléotides (tableau 13).
Cependant, on pourrait concevoir que des différences puissent existerquant au nombre d'adduits pour un même spot présent dans les Béchantillons. Là encore, les résultats présentés dans le tableau 13montrent qu'il n'y a pas de différences significatives entre les essaistémoin et traités .
Ainsi, les valeurs trouvées pour les adduits totaux, autant pour letémoin que pour les cellules traitées, sont tout à fait similaires, lesdifférences minimes observées ne sont absolument pas significatives,compte-tenu de la méthode employée.
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L8,724,4L73,33,32,75,12,21,8
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tTableau 13 : Nombre d'adduits pour 109 nucléotides pour les lZ spotsmajeurs des radiogrammes. a) témoin ; b) traitées 24 heures ; c)traitées 48 heures.
En se basant sur les données qualitatives et quantitatives, on peutdonc conclure que le chlordane, d'une pâft, n,induit pas d'adduitssupplémentaires sur les cellules SHE, et que d'autre pâft, il n'induitpas d'augmentation quantitativement parlant des adduits endogènes.
Il reste à expliquer la présence des adduits endogènes, présence quipeut paraître surprenante de prime abord. Il faut noter que latechnique utilisée, c'est à dire le post-marquage, à l,inverse de latechnique par marquage direct à I'aide d'un xénobiotique radioactif,présente l'avantage de mettre en évidence I'ensemble des adduits surI'ADN.
86
Parmi ces adduits, certains peuvent être induits par des moléculesprésents naturellement dans la cellule. Dans notre cas où des culturescellulaires sont utilisées, la présence des adduits endogènes peut êtreliée à des facteurs provenant du milieu de culture ou à des facteursd'origine maternel.D'autres travaux ont également montré la présence d'adduits dans lestissus animaux et humains non exposés à des xénobiotiques (Gupta,1985 ; Everson et a,1., 1986 ; Wong et aI., 19g6). Randerath et ol. (f gAO)ont démontré qu'il existe chez le rat une corrélation entre l,apparitiondes adduits endogènes et l'âge de I'animal, le vieillissement favorisantcette apparition. Nous avons affaire, dans Ie cas présent, à desembryons, mais il n'est pas exclu que des facteurs intrinsèques à lafemelle en gestation aient pu être transférés aux embryons par la voieplacentaire.
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87
DISCUSSION GENERAI,E
Les résultats obtenus avec le test d'Ames, I'essai d'inhibition de lacoopération métabolique et l'essai de transformation cellulaire, sur lesdeux substances, chlordane et chlorothalonil, d'une part et sur lesextraits d'échantillons environnementaux complexes d'autre part, sontsynthétisés dans le tableau 14 peuvent se résumer comme suit :
- le chlordane, non mutagène sur la base du test d'Ames, inhibe lacommunication intercellulaire et induit la transformationmorphologique des cellules SHE après 3 applications répétées auxconcentrations de 5 et 8 pglml ou lors d'une association avec le TPA.
- le chlorothalonil ne donne de réponse positive que sur les cellulesSHE : il provoque la transformation cellulaire après 3 applicationsrépétées de 0,2 et 0,3 vq/ml ou lorsqu'il est appliqué après le B(a)p ;ces derniers résultats faisant assimiler ce dérivé à un promoteur.La cytotoxicité très élevée du chlorothalonil justifÏe de ses utilisationsen tant que biocide et explique le niveau très faible des concentrationstestées.
- Les deux extraits complexes se sont montrés génotoxiques avec letest d'Ames, après activation métabolique pour l'échantillon T4, avecet sans activation métabolique pour l'échantillon B. Aucun effet sur lacoopération métabolique n'a été enregistré. par contre, ils se sontrévélés actifs sur la transformation morphologique des cellules SHE.
. L'échantillon T4 a induit la transformation après une seuleapplication à la concentration de 0,16 ullml et s,est montré égalementtrès actif lorsqu'il est suivi du TpA, ce qui témoigne d'une forteactivité génotoxique de type initiateur.
. L'échantillon B présente également un profil initiateur, étantdonné le taux de transformation élevé des cellules SHE lorsque sonapplication est suivie de celle du TpA.
Ces résultats appellent plusieurs commentaires.
- L'essai de transformation morphologique des cellules SHE est le seulessai à avoir répondu positivement aux quatre échantillons testés :
- aux deux pesticides, non génotoxiques mais cancérogènes chezI'animal,
- et aux deux extraits qui se sonttest d'Ames.
révélés génotoxiques avec le
Dans le cas de su,bstannes mutagènns, la réponse peut apparaître aprèsune seule application pour peu que la concentration d'exposition descellules soit suffisamment élevée dans la gamme des concentrationsnon cytotoxiques ; la réponse est plus manifeste lorsque I'applicationest suivie de celle d'un promoteur fort comme le TpA.
88
Par exemple, I'extrait B reste sans effet après 1,2 ou 3 applications ;le résultat est nettement positif à la concentration de 162 Uld'équivalent lixiviat par ml, après I'action du TPA.
Ces essais sur les dnur ertrai,ts soul;ignent ln sensi,bilité du sgstèmn SHEtrès supéri,eure d, cell,e du test dl Ames, étant dnnnÉ qrf au wiueau deconnentrations testées sur SHE, au,ctlntp répon^se positi,ue niest obtenuesur Sa,Imnnelln tgphimuri,um. Le percolat T4 et le lixiviat B testésbruts sans étape de concentration des micropolluants ne s'étaient pasrévélés mutagènes ; à la concentration équivalente à 0,6 ml de lixiviatB par boîte, ce qui correspond à 240 vl/ml de suspension bactériennegélosée, le test d'Ames était resté négatif.
Dans le cas des szbsta,npes nan génotori,quns comme le chlordane et lechlorothalonil, la transformation cellulaire est induite essentiellementaprès répétition des applications (3 en général), si l'échantillon esttesté seul. L'utilisation d'un schéma initiation-promotion améliore lasensibilité par la synergie des effets possibles avec un initiateur et unpromoteur.
Les résultats obtenus avec le chlordane nous incitent à la prudenceavant de classer "initiateuru ou "promoteur" une substance sur la seulepositivité obtenue après traitement séquentiel substance-TPA ouB (a)P-substance respectivement.L'absence d'adduits supplémentaires sur I'ADN des cellules SHEtraitées au chlordane par rapport aux contrôles, a confïrmé lesdonnées bibliographiques concluant au caractère non génotoxique dupesticide, évitant ainsi qu'un label d"initiateurn ne soit abusivementdécerné au chlordane. Il nous semble important de retenir de cetteinduction du taux de transformation lors du traitement séquentielchlordane-TPA, que des effeE dii,nterantinn peuuent rêsulter dlunepotenûiaùisa,tian des effets de substa,nces au mécani,s'me dlanti,on di,ffêrentet cornplâmnntoiilv, Eo;ns qu il I agrisse nÉcessui,rement, dl unecotnAi,nnison iwi,tiateu,r-prmntaff .
- Le test d'inhibition de la coopération métabolique selon Trosko et al.,(1979), n'a permis de retenir que le chlordane comme substanceinhibitrice de la communication intercellulaire. Les rêponses négativesobtenues avec les trois autres échantillons montrent que ce critère estmoins rêvélateur d'une potentialité cancérogène in ttitrp que I'essai detransformation cellulaire.
L'inhibition de la communication entre cellules est un êlément dedéstabilisation de I'homéostasie cellulaire suffisant, mais nonindispensable au processus de transition des cellules normales versl'état tumoral.
89
L'essai d'inhibition de la coopération métabolique étant effectué surdes lignées cellulaires v7g, la déficience partielle en enzyrnes demétabolisation de ce système est un ètément à prendre enconsidération avant de conclure à l'absence totale d,effet sur lacommunication intercellulaire des échantillons ayant répondunégativement ; c'est le cas, en particulier, du chlorothalonil et del'échantillon T4 dont la toxicité peut être due aux métabolites, ainsiqu'il ressort des données de la littérature pour le chlorothalonil et desrésultats du test d'Ames pour T4.La réalisation d'essais d'inhibition de coopération métabolique enprésence de fraction Sg aurait été utile pour lever cette incertitude.
- Cette étude démontre que I'absence de génotoxicité n,est pas unegarantie d'innocuité : des potentinlités caræêrogànns imptiquant dpsm'éca'nis'rnes epigénetiqu,es peuuent erister, mêmp si tn reclwrche d,esaltÉratinns strztcturar,es d,u génome dest réaélée négatiue .
La stratégie d'évaluation d'un potentiel cancérog ène in vitro basée surdes essais de mutagénèse ou d'activité de réparations de I,ADN estinsuffÏsante dans la mesure où res cancérogènes agissant par desméeanismes ne relevant pas d'altération du génome ?chapperont auscreening.Le protocole d'évaluation des substances chimiques nouvelles selon lesdirectives actuelles, qui consiste à mettre en oeuvre, d,abord desessais de mutagénicité sur bactéries, comme le test d,Ames, et à nepousser les investigations sur cellules eucaryotes que pour lessubstances détectées positives lors de ce premier screening, estinsuffisante et discutable pour les mêmes raisons.
Les rêsultats de cette étudp souligmnnt Ai.en qun diautres effets tnrrchantIn commurainatinn interceltulaire, Il antiuatinn d,e kir*tn, ou dl autresmécanismcs peuuent cond,uire à In transformntion cellula:ire, a,lors qrrcIa sabstanne est dégtou.ntun diantùvité mutogdrn sur bactêries.
Ce sont au contraire les substances négatives en mutagénicité quimériteraient de faire I'objet d'investigations supplémentaires, pour larecherche de ces potentialités épigénétiques. Dans l'état actuel de lalégislation et de la pratique, ces potentialités cancérogènes parmécanismes 'épigénétiques'
ne sont détectées que lors desexpérimentations animales à long terme. Ces essais sont requis pourI'homologation des produits phytosanitaires, mais non pour lanotification des substances chimiques.De telles substances sont donc commercialisées et rejetées dansl'environnement en toute impunité. Leur dêtectinn est dautant ptttsnmpornnfu quo les rniùieu'o entvùrpnrwmsnta u,r rertf,erment unemultipÙicité d'e misrcpolhnnts dant tinteractinn est inÉtuntable etTnuma fauoriser Le d,êuelnTryement de Trocesstts ca,nnêrqu,u.
90
Peu d'essais ont été développés pour détecter des potentialitéscancérogènes épigénétiques in vitro.
. La détection d'une perturbation de la communicationintercellulaire est significative de telles potentialités mais l'intégritédu mécanisme n'est pas non plus, une garantie d'innocuité comme l'ontmontré ces résultats.
. L'essai de transformation morphologique des cellules SHE estintégrateur de l'ensemble des modifications biochimiques, structuraleset fonctionnelles induites par les cancérogènes et semble être lemodèle d'élection pour la détection in tfitro de cette catégorie desubstances.Ce modèle permet, par ailleurs, de détecter à la fois les cancérogènesgénotoxiques et épigénétiques. La mise en oeuvre de plusieursprotocoles incluant I'application de la substance seule d'une part, ouassociée à un initiateur ou un promoteur d'autre part, permetd'augmenter les performances de ce système. Son intérêt estindiscutable ; il faut cependant reconnaître que cette mise en oeuvreimplique des séries d'essais assez lourds.
Les conditions expérimentales que nous avons utilisées sont cellespréconisées par Chouroulinkov et Lasne (1978). D'autres auteurs ontproposé certaines modifications afin d'augmenter la sensibilité del'essai et d'en simplifier le protocole. Ainsi, Elias et al. (1989) etRivedal et Sanner, (1992) utilisent un milieu de culture à pH 7,0 au lieudu pH 7,35 initial, et considèrent que les perforrnances de l'essai s'entrouvent augmentées.Leboeuf (1987) préconise un pH acide de 6,7 qui permettraitd'atteindre une sensibilité élevée tout en ne traitant les cellules qu'uneseule fois, sans avoir à renouveler le milieu pendant les 7 joursd'exposition. Il faut souligner que si le pH acide du milieu augmente letaux de transformation des eellules SHE exposées à ces cancérogènes,il augmente également leur taux de transformation spontanée, lié enpartie à l'inhibition des communications intercellulaires par I'aciditédu milieu ; cela se traduit par l'aspect des colonies qui sont beaucoupmoins belles qu'au pH physiologique.
Il serait intéressant de comparer les performances de ces différentesméthodes pour optimiser le protocole de I'essai de transformationmorphologique des cellules SHE, avec le souci de gagner à la fois ensensibilitê et en facilité de mise en oeuvre.
- n serait souhaitable de rechercher les potentialités cancérogènesêgalement dans les milieux environnementaux et leurs sources decontamination représentées par les effluents de diverses origines :domestique, industrielle et agricole. Actuellement, aucun essairépondant à cet objectif n'est exigé par la réglementation. Le seul test
91
biologique requis est I'essai de toxicité aiguë sur daphnies évaluant lamortalité après 24 heures ; il est question d'y ajouter dans I'avenir untest d'inhibition de la reproduction de ces microcrustacés.
Quoi qu'il en soit, ce contrôle est insufflrsant et devrait prendre encompte le risque cancérogène. C'est pour souligner la réalité de cerisque au niveau environnemental et inciter à sa prévention que nousavions entrepris préalablement à ce travail, une étude de lagénotoxicité des lixiviats de déchets solides stockés en décharge.
Cette étude a fait I'objet d'une publication qui figure en annexe II. Letest d'Ames utilisé alors avait mis en évidence Ia présence demicropolluants mutagènes dans les lixiviats de certains échantillons eta souligné ainsi, le risque génotoxique pour I'environnement aquatique,des eaux de lessivage ou de percolation de ces déchets.
L'analyse physicochimique visant à identifier les micropolluantsresponsables de la toxicité n'avait pas donné de résultatssatisfaisants. L'analyse des traces, malgré la sensibilité des techniquesanalytiques, est effectivement très difficile:Si le screening analytique ne permet pas d'expliquer un risqueidentifié, a fortiort liana,Igse phgsinochirni,qrrc standnrd qui ne mpsurequ'e dns paramÈtres globaur, sera insuffisante pour êaalusr un ri,squecannérogène. Ceci apparaissait aussi des résultats des échantillons T4et B dont les bilans analytiques ne reflètent pas la toxicité. C'est laraison pour laquelle iI nous pa,ralt ind,ispensable dii,nnlure un minimu,md! essais Aiabgiqu,es dans la stratÉgie du contrôle enri,ronnsm,entq,I.
En matière de cancérogénèse, il est nécessaire d'appréhender et deprévenir , d'une part, le risque génotoxique, d'autre part le risque liéaux cancérogènes épigénétiques. L'étude des percolat de décharge etlixiviat de déchet donne un exemple des essais qui peuvent êtreappliqués dans cet objectif.
. Le test diAmes est Aien, appopri,é pour unn êuo,htntinn dp lngArcbù,ei,té de par Ea simpl;i,ei,tÉ et sa rapid;i,té et il rærrts po,raîtrecammnndé er,, prsrn/i,ère apptwlrc.Les investigations complémentaires ne nous semblent pasindispensables en cas de positivité, I'information étant suffisante pouralerter et inciter à la prévention.En cos de rêponse nêgatiue par contre, la question reste posée de lapertinence et de la sensibilité de ce test à détecter I'ensemble descancérogènes, c'est, à notre sens, dans ce cos qun des i,naestiga,ti,onscomplâmentaires sæai,snt souhnitables.
- cette étude a. également permis d'éclaircir quelques aspects dumécanisme d'action du chlordane. Cet organochloré paraît modifier lesflux de calcium libre intracytoplasmique, comme cela avait été notépour d'autres de ses congénères de type DDT.
92
Cette augmentation des flux calciques pourrait expliquer les effets desynergie avec le TPA ; il a été montré en effet que les effets du TPAétaient potentialisés par un ionophore de calcium A 23L87 avec desrépercussions sur (1) l'activation de la PKC elle même dépendante dutaux de calcium et (2) I'induction de la cascade de I'acidearachidonique (Moser et Smart, 1989).
L'interaction chlordane-TPA se reflète également sur I'activité deI'ODC : L'activité basale de I'ODC augmenté déià par le TPA, estencore accrue lors d'un traitement préalable ou simultané par lechlordane.Il serait intéressant d'élucider les mécanismes de ces effets, voir s'ils
relèvent de mécanismes autres que l'influx calcique et comments'inscrivent dans ce contexte les effets observés sur l'activitéprotéasique cytosolique de la 70 KDa dans la régulation post-transcriptionnelle de I'ODC.
Les mécanismes d'induction de l'activité ODC n'ont été qu'abordés aucours de cette étude pour montrer l'intérêt de ce critère, égalementtrès significatif d'une perturbation de la croissance et de la divisioncellulaire. Une étude plus poussée des cinétiques d'activité de I'ODCen fonction des modalités de traitement par le chlordane seul ouassocié au TPA aurait été nécessaire pour mieux appréhender cettevoie fondamentale.n en est de même des essais sur I'activité protéasique que nousn'avons qu'abordés, grâce au concours de l'équipe de G. NGLIIEN-BAet H. TAPIERO.
93
CONCLUSION
Ce travail a concerné la détection in uitro des cancêrogènes nongênotoriqxæs et l'étude des performances de trois essais à détecter lespotentialités cancérogènes des contaminants de l'environnement :
. le test de mutagénèse sur Sal,mnnelln tEphimuriu,m lvis-,
. I'inhibition de la communication intercellulaire des cellules dela lignée V79,
. et I'essai de la transformation morphologique des cellulesembryonnaires d'hamster syrien SHE.
Deux pesticides chlorés, le chlordane et le chlorothalonil, cancérogèneschez I'animal mais non mutagènes, ont été testés à I'aide de cettebatterie d'essais.Des lixiviats de déchets ultimes et percolats de décharge ont étéégalement étudiés dans les mêmes conditions.
L'ensemble de ces travaux ont montré I'intérêt d'utiliser des modèlescellulaires en vue de la détection de cancérogènes environnementaux, etl'étude de leur profil d'action, qu'il s'agisse de substances pures ou demilieux complexes,.
- Le chlordane non mutagène dans le test d'Ames, inhibe lacoopération métabolique entre les cellules V79 et potentialise latransformation morphologique et I'activité ODC des SHE induites par leTPA.
Les effets de synergie entre le chlordane et le TPA peuvent trouver uneexplication dans I'augmentation des flux intracellulaires de calcium libredes cellules SHE prétraitées au chlordane et soumises à I'actionsupplémentaire de l'ester de phorbol.
- Le chlorothalonil n'induit pas de mutation sur les souchesbactériennes de Salmonella et n'inhibe pas la coopération métaboliquedes cellules V79 ; il se comporte comme un promoteur si I'on en juge parI'augmentation de la transformation des cellules SIIE prétraitées auB(a)P.
- Le caractère génotoxique des concentrés organiques deséchantillons de percolat de décharge et de lixiviats de déchets ultimesest mis en évidence par le test d'Ames et confirmê par la transformationdes cellules SHE observée lors d'un traitement par l'échantillon seul ousuivi par un traitement au TPA.Ces deux extraits se montrent inactifs quant à l'inhibition de lacoopération métabolique des cellules V79.
94
L'essai de transformation morphologique des cellules SHE, utiliséparallèlement au test d'inhibition de la coopération métabolique sur lescellules de la lignée V79 et au test de mutagénèse sur Salmnnellatgplui,muri.un, se révéle le plus sensible à la détection des actions tantgénotoxiques qu'épigénétiques des agents chimiques.
Cet essai apparaît bien représentatif des perturbations biochimiques,fonctionnelles et structurales susceptibles de dérégler les mécanismes decontrôle de la croissance et de la prolifération cellulaire et de fairetransiter une cellule de l'état normal vers l'état transformé.
Llessui de transformation m,orythologiqrrc d,es cellul,es SHE sqnr,ble être l,emodèl'e di él'ectinn pou,r la détecti,on i,n vitro d,es cannûrogènns ; il m,M,tera,itdiêtre intêgrré dans la batteri,e des essa,is in uitro mis en oeuure pour Iaprâfi,sinn des potentiaùi,tés cancêrogènes d,es conta,minnnts d,et enuironnement et des rênoAinfiqlrps, dnns Le but d,e ln prêaentinn durisqun cannêrogène m gênêral.
n resterait à optimiser'encore la méthodologie de cet essai et voircomment il est possible de réduire la variabilité des réponses par unmeilleur contrôle des spécificités physiologiques des cellules, de laqualité du sérum ou par des modifîcations des conditions expérimentalestelles que le pH. Une validation, en cours, au niveau internationalpermettrait de mieux tirer profit des capacités de l'essai detransformation cellulaire des SHE à détecter les cancérogènesenvironnementaux.
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REFERET'ICES BIBLtrOGRAPHIQLJES
AARANSON S.A. and TODARO c.J., 1968.Development of 3T3-like lines from BalB/c mouse embryo cultures transformationsusceptibility to SV40. J. Cell. Physiol 72, l4l-148.
AFNOR X3r-210, 1988.Déchets. Essai de lixiviation. T95J.
AHMED F.E., I'IART RW. and LEWIS N.J., 1977a.Pesticide induced DNA damage and its repair in cultured human cells. Mutation Research42, t6t-174.
AHMED F.E., LEWIS N.J. and HART RW., 1977b.Pesticide induced ouabain resistant mutants in chinese hamster V79 cells. Chem. Biol.Interactions. 19, 369-374.
AMACHER D.E. and ZELLIADT I., 1973.The morphological transformation of Syrian hamster embryo cells by chemical reportednon-mutagenic to Salmonella typhimurium. Carcinogenesis 4, 2gl-295.
AMES 8.N., McCANN J. and YAMASAKI E., 1975.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutat. Res. 31, 342-964.
ASIIBY J. and TENNANT R.W., 1990.Definitive relationships among chemical structure, carcinogenicity and mutagenicity for301 chemicals tested by the U.S. NTP. Mutat. Res. 2bZ, 29-906.
AS}DNDAL C.L, STAITFR J.M. and BOUTWELL R.K., 1983.Protein kinase activity associated with a phorbol ester receptor purified from mousebrain. Cancer Res. 43, 4333-4337.
ASTRUP E. and BOUTWELL R.K., 1982.Ornithine decarboxylase activity in chemically induced mouse skin papillomas.Carcinogenesis 3 (3), 303-308.
BACH B. and PEDERSEN N.8., 1977.Contact dermatitis from a wood preservative containing tetra chloroisophtalonitrile.Contact Dermatitis 3, I42.
BAIITFUL 8., BRo\ryN K., RAMSDEN M., AKHURST R.J., FEE F. and BALMAIN A., 1989.Chemical induction of oncogene mutations and growth factor activity in mouse skincarcinogenesis. Environ. Health Perspect. 81, 23-22.
BAIRD W.M. and BOUTWELL R.K., 1971.Tumor promoting activity of phorbol and four diesters of phorbol in mouse skin. CancerRes.3l. 1074-1079.
BARRETT J.C. and LAMB P.w., 1985.Tests with the Syrian hamster embryo cell transformation assay. In Ashby J., De SeresF.J., Draper M., Ishidate M., Margolin 8., Matters 8., shelby B.D. (Eds) : Evaluation ofshort-term tests for carcinogens. Amsterdam : Elsevier sc publ. 623-62g.
BARRETT J.C., WONG A., MC I.ACHI.AN J.A., 1981.Diethylstilbestrol induces neoplastic transformation of cells in culture withoutmeasurable somatic mutation at low loci. science.2l2, 1402-1404.
I
BARRETT J.C. and TS'O P.O.P., 1978.Evidence for the progressive nature of neoplastic transformation in vitro. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75,3761-3765.
BARRETT J.C., HESTERBERG T.W. and THOMASSEN D.G., 1984.Use of cell transformation systems for carcinogenicity testing and mechanistic studies ofcarcinogenesis. Pharmacol. Rev. 36, 535-705.
BARTSCH H., TERRACINI 8., lv[r{L{VEII I E C., TOMATIS L., WAHRENDORF' J., BURN G.and DODET 8., 1983.Quantitative comparison of carcinogenicit5r, mutagenicity and electrophilicity of 10direct-acting alkylating agents and of the initial 06 : 7-alkylguanine ratio in DNA withcarcinogenic potenty in rodents. Mutat. Res. 110, 181-219.
BARTSCH H. and TOMATIS L., 1983.Comparison between carcinogenicity and mutagenicity based on chemicals evaluated inthe IARC monographs. Environ. Health Perspect. 47, 305-317.
BELMAN S. and ]AOLL W., 1972.The inhibition of croton oil-promoted mouse skin tumorigenesis by steroid hormones.Cancer Res. 32, 450-454.
BERENBLUM I., 1941.Carcinogenesis as a biological problem. North Holland Co, Amsterdam.
BERENBLLIM I. and SHUBIK P.,1947.A new quantitative approach to the study of the stages of chemical carcinogenesis in themouse skin Br. J. Cancer l, 383-389.
BERWALD Y. and SACHS L, 1963."In vitro" cell transformation with chemical carcinogens. Nature (l,ondon) 200, 1182-1184.
BERWAID Y. and SACHS L., 1965."In vitro" cell transformation of normal cells to tumor cells by carcinogenichydrocarbons. J. Nat. Cancer. Inst. 35, 641-661.
BEYER E.C., GOODENOUGH D.A. and PAUL D.L., 1988.The connexins, a family of related gap junctions proteins. In : Hertzberg E.L. andJohnson R.G. (Eds). Gap junctions, Alan R. Liss, Inc. New-York, 165-175.
BIGMANI M., ROSA S., FALCONE G., TATO F., I(ATOH F., YAMASAKI H., 1988.Specific viral oncogens cause differential effects on cell-to-cell communication, relevantto the suppression of the transformed phenotype by normal cells. Mol carcinogen 1,67-/ D .
BISHOP J.M., 1987.The molecular genetics of cancer. Science 235, 305-31l.
BOVERI T.H., 1929.The origin of malignant tumors. Williams and Wilkins, Baltimore MD.
BRADFORD M., 1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding, Analyt. Biochem. 72,248-254.
BROOKES P. and IAWLEY P.D., 1964.Evidence for the binding of polynuclear aromatic hydrocarbons to the nucleic acids ofmouse skin : relation between carcinogenic power of hydrocarbons and their binding todeoxyribonucleic acid. Nature 202, 781-7 84.
BROWN K., BUCHMANN A. and BALMAIN A., 1990.A carcinogen induced mutations in the mouse C-Ha-ras gene provide evidence ofmultiple pathways for tumor progression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 538-542.
CAIRNS J., 1975.Mutation, selection and natural history of cancer. Nature 225, 197-200.
CASTAGNA M., TAKAI Y., KAIBUCHI K., SANO K., KIKKAWA U. and NISHIzuKA Y., 1982.Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters. J. Biol. Chem. 257,7847-7851.
CAVENEE'W.K., DRYJAE T.P., PHILLIPS R.A., BENEDICT W.F., GODBOUT R, GALLIE B.L,MURPHREE A.L., SIRONG L.C. and WHITE R.L., 1983.Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. Nature(Iondon) 305,779-784.
CERUTTI P.A., 1985.Prooxidant states and tumor promotion. Science 227,375-38L.
CHEN Y. and HEIDELBERGER C., 1969.Quantitative studies on the malignant transformation of mouse prostate cells bycarcinogenic hydrocarbons nin vitro". Int. J. Cancer 4, 166-178.
CHIN 8.H., McGLOIN J.E., SPANGLER N.L. and HEILMAN R.D., 1981.Chlorothalonil equivalents in the blood and urine of rats following oral, endotrachealand dermal administration of l4C-Chlorothalonil. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 26.258-26L.
CHOUROULINKOV L and LAZAR P., 1974.Action cancérogène et cocancérogène du lz-O-tétradécanoyl-phorbol-13-acétate (TPA) surla peau de souris. C.R. Acad. Sci., Paris, 278, série D, 3027-3030.
CHOUROULINKOV I. and I-ASNE C., 1978.Two stage (initiation-Promotion) carcinogenesis in vivo and in vitro. Bulletin du cancer65 (3).
COFFINO P. and LICHUAN CHEN E., 1988.Nucleotide sequence of the mouse ornithine decarboxylase gene. Nucleic Acids Research16 (6), 273t-2732.
coNwAY R.A., 1982.Environmental Risk Analysis for chemicals. Van Norstand Reinhold Co : New-York.
CULLEN J.W., 1986.Design of cancer prevention studies. Cancer Detection Prev. 9, 125-138.
DAVIES P.E., 1985a.The toxicolory and metabolism of chlorothalonil in fish. III. Metabolism enzymatics anddetoxification in Salmo spp. and Galaxias spp. Aquat. Toxicol.7,277-299.
DAVIES P.E., 1985b.The toxicology and metabolism of chlorothalonil in fish. II. Glutathione coqiugates andprotein binding. Aquat. Toxicol. 7,265-275.
DAVIES P.E., 1988.Disppearance rates of chlorothalonil (TCIN) in the aquatic environment. Bull. Environ.Contam. Toxicol. 40, 405-409.
DEAI.I N.M,,MORDAN L.J., TSE K., MOOBERY S.Land BOYNTON A.L, 1991.Okadaic acid inhibits PDGF-induced proliferation decreases PDGF receptor number inCgH/10T1/2 mouse fibroblasts. Carcinogenesis. 12, 665-670.
DE BERTOLDI M., GRISELLI M., GIOVANNETTI M. and BARALE P., 1980.Mutagenicity of pestieides evaluated by means of gene-conversion in Saccharomycescerevisiae and in Aspergillus nidulans. Environ. Mutagenesis 2, 359-370.
DE CHATELET L.R., SHIRLEY P.S. and JOHNSON R.B. Jr., 1976.Effect of phorbol myristate acetate on the oxidative metabolism of humanpolymorphonuclear leucocytes. Blood 47, 545-554.
DI PAOLO J.A., 1980.Quantitative in aitro transformation of Syrian hamster embryo cells using frozen storedcells. J. Natl. Cancer Inst. 64, 1485-1489.
DI PAOLO J.A., NEISON R.L. and DONOVAN P.J., 1972.In vitro tranformation of Syrian hamster embryo cells by diverse chemical carcinogens.Nature 235,278-280.
DI PAOLO J.4., DONOVAN P. and NEISON R., 1969.Quantitative studies of in vitro transformation by chemical carcinogens. J. Natl. CancerInst. 42, 867-876.
DOII R. and PETO R., 1981.The causes of cancer : quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the UnitedStates today. J. Natl. Cancer. Inst. 66, 1191-1308.
DOTTO G.P., IVEINBERG R.A. and ARIZA 4., 1988.Malignant transformation of mouse primary keratinocytes by Harvey sareoma.virus andits modulation by surrounding normal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6389-6393.
ELIAS 2., POIROT O., PEZERAT H., SUQUET H., SCHNEIDER O., DANIERE M.C., TERZETTIF., BARUTHIO F., FOURNIER M. and CAVELIER C., 1989.Cytotoxic and neoplastic transforming effects of industrial hexavalent chromiumpigments in Syrian hamster embryo cells. Carcinogenesis I0,2043-2052.
ELIAS 2., 1993.Transformation et cancérogénèse. Essais en cours de validation. Formation Continuemars 1993, Metz-France.
EPSTEIN S.S., 1976.Careinogenicity of heptachlor and chlordane. Sci. Total. Environ. 6, 103-154.
ESWORTLY R.F., 1985.Preliminary quantitative usage analysis of chlordane. Washington D.C., US EnvironmentalProtection Agency, Office of Pesticide Programs.
EVERSON RB., RANDERATH E., SANTELI.A, R.M., CETALO R.C., AVITTS T.A. ANdRANDERATH K., 1986.Detection of smoking related covalent DNA adducts in human placenta. Science 231 : 54-57.
FISCHER S.M., CAMERON G.S., BALDWIN J.K., JASHEWAY D.W., PATRICK K.E. ANdBELURY M.A., 1989.The arachidonic acid cascade and multistage carcinogenesis in mouse skin. SkinCarcinogenesis : Mechanisms and Human Relevance, 249-264.
FITZGERALD D.J. and MURRAY A.W., 1980.Inhibition of intracellular communication by tumor promoting phorbol esters. CancerRes.40, 2935-2937.
FITZGERALD D.J., MESNIL M., OYAMADA M., TSUDA H., ITo N. and YAMASAKI H ., 1989.Changes in gap junctions protein (connexin 32) gene expression during rat livercarcinogenesis. J. Cell. Biochem. 41, 97-102.
FITZGERALD D.J. and YAMASAKI H., 1990.Tumor Promotion : models and assay systems. Teratogenesis, Caracinogenesis andMutagenesis 10, 89-102.
FI.ASCHENTRAGER 8., 1930.Z. Angew, Chem. 43, 1011-1012.
FLOWER R.J. and BLA,CKWELL G.J., 1979.Anti-inflammatory steroids induce biosynthesis of a phospholipase A2 inhibitor whichprevents prostaglandin generation. Nature 278,29 March.
FUJIKI H. and SUGIMURA T., 1987.New classes of tumor promoters : Teleocidin, Aplysiatoxin and Palytoxin. In Klein G. andWEINHOUSE S. CEds). Advances in Cancer Research. Academic Press London, vol. 4g,223-264.
FUJIKI H., SUGANUMA M. and SUGIMURA T., 1989.Significance of new environmental tumor promoters. Enviro. Carcino. Revs. (J. Envir. Sci.HIth.) 7, 1-51.
FUJITA I., IRITA K., TAKESHIGE K. and MINAKAMI S., 1984.Diacylglycerol, l-oboyl-2-acetyl-glycerol, stimulates superoxide-generation from humanneutrophiles. Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, glg-924.
GAINER H.ST.C. and MURRAY A.w.. 1986.The effect of cAMP on tllmour promoter responses mediated by C-Kinase. ExperimentalCell Research 166, 771-179.
GENTILE J.M., GENTILE c.J., BULTMAN J., SECHRIEST R., wAcNER E.D. and pLElr/AM.J., 1992.An evaluation of the genotoxic properties of insecticides following plant and animalactivation. Mutation Research. 101, 19-29.
GLIMOUR S.K., AVDALOVIC N., MADARA T. and O'BRIEN T.c., 1985.Induction of ornithine decarboxylase by 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate in hamsterfibroblasts. The Journal of Biological chemisrry 260 (90), 16439 -16444.
GOLD S., SA\ryYER C.8., MAGAW R., BACKMAN G.M., DE VECIANA M., LEVINSON R.,HooPER N.K., HAVENDER w.R., BERNSTETN L., PETO R., ptKE M.C. and AMES 8.N., 1984.A carcinogenic potency data base of the standardized results of animal bioassavs.Environ. Health Perspect. 58, 9-319.
GOODENOUGH D.A., PAUL D.L. and JESAITIS L., 1988.Topological distribution fo two connexin 32 antigenic sites in intact and split rodenthepatocyte gap junctions. J. Cell. Biol. l0Z, lgl7-1824.
GREEN S., 1991.The search for molecular mechanisms of non-genotoxic carcinogens. Mutation R€search248,371-374.
GRIFFIN D.E. and HILL W.E., 1978.In vitro breakage of plasmid DNA by mutagens and pesticides. Mutation Res 52, 16l-169.
GUPTA R.C., 1985.Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen : DNAadducts. Caneer Res 45, 5656-5662.
GSCHWENDT M., HORN F., KITTSTEIN W. and MARKS F., 1989.Inhibition of the calcium and phospholipid dependant protein kinase activity frommouse brain cytosol by quercetin. Biochem. Biophys. Res. Commun. llz, 441-MT.
HARRTS C.C., 1991.Chemical and physical carcinogenesis : advances and perspectives for the lg90s. CancerRes. (suppl.) 51, 5023-5044.
HAYES W.J., 1982.Pesticide studies in man. Williams and Wilkins, Baltimore, MD, IZZ-299.
HAYES W.J. Jr, DAI-ES W.E. and BURSE V.W., 1965Chlorinated hydrocarbons pesticides in the fat of people in New Orleans. Life Sci. 4,1611-1615 .
HAYSTEAD T.A.J., SIM A.T.R., CARLING RC., TSUKITANI Y., COHEN P. and HARDIE D.c..1989.Effects of the tumor promoter okadaic acid on intracellular protein phosphorylation andmetabolism. Nature 337, 78-81.
HEBY O., 1981.Role of polyamines in the control of cell proliferation and differenciation. Differenciation19, 1-20.
HECKER E., 1968.Cocarcinogenic principles from the seed oil of croton tiglium and from otherEuphorbiaceae. Cancer Res. 28, 2338-2349.
HERTZBERG E.L. and JOHNSON R.c., 1988.Gap junctions. Alan R. Liss. Inc. New-York.
HESTERBERG T.W. and BARRETT J.C., 1984.Dependence of asbestos and mineral dust induced transformation of mammalian cel,ls inculture on flber dimension. Cancer Res. 44, 2170- 2180.
HIGGINSON J. and MUIR C.S., 1977.Determination of the importance of environmental factors in Human cancer : the role ofepidemiology. Bull. Cancer 64, 365-384.
HILL J.. 196I.Cautions against the immoderate use of Snuff. Baldwin R. and Jacobson J. (Eds),l,ondon.
HORIUCHI N. and ANDO S., 1980.Contact dermatitis due to pesticides for agricultural use (Jpn). Jpn. J. Dermatol. 90.Pestic. Abstn. 3, 80-1644.
HUANG M.T., SMART R.C., WONG C.O. and CONNEY A.H., 1991.Inhibitory effects of curcumin on in vitro lipooxygenase and cyclooxygenases activities inmouse epiderms. Cancer Res. 51, 813-819.
HUEPER W.C., 1966.'Occupational and environmental cancers of the respiratory system. In : Recent Results inCancer Res., 3, ll2-114.
HUGHES M.F., CHAMULITRAT W., MASEN R.P. and ELING T.8., 1999.Epoxidation of 7,8-dihydroxy-7,8-dihydrobenzo(a)pyrene via a hydroperoxide dependentmechanism catalyzed by lipooxygenases. carcinogenesis 10, zo75-zogo.
IARC Monographs, 1983.On the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. Volume 30. IARC,Lyon, France.
INFANTE P.F., EPSTEIN S.S. and NEWTON W.A., 1978.Blood dyscrasias and childhood tumors and exposure to chlordane and heptachlor.Scand.J. Work & Health.
INFANTE P.F. and FREEMAN C., 1928.Cancer mortality among workers exposed to chlordane. J. Occup. Med. 29, 908-909.
ISOMAA V.V., PAJIJNEN A.E., BARDIN C.W. ANd JÂNNE O.A., 1983.Ornithine decarboxylase in mouse kidney: purification , characterization and radioimmunological determination of the en2yme protein. J. Biol. Chem. 258,6235-6240.
JÀNNE J., PÔSÔ H. ANd RAINA A., 1978.Polyamines in rapid growth and cancer. Biochemica and Biophysica Acta 423,24I-Zgg.
JIANG H., YAMAMOTO S. and KATO R., 1992.Staurosporine, a potent protein kinase C inhibitor, augments phorbol ester-causeornithine decarboxylase induction in mouse epidermis. Carcinogenesis 13, 35b-3S9.
JOHNSON C.J., 1982.Environmental and Health effects of the nuclear industry and nuclear weapons : acurrent evaluation. Ecologr of Disease l, lg5-lb2.
KAKUNAGA T., 1973.A quantitative system for assay of malignant transformation by chemical carcinogensusing a clone derived from Balb/3T3. Int. J. Cancer lZ,469-429.
IGKLINAGA T. and YAMASAKI H. (Eds), lg8b.Transformation assays of established cell lines : mechanisms and applications. IARCScientific publications no 67, Lyon. International Agency for Research on Cancer.
KAM E. and PITTS J.D., 1988.Effects of the tumor promoter 12-O-tetradecanoyl phorbol-I3-acetate on junctionalcommunication in intact mouse skin : persistence of homologous communication andincrease of epidermal-dermal coupling. carcinogenesis 9, I 3B-g- l gg4.
KASAI H., YAMAIZUMI 2., WAKABAYASHI K., NAGAO M., SUGIMURA T., YOKOYAMA S.,MIYAZAWA T., SPINGARN N.E., WEISBURGER J.H. and NISHIMURA s., 1980.Potent ngveJ mutagens produced by broiling fish under normal conditons. proc. Jpn.Acad. 56F,278-283.
KATO R., NAKADATE T., YAMAMOTO S. and SUGIMURA T., 1989.Inhibition of l2-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate induced tumor promotion andornithine decarboxylase activity by quercetin : possible involvment by lipooxygenaseinhibition. Carcinogenesis. 4, l30l-1305.
KAWAOHI T., YAHAGI T., KADA T., TAztMA y., ISHIDATE M., sAsAKI M. and suGIyAMAT., 1990.
lo^gpe11tiy9_programme on short-term assays for carcinogenicity in Japan. In :MONTESANO, Bartsch H. and Tamatis L (eds). Molecularlnd cèllular àspecæ ofcarcinogen screening tests, IARC scientific publications no 27, Lyon, Bzg-990.
KENNAWAY 8.L., 1924.The formation of a cancer producing substance from isoprene. J. Path. Bact. 27, Zgg.
I
KENSLER T.W. and TRUSH M.A., 1981.Inhibition of phorbol ester-stimulated chemiluminescence in human polymorphonuclearleucocytes by retinoic acid and 5,G-epoxyretinonic acid. Cancer Res. 41,216-222.
KfyOTO I., YAMAMOTO S., AIZU E. and KATO R., tgBZ.staurosporine, a potent protein kinase c inhibitor, fails to inhibit lz-o-tetradecanoylphorbol-l3-acetate caused ornithine decarboxylase induction in isolatedmouse epidermal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. l4B, Z40-746.
KNUDSON A.G., 1971.Mutation and Cancer : statical study of retinoblastoma. Proc Natl. Acad. Sci. USA 68,820-823.
KNUDSON A.c., 1985.Hereditary cancer, oncogens and antioncogens. cancer Res. 45, l4gr-1449.
KOzuMBO w.J., TRUSH M.A. and KENSLER T.W., 1985.Are free radicals involved in tumor promotion ? Chem. Biol. Interaet.54, lg9-207.
KUMAR N.M. and GILUI-A N.8., 1986.Cloning and characterization of human and rat liver C DNAs coding for a gap junctionprotein. J. Cell. Biol. 103, 767-776.
KURATA M., HIROSE K. and UMEDA M., 1982.Inhibition of metabolic cooperation in chinese hamster cells by organochlorine pesticides.Gann. 73,217-22I .
LASI{E C., GENTIL A. and CHOUROULINKOV 1., tg74.Two stage malignant transformation of Syrian hamster cells. Nature 247,490-491.
LAWRENCE T.S., BEERS W.H. and GILULA N.8., t9?8.Hormonal stimulation and cell communication in coculture. Nature. 272,501-506.
LEBOEUF R.A. and KERCKAERT c.A., 1987.Enhanced morphological transformation of early passage Syrian hamster embryo cellscultured in medium with a reduced bicarbonate coneentration and pH. Carcinogenesis8(5), 689-697.
LEE T.C., OSHIMURA M., BARRETT J.C., 1985.Comparison of arsenic induced cell transformation, cytotoxiciez, mutation andchromosome effects in syrian hamster embryo cells in culture. Carcinogenesis. 6, I42l-t426.
LEVIN W., WOOD A.!V., LU A.Y.H., RYAN D., V/EST S., THAKKER D., YAGI H., JERINAD.M. and CONNEY A.H., 1977.Role of purified cytochromeP-448 and epoxide hydrase in the activation anddetoxification of benzo(a)pyrene. In Jerina D.M. (Ed). Drug metabolism conceprs, ACSsymposium series n" 44. American chemical societ5r, washington DC, 99-126.
LEVINE L., FUJIKI H., HILDA 8., GJIKA B. and VANASKIS H.V., 1990.Production of antibodies and development of a radioimmunoassay for palytoxin. In HallS. and Strichartz G. (Eds), Marine Toxins : origin, structure and molecutai ph.rmacoiory.American Chemical Society, Washington DC.
UTCHI U. and GOTTESSMAN M., 1983.Genetic evidence that a phorbol ester tumor promoter stimulated ornithinedecarboxylase activity by a pathway that is independant of cyclic AMP-dependentprotein kinases in CHO cells. J. Cell Physiol. llg, 4gg-4gg
LOEWENS]EIN W.R., 1979.Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochem. Biophys.Acta. 560, l-65.
LOVELESS A., 1969.Possible relevance of 60 atkylation of deoxyguanosine to the mutagenicity andcarcinogenicity of nitrosamines and nitrosamides. Nature 233, 206-207.
LU Y.P., 1988.Application d'une méthode orthogonale à l'étude de la cancérogénèse chimique en deuxphases sur cellules in uitro. Thèse de Doctorat, Paris V.
LUTZ W.K., 1979.In vivo covalent binding of organic chemicals to DNA as a quantitative indicator in theprocess of chemical carcinogenesis. Mutation Research 65, 289-356.
MADHLIKAR 8.V., YONEYAMA M., MATSUMURA F., TROSKO J.E. and TSUSHIMOTO c.,1983.Alteration of calcium transport by tumor promoters, t2-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate and p,p'-dichlorodiphenyltrichloroethane, in the chinese hamster V79 fibroblastcell line. Cancer l-etters 18,25L-259.
MAY W.S., SAHYOTIN N., WOLF M. and CUATRECASAS P., 1985.Role of intracellular calcium mobilization in the regulation of protein kinase C-mediatedmembrane processes. Nature 317, 549-551.
MEHTA P.P., BERTRAM J.S. and LOWENSTEIN W.R., 1986.Growth inhibition of transformed cells correlates with their junctionnal communicationwith normal cells. CeIl.44, 187-196.
MERLETTI F., HESELTINE E., SACACCI R., SIMONATO L., VAINIO H. and WILBOURN J.,1984.Target organs for carcinogenicity of chemicals and industrial exposure in humans : areview of results in the IARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk ofchemicals to humans. Cancer Res. 44, Z2U-2250.
MII(AISEN S.O. and SANNER T., 1993.Intercellular communication in colonies of Syrian hamster embryo cells and thesusceptibility for morphological transformation. Carcinogenesis 14 (2),251-257.
MILKS L.C., MUKAR N.M., HOUGTEN R., UNWIN N. and clBUl-A N.8., 1988.Topologr of the 32 Kd liver gap junction protein determined by site-directed antibodylocalizations. EMBO J. 7. 2967 -2975.
MII I PP E.C. and MIr I ER J.A., 1947.The presence and significance of bound aminozo dyes in the livers of rats fed p-dimethylamino-azobenzene. Cancer Res. 7, 468-480.
MII I FR J.A., 1970.Carcinogenesis by chemicals : and overview-G.H.A. Clowes memorial lecture. Cancer Res.30, 559-576.
MII I FR J.A. and MII I FR E.C., 1977.Ultimate chemical carcinogens as reactive mutagenic electrophiles. In Hiatt H.H., WatsonJ.D. and Winsten J.A. (Eds), origins of human cancer (Book B), Cold spring Harborlaboratory, Cold spring Harbor, 605-627.
MIr tFR E.C., lg7g.Some current perspectives on chemical carcinogenesis in humans and experimentalanimals : Presidential Address. Cancer Res. 38, 1479-1496.
MINISTERE DE UENVIRONNEMEM (MEV), 1990.Rapport de la Direction de la Prévention des Pollutions. Mission de Contrôle desProduits : Evaluation des risques mutagènes et Cancérogènes liés à l'exposition auchlorothalonil. Février 1990, Rapporteur I. Chouroulinkov.
MINISTERE DE L'EI{VIRONNEMENT (MEV), 1991.Informations complémentaires concernant le chlorothalonil et son emploi pour laprotection du bois. XIème réunion de la Commission d'Evaluation de I'Ecotoxicité desSubstances Chimiques, Doc. n" 211/91IC.
MINTA A., I(AO J.P.Y. and TSEIN R.Y., 1989.Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluoresceinchromophores. J. Biol. Chem. 246,8171.
MIYAZAKI T., YAMAGISHI T. and MATSUMOTO M., 1985.Isolation and structure elucidation of some components in technical grade chlordane.Arch. Environ. Contam. Toxicol. 14,475-483.
MONDAL S. and HEIDELBERGER C., 1976.Transformation of C3H/10T1/2 Cl9 mouse fibroblasts by ulfaviolet irradiation andphorbol esters. Nature 26A, 710-7L5.
MORGAN D.M.L., 1987.Polyamines. Essays in Biochemistry 23, 83-115.
MORTELMANS K., HOWORTH S., LAWLOR T., SPECK W., TAINER B. and ZEIGER E., 1986.Salmonella mutagenicity tests : II. Results from the testing of 270 chemicals. Environ.Mutagenesis 8 (Suppl. 7), 1-119.
MOSER G.J. and SMART R.C., 1989.Hepatic tumor-promoting chlorinated hydrocarbons stimulate protein kinase C activit5r.Carcinogenesis l0 (5), 851-856.
MURAKAMI Y., MATSUFUJI S., KAMLII T., HAYASHI S., IGARASHI K., TAMURA T.,TANAIG K. and ICHIHARA A., 1992.Ornithine decarboxylase is degraded by the 265 proteasome without ubiquitination.Nature 30, 597-599.
MURRAY A.W. and FITZGERALD D.J., 1979.Tumor promoters inhibit metabolic cooperation in cocultures of epidermal and 3T3 cells.Biochem. Biophys. Res. Commun.9l (2), 395-401.
National Cancer Institute, 1977.Bioassay of chlordane for possible carcinogenicity, Technical Report series no 8,rù[ashington DC, Department of Health, Education and Welfare, Publication No DHEW(NIrD, 77-808.
NCI, 1978.Bioassay of chlorothalonil for possible carcinogenicity. Tech. Rep. Ser. no 41, DHEW Publ.n' (NIH) 78-8/^l, Washington DC, US Government Printing Office.
NEWMARK H.L., 1987.Plant phenolics as inhibitors of mutational and precarcinogenic events. Can. J. Physiol.65, 461-466.
NGUIEN-BA G., CHOUROLILINKOV I. et TRUHAUT R., 1988.Mécanisme épigénétique de la promotion tumorale. Interrelation entre I'inflammation etI'activité d'ornithine décarboxylase induites in vivo par le cancérogène 12-0-tétradécanoylphorbol-l3-acétate. C.R. Acad. Sci., Paris, 307, série III, 229-234, 19æ.
NGUYEN-BA G. and CHOLJROULINKOV I., 1989.Epidermal cell proliferation and modulation of the protective potency of dexamethasoneagainst phorbol ester-induced ornithine decarboxylase activity. Carcinogenesis 10 (4),793-796.
NGTIYEN-BA G., ROBERT S., I.ASNE C., VENTURA L., CHOUROUIJNKOV I., VAN KREIJLC.F., STEEG H.V. and TRUHAUT R., 1992.Induction spécifique par I'ester de phorbol de la transcription du gène et de I'activitéd'ornithine décarboxylase dans deux lignées de cellules épithéliales témoins ettransformées. Effet modulateur des agents anti-inflammatoires. C.R. Acad. Sci. Paris, L314 (IID, æ5-492.
NISHIzu}(A Y., 1984.The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion.Nature 308, 693-698.
NISHIzuKA Y., 1988.The molecular heterogenicity of protein kinase C and its implications for cellularregulation. Nature 334, 661-665.
NOGUSHI N., 1985.Epidemiological studies of chlordane for termite prevention. II. Metabolism of chlordanein exposed rats. Okayama Igakkai Zasshi 97,327-339 (in Japanese).
NOWELL P.C., 1976.The clonal evolution of tumor cell populations. Science 794, 23-28.
NOWELL P.C., 1986.Mechanisms of tumor progression. Cancer Res. 46, 2203-2207.
O'BRIEN T.G., HIETALA O., O'DONNELL K. and HOLMES M., 1987.Activation of mouse epidermal tumor ornithine decarboxylase by GTP : evidence fordifferent catalytic forms of the enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8927-8931.
OGATA M., IZUSHI F., ETO K., SAKAI R., INOUE B. and NOGUCHI N., 1989.Effect of chlordane on hepatic mitochondrial respiration. Toxicololry Letters 48,67-74.
OKUZUMI J., YAMANE T., KITAO Y., TOKIWA K., YAMAGUSHI T., FUJITA Y., NISHINO H.,IWASHIMA A. and TAKAHASHI T., 1991.Increased mucosal ornithine decarboxylase activity in human gastric cancer. Cancer.Res.51, 1448-1451.
PASTI G., RIVEDAL E., YUSPA S.H., HERALD C.L., PETIT G.R. and BLUMBERG P.M., 1988.Contrasting duration of inhibition of cell-cell communication in primary mouseepidermal cells by phorbol 12,l3-dibutyrate and by bryostatin l. Cancer Res. 48, 47-45L.
PATRIARCA P., ZATTI M., CRAMER R. and ROSSI F., 1970.Stimulation of the respiration of polymorphonuclear leucocytes by phospholipase C. LifeSci. 9, 84l-849.
PAUL D.L, 1986.Molecular cloning of c DNA for rat liver gap junction protein. J. Cell. Biol. 103, 123-134.
PIENTA R.J., 1980.Evaluation and relevance of the syrian hamster embryo cell system. In \{illiams G.M.,Kroes R., Waaiiers H.W., Van de Poll K.W. (Eds). The predictive value of short termscreening tests in carcinogenicity evaluation, Elsevier/North Holland, Biomedical Press.Amsterdam, 149-169.
PIENTA RJ., LEBHERZ W.B. and SCHUMAN R.F., 1981.The use of cryopreserved Syrian hamster embryo cells in a transformation test fordetecting chemical carcinogens. In : Stick H.F., San R.H.C. (Eds). Short term tests forchemical carcinogens, Springer-Verlag, N.y., g2g-887.
PIENTA R.J., POILEY J.A. and LEBHERZW.B., tgTT.Morphological transformation of early passage golden Syrian hamster embryo cellsderived from cryopreserved primary cultures as a reliable in vitro bioassay foridentiffing diverse carcinogens. Int. J. Cancer lg,642-655
PROBST G.s., McMAHON R.E., HILL L.E., THoMpsoN c.2., Epp J.K. and NEAL s.8., tgBI.Chemically-induced unscheduled DNA synthesis in primary rat heparoclrte cultures : acomparison with bacterial mutagenicity using 218 compounds. EnvironmentalMutagenesis 3, l1-32.
RANDERATH E., AVITTS T.A., REEDY M.v., MILLER R.H., EVERSON R.B. and RANDERATHK., 19g6. ooComparative ùaP analysis of cigarette smoke induced DNA damage in human tissues andmouse skin. Cancer Res., 46 : 5869-b8ZZ.
EI$,NDERATH K., REEDY M.V. and GUPTA R.C., 1981."-P-labelling test for DNA damage. proc. Natl. Acad. sci. usA, 79,6126-6129.
REDDY M.V. and RANDERATH K., 1986.Nuclease Pl-mediated enhancement of sensitivity of 3ze-posflabelling test forstructurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis, Z, lS4g-1S51.
RETHER 8., PFoHL-LESzKowrczP., GUILLEMAUT and KEITH c., 1990.BentroJa)pyrene induces nuclear-DNA adducts in plant cell suspension culture. Detectionby ("'P) post-labelling. FEBS Lett, 26g, ITZ-124.
REZNIKOFF c.A., BERTRAM J.s., BRANKOW D.w. and HEIDELBERGER c., tgz3.Quantitative and qualitative studies of chemical transformation of cloned C3H mouseembryo cells sensitive to post confluence inhibition of cell division. Cancer Res. 83, 32Bg-3249.
RIVEDAL E. and SANNER T., 1992.Regulation of gap junctional communication in Syrian hamster embryo cells by retinoicacid and 12-0-tetradecanoylphorbol-l3-acetate. Carcinogenesis lg (Zi, lgg-20g.
RMDAL E. and SANNER T., tg8b.Retinoids have different effects on morphological transformation and anchorageindependent growth of Syrian hamster embryo cells. Carcinogenesis 6 (Z), g55-g5g.
RIVEDAL E. and SANNER T., 1982.Promotional effect of different phorbol esters on morphological transformation onhamster embryo cells. Cancer Lett. lZ, l-8.
ROBERT S., I99I.Rôle de I'ornithine décarboxylase dans le processus de cancérogénèse épigénétique.Induction et modulation de son activité au cours de la transformation ô"ll,rl"ir". Thèsede Doctorat, Université de Metz.
ROCHETTE-EGLY C., 1978.Contribution à l'étude des altérations membranaires induites par un promoteur detumeurs, le l2-0-tétradécanoylphorbol-I3-acétate dans les celiules
"mbryonn"ires de rat
en culture secondaire. Thèse de Doctorat, paris VI.
ROGERS M., BERESTECKY J.M., HOSSAIN M.2., GUO H., KADLE R., NICHOISON BJ. ANdBERTRAM J.S., 1990.Retinoid-enhanced gap junctional communication is achieved by increased levels ofconnexin 43 mRNA and protein. Molecular carcinogenesis 3, ggb-949.
ROSANOFF K.A. and SIEGEL M.R., 1981.Mechanisms of action and fate of the fungicide chlorothalonil in biological systems. 3.Interaction with mammalian DNA, histones and isolated rat liver nuclèi. Pestic. Biochem.Physiol. 6,l2O-I28.
ROSENG LE., RIVEDAL E. and SANNER T., 1992.Effect of cAMP elevating compounds on inhibition of gap juntional communication andinduction of morphological transformation in Syrian hamster embryo cells.Carcinogenesis 13, 1803-1809.
RorELLo R.J., LIEBERMAN Rc., PUROHIO A.F. and GERSHENSON LE., 1991.Coordinated regulation of apoptosis and cell proliferation by transforming growth factorbeta I in cultured uterine epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, SZiZ-gatS.
RUCH R.J., FRANSSON R, FLoDsrRoM s., WARNGARD L. and KI-AUNIG J.E., 1990.Inhibition of hepatocyte gap juntional intercellular communication by endosulfan,chlordane and heptaehlor. Carcinogenesis ll (Z), l0g7-1101.
RUSSEL D.H. and SNYDER S.H., 1969.Amine synthesis in regenerating rat liver : extremely rapide turnover of ornithinedecarboxylase. Mol pharmacol 5, 25g-262.
RUSSEL D.H. and DURIE B.c.M., tgZB.Polyamines as biochemical markers of normal and malignant crowth. Rowen press, New-york.
SAEZ J.C., SPRAY D.C. and HERTZBERG E.L, 1990.Gap junctions : biochemical properties and functional regulation under physiological andtoxicological conditions. In Vitro Toxicology g (1), 69-Z9.
SAEZ J.C., CONNER J.4., SPRAY D.C. and BENNETT M.V.L., 1989.Hepatocyte gap junctions are permeable to a second messenger, inositol 1,4,btriphosphate and to calcium ions. Proc. Natl. Acad. sci. usA g6, z7og-2712.
sAEz J.c., SPRAY D.c., NAIRN 4.c., HERTZBERG E.L., GREENGARD p. and BENNETTM.V.L, 1986.CAMP increases junctionnal conductance and stimulates phosphorylation of the 27-I(Daprincipal gap junction polypepride. proc. Natl. Acad. sci. usA gs,r4zg-z4zr.
SAKO T., TAUBER A.I., JENG 4.Y., YUSPA S.H. and BLUMBERG p.M., I9BB.Contrasting actions of staurosporine a protein kinase C inhibitor, on human neutrophilsand primary mouse epidermal cells. Cancer Res. 49,4646-4650.
SAPIENZA C., 1990.Genome imprinting, cellular mosaicism and carcinogenesis. Mol. Carcinog. g, llg-121.
SASSA T., RICHTER W.W., UDA N., SUGANUMA M., SUGURI H., YOSHIZAWA S., HIROTAM. and FUJIKI H., 1989.Apparent tractivationn of protein kinase by okadaic acid ctass tumor promoters. Biochem.Biophys. Res. Commun. 159, ggg-944.
SCAL-ABRINO G. and FERIDI M.E., 1981.Polyamines in mammalian tumors. Advances in Cancer Research Ab, 15l-26g.
SCHEFFNER M., WERNESS 8.A., HLIIBREGTSE J.M., LEVINE A.J. and HOWLEY P.M., 1990.The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes thedegradation of p53. Celt. 63, llZg-llg6.
scHwARTz J.4., VIAJE 4., SLAGA T.J., yuspA s.H., HENNINGS H. and LICHTI u., 1927.Fluocinolone acetonid : a potent inhibitor of mouse skin tumor promotion andepidermal DNA synthesis. chem. Biol. Interactions. lz, 331-342.
SEELY J.E., PÔSÔ H. and PEGG A.E., 1982.Effcct of androgens on turnover of ornithine decarboxylase in mouse kidney : studieslsing labeling of the enzyme by reaction with (l4C) -difluoromethylornithine. J. Biol.Chem. 257,7549-7553.
SHUKER D.E., FRIESEN M.D., GARREN L and PREVOST V., 1991.A rapid gas chromatography-masse spectrometry method for the determination ofurinary-3-methyladenine : application in human subjects. In O'Neill I.K., Chen J. andBartsch H. @ds), Relevance to human cancer of N-Nitrosocompounds, Tobacco Smokeand Mycotoxins, IARC Sci. Publ. l0S, IARC, Lyon, lO2-106.
SIMMON V.F., KAUHANEN K. and TARDIFF R.c., 1922.Mutagenic activit5l of chemicals identified in drinking water. Dev. Toxicol. Environ. Sci. 2,249-258.
SKALKOWSKI M.B. and STALLARD D.E., 1926.Effect of pH on the hydrolysis of chlorothalonil. J. Agrica. Food Chem. 25, 2Og-210.
SI-AGA T.J., FISHER S.M., VIAJE A., BERRY D.L., BRACKEN W.M., LECLERC S. ANdMIrr.FR D.R., 1978.Inhibition of tumor promotion by anti-inflammatory agent : an approach to thebiochemical mechanism of promotion. In Slaga T.J., Sivâk A. and Eiounrell R.K. (Eds)Carcinogenesis : Mechanisms of tumor promotion and carcinogenesis. Raven press, New-York, Vol. 2, 173-195.
SLAGA T.J., 1980.Anti-inflammatory steroïds : potent inhibitors of tumor promotion. In Slaga, T.J. (Ed)carcinogenesis : A comprehensive survey. Raven press, New-york, vol. s, l-ll-126.
SOBTI R.C., KRISHAN A. and DAVIES J., 1989.Cytokinetic and cytogenetic effect of agricultural chemicals on human lymphoid cells invitro. I[ : organochlorine Pesticides. Arch. Toxicol. 52, zzl-zgr
SOL-A,NKI V., RANA R.S. and SIAGA T.J., 1981.Diminution of mouse epidermal superoxide dismutase and catalase by tumor promoters.Carcinogenesis 2, I l4l- I 146.
SPENCER E.Y., 1973.Guide to the chemicals used jn crop protection . Research Branch, Agriculture Canada,Publ. 1093, 6th ed, London, ont. university of western ontario, p. 121.
SPINDELDREIER A. and DEICHMAN 8., 1980.Contact dermatitis against a wood preservative with a new fungicidal agent (Ger).Dermatosen 28,88-90.
STALLARD D.E. and WOLF 4.L., 196?.The fate of 2,4,5,6-tetrachloroisophtalonitrile @aconil 2787R) in soil. Diamond ShamrockChemical Co. Report
SUGANUMA M., FUJIKI H., SUGURI H., YOSHIZAWA S., HIROTA M., NAKAYASU M., OJIKAM., WAKAMATSU K., YAMADA K. and SUGIMURA T., 1988.Okadaic acid : an additional non phorbol-12-tetradecanoate-lg-acetate-type tumorpromoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. gS, 176g-lZZl.
SUGIE S., MORI H. and TAIiU{.ASHI M., 1982.Effect of in vivo exposure to the liver tumor promoters phenobarbital or DDT on the gapjunctions of rat hepatocytes : a quantitative freese-fracture analysis. Carcinogenesis g,45-51.
SUGIMTIRA T., KAWACHI T., NAGAO M., YAYAGI T., SEINO Y., OKAMOTO T., SHUDO K.,KOSUGE T., WAKABAYASHI K., LITAKA y. and ITAI A., 1927.Mutagenic principle(s) in tryptophan and phenylalanine pyrolysis pnoducts. proc. Jpn.Acad. 53, 58-61.
SUKUMAR S., 1990.An experimental analysis of cancer : role of ras oncogens in multistep carcinogenesis.Cancer Cells. (Cold Spring Harbor) Z, lgg-204.
SUYIMOTO H., BAER A.R. and WARGOVICH J., 1991.Heterogenicity of ornithine decarboxylase during mouse colon carcinogenesis and inhuman colon tumors. Cancer Res. Sl, 2069-20Z2.
SUZAKI E., INONE 8., OKIMASU E., OGATA M. and UTSUMI K., 19g8.Stimulative effect of chlordane on the various functions of the guinea pig leucocyres.Toxicol. Appl. Pharmacot. 93, lg7-14S.
TABOR C. and TABOR H., tg84.Polyamines. Ann. Rev. Biochem. bS, Z4g-TgO.
TAKAMIYA K., 1990.Interruption of chronic chlordane exposure and plasma residue levels in occupationalworkers. Bull. Envir. Contam. Toxicol. 44, gOS-909.
TAKEDA 4., HASHIMOTO E., YAMAMURA H. and SHIMAZU T., 19g2.Phosphorylation of liver gap junction protein by protein kinase C. Federation ofEuropean Biochemical Socieries 210 (Z), 169-172.
TACHIBANA K., SCHEWER P.J., TSUKITANI Y., KIKUCHI H., VAN ENGEN D., CI.ARDY J.,GOPICHAND Y. and SHMITZ F.J., 1981.Okadaic acid acytotoxic polyether from two marine sponges of the genus halichondria. J.Am. Chem. Soc. 130, 2469-247t.
TAKIGAWA M., VERMA 4.K., SIMSIMAN R.c. and BourwELL R.K., 1982.Polyamine biosynthesis and skin tumor promotion : Inhibition of l2-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate-promoted mouse skin tumor formation by theirreversible inhibitor of ornithine decarboxylase, -difluoromethylornithiné. Biochemicaland Biophysical Research Communication 105, 969-926.
TAMAOKI T., NoMoro H., TAKAHASHI I., KATO y., MoRIMoro M. and TOMITA F., 19g6.Staurosporine a potent inhibitor of phospholipid/Ca2+-dependent protein kinase.Biochem. Biophys. Res. Commun. t3b, SgT-40t.
TEL-ANG S., TONG C. and WILLIAMS G.M., l982a.Induction of mutagenesis by carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons but not byorganochlorine pesticides in the ARUHGPRT mutagenesis assay. Naylor Dana Inst. forDisease Prevention, American Hlth. Fdn., valhalla,
-New-york r-osgs.
TELq,NG S., TONG G. and WILUAMS G.M., lgg2b.Epigenetic membrane effects of a possible tumor promoting type on cultured liver cells!v tne non-genotoxic organochlorine pesticides chlordane and heptachlor. Carcinogenesis3, l l75-1178.
TERZAGHI-HOWE M., 1987.Inhibition of carcinogen-altered rat tracheal epithelial cell proliferation by normalepithelial cells in vivo. Carcinogenesis g (l), tâS_tSO.
THASTRUP o., CULLEN P.J., DROBAK 8.K., HANLEY M.R and DAwsoN A.p., 1990.Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular CaZ+ stores by specificinhibition of the endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. proc. Natl. Acadl Sci. usa gz,2466-2470.
THOMASSEN D.c., GILMER T.M., ANNAB LA. and BARRETT J.c., 1985.Evidence for multiple steps in neoplastic transformation of normal and preneoplasticsyrian hamster embryo cells following transfection with harvey murine sarcoma virusoncogene (V-Ha-ras). Cancer Res. 4b, 226-Tg2.
TONG C., FAZIO M. and WILLIAMS G.M., l9BZ.Rat hepatocytes-m€diated mutagenesis of human cells by carcinogenic polycyclicaromatic hydrocarbons but not organochlorine pesricidel. proc. Sic. eù. biôr. Med. 162,572-575.
TROLL W. and WIESNER R., l9BS.The role of oxygen- t?9iq"tt as a possible mechanism of rumor promotion. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol. 25, 509-528.
TROSKO J.E., 1979.Elimination of metabolic cooperation in chinese hamster cells by a tumor promoter.Science 206, 1089-l0gl.
TROSKO J.E., JONE C. and CHANG C.C., 1984.The use of in vitro assays to study and to detect tumour prornoters. World HealthOrganization IARC. Models, Mechanisms and Etiology of rumors promotion, IARC ScPubl. N'56, Lyon.
TRosKo J.E., Yorrl L.p., WARREN s.T., TSUSHIMOTO G. and CHANG c.c., 1982.Inhibition of cell-cell communication by tumor promoters. Carcinogenesis'7, S6b-bgb.
TsusHlMoro c., cHANc c.c., TRosKo J.E. and MATSUMURA F., t98g.Cytotoxic, Mutagenic and cell-cell communication inhibitory properties of DDT, Iindaneand chlordane on Chinese hamster cells in vitro. Arch. Envirôn.
-Contam. Toxicol. 12,72t-730.
US Tariff commission, 1971.!v1t19ti9 organic chemicals. us Producrion and sales - l969 (Tc publ. 412) washingtonDC, US Government printing Office, 192.
US Environmental Protection Agency, l9g7.Chlordane, heptachlor, aldrin ana aietarin (Technical Report Document). WashingtonD.C., Office of Pesticides and Toxic Substances.
VAINIO H., HEMMINKI K. and WILBOURN J., 1985.Data on the carcinogenicity of chemicals in the IARC monograph programme.Carcinogenesis 6, lGSg-1665.
vAssEUR M., 1989.Les produits des proto-oncogènes. Dans "I-es Virus Oncogènes,r, Hermann (Eds), 50g-54g.
VENITT S. and PARRY J.M., 1984.Background to mutagenicity testing. In venitt s. and Parry J.M. (Eds), Mutagenicitytesting a practical approach IRL press oxford \ilashington DC.
VERI\,IA A.K. and BOUTWELL R.K., l9ZZ.Vitamin A acid (Retinoic acid), a potent inhibitor of l2-O-tetra decanoyt-phorbol-lB-acetate induced ornithine decarboxylase activit5r in mouse epidermis. Cancer Res. 32,2196-220r.
vIGFUssoN N.v., VYSE E.R., PERNS]EINER c.A. and DAwsoN R.J., tggg.In vivo induction of sister-chromatid exchange in Umbra limi by the insecticides endrin,chlordane, diazinon and guthion. Mutation Research llg, 6l-69.
WARIISHI M., SUZUKI and NISHIYAMA K., 1996.Chlordane residues in normal human blood. Bull. Environ. Conramin. Toxicol. 96, 6gb-643.
WEINBERG R.A., 1989.Oncogens, antioncogens and the molecular basis of multistep carcinogenesis. Cancer Res.49,37L3-3721.
WEINSTEIN I.8., 1980.Evoluating substances for promotion, cofactor effects and synergl in the carcinogenicprocess. Journal of Environmental pathologr and Toxicologl 3, bg_tOt.
WEINSTEIN I.8., 1988.The origine of human caneer : Molecular mechanisms of carcinogenesis and theirimplications for cancer prevention and treatment. Cancer Reseaich 48, 4l}5-414g.
WEITZMAN S.4., WEITBER 4.8., CT.ARK E.p. and STOSSEL T.p., tgBS.Phagocytes as carcinogens : Malignant transformation produced by human neutrophiles.Science 227, l23l-t233.
WESTON A. and BOWMAN E.D., 1991.Fluorescence detection of benzo(a)pyrene-DNA adducts in human bang. Carcinogenesist2, t445-t449.
wHo, 1988.Chlordane Health and Safety Guide. Health and Safety Guide no 14, Geneva.
WILD C.P., 1990.Antibodies to DNA alkylation adducts as analytical tool in chemical carcinogenesis.Mutat. Res. 233, 219-239.
WIï I EY J.C., MOSER C.E. Jr., LECHNER J.F. and HARRIS C.C., 19g4.Differential effects of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-aeetate on cultured normal andneoplastic human bronchial epithelial cells. cancer Res. 44,5124-5126.
WILLIAMS G.M., 1980.Classification of genoto_xic and epigenetic hepatocarcinogens using liver culture assays.Annals N.Y. Acad. Sci. 349, Z7ï-ZBZ.
WILLIAMS G.M., 1981.Liver carcinogenesis : the role for some chemicals of an epigenetic mechanism of liver-tumour promotion involving modification of the cell membiane. Fd Cosmet. Toxicol. 19,577-583.
WILLIAMS G.M. and NUMOTO S., 1984.Promotion of mouse liver neoplasms by the organochlorine pesticides chlordane andheptachlor in comparison to dichlorodiphenyltrichloroethane. Carcinogenesis 5, l6g9-1696.
woLF M', LEVINE H., MAy s., cuATREcAsAs p. and sAHyouN N., 198s.A model for intracellular translocation of protein kinase C involving synergism betweenCa2+ and phorbol esters. Nature gl7,546-i49.
\ryONG D., MITCHELL C.E., WOLF'R.K., MAUDERLY J.L and JEFFREY 4., lgBG.Identification of DNA damage as a resullt of exposure of rats to diesel engine exhaust.Carcinogenesis 7 : 1595-1597.
\ryORLD Health Organisation, 1984.Chlordane. Environmental Health Criteria 34, Geneva.
YAMAGIWA K. and ICHIKAWA K., 1918.Experimental study of the pathogenesis of carcinoma. J. Cancer Res. 3, l-21.
YAMAMOTO S., KIYOTO I., /,J,ZV E., NAKADATE T., HOSODA Y. and KATO R, 1989.Differential inhibition by staurosporine, a potent protein kinase C inhibitor of 12-tetradecanoylphorbol-I3-acetate caused skin tumor promotion, epidermal ornithinedecarboxylase induction hyperplasia and inflammation. Carcinogenesis 10, 1315-1322.
YAMASAKI H., 1990.Gap junctional intercellular communication and carcinogenesis. Carcinogenesis 1l (7),1051-1058.
YAMASAKI H., ENOMOTO T., SHIBA Y., KANNO Y. and KAKLJNAGA T., 1985.Intercellular communication capacity as a possible determinant of transformationsensitivity of BALB/c 3T3 clonal cells. Cancer research 45,637-64I.
YAMASAKI H., HOII STEIN M., MESNIL M., MARTEL N. and AGUELON A.M., l9BZ.Selective lack of intercellular communication betu'een transformed and nontransformedcells as a common property of chemical and oncogene transformation of BALB/c 3T3cells. Cancer research 47, 5658-5664.
YOSHIKAWA H. and KAWAI K., 1966.Toxicity of phtalodinitrile and tetrachlorophtalodinitrile.I. Acute toxicity in mice. Ind.Heal th 4, l1-15.
YOTTI L.P., CHANG C.C. and TROSKO J.E., 1979.Elimination of metabolic cooperation in chinese hamster cells by a tumor promoter.Science 206, 1089-1091.
YOUNG S., PARKER P.J. and ULLRICH A.. 1985.Down regulation of protein kinase C is due to an increased rate of degradation. Biochem.J .224 ,775 -779 .
YUSPA S.H. and POIRIER M.C.. 1988.Chemical carcinogenesis : from animal models to molecular models in one decade. Adv.Cancer Res. 50, 25-70.
YUSPA S.H. and HARRIS C.C., 1982.Molecular and cellular basis of chemical carcinogenesis. In Schottenfeld and FraumeniJ.F. (Eds), Cancer Epidemiolory and Prevention, pp 23-43, Philadelphia W.B. SaundersCo.
ZHANG J.L. and NICHOISON 8.J., 1989.Sequence and tissue distribution of a second protein of hepatic gap junctiofls, C x 26, asdeduced from its c DNA. J. Cell Biol. 109, gggl-9401.
ZIMMERMAN M.R., 1977.An experimental study of mummification pertinent to the antiquity of cancer. Cancer 40,1358-1362.
ANNEXEI
Milieux et tampons pour la culture cellulaire.
1 - Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM HI6) pH 7,4
ComposantsNaClKCICaClZ (anhyd)
MgSo4 7H20NaH2P04H20GlucoseFe(NO8)B 9H20L-arginine HCLL-valineGlycineL-serineL-cystine zHClL-tyrosinecholine ClNicotinamidineD-Ca-PantothenateL-Histidine HCI H20L-isoleucineL-leucineLJysine HCIL-méthioninePhénylalanineL-thréonineL-tryptophanePyrydoxal HCIThiamine HCIRiboflavineAcide FoliqueI-inositolL-glutamineRouge de phénolNaHCOSPyruvate de Na
Réfêrence Gibco 074-1600.
mgn6400,0400,0200,0200,0r25,0
1000,00,1
84,094,030,042,0
63,0104,04,04,04,042,0
105,0105,0146,030,066,095,016,04,04,00,44,07,2
584,015,0
3700,0110,00
2 - Milieu de EaEle modifiê par Dulbecco pH 6.7Amino-acidesL-arginine HCLL-cystineL-glutamineGlycocolleL-Histidine H20L-isoleueineL-leucineL-lysine HCIL-méthionineL-phénylalanineL-sérineL-thréonineL-tryptophaneL-tyrosineL-valinePymvate-Na
mgn8448
5843042105105L46
30664295167294
110
mg/l4,04,07r2
4,04,04,00,44,0
mg/l400200
6400750L240,1
2001000
P
D
Eurobio.
VitaminesAcide Foliquecholine Chlomrel-InositolNicotinamidineD-Ca-PantothénatePyrydoxal HCIRiboflavineThiamine
Sels et autres composantsKCrCaCl2NaClNaHCOgNaH2P04H20Fe(No$3 9H20MgSO4 7HZ0GlucoseRouge de phênol
Référence : ce milieu a êté rêalisé sur demande auprès de la maison
3 - Solution de PBS sans calcium ni magnêsium.ComposantsNaClKCINaH2P04H20KH2PO4
4 - Solution de trvnsine 0.25 % ph 7.00.ComposantsNaClKCt
g/5 litres eau bidistillée.40,00
4001241,00
g/5 litres eau bidistillée.40,00
4001241,00
12,50
NaH2P04H20KH2PO4Trypsine
Milieux pour la préparation de I'AI)N
- Eto>ryéthanol (Riedel de H)
- Tampon SET
100 mM NaCl 585 mg)20 mM EDTA584 mg) 100 ml50 mM Tris 605 mg)
dissoudre et ajuster à pH = 8
- SET/SDS
Tampon SET + O,5 % SDS -+réajuster pH
- Phénol équilibré avec 0,1 M Tris-HCl pH8- saturer le phénol avec de I'eau après l'avoir fondu- 500 ml phénol saturé + 500 ml Tris HCI M pH8
agiter - laisser décanter - soutirer le phénol- reprendre phénol avec 500 ml Tris-HCl M
faire de même- reprendre phénol avec 500 ml Tris-HCl 0,1 M pH8
laisser décanter --+prendre le pH du Tris qui doitêtre de 7,6
- si pH pas bon + remettre 500 ml Tris-HCl M pH8- congeler le phénol en laissant du Tris-HCl sur le phénol
- Chloroforrne + isomylique alcool24 parts chloroforme + 1 part alc. isomylique
- Phénol-chloro-alcool isomyliqueI part phénol équilibré + I part mil. chloro. isomylique
- Protéinase K Sigma P0390préparer extemporanément : 1 mg/ml dans SET/SDS
- RNases A Sigma R 4875T1 Sigma R 8251
- RNAse I préparer extemporanément : 0,1 mg/ml dans SET- RNAse Tl vortexer RNAse T, suspension dans son flacon
d'origine et additio. Tl à la solution RNAse Z pouravoir 1000 unités/ml
ANNEXEII
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Tab leau 8a : E f fe ts de L 'EXTRAIT oRGAi l IQUE Du L IXIVIAT B sur la t rans format iondes ce l ' l u ' l es sHE après uNE, DEUx ET TROIS AppL IcATIoNS.
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Tab ]eau 8a b i s : E f f e t de L 'EXTRAIT 0RGANIQUE DU L IX IV IAT B , app ' l i qué EN ASSoCIAT IONAvEc LE TPA ET LE B (a )p , su r ' l a t r ans fo rma t ton des sHE
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su r l a t rans fo rna t l onAPP LI CATI O}IS.
DU PERCOLAT T4DEUX ET TROIS
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Tab leau 7a b i s
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: Ef fEtS dE . I 'EXTRAIT
ORGA}, I iOUE DUASSOCIATION AVEC LE TpA ET LE B(a )p
PERCOLAT T4 app l l qué ensu r ' l a t r ans fo rma t i on des SHE.
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Scan 2676
Scan 2713
C 1.;.H22 Cyclopropane octyl
Cr.Hæ Cyclotetradecane
CtrHæ Benzene 1,1' (1,4 dimethyl I butene 1,4 diyl) bis
CrzHr6N2O6 Benzene 1 (1,1 dimethyl ethyl) 2 methoxy4 methyl3,5 dinitro
C2rHæN2O Methanone (bis 4 (diethylamino) phenyl)
C20II26O4 2H,8H Benzo 1,2 B 5,4 B" Dipyran10 propanol, 5 methoxy 2,2,8,8, Tetramethyl
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Fig. 3. CPGÂvtS chromatogram of the F organic fraction.
TABLE ryIdentified compounds in organic extract of K leachate by GC/IVIS
Compound FormulaOrder of
concentration
Phosphorodithioic acid, dipropyl ester5 Cbloro 2(3ID benzorazolonePhoephoroditbioic acid S,,S'-methylene-O,O,O',O'-tetraethylesterPhosphorodithioic acid S [(&chloro-2-oxo'3(2H)-benzoxazolyl)methyU O,O'dietbyl esterDioctyl phtalatePhosphorothioic acid 92 (l<7ano-1-methylethyl)amino-2oxoPhoophomtàioic acid S (chloronethyl)O,O,diethylester2(3II) benzorazolone 5 chloro6 Phenyl 2 pyridoneSouôe 8.S8
c6IIËO2PrS2c?II{Cl,NO2caII22O.P2S.cuH$clrNro{PrszczH$o.CloIItel.I2O.PlSl
c/I{clrNo2
>10 mg/L>10 mg/L=10 mg/La10 mg/La10 mg/LTtacesTracesIÏacesTlacesTracee
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Résumê
TRANSFORMATION MORPHOLOGIQUE DES CELLULES SIIE ET COMMUNICATIONINTERCELLULAIRE DES V79 APPLIQUEES A LA DETECTION DE CAT{CEROGENESNON GENOTOXTQUES.Ce lravail a corrcerné l'étude des performances de trois essais invitro à détecter les potentialitéscancérogènes gérntoxiques ou épigénetiques des contarninants dc l'envirowrcment.Cette détection est basée sur les propriêtés de ces substances d'activer la prolifération cellulaire,de perturber le contrôle de la croissance et dc la différenciation des cellules et de potentialiserl.'action des agents génotoxiques tels que le B(a)P ou I'action des agenîs rwn génotoxiques ditspromoteurs tels que le TPA.Izs essafus mis en oeuvre éndicnt :
- I'indrction de muntiaru géniEæs sur des souches de Snlmonella typhimuriwn his-,- I'it hibition de Ia corrununication intercellulaire entre dcs cellules dc lignee V79sensibles ou résistantcs à la 6+hioguanfuæ,
- la transformation morplnlogique dcs cellules embryonrwires d'Harnster Syrien.
Deux pesticides chlorés, le chlordanc et le chlorotlnlonil, canérogènes chcz l'animal mais nonmutagèrcs, ont été testés à l'aide de cettc batterie dc tests.Des lixiviats de déchcts ultimes et dcs percolnts de décharge ont été également étudiés dans lesmêmes conditions.Izs résulnts obtcnw ttnnlrent que :- le chlordane twrn mutagènc dans le test d'Ames inhibe In coopération métabolique entre lescellules V79, il potentialise la transformation nnrplnlogique et I'anivité ODC dcs cellulee SHEinduitcs par lc TPA.I*s eflets de synergie entre le chlordane et le TPA peuvent trouver une explication dansI'augmentation des fhrt intracellulaires dc calcium libre dcs cellulcs SHE prétraitées au chlordatæ,et sournises à l'action consécutive duTPA.
.- Le chlorotlulonil n'induit pas de mutation sur les sowches bactériennes de Salrnonella etn'inhibe pas la coortrafion métabolirye dcs cellules V79 ; il se comporte comrne un prornoteur sil'on en juge par l'aagmentation de la transformaion dcs cellules SHE prétraitées au B(a)P,
- Le caractère génoloxique des concentrés organiques des percolats dc declurge et de hrtviats dc,déchcts ultirncs est mis en évidence par le test d'Anus, et confinné par la transformation descellules SHE observée lars d'un traitcment par l'échantillon seul, ou suivi par un traitenicnt auTPA.Ces dew échantillons se tnontrent iructiJs qtnnt à l'inhibition de Ia coopérarion nætabolique descellules V79.L'érude des perfortnances de ces îois tests milite enfaveur de l'essai de traruformation cellulairequi s'est avéré nettement plus sensible à la détection des altérations tant génotoxiquesqu'épigénétiques.
Mots clés : -Tlansfomutionmorphologi4uc - Conanunication intercellulaire -- Cancérogénèse épigéttétique - Mutagénicité - Chlordane - Chlorothalonil -- P olluants e nvirowementa ut.
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