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La culture cellulaire – Mme Chevalier

INTRODUCTION L’évolution des techniques de culture cellulaire a permis une avancée importante dans le domaine de la biologie

depuis les années 40 (lignée HeLa). Actuellement, les cellules vivantes sont des outils biologiques de choix dans

de nombreux domaines :

On sait cultiver des cellules d’origine diverse : bactérienne, végétale ou animale Les cellules peuvent être cultivées et manipulées facilement Les cellules peuvent être congelées (et décongelées) tout en gardant leur potentiel de division et leur

patrimoine génétique → Source continue homogène de cellules utilisables dans différents domaines : recherche, santé, cosmétique

Les cellules de culture permettent de minimiser l’utilisation des animaux de laboratoire

Exemples d’utilisations dans le domaine de la santé :

- Greffe de peau - Fécondation in vitro - Greffe de moelle - Thérapie cellulaire : cellule = médicament

La culture cellulaire permet de maintenir et multiplier des cellules en dehors de l’organisme.

Conditions : Créer un environnement proche de l’environnement naturel.

Pour chaque type cellulaire, il faut connaître son environnement afin d’identifier :

- Les besoins nutritifs (pouvoir se multiplier) - Les contraintes physiologiques

CONDITIONS NECESSAIRES POUR LA CULTURE

LES BESOINS NUTRITIFS Mise au point de milieux de culture adaptés pour maintenir la survie et la prolifération des cellules en dehors de l’organisme : milieux plus ou moins adaptés selon la cellule. Trouver un milieu nécessaire et commun à toutes les cellules avec les éléments nécessaires à tous les types cellulaires eucaryotes → sels + sucres + acides aminés + vitamines = milieux commerciaux de base. Composition d’un milieu de base nécessaire à toutes les cellules eucaryotes :

- Sels : Na, Cl, K, P, Mg, mais à des concentrations différentes, adaptées en fonction des cellules Maintien du potentiel de membrane Maintien de la balance osmotique Cofacteurs pour des réactions biochimiques

- Oligo-éléments : fer, zinc... - Sucres : sucres en C6 → source d’énergie - Acides aminés : acides aminés Arg, Cys, Glu, Hist … → essentiels à la croissance cellulaire - Vitamines : VitB, Biotine, Acide folique, Nicotinamine, Choline et Inositol → cofacteurs d’enzymes,

synthèse de molécules

Survie des cellules en culture : le milieu de base n’est pas suffisant pour que les cellules puissent survivre et proliférer en culture.



LES BESOINS EN SERUM Le milieu de base assure la survie à court terme des cellules en culture. Mais il est nécessaire d’ajouter un complément à ces cellules → sérum de veau fœtal. Il permet aux cellules de survivre longtemps.

Rôles d’apport d’éléments du sérum :

- Sels minéraux, nutriments, oligo-éléments, vitamines, cholestérol, acides gras… - Facteurs d’attachement : fibronectine, laminine → les cellules ont besoin d’avoir un contact entre

cellules ou avec la matrice - Hormones et facteurs de croissance : insuline, PDGF, EGF, FGF → prolifération de certains types

cellulaires - Protéines diverses permettant le transport des minéraux, de lipides ou d’hormones à travers la

membrane plasmique

Avantage du sérum : - Agent mitogène indispensable pour la division cellulaire (multiplication cellulaire) - Protecteur contre différents paramètres physiques : viscosité, atténuation de chocs, osmolarité - Protecteur contre différents paramètres chimiques (ex : présence d’inhibiteurs de protéases)

Inconvénients du sérum :

- Composition pas bien déterminée - Variabilité en fonction des lots - Difficultés d’approvisionnement - Possibilité de présence de virus et de pathogènes - Présence d’immunoglobulines

LES BESOINS CELLULAIRES PHYSIOLOGIQUES ✓ Température : Le nombre de division cellulaire augmente avec la température avec une valeur supérieure

limite où elle devient inhibitrice → cellules humaines : 37°C ✓ pH : La limite de pH pour laquelle la cellule présente une croissance optimale est étroite (variation délétère

pour les cellules : pH trop acide ou trop basique empêche les cellules de proliférer et elles meurent) → cellules humaines : pH 7.2-7.4

✓ CO2 : Le CO2 et le bicarbonate sont nécessaires à la croissance cellulaire. L’équilibre bicarbonate/acide carbonique est obtenu avec du CO2 en phase gazeuse. On cultive les cellules dans une atmosphère ouverte et contrôlée en permanence → cellules humaines : présence de 5% de CO2.

✓ Tampon : Le milieu doit être tamponné, car les cellules sont sensibles aux variations de pH → présence d’une molécule tampon dans le milieu de culture, l’HEPES, permet d’éviter les variations de pH brutales. Sécrétion d’éléments qui vont acidifier le pH tampon permettant ainsi de le réguler.

✓ Osmolarité : Ajustée avec du NaCl et une atmosphère humide. ✓ Humidité : Proche de la saturation, évite les variations de pression osmotique dues à des évaporations du

milieu de culture → à 37°C le milieu va s’évaporer

La culture de cellules humaines se fait dans des incubateurs humidifiés, réglés à 37°C, avec un apport de CO2.



LE MATERIEL NECESSAIRE Du matériel spécifique pour la manipulation et la culture des cellules

MANIPULATION

- Consommables stériles : - Manipulation avec du matériel stérile (irradiation). Ex : plastiques commerciaux à usage unique. - Milieux commerciaux et sérums filtrés sur 0.2 µm, permettant d’éliminer les bactéries.

- Hottes stériles : Manipulation sous des hottes à flux laminaire, entrée de l’air filtrée. Hotte : en hauteur,

espèce de filtre dans lequel l’air va passer, enceinte faite d’air stérile, évacuation de l’air par derrière, zone de travail complétement stérile.

CULTURE

- Incubateurs : - Température constante et homogène : 37°C - Humidité : 90-95% - Pression partielle en oxygène proche des conditions naturelles : atmosphère ouverte - Teneur en CO2 (5%) suffisante pour maintenir le pH constant

Incubateur : Connecté à une bonbonne de CO2. En bas, un bac d’eau permet maintenir l’humidité → Milieu

adapté à la cellule.

Chaque type cellulaire d’origine différente aura des besoins qui lui seront plus spécifiques pour sa division et sa

croissance. Ce que l’on a permettra de les maintenir mais pas qu’elles se développent : facteurs spécifiques.

Exemples :

- Facteurs de croissance particuliers - Des taux de glucose plus importants pour certaines cellules - Facteurs d’attachement : boite de culture adapté pour l’attachement mais certaines ont du mal

(fibronectine) → Qui seront additionnés au milieu standard.



LES DIFFERENTS SYSTEMES DE CULTURE Les systèmes de culture vont dépendre du type cellulaire :

Cellules en suspension : cellules ne nécessitant pas de facteurs d’attachement (qui ne sont pas obligatoirement

attachées à un support pour survivre) → culture en suspension dans le milieu adapté (ex : cellule sanguines).

Ces cellules en culture n’adhèrent pas au support plastique. Visualisation sous microscope inversé : regarder à

travers la boite.

Cellules adhérentes : cellules nécessitant des facteurs d’attachement (la majorité des cellules sont adhérentes)

→ culture sur un support dans le milieu adapté avec apport d’un facteur d’attachement (ex : fibroblastes).

Culture des cellules, adhérence au support plastiques, cellules en association les unes avec les autres tapissent

le support. Quand on regarde les cellules, on voit que les cellules adhérentes ont des protéines membranaires

qui sont des intégrines, elles vont exprimer un grand nombre de fibronectine, collagène…

Molécules impliquées dans l’adhérence dans les tissus :

Des protéines membranaires : les intégrines qui font le relais entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette (formation de points focaux d’adhérence).

Les composants de la matrice extracellulaire : glycosaminoglycanes, protéoglycanes et des protéines type collagène, fibronectine, laminine.

Molécules impliquées dans l’adhérence in vitro :

Cet ancrage dépend de facteurs d’attachement cités ci-dessus qui seront synthétisés par les cellules et apportés

dans le milieu de culture. Il dépend également de la nature du support utilisé. Ils sont en général en plastique,

polystyrène, traité physiquement pour exposer des charges négatives.



Cellules nécessitant une configuration en 3 dimensions → culture en milieu semi-solide (agar, méthylcellulose) :

cellules en suspension (ex : cellules sanguines, de la moelle osseuse).

Cellules nécessitant une configuration en 3 dimensions + des facteurs produits par d’autres types cellulaires →

culture en milieu semi-solide sur assise nourricière : cellules en suspension (ex : cellules de la moelle osseuse).

NOTIONS SUR LES CULTURES PRIMAIRES, SECONDAIRES, DE LIGNEE ET DE CLONES Différents outils cellulaires peuvent être utlilisés : cultures primaires, cultures secondaires (à durée de vie limitée) et des lignées transformées (à durée de vie illimité).

LES CULTURES PRIMAIRES Culture primaire : Cellules cultivées directement après isolement à partir d’un tissus ou d’un organe

ISOLEMENT DES CELLULES

La 1ère étape implique des procédures afin d’isoler et d’individualiser les cellules d‘intérêt.



Plusieurs types cellulaires différents à individualiser : Cellules circulantes ou sanguines :

- Prélèvement sanguin : globules rouges (GR), globules blancs (GB), macrophages… - Ponction du liquide céphalorachidien (LCR)

Majoritairement les cellules sont organisées en tissus : - Biopsie de peau, foie, rein - Dissection

A l’issue de la biopsie/dissection : dissociation de manière mécanique ou chimique → rompre les liens

DIFFERENTS MODES DE SEPARATION CELLULAIRE

- Séparation sur des paramètres physiques :

✓ Gradient de densité : des cellules différentes peuvent avoir des densités différentes. Ex : Ficoll sur du sang total, les cellules mononucléées se retrouvent à l’interface du ficoll et du plasma après centrifugation.

✓ Adhérence : certains types cellulaires adhèrent naturellement à un support.

Capacité des cellules à adhérer ou à ne pas adhérer : incubation de cellules mononuclées, vont adhérer et donner les macrophages. Enlever les monocytes et ne conserver que les lymphocytes : dans une boite de pétri, une partie flottante et une partie adhérée : récupérer les cellules flottantes.

Donne une population de cellules hétérogène, d’où la nécessité d’étapes de séparation des différentes

populations cellulaires.



- Séparation en fonction de marqueurs spécifiques : Les LT expriment une molécule que les LB n’expriment pas, ce qui permet de les différencier.

- Enrichissement d’une population à l’aide de facteurs de croissance spécifique : Facteur qui ne fait proliférer que les LT. Les LB vont mourir, favoriser la multiplication d’une cellule par rapport à une autre.

LES CULTURES SECONDAIRES

Quand après la culture primaire il n’y a pas suffisamment de cellules → amplification. Mettre en culture dans un milieu favorable à la multiplication de cellules : trop de cellule dans la boîte. Le milieu est appauvri car les nutriments ont été consommés pour la majorité. Le milieu s’acidifie et les cellules changent de couleur, elles sont trop les unes sur les autres. On procède à un repiquage de cellules, en prenant une partie des cellules et en les mettant dans un milieu neuf : à chaque fois que l’on fait des repiquages on est dans la culture secondaire. Pour les cellules adhérentes, c’est plus compliqué car elles vont coloniser complétement la boite de pétri. Le milieu est plus acide, il faut faire un repiquage une fois que la cellule est décollée

D’une manière générale les cultures de cellules évoluent en 3 phases : ✓ A : Culture primaire : les cellules mettent plusieurs jours pour se multiplier ✓ B : Culture secondaire : les cellules se multiplient plus vite (adaptation) ✓ C : la multiplication des cellules ralentie (sénescence) puis les cellules déclinent (mort cellulaire)

Les cultures secondaires sont dérivées de cultures primaires



Au temps 0 : lors de l’isolement des cellules et la mise en culture, des cellules vont mourir parce qu’elles ne peuvent pas s’adapter, on a une perte de cellules. Mais les cellules qui sont restées vont s’adapter, d’où un taux de multiplication régulier. Finalement, après peu, on retrouve le cycle : les cellules vont se multiplier de moins en moins car moins de place et présences de cellules mortes. Il faut repurifier des cellules et refaire le cheminement. Quelques cellules restent vivantes et la lignée continue si on s’en occupe : la transformation génétique est un évènement rare. Il est compliqué de mettre des cellules en culture et après difficile de pouvoir les travailler car elles vont, entre-temps, mourir. Il est plus intéressant d’avoir des cellules à durée de vie illimitée.

LES LIGNEES CELLULAIRES PERENNISEES Quelques caractéristiques :

Cellules qui se divisent indéfiniment Pouvoir multiplicatif important Peuvent avoir un nombre de chromosomes anormal (souvent hétéroploïdie) Morphologie souvent différente des cellules normales

Obtention de lignées pérennisées → Plusieurs possibilités :

- Evènement spontané à partir de cultures primaires (événement rare) - A partir d’un prélèvement de tumeur : les cellules tumorales sont pérennisées, immortelles (ex : lignée

cellulaire Hela) - Par fusion cellulaire (ex : hybridomes) : immortalisation par fusion membranaire (entre une cellule

normale et une cellule immortelle) → utilise la capacité des membranes cellulaires à fusionner. - Par des virus transformant (virus SV40 ou EBV), agents chimiques ou physiques (tropisme pour les LB)

Il existe des banques de cellules aux Etats-Unis (ATCC : American Type Culture Collection).

Acquisition par les cellules de nouvelles propriétés les rendant immortelles = modifications génétiques

Cellules différentes mais encore utilisables pour de nombreuses manipulations → gardent leurs

spécificités cellulaires



Ex : Immortalisation par fusion membranaire :

Membrane plasmique équivalente, quelque chose va aider à la fusion comme le polyéthylène glycol (agent

fusionnant). La cellule fille va avoir les chromosomes de la cellule immortelle et de la cellule normale.

Modification génétique transmises au produit de fusion. Les protéines vont se répartir le long de l’hétérocaryon

et le noyau se fragmente : tous les chromosomes sont mélangés, autour des chromosomes à l’autre membrane

nucléaire. La cellule va se diviser, la membrane se désagrège, les chromosomes sont libérés, dans ce cas-là la

cellule va éliminer des chromosomes, des cellules parmi elles vont être immortelle et d’autres normales.

METHODE DE CLONAGE CELLULAIRE Clone : population cellulaire issue de la division cellulaire, par mitose d’une cellule unique. Toutes les cellules d’un clone sont identiques. Il existe différentes méthodes pour obtenir des clones : Clonage par micromanipulation à partir de colonies obtenues en milieu semi solide : Chaque colonie provient d’une cellule unique au départ.

Les cellules ne peuvent pas bouger mais elles peuvent se diviser. Toutes cellules issues de la division vont rester accrochées à la cellule mère, les micropipettes permettent de récupérer les cellules et de les mettre en culture.



Clonage par dilution limite :

La population cellulaire est diluée de manière sériée, afin d’obtenir une concentration cellulaire faible. Pour

avoir au départ de la culture une seule cellule par puits dans une plaque de culture.

Les cellules sont semées à différentes concentrations décroissantes, pour avoir au départ de la culture une seule

cellule par boite. Dilution de 10 en 10 : suspension cellulaire à 1 cellule par µL. Au microscope, 1/3 des puits va

contenir des cellules poussées. Afin d’être quasi-certain qu’il n’y a qu’une cellule par puits, on dilue la population

cellulaire.

Clonage par tri cellulaire : Cytomètre de flux. L’appareil fait le travail pour n’avoir qu’une cellule dans le puit.

CRYOCONSERVATION DES CELLULES

CONGELATION

✓ Utilise des agents cryoprotecteurs → empêche la formation de cristaux à l’intérieur de la cellule : (ex :

DMSO = Diméthylsulfoxide, glycérol)

✓ Permet de descendre rapidement la température à -80°C

✓ Les cellules sont conservées dans des cryotubes

✓ Conservation pendant plusieurs années dans de l’azote liquide (-196°C)

Conteneurs à azote : stock de cellules congelées

Le but est de maintenir intacts la cellule et ses organites tout en arrêtant net son activité biologique pour

une conservation à long terme



DECONGELATION

✓ Laisser le moins possible les cellules en présence de l’agent cryoprotecteur : toxique à température

ambiante

TRANSFECTION DE GENES DANS DES CELLULES EUCARYOTES Transfection : Introduction d’un gène (ADN) étranger dans une cellule dans le but de faire exprimer à la cellule ce gène par conséquent la protéine. Pour transférer un gène dans les cellules eucaryotes, on utilise des vecteurs (qui amènent le gène dans le noyau) : plasmides ou virus modifiés non pathogènes. Le vecteur permettra l’expression du gène dans le noyau et aussi si nécessaire d’incorporer ce gène dans le génome de la cellule transfectée. Pour transférer un gène dans une cellule eucaryote nous avons besoin : - D’un vecteur qui contient le gène d’intérêt - D’une cellule hôte - D’une technique qui permet de faire entrer le vecteur dans la cellule (passage de la bicouche lipidique de la

membrane plasmique et de la double membrane du noyau)

LES PLASMIDES Plasmides : ADN bicaténaire, circulaire Réplication épisomale : se répliquent indépendamment Plusieurs centaines de plasmides par cellule de bactérie, indépendants du génome

Plasmides modifiés ou vecteurs plasmidiques : Sites d’insertion pour insérer le gène d’intérêt Présence d’un gène de résistance à un antibiotique (facultatif)

Le but est d’obtenir après décongélation une population cellulaire intacte avec un faible pourcentage de

mort cellulaire



LES DIFFERENTES METHODES POUR FAIRE ENTRER UN GENE DANS UNE CELLULE EUCARYOTE

Grâce à un plasmide : on force le système pour faire entrer le plasmide dans la cellule

1. Infection par un virus modifié 2. Injection directe dans le noyau (micropipette) 3. Fusion par des liposomes : Lipides cationiques utilisés pour créer des membranes artificielles sous forme

de vésicules (liposomes). Ces membranes se fixent sur le plasmide et les complexes plasmides-liposomes adhérent et fusionnent avec les charges négatives de la membrane plasmique.

4. Précipitation au phosphate de calcium : Le phosphate de calcium forme un précipité avec le plasmide, s’attache à la membrane cellulaire et le précipité est absorbé par endocytose.

5. Complexe DEAE Dextran : Le DEAE Dextran par ses charges positives se fixe aux charges négatives du plasmide et l’agrégat formé se fixe aux charges négatives de la membrane plasmique. Entrée dans la cellule par endocytose.

6. Electroporation : Application d’un bref pulse électrique à haut voltage créant temporairement des pores dans la membrane plasmique de quelques nanomètres de diamètre. Entrée du plasmide directement dans le cytoplasme.

TRANSFECTION TRANSITOIRE / TRANSFECTION STABLE

TRANSFECTION TRANSITOIRE

✓ Exemple : Transfection d’une cellule avec un gène qui code pour une protéine membranaire A.

✓ La protéine A est absente de la cellule normale.

✓ Utilisation d’un plasmide dans lequel a été inséré le gène d’intérêt.

Gène d’intérêt : code pour la protéine membranaire A.



Cellule eucaryote transfectée avec le plasmide :

TRANSFECTION STABLE

✓ Exemple : Transfection d’une cellule avec un gène qui code pour une protéine membranaire A.

✓ La protéine A est absente de la cellule normale.

✓ Utilisation d’un plasmide dans lequel a été inséré le gène d’intérêt, et un gène de résistance à un

antibiotique.

Gène de résistance : code pour une protéine permettant de résister (survivre) en présence d’antibiotique.

Cellule eucaryote transfectée avec le plasmide :

Expression de la protéine après 24-48 heures, perte du plasmide pendant les divisions cellulaires.

Perte de l’expression de la protéine après 72-96 heures.



CONCLUSION

L’intérêt des cultures cellulaires est la possibilité de faire des tests fonctionnels de migration, de prolifération.

On peut aussi faire des analyses cellulaires en ME ou en microscopie à fluorescence. On fait aussi des cultures

en 3D, pour reconstruire de la peau. On peut aussi faire de la microdissection laser : on isole une cellule qu’on

utilise pour analyser son génome. On peut faire des modèles in vivo, les injecter des cellules cultivées in vitro.

On peut aussi faire de la fécondation in vitro.

Mort des cellules n’ayant pas incorporé le gène de résistance à l’antibiotique.

Expression permanente de la protéine dans la cellule :

La protéine fait partie de la cellule

Les cellules issues de cette cellule transfectée exprimeront la protéine

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