LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE ET LES MESURES IN VITRO

HAMMA IBRAHIM MAIGA, MD

Malaria Research & Training Center/Département D’Épidémiologie des Affections Parasitaires/

Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontostomatologie.Bamako, Mali (Afrique de l’Ouest).

BP: 1805 TEL: 223 222 81 09

EVALUATION

par les FACILITATEURS

Plan

• Introduction

• Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation du parasite (malaria)

• Reproduction in vitro de la réponse cellulaire

• Intérêt

1

Introduction

� Immunité cellulaire:

1- Lymphocyte T détecte & reconnaît l’Ag immédiatement

2- Plusieurs populations de lymphocytes T CD4 – CD8

3- La cible n’est pas directement l’Ag mais la cellule qui le porte et alors reconnue comme non-soi

� In vitro : Qualifie un processus biologique observé/étudié en éprouvette ou en laboratoire, dans des conditions artificielles, par opposition à in vivo.

Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation du parasite

2

L'hépatocyte au sein duquel se développe Plasmodium est la seule cible vis à vis de laquelle peuvent opérer des cellules T CD8[+] et T CD4[+].

Cela implique que ces cellules peuvent reconnaître des peptides dérivés de protéines parasitaires présentés en surface de l'hépatocyte parasité en association avec les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH).

Une séquence peptidique leurs a conduit à l'identification d'un peptide présentant des motifs d'ancrage de l'haplotype H-2K[d]

Ce peptide est capable d'induire des mécanismes de cytotoxicité dépendant des cellules T CD8[+] dirigés contre l'hépatocyte infecté in vitro.

Phase hépatique [Pétour Pascal ; Mazier Dominique] 3

• Les cellules NK purifiées des donneurs de sang n’ayant eu aucune exposition préalable au paludisme avant le prélèvement sanguin, inhibent la croissance des parasites après 48h de co-culture en présence de sérum de sujets semi immuns.

• Cette situation est abolie lorsque les cellules NK sont préalablement incubées avec un anticorp monoclonal anti-CD95 (anti-fas) humain ou avec la protéine chimère composé par la fusion de la molécule fas et du fragment Fc d’immunoglobuline humaine soluble.

- le niveau de l’inhibition de la croissance des parasites est également substantiellement réduit par le prétraitement des cellules avec un anticorp anti-CD56.

• D’autre part la destruction direct des érythrocytes parasités par les cellules NK, en l’absence de tout sérum a été observée par le test standard de mesure de cytotoxicité par la libération de chrome radioactif.

Phase Érythrocytaire [Pr Elie Mavoungou] 4

Technique in vitro

Préparation des cellules effectrices:- PBMC : Peripheral blood mononuclear Cells; Monocytes et lymphocytes

L’obtention des cellules NK humaines

En utilisant le système de purification MACS (Magnetic Activated Cell Sorter).

1- Sélection positive, les cellules NK contenues dans le mélange de PBMCs sont reconnues par leur marqueur majeur, l’antigène CD56. Cette reconnaissance sélective est réalisée par l’utilisation d’anticorps dirigés contre cet antigène. L’anticorps est artificiellement couplé aux billes magnétiques.

Le mélange cellulaire est ensuite passé dans un champ magnétique qui va piéger les billesmagnétiques et donc le couplage anticorps CD56-cellules NK.

Après lavage des cellules dans du milieu complet frais, les cellules sont placées dans un incubateur à CO2 réglé à 37°C pendant environ 16 heures afin de permettre le détachement des billes magnétiques.

2- Sélection négative est basée sur le même principe, mais dans ce cas, ce sont tous les autres types cellulaires, autre que les cellules NK,

Toutes ces cellules sont retenues dans le champ magnétique à l’exception des cellules NK qui sont recueillies librement. Les anticorps spécifiques utilisés dans ce cas sont essentiellement :

• l’anticorps anti-CD3, marqueur sélectif de tous les lymphocytes T, • l’anticorps anti-CD4, lymphocytes T helper, les monocytes et les macrophages,• l’anticorps anti-CD14, monocytes, • l’anticorps anti-CD15 marqueur des neutrophiles et des éosinophiles,

Stimulation des PBMC par des hématies parasitées par Plasmodium falciparum.Mesure de la prolifération des lymphocytes T, de la stimulation des sous populations, et activation des CPA

par cytométrie en flux.

PrélèvementsHéparine sodium Ficoll

PBMC

Plasma

Ajuster à

1.106¢/ml dans du RPMI-0

Répartition

…

600µl pour

0,6.106¢

6ml pour

6.106¢

Le plasma servira

pour la mise en

culture en système

autologue…

Centrifugati

on pour

mettre en

culot

Incubation avec

le CFDA

Re-centrifugation

pour mettre en

culot

Ajouter 360µl

de RPIM-0 +

240µl de plasma

autologue

Ajouter 3,6ml

de RPIM-0 +

2,4ml de plasma

autologue

RBC

PRBC6 puits avec

100µl/puit

3 puits

avec

2ml/puit

+100µl/puit de

RBC ou PRBC

+ 2ml/puit de

RBC ou PRBC

…voir le

protocole pour

les plans de

plaques…

Préparation des

suspensions de

globules rouges de

manière à avoir

1.106PRBC/ml

PrélèvementsHéparine sodium Ficoll

PBMC

Plasma

Ajuster à

1.106¢/ml dans du RPMI-0

Répartition

…

600µl pour

0,6.106¢

6ml pour

6.106¢

Le plasma servira

pour la mise en

culture en système

autologue…

Centrifugati

on pour

mettre en

culot

Incubation avec

le CFDA

Re-centrifugation

pour mettre en

culot

Ajouter 360µl

de RPIM-0 +

240µl de plasma

autologue

Ajouter 3,6ml

de RPIM-0 +

2,4ml de plasma

autologue

RBC

PRBC6 puits avec

100µl/puit

3 puits

avec

2ml/puit

+100µl/puit de

RBC ou PRBC

+ 2ml/puit de

RBC ou PRBC

…voir le

protocole pour

les plans de

plaques…

Préparation des

suspensions de

globules rouges de

manière à avoir

1.106PRBC/ml

5

Test de prolifération

(CFDA)

Phénotypages et

stimulations cellulaires

Stimulation…

LyT α/β et γ/δLyT Helper, Cytotox. et Reg.

DC, MØ et LyB

PBMC + RBC

PBMC + PRBC

PBMC PRBC

PBMC PRBC

monensin

PBMC RBC

monensin

Prolifération…

Ratio PRBC/RBC

Profil…

Th1/Th2

Test de prolifération

(CFDA)

Phénotypages et

stimulations cellulaires

Stimulation…

LyT α/β et γ/δLyT Helper, Cytotox. et Reg.

DC, MØ et LyB

PBMC + RBC

PBMC + PRBC

PBMC PRBC

PBMC PRBC

monensin

PBMC RBC

monensin

Prolifération…

Ratio PRBC/RBC

Profil…

Th1/Th2

Intérêt

� Compréhension des mécanisme in vivo

� Relation hôte/parasite

� Essais vaccinaux

GRAND MERCI A LA CULTURE IN VITRO QUI NOUS PERMET D’AVOIR UNE BANQUE CELLULAIRE

*********

MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION

*******

QUESTIONS

Références Bibliographiques

1- http//www.ifmt.auf.org/IMG/pdf/IFMT MB1 Immunité anti-infectieuse.pdf

2- Olivier Silvie, Dominique Mazier, Eric Rubinstein et Claude Boucheix« CD81: une tétraspanine impliquée dans l’infection par Plasmodium ». M/S médecine sciences Volume 19,

numéro 2, Février 2003

3- Pétour Pascal ; Mazier DominiqueIsolement et identification de nouveaux épitopes exprimés en surface de l'hépatocyte infecté par des

Plasmodies : modèle de la souris BALB/c infectée par Plasmodium yoelii (Isolation and identification ofnews epitopes expressed at the surface of the infected hepatocytes by Plasmodium spp : model of theBABL/c mice infected by Plasmodium yoelii) 1997, [Note(s) : , 173] (341 ref.) Travaux universitaires (Année de soutenance : 1997) (No : 97 PA06 6503) Université de Paris 06, Paris, FRANCE

4- Elie MavoungouLa cytolyse des érythrocytes au cours du paludisme: L’implication des cellules NKIn European cytokine network vol. 14, N°3, pp. 134-142, 2003.

5- Olivier Domarle (Anonyme).Protocole de recherche de l’unité d’immunologie, Institut Pasteur de Madagascar.