la production d’embryons in vitro dans l’espèce bovine · énoncer les signes de la...

Année 2008-2009 Prof. Ch. Hanzen –La production d’embryons in vitro chez la vache 1

La production d’embryons in vitro dans

l’espèce bovine

Prof. Ch. Hanzen

Faculté de Médecine Vétérinaire

Service de Thériogenologie des animaux de production

Année 2008-2009


Objectifs

Sous une forme chronologique, ce chapitre présente les

différentes étapes entre la collecte d’ovocytes et l’obtention in

vitro d’embryons transférables à savoir : la ponction transvaginale

échoguidée (OPU) des ovocytes (Ovum Pick Up : OPU),

l’évaluation de leur qualité, leur maturation et fécondation in vitro,

la préparation des spermatozoïdes puis la culture des embryons

obtenus. Le chapitre se conclut par une brève présentation des

conséquences possibles de cette biotechnologie de l’embryon.


Objectifs spécifiques

● Objectifs de connaissance� Enoncer le matériel nécessaire à la réalisation de l'OPU

� Enoncer les critères de prélèvement des ovocytes d'une vache

� Enoncer les champs d'application potentiels de la méthode transvaginale

� énoncer de manière chronologique les différentes étapes conduisant au transfert de l’embryon obtenu in vitro.

� énumérer les divers aspects de la maturation ovocytaire

� énoncer les signes de la capacitation des spermatozoïdes et l'agent responsable de son induction in vitro

� énoncer les critères de fécondation

� définir la coculture et ses moyens de réalisation

� définir le LOS

● Objectifs de compréhension� décrire la méthode dite OPU de prélèvement des ovocytes

� Comparer avantages et inconvénients de la FIV par rapport à la production in vivo d'embryons


Production d ’embryons

in vitro

● Introduction générale

● Le prélèvement des ovocytes

● L ’évaluation de la qualité des ovocytes

● La maturation ovocytaire

● La fécondation in vitro

● La culture des embryons

● Autres manipulations


In Vivo

In vitro

7

Introduction générale

● Biotechnologies de l’embryon : définition Techniques mises au

point à partir des connaissances de base acquises sur le

développement de l'embryon.

● Trois générations à distinguer…

8

Biotechnologies de l’embryon : génération 1

● production d’embryons in utero après stimulation hormonale des

femelles donneuses : superovulation

● mise au point du transfert d'embryons

● développement de la congélation

9


● Facteurs limitants :

� nombre faible d'embryons obtenus (7-8) et 5 à 6 transférables

� variabilité de production entre femelles traitées

• 20 à 30 % des femelles traitées ne donnent pas d'embryons transférables

• 25 % produisent plus de 6 embryons

� délai entre traitements de superovulation (60 j)

10


● Production d'embryons en co-culture, après maturation et

fécondation in vitro d'ovocytes prélevés sur l'animal vivant ou

après abattage

●

� FIVETE : Fécondation in vitro et transfert d’embryons

� OPU : Ovum Pick Up

� MIV : maturation in vitro (ovocyte)

� FIV : Fécondation in vitro (ovocyte)

� CIV : Coculture in vitro (embryon)

11


● Mise à profit des connaissances relatives aux premiers stades

embryonnaires

� transfert nucléaire : production de clones

� transgenèse : introduction d’un gène étranger dans l'embryon

� sexage de l’embryon

● ICSI : Intra Cytoplasmic Spermatozoa Injection

● SUZI : Sub Zonal sperm Insertion

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Chronologie du développement

des biotechnologies de l’embryon

● 1951 Identification du phénomène de capacitation

● 1951 Premier transfert d’embryon dans l’espèce bovine

● 1959 Naissance du premier lapereau obtenu par FIV

● 1970 Premiers essais de fécondation in vitro chez la vache

● 1970 Première réussite de fécondation in vitro d'un ovocyte bovin

● 1973 Naissance du 1er veau après transfert d’un embryon congelé

● 1981 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vivo

● 1986 Naissance du premier agneau obtenu par IVM/IVF

● 1986 Naissance du premier porcelet obtenu par IVF

● 1987 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vitro

13

Chronologie du développement des biotechnologies de

l’embryon

● 1988 Mise au point de l’OPU

● 1989 Naissance du premier porcelet obtenu par IVM/IVF

● 1990 Naissance du premier poulain obtenu par IVF

● 1992 Naissance du premier buffle obtenu par IVM/IVF

● 1993 Application de l’OPU en Belgique (Ulg)

● 1993 Naissance du premier chevreau obtenu par VM/IVF

● 1997 Naissance de Dolly

● 2000 Application en Belgique de l’OPU en ferme


Importance relative des biotechnologies de l’embryon

● MOET : Multiple Ovulation and Embryo Transfer

� 1.000.000 de veaux nés

● OPU : Ovum Pick Up et FIV, MIV et CIV

� 100.000 veaux nés

● Clonage

� 500 veaux nés


Le prélèvement des ovocytes in vitro


Le prélèvement des ovocytes in vitro

● Lavage préalable des ovaires prélevés dans du liquide

physiologique à 39°C

● Aspiration dans un tube de 50 ml au moyen d ’une pompe à eau

et d ’une aiguille (19G à biseau court) ou d ’une seringue

● Ponction de tous les follicules visibles de diamètre < 10 mm et

d ’aspect transparent

● Décantation pendant 10 minutes

● Récupération des ovocytes

● Lavage dans milieu 199


Le prélèvement in vitro


Résultats de FIV service d ’OGA

Prélèvements in vitro d ’ovocytes

Années Type N ov NET %

---------------------------------------------------------------------------------------------

● 96-00 haute valeur génét 305 50 16

● 96-00 abattage nécessité 209 31 15

● 96-00 après engraissement 96 19 20

● 98-99 vaches réformées 6014 1582 26

-----------------------------------------------------------------------------------------------


Le prélèvement in vivo des ovocytes

l’OPU : Ovum Pick Up


Le prélèvement in vivo des ovocytes :

OPU (Ovum Pick Up)


1210


2438


1635

27

OPU : technique

● Evacuation des matières fécales et de l’urine

● Désinfection région vulvaire

● Introduction du guide aiguille dans le vagin

● Positionnement transrectal de l’ovaire sur la sonde

● Identification du follicule

● Ponction et aspiration (mouvements circulaires)

● Une même aiguille pour les deux ovaires

● Temps total : 10 à 15 minutes


La ponction en direct

29

L’OPU : une étape parmi d’autres ...

● Prélèvement des ovocytes par ponction

● Recherche des ovocytes

● Identification de la qualité des ovocytes

● Maturation des ovocytes pendant 24h

● Fécondation des ovocytes : 18 heures

● Co-culture sur cellules d’oviductes des embryons

● Transfert au jour 7

● Gestation

● Parturition


Résultats moyens de l’OPUOR : ovocytes récupérés : 60 % (/ N follicules)

OMM : ovocytes mis en maturation : 80 % (/ OR)

OM : ovocytes maturés : 50 % (/ OMM)

MO/BL : N embryons obtenus 30 % (/ OM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

F OR OMM OM MO/BL


Résultats moyens de l’OPU par session

0

1

2

3

4

5

6

OR OMM OM MO/BL

33

Facteurs d ’influence des résultats

la stimulation ovarienne

● Effets

� Le traitement multiplie par 2.4 le nombre de follicules

ponctionnables (11 à 17 vs 5 à 7)

� Le traitement de stimulation triple le nombre d ’ovocyte (8 à 12 vs

3 à 4) et le nombre d ’embryons obtenus par ponction

� Le traitement de stimulation augmente le % de récupération (70

% vs 52 %)

34

OPU : conséquences

● A court terme,

� Ponction hebdomadaire : pas d’effet sur le cycle

� Ponction bihebdomadaire :

• état d’anoestrus

• recrutement d’une population plus homogène

• Pas de lutéinisation du follicule ponctionné

• Pas de modification du moment d’apparition du pic de LH (après PGF)

35

OPU : conséquences à moyen terme (5 mois de

ponction)

● pas d’effet sur la cyclicité

● Gestation toujours possible

● Léger épaississement de la capsule ovarienne

● Très rarement : hématome folliculaire (>10 mm)

36

OPU : autres champs d’application potentiels

● Animaux prépubères

� laparoscopie : veaux de 3 à 9 semaines

� échographie : veaux de 6 à 16 semaines ou de 6 à 9 mois

� Avantage : raccourcissement de l’intervalle entre générations

� A réserver aux animaux > 6 mois (problème de maturation

ovocytaire)

● Animaux gestants :

� pas d’interférence avec l’intervalle de vêlage

� pas de risque d’avortement

� à réserver aux 3 premiers mois : accès aux ovaires

37

OPU : autres champs d’application potentiels

● Applications cliniques

� prélèvements répétés de liquides allantoïdien ou amniotique (> J30) : sexage ?

� Suppression de l’effet négatif du follicule dominant (infertiles)

� Synchronisation de l’ovulation si ponction des follicules > 5 mm 4 jours avant l ’injection d ’une PGF

● Production d’animaux transgéniques : meilleur contrôle du statut sanitaire et génétique des animaux prélevés in vivo

● Application à d’autres espèces animales : jument, chèvre


Le prélèvement in vitro des ovocytes : avantages

● Augmentation du nombre d ’embryons produits par unité de temps /

superovulation

● Réduction de la consanguinité par l ’utilisation de taureaux différents

lors de chaque séance de FIV

(Rem : 1.8 taureau en moyenne utilisé pour 3.4 ponctions)

● Reproduction des animaux qui ne répondent plus à la superovulation

● Prélèvement des donneuses sans interférence avec l ’intervalle entre

vêlages

● Réalisation possible en ferme


L ’évaluation de la qualité

des ovocytes

du COC (Cumulus Oocyte Complex)


Evaluation de la qualité : 4 classes

● Classe 1

� Aspect transparent du COC

� Cumulus compact

� Ooplasme homogène

● Classe 2

� COC et cumulus idem

� Ooplasme plus irrégulier


Evaluation de la qualité : 4 classes

● Classe 3

� cumulus moins compact

� ooplasme sombre et plus irrégulier

● Classe 4

� Cumulus expansé voire absent

(naked oocytes)


La maturation des ovocytes


La maturation in vivo des ovocytes

● Rappels

● Naissance : blocage des ovocytes en prophase 1

● Maturation ovocytaire = reprise du développement

● Finalité de la maturation

� reconnaissance et pénétration par le spz

� assurer les premiers stades du développement de l ’embryon

● Population concernée : 1 % des ovocytes


La maturation in vivo ou in vitro des ovocytes (rappels)

● maturation membranaire

� reconnaissance de la ZP3 par le spz

� fixation du spz par la ZP2

� stabilisation de la pellucide par ZP1

● maturation cytoplasmique

� Migration des granules vers la périphérie

� synthèse de l ’ovoperoxydase pour empêcher polypsermie

� protéosynthèses

● maturation nucléaire :

� perte de la membrane nucléaire (GVMB : Germinal Vesicule Membrane Breakdown)

� émission du 1er globule polaire


La maturation in vitro des ovocytes

Données générales

● Mise en maturation dans des micropuits (une vingtaine

d ’ovocytes par 50 à 100 microlitres)renfermant un milieu

● Température de 39°C

● Durée de la maturation : vache : 18 à 24 heures

● Critères de maturation

� expulsion le plus souvent du 1er globule polaire

� dispersion des cellules du cumulus (COC expansé) sous l ’effet

de l ’acide hyaluronique induit par la LH

� développement d ’un blastocyste


Ovocytes avec globule polaire expulsé


Ovocyte et cellules folliculaires


OvocytesOvocytes


Ovocyte maturOvocyte maturéé

GPGP

GoutelettesGoutelettes lipidiqueslipidiques

Espace pEspace péérivitellinrivitellin


Ovocyte maturOvocyte maturéé


La maturation en direct

(avec l’aimable autorisation de l’UCL)


La fécondation in vitro


Des milieux pour la FIV ...

● Lavage des ovocytes prélevés : M199

● Maturation des ovocytes : M199 + LH + FSH

● Milieu de lavage en postmaturation : HTL cad Tampon Hepes et TALP cad milieu de Tyrode modifié par addition d ’Albumine, Lactate et Pyruvate

● Milieu de préparation des spermatozoïdes : SPTL cad SpermTALP

● Milieu de fécondation : IVFTL (In Vitro Fécondation TALP)


Des milieux pour la FIV...

● Milieu de lavage des cellules de coculture :

PBS et FCS

● Milieu de culture des cellules de coculture :

M 199 et ECS

● Milieu de coculture des embryons :

Menezo et ECS

● Remarque : toujours addition d ’Ab


Migration des spermatozoïdes

● Migration passive et active

● Zones de stockage et de relarguage

● Perte de protéines de surface présentes dans l ’épididyme et le

plasma séminal et de la spermine un agent de décapacitation

● Réduction du nombre

● Capacitation


La fécondation in vitro

méthodologie


La sélection des spermatozoïes

● Décongélation d ’une paillette

● Séparation des spz du milieu séminal et des agents

cryoprotecteurs par lavage dans un milieu ou par passage sur

un double de gradient de percoll ou par swim-up

● Remise en suspension pour enlever le glycérol

● Détermination de la concentration

● Ajustement de la concentration à 2.000.000 /ml


Sélection des spermatozoïdes sur gradient de Percoll


L’induction de la capacitation

● incubation pendant 15 minutes de la solution de spz avec de

l ’héparine

● Capacitation = Processus qui rend le spz apte à assurer la

fécondation

● Durée (vache) de 4 à 6 heures

● Faits

� Augmentation de la mobilité

� Déclecnhement de la réaction acrosomique


La fécondation proprement dite

● goutte de 50 à 100 microl de milieu sous paraffine (pour éviter

l ’évaporation)

● / goutte : 10 ovocytes et 100.000 spermatozoïdes (2 millions /

ml)

● incubation de 18 heures à 39°C à 5% de CO2 et atmosphère

saturée en humidité


Critères de fécondation

● apparition des deux globules polaires ou de deux pronoyaux

(visualisation chez la vache après centrifugation ou coloration à la

fuschine : différence avec la souris ou la femme)

● Identification de spermatozoïdes accessoires sur la pellucide

● Taux de clivage : nombre de blastomères identifiés à 48 heures

� 4 : 13 % de développement blastocytaire

� > 4 : 40 % de développement blastocytaire

Année 2008-2009 Prof. Ch. Hanzen –La production d’embryons in vitro chez la vache 64Ovocytes en fécondation


Ovocytes et expulsion des deux globules polaires


La fécondation en direct …


La culture des embryons


La culture des embryons

● Impératif

� levée du blocage de développement observé in vitro avec les

embryons animaux (différence avec l ’espèce humaine)

� Stade du blocage variable

• souris : 2 cellules

• porc : 4 cellules

• bovin : 4-8 cellules

• brebis : 8 - 16 cellules

● Méthodes : in vivo ou in vitro


La culture in vivo des embryons

● Oviductes de lapine ou de brebis

● intérêt surtout historique

● transfert de plusieurs dizaines (20 à 50) d ’embryons par

oviducte (ligaturé) 1 à 2 jours après l ’ovulation de brebis

synchronisées

● A J7 récupération de 57 % des embryons

● Stade morula - blasto : 24 %


La culture in vitro des embryons

● Cultures de cellules trophoblastiques tubaires, granuleuse ou

somatiques (foie, rein)

● Milieux définis renfermant les secrétions des cellules tubaires

� SOF : Synthetic oviductal fluid

� CR1 = milieu de Rosenkrans

� BMOC-3 milieu de Brinster


Morula en coculture

de cellules d ’oviducte

1683


Le développement des embryons en direct

(avec l’aimable autorisation de l’UCL)


Conséquences de la FIVETE


Embryons in vitro et in vivo

75

OPU : Caractéristiques comparées des gestations

obtenues par IA et par FIV

IA FIV

(n = 2787) (n = 944)

---------------------------------------------------------------

Poids naissance mâle 44 48

femelle 41 47

Durée de gestation 281 284

Mortalité périnatale (%) 6.2 8.6

% de veaux mâles 49 55

% de malformations 0.7 3.2 (30 cas)

---------------------------------------------------------------

Résultats: Holland genetics (De Ruigh L. AI Vets Bruges 1998)

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OPU : Nature des anomalies observées après FIV

3.2 % sur 944 gestations (30 cas)

-----------------------------------------------------------------

N %

-----------------------------------------------------------------

Hydropisie des membranes fœtales 17 57

Anomalies des membres 8 27

Veau bull-dog 1 3

Autres 4 13

-----------------------------------------------------------------

Résultats: Holland genetics

(De Ruigh L. AI Vets Bruges oct.1998)

la production d’embryons in vitro dans l’espèce bovine · énoncer les signes de la...

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