l'hybridation fluorescente (fish) fluorescent in situ hybridization
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L'hybridation fluorescente (FISH)
fluorescent in situ hybridization
Définition
• repérer la présence d'anomalies chromosomiques par un système couplé anticorps-fluorophore
• Les sondes• L'hybridation• La révélation• L'observation :
Les sondes
un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice
de départ. polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de
monobrin (brins composés de six nucléotides aléatoires)
N : brin complémentaire synthétise entre l'hexamère 1 et l'hexamère 2
M: brin matrice
En rose : les nucléotides marqués
trois types principaux de sondes• séquences uniques: identification d’une séquence spécifique
• séquences multiples: spécifiques à un chromosome entier.
• ADN -satellite: identification de séquences au niveau du
centromère du chromosome.
Les sondes marquées : la biotine révélée par l'avidine
la digoxygénine révélée par un anticorps anti-digoxygénine,
les deux couplés à un fluorochrome
Le principeL'ADN cible parmi l'ADN cellulaire
Dénaturation de l'ADN cellulaire par chauffage
Une sonde d'ADN complémentaire de l'ADN cible et munie d'une molécule de reconnaissance (R).
Hybridation de la sonde et de la séquence cible.
Révélation par reconnaissance de la molécule R par un anticorps anti R muni d'un fluorophore F.L'observation au microscope à fluorescence permet de visualiser la présence de la séquence cible.
La révélationsystème biotine-avidine: reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites
moléculaires fluorescent,
M : brin d' ADN matrice dénaturé , H : séquence sonde hybridée.
biotine liée de streptavidine possédant un site fluorescent.elles-mêmes reconnues par des anticorps anti-avidine "équipés" d'un site biotine et d'un site fluorescent (ou fluorophore).
L'observation microscope à fluorescence, la lumière émise par les sites fluorescent : sites hybridés.
INDICATIONSDiagnostic de la trisomie
21
Une sonde pour identifier le chromosome 13 (vert),
une sonde pour identifier le chromosome 21 (rouge)
Individu A Individu B
TECHNIQUE RAPIDE DE DIAGNOSTIC PRENATAL
•L’amniocentèse :dépister les anomalies chromosomiques
•L’analyse FISH : pas de culture cellulaire. Elle s’applique
directement aux cellules contenues dans le liquide
amniotique.
•fréquence anomalies chromosomiques: Les trisomies des
chromosomes 21,13, 18, X et Y représentent 70% des
anomalies.
•Ce test dépiste la trisomie 21, la trisomie 13 et la
trisomie 18 ainsi que les anomalies de nombre des
chromosomes sexuels (Turner, triple X, Klinefelter, Double
Y).
DIAGNOSTIC PRENATAL
• L’analyse fiabilité: 99,9%• Le taux de réussite technique: 97%
anomalies numériques des chromosomes 21, 18, 13, X, Y.
• 3 causes principales des échecs : • le nombre de noyaux est trop faible; • les noyaux sont d’origine maternelle • un problème technique lors de la
manipulation.
Diagnostic d'une translocation équilibrée.
un chromosome ou un fragment
de chromosome se soude à un
autre chromosome.
translocation
équilibrée :phénotype de
l'individu est normal : il n'y a
alors ni perte , ni gain de
matériel génétique
ex: translocation équilibrée
entre les chromosomes 11 et 12
Une sonde du chromosome 11
(rose); une sonde
caractéristique du chromosome
12 (vert)
Diagnostic d'une délétionUne délétion : perte d'un fragment de chromosome.
ex : sd de Di George: anomalies thymiques, cardiaques ,hormonaux et
psychiques
individu normal individu malade
Les deux caryotypes après la technique du FISH
Individu normal individu malade
Marquage de l'extrémité du chromosome 22 sonde associée à un marqueur vert; marquage de la zone absente après délétion, avec une sonde associée à un marqueur rouge
Étude de cellules malignesmarquage avec un mélange de plusieurs sondes chacune associée à un fluorophore différent permet une "peinture des chromosomes".Exemple : étude chromosomique d'une cellule cancéreuse du foie chez l'homme.
a: après révélation;
b: après traitement à
l'ordinateur
cellules malignes :
nombreuses anomalies
chromosomiques
Limites du test
•Le FISH : 70% des anomalies en moins de 48 heures.
•Ce test ne dépiste que les anomalies des chromosomes;
• ne dépiste pas les anomalies des gènes des
chromosomes.
•recourir à un conseil génétique qui permettra
d’envisager le diagnostic prénatal souhaitable lors de
maladie génétique due à une mutation génique.
Caryotype
Le caryotype(ou caryogramme): arrangement
standard de l'ensemble des chromosomes d'une
cellule. Les chromosomes sont photographiés et
disposés selon un format standard : par paire et
classés par taille.
but : détecter des aberrations chromosomiques
(comme la trisomie 21) ou d'identifier certains
aspects du génome de l'individu, comme le sexe
(XX ou XY).
Caryotype d'un individu de sexe masculin (XY)