la spectrométrie de masse pour la détection, la...

Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments, DSV/iBiTec-S/SPI

Christophe Junot

CEA/Laboratoire d’Etude du Métabolisme des MédicamentsCEA-Saclay (iBiTec-S)

[email protected]

La spectrométrie de masse pour la détection, lacaractérisation et la quantification des biomoléculesdans les fluides biologiques


The huge complexity of biological media


Biomolecules occur at a wide concentration range

(Adapted from Sumner L.W. et al., 2003)

mM

Concentration range

µM

nM

pM

Glucose

Citric acid

Amino-acids

Hormones

NeurotransmittersProstanoids

NMR

GC/MS

LC/MS

LC/Fluo


Analytical chemistry for biological sciences

Detection Quantification Structural analysis


La spectrométrie de masse: détecter et identifier des molécules par mesurede leur masse

Source Analyseur(s) Détecteur Traitement du signal

Production d’ions en phase gazeuse

Séparation des ions selon leur rapport m/z

Conversion d’un courant ionique en courant électrique

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

288.2531

179.1068

147.1126114.0912

135.0910

159.0676119.0831

234.0970167.0830196.6413

183.0779

265.1116227.1752 244.2270281.0650


What is mass spectrometry ?

Source

Analyser(s)

Detector

direct introductionGaschromatography Liquid chromatography

Atmospheric pressure ionizationElectrospray (ESI), APCI, APPIElectron impact

Chemical ionization

Low resolution:TQ (triple quadripole)IT (ion trap)

High resolution:TOF (time of flight)FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)OrbitrapTM


Accès à la masse moléculaireAnalyse des molécules thermolabilesCouplages LC/MS

Spectrométrie de masse à source à ionisation à pression atmosphérique

[M+H]+

[M-H]-


Différents types d’analyseurs pour des applications variées

Pièges ioniques (mode MSn)

- Analyses structurales

50 100 150 200m/z

1,8

0,0

0,5

1,0

1,5

100

0

20

40

60

80

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

120,9

79,8

121,981,3200,758,9 137,1

105,9

urine de rats 02_030131142846#696 RT: 29,47 AV: 1 NL: 7,96E5 F: - p d Full ms2 200,97@35,00 [ 45,00-415,00]

urine de rats 02_030131142846#706 RT: 29,93 AV: 1 NL: 1,41E4 F: - p d Full ms3 200,97@35,00 120,91@35,00 [ 20,00-250,00]

50 100 150 200m/z

1,8

0,0

0,5

1,0

1,5

100

0

20

40

60

80

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

120,9

79,8

121,981,3200,758,9 137,1

105,9

urine de rats 02_030131142846#696 RT: 29,47 AV: 1 NL: 7,96E5 F: - p d Full ms2 200,97@35,00 [ 45,00-415,00]

urine de rats 02_030131142846#706 RT: 29,93 AV: 1 NL: 1,41E4 F: - p d Full ms3 200,97@35,00 120,91@35,00 [ 20,00-250,00]

MS2

MS3

OS

O

O

OH m/z 121

m/z 80

m/z 106

Analyseurs à haute et ultra-haute résolution (TOF, Orbitrap, FTICR)

Triples quadripôles (MS/MS)

- Quantification sensible et spécifique - Analyse sélective de familles chimiques


MS à haute résolution: détecter plus de métabolites et les identifier plus facilement

Résolution en masse

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

999.00 1000.0 1001.0 1002.0m/z

R=3000

m/z

FWHM: R = (m/z)/( m/z)1.0000

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

999.00 1000.0 1001.0 1002.0m/z

R=1400 0.9885

C10H15O4 (0.1 ppm)

Databases

Précision en masse

Mais attention aux isomères!!

Urines humaines

38 métabolites détectés en conditions C18correspondent à 83 métabolites en conditions PFPP

(Roux et al., Anal. Chem., 2012)


Les principales difficultés à surmonter en analyse quantitative par spectrométrie de masse

• sensibilité

• Effet matrice: diminution du rendementd’ionisation du à la présencede substances co-éluées.

MRM1MRM2

Composés endogènesinvisibles

• Spécificité:

dGTPC10H16N5O13P3

ATPC10H16N5O13P3

RT: 0.00 - 10.02 SM: 7G

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min)

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

RT: 4.86MA: 5548515

5.721.34 6.630.17 9.807.85 8.673.992.08 2.73RT: 4.86MA: 1119001

5.68 5.944.550.82 7.591.60 2.17 3.47 8.20 9.28

dGTP

ATP


Sample preparation

Sophisticated sample preparation improves detection sensitivityat the expense of biomolecules coverage

Solid phase extraction

Liquid-liquidextractionSolvent/acid

precipitation

To clean-up samples and/or to concentrate metabolites

Sample preparation depends on the kind of biological medium investigated and on the kind of biomolecules of interest. Cell extracts, tissue extracts, biofluidsQuenching issue


La validation des méthodes LC/MS pour laquantification de médicaments dans les milieuxbiologiques

- Rendement d’extraction

- Rendement d’ionisation

- Effet mémoire

- Linéarité

- Limite de détection, limite de quantification approximative

- Précision et exactitude (intra- et inter-série)

- Stabilité (dans les conditions d’analyse et dans les conditions de

conservation)

- Effet des anticoagulants (pour les dosages plasmatiques)

Bien décrit (Shah et al., 1992, 2000 ; FDA, 2001…)


Metabolite-profiling for studying the regulation of the glutathione biosynthesis pathway in S. Cerevisiae

Cystathionine Cysteine

S-Adenosyl-Homocysteine

Oxidized glutathione

Homocysteine

-Glutamyl-Cysteine

Reduced glutathione

Methionine

S-Adenosyl-

Methionine

Cys4

Cys3

Str2

Gsh1

Gsh2

Sam1

Sam2

Met6

Str3

Sulfate assimilation

Glr1

Sah1

METHYLCYCLE

Previous proteomic results

showed that Cadmium stongly

increases GSH synthesis, which is

used for the detoxication process.

(Vido et al., 2001)

How is it regulated ?Are there any limiting enzymes ?

To develop an analytical method for the simultaneous quantification of the metabolites involved in the biosynthesis of GSH


(Lafaye et al.,Anal Chem 2005)

LC-ESI-MS/MS combined with 15N metabolic labelingof S.cerevisiae

14 N culture to be analyzed

15 N culture

14 N extract

15 N referenceextract

METABOLITE EXTRACTION

MIXING OF ALIQUOTS

LC- MS /MS ANALYSIS OF THE MIXTURE

14N/15N isotope ratio

QUANTITATIVERESULTS

N signals

14 metabolite

14 N referencecompounds

CONSTRUCTION OFCALIBRATION CURVES

0 25 50 75 100 1250

1

2

3

4

Concentration (µg/mL)

14N

/15N

rat

io

MS2collision cell

MRM: MULTIPLE REACTION MONITORING

MS1


Cys 4

Cys 3

Gsh 1

Gsh 2

Met 6

Sulfate Cysteine

0 2 4 60.00

0.25

0.50

0.75

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(m

M)

Homocysteine

0 2 4 60

50

100

150

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(µ

M)

Methionine

0 2 4 60.00

0.25

0.50

0.75

1.00

16 20 24

Time (h)

Conc

entr

atio

n(m

M)

Cystathionine

0 2 4 60.0

0.5

1.0

1.5

2.0

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(m

M)

-Glutamyl-Cysteine

0 2 4 60.0

2.5

5.0

7.5

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(m

M)

S-Adenosyl-Homocysteine

0 2 4 60

100

200

300

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(µ

M)

Total Glutathione

0 2 4 60

5

10

15

20

16 20 24

Time (h)

Con

cent

ratio

n(m

M)Sam1

Sam2

Sah1

(Lafaye et al., J.Biol.Chem. 2005)


Basic principle of quantitative mass spectrometry for proteins

Mass filtering approach with standard technologies

Triple quadrupole OrbitrapMaldi-Tof

8+

7+

6+

5+

4+8+

7+

6+

5+

4+8+

7+

6+

5+

4+8+

7+

6+

5+

4+

1. Whole protein

2. Digested protein (peptides)


Internalstandard

Trypsination and analysisof peptides by LCMS/MS

F: \ 0101 2 8\ 080 40 8 \0 8040 8 007 0 8/0 4/ 2008 2 0: 55: 5 1 A pel in 12 1 0ng/ m L SI 10 ng /m L

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 00

Relat

ive

Abu

ndan

ce

3 56 . 449 84

35 6. 700 53

35 9. 4 56 59

35 9.7 0 73 2

356 .9 5 10 4

359. 9 57 74357 . 20 1 48 3 59 . 20 581 3 60. 20 79 3

3 57. 45 20 5 358 .2 572 73 56 . 449 84

N L: 3 . 93E 5

08 040 800 7#5 7 7- 59 0

R T: 5 . 10- 5. 21 A V: 14 T : F TM S + p E S I

F ull m s [ 140 .0 0- 900 .0 0 ]

N L: 3 . 93E 5

Elution

Digestion

LC/MS quantificationin MRM mode

RT: 3.15 - 7.15 SM: 7G

3.5 4.0 4. 5 5.0 5.5 6.0 6.5 7. 0Time (min)

0102030405060708090

1 00

01020304050

60708090

1 00

Rela

tive A

bund

ance

RT: 5.15BP: 356.4500 1

RT: 5.15BP: 359.4567 9

NL:5.44E5m/z= 356.44435-356.45509 MS 08040800 7

NL:3.62E5m/z= 359.45097-359.46192 MS 08040800 7

Extraction by solid-phaseBound target (VEGFR)

ProteinAntibody (rabbit IgG)

IS Elution

Digestion

(Dubois et al, Anal. Chem., 2008)

Quantification of a therapeutic antibody (Erbitux) using LC/MS/MS in human serum

Erbitux(146 kDa)

LOQ=20 ng/ml


Les approches globales «omiques»

Les gènesLe génome

génomiquepolymorphisme

Les ARN messagersLe transcriptome

transcritomique

Les métabolitesLe métabolome

métabolomique

Les protéinesLe protéome

protéomique

GENOTYPE PHENOTYPE


Déroulement d’une analyse métabolomique

-4000

-3000

-2000

-1000

0

1000

2000

3000

4000

-4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000

t[2]O

t[1]P

TEMOINSMALADES

PREPARATION DES ECHANTILONS

ACQUISITION DES EMPREINTES TRAITEMENT DES DONNEES

IDENTIFICATION DES BIOMARQUEURSCONFIRMATION ET QUANTIFICATION

ECH.

VAR

IAB

LES

(RT-

MA

SSES

)

EXTRACTION

DILUTION…

UR INE 3 0D IL4_ C ID 2 0_e ndo gèn es #6 8 R T : 1.22 AV: 1 NL: 4 .1 7E 5F : F TM S + p E S I Fu ll m s 2 173 .0 9@ c id2 0.00 [50.00 -800 .0 0]

60 8 0 100 12 0 140 16 0 1 80m /z

05

1 0

1 52 0

2 53 03 5

4 04 5

5 0

5 56 0

6 57 07 5

8 08 5

9 09 5

1 00

Rel

ativ

e A

bund

ance

1 16.07 041

17 3.091 901 27.08 652

1 55.08 1368 0.494 587 0.064 97 1 69.67 42686 .0 640 018 4.862 1861 .0 399 0 1 02.71 753 143 .0 416 7

-H2O

[M+H]+-HCOOH

-C2H3ON

BASES DES DONNEES, MS/MS …

DETECTION AUTOMATIQUE DES SIGNAUX

DETECTION AUTOMATIQUE DES SIGNAUX


Détection automatique des signaux

1. Alignement des variables en temps de rétention et en mesures de masses2. Suppression du bruit de fond3. Détection et mesure des pics4. Présentation des données sous forme matricielle

Echantillons

Varia

bles

(Rt-m

asse

)


Few thousands of variables…

…Few hundreds of metabolites ??

Annotation of peak lists is requiredto help for metabolite identification

0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

Samples

Varia

bles

(Rt-m

ass)

?????????0 20 40 60 80 100 120 140

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

Chemical and biochemical databases: KEGG (www.genome.jp/kegg), Metlin (www.metlin.scripps.edu), HMDB (www.hmdb.ca)

spectral databases


Pourquoi une base de données spectrale ?

Annotations (HMDB, KEGG, METLIN)Deethylatrazine 3-amino-2-naphthoic acid Indoleacrylic acid

189.0757 5.28 C10[13C]H10NO2 Tryptophan [(M+H)-(NH3)]+ (13C) Ethyl Oxalacetate190.0787 5.28 C9[13C]2H10NO2 Tryptophan [(M+H)-(NH3)]+ (13C2)

TryptophanethotoinVasicinolIdazoxanNirvanolN-Acetyl-D-fucosamineN-Acetyl-D-quinovosamine

207.1051 5.28 C9[13C]2H13N2O2 Tryptophan [(M+H)]+ (13C2)Gly Trp Phe (and isomers)Lys Met Met (and isomers)Tyr Leu Asp (and isomers)Ile Tyr Asp (and isomers) Val Tyr Glu (and isomers)

410.1938

AttributionCompoundFormulaRTM/Z

[(2M+H)]+ (13C)TryptophanC21[13C]H25N4O45.28

[(2M+H)]+TryptophanC22H25N4O45.28409.1902

205.0975

[(M+H)]+ (13C)TryptophanC10[13C]H13N2O25.28206.1010

[(M+H)]+TryptophanC11H13N2O25.28

[(M+H)-(NH3)]+TryptophanC11H10NO25.28188.0709

Extraction des ions : liste de variables annotésePic d’intérêt

Une molécule = plusieurs ions = redondance du signal

(Thèse Aurélie Roux 2008-2011)


Metabolomics for the characterization of metabolites in complex biofluids

Experimental design:

– 20 rats per groups

– Rats administered with phenobarbital(PB) for 4 days (i.p injections)

– Urines collected: 16hours fractions

– 2 time points: D-3 (PD: pre-dose) and D5(PT=post-treatment)

The aim: to discover some biomarkers for enzyme (CYP 450) induction

(Erwan Werner PhD work)


1 00

2 00

3 00

4 00

5 00

6 00

7 00

8 00

-1 0 00 0 1 00 0

t[2]O

t[1]P

PD

PT

1 00

2 00

3 00

4 00

5 00

6 00

7 00

8 00

-1 0 00 0 1 00 0

t[2]O

t[1]P

PD

PT

Principal Component Analysis(ACP)

• Unsupervised analysis• To evaluate the structure of the data set

Orthogonal Projection to Latent Structures (OPLS)

D-3D5

Component 1(Inter-Class)

Com

pone

nt2

(Intr

a-C

lass

)• Supervised analysis• To improve the clustering• To focus on a particular effect• To sort variables


-0.6

-0.4

-0.2

-0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

-0.06 -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 -0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08

p(co

rr)[1

]P

w*c[1]P

(OPLS)w*c[Comp. 1]/p(corr)[Comp. 1]

SIMCA-P 11 - 18/12/2006 10:16:35

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

PD

-01

PD

-02

PD

-03

PD

-04

PD

-05

PD

-06

PD

-07

PD

-08

PD

-09

PD

-10

PD

-11

PD

-12

PD

-13

PD

-14

PD

-15

PD

-16

PD

-17

PD

-18

PD

-19

PT-

01

PT-

02P

T-03

PT-

04P

T-05

PT-

06P

T-07

PT-

08P

T-09

PT-

10P

T-11

PT-

12P

T-13

PT-

14

PT-

15

PT-

16

PT-

17

PT-

18

PT-

19

XVar

(231

.084

7_17

.768

)

Obs ID (Primary)

dataservier-neutre-neg.M6 (OPLS)XVar(231.0847_17.768)

SIMCA-P 11 - 18/12/2006 10:16:10

D-3 D+5

D-3 D+5

OPLS loadings: S-plot

UPLC-TOF :2458 extracted variables(suppression of isotopes) SIMCA P11:

628 variables modified by PB42 variables related to PB

m/z 247


•MS- molecular formula

•MS²- Add-on removal

•MS3

- highlights PB substructure (Werner et al., Analytical Chemistry, 2008)

OrbitrapOrbitrap®

LTQ


Overview of identified metabolites

(Werner et al., Analytical Chemistry, 2008)


Conclusion-perspectives

La spectrométrie de masse est un outil polyvalent et performant pour l’analyse des biomolécules dans les milieux biologiques.

Le futur: miniaturisation, gérer la complexité: couplage à d’autre techniques séparatives

(mobilité ionique)La spectrométrie de masse au pied du malade???

(Schäfer KC, Anal. Chem., 2012)


RemerciementsCEA/LEMMJean-François HeilierAlexandra LafayeCéline DucruixErwan WernerGeoffrey MadalinskiEmmanuel GodatJérôme CottonYing XuAurélie RouxEric EzanBenoit ColschSamia Boudah

CEA/iRCMPaul-Henri RoméoDhouha DarghouthBérengère KoehlMarie-Françoise Olivier

G.H. Pitié-SalpétrièreFrédéric SedelMaria del Mar AmadorFanny MochelFoudil Lamari

Laboratoire de Chimie Structurale Organique et Biologique (UPMC)Jean-Claude Tabet, Richard ColeDenis Lesage, Sandra AlvesEstelle Paris, Baiyie Xu

Groupe de Chimie Analytique de Paris Sud,EA 4041 (Université Paris 11)Pierre Chaminade

CEA/DRT/LIST/DETECSOlivier Gal, Antoine Souloumiac, Etienne Thévenot, Jean-Pierre Both

CEA/Programmes Transversaaux de Technologies pour la santé et Tox NucJacques Grassi, Marie-Thérèse Ménager

CEA/iBiTecJean Labarre, Franck et Corinne Chauvat, Michel Toledano


Glu-Phe

×

× ×

×

×××

×

×

×

×

××

×

Glutamate

CSF metabotype of a Dihydropteridinereductase (DHPR) deficient patient

Autosomal recessive genetic disorder. Hyperphenylalaninemia due to tetrahydrobiopterinedeficiency (malfunctioning Tyr and Trphydroxylases)

no change

not detected×

increased concentrations

Phenylalanine metabolism

Tryptophanmetabolism

Medication

Miscellaneous

(Coll. Dr. F. Sedel, G.H. Pitié-Salpétrière)


But (!!!...) : Require specific reagents (Anti idiotype, soluble targets….)

Are susceptible to matrix interferences which may lead to variable results

Immunoassays for protein quantification• Are routinely applied• Are sensitive (20 to 500 ng/ml) and easy to perform


nM

µM

pM

Global approaches

1-10 10-100 100-1000

Targetedapproaches

Number of analyzed compounds

High Resolution MS

Triple quadrupole instruments (MRM mode)

Relative quantification

Absolute quantification

0 20 40 60 80 100 120 140Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

la spectrométrie de masse pour la détection, la...

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