le 24 novembre 2011

Le 24 Novembre 2011Le 24 Novembre 2011

Cours de chromatographie drsquoexclusionCours de chromatographie drsquoexclusion

Professeur SAALAOUI EnnouamaneProfesseur SAALAOUI Ennouamane

CHROMATOGRAPHIE DrsquoEXCLUSION

FILTRATION

TAMISSAGE MOLECULAIRE

Chromatographie dexclusion -diffusion

Chromatographie par permeacuteation de gel

geacuteneacuteralement

Chromatographie drsquoexclusion steacuterique

Chromatographie dexclusion ndashde taille

Professeur SAALAOUI Ennouamane20112012Professeur SAALAOUI Ennouamane20112012

Chimie macromoleacuteculaire

Phase mobile est de nature organique

Permeacuteation de gel

Filtration sur gelBiopolymegraveres commeprotegraveines

La phase mobile est aqueuse

Chromato drsquoexclusion de taille

Silices greffeacutees et non des gels

Chaicircnes poly-2hydroxymeacutethyl aspartamide

Bcp de NH2 OH CO caractegravere hydrophile Liaisons hydrogegravenes creacutee des ponts

des chaicircnes polyaspartamide


Le principe de la chromatographie drsquoexclusion-Le tamissage moleacuteculaire (pores)

-Seacuteparation en fonction de la taille

-Le chemin parcouru par les moleacutecules deacutepend de leur taille

-Les plus grandes srsquoexcluent

-Les plus petites srsquoinclusent



liaison 1-6

et 1-4

dextrane (polymegraveres de glucose) des ponts

1959 Branchement

+

Reacuteseau + ou - serreacute

Seacutephadex G10 G15 G200

Degreacute de reacuteticulation deacutecroissant

Mailes + en+ grandes

Le choix en fct de la taille des moleacutecules agrave seacuteparer


VT = Vo + Vp + Vs

Vo= Vm

Vi= Vp

Vs = VG

VP

VP

VS

VP

VSVS

Vo

Principe de lrsquoexclusion


Diffeacuterents volumes sur le chromatogrammeDiffeacuterents volumes sur le chromatogramme

Vo VR VT

VoVp Vs

Vc

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP

Volume de la colonne

VP

VP

VS

VP

VSVS

Vo Vo = volume mort = Vm

Vp = volume des pores

Vs = volume interneVg


VC = Vo + VP + VS VT = Vo +

VP VR = Vo + VP f K

VS est neacutegligeable

VT = Vc

f = fraction des pores1-0

Si K=1 moleacutecules diffusent bien

VR = Vo + VP f Si f=0 moleacutecules totalement exclues

VR = VoSi f=1 moleacutecules incluses

VR = Vo + VP

Volume de diffusion totale

f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve


Si K 1 ceci signifie

VR VT forte inclusion

Drsquoautres pheacutenomegravenes que lrsquoexclusion

Adsorption ou Eacutechange ionique

Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn

VR = Vo + VP f K


VR = Vo + VP f K Si K= O

Moleacutecules complegravetement exclues

K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG

Available accessible

Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo

=Kav Vo-VR VT ndash Vo


La seacutelectiviteacute

Reacutetention relative

Distributdeg des 2 S

-porositeacute du gel

-taille des S

-uniformiteacute des des pores

Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212 Efficaciteacute de la

colonne

Influence de la capaciteacute

La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1

Domaine exploreacute

k = K VsVM Vs = f VpEn chromato drsquoexclusion le K est tj voisin de 1 k entre 05 et

3k = VsVM

Vs volume des pores accessibles

VM volume extragranulaire


Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212

Le R augmente en mecircme temps que k

Au delagrave de 5 agrave 10 la reacutesolution ne varie pas

N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN


Aspects pratiquesAspects pratiques

bull Sur couche minceSur couche mince

bull colonnecolonne


Caracteacuteristiques des Phase Caracteacuteristiques des Phase statstatbull Le Le des pores (reacuteticulation)des pores (reacuteticulation)

bull La taille et la forme des particulesLa taille et la forme des particulesndash PPetitesetitesndash SSpheacuteriquespheacuteriquesndash GGranulomeacutetrie variableranulomeacutetrie variable

bull LrsquoinertieLrsquoinertie

bull Lrsquoaffiniteacute des gels pour les soluteacutesLrsquoaffiniteacute des gels pour les soluteacutes

bull La consistanceLa consistance

micomiegravetre 120 -


Diffeacuterents supports

diffeacuterents polymegraveres dextrane

polyacrylamide agarose

La phase stationnaire

Substrat du gel (phase disperseacutee)

La phase dispersante le solvant

Grains bille ou perle

calibreacutees


Classification des gel drsquoexclusion

Xeacuterogels

- mous

- semi rigides

Dextran agarose polyacrylamide -

seacutephadex S

S

fractogelS

ne gonflent pas Perles de verre Ou silice poreuse


Colonnes de dessalages de solutions proteacuteiques precirctes agrave lemploi rapides et eacuteconomiques

En 3-4 minutes les sels et moleacutecules de poids moleacuteculaire lt 5 kDa sont eacutelimineacutesCaracteacuteristiques du gel1048733 Polymegravere poreux hydrophile reacuteduction au maximum des adsorptions non speacutecifiques1048733 Stabiliteacute meacutecanique eacuteleveacutee reacutesistance agrave des pressions jusqursquoagrave 7 bars1048733 Stable aux pH de 0 agrave 141048733 Pas de reacutetraction ni de dilatation des billes quel que soit le tampon

des colonnes TSK-Gel de chromatographie drsquoexclusion de tailles aussi bien pour la GFC (Gel Filtration Chromatography) seacuteparation de peptides proteacuteines et autres moleacutecules

solubles en milieux aqueux que pour la GPC (Gel PermeacuteationChromatography) seacuteparation de polymegraveres solubles en milieux organiques


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CHROMATOGRAPHIE DrsquoEXCLUSION

FILTRATION

TAMISSAGE MOLECULAIRE

Chromatographie dexclusion -diffusion

Chromatographie par permeacuteation de gel

geacuteneacuteralement

Chromatographie drsquoexclusion steacuterique

Chromatographie dexclusion ndashde taille




















liaison 1-6

et 1-4


1959 Branchement

+







VT = Vo + Vp + Vs

Vo= Vm

Vi= Vp

Vs = VG

VP

VP

VS

VP

VSVS

Vo




Vo VR VT

VoVp Vs

Vc

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP


VP

VP

VS

VP

VSVS






VP VR = Vo + VP f K


VT = Vc





VR = Vo + VP


f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve







VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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liaison 1-6

et 1-4


1959 Branchement

+







VT = Vo + Vp + Vs

Vo= Vm

Vi= Vp

Vs = VG

VP

VP

VS

VP

VSVS

Vo




Vo VR VT

VoVp Vs

Vc

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP


VP

VP

VS

VP

VSVS






VP VR = Vo + VP f K


VT = Vc





VR = Vo + VP


f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve







VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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VT = Vo + Vp + Vs

Vo= Vm

Vi= Vp

Vs = VG

VP

VP

VS

VP

VSVS

Vo




Vo VR VT

VoVp Vs

Vc

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP


VP

VP

VS

VP

VSVS






VP VR = Vo + VP f K


VT = Vc





VR = Vo + VP


f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve







VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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Vo VR VT

VoVp Vs

Vc

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP


VP

VP

VS

VP

VSVS






VP VR = Vo + VP f K


VT = Vc





VR = Vo + VP


f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve







VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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VP VR = Vo + VP f K


VT = Vc





VR = Vo + VP


f=0

f=1

0 f 1log PM

VR

Vo VP

Ou Ve







VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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VR = Vo + VP f K




K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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K f ( Vo-VR =(

Vp

Kav = VR-VO

Vp + VG


Kav = Vp

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo







-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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-taille des S



colonne


La reacutesolution

f=0 f 1 f=1

1 2



Distribution 2 S


-taille des S


= TR2 ndash To


ndash

Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

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calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

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seacutephadex S

S

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Exclusion

Diffusion totale

Inclusion

log PM f=0

f=1



3k = VsVM




Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

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calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

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Rs = frac14 (-1) k2(1+k2) N212



N = 16 (TR2

VoVp Vs

H = LN




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Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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bull colonnecolonne
















calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

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calibreacutees



Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

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Xeacuterogels

- mous

- semi rigides


seacutephadex S

S

fractogelS








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