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La capacitation des spermatozoïdes porcins et équins : une question de protéines

Mémoire

Andréane Martin

Maîtrise en sciences animales

Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Andréane Martin, 2015

III

Résumé

Suite à l’éjaculation, les spermatozoïdes ne sont pas aptes à féconder un ovocyte. Ces derniers doivent subir

une maturation dans le tractus génital femelle afin d’acquérir le pouvoir fécondant soit la capacitation. Bien

qu’elle fût découverte depuis plus de soixante ans, les modifications protéiques de la surface de la membrane

des spermatozoïdes ne sont toujours pas complètement élucidées. Particulièrement chez le cheval et le porc,

l’étude des protéines de surface des spermatozoïdes lors de la capacitation aurait un impact direct sur

l’amélioration des techniques de reproduction avancées. La présente étude a pour premier objectif d’abord

d’établir les meilleures conditions afin de promouvoir et caractériser la capacitation des spermatozoïdes

équins et porcins en condition in vitro. Le deuxième objectif est d’optimiser un protocole d’isolement de

protéines de surface des spermatozoïdes en utilisant la biotinylation. La démarche est de rendre ce processus

complètement imperméable afin d’étudier seulement les protéines de surface.

V

Abstract

After ejaculation spermatozoa must undergo a maturation to be able to fertilize an oocyte. The collective

events that lead to this capability are named capacitation. Although capacitation was first discovered more

than sixty years ago, the events and regulation of this maturation are still not fully understood. Also, the equine

and porcine species has several reproductive issues believed to be caused by defects in sperm capacitation.

Thus, the study of stallion sperm surface protein modification during capacitation could help to ameliorate

advanced reproductive technologies in the horse and the pig. The aim of the first study was to establish the

best in vitro conditions to promote horse sperm capacitation and to characterize the sperm using different

tests. Our second objective was to optimize a surface biotinylation protocol to prevent biotin labeling of internal

sperm proteins in order to study the surface membrane protein changes during capacitation.

VII

Table des matières

Résumé .............................................................................................................................................................. III

Abstract ............................................................................................................................................................... V

Table des matières ............................................................................................................................................ VII

Liste des tableaux .............................................................................................................................................. XI

Liste des figures ............................................................................................................................................... XIII

Liste des abréviations ...................................................................................................................................... XV

Remerciements .............................................................................................................................................. XVII

Avant-propos ................................................................................................................................................... XIX

Introduction ......................................................................................................................................................... 1

Chapitre 1 Revue de littérature ........................................................................................................................... 3

1.1 Anatomie des spermatozoïdes ................................................................................................................. 3

1.1.1 La tête ............................................................................................................................................... 3

1.1.1.1 Le noyau .................................................................................................................................... 4

1.1.1.2 L’acrosome ................................................................................................................................. 5

1.1.1.3 La membrane plasmique ............................................................................................................ 8

1.1.2 La pièce intermédiaire ....................................................................................................................... 9

1.1.3 La pièce principale : le flagelle ........................................................................................................ 10

1.2 La maturation des spermatozoïdes ......................................................................................................... 12

1.2.1 L’épididyme ..................................................................................................................................... 12

1.2.1.1 Structure ................................................................................................................................... 12

1.2.1.2 Fonction ................................................................................................................................... 13

1.2.1.3 Synthèse de protéines par l’épithélium épididymaire ............................................................... 13

1.2.1.4 Modification protéique membranaire des spermatozoïdes ....................................................... 13

1.2.1.4.1 Les épididymosomes ........................................................................................................ 14

1.2.1.5 Acquisition de la mobilité .......................................................................................................... 14

1.2.1.5.1 Aspect protéique ............................................................................................................... 15

1.2.1.5.2 Aspect environnemental ................................................................................................... 15

1.2.1.6 Acquisition du pouvoir fécondant ............................................................................................. 16

1.2.1.6.1 Aspect membranaire ......................................................................................................... 17

1.3 Éjaculation .............................................................................................................................................. 18

1.3.1 Le plasma séminal ........................................................................................................................... 18

VIII

1.4 La capacitation ........................................................................................................................................ 19

1.4.1 Changements membranaires........................................................................................................... 20

1.4.2 Calcium intracellulaire ...................................................................................................................... 21

1.4.3 Bicarbonate et pH ............................................................................................................................ 21

1.4.4 Capacitation et protéines kinases .................................................................................................... 22

1.4.5 Capacitation et espèces réactives d’oxygène .................................................................................. 23

1.5 L’hyperactivation ..................................................................................................................................... 25

1.6 La réaction de l’acrosome ....................................................................................................................... 26

1.6.1 La régulation de la réaction de l’acrosome ...................................................................................... 26

1.6.2 Dogme de la réaction de l’acrosome ............................................................................................... 29

1.7 Hypothèse et objectifs de recherche ....................................................................................................... 30

1.7.1 Hypothèse ........................................................................................................................................ 30

1.7.2 Objectif général ................................................................................................................................ 30

1.7.3 Objectifs spécifiques ........................................................................................................................ 30

Chapitre 2 Comparison of two incubation conditions to promote horse sperm capacitation in vitro .................. 33

2.1 Résumé ................................................................................................................................................... 34

2.2 Abstract ................................................................................................................................................... 35

2.3 Introduction ............................................................................................................................................. 36

2.4 Materials and methods ............................................................................................................................ 37

2.4.1 Chemicals ........................................................................................................................................ 37

2.4.2 Incubation media ............................................................................................................................. 37

2.4.3 Semen preparation .......................................................................................................................... 37

2.4.4 Protein extraction ............................................................................................................................. 38

2.4.5 SDS-PAGE and Western blotting .................................................................................................... 38

2.4.6 Sperm motility .................................................................................................................................. 39

2.4.7 Chlortetracycline fluorescence assay .............................................................................................. 39

2.4.8 Statistical analysis ........................................................................................................................... 40

2.5.1 Motility .............................................................................................................................................. 41

2.5.2 Tyrosine phosphorylation of sperm proteins .................................................................................... 43

2.5.3 Chlortetracycline assay .................................................................................................................... 45

2.5.4 pH of the media in the presence and absence of sperm .................................................................. 47

2.6 Discussion ............................................................................................................................................... 49

2.7 Acknowledgments ................................................................................................................................... 51

IX

2.8 References ............................................................................................................................................. 52

Chapitre 3 Comparison of different media to promote horse sperm capacitation in vitro .................................. 56

3.1 Résumé .................................................................................................................................................. 57

3.2 Abstract ................................................................................................................................................... 58

3.3 Introduction ............................................................................................................................................. 59


3.4.1 Chemicals ........................................................................................................................................ 60

3.4.2 Incubation media ............................................................................................................................. 60

3.4.3 Semen preparation .......................................................................................................................... 60


3.4.5 SDS-PAGE and Western blotting .................................................................................................... 61

3.4.6 Sperm motility .................................................................................................................................. 62

3.4.7 Internal cytosolic calcium concentration .......................................................................................... 62

3.4.8 Statistical analysis ........................................................................................................................... 63

3.5 Results .................................................................................................................................................... 64

3.5.1 Motility ............................................................................................................................................. 64

3.5.2 Tyrosine phosphorylation of sperm proteins .................................................................................... 66

3.5.3 Sperm intracellular cytosolic calcium assay .................................................................................... 68

3.6 Discussion .............................................................................................................................................. 70

3.6.1 Future perspective ........................................................................................................................... 71

3.7 Acknowledgments ................................................................................................................................... 73

3.8 References ............................................................................................................................................. 74

Chapitre 4 Optimization of sperm surface protein isolation using biotinylation .................................................. 79

4.1 Résumé .................................................................................................................................................. 80

4.2 Abstract ................................................................................................................................................... 81

4.3 Introduction ............................................................................................................................................. 82


4.4.1 Chemicals ........................................................................................................................................ 83

4.4.2 Culture media .................................................................................................................................. 83

4.4.3 Preparation of spermatozoa ............................................................................................................ 83

4.4.4 Percoll® wash.................................................................................................................................. 84

4.4.5 Biotinylation ..................................................................................................................................... 84

4.4.6 Membrane integrity staining ............................................................................................................ 84

X


4.4.8 SDS-PAGE and western blotting ..................................................................................................... 84

4.4.9 Immunolocalization .......................................................................................................................... 85

4.4.10 Statistical analyses ........................................................................................................................ 86

4.5 Results .................................................................................................................................................... 87

4.5.1 Internal protein labeling ................................................................................................................... 87

4.5.2 Confirmation that biotin binds sperm proteins .................................................................................. 89

4.5.3 Biotin-sperm co –incubation conditions ........................................................................................... 91

4.5.4 Sperm preparation affected biotin penetration ................................................................................. 94

4.5.5 Reagent analysis ............................................................................................................................. 96

4.5.6 Crucial step: Quench reaction.......................................................................................................... 98

4.5.7 Fixing sperm surface ....................................................................................................................... 98

4.5.8 Immunolocalization ........................................................................................................................ 100

4.5.9 Improved protocol .......................................................................................................................... 102

4.6 Discussion ............................................................................................................................................. 105

4.6.1 Internal protein labeling ................................................................................................................. 105

4.6.2 Paraformaldehyde ......................................................................................................................... 106

4.6.3 Future perspective ......................................................................................................................... 106

4.7 Acknowledgments ................................................................................................................................. 107

4.8 References ............................................................................................................................................ 108

Chapitre 5 Discussion générale ....................................................................................................................... 111

5.1 Implication générale de la recherche : .................................................................................................. 111

5.2 Étude sur les meilleures conditions afin de promouvoir et caractériser la capacitation des

spermatozoïdes équins in vitro ................................................................................................................... 111

5.2.1 Forces de l’étude ........................................................................................................................... 112

5.2.2 Faiblesses de l’étude ..................................................................................................................... 112

5.2.3 Perspectives futures ...................................................................................................................... 112

5.3 Étude sur l’optimisation d’un protocole d’isolement de protéines de surface des spermatozoïdes ....... 113

5.3.1 Forces de l’étude ........................................................................................................................... 113

5.3.2 Faiblesses de l’étude ..................................................................................................................... 113

5.3.3 Perspectives futures ...................................................................................................................... 114

Chapitre 6 Conclusion générale ...................................................................................................................... 115

Bibliographie .................................................................................................................................................... 117

XI

Liste des tableaux

Tableau 1.1: Composition de la membrane plasmique de différents mammifères (Darin-Bennett & White, 1977;

Gadella et al, 2001; Lynch, 1992). ...................................................................................................................... 8

Tableau 1.2: Glycoprotéines de la zone pellucide responsables réaction de l'acrosome (RA). ........................ 27

Table 2.1 : Comparison of the percentages of motile and progressively motile sperm during incubation for 6 h

in air-only (AO) and 5 % CO2 in air (CO2) atmospheres. ................................................................................... 42

Table 2.2: Rates of capacitated and spontaneously acrosome reacted sperm according to chlortetracycline

fluorescent patterns B and AR, respectively, during incubation in air-only (AO) and 5 % CO2 in air (CO2). ...... 46

Table 2.3: pH of NCM and CM with or without sperm during incubation in air-only (AO) and 5 % CO2 in air

(CO2) atmospheres. The initial pH of all samples was adjusted to 7.25. ........................................................... 48

Table 3.1: Comparison of the percentage of motile and progressively motile sperm during incubation for 6 h in

modified Whittens (MW) or modified TALP media composed with different sources of calcium, CaCl2 or lactic

acid hemicalcium salt. ....................................................................................................................................... 65

Table 3.2: Review of medium composition from significant articles on horse sperm capacitation .................... 72

Table 4.1: Pierce® solutions were hyperosmotic and composed of different reagents than the standard sperm

solution. ............................................................................................................................................................. 97

XIII

Liste des figures

Figure 1.1 : Structure d'un spermatozoïde équin. Figure adaptée avec la permission de Gadella et al, 2001. ... 3

Figure 1.2: Agencement de l'ADN des spermatozoïdes. Figure adaptée avec la permission de Miller et al,

2005. ................................................................................................................................................................... 5

Figure 1.3: Réaction de l'acrosome. Figure adaptée avec la permission d’Ellerman et al, 2006. ....................... 6

Figure 1.4:Schéma de la fécondation. Figure adaptée avec la permission de Gadella et al, 2001. .................... 7

Figure 1.5: Structure du flagelle. Figure adaptée avec la permission de Turner, 2003. .................................... 11

Figure 1.6: Épididyme de verrat. Figure adaptée avec la permission de Guyonnet et al, 2009. ....................... 12

Figure 1.7: Schématisation de la fécondation. Figure adaptée avec la permission de Flesh et Gadella, 2000. 26

Figure 1.8: Modèle de la réaction de l'acrosome chez la souris. Figure adaptée avec la permission de Flesch

et Gadella, 2000. ............................................................................................................................................... 28

Figure 2.1: Sperm incubated in 5 % CO2 in air demonstrated a more intense profile of tyrosine phosphorylated

proteins compared to sperm incubated in air only. A representative blot is shown. .......................................... 44

Figure 3.1: (Top) Western blots probed with phosphotyrosine antibody of proteins (from 5 x 106 sperm) before

or after 6 h of incubation (n=3). All lanes are on the same blot, but to facilitate visualization, irrelevant data

have been cut. A representative blot is shown. (Bottom) Ponceau red membrane staining of the same

immunoblot as measure of protein loading. ...................................................................................................... 67

Figure 3.2: Sperm internal calcium level (free Ca2+) varies between base media (mTALP and MW), calcium

source (CaCl2 and lactic acid hemilactate calcium) and condition (NCM = non-capacitating versus CM =

capacitating medium). ....................................................................................................................................... 69

Figure 4.1: Biotinylation according to the manufacturer’s instructions permits labeling of internal sperm

proteins. ............................................................................................................................................................ 88

Figure 4.2: Biotin binds sperm proteins. ............................................................................................................ 90

Figure 4.3: There is no difference in biotin penetration due to the duration of biotin-sperm co-incubation. ...... 92

Figure 4.4: Biotin- sperm co-incubation temperature influences subsequent percentage of disrupted sperm

membrane as assessed by eosin-nigrosin staining. Means ± SEM (n=3); a –SD (P ˂0.05). ........................... 93

Figure 4.5: Percoll washing increases membrane permeability as assessed by eosin-nigrosin staining. Means

± SEM (n=4);a –SD (P ˂0.06). .......................................................................................................................... 95

Figure 4.6: Quenching for either 30 min with 25 mM glycine or 30 sec with Tris-HCl was more effective at

preventing biotinylation of internal proteins than the proprietary quenching solution. Also, fixing sperm with

paraformaldehyde resulted in a significant reduced amount of labeling of α-tubulin by the biotinylation

procedure. ......................................................................................................................................................... 99

XIV

Figure 4.7: Pierce quenching solution concentration and incubation time does not affect the ability to prevent

biotinylation of internal proteins. As well, fixing the sperm with PFA definitely decrease labeling of internal

protein. .............................................................................................................................................................. 99

Figure 4.8: Immunolocalization of biotin demonstrates the impermeability of the improved biotinylation protocol.

........................................................................................................................................................................ 101

Figure 4.9: The biotinylation protocol is impermeable. .................................................................................... 103

Figure 4.10: Improved protocol does not label internal sperm protein. ............................................................ 104

XV

Liste des abréviations

ACs adénylyl cyclase soluble

ADN acide désoxyribonucléique

AGAB acide gamma-aminobutyrique

AMPc adénosine 3’,5’-monophosphate cyclique

ATP adénosine triphosphate

BSP protéine spermatique liante (Binder of SPerm protein)

COC complexe ovocyte-cumulus

FMP protéine mobile (Forward Mobility Protein)

GAPDS glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénases-S

GPI glycosylphosphatidylinositol-ancrée

HDL lipoprotéine de haute densité

kDa kilodalton

L-NAME N-omega-nitro-L-arginine méthyl ester

ODF Fibre dense externe (outer dense fibers)

PKA protéines kinases dépendantes de l'AMPc

PSA-FITC Agglutinine pisum sativum couplée avec la fluorescein isothiocyanate

(Pisum sativum agglutinin conjugated withc fluorescein isothiocyanate)

ROS dérivés actifs de l’oxygène (reactive oxygen species)

SDS-PAGE électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate

de sodium

ZP Zone pellucide

XVII

Remerciements

En premier lieu, je remercie Dr Janice Bailey d’avoir cru en mes capacités et m’avoir fait une place au sein de

sa formidable équipe de recherche malgré le peu de financement pour les projets équins. Je suis

particulièrement reconnaissante de sa disponibilité malgré un horaire chargé, ses discussions constructives,

ses conseils, son écoute, son leadership, sa capacité de faire briller son équipe et surtout son investissement

dans nos différentes présentations et articles.

Ensuite, je remercie M. Christian Lessard, professionnel de recherche du laboratoire, pour tout l’apprentissage

des techniques de laboratoire qu’il m’a offert. J’ai apprécié notamment sa patience, sa capacité de

vulgarisation, sa rigueur et sa bonne humeur.

Au niveau du Laboratoire de Fonction Spermatique et Toxicologie, je remercie tous mes collègues qui sont

devenus des amis au fils du temps. Particulièrement, Geneviève pour sa grande persévérance et Clotilde pour

sa détermination sans faille.

Mon projet de recherche m’a permis de rencontrer des personnes extraordinaires tant au département des

sciences animales de l’Université Laval qu’à la section Theriogenology de la Faculté de Médecine Vétérinaire

de l’université Texas A & M. J’ai adoré travailler avec vous tous et particulièrement avec Sheila Teague, Dr

Charles Love, Dr Terry Blanchard et Dr Dickson Varner qui m’ont appris énormément sur la gestion des

étalons.

Je remercie tous ceux qui de près ou de loin m’ont encouragé à terminer ce mémoire au travers de différentes

motivations, encouragements et même d’épreuves. Vous saurez vous reconnaitre. Merci!

Finalement, je remercie mes parents pour leur support inconditionnel. Merci d’avoir cru en moi parfois plus que

la principale intéressée. Vos précieux encouragements et motivations m’ont permis de continuer malgré les

épreuves et embûches.

La section porcine de ce mémoire a été en partie supportée par le Conseil de recherches en sciences

naturelles et en génie du Canada. La section équine en sol texan du projet a été rendu possible grâce à une

bourse de stage à l’étranger du Réseau Québécois en Reproduction.

Je remercie le Réseau Québécois en Reproduction-FONCER, ainsi que le Centre en Biologie de la

Reproduction pour leurs bourses d’études.

XIX

Avant-propos

Ce mémoire contient trois chapitres rédigés sous forme d'article scientifique.

Je suis l’auteur principal des articles portant les titres « Comparison of two incubation condition to promote

horse sperm capacitation in vitro » et « Comparison of different media to promote horse sperm capacitation in

vitro ». Les coauteurs de ces articles sont les chercheurs J. L. Bailey, K. Hinrinchs, C. L. Love, D. D. Varner et

les professionnels de recherche S. Teague et C. Lessard. Toutes ces personnes se sont impliquées dans les

travaux. Ces articles seront soumis pour publication dans une revue scientifique.

Je suis l’auteur principal de l’article portant le titre « Optimization of sperm surface protein isolation using

biotinylation in boar » et les coauteurs sont la chercheuse J. L. Bailey et le professionnel de recherche C.

Lessard. Toutes ces personnes se sont impliquées dans les travaux. Cet article a été présenté sous forme

d’affiche au congrès annuel de l’American Society for Andrology à Montréal en 2011.

1

Introduction

Les spermatozoïdes de mammifères nécessitent une maturation dans le tractus génital femelle à la suite de

l’éjaculation afin d’acquérir le pouvoir de féconder l’ovule. Cette étape, nommée capacitation, englobe

l’ensemble des évènements rendant les spermatozoïdes féconds.

Le cheval est reconnu pour avoir une reproduction capricieuse. Les spermatozoïdes équins ne font pas bande

à part de leur espèce; plusieurs problématiques leurs sont reprochés. D’abord, la survie des spermatozoïdes

suite à la cryoconservation de la semence équine est plutôt faible. Ensuite, plusieurs étalons pur-sang anglais

sont considérés infertiles dû à une incapacité de leurs spermatozoïdes de subir la réaction de l’acrosome dans

le tractus de la jument. Leurs taux de fertilité sont dramatiquement bas. Finalement, les spermatozoïdes

subissent mal la capacitation rendant la fécondation in vitro impossible chez le cheval. La compréhension des

difficultés de cette espèce passe par l’étude de la capacitation équine.

Bien que plusieurs chercheurs de renommées mondiales en reproduction masculine font de la recherche

subventionnée au Québec, aucun fond n’est disponible pour le genre de travail traité dans ce mémoire et ce,

malgré plusieurs tentatives de financement. J’ai donc effectué une partie de mes expériences à l’international

au sein de l’Université Texas A&M afin de poursuivre les objectifs initiaux de ce mémoire. Ce stage m’a permis

d’utiliser des ressources matérielles et humaines à la fine pointe de la technologie et également d’apprendre

de techniques non-disponibles au Québec.

Comme la semence équine est difficilement disponible au Québec, j’ai utilisé la semence porcine pour bâtir

mon modèle. La semence porcine et équine ont des problématique et des caractéristiques semblables, soit la

fécondation in vitro est très difficile, ils sont sensibles à la cryoconservation, leur capacitation in vitro est peu

régulée et la composition de leur membrane est similaire.

Ce mémoire porte d’abord en revue les travaux antérieurs sur les caractéristiques des spermatozoïdes des

deux espèces étudiées en s’attardant plus particulièrement sur la capacitation.

Les deux premiers chapitres de recherche porte sur les études effectuées en stage avec le cheval avec la

précieuse collaboration de l’Université Texas A&M et du département de Theriogenology.

Le troisième chapitre mettra l’accent sur les étapes menant à un protocole optimisé d’isolation de protéines de

surface de spermatozoïdes en utilisant un ensemble commercial de biotinylation.

3

Chapitre 1 Revue de littérature

1.1 Anatomie des spermatozoïdes

L’anatomie est directement reliée avec la fonction d’un organe en particulier. La conception de son activité

passe par la compréhension de sa conformation. Cette section servira à décrire la structure des différentes

parties du spermatozoïde de mammifères et ensuite établir leur fonctionnement. Grossièrement, le

spermatozoïde est structurellement divisé en trois sections, soit la tête, la pièce intermédiaire et le flagelle

(Figure 1.1). Le tout étant enveloppé d’une membrane plasmique ayant une composition lipidique et

glycoprotéique variant d’une région à l’autre amenant ainsi la notion de domaine membranaire (Yanagimachi,

1994).

1.1.1 La tête

La tête du spermatozoïde de mammifères est composée de deux organelles principales, soit le noyau et

l’acrosome, avec le tout englobé par la membrane plasmique. Le rôle de la tête est de permettre les

Tête

Pièce

intermédiaire

Flagelle

Figure 1.1 : Structure d'un spermatozoïde équin. Figure adaptée avec la permission de

Gadella et al, 2001.

4

interactions avec l’oviducte et l’ovocyte comme la reconnaissance de l’ovocyte, l’ancrage à ce dernier afin de

permettre la fécondation et l’abritement du génome paternel (Shapiro et al, 1980).

1.1.1.1 Le noyau

Le noyau est directement relié à la fonction principale du spermatozoïde soit d’apporter le patrimoine

génétique mâle à l’ovule afin de créer un nouvel être génétiquement différent à partir de gamètes haploïdes

mâle et femelle. La structure de la chromatine à l’intérieur du noyau est très importante afin d’assurer l’intégrité

du génome paternel (Andrabi, 2007).

L’acide désoxyribonucléique (ADN) du spermatozoïde est compacté avec un agencement d’histones et de

protamines afin d’obtenir une forme très dense, six fois plus compacte que les chromosomes mitotiques

(Fuentes-Mascorro et al, 2000). Le premier type de structure est composé de 146 paires de bases enroulées

autour d’un octamère d’histones, il s’agit du nucléosome. La structure principale des bases est plutôt

composée de petites protéines nucléaires riches en arginine et en cystéine soient les protamines (Byun et al,

2000). Avec un poids moléculaire entre 5 à 8 kDa comparativement entre 10 à 20 kDa pour les histones, les

protamines remplacent la majorité des histones au stade haploïde de la spermatogénèse. Il s’agit d’une forme

plus condensée que le nucléosome (Oliva, 2006).

Jusqu’à maintenant, chez une grande partie des mammifères, on a identifié deux types de protamines

différentes soient P1 et P2 (Oliva, 2006). Ces deux petites protéines nucléaires riches en arginines sont

observées chez l’étalon tandis que l’on observe seulement P1 chez le verrat (Andrabi, 2007). Les protamines

se compactent afin de former un agencement en forme de boucle (Krawetz, 1996; Shaman et al, 2007). Ces

boucles sont attachées à des protéines de la matrice du noyau (Figure 1.2) (Shaman et al, 2007). Cette

matrice possède un rôle essentiel à la formation du pronoyau lors de la fécondation (Krawetz, 1996; Shaman

et al, 2007).

Afin de diminuer les risques de déroulement de la chromatine, en théorie, la membrane nucléaire du

spermatozoïde n’aurait pas de pores (Krawetz, 1996). Cependant, certaines recherches ont démontré qu’une

partie de la membrane nucléaire en direction de la pièce intermédiaire possèderait des pores, qui peuvent

théoriquement servir à libérer de nouvelles protéines (Miller et al, 2005).

5

Sous cette forme très condensée, la chromatine ne peut pas être transcrite. Toutefois, dans la partie basale du

noyau, il existe un petit espace de chromatine non condensée qui peut théoriquement subir la transcription

(Miller et al, 2005). Par contre, sans organite traditionnellement associé à la traduction de protéines et sans

avoir confirmé la fonction de ces protéines, ces études demeurent controversées.

L’espace qui lie la membrane nucléaire à la membrane interne de l’acrosome possèderait un rôle important

dans la fusion avec l’oolème (Pesch & Bergmann, 2006). La viscosité de cet espace faciliterait l’adhésion avec

l’oolème afin de rendre l’injection du génome paternel du noyau à l’ovocyte possible (Fawcett, 1970).

1.1.1.2 L’acrosome

L’acrosome est une organelle englobant une partie de la tête du spermatozoïde. Il est situé au-dessus du

noyau et en dessous de la membrane plasmique au niveau de la région apicale de la tête du spermatozoïde et

est composé d’une membrane interne et externe (Litscher, 2008; Pesch & Bergmann, 2006). L’acrosome

possède un rôle primordial dans la fécondation.

L’ovocyte mature est bien protégé par sa zone pellucide, une couche épaisse de cellules de granulosa et par

des cellules folliculaires voisines créant le complexe ovocyte-cumulus. Ce dernier est enveloppé par une

matrice composée de polymères d’acide hyaluronique (Talbot & Riveles, 2005).

La fonction ultime du spermatozoïde étant d’apporter la génétique paternelle au gamète femelle, lors de son

approche, de multiples fusions entre la membrane externe de l’acrosome et la membrane sous adjacents soit

Figure 1.2: Agencement de l'ADN des spermatozoïdes. Figure adaptée avec la permission

de Miller et al, 2005.

6

la membrane plasmique de la tête du spermatozoïde ce qui déclenchent la réaction acrosomale, un

événement exocytotique essentiel à la fécondation (Ikawa et al, 2010; Kim et al, 2008; Yanagimachi, 2011).

Il est admis que le contact physique et chimique entre les deux porteurs de génome, l’ovocyte et le

spermatozoïde, sont nécessaires afin de permettre la liaison entre la membrane externe de la surface du

spermatozoïde (membrane interne de l’acrosome), une fois exposé suite à la désintégration de l’acrosome

(Figure 1.3), et la membrane externe de l’ovocyte permettant la fécondation (Yanagimachi, 1994;

Yanagimachi, 2011).

Selon le dogme classique, (Evans & Florman, 2002) la séquence des événements menant à la fécondation est

décrite comme suite :

1) d’abord la liaison avec la zone pellucide;

2) ensuite la réaction de l’acrosome;

3) suivie de la fusion de la membrane de l’oolème et de la surface du spermatozoïde;

4) l’injection du génome paternel (Figure 1.4).

Figure 1.3: Réaction de l'acrosome. Figure adaptée avec la permission

d’Ellerman et al, 2006.

7

Figure 1.4:Schéma de la fécondation. Figure adaptée avec la permission de Gadella et al,

2001.

Cette chronologie est de plus en plus questionnée. Récemment, une étude a démontré que la réaction de

l’acrosome débute durant la pénétration du cumulus chez les spermatozoïdes de souris (Hirohashi et al,

2011). Le mécanisme de la réaction de l’acrosome sera vu en détail dans une section ultérieure.

L’acrosome permet de conserver son contenu qui, une fois libéré, digérera et morcellera en partie le complexe

ovocyte-cumulus. Son contenu est principalement composé d’enzymes hydrolytiques comme l’hyaluronidase

retrouvée communément chez les spermatozoïdes de mammifères, d’insectes, des sangsues et les bactéries

(Kim et al, 2008). L’acrosome contient également des glycohydrolases, des protéases, des estérases, des

acides phosphatases et des aryles sulfatases (Abou-Haila, 2000). Principalement, trois enzymes sont

impliquées dans la pénétration de la zone pellucide : l’acrosine, une sérine protéase, TESP5, également une

8

sérine protéase glycosylphosphatidylinositol-ancrée (GPI) dans la membrane spermatique et une protéosome

(Kim, et al, 2008). Aussi, l’acrosome contient l’antigène de l’acrosine soit la proacrosine précurseur de cette

dernière et possède un rôle majeur dans la fusion et la pénétration de l’oolème (Sun et al, 2011).

1.1.1.3 La membrane plasmique

La membrane plasmique du spermatozoïde est composée d’une bicouche lipidique faite d’un mélange

hétérogène de stérols, de phospholipides et de glycolipides (Apel-Paz, 2003; Gadella et al, 2008). Le

cholestérol est de loin le stérol le plus abondant de la membrane. Sa présence permet de garder la stabilité de

la membrane grâce à sa colonne non flexible et plate (Apel-Paz, 2003). Les éléments de la membrane

diffèrent très peu entre les principales parties du spermatozoïde soit la tête, la pièce intermédiaire et le flagelle

cependant chaque domaine possède son agencement qui lui est propre (Apel-Paz, 2003; Christova et al,

2004; Flesch & Gadella, 2000; Gadella & Evans, 2011). La perte de cholestérol, le remaniement ainsi que

l’adsorption de protéines et de lipides sont des caractéristiques de la maturation des spermatozoïdes soit dans

l’épididyme et dans le tractus femelle (Flesch & Gadella, 2000). La composition lipidique de la membrane

diffère un peu selon les espèces (Tableau 1.1).

Tableau 1.1: Composition de la membrane plasmique de différents mammifères (Darin-

Bennett & White, 1977; Gadella et al, 2001; Lynch, 1992).

Espèce Phospholipides Glycolipides Cholestérols Ratio cholestérol sur

phospholipides

Cheval 57 % 6,8 % 37 % 0,36

Verrat 67 % 8 % 25 % 0,26

Taureau 69 % 8 % 31 % 0,45

On remarque que le ratio cholestérol sur phospholipides diffère d’une espèce à l’autre (Gadella et al, 2001).

Un ratio élevé démontre une susceptibilité à mieux résister à la congélation donc la semence de taureau est

plus apte à survivre à la cryoconservation (Bailey et al, 2000).

Une particularité intéressante est que la membrane plasmique des spermatozoïdes de cheval possède un taux

très élevé en acides gras 22:5 dans la fraction phosphoglycérolipides tandis que les autres mammifères

9

possèdent un taux très élevé en acide gras 22:6 (Gadella et al, 2001). La quantité de ce dernier est

positivement corrélée avec la motilité ainsi que la viabilité chez les spermatozoïdes porcins (Cerolini et al,

2006). Pour le moment, aucune étude ne confirme que le pourcentage d’acide gras 22:6 ou de 22:5 est relié

avec la motilité ou la viabilité chez l’étalon. Somme toute, le pourcentage total membranaire de ces deux types

d’acide gras est sensiblement la même chez ces deux espèces.

La membrane plasmique du spermatozoïde est composée d’une mosaïque de domaines avec des distinctions

régionales selon sa constitution en lipide et en glycoprotéine (Pesch & Bergmann, 2006). De plus, les

interactions lipides-lipides et lipides-protéines différentes participent également au concept de la spécificité

interrégionale (Parks & Graham, 1992). Comparativement aux parois membranaires des autres cellules, la

diffusion des composantes interrégionales est très faible afin de maintenir la bonne fonction spécifique de la

région (Apel-Paz, 2003). Cette compartimentisation est supportée par des protéines intermembranaires

stationnaires qui empêchent la diffusion au deçà du domaine (Parks & Graham, 1992). Également, la

membrane est composée de microdomaines composés de sphingomyléine, de cholestérol et de protéines

ancrées au glycosylphosphatidylinositol (GPI). Ces microdomaines sont nommés radeaux lipidiques (Girouard

et al, 2008). Leur fonction en lien avec la distribution des protéines membranaires, l’activation de récepteurs et

initiateur de voie de signalisation cellulaire (Girouard et al, 2008).

La littérature concernant les protéines membranaires seront approfondies dans la section sur la maturation

épididymaire.

1.1.2 La pièce intermédiaire

Le flagelle du spermatozoïde peut être divisé en trois parties soit la pièce intermédiaire, la pièce principale et

la pièce terminale. Dans cette revue, il sera principalement abordé la pièce intermédiaire et le flagelle, incluant

la pièce terminale et la pièce principale.

La pièce intermédiaire est partiellement séparée de la pièce principale soit le flagelle par l’annulus. Ce dernier

semble avoir pour fonction d’établir une barrière pour empêcher la diffusion latérale (Kwitny et al, 2010).

Comme discuté précédemment, certaines protéines qui circulent librement dans la membrane sont confinées

à certains domaines spécifiques (Kwitny et al, 2010).

La pièce intermédiaire ainsi que le flagelle collaborent afin de produire le mouvement rendant ainsi le

spermatozoïde motile. La fonction principale de la pièce intermédiaire est de générer l’énergie nécessaire au

mouvement du flagelle (Kwitny et al, 2010). La rangée de six mitochondries de forme hélicoïdale entourant les

10

composantes de la pièce intermédiaire (Olson & Winfrey, 1990) produit l’adénosine monophosphate cyclique

(AMPc) à partir de l’adénosine triphosphate (ATP) avec l’action de l’adénylyl cyclase (Shi et al, 2008).

Il est important de noter qu’une autre voie produit aussi de l’énergie. Des souris mâles avec le gène désactivé

pour l’enzyme glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase-S (GAPDS) sont infertiles dû à une faible motilité

de leurs spermatozoïdes (Miki et al, 2004). Somme toute, la consommation mitochondriale d’oxygène était

normale, mais le niveau de l’ATP était près de 90 % plus faible que les spermatozoïdes de souris normales

(ayant le gène GAPDS actif) démontrant que l’énergie nécessaire à la motilité est produite d’autant plus par la

glycolyse que par la phosphorylation (Miki et al, 2004). En lien avec cette constatation, une source alternative

d’ATP est une excellente option étant donné que la localisation des mitochondries ne permettent pas de

rendre disponible de l’ATP dans toute la longueur du flagelle.

En conséquence, ces études laissent envisager que le rôle des mitochondries ne serait pas seulement de

fournir l’énergie nécessaire, mais aussi d’apporter de l’ADN paternel lors de la fécondation. Cette fonction est

très mitigée dans le monde scientifique (Miller et al, 2005).

La structure interne de la pièce intermédiaire est sensiblement la même que celle du flagelle qui sera vu dans

la prochaine section.

1.1.3 La pièce principale : le flagelle

Le rôle principal du flagelle est de procurer la locomotion au spermatozoïde le rendant apte à se mouvoir, mais

surtout à subir l’hyperactivation. La structure principale est l’axonème. Elle est composée par un anneau de

neuf doublets entouré par une paire centrale de doublets nommé microtubule (Figure 1.5) (Turner, 2003). Les

microtubules sont continus tout au long du flagelle.

Les doublets autour des microtubules sont maintenus par des bras de dynéines internes et externes qui les

poussent et rétractent créant ainsi le mouvement. Cela se traduit par le battement du flagelle (Figure 1.5)

(Turner, 2003). Les doublets externes sont aussi reliés entre eux ainsi qu’aux microtubules internes (Turner,

2003). L’axonème est recouvert par la gaine mitochondriale, dans la pièce intermédiaire, les fibres denses

externes (ODF; « Outer Dense Fibers ») et la gaine fibreuse (Figure 1.5) (Cao et al, 2006). Chaque structure

est formée par un mélange hétérogène de polypeptides comme le α et la β tubuline et les tektines (Cao et al,

2006).

11

Le mouvement est créé à partir de la phosphorylation de la dynéine qui active l’ATPase. L’hydrolyse de l’ATP

est convertie en force qui permet aux microtubules de glisser l’un contre l’autre. La vitesse de l’hydrolyse de

l’ATP est d’environ 50 ATP par seconde. La déphosphorylation de la dynéine par une phosphatase, soit la

calcineurine, renverse le processus (Turner, 2003).

Figure 1.5: Structure du flagelle. Figure adaptée avec la permission de Turner, 2003.

12

1.2 La maturation des spermatozoïdes

Après leur formation dans les tubules séminifères, les spermatozoïdes sont parfaitement formés, mais ils ne

possèdent pas la motilité ni le pouvoir fécondant. Afin de pouvoir féconder un ovocyte, ils doivent subir une

série de changements tant au niveau biologique que fonctionnel. Cette maturation à lieu en deux temps soit

lors du transit dans l’épididyme et du transit dans le tractus femelle.

1.2.1 L’épididyme

1.2.1.1 Structure

L’épididyme est un organe clé dans la maturation des spermatozoïdes ainsi que dans leur entreposage

(Ecroyd et al, 2009). Composé d’un long tube circonvolué, l’épididyme est divisé en trois segments soient la

tête ou caput, le corps ou corpus et la queue ou cauda (Figure 1.6) (Guyonnet et al, 2009). À l’entrée du rete

testis dans les canaux efférents les spermatozoïdes sont structurellement formés, mais ils sont toujours

immotiles et infertiles (Hunnicutt et al, 1997).

Figure 1.6: Épididyme de verrat. Figure adaptée avec la permission de Guyonnet et al, 2009.

Caput

Corpus

Cauda

13

1.2.1.2 Fonction

Le transit dans l’épididyme permet aux spermatozoïdes d’acquérir le potentiel de la motilité, le pouvoir de

reconnaître la zone pellucide, de s’y lier et de fusionner avec l’ovocyte (Belleannée et al, 2011). Bien que suite

au passage dans l’épididyme, les spermatozoïdes ont le pouvoir de bouger, ils restent immobiles jusqu’à

l’éjaculation (Dacheux et al, 2005; Dacheux et al, 2003; Guyonnet et al, 2009; Yanagimachi, 1994).

Cependant, si ces derniers sont récupérés dans la partie cauda de l’épididyme et incubés dans un milieu

approprié, ils démontrent une excellente motilité in vitro comparativement à ceux récupérés dans la partie

caput (Cornwall, 2009). De plus, les spermatozoïdes du cauda sont aptes à réactés leur acrosome en

présence d’ionophore de calcium fait qui n’est pas observé avec ceux provenant du caput (Cornwall, 2009;

Yeung & Cooper, 2002).

1.2.1.3 Synthèse de protéines par l’épithélium épididymaire

L’environnement de l’épididyme influence grandement la fonction spermatique. Notamment, l’épithélium est

très actif au niveau de la sécrétion de protéines. Bien que peu de protéines différentes représentent la majorité

des protéines excrétées, la composition diffère d’une espèce à l’autre (Dacheux et al, 2003).

Les sécrétions protéiques de l’épithélium de l’épididyme sont très élevées dans la section caput et diminuent

progressivement tout au long du trajet épididymaire (Dacheux et al, 2003; Syntin et al, 1996).

1.2.1.4 Modification protéique membranaire des spermatozoïdes

Une des premières étapes de la maturation épididymaire est les modifications des protéines membranaires

des spermatozoïdes. Ce remaniement se traduit par des pertes, des adsorptions et des modifications de

protéines membranaires (Flesch & Gadella, 2000).

Les protéines épididymaires modifiant la membrane des spermatozoïdes peuvent être classées en trois

catégories de liaisons soit celles qui sont liées par une faible affinité, celles par des liens électrostatiques et

celles qui sont intrinsèques. Elles seront détaillées dans les prochaines lignes.

Les protéines épididymaires liées par faible affinité aux spermatozoïdes sont facilement enlevées avec un

traitement dans un milieu isotonique. Cette addition protège les sites de liaison des spermatozoïdes afin

d’empêcher l’activation des récepteurs avant le moment opportun (Dacheux et al, 2003).

14

Les protéines épididymaires très faiblement liées aux spermatozoïdes le sont par liaison électrostatique. Dans

cette catégorie, les principales protéines sont la lactoferrine, la clustérine et la glutathionne peroxydase

(Dacheux et al, 2003). La lactoferrine est généralement associée au transport du métal, mais elle possède

aussi des propriétés antivirales, antibactériennes, anti-inflammatoires et antimycotiques. La clustérine possède

un rôle dans le nettoyage des débris et l’apoptose des cellules tandis que la glutathionne peroxydase protège

l’organisme contre les dommages oxydatifs (Belleannée et al, 2011).

Finalement, les protéines épididymaires intégrées à la membrane spermatique ne peuvent pas être dissociées

avec le pouvoir isotonique. Plusieurs de ces protéines sont glycosylphosphatidylinositole-ancrées (GPI). Dans

le cadre des protéines standards GPI-ancrées, celles-ci sont normalement formées par la liaison du peptide

signal de la GPI-liée dirigée vers le réticulum endoplasmique du spermatozoïde. Tandis que sa queue

hydrophobe (C-terminal) ne peut pas pénétrer la membrane, une partie de la molécule reste à l’extérieur.

Ensuite, la liaison C-terminal est clivée et remplacée par la GPI-ancrée. Cette dernière est transférée par

vésicule au travers de l’appareil de Golgi pour finalement être trappée au travers la membrane. Cependant,

certaines protéines épididymaires des spermatozoïdes de surface sont GPI-ancrées, fait qui ne peut pas être

expliqué par la littérature classique sur la GPI-ancrée. Cependant, il est possible in vitro d’incorporer des

protéines aux spermatozoïdes épididymaires avec l’aide des épididymosomes (Sullivan et al, 2007).

1.2.1.4.1 Les épididymosomes

Ces vésicules sont sécrétées par l’épithélium de l’épididyme et elles se collent au réticulum endoplasmique

des spermatozoïdes. Elles ont été décrites pour la première fois par Yanagimachi et à l’aide du microscope

électronique en 1985, et elles ont été nommées épididymosomes en 2002 (Sullivan et al, 2007). Elles ont un

diamètre variant de 50 à 500 nanomètres et ont un ratio très élevé cholestérol sur phospholipides, dont la

sphingomyéline est la principale composante (Yanagimachi, 1994). Étant donné l’importance de la surface des

spermatozoïdes pour son rôle initiateur de la signalisation cellulaire, d’échange avec le milieu ainsi que

d’entrée des composantes; l’étude des fonctions exactes des épididymosomes demeure un élément clé dans

la compréhension de la maturation épididymaire des spermatozoïdes (Sullivan et al, 2007).

1.2.1.5 Acquisition de la mobilité

Un des principaux impacts de la maturation épididymaire des spermatozoïdes est la capacité d’acquérir la

motilité. En effet, à son entrée dans le caput l’épididyme le spermatozoïde n’a pas la faculté de se mouvoir

15

contrairement à ceux extraits de la partie cauda finale de l’épididyme. Cette acquisition s’explique par des

modifications protéiques ainsi que par l’impact des composants de son environnement.

1.2.1.5.1 Aspect protéique

Jusqu’à ce jour, l’acquisition de la mobilité des spermatozoïdes dans le transit épididymaire a été associée à

deux protéines spécifiquement. D’abord, il y a la Forward Mobility Protein (FMP) ainsi que l’immobiline. Dans

les prochaines lignes, elles seront décrites succinctement.

1.2.1.5.1.1 Forward Mobility Protein

Couramment nommée FMP, cette protéine de 37 kDa fut décrite en 1978 par Acott et Hopkins (Saha et al,

2009). Elle fut retrouvée dans le plasma séminal ainsi que dans l’épididyme de différentes espèces comme le

bovin, le porcin, l’humain, le caprin et d’autres. Son action se décrit par l’induction de la motilité progressive

des spermatozoïdes, soit le mouvement flagellaire ayant une direction rectiligne (Cooper et al, 2010; Saha et

al, 2009). Cette protéine est produite par l’épithélium épididymaire et travaille de concert avec l’adénosine

monophosphate cyclique. En présence d’inhibiteur de cette dernière, la FMP ne peut pas exercer son rôle

d’initiateur de la motilité progressive. Son action serait d’augmenté le niveau d’adénosine monophosphate

cyclique interne du spermatozoïde (Saha et al, 2009).

1.2.1.5.1.2 Immobiline

Cette protéine ressemblant à du mucus a pour rôle d’empêcher les spermatozoïdes de bouger dans

l’épididyme en créant un environnement très visqueux (Usselman & Cone, 1983). Cette grosse glycoprotéine

est principalement retrouvée dans la partie cauda de l’épididyme du rat (Usselman & Cone, 1983). Son effet

est purement physique, sa liaison avec les spermatozoïdes les empêche de se mouvoir et sa présence rend le

milieu considérablement visqueux. Lors de l’éjaculation, les spermatozoïdes mélangés avec le plasma séminal

se départissent de l’immobiline aidant à l’activation de la motilité (Robaire & Hinton, 2002; Usselman & Cone,

1983).

1.2.1.5.2 Aspect environnemental

Le milieu avec lequel le spermatozoïde interagit a un grand impact sur l’acquisition et l’initiation de la motilité.

D’abord, le pH interne des spermatozoïdes augmente tout au long de son transit dans l’épididyme (Kirichok &

16

Lishko, 2011; Yeung & Cooper, 2002). Le pH interne du spermatozoïde est contrôlé en partie par le pH

externe du milieu ainsi que l’activité de la pompe à proton.

D’abord, le niveau de calcium intracellulaire est six fois plus élevé dans le caput comparativement au cauda.

Malgré le fait qu’un faible niveau de calcium seulement ne puisse pas inhiber la motilité, il est bien établi que

cela cause un battement flagellaire asymétrique en lien avec la régulation de la calmoduline (Yeung & Cooper,

2002).

De plus, les spermatozoïdes du caput démontrent un niveau plus élevé d’AMPc ainsi qu’une activité plus

intense de l’adénylyl cyclase. L’importance de l’AMPc et de la phosphorylation des protéines au niveau de la

motilité des spermatozoïdes ont été bien décrites dans la littérature (Yeung & Cooper, 2002). La réponse à

l’ajout d’AMPc aux spermatozoïdes a été modulée en fonction de leur provenance dans l’épididyme. Les

spermatozoïdes extraits du cauda de l’épididyme ont eu une réponse beaucoup plus élevée à l’ajout d’AMPc

que ceux provenant du caput (Aitken et al, 2007).

Encore est-il que les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant dans leur passage dans l’épididyme,

faut-il qu’ils restent immobiles jusqu’à l’éjaculation afin d’être efficaces. Donc, certains facteurs s’assurent que

les spermatozoïdes restent en état de dormance durant leur stockage dans l’épididyme.

D’abord, le milieu épididymaire est hyperosmotique dû à la grande quantité de sorbitol empêchant ainsi les

spermatozoïdes d’être motiles. Aussi, la membrane plasmique est difficilement perméable au sorbitol. Donc, il

ne peut ne pas être utilisé comme source d’énergie privant ainsi les spermatozoïdes. Cependant vers la fin du

passage dans l’épididyme, le sorbitol est oxydé en fructose, source d’énergie perméable à la membrane

plasmique donc disponible aux spermatozoïdes (Caballero et al, 2011). Également, la faible concentration de

bicarbonate et le pH faible assurent de garder les spermatozoïdes en état de quiétude et d’achever leur

maturation (Chan et al, 1995).

1.2.1.6 Acquisition du pouvoir fécondant

L’épididyme permet également la maturation des spermatozoïdes afin d’acquérir le pouvoir fécondant. Un plus

grand pourcentage des spermatozoïdes récupérés de sections les plus près du cauda de l’épididyme ont

atteint le pouvoir de féconder un ovocyte suite à une maturation adéquate dans un milieu capacitant. Aussi,

les spermatozoïdes immatures ne sont pas aptes à subir la réaction de l’acrosome même en présence d’influx

de calcium (Sostaric et al, 2008). Ces modifications sont principalement de l’ordre membranaire et seront

détaillées dans les prochaines lignes.

17

1.2.1.6.1 Aspect membranaire

La composition des acides gras membranaires des spermatozoïdes est modifiée lors du transit épididymaire

avec une augmentation de la proportion d’acides gras polyinsaturés changeant la fluidité de la membrane

plasmique (Saez et al, 2011). Le changement de la fluidité de la membrane serait associé aux changements

menant à l’acquisition du pouvoir fécondant (Saez et al, 2011).

L’apparition de certaines protéines phosphorylées en tyrosine sur les spermatozoïdes durant le transit telles

que celles régulées par le glucose, la protéine « Heat-Shock 70 », l’actine, β-tubuline, l’acide lactique

déshydrogénase et des protéines mitochondriales démontrent une partie de l’acquisition du pouvoir fécondant

(Aitken et al, 2007). Cependant, aucune protéine en particulier n’est directement associée à l’acquisition du

pouvoir fécondant. Il s’agit plutôt d’un concept d’activation, de modifications structurales de certaines

protéines, d’apparition de récepteurs membranaires et finalement l’addition des toutes ces changements qui

permet aux spermatozoïdes de subir la capacitation et ainsi ultimement partager son génome avec un ovule

(Aitken et al, 2007; Cornwall, 2009; Sullivan et al, 2007; Turner, 2011; Yeung & Cooper, 2002; Zuo et al,

2011).

De la réabsorption des fluides testiculaires ainsi que du sodium, de l’excrétion de potassium et de chlore et de

l’acidification créant un entreposage idéal, l’épididyme est une étape clé pour la préparation des

spermatozoïdes à leur grande finalité (Chan et al, 1995; Zuo et al, 2011).

18

1.3 Éjaculation

Lors de l’éjaculation, les spermatozoïdes stockés dans la partie cauda de l’épididyme se mélangent avec les

différentes sécrétions provenant des glandes du système reproducteur mâle; le plasma séminal et sont

expulsés dans le tractus femelle.

L’éjaculation est composée d’une série de trois fractions distinctes soient la fraction pré-éjaculatoire, la fraction

riche en spermatozoïdes et finalement la fraction post riche en spermatozoïdes.

La fraction pré-éjaculatoire est composée principalement par les sécrétions des glandes urétrales et bulbo-

urétrales permettant ainsi de nettoyer l’urètre du mâle et de rendre le tractus cervical plus alcalin favorisant la

survie des spermatozoïdes

La fraction riche en spermatozoïdes comme son nom l’indique est composée principalement de

spermatozoïdes tandis que la fraction post riche en spermatozoïdes ne contient que très peu de

spermatozoïdes, mais plutôt des sécrétions de vésicules séminales, de la prostate et vers la fin de l’éjaculation

des sécrétions gélatineuses des glandes bulbo-urétrales (Rodríguez-Martínez et al, 2005).

1.3.1 Le plasma séminal

La provenance du plasma séminal du verrat diffère quelque peu de celui de l’étalon étant donné qu’ils

possèdent un agencement de glandes accessoires semblables soit les glandes bulbo-urétrales, l’ampoule, les

vésicules séminales et une prostate (Edwards, 2008; Rodríguez-Martínez et al, 2005). Cependant, l’étalon

possède une ampoule très élargie contrairement au verrat. Quand à ce dernier, il possède une prostate très

développée (Edwards, 2008; Rodríguez-Martínez et al, 2005).

Le plasma séminal a pour rôle d’abord de fournir l’énergie nécessaire aux spermatozoïdes afin de parcourir le

trajet jusqu'à l’ovule. Aussi, il permet de diluer les gamètes dans un environnement plus accueillant que le

tractus femelle favorisant la survie des spermatozoïdes. De plus, la teneur du plasma séminal en

prostasomes, de petites vésicules contenant du cholestérol, permet de maintenir l’état non-capacitants des

spermatozoïdes jusqu’à l’enlèvement de ces prostasomes (Sostaric et al, 2008). De plus, il favorise l’activation

de la motilité ainsi facilite la migration dans le tractus en provoquant des contractions des muscles lisses de

l’endomètre de la femelle grâce aux cytokinines et aux prostaglandines du plasma séminal (Robertson, 2007).

Lors de ce transit dans le tractus femelle, les spermatozoïdes vont murir une seconde fois afin d’acquérir le

pouvoir de se lier à la zone pellucide et de féconder l’ovule. Cette étape clé de la procréation est nommée

capacitation.

19

1.4 La capacitation

On décrit la capacitation comme toutes les transformations que subissent les spermatozoïdes dans le tractus

femelle suite à l’éjaculation pour les rendre féconds (Yanagimachi, 1994). Chez certaines espèces,

notablement la souris, l’homme et le bovin, la capacitation pourrait aussi être réalisée in vitro (De Jonge, 2005;

Gwatkin et al, 1974; Iritani & Niwa, 1977).

Ce phénomène a été observé pour la première fois en 1951, et ce dans deux laboratoires indépendants soit

celui de Collin Russell Austin et de Min Chueh Chang. Ces chercheurs ont observé que les spermatozoïdes

doivent séjourner dans le tractus femelle suite à l’éjaculation un certain nombre d’heures afin de pouvoir

féconder un ovule. Le 23 août 1952, Austin publia dans la revue Nature : « Capacitation of mammalian

spermatozoa » d’où le terme capacitation fut utilisé pour la première fois.

Dans les années 70, les travaux de John Michael Bedford ont fortement contribué à la compréhension et

l’étude des phénomènes décrivant la capacitation. À l’aide du microscope électronique, il démontra que les

spermatozoïdes capacités n’ont pas de changement morphologique ou de différences visuelles avec ceux qui

ne sont pas capacités (Bedford, 1970). Bedford a également démontré que la capacitation est différente d’une

espèce à l’autre (Bedford, 1970). Chez certaines espèces, il observa que les spermatozoïdes fraîchement

éjaculés sont aptes à subir la réaction de l’acrosome et féconder un ovule. Bien que ces écrits soient

clairement connus, les résultats obtenus ne sont plus applicables dans l’univers scientifique moderne.

Les travaux de Bedford permirent de différencier la réaction de l’acrosome de la capacitation en deux étapes

distinctes.

La capacitation est aujourd’hui définie comme permettant aux spermatozoïdes

1) de subir l’hyperactivation qui est caractérisée par un mouvement flagellaire très rapide, asymétrique

et avec une grande amplitude (Olson et al, 2011);

2) de se lier à la zone pellucide (Yanagimachi, 1994);

3) d’enclencher la réaction de l’acrosome (Honda et al, 2002);

4) pour finalement fusionner avec l’ovocyte (Austin, 1992).

Bien qu’étudiée depuis plusieurs décennies, la capacitation demeure une étape clé dans la compréhension de

la fécondation. Aussi, l’amélioration des techniques de fécondation in vitro passe par l’étude de la capacitation

étant donné que cet événement est préalable à la fécondation (Yanagimachi, 1994). La capacitation est

20

composée d’une série de modifications biologiques telles que des changements membranaires; lipidiques, au

niveau de la charge nette, d’influx d’ions, de la fluidité membranaire, augmentation du métabolisme et

d’enlèvement de facteurs anti-capacitants (Arcelay et al, 2008; Bailey, 2010).

1.4.1 Changements membranaires

Des changements au niveau de la membrane plasmique du spermatozoïde sont associés comme les étapes

initiatrices à la capacitation. Les premières interactions plasma séminal-spermatozoïde-oviducte permettent

d’abord la perte de facteurs anti-capacitants. Ces derniers sont retrouvés dans le plasma séminal et servent à

envelopper les spermatozoïdes empêchant une capacitation précoce par l’activation de récepteurs clés

(Austin, 1992; Bailey, 2010; Gadella et al, 2001; Visconti et al, 1999; Yanagimachi, 1994).

La perte de ces facteurs anti-capacitants entraine également l’enlèvement de stérols à la surface de la

membrane. Cette perte est associée à la présence d’accepteur de stérol dans le fluide de l’oviducte,

particulièrement les lipoprotéines de haute densité (HDL) (Arcelay et al, 2008; Manjunath et al, 2009; Travert

et al, 2009). En condition in vitro, l’albumine sérique ou le β-cyclodextrine sont fréquemment utilisés comme

accepteur de stérols (Choi & Toyoda, 1998; Cross, 1998).

Un des facteurs anti-capacitant le plus caractérisés est sans aucun doute la famille des lieurs de

spermatozoïdes, en anglais : « Binder of SPerm family » (BSP) préalablement connue comme Bovine Sperm

Proteins (Arcelay et al, 2008; Bailey, 2010; Manjunath et al, 2009; Travert et al, 2009; Visconti et al, 2011). La

présence de BSP et de ses homologues a été identifiée chez le taureau, l’homme, le verrat, l’étalon, le bouc,

le bélier et le bison et a comme rôle l’adsorption du cholestérol membranaire, la formation du réservoir de

spermatozoïdes dans l’oviducte et la liaison avec l’épithélium de l’oviducte (Bailey, 2010; Manjunath et al,

2009; Tienthai, 2015). Son mode d’action est d’abord de se lier à la choline des phospholipides pour ensuite

être retiré suite à l’attachement l’épithélium de l’oviducte (Bailey, 2010; Manjunath et al, 2009; Travert et al,

2009; Visconti et al, 1999).

La perte de cholestérol engendre indirectement une diminution du ratio cholestérol sur phospholipides de la

membrane ce qui résulte d’une diminution de la charge nette négative de la membrane (Langlais et al, 1988;

Langlais, 1985; Travis & Kopf, 2002).

Cette diminution du ratio cholestérol sur phospholipides entraîne un changement au niveau de la fluidité de la

membrane augmentant la réorganisation des protéines au travers de celle-ci (Langlais et al, 1988;

21

Yanagimachi, 1994). La perte de cholestérol et le changement de fluidité sont intimement liés, il est difficile

d’établir lequel provoque l’autre.

Avant la capacitation, la mobilité des phospholipides dans la membrane ainsi que la perméabilité membranaire

aux ions sont très limitées (Langlais et al, 1988; Travert et al, 2009). Avec la perte de cholestérol

membranaire, il y a augmentation de la perméabilité ainsi que de la fluidité de la membrane (Abou-Haila &

Tulsiani, 2009; Langlais et al, 1988; Travert et al, 2009; Travis & Kopf, 2002). Ce changement engendre un

influx d’ions important, dont le calcium et le bicarbonate (Bailey, 2010; Visconti et al, 2011; Yanagimachi,

1994).

1.4.2 Calcium intracellulaire

La communication entre le spermatozoïde et son milieu se fait par échanges ioniques et cationiques au travers

de différentes pompes à ions et transporteurs (Visconti et al, 2011). Avec l’efflux de cholestérol, les canaux

ioniques de calcium s’ouvrent et le calcium pénètre à l’intérieur du spermatozoïde (Baldi et al, 1991; Dubé et

al, 2003). Le calcium serait également emmagasiné dans des réservoirs de calcium à l’intérieur du

spermatozoïde et ceux-ci s’ouvriraient lors de la capacitation (Visconti et al, 2011). Donc, l’augmentation de

calcium intracellulaire lors de la capacitation ne serait pas seulement occasionnée par l’entrée de calcium

extérieur, mais également par la libération du calcium déjà entreposé dans le spermatozoïde.

Les responsables de l’influx de calcium extérieur seraient les canaux CatSper, les échangeurs Na+/Ca+, la

pompe à ATP pour Ca2+ ainsi que des nouveaux canaux (Visconti et al, 2011). Tandis que les responsables

pour la libération de calcium entreposé seraient les récepteurs inositol triphosphate (IP3), les récepteurs

ryanodine, et les pompes à ATP (Visconti et al, 2011). Le calcium est un second message d’une importance

capitale dans la capacitation (Dubé et al, 2003; Lawson et al, 2007; Tardif et al, 2003).

1.4.3 Bicarbonate et pH

Le bicarbonate est essentiel afin de promouvoir la capacitation (Tardif et al, 2003). L’environnement de

l’oviducte est riche en bicarbonate contrairement au plasma séminal activant la pénétration du bicarbonate

dans le spermatozoïde (Rodríguez-Martínez et al, 2005). Chez le verrat, l’apport de bicarbonate incite la

translocation de protéines au travers de la membrane (Gadella & Harrison, 2000). Également, l’augmentation

22

de la charge d’ions négatifs (HCO3-) favorise une augmentation du pH interne (Handrow et al, 1989; Parrish et

al, 1989).

Les travaux de Chen et ceux de Liu ont établi que le bicarbonate est régulateur de l’adénylyl cyclase soluble,

ce qui est particulier chez le spermatozoïde. Contrairement aux autres cellules qui activent l’adénylyl cyclase

membranaire et qui est régulé par les protéines G membranaires, l’adénylyl cyclase soluble n’est pas

transmembranaire et n’est pas contrôlé par le bicarbonate (Chen et al, 2000; Liu, 2015). Les effets de

l’augmentation de l’adénylyl cyclase soluble seront vus en détail dans la prochaine section.

Chez la souris, la capacitation est également associée à une hyperpolarisation de la membrane. Cette

dernière est occasionnée par une perméabilité ionique accrue pour le potassium (K+) (Darszon et al, 2007).

Dans état hyperpolarisé, la membrane peut générer un influx de calcium important tel que celui exigé pour la

réaction de l’acrosome (Darszon et al, 2007). Bien que l’hyperpolarisation de la membrane soit très bien

étudiée chez la souris, peu d’études ont pu clairement démontrer son impact chez l’espèce bovine et équine.

1.4.4 Capacitation et protéines kinases

L’activation de l’adénylyl cyclase soluble par le bicarbonate résulte en la production d’adénosine

monophosphate cyclique (AMPc). Cette dernière stimule la protéine kinase A (dépendante de l’AMPc) ainsi

que d’autres kinases telles que la kinase C (Abou-Haila & Tulsiani, 2009; Bailey, 2010; Naor & Breitbart,

1997). Ces dernières vont engendrer une phosphorylation en résidus de tyrosine, sérine et thréonine de

certaines protéines clés (Leclerc & Kopf, 1999; Naz et Rajesh, 2004; Visconti et al, 1995).

Plusieurs études démontrent la corrélation entre l’augmentation de la phosphorylation en résidu de tyrosine et

l’aptitude d’un spermatozoïde à pouvoir féconder et ce chez plusieurs espèces comme le porc ainsi que le

cheval (Gadella et al, 2001; González-Fernández et al, 2009; Pommer et al, 2003; Visconti et al, 2002).

Cependant, le cheval démontre un niveau plus bas de phosphorylations en résidu de tyrosine que le verrat

(González-Fernández et al, 2009; McPartlin et al, 2008; McPartlin et al, 2009; Pommer et al, 2003). L’ajout

d’analogue à l’AMP cyclique, d’inhibiteurs de phosphodiestérases où les deux sont des moyens d’obtenir un

niveau plus élevé de phosphorylation en résidu de tyrosine (McPartlin et al, 2008). Cette spécificité des

spermatozoïdes équins laisse présumer que l’insuccès de la fécondation in vitro chez cette espèce peut être

en lien direct avec la difficulté de contrôler la capacitation chez le spermatozoïde équin.

L’augmentation de la phosphorylation en résidu tyrosine est, chez la souris, parfaitement régulée par l’activité

de l’AMP cyclique ce qui en fait la voie de signalisation la plus importante de la capacitation (Naz & Rajesh,

23

2004). En effet, l’utilisation d’analogues à l’AMP cyclique permet d’augmenter la phosphorylation des protéines

en résidu de tyrosine (Asquith et al, 2004). L’inverse est également vrai; l’ajout d’inhibiteurs d’AMP cyclique

empêche la phosphorylation des protéines en milieu capacitant (Esposito et al, 2004).

Cette voie est aussi responsable de l’hyperactivation des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes des souris

sans le gène pour l’adénylyl cyclase soluble soit sAC (-/-), ne sont pas capables de s’hyperactiver en présence

d’ions carbonate (Esposito et al, 2004). Également, la famille Src des tyrosines kinases furent identifiés

comme précurseurs des changements observés lors de la phosphorylation en tyrosine durant la capacitation

(Visconti et al, 2011). En effet, l’ajout d’inhibiteurs Src aux spermatozoïdes humains et murins bloquent

l’augmentation de phosphorylation en tyrosine ce qui corrobore avec leur rôle au niveau de la régulation de la

capacitation (Lawson et al, 2008; Mitchell et al, 2008).

1.4.5 Capacitation et espèces réactives d’oxygène

Les espèces réactives d’oxygène (ROS) possèdent un rôle très important chez les spermatozoïdes. Autrefois,

ils étaient étudiés pour leurs effets oxydatifs sur les lipides de la surface des spermatozoïdes. Leurs fonctions

étant mieux définies, ils sont maintenant reconnus comme un joueur important de la phosphorylation des

protéines et de l’enclenchement du processus de capacitation (Travert et al, 2009). L’addition de ROS

exogène entraîne une augmentation de la phosphorylation des protéines en résidu de tyrosine tandis que

l’addition d’inhibiteurs comme l’oxyde nitrique synthase ou de capteurs de ROS comme le superoxyde

dismutase; empêche la capacitation (Travert et al, 2009).

Chez l’étalon, l’activité des ROS sur la capacitation fut beaucoup étudiée étant donné que leur ajout favorise la

capacitation in vitro (Baumber et al, 2000). Le spermatozoïde équin peut synthétiser des ROS par la médiation

des NADPH oxydases tout comme il a été démontré chez les spermatozoïdes humains (Aitken, 1997;

Baumber et al, 2000). Cependant, le processus par lequel les ROS agissent sur le spermatozoïde n’est pas

encore complètement élucidé. L’hypothèse la plus courante est que les ROS permettraient de délier des

facteurs anti-capacitants à la surface de la membrane (Pons-Rejraji et al, 2009).

L’oxyde nitrique est particulièrement identifiable durant la capacitation chez l’équin. Cette dernière est

synthétisée lors de la conversion de la L-arginine en L-citrulline par l’enzyme oxyde nitrique synthétase

(Purohit et al, 1999). L’oxyde nitrique a plusieurs rôles importants dans la fonction reproductive telle que dans

la spermatogénèse, l’érection, la folliculogénèse et l’ovulation (Baumber et al, 2000). Pour ce qui est de son

rôle chez les spermatozoïdes, en forte concentration, elle affecte négativement la motilité et la viabilité du

spermatozoïde tandis qu’en faible quantité elle améliore la motilité et la viabilité des spermatozoïdes post-

24

congélation (Ortega Ferrusola et al, 2009; Purohit et al, 1999). De plus, l’utilisation d’inhibiteur d’oxyde

nitrique, N-omega-nitro-L-arginine méthyl ester (L-NAME) diminue le taux de succès de la fécondation in vitro

chez le bovin (Leal et al, 2009). Les spermatozoïdes produisent en faible quantité de l’oxyde nitrique et que

cette production contribue à aider à la capacitation (Perez Martinez et al, 2000). Dans le cadre de la

capacitation in vitro chez l’équin, il est fréquent d’utiliser la L-arginine afin de fournir beaucoup de substrats à

l’oxyde nitrique synthétase qui augmentera la quantité d’oxyde nitrique produite (McPartlin et al, 2008). Aussi,

l’utilisation de promoteurs de l’oxyde nitrique peut favoriser la capacitation in vitro chez l’équin en augmentant

la phosphorylation en résidu de tyrosine (Baumber et al, 2000).

25

1.5 L’hyperactivation

L’hyperactivation fut décrite pour la première fois en 1970 comme un mouvement hyperactif du spermatozoïde

augmentant avec l’acquisition du pouvoir fécondant (Yanagimachi, 1970). Les caractéristiques de

l’hyperactivation sont une vitesse du mouvement et une plus grande amplitude (Suarez & Ho, 2003). Ce

mouvement semble très désordonné dans un milieu offrant peu de résistance mais la trajectoire du

spermatozoïde dans un milieu visqueux, telle que la glaire cervicale, est rectiligne (Suarez et al, 1992).

En plus de permettre aux spermatozoïdes d’avancer dans le milieu visqueux dans l’oviducte, l’hyperactivation

aurait comme rôle de traverser la zone pellucide. Des spermatozoïdes hyperactivés mis en présence d’ovules

et d’inhibiteurs de calcium, bloquant l’hyperactivation, subissent la réaction de l’acrosome mais ne sont pas

capables de pénétrer la zone pellucide (Stauss et al, 1995). Le calcium est le principal activateur de

l’hyperactivation. Bien que le spermatozoïde doive être capacité pour subir l’hyperactivation, celle-ci n’est pas

nécessaire pour féconder un ovule dénudé de sa zone pellucide (Suarez & Ho, 2003).

26

1.6 La réaction de l’acrosome

Décrite précédemment, la réaction de l’acrosome est en fait une désintégration de la membrane de

l’acrosome, au niveau de la tête du spermatozoïde, laissant échapper des enzymes hydrolytiques entrainant la

digestion de la zone pellucide du complexe ovocyte cumulus (Figure 1.7, étape C) (Yanagimachi, 1994). La

première étape pour le spermatozoïde consiste à atteindre la zone pellucide (Figure 1.7, étape A). Ensuite, le

spermatozoïde doit entrer en contact avec la zone pellucide comme illustré à l’étape B. Suite à la

désintégration de l’acrosome et la digestion de la zone pellucide (Figure 1.7, étape C), le spermatozoïde doit

bloquer la zoospermie (Figure 1.7, étape D). Cependant, pour qu’il y ait fécondation, une autre étape

essentielle est de mise soit la liaison avec l’oolème (Figure 1.7, étape F). Toutes ces étapes sont démontrées

dans la Figure 1.7.

1.6.1 La régulation de la réaction de l’acrosome

La membrane plasmique de l’acrosome est composée de plusieurs récepteurs sensibles aux glycoprotéines

de la zone pellucide (Sun et al, 2011). Chez la souris, la liaison entre les récepteurs spermatiques et les

glycoprotéines ZPC est responsable de la réaction de l’acrosome (Gupta & Bhandari, 2011; Mugnier et al,

2009). Cependant, cela diffère d’une espèce à l’autre. Dans le tableau 1.2, les types de ZP selon les espèces

y sont notés (Gupta & Bhandari, 2011; Kölle et al, 2007; Mugnier et al, 2009).

Figure 1.7: Schématisation de la fécondation. Figure adaptée avec la permission de Flesh et

Gadella, 2000.

27

Tableau 1.2: Glycoprotéines de la zone pellucide responsables réaction de l'acrosome (RA).

Espèce Glycoprotéines Responsable RA Références

Souris ZPA, ZPB et ZPC ZPC Gupta et Bhandari, 2011

Homme ZPA, ZPB, ZPC et ZPD ZPA, ZPC et ZPD Gupta et Bhandari, 2011

Cheval ZPB et ZPD ZPC? Kölle et al, 2007

Verrat ZPB, ZPC et ZPD ZPC Mugnier et al, 2009

Suite à la capacitation, les récepteurs membranaires de ZP sont démasqués et actifs (Gadella & Evans, 2011;

Gadella et al, 2008). L’activation de ces récepteurs entraine un influx de calcium à l’intérieur du

spermatozoïde. La séquence exacte des événements encourus ensuite est toujours hypothétique. Chez la

souris, le modèle propose que l’ouverture des canaux ioniques poussant un influx de calcium provoque une

augmentation de seconds messagers et ainsi une augmentation du pH interne (Flesch & Gadella, 2000). La

barrière physique que forme l’actine F entre la membrane plasmique et la membrane externe de l’acrosome se

dépolymérise afin de former des vésicules fusionnées des deux membranes (Flesch & Gadella, 2000).

Également, l’influx de calcium activerait des enzymes qui scindent l’acide gras des phospholipides, les

phospholipases A (Flesch & Gadella, 2000; Gadella & Evans, 2011). Celles-ci incitent la fusion des

membranes, et ce à plusieurs endroits favorisant la vésiculation des membranes. Ces vésicules permettent de

libérer le contenu acrosomique dans un premier temps et ensuite la fusion entre le spermatozoïde et l’ovocyte.

Ce modèle est simplifié dans la Figure 1.8.

28

Figure 1.8: Modèle de la réaction de l'acrosome chez la souris. Figure adaptée avec la

permission de Flesch et Gadella, 2000.

Chez le bovin, il a été avancé que la progestérone et l’acide gamma-aminobutyrique (AGAB) agiraient via les

mêmes récepteurs ou du moins par le même mécanisme (Puente et al, 2011). AGAB est un inhibiteur de

neurotransmetteur du système nerveux central régulé par des récepteurs membranaires. Les récepteurs

AGAB de type A sont retrouvés au niveau membranaire des spermatozoïdes bovins (Puente et al, 2011).

Cette hypothèse est avancée par le fait que ces deux composantes, la progestérone et l’AGAB, provoquent la

réaction de l’acrosome, et ce même avec la présence de bicuculline, un inhibiteur commun de ces deux

composantes. De plus, l’effet combiné de la progestérone et de l’AGAB était au même niveau que celui de

l’effet simple de chacun démontrant qu’ils agissent par les mêmes récepteurs ou par le même procédé

(Puente et al, 2011).

Essentielle à la fécondation, la réaction de l’acrosome est grandement étudiée, mais il réside toutefois encore

des aspects nébuleux et controversés.

29

1.6.2 Dogme de la réaction de l’acrosome

La littérature classique de la réaction de l’acrosome affirme que cette dernière est enclenchée lorsque, chez la

souris, les récepteurs de la surface des spermatozoïdes sont activés par ZP3 situés à la surface de la zone

pellucide. Cette activation enclencherait l’influx de calcium et mènerait vers la fusion de la membrane de

l’acrosome libérant les enzymes. Cependant l’hybridation in situ du calcium avec une sonde fluorescente a

démontré que la réaction de l’acrosome débute avant d’avoir atteint la zone pellucide (Hirohashi et al, 2011;

Jin et al, 2011; Yanagimachi, 2011;). Il a été clairement établi que chez la souris, en condition in vitro, la

réaction de l’acrosome débute avant l’atteinte de la zone pellucide du complexe ovocyte cumulus (Jin et al,

2011). Somme toutes, les conditions exactes qui mènent à tout coup à une fécondation ne sont toujours pas

élucidées.

30

1.7 Hypothèse et objectifs de recherche

1.7.1 Hypothèse

L’importance de la surface des spermatozoïdes lors de l’initiation de la voie de protéine-kinase A (PKA), lors

du transport d’ions ainsi que lors de l’adhésion à l’oviducte et au complexe ovocyte cumulus (COC), suggère

que les protéines de surface auraient un rôle essentiel dans la capacitation. L’étude des changements

protéiques exclusivement de la surface de la membrane durant la capacitation est une étape clé dans la

compréhension de la capacitation équine.

1.7.2 Objectif général

L’objectif général de ce mémoire est de caractériser la capacitation in vitro chez les spermatozoïdes équins en

fonction de deux aspects. Le premier aspect étant de raffiner le protocole d’isolation des protéines de la

surface des spermatozoïdes afin de rendre la méthode efficace et imperméable. Le second aspect est d’établir

le meilleur milieu afin de provoquer la capacitation des spermatozoïdes équins in vitro. Ces deux projets

constituent une base solide dans la mise en place d’études sur la capacitation des spermatozoïdes équins.

À la base, l’objectif initial de ce mémoire était d’étudier exclusivement les protéines de surface des

spermatozoïdes équins durant la capacitation. Dans un souci d’obtenir des résultats fiables, répétables, précis

et non contaminés, l’objectif général a dû être revu afin de bien « mettre la table » pour ce genre de recherche

fondamentale.

Les résultats des travaux effectués dans le cadre de ce mémoire, permettront aux recherches subséquentes

de posséder un acquis cohérent.

1.7.3 Objectifs spécifiques

Afin de répondre à l’objectif général de ce mémoire, différents objectifs spécifiques ont été testés au travers

des 3 chapitres suivants.

1. Définir la meilleure atmosphère d’incubation entre l’air et l’air supplémentée de 5 % CO2 pour

promouvoir la capacitation sans détriment sur la motilité des spermatozoïdes équins.

31

2. Déterminer le milieu capacitant afin de promouvoir dans le temps la capacitation des spermatozoïdes

équins.

3. Établir le rôle de la source de calcium dans le milieu sur la capacitation des spermatozoïdes équins et

la motilité dans le temps.

4. Optimiser un protocole d’isolation de protéine de surface des spermatozoïdes porcins par la

biotinylation.

33

Chapitre 2 Comparison of two incubation

conditions to promote horse sperm capacitation in

vitro

TITLE: Comparison of two incubation conditions to promote horse sperm capacitation in vitro

SHORT TITLE: Horse sperm capacitation in vitro

AUTHORS: Andréane Martin, Christian Lessard, Katrin Hinrichs, Charles L. Love, Dickson D. Varner, Janice

L. Bailey

Laboratoire de Fonction Spermatique et Toxicologie, Faculté des Sciences de l’Agriculture et de l’Alimentation,

Département des Sciences Animales, Université Laval, 222 de l’Agriculture, Pavillon Paul-Comtois, Québec

(Québec), Canada, G1K 7P0

Correspondence should be addressed to Janice L. Bailey, e-mail [email protected]

34

2.1 Résumé

Depuis sa découverte en 1951, la capacitation fut réalisée de manière répétable in vitro dans des conditions

spécifiques chez différentes espèces tel que le bovin, le murin et l’humain. La série d’événements qui régulent

la capacitation chez de nombreuses autres espèces est encore vaguement comprise notamment la

compréhension de la fonction spermatique et la fécondation chez le cheval. Peu d'études ont démontré

l’apparition de marqueurs physiologiques chez les spermatozoïdes équins tels que la phosphorylation des

protéines tyrosine, évènement considéré symbolique de la capacitation in vitro, et la coloration à la

chlorotétracycline. Les recherches chez l’équin diffèrent grandement dans leur protocole au niveau de

l’atmosphère supplémenté ou non de 5 % de CO2 lors de l'incubation. L'objectif de cette étude était donc de

comparer la capacitation des spermatozoïdes dans un atmosphère supplémenté de 5 % de CO2 (CO2) ou non

(AO) afin d'établir la meilleure condition pour promouvoir la capacitation in vitro équine sans nuire à la motilité.

En outre, le pH des milieux a été noté au cours de l'expérience notablement dû à l'interaction entre le

bicarbonate et de la fonction spermatique. Après 6 heures d'incubation, le pourcentage de spermatozoïdes

mobiles était plus élevé en CO2 qu’AO (74.0 % ± 1 vs 65.4 % ± 2, P < 0.01). En revanche, le pourcentage de

spermatozoïdes progressivement motiles ne différait pas entre les traitements. L’immunobuvardage des

protéines tyrosine phosphorylée semblent être plus intense dans le traitement CO2. Une bande notable

apparue autour de 60 kDa après 3 h-6 h dans l'atmosphère de CO2 seulement. Il n'y avait pas de différence du

pourcentage de spermatozoïdes capacités selon la coloration à la chlortétracycline entre les traitements (AO

36 % ± 1; CO2 35.8 % ± 1, P < 0.05). Les profils AR, acrosome réacté, furent plus élevés chez les

spermatozoïdes incubés dans CO2 (13 % ± 1 vs 4.3 % ± 1, P < 0.05). Finalement, le milieu des

spermatozoïdes incubés dans AO a montré une plus grande augmentation du pH au cours du temps 3h et 6 h

(7.61 ± 0.1 vs 7.39 ± 0.1, P < 0.05). Basé sur ces résultats, l'atmosphère plus appropriée pour promouvoir la

capacitation et maintenir la motilité pendant le temps chez l'étalon serait 5 % de CO2.

35

2.2 Abstract

Since its discovery in 1951, capacitation has been well achieved in vitro under species-specific conditions for

the mouse, bovine and in humans. The events that regulate capacitation in many other species, including the

horse, remain vaguely understood. Several key studies, however, have demonstrated the appearance of

physiological markers in horse sperm such as specific chlorotetracycline fluorescence patterns and protein

tyrosine phosphorylation, which are considered to be the hallmark of in vitro capacitation. The published

protocols for horse sperm capacitation, however, are variable with respect to on the use of sperm incubation

atmosphere with or without 5% CO2. The objective of this study, therefore, was to compare the differences

between capacitated sperm incubated in air (AO) or in 5% CO2 supplemented air (CO2) to establish the best

condition to promote equine in vitro capacitation without harming motility. Also, the pH of each medium was

monitored during experimentation because of known interactions between bicarbonate and sperm function.

After 6 h of incubation, the percentage of motile sperm was higher in CO2 than AO (74 % ± 1.4 vs 65.4 % ±

1.6, P < 0.01). In contrast, the percentage of progressively motile sperm did not differ between treatments.

Through immunoblotting, tyrosine phosphorylated sperm proteins appeared to be more intense in CO2 and a

60 kD band appears after 3 h-6 h in CO2 atmosphere only. There was no difference in capacitation induction

(AO 36 % ± 1; CO2 35.8 % ± 1, P < 0.05) between treatments according to chlortetracycline fluorescence.

CO2 induced a higher level of acrosome reacted sperm (pattern AR) (13 % ± 1 vs 4.3 % ± 1, P < 0.05). Finally,

media incubated in AO showed greater pH increase over time (7.61 ± 0.1 vs 7.39 ± 0.1, P < 0.05). Based on

these results, an atmosphere of 5% CO2 supplemented air is the more appropriate for promoting capacitation

of stallion sperm while maintaining motility.

36

2.3 Introduction

In 1951, Austin and Chang independently discovered that freshly ejaculated mammalian sperm were unable to

fertilize an oocyte without maturation in the female tract (Austin, 1952; Chang, 1951). The assortment of

modifications that lead sperm to gain this ability is called capacitation. Well-known biochemical modifications

occurring during capacitation include membrane cholesterol efflux, membrane hyperpolarization, ion influx,

increased metabolism and removal of surface anti-capacitating factors (Bailey, 2010; de Lamirande et al,

1997; Visconti et al, 1999b). The appearance of tyrosine phosphorylated sperm proteins is also a notable and

easily monitored capacitation-associated change (Arcelay et al, 2008; Dubé et al, 2003; Leclerc et al, 1997;

Pommer et al, 2003; Visconti et al, 1995).

Although capacitation has been studied for more than sixty years and has been well achieved in vitro under

species-specific conditions for the mouse, bovine and in humans the events that regulate capacitation in many

other species remain vaguely understood (Collin et al, 2000; Tardif et al, 2003; Visconti et al, 1999a;

Whittingham, 1979). In particular, current understanding of sperm function and fertilization in the horse lags

well behind. Since ICSI can be used to produce foals while reliable IVF still eludes equine scientists and

theriogenologists, it appears that proper sperm capacitation in vitro is a major obstacle (McPartlin et al, 2008;

McPartlin et al, 2009). Previous work has made obvious the importance of bicarbonate during capacitation to

increase metabolism and control internal pH (Liu et al, 2012). Incubation to promote capacitation in other

species is usually performed in 5% CO2 atmosphere, but horse sperm capacitation protocols are variable, with

some occurring in air that was not supplemented with CO2 (McPartlin et al, 2008; McPartlin et al, 2009) and

others in 5% CO2 in air (Baumber et al, 2003; Bromfield et al, 2014; Thomas et al, 2006).

The objective of this study, therefore, was to test the hypothesis that a CO2-supplemented air atmosphere best

supports stallion sperm motility and in vitro capacitation over time. To achieve this goal, we used different

physiological markers of capacitation, including the chlortetracycline fluorescence assay (Varner et al, 1987),

appearance of sperm tyrosine phosphoproteins (Pommer et al, 2003) and media pH which can affects internal

pH while monitoring sperm motility during incubation, to compare air only and CO2-supplemented incubation

conditions (Liu et al, 2012).

37

2.4 Materials and methods

2.4.1 Chemicals

Monoclonal mouse anti-phosphotyrosine antibody (clone 4G10) and peroxidase-conjugated goat anti-mouse

antibody were purchased from Millipore (Billerica, Massachusetts). Molecular weight standards, β-

mercaptoethanol, Tween 20 were purchased from Bio-Rad Laboratories (Hercules, California). All other

chemicals used in this study were purchased from Sigma-Aldrich, (St. Louis, Missouri).

2.4.2 Incubation media

The capacitation medium used was Modified Whittens (100 mM NaCl, 4.8mM lactic acid hemicalcium salt, 4.7

mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5.5 mM glucose (anhydrous), 22 mM HEPES, 1 mM pyruvic acid, 25 mM NaHCO3, 7

mg/mL BSA (Travis et al, 2001). The medium was partially prepared the day before experimentation without

adding pyruvic acid, lactic acid hemicalcium salt, NaHCO3 and BSA. A non-capacitating version of the medium

lacking BSA and NaHCO3 was used as negative control and for centrifugation. After equilibration in air-only

atmosphere or air supplemented with 5 % CO2 upon treatment, the osmolarity of all media was adjusted with

NaCl to 390 Osm/L and pH was adjusted to 7.25.

2.4.3 Semen preparation

Semen was collected with Missouri type artificial vagina (Nasco, Ft. Atkinson, WI, USA), fitted with a nylon

micromesh filter (Animal Reproduction Systems, Chino, CA, USA), to remove gel and debris from three mature

stallions (9-20 years of age) of proven fertility. Animal protocols were conducted according to the United States

Government Principles for the Utilization and Care of Vertebrate Animals Used in Testing, Research and

Training and were approved by the Laboratory Animal Care Committee at Texas A&M University. Sperm

motility of the sperm-rich fraction was evaluated by computerized semen analysis (IVOS Version 12.2 L;

Hamilton, Thorne Biosciences, Beverly, MA, USA) and sperm concentration was evaluated using an

automated cell counter (NucleoCounter® SP-100™, ChemoMetec A/S, Allerød, Denmark). Semen was diluted

2:1 (v:v) in a conical 15 mL tube with the pre-warmed (37°C) appropriate non-capacitating medium and

centrifuged (100 g, 37°C, 1 min) to remove debris. The supernatant was transferred to a new tube and

centrifuged again (600 g, 37°C, 5 min). After discarding the supernatant, the pellet was resuspended with the

38

appropriate medium to a final concentration of 30 x 106 sperm/mL and incubated under appropriate conditions

in 5 mL polyvinyl alcohol-coated, round bottom tubes (Holmquist, 1982).

2.4.4 Protein extraction

At specific incubation times, sperm were diluted in a 1:1 ratio to 5 x 106 sperm/mL, in 0.2 mM sodium

orthovanadate diluted in PBS (145 mM sodium chloride (0.85%) in 150 nM phosphate buffer), and centrifuged

(16 060 × 22°C, 4 min), discarding the supernatant. Samples were then extended in 25 L sample buffer

containing 65.2 mM Tris HCl pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS and 0.001 % bromophenol blue and then boiled

for 5 min at 95°C (Laemmli, 1970).

Extended samples were centrifuged again (16 060 × g, 22°C, 4 min), and the supernatant transferred to a

clean test tube to which 5% β-mercaptoethanol were added. Samples were stored immediately at -80°C until

electrophoresis. The protein samples were then heated for 1 min at 95°C, and then SDS-PAGE was carried

out.

2.4.5 SDS-PAGE and Western blotting

SDS-PAGE was performed according to the Laemmli method, on 12% TGX precast polyacrylamide mini-gels

(Bio-Rad), at 170 V for 40 min (Laemmli, 1970). The proteins were then transferred to a polyvinylidene fluoride

(PVDF) membrane at 350 mAMPs for 60 min. Membranes were rinsed with deionized water and stained with

Ponceau Red (0.2%) to visualize the proteins. After three rigorous washings in TBS-T (0.5M NaCl, 20mM Tris

and 0.1% TWEEN, pH 7.4, 5 min), non-specific binding sites on the membrane were blocked with 5% non-fat

dried milk, for 1 h at 25°C. Before incubation with antibody, the PVDF membrane was again washed thrice for

5 min in TBS-T. Primary antibody incubation was performed in TBS-T, for 1 h at 25°C, on an oscillating plate,

after which the membrane was washed thrice for 10 min in TBS-T. Incubation with the specific secondary IgG

antibody, conjugated with horseradish peroxidase, was carried out for 30 min at 25°C. Monoclonal mouse anti-

phosphotyrosine was diluted 1:10 000 in TBS-T, and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse was

diluted 1:10 000 in TBS-T. Proteins were visualized using a chemiluminescence detection kit (ECL, Amersham

Corp., Arlington Heights, IL, USA), according to the manufacturer's instructions.

39

2.4.6 Sperm motility

At 0 and 6 h of incubation, sperm motility was evaluated by computer-assisted sperm analysis (CASA), as

previously described (Love et al, 2012). Six μL sperm aliquots for each treatment were placed briefly in a

warmed (37°C) counting chamber, with a fixed height of 20 μm (Leja Standard count 2 Chamber slides; Leja

Products, B.V., Nieuw-Vennep, The Netherlands). The slide was then positioned on the warmed (37°C) stage

and inserted into the IVOS CASA system for assessment. At least 10 microscopic fields and 500 sperm were

observed. Preset values for the IVOS system consisted of the following: frames acquired −45; frame rate −60

Hz; minimum contrast −70; minimum cell size −4 pixels; minimum static contrast −30; average-path velocity

threshold for static cells −15; cell intensity −106; static head size −0.60 to 2.00; static head intensity −0.20 to

2.01; static elongation −40 to 85; LED illumination intensity −2200. Endpoints included percentages of total

sperm motility and progressive sperm motility. Settings for progressive motility were STR- 50% and VAP- 30

μm/sec.

2.4.7 Chlortetracycline fluorescence assay

The acrosome reacted and capacitated sperm were estimated by using chlortetracycline (CTC) fluorescence

assay, as previously described (Varner et al, 1987, Parker et al, 2000). Briefly, to make the CTC staining

solution, 150 L CTC-Cys solution (5 mM cysteine and 750 M chlortetracycline were combined with TN stock

solution (20 mM Tris, 130mM NaCl, pH 7.4) and pH adjusted to 7.8) were mixed with 2 L Glut-Tris solution

(2.5 M Tris and 25% glutaraldehyde) and 25 L DABCO solution (0.22 M DABCO). The CTC staining solution

was shielded from light until adding to sperm. Ten L of diluted semen from the specific treatments were

combined with 10 L CTC staining solution and gently mixed using a pipette. Two separate droplets of 10 L

from each treatment were set on a pre-warmed (37°C) slide and covered with square cover slips. The slides

were placed in a pre-humidified dark box and were kept refrigerated (4-5°C) until evaluation of the fluorescent

patterning of the sperm. Evaluation occurred within two days. At least 200 sperm were evaluated per droplet

for 400 sperm per slide under fluorescence microscopy (Olympus BX60, Olympus America, Inc., Melville, NY,

USA; X 400 magnification). The excitation beam was passed through a B-2A fluorescence filter block with a

double cube illuminator and collector lens. Excitation wavelength emission was between 450 and 490 nm.

Three patterns were observed; F pattern: non-capacitated sperm uniformly fluorescent, B pattern: capacitated

sperm with non-fluorescent midpiece and fluorescent acrosome, and AR pattern: acrosome-reacted sperm

with a post acrosomal fluorescent ring.

40

2.4.8 Statistical analysis

Each experiment was repeated two times with ejaculates from two different stallions (n = 4). Statistical

analyses were performed using the General Linear Models procedure of the Statview software (SAS Institute

Inc, Cary, North Carolina). Holm-Sidak’s pairwise multiple comparison test was used to compare treatments.

Differences with values of P ≤ 0.05 were considered statistically significant. Data are presented as means ±

SEMs.

41

2.5 Results

2.5.1 Motility

Total and progressive motility were monitored from two ejaculates from each of two stallions incubated in

capacitating medium (CM) and non-capacitating medium (NCM). After 6 h of incubation in air with 5% CO2, the

total percentage of motile sperm was higher compared to sperm incubated in air only (Table 2.1). In contrast,

the percentage of progressively motile sperm was not different between treatments. For the negative control

(NCM) at 0 h, more sperm were motile in the supplemented CO2 air atmosphere. There were no statistical

differences in motility between 0 h and 3 h (data not shown).

42

Table 2.1 : Comparison of the percentages of motile and progressively motile sperm during

incubation for 6 h in air-only (AO) and 5 % CO2 in air (CO2) atmospheres.

Time 0 h

Time 6 h

NCM

CM CM

Total Progressive Total Progressive

Total Progressive

AO 77.0 ± 2 36.6 ± 2

76.1 ± 1 36.7 ± 1

65.4 ± 2* 31.7 ± 1

CO2 63.5 ± 1* 27.5 ± 3

76.3 ± 1 41.0 ± 1

74.0 ± 1 47.7 ± 3

Means ± SEM (n=4); * –SD due to atmosphere within each time (P < 0.01)

43

2.5.2 Tyrosine phosphorylation of sperm proteins

Baseline immunoblotting of tyrosine phosphorylated sperm proteins revealed no difference between

atmosphere treatments and showed two bands around 100 kDa and 50 kDa (arrows in Figure 2.1). After 3 h

and 6 h of incubation in 5 % CO2, the tyrosine phosphorylated sperm proteins appeared to be more intense

compared to the air-only treatment (Figure 2.1). Note that a band around 60 kDa appears after 3 h in the 5 %

CO2 atmosphere but is not visible in the air-only treatment (circle in Figure 2.1).

44

Figure 2.1: Sperm incubated in 5 % CO2 in air demonstrated a more intense profile of tyrosine

phosphorylated proteins compared to sperm incubated in air only. A representative blot is

shown.

Western blots probed with phosphotyrosine antibody of proteins (from 5 x 106 sperm) before and after 6 h of

incubation (n=4). All lanes are on the same blot, however, in order to facilitate visualization, irrelevant data

have been cut.

Lane 1: Sperm mixed with NCM in air only before incubation (0 h) (negative control);

Lane 2: Sperm mixed with NCM in air + 5% CO2 before incubation (0 h) (negative control);

Lane 3: Sperm incubated 3 h in capacitating medium in air only;

Lane 4: Sperm incubated 3 h in capacitating medium in air + 5% CO2;

Lane 5: Sperm incubated 6 h in capacitating medium in air only;

Lane 6: Sperm incubated 6 h in capacitating medium in air + 5% CO2.

45

2.5.3 Chlortetracycline assay

The chlortetracycline fluorescent assay was carried out before and after 6 h incubation in air-only and 5 % CO2

in air on sperm from two ejaculates from each of two stallions. As assessed by the percentage of sperm

showing pattern B fluorescence, there were no differences in the level of capacitated sperm between air-only

and 5 % CO2 in air (Table 2.2). Higher percentages of spontaneously acrosome reacted sperm (pattern AR)

were detected in the 5 % CO2 atmosphere compared to the air-only treatment (Table 2.2).

46

Table 2.2: Rates of capacitated and spontaneously acrosome reacted sperm according to

chlortetracycline fluorescent patterns B and AR, respectively, during incubation in air-only

(AO) and 5 % CO2 in air (CO2).

Condition Time 0 h

Time 6 h

NCM

NCM

CM

Pattern B Pattern AR



AO NA NA

19.5 ± 2 1.0 ± 1

36.0 ± 1 4.3 ± 1

CO2 7.0 ± 3 1.3 ± 1

12.6 ± 1 1.4 ± 1

35.8 ± 1 13.0 ± 1*

Means ± SEM (n=4); * –SD due to atmosphere within time and media (P < 0.05)

47

2.5.4 pH of the media in the presence and absence of sperm

Before experimentation, the pH of each medium was adjusted to 7.25 after equilibration for at least one hour in

specific incubator for each treatment AO or CO2. Indeed, the pH of all media was 7.25 at 0 h. During

incubation, media pH was monitored twice with a conventional pH-meter. The tubes of non-capacitating media

tightly closed and sealed with arafilm while the tubes of capacitating media were left open in contact with the

appropriate atmosphere (AO or CO2). In general, the pHs of the media were stable (Table 2.3). After 3 and 6 h

of incubation within AO atmosphere, media with sperm showed more moderate increase in pH than media

without sperm (Table 2.3). This was not observed in 5 % CO2 supplemented air. All results were significant (P

˂ 0.05) except after 6 h incubation without sperm compared to with sperm.

48

Table 2.3: pH of NCM and CM with or without sperm during incubation in air-only (AO) and 5 %

CO2 in air (CO2) atmospheres. The initial pH of all samples was adjusted to 7.25.

Condition Time 3 h Time 6 h

NCM

CM

NCM

CM

Sperm With Without With Without With Without With Without

AO 7.28 ± 0.1* 7.35 ± 0.3* 7.46 ± 0.1* 7.77 ± 0.3* 7.27 ± 0.1* 7.44 ± 0.2* 7.61 ± 0.1* 8.04 ± 0*

CO2 7.02 ± 0.1 7.14 ± 0.3 7.39 ± 0 7.40 ± 0.1 6.99 ± 0.1 7.03 ± 0.2 7.39 ± 0.1 7.5 ± 0.2

Means ± SEM (n=4); *–SD due to atmosphere within medium and sperm presence (P < 0.05)

49

2.6 Discussion

In support of our hypothesis, we demonstrated that horse sperm capacitation in a modified Whitten’s medium

is enhanced in an air atmosphere supplemented with 5 % CO2 when compared to air only. Although the

chlortetracycline fluorescence assay did not reveal any change in the appearance of Pattern B sperm due to

atmosphere, the intensity and number of tyrosine phosphorylated sperm proteins were greater and sperm

motility was significantly higher with the 5% CO2 treatment. Therefore, the 5% CO2 appeared to conserve

sperm function (motility) whilst favoring the signaling pathways associated with the onset of capacitation.

A previous study showed that stallion sperm motility was better maintained in an air only atmosphere in a

Hank’s medium (Bedford et al, 1999). The difference in the composition of Hank’s medium and the modified

Whitten’s used in the present study are considerable, particularly with respect to the energy sources. Hank’s

contains neither pyruvate nor lactate, both of which are present in the modified Whitten’s used here. The

Whitten’s also contains more bicarbonate than the Hank’s. The impact of atmosphere on the ability of the

sperm to capacitate in the Hank’s medium, however, was not assessed.

Recent research has demonstrated that the rise of medium pH occurring during in vitro capacitation is directly

correlated to tyrosine phosphorylation intensity of horse sperm proteins (Macías-García et al, 2015). On the

other hand, oviduct binding, which is thought to occur by sperm that are not yet capacitated, has also been

related to an increase of external pH and correlated to tyrosine phosphorylation of horse sperm (Leemans et

al, 2014). Our result has demonstrated an increase of pH when sperm are incubated in capacitating medium

when compared to non-capacitating medium. As well, this increase has been correlated with sperm incubation

time. Our findings are consistent with results found in literature. As well, capacitation has been correlated with

increase of internal pH.

For decades, in vitro fertilization has routinely been attempted by incubating the gametes in 5 % CO2 in air with

bicarbonate, BSA and calcium in the medium. Bicarbonate plays a role on promoting acrosomal exocytosis

through bicarbonate-stimulated calcium influx in the sperm (Boatman & Robbins, 1991; Flesch et al, 2001;

Gadella & Van Gestel, 2004). Sperm membrane cholesterol efflux, which is the principle initiator of

capacitation, is known to be dependent on the presence of bicarbonate and BSA in the medium (Flesch et al,

2001). As well, tyrosine phosphorylation of horse sperm proteins depends on the presence of bicarbonate

during incubation, presumably by alkalizing the medium (pH 7.25 to pH 7.7-8.0) (González-Fernández et al,

2012). This pH-related increase in protein tyrosine phosphorylation is thought to be related to an increase in

intracellular bicarbonate through sAC signaling pathway by Na+/HCO3- (Demarco et al, 2003; González-

Fernández et al, 2012). In our hands, extracellular pH only increased to 7.36 in the CO2 atmosphere and 7.6 in

air only from initial pH 7.25, yet the tyrosine phosphorylation was much more intense in the CO2 atmosphere.

50

Clearly, this CO2 environment is able to stimulate the signal transduction pathways leading to protein tyrosine

phosphorylation more effectively than via the increased extracellular pH observed in AO.

González-Fernández et al (2012, 2013), however, expressed doubt concerning the use of protein tyrosine

phosphorylation as a significant marker of in vitro capacitation in the horse. Although it is clear endpoint of

capacitation in other species, in particular for the mouse and human, their studies in the horse show that

increasing protein tyrosine phosphorylation is not linked with other events associated with capacitation as

cholesterol efflux, cholesterol distribution among membrane and zona pellucida binding (de Lamirande et al,

1997; Gonzalez-Fernandez et al, 2012; Leclerc et al, 1998, 1997; Matas et al, 2010; O'Flaherty et al, 2005;

Pommer et al, 2003; Ravnik et al, 1990; Tardif et al, 2001; Tardif et al, 2003). These observations highlight our

lack of understanding of equine spermatozoa and their species-specific regulation.

The tyrosine phosphorylation band appearing around 64 kDa is likely PTPN11, has been previously reported,

which is a specific type 2 non receptor tyrosine phosphatase (González-Fernández et al, 2009). This

phosphatase is also found in boar, human and dog sperm (Alonso et al, 2004; González-Fernández et al,

2009). Immunolocalization showed that PTPN11 is mostly located around at the base of the sperm head and

on the midpiece, but some fluorescence has been observed around the acrosome (González-Fernández et al,

2009). Via its own tyrosine phosphorylation, PTPN11 can modulate the intensity and duration of the tyrosine

phosphorylation-related pathways (Sun and Tonks, 1994). It has been advanced that PTPN11, PTPRB and

DUSP3 phosphatases could be regulator of sp32 found in boar sperm because of their localization on sperm

head (González-Fernández et al, 2009). This outcome may prove the impact of CO2 and subsequent

enhancement of PTPN11 on tyrosine phosphorylation or sperm motility during incubation.

Based on these results, the most appropriate condition using modified Whitten’s medium to promote

capacitation and maintain motility of stallion sperm during incubation is 5% CO2 supplemented air. More work

is still need to fully understand molecular events happening during capacitation to eventually support equine in

vitro fertilization.

51

2.7 Acknowledgments

This research was supported by NSERC of Canada to JLB. AM was the recipient of scholarships from RQR-

CRBR-FQRNT, NSERC-Create and the International Office of Université Laval. We are sincerely grateful to

Sheila Teague, Drs J. Vogue, S. Bliss, and K. Sudderth for assistance with semen collection and processing.

52

2.8 References

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56

Chapitre 3 Comparison of different media to

promote horse sperm capacitation in vitro

TITLE: Comparison of different media to promote horse sperm capacitation in vitro

SHORT TITLE: Horse sperm capacitation in vitro

AUTHORS: Andréane Martin, Christian Lessard, Katrin Hinrichs, Charles L. Love, Dickson D. Varner, Janice L.

Bailey





57

3.1 Résumé

Les conditions nécessaires pour promouvoir la capacitation in vitro chez les spermatozoïdes équins ne sont

pas encore bien établies. Chez d’autres espèces comme l’humain, le bovin et le murin, la capacitation in vitro

est associée notamment à l'apparition de protéines spermatiques phosphorylées en tyrosine, à l'augmentation

de calcium intracellulaire et une augmentation concomitante du pH intracellulaire stimulée par le calcium.

L'objectif de cette étude était d'utiliser ces marqueurs physiologiques pour comparer deux média traditionnels,

Modified Whittens (MW) et Modified TALP (mTALP) ainsi que deux sources de calcium, soit le chlorure de

calcium (CaCl2) et l'acide lactique hemilactate de calcium (hemiCa) pour promouvoir la capacitation in vitro

des spermatozoïdes équins (McPartlin et al, 2008). En début d’expérimentation, il n’y avait pas de différence

au niveau de la motilité totale et progressive des spermatozoïdes entre les traitements. Après 6 h d'incubation,

mTALP CaCl2 a démontré une plus grande motilité totale que MW CaCl2 (77 % ± 2 VS 66 % ± 2, P ˂ 0.05).

La motilité progressive fut plus élevée chez MW que TALP peu importe la source de calcium utilisée.

L’immunobuvardage n’a pas révélé de différence entre les médias et le calcium au niveau de la

phosphorylation en tyrosine des protéines spermatiques. Le niveau de calcium interne était significativement

plus élevé dans des milieux contenant du CaCl2. Également, mTALP avec hemiCa a induit des niveaux plus

élevés de calcium interne que les autres média contenant du hemiCa (P ˂ 0.05). Dans l'ensemble, nous ne

pouvons pas établir la meilleure combinaison de média et de calcium en se fiant aux tests de motilité des

spermatozoïdes et la phosphorylation sur tyrosine. En outre, la disponibilité de calcium au sperme pour induire

l’influx lors de capacitation a été corrélée à la source utilisée. Cette étude démontre une problématique avec le

calcium dans les milieux et leur disponibilité durant la capacitation in vitro, ce qui nécessite des études

complémentaires.

58

3.2 Abstract

For stallion sperm, the conditions required for capacitation in vitro are not well established. In other species, in

vitro sperm capacitation is associated with the appearance of tyrosine phosphorylated proteins, increased

internal calcium and a concomitant rise in intracellular pH stimulated by calcium. The objective of the present

study was to use these markers to compare the ability of two traditional capacitating media, Modified Whittens

(MW) and Modified TALP (mTALP), which include different sources of calcium (calcium chloride (CaCl2) and

lactic acid hemilactate calcium (hemiCa), respectively) to promote in vitro horse sperm capacitation. We tested

the hypothesis that the appearance of these markers would be similar after sperm incubation in both media,

irrespective of calcium source. After 6 h, however, more sperm incubated in mTALP CaCl2 were motile than in

MW CaCl2 (P < 0.05). But progressive motility was higher within MW than mTALP with both calcium sources.

Immunoblotting revealed no difference due to media and calcium source on the appearance of sperm protein

tyrosine phosphorylation. Internal free calcium level was higher in sperm incubated in media containing CaCl2

rather than hemiCa (P < 0.05), whereas mTALP with hemiCa induced higher levels of internal sperm calcium

than MW containing hemiCa (P < 0.05). We could not establish an optimal medium + calcium source

combination to best promote sperm capacitation as detected by the appearance of tyrosine phosphorylated

proteins and high motility, however, the calcium availability to sperm to induce influx was correlated with the

source used. This study brings forth new questions related to the interaction between media and calcium

source and accessibility to equine sperm during capacitation.

59

3.3 Introduction

Since 1951, research demonstrated that mammalian sperm cannot fertilize an egg before an initial maturation

as occurs in the female tract (Austin, 1952; Chang, 1951). This maturation is commonly known has

capacitation and still today it is poorly understood from many species. Biochemical modifications associated

with capacitation includes membrane hyperpolarization, membrane cholesterol efflux, ion influx, increased

metabolism, removal of surface anti-capacitating factors and activation of secondary messenger systems,

including a sperm specific soluble adenylate cyclase, cAMPs (Bailey, 2010; de Lamirande et al, 1997; Visconti

et al, 1999). Elevated cAMP activated protein kinase A (PKA) leading to the phosphorylation of tyrosine

residues on many sperm proteins (Arcelay et al, 2008; Dubé et al, 2003; Leclerc et al, 1997; Pommer et al,

2003; Visconti et al, 1995). Indeed, one of the most common molecular endpoints of capacitation is sperm

protein tyrosine phosphorylation (Piehler et al, 2006; Bomber et al, 2003; Bajpai et al, 2003; González-

Fernádez et al, 2013).

Despite decades of work on equine in vitro fertilization (IVF), results are still not successful (Dell’Aquilla et al,

1997 and Hinrinch, 2012), however, intracytoplasmic sperm injection (ICSI) has been well-achieved in horses,

leading to the assumption that equine sperm does not effectively undergo in vitro capacitation (McPartlin et al,

2008; 2009). Generally, horse sperm capacitation attempts are performed using media that were optimized for

other species, such as modified Whitten’s (MW) or modified TALP’s (mTALP), which are commonly used for

pig and bovine sperm, respectively (McPartlin et al, 2008; 2011). To optimize and understand the signaling

pathways leading to equine sperm capacitation, an effective defined medium should be designed (Graham,

1996). To this end, we assessed the manifestation of sperm tyrosine phosphoproteins (Pommer et al, 2003)

and intracellular calcium levels (Purohit et al, 1999) to compare the efficacy of the two classical media, MW

and mTALP, to induce capacitation of horse sperm. In addition, since calcium is a key component to promote

capacitation (Dubé et al, 2003), we also compared the effect of calcium source, since it varies between these

two media: MW typically contains lactic acid hemilactate calcium whereas mTALP contains calcium chloride.

60


3.4.1 Chemicals

Monoclonal mouse anti-phosphotyrosine antibody (clone 4G10) and peroxidase-conjugated goat anti-mouse

antibody were purchased from Millipore (Billerica, Massachusetts). Molecular weight standards, β-

mercaptoethanol, Tween 20 were purchased from Bio-Rad Laboratories (Hercules, California). Fluo 3-AM, a

fluorescent intracellular calcium indicator, was purchased from Invitrogen (Grand Island, New York) and 4-

bromo-calcium ionophore A23187 was obtained from Calbiochem (San Diego, California). All other chemicals

used in this study were purchased from Sigma-Aldrich, (St. Louis, Missouri).

3.4.2 Incubation media

The study was designed to compare two culture media on in vitro capacitation of horse sperm. The media

used were modified TALP (mTALP: 2 mM CaCl2, 3.1 mM KCl, 1.1 mM MgCl2, 0.4 mM NaH2PO4, 5 mM

glucose, 10 mM HEPES, 25.4 mM sodium lactate, 1 mM sodium pruvate, 50 g/mL gentamincin, 0.02%

polyvinyl alcohol, 77.5 mM NaCl and 25 mM NaHCO3 and 7 mg/mL BSA; Padilla et al, 1991, Mc Partlin et al,

2007 and Modified Whittens medium (MW: 4.8 mM lactic acid hemicalcium salt, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,

5.5 mM glucose (anhydrous), 22 mM HEPES, 1 mM pyruvic acid, 25 mM NaHCO3, 7 mg/mL BSA; Travis et al,

2001). Both media were partially prepared the day before experimentation without adding PVA, sodium

pyruvate, CaCl2, sodium lactate, NaHCO3 and BSA for mTALP and without pyruvic acid, lactic acid

hemicalcium salt, NaHCO3 and BSA for MW. Non-capacitating versions of each medium lacking BSA and

NaHCO3 were used as negative controls and sperm washing solutions for centrifugation. After equilibration in

air only atmosphere upon treatment, the osmolarity of all media were adjusted with NaCl to 390 Osm/L and pH

was adjusted to 7.25.

3.4.3 Semen preparation

Semen was collected with Missouri type artificial vagina (Nasco, Ft. Atkinson, WI, USA) fitted with a nylon

micromesh filter (Animal Reproduction Systems, Chino, CA, USA) to remove gel and debris, from three mature

stallions (9-20 years of age) of proven fertility. Animal protocols were conducted according to the United States

Government Principles for the Utilization and Care of Vertebrate Animals Used in Testing, Research and

Training and were approved by the Laboratory Animal Care Committee at Texas A&M University. Sperm

motility of the sperm rich fraction was evaluated by computerized semen analysis (CASA; IVOS Version 12.2

61

L; Hamilton, Thorne Biosciences, Beverly, MA, USA) and sperm concentration was evaluated using an

automated cell counter (NucleoCounter® SP-100™, ChemoMetec A/S, Allerød, Denmark). Semen was diluted

2:1 (v:v) in a conical 15 mL tube with the pre-warmed (37°C) appropriate non-capacitating medium and

centrifuged (100 g, 37°C, 1 min) to remove debris. The supernatant was transferred to a new tube and

centrifuged again (600 g, 37°C, 5 min). After discarding the supernatant, the sperm pellet was resuspended

with the appropriate medium to a final concentration of 10 x 106 sperm/mL and incubated under appropriate

conditions in 5 mL polyvinyl alcohol-coated, round bottom tubes (Holmquist, 1982).


At specific incubation times, sperm were diluted in a 1:1 ratio to 15 x 106 sperm/mL, with 0.2 mM sodium

orthovanadate diluted in PBS (145 mM sodium chloride (0.85%) in 150 nM phosphate buffer) and centrifuged

(16 060 × 22°C, 4 min), discarding the supernatant. Samples were then extended in 25 L sample buffer (65.2

mM Tris HCl pH 6.8, 10 % glycerol, 2 % SDS and 0.001 % bromophenol blue) and then boiled for 5 min at

95°C (Laemmli, 1970). Extended samples were centrifuged again (16 060 ×g, 22°C, 4 min) and the

supernatant transferred to a clean test tube. Five percent β-mercaptoethanol was added at this time. Samples

were stored immediately at -80°C until electrophoresis. The protein samples were then heated for 1 min at

95°C, and then SDS-PAGE was carried out.

3.4.5 SDS-PAGE and Western blotting

SDS-PAGE was performed according to the Lamemmli method, on 12% TGX precast polyacrylamide mini-

gels (Bio-Rad Laboratories; Hercules, California), at 170 V for 40 min (Laemmli, 1970). The proteins were then

transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane at 350 mAMPs for 60 min. Membranes were rinsed

with deionized water and stained with Ponceau Red (0.2%) to visualize the proteins. After three rigorous

washings in TBS-T (0.5M NaCl, 20mM Tris and 0.1% TWEEN, pH 7.4, 5 min), non-specific binding sites on

the membrane were blocked with 5% non-fat dried milk, for 1 h at 25°C. Before incubation with the antibody,

the PVDF membrane was again washed thrice for 5 min in TBS-T. Primary antibody incubation was

performed in TBS-T, for 1 h at 25°C, on an oscillating plate, after which the membrane was washed thrice for

10 min in TBS-T. Incubation with the specific secondary antibody, conjugated with horseradish peroxidase,

was carried out for 30 min at 25°C. Monoclonal mouse anti-phosphotyrosine was diluted 1:10 000 in TBS-T,

and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse was diluted 1:10 000 in TBS-T. Proteins were

62

visualized using a chemiluminescence detection kit (ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA),

according to the manufacturer's instructions.

3.4.6 Sperm motility

At 0 and 6 h of incubation, sperm motility was evaluated by computerized assisted semen analysis (CASA) as

previously described (Love et al, 2012). Six μL sperm aliquots for each treatment were placed briefly in a

warmed (37°C) counting chamber, with a fixed height of 20 μm (Leja Standard count 2 Chamber slides; Leja

Products, B.V., Nieuw-Vennep, The Netherlands). The slide was then positioned on the warmed (37 °C) stage

and inserted into the IVOS CASA system for assessment. At least 10 microscopic fields and 500 sperm were

observed. Preset values for the IVOS system consisted of the following: frames acquired −45; frame rate −60

Hz; minimum contrast −70; minimum cell size −4 pixels; minimum static contrast −30; average-path velocity

threshold for static cells −15; cell intensity −106; static head size −0.60 to 2.00; static head intensity −0.20 to

2.01; static elongation −40 to 85; LED illumination intensity −2200. Endpoints included percentages of total

sperm motility and progressive sperm motility. Settings for progressive motility were STR- 50% and VAP- 30

μm/sec.

3.4.7 Internal cytosolic calcium concentration

At 0 and 6 hours, diluted sperm in each treatment medium were incubated with 5 µm Fluo3-AM at 25°C, for 30

min in the dark, centrifuged (600 xg, 25°C, 5 min) and then resuspended in the appropriate treatment medium.

Initial preliminary experiments using different sperm concentrations were conducted to obtain sufficient

fluorescence to detect maximum calcium responses with ionophore A23187, Triton X-100 and EGTA (data not

shown). Consequently, 4 million sperm for each treatment were loaded into a 96-well plate and excited at 488

nm and 440 nm. Emission was read at 535 nm with Synergy 2 SL Luminescence Microplate Reader (BioTeck,

Winooski,VT, USA). Three reference point measurements were recorded initially and after adding each

reagent; 0.1% Triton X and 8 mM EGTA were added to quantify the maximal and minimal fluorescence

emissions, respectively. The level in intracellular calcium concentration ([Ca]i) were expressed as the ratio

between the change in fluorescent signal and the reference point.

63

3.4.8 Statistical analysis

Each experiment was repeated two times with ejaculates from two different stallions (n = 4). Statistical

analyses were performed using the General Linear Models procedure of the Statview software (SAS Institute

Inc, Cary, North Carolina). Student-Newman-Keul's multiple comparisons test was used to compare

treatments. Differences with values of P ≤ 0.01 were considered statistically significant. Data are presented as

means ± SEMs.

64

3.5 Results

This experiment was designed to determine which incubation medium, MW or mTALP, and calcium, calcium

chloride or lactic acid hemilactate calcium, would best promote capacitation in vitro while supporting motility as

well. The incubation was conducted in air atmosphere at 37°C.

3.5.1 Motility

At 0 h, the rate of motile and progressively motile sperm did not differ among different media (MW and

mTALP) or calcium source (CaCl2 and lactic acid hemicalcium salt; Table 3.1). After 6 h of incubation, the

percentage of motile sperm declined in both media relative to initial levels (Table 3.1) (P ˂ 0.05). Also, sperm

incubated in MW demonstrated lower motility rates than sperm in mTALP when both included CaCl2. On the

other hand, the percentage of progressively motile sperm was higher in MW than mTALP without any

significant difference between calcium used (Table 3.1). Overall, we cannot establish the best combination of

media and calcium regarding sperm motility over time.

65

Table 3.1: Comparison of the percentage of motile and progressively motile sperm during

incubation for 6 h in modified Whittens (MW) or modified TALP media composed with different

sources of calcium, CaCl2 or lactic acid hemicalcium salt.

Medium Time 0 h Time 6 h

CaCl2 Lactic acid hemicalcium

salt CaCl

2 Lactic acid hemicalcium

salt

Total Progressive Total Progressive Total Progressive Total Progressive

MW 88.3 ± 2 52.3 ± 2 86.3 ± 1 42.0 ± 2 66.0 ± 2* 24.0 ± 2* 69.3 ± 2* 54.3 ± 2*

mTALP 87.3 ± 2 44.3 ± 2 89.0 ± 1 46.8 ± 2 77.0 ± 2 33.0 ± 2 75.0 ± 2 31.0 ± 2

Means ± SEM (n=4); * –SD (P ˂0.05) due to medium and calcium source within time

66

3.5.2 Tyrosine phosphorylation of sperm proteins

To compare the ability of the two media to stimulate the intracellular signal transduction pathways known to

occur during in vitro capacitation, the tyrosine phosphorylation of sperm proteins was monitored after

incubation for 6 h.

Before and after 6 h, non-capacitated negative controls in mTALP devoid of BSA and NaHCO3, responded

similarly and presented few bands around 60-50 kDa (arrows on lanes 1 & 2, Figure 3.1). After 6 h of

incubation, immunoblotting to visualize the tyrosine phosphorylated sperm proteins revealed an increase in the

intensity of the signal in lanes from capacitating medium (Figure 3.1). When compared to the Ponceau red

membrane (bottom), the protein loading seems higher in lanes containing capacitated sperm than non-

capacitated sperm (Figure 3.1). We observed a slightly greater level of intensity of tyrosine phosphorylated

protein in media made of MW regardless the calcium source used (Lanes 3 & 7).

67

Lane 1: Sperm in the non-capacitating version of TALP with CaCl2 before incubation (negative control);

Lane 2: Sperm in the non-capacitating version of MW with lactic acid hemilactate calcium (6 h) (negative

control);

Lane 3: Sperm incubated for 6 h in capacitating MW medium with lactic acid hemilactate calcium;

Lane 4: Sperm in the non-capacitating version of mTALP with lactic acid hemilactate calcium (6 h) (negative

control);

Lane 5: Sperm incubated for 6 h in capacitating mTALP medium with lactic acid hemilactate calcium;

Lane 6: Sperm in the non-capacitating version of MW with CaCl2 (6 h) (negative control);

Lane 7: Sperm incubated for 6 h in capacitating MW medium with CaCl2;

Lane 8: Sperm in the non-capacitating version of mTALP with CaCl2 (6 h) (negative control);

Lane 9: Sperm incubated for 6 h in capacitating mTALP medium with CaCl2

Figure 3.1: (Top) Western blots probed with phosphotyrosine antibody of proteins (from 5 x

106 sperm) before or after 6 h of incubation (n=3). All lanes are on the same blot, but to

facilitate visualization, irrelevant data have been cut. A representative blot is shown. (Bottom)

Ponceau red membrane staining of the same immunoblot as measure of protein loading.

68

3.5.3 Sperm intracellular cytosolic calcium assay

The level of intracellular calcium [Ca2+] was calculated by the difference between the initial, maximal and

minimal fluorescence emissions. In our hands, sperm in mTALP showed a higher level of internal calcium than

sperm in MW (data not shown). These observations led us to speculate that the different sources of calcium

between MW and mTALP could impact calcium availability and influence intracellular calcium levels during

incubation. In order to test this hypothesis, both media were tested with both sources of calcium: lactic acid

salt hemicalcium (hemiCa) and calcium chloride (CaCl2) (Figure 3.2).

Mostly before incubation at 0 h, media composed with CaCl2 induced higher internal free calcium levels in the

sperm (Figure 3.2). Moreover, mTALP with hemiCa induced higher levels of internal calcium than other media

containing hemiCa, all of which showed “negative” calcium levels, meaning that the minimal response was

greater than the initial reading (Figure 3.2). After 6 h of incubation, free calcium levels in sperm increased in

non-capacitating conditions and decreased in capacitating conditions (Figure 3.2).

69

Figure 3.2: Sperm internal calcium level (free Ca2+) varies between base media (mTALP and

MW), calcium source (CaCl2 and lactic acid hemilactate calcium) and condition (NCM = non-

capacitating versus CM = capacitating medium).

Means ± SEM (n=4);a,b–SD (P < 0.05) due to medium and calcium source within time

mTALP MW mTALP MW mTALP MW mTALP MW

CaCl2 CaCl2 CaCl2 CaCl2 hemiCa hemiCa hemiCa hemiCa

NCM NCM CM CM NCM NCM CM

CM

a a a

a

b

b

a

70

3.6 Discussion

Our results demonstrate that all the combinations of medium and calcium source tested promoted equine

capacitation, as assessed by tyrosine phosphorylation of sperm proteins, while supporting total motility and

progressive motility. None of the treatments was statistically superior. However, the internal calcium assay

revealed that hemiCa within mTALP induced higher levels of internal calcium than other media containing

hemiCa. As well, the calcium availability to sperm to induce influx during capacitation was correlated to the

source used. For the first time, equine sperm internal calcium has been assayed during capacitation and

compared among different media composed of different calcium sources. Indeed, it has been suggested that

the calcium component use for horse sperm capacitation has an impact on the internal calcium dynamics (Boni

et al, 2007).

Calcium is a primary signaling molecule involved in vital process as muscle contraction, protein

phosphorylation, channel activation, ionic homeostasis and others (Bailey, 2010). In sperm, calcium is well

known for its role in flagellum movement, hyperactivation, acrosomal exocytosis and likely plays a role in

capacitation. In equine sperm, calcium entry into the flagellum or sperm head is largely considered to result in

hyperactiation and the acrosome reaction, respectively (Varner et al, 2014). In other species, capacitation

depended on extracellular calcium in the medium (Saidur Rahman et al, 2014).

In men, a reduced level of intracellular calcium has been associated with asthenozoospermic infertile patients

(Espino et al 2009). In contrast to these reports, our experiment revealed different results among calcium

sources. These effects could be caused by the availability of calcium depending on the molecule or the

difference between horse sperm and other well-investigated species. Recently, it was demonstrated that

extracellular calcium has an inhibitory effect on stallion sperm tyrosine phosphorylation and speculated that

capacitation rate is modulated by external pH and absence of calcium in the media (González-Fernández et al,

2012). Furthermore, in human sperm, capacitation-associated tyrosine phosphorylation is inhibited by

extracellular calcium that can be reversed by the inclusion of a specific calmodulin inhibitor (Leclerc et al,

1992). Then again, in the presence of inhibitors of calcium/calmodulin-dependent kinases, protein kinase A or

Src family kinases, equine sperm did not show protein tyrosine phosphorylation when the medium lacked

calcium. On the other hand, protein tyrosine phosphorylation was observed when sperm were incubated in

calcium-supplemented medium with a calmodulin inhibitor (González-Fernández et al, 2013). These

observations suggest that equine sperm tyrosine phosphorylation during capacitation is regulated by two

distinct signaling pathways, one including calcium and the other excluding calcium. First, the classical protein

kinase A-mediated pathway is inhibited by calcium in conditions of low pH. A second pathway does not involve

protein kinase A and requires the presence of calcium and low pH (González-Fernández et al, 2013).

71

Other studies have assayed sperm cytosolic calcium levels during capacitation, mainly with murine, bovine

and human sperm (Li et al, 2014, Loux et al, 2013, Dorval et al, 2002, Baker et al, 2004). A notable increase in

internal calcium mainly regulated by transporters such as the CatSper channel and Ca2+-ATPases is observed

during capacitation (Visconti et al, 2011, Olson et al, 2011). Recent studies, however, have established that

the CatSper channel, which is responsible for horse sperm hyperactivation, is not upstream of an external

calcium influx (Loux et al, 2013). It appears that Heat shock protein 90 plays a role in the rise of cytosolic

[Ca2+] occurring during capacitation caused by increasing the availability of ATP, thereby accelerating Ca2+

efflux via protein kinase C and plasma membrane Ca2+ pumps (Li et al, 2014). Heat shock protein 90 has been

located on the neck, midpiece and tail of dog and stallion sperm (Volpe et al, 2008). However, in our hands,

we did not observed differences in protein tyrosine phosphorylation corresponding to fluctuations of internal

calcium level among treatments indicating that the external calcium level was essentially the same between

treatments. A high level of external calcium is associated with decreased tyrosine phosphorylation in human

and murine sperm (Baker et al, 2004).

Previous stallion capacitation studies mostly used either modified Whitten’s medium containing lactic acid

hemicalcium salt, or modified TALP medium with CaCl2 (Table 3.2). In vitro horse fertilization attempts mainly

used Modified Biggers, Whitten & Whittingham medium with CaCl2 for sperm maturation (Table 3.2). Our

findings indicate that the availability of Ca2+ is different between HemiCa and CaCl2.

3.6.1 Future perspective

Based on these results, both MW and mTALP media are appropriate to promote capacitation and maintain

sperm motility in the stallion. This study brings forth issues with the sources of calcium in the media and its

accessibility to sperm during in vitro capacitation, which requires further study. More work is needed to

understand the interaction of calcium source on other medium components resulting in different internal

calcium responses.

72

Table 3.2: Review of medium composition from significant articles on horse sperm

capacitation

Medium Calcium source Species Reference

Modified Whitten’s

2.4 mM CaCl2 Equine Macías-García et al, 2015

2.4 mM CaCl2 Equine González-Fernández et al, 2013

Modified Whitten’s

4.8 mM lactic acid hemicalcium salt Equine McPartlin et al, 2009


2.4mM Calium L-Lactate Equine González-Fernández et al, 2012

4.8 mM lactic acid hemicalcium salt Equine Mc Partlin et al, 2011

4.8 mM lactic acid hemicalcium salt Murine Wertheimer et al, 2013

Modified Biggers, Whitten & Whittingham

1.7 mM CaCl2 *2 H20 Equine Bromfield et al, 2013

1.7 mM CaCl2 Human Battistone et la, 2014


1.3 mM CaCl2 Equine Pommer et al, 2002

Modified TALP

CaCl2 Equine Hinrichs et al, 2002

2 mM CaCl2 Equine McPartlin et al, 2008

Tyrode’s medium

1.71 mM CaCl2 *2 H20 Equine Choi et al, 2003

2 mM NaCl2 Porcine Piehler et al, 2006

2 mM CaCl2 Equine Rathi et al, 2001

73

3.7 Acknowledgments

This research was supported by NSERC of Canada to JLB. AM was the recipient of scholarships from RQR-

CRBR-FQRNT, NSERC-Create and the International Office of Université Laval. We are sincerely grateful to

Sheila Teague, Drs J. Vogue, S. Bliss, and K. Sudderth for assistance with semen collection and processing.

74

3.8 References



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79

Chapitre 4 Optimization of sperm surface protein

isolation using biotinylation

TITLE: Optimization of sperm surface protein isolation by biotinylation

SHORT TITLE: Isolation of sperm surface proteins

AUTHORS: Andréane Martin, Christian Lessard, Janice L. Bailey





80

4.1 Résumé

Puisqu'elles jouent un rôle dans la signalisation cellulaire et le transport d'ions, la caractérisation des protéines

de surface des spermatozoïdes avant et après la capacitation aidera, élucider la régulation et les évènements

biologiques menant à la capacitation. Notre objectif était d'utiliser la biotinylation afin d'isoler les protéines de

surface des spermatozoïdes en utilisant le porcin comme modèle. La membrane spermatique est imperméable

aux esters NHS sulfurés de la biotine et, par conséquent, appropriés pour la biotinylation de surface cellulaire.

Toutefois, l’immunobuvardage de protéines obtenues par un essai commercial nous a révélé la présence

inattendue de protéines internes. Pour développer notre propre protocole, nous avons analysé la perméabilité

de la biotine en utilisant la coloration à l'éosine-nigrosine et l’immunobuvardage de protéines internes soient

l’α-tubuline et l’acrosine. D'abord, nous avons observé que l’utilisation d’un gradient de Percoll augmente la

perméabilité de la membrane, de sorte que le lavage des spermatozoïdes a été réalisé dans du PBS

seulement. Deuxièmement, la biotinylation pendant 30 min à 18°C était la meilleure condition de co-incubation

spermatozoïdes-biotine pour éviter la pénétration de la biotine. Troisièmement, nous avons comparé les

différents réactifs d’arrêt d’interaction entre la biotine et les protéines des spermatozoïdes. Deux traitements

ont démontré des rendements supérieurs à la solution fournis avec l’essai commercial soit 30 min d'incubation

avec de la glycine 25 mM ou 30 secondes avec 50 mM de Tris-HCl. La quatrième et le facteur le plus

important fut de fixer avec 4% de paraformaldehyde. Pour confirmer notre protocole final, l’immunobuvardage

et l’immunolocalisation avec l’anti-biotine ont révélé que la biotine a marqué les protéines de la surface des

spermatozoïdes seulement. Notre protocole peut maintenant être utilisé pour caractériser les protéines de

surface sans contamination des protéines internes.

81

4.2 Abstract

Since they play a role in signaling pathways, cell adhesion and ion transport, characterizing the proteins on the

sperm surface before and after capacitation will help elucidate the regulation and biological implication of

capacitation. The aim of this study was to use biotinylation to isolate sperm surface proteins using the porcine

model. The sulfonated NHS esters of the biotin label are membrane-impermeable and, therefore, suitable for

cell-surface biotinylation. In our hands, however, SDS-PAGE and western blotting of pig sperm proteins

isolated using a commercial kit revealed the unexpected presence of internal proteins. To develop our own

protocol, we analyzed the permeability of the biotin using eosin-nigrosin staining on live sperm and western

blotting to assess for internal sperm proteins, α-tubulin and acrosin. First, we observed that Percoll increased

membrane permeability, so sperm washing was carried out in PBS alone. Second, biotinylation for 30 min at

18°C was the best optional biotin-sperm co-incubation condition to avoid biotin penetration. Third, we

compared different quenching reagents to halt biotin interaction with the sperm. Either 30 min of incubation

with 25 mM glycine or 30 sec with 50 mM Tris-HCl were more effective at preventing biotinylation of internal

proteins than the proprietary quenching solution. The fourth and most dramatic factor that prevented biotin

penetration was fixation with 4% paraformaldehyde. To confirm our final protocol, western blotting and

immunolocalisation with anti-biotin, revealed that biotin labeled proteins along the sperm surface but not

internally. Our protocol can now be used to characterize sperm surface proteins without contamination of

internal proteins.

82

4.3 Introduction

After ejaculation, although spermatozoa are motile and morphologically mature, they must undergo

capacitation to acquire the ability to fertilize an oocyte (Yanagimachi, 1994). Capacitation has been associated

with biochemical modifications such as changes to the protein and lipid composition of membrane, membrane

cholesterol efflux, membrane hyperpolarisation, ion influx, increased metabolic function and removal of surface

anti-capacitating factors (de Lamirande et al, 1997; Visconti et al, 1999; Bailey, 2010). Also, capacitation is

commonly associated with the tyrosine phosphorylation of specific proteins such as p32 and sp32 in pig sperm

and others proteins found in mouse, bull, stallion and human sperm (Visconti et al, 1995; Leclerc et al, 1997;

Dubé et al, 2003; Pommer et al, 2003; Arcelay et al, 2008). However, regulation of the events that lead to

capacitation is still poorly understood.

Capacitation initiates at the sperm surface and is associated with changes to the surface protein population of

the sperm membrane (Naaby-Hansen et al, 1997; Kaneto et al, 2002; Gadella et al, 2008). The membrane

surface plays a central part in the initiation of general signaling pathways and it is the principal matrix of

interaction between the cell and its environment (Töpfer-Petersen, 1999). Since the membrane surface is also

largely involved in cell adhesion and ion transports, the description of surface changes appearing during

capacitation is important to elucidate the regulation of this phenomenon (Boni et al, 2007).

The sperm surface plasma membrane is highly heterogeneous and separated in different domains related to

its specific function and organelle localization (Langlais, 1985). Our aim, therefore, was to isolate sperm

surface proteins in an accurate and reproducible manner in order to subsequently characterize the change in

the population of these surface proteins before and after capacitation. To achieve this goal we used the

porcine model because high numbers of ejaculated sperm are readily available, which facilitates comparison of

numerous experimental treatments.

Biotinylation was selected to isolate sperm surface proteins because this approach is theoretically

impermeable (Larson and Miller, 1997; Naaby-Hansen et al, 1997; Pierce-Biotechnology, 2008) and easy to

perform using commercially available kits. With this technique, a membrane impermeable biotin label is added

to the sperm, the proteins are released and avidin is added to isolate the biotin-bound proteins. In practice,

however, we showed here that SDS-PAGE and western blotting of sperm proteins isolated using this kit

revealed the unexpected presence of internal proteins. To redefine a protocol suitable for sperm, we analyzed

the permeability of the biotin using SDS-PAGE and western blotting for internal sperm proteins.

83


4.4.1 Chemicals

The Pierce® Cell Surface Protein Isolation Kit and additional EZ-Link® -Sulfo-NHS-SS-Biotin were purchased

from Thermo Scientific (Nepean, Ontario). Permount mounting medium was obtained from Fisher Scientific

(Ottawa, Ontario). Monoclonal mouse anti-phosphotyrosine antibody (clone 4G10) and peroxidase-conjugated

goat antimouse antibody were purchased from Millipore (Billerica, Massachusetts). Molecular weight standards

and acrylamide N,N0-methylene bisacrylamide were obtained from Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd.

(Mississauga, Ontario). Monoclonal mouse anti-α-tubulin antibody and all others chemicals used in this study

were purchased from Sigma-Aldrich Canada Ltd, (Oakville, Ontario).

4.4.2 Culture media

Culture media were prepared daily as cited in previous studies (Tardif et al, 2001; Dubé et al, 2005) and were

based on Krebs Ringer Bicarbonate (Toyoda and Chang, 1974). Capacitating medium (CM) was composed of

4.78 mM KCl, 1.19 mM KH2PO4, 1.19 mM MgSO4, 113.1 mM NaCl, 5.56 mM glucose, 25 mM NaHCO3, 5 mM

CaCl2, 0.4% BSA and 0.5 mM pyruvate (pH 7.4). Non-capacitating medium (NCM) was similar to CM, but

without calcium, bicarbonate and BSA (78 mM KCl, 1.19 mM KH2PO, 1.19 mM MgSO4, 113.1 mM NaCl, 5.56

mM glucose and 0.5 mM pyruvate at pH 7.4).

4.4.3 Preparation of spermatozoa

This research was conducted with the approval of the university committee for animal care. Sperm-rich semen

fractions from mature and fertile Duroc boars were graciously donated by the Centre d’Insémination Porcine

du Québec Inc (CIPQ, Saint-Lambert de Lauzon, Québec) and transported to the laboratory at 18°C–25°C

within 30 min. Pre-warmed PBS (phosphate buffered saline; at 37oC) was added to the sperm-rich semen and

centrifuged twice at 500 ˟ g for 5 min at room temperature, discarding the supernatants. The sperm pellet was

diluted to 40 x 106 sperm/mL in either NCM, as a non-capacitating negative control, or in CM, to induce

capacitation. Control tests at 0h were immediately performed and sperm were then incubated at 38.5°C in a

humidified 5% CO2 atmosphere up to 3 h.

84

4.4.4 Percoll® wash

When indicated, Percoll® (Amersham, San Francisco, California, USA) washes were performed to prepare the

sperm. Briefly, 2 mL of sperm-rich fraction were layered over an isotonic 45% Percoll® column and centrifuged

at 600 × g for 20 min. The supernatant was discarded and the pellet was centrifuged twice at 500 × g for 5

min, resuspending with warm PBS (37°C).

4.4.5 Biotinylation

The procedure was performed as directed by the manufacturer’s directions with the Pierce® Surface Protein

Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Burlington, Ontario, Canada). Prior to biotinylation, sperm were washed

twice by adding warm PBS at 37°C and centrifuged at 500 × g for 3 min. Certain conditions will change in

order to optimize the biotinylation protocol.

4.4.6 Membrane integrity staining

Sperm membrane integrity was performed by using eosin-nigrosin staining as described previously (Barth and

Oko, 1989; Tardif et al, 1999). At least 200 spermatozoa were identified per slide by light microscopy (400X),

and the percentage of membrane disrupted (colored pink) and live (unstained) cells were evaluated.


Processed sperm aliquots were diluted 1:1 (volume: volume) in 0.2 mM sodium orthovanadate diluted in PBS,

and centrifuged at 16 060 × g for 4 min at 22°C, discarding the supernatant. Samples were then extended in

25 L sample buffer containing 65.2 mM Tris HCl pH 6.8, 10% glycerol and 0.001 % bromophenol blue and

then boiled for 5 min at 95°C. Extended samples were centrifuged at 16 060 × g for 4 min at 22°C with

supernatant transferred to a fresh tube. Five percent β-mercaptoethanol were added at this time. Samples

were stored immediately at -80°C until electrophoresis.

4.4.8 SDS-PAGE and western blotting

Extracted protein samples were heated for 1 min at 95°C, loaded into wells on a 12% SDS-PAGE gel, run at

170 V for 40 min, and then transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane at 350 mAMPs for 60

85

min. The membrane was washed with deionized water and stained with Ponceau Red (0.2%) to visualize

proteins. After three intensive washings in TBS-T (0.5M NaCl, 20mM Tris and 0.1% TWEEN, with pH adjusted

to 7.4, 5 min), non-specific binding sites on the membrane were blocked with 5% non-fat dried milk for one

hour at 25°C. Before incubation with the antibody, the PVDF membrane was again washed thrice for 5 min in

TBS-T. Primary antibody incubation was performed in TBS-T for an hour at 25°C on an oscillating plate, after

which the membrane was washed thrice for 10 min in TBS-T. Incubation with the specific secondary IgG

antibody conjugated with horseradish peroxidase was carried out for 30 min at 25°C . Monoclonal goat anti-

biotin was diluted 1:30 000 and horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat secondary antibody was

diluted 1:20 000. Monoclonal mouse anti-α-tubulin was diluted 1:50 000 and horseradish peroxidase-

conjugated rabbit anti-mouse was diluted 1:10 000. Monoclonal anti-acrosin was diluted 1:10 000 in TBS-T.

Proteins were visualized using a chemiluminescence detection kit (ECL, Amersham) according to the

manufacturer's instructions.

4.4.9 Immunolocalization

Following incubation with biotin and quenching, 4 x 106 sperm were air dried on poly-L-lysine slides for 20 min

in the dark. Liquid was then removed from slide and sperm were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for

10 min at 25°C. Three washings of 5 min with PBS were performed and sperm were blocked with PBS

containing 1% BSA with or without 0.5% Triton X-100 according the treatment for 1.5 hours at 25°C in the

dark. Before and after incubation with first antibody, sperm were washed thrice for 5 min with PBS. Goat anti-

biotin (Millipore) diluted at 1:5 000 in PBS-BSA blocking solution was added to the slide and incubated

overnight at 4C. Negative control slides were incubated with goat IgG 1: 5 000 instead of anti-biotin to reveal

the background fluorescence. Donkey anti-goat coupled to Alexa 488 (green) was added as the secondary

antibody diluted at 1:200 in PBS-BSA blocking solution for one hour at 37C in the dark. After 3 X 5 min

washes with PBS, slides were mounted with Pro-Long Gold coupled with DAPI (blue) (Invitrogen, Grand

Island, NY). A cover slip was placed on the slide, which was held at 4°C for at least 2 hours before

observation. The sperm were examined by epifluorescence using a Nikon Eclipse E600 microscope equipped

with fluorescence (Alexa 488: maximal excitation: 488 nm, DM 510 filter; DAPI: maximal excitation: nm, BV2A

filter).

86

4.4.10 Statistical analyses

Each experiment was repeated 3 times with ejaculates from three different boars. Statistical analyses were

performed using the General Linear Models procedure of the Statview JMP software (SAS Institute Inc, Cary,

North Carolina). Student-Newman-Keul's multiple comparisons test was used to compare treatments when

analysis of variance indicated the model to be valid. Differences with values of P < 0.05 were considered

statistically significant. Data are presented as means ± SEMs.

87

4.5 Results

4.5.1 Internal protein labeling

To validate the permeability of the biotinylation protocol described by the manufacturer, western blotting was

used to observe α-tubulin, a well-known internal sperm protein. Figure 4.1 indicates little difference due the

biotinylation protocol: lane 1 is the unbiotinylated extract versus 2 and 3, which are biotinylated extracts from

sperm in either CM or NCM, respectively. All three treatments revealed prominent bands at 50 kDa,

corresponding to the presence of α-tubulin.

88

Western blots probed with monoclonal anti-α-tubulin of proteins (from 30 x 106 sperm) isolated using the

biotinylation kit or not after 3h of incubation (n=3). All lanes are on the same blot, but in order to facilitate

visualization non-important data have been cut.

Lane 1 Total proteins extracted from sperm after incubation in CM (positive control);

Lane 2: Proteins isolated by biotinylation after incubation in CM;

Lane 3: Proteins isolated by biotinylation after incubation in NCM.

Figure 4.1: Biotinylation according to the manufacturer’s instructions permits labeling of

internal sperm proteins.

Molecular weight

(kDa)

89

4.5.2 Confirmation that biotin binds sperm proteins

In order to confirm that the EZ-Link® -Sulfo-NHS-SS-Biotin provided in the commercial kit effectively labels

sperm proteins, the protocol was performed and interrupted after the sperm plus biotin incubation prior to the

addition of avidin beads. Western blotting with anti-biotin (Figure 4.2) confirms that proteins were labeled by

biotin from sperm incubated in either CM (lane 3) or NCM (lane 4) at time 0 h. The total sperm proteins

extracted from 100 million spermatozoa in CM (lane 1) and NCN (lane 2) were used as negative controls and

do not reveal significant protein content.

These results confirm the biotin indeed binds sperm proteins (Figure 4.2) but the process does not seem to be

specific to surface and allows internal penetration by biotin (Figure 4.1). Therefore, we proceeded to improve

the biotinylation protocol in a manner suitable to study sperm physiology.

90

Figure 4.2: Biotin binds sperm proteins.

Western blots probed with monoclonal anti-biotin of sperm proteins (from 100 x 106 sperm) extracted from

sperm labeled or not with biotin (n=3). Theses lanes are on the same blot, but in order to facilitate visualization

only noteworthy data are showed.

Lane 1: Total protein extracts from non-biotinylated boar sperm in CM (negative control);

Lane 2: Total protein extracts from non-biotinylated boar sperm in NCM (negative control);

Lane 3: Proteins from boar sperm exposed to biotin in CM;

Lane 4: Proteins from boar sperm exposed to biotin in NCM.

Molecular weight

(kDa)

91

4.5.3 Biotin-sperm co –incubation conditions

Western blotting with anti-α-tubulin of sperm surface proteins from 30 x 106 sperm per lane reveals no

differences due to duration of biotin-sperm co-incubation and the positive control (Figure 4.3). Sperm

membrane integrity decreases significantly after biotin sperm co-incubation at 4°C and 22°C compared to

16.5°C and 39°C (P < 0.05; Figure 4.4). There is no difference in sperm membrane integrity between

incubations at 16.5°C and 39°C (P < 0.05; Figure 4.4).

92

A: Western blots of sperm surface proteins (from 30 x 106 sperm) isolated by biotinylation probed with anti-

phosphotyrosine (n=3);

B: Same blot as panel A probed with anti-α-tubulin (n=3);

Lane 1: Biotin- sperm co-incubation for 10 min;

Lane 2: Biotin- sperm co-incubation for 20 min;

Lane 3: Biotin- sperm co-incubation for 30 min.

Figure 4.3: There is no difference in biotin penetration due to the duration of biotin-sperm co-

incubation.

Molecular weight

(kDa)

93

Figure 4.4: Biotin- sperm co-incubation temperature influences subsequent percentage of

disrupted sperm membrane as assessed by eosin-nigrosin staining. Means ± SEM (n=3); a –

SD (P ˂0.05).

% disrupted sperm

membrane

Incubation temperature (0C)

94

4.5.4 Sperm preparation affected biotin penetration

To discern if the sperm preparation methods influence biotin penetration, plasma membrane integrity was

monitored at different points throughout the protocol with eosin-nigrosin sperm staining.

Percoll washing significantly increased membrane permeability compare to controls that were centrifuged

without Percoll (P < 0.06; Figure 4.5). Double PBS centrifugation is sufficiently effective to remove the CM or

NCM without disrupting membrane integrity (Figure 4.5).

95

Figure 4.5: Percoll washing increases membrane permeability as assessed by eosin-nigrosin

staining. Means ± SEM (n=4);a –SD (P ˂0.06).

a

96

4.5.5 Reagent analysis

The commercial Pierce® TBS and PBS are very hyperosmotic compared to PBS and TBS usually used with

boar semen (Table 4.1). Also, the pH of the Pierce® TBS and PBS solutions are considerably lower than the

pH usually used for pig sperm solutions (Table 4.1). In addition, the components used in the composition of

Pierce® solution are different than those used traditionally for pig sperm PBS and TBS (Table 4.1).

97

Table 4.1: Pierce® solutions were hyperosmotic and composed of different reagents than the

standard sperm solution.

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0.01M Tris

Pierce® TBS 7.2 b Beyond detection limits

25mM Tris Pierce, 2008

0.15 M NaCl

Means ± SEM (n=3); a, b –SD (P ˂0, 05)

98

4.5.6 Crucial step: Quench reaction

After biotinylation, the remaining free biotin must be inactivated to prevent undesirable binding during sperm

permeabilization. Western blotting with α-tubulin antibody showed that the quenching reaction proposed by the

manufacturer’s protocol unexpectedly allowed biotin penetration when compared to other commonly used

quenching solutions (Figure 4.6). In fact, the Pierce® quenching solution in different volumes and incubation

durations always consistently labeled internal sperm proteins, as represented by α-tubulin (Figure 4.7). In

contrast, 50 mM Tris-HCl and 25 mM glycine quenching solutions did not permit the appearance of the 50 kDa

tubulin band as an indicator of internal labeling (Figure 4.6).

4.5.7 Fixing sperm surface

Fixing sperm prior to biotinylation with 4% paraformaldehyde (PFA) was carry out to prevent internal protein

labeling by biotin. So then, paraformaldehyde with phosphate buffered saline solution (PFA-PBS) replaced the

first washing followed by a PBS washing ahead of biotinylation. Western blotting with α-tubulin antibody

demonstrated that fixing sperm helps to prevents labeling of internal protein (Fig 4.6-7). Also, PFA did reduce

internal protein labeling when achieved with Pierce ® quenching solution.

99

Figure 4.6: Quenching for either 30 min with 25 mM glycine or 30 sec with Tris-HCl was more

effective at preventing biotinylation of internal proteins than the proprietary quenching

solution. Also, fixing sperm with paraformaldehyde resulted in a significant reduced amount

of labeling of α-tubulin by the biotinylation procedure.

Western blots of sperm surface proteins (from 30 x 106 sperm) labeled with monoclonal anti-α-tubulin (n=3).

Data showed are from two blots, but in order to facilitate visualization only figures of interest are shown.

Figure 4.7: Pierce quenching solution concentration and incubation time does not affect the

ability to prevent biotinylation of internal proteins. As well, fixing the sperm with PFA

definitely decrease labeling of internal protein.

Western blots of sperm surface proteins (from 30 x 106 sperm) labeled with monoclonal anti-α-tubulin (n=3).

Data shown are from two blots, but in order to facilitate visualization only figures of interest are shown.

Molecular weight

(kDa)

Molecular weight

(kDa)

100

4.5.8 Immunolocalization

In order to confirm impermeability of the optimized protocol, indirect immulocalization of biotin fixed and

permeabilized porcine sperm was conducted. Surface labeling was evident when detected with biotin

polyclonal antibody (Figure 4.8).

101

Figure 4.8: Immunolocalization of biotin demonstrates the impermeability of the improved biotinylation protocol.

In (A) biotin polyclonal antibody Alexa 488 (green) uniformly labeled the sperm head and the flagellum. Intensely fluorescent stains are only debris. In (B) contrast

phase and in (C) coupled photo of biotin (green) + DAPI (blue) of the same field demonstrated the biotin labeling (green) (n=4; representative photos are shown).

102

4.5.9 Improved protocol

Our amended protocol prevents internal sperm protein labeling and allows isolation of sperm surface proteins

(Figure 4.9 and Figure 4.10). Furthermore, western blotting with biotin antibody of surface proteins still

bounded to biotin exposed pattern bands as expected. In addition, the same membrane exposed with anti-

acrosin antibody revealed two bands around 46 kDa in the positive control, the same total protein extract. No

other band appeared on the surface protein lanes.

103

Western blots of surface sperm protein (from 100 x 106 sperm) bound to biotin labelled with anti-biotin (A) and

anti-acrosin (B) confirms the impermeability of this improved method (n=2). Data shown are from the same

blots, but in order to facilitate visualization only lanes of interest are shown. The absence of acrosin labeling on

blots from surface proteins extract prove the improved protocol impermeability.

Lane 1: total sperm protein extracts incubated in CM (negative (A) & positive control (B));

Lane 2: total sperm protein extracts incubated in NCM (negative (A) & positive control (B));

Lane 3: surface proteins bound with biotin incubated in CM;

Lane 4: surface proteins bound with biotin incubated in NCM.

Figure 4.9: The biotinylation protocol is impermeable.

Molecular weight

(kDa)

Anti biotin

Anti acrosin

104

Western blots of surface sperm protein (from 60 x 106 sperm) isolated by biotinylation and probed with anti-

phosphotyrosine (A) and anti-α-tubulin (B) further confirms the impermeability and the efficiency of the revised

protocol (n=2).

Lane 1: total sperm protein extraction (positive control);

Lane 2: surface protein from sperm in CM;

Lane 3 : surface protein from sperm in NCM;

Lane 4 : surface protein from sperm in PBS.

Figure 4.10: Improved protocol does not label internal sperm protein.

Molecular weight

(kDa)

Anti PY

Anti α-tubulin

105

4.6 Discussion

A wide range method has been largely used to study sperm proteomics. Lately, more specific approaches

have been employed to target proteins in order to upgrade the specificity. As well, surface protein extraction by

biotinylation could bring new facet of sperm proteomics. To the best of our knowledge, previous study has use

this process but none of them showed internal testing from their technique in spermatozoa labeling.

This study was performed to optimize a biotinylation protocol to isolate surface protein from sperm membrane.

Numerous technical adjustments were required of the original protocol from Pierce® to biotinylated sperm

surface proteins without inappropriate penetration of the biotin label into the sperm. The first modification was

about the sperm preparation. Percoll wash is communally use with sperm to eliminated dead sperm, debris

and obtain a clean population of motile sperm. Previous study has report that Percoll wash fragile sperm

membrane and promote premature capacitation (Matajs et al, 2010). As well, sperm previously washed with

Percoll demonstrated significant increase of disrupted membrane after biotinylation. Sperm centrifugation and

wash with warmed PBS showed clean population of live sperm and decreased percentage of disrupted

membrane compare to sperm wash with Percoll. In our goal to obtain a clean population of live sperm, warm

PBS wash was enough effective. Although we tend to choose motile and non-fragile spermatozoa, the

biotylation protocol still showed penetration through membrane. It has been well documented with surface

biotiynaltion protocol fixing studied cells as leukocytes with paraformaldehyde makes the process impermeable

(Hurley et al, 1985). Our study also found that of the Tris-HCl (50 mM) and glycine (25 mM) were both effective

in neutralizing free biotin before lysis preventing sperm biotinylation from inside them. These modifications

combined together developed a protocol to isolated sperm surface proteins only responding to the principal

aim. However, some aspects in surface biotinylation still needed to be explored in further study.

4.6.1 Internal protein labeling

Confidently used as a control in proteomics, the α-tubulin is mainly found into sperm cytoskeleton. The state of

penetration of the biotin into sperm was established by the level of marking of structural proteins. During

acrosomal reaction and capacitation certain morphological changes such as rearrangement of cytoskeletal

proteins are noticeable. Relocation of cytoskeletal structures was previously observed especially in the case of

actin-, alpha-, gamma-tubulin- and spectrin-containing structures (Dvorakova et al, 2001). Indeed the presence

of small amount of α-tubulin could be explicated by the reorganisation of sperm membrane during capacitation.

However monitoring absence of α-tubulin supports the amelioration of the protocol. At last, improve surface

biotinylation protocol was also tested with acrosin antibody, whom is found in the intact acrosome. Non-

appearance of acrosin and α-tubulin both confirm impermeability of the process. On the other hand biotin

106

could have penetrated sperm via numerous ions channel. To prevent this natural form of absorption,

sulfosuccinimidyl-2 (biotinamido) ethyl-1-1,3-diothiopropionate was selected for its high molecular weight

(606,7) and size.

4.6.2 Paraformaldehyde

During our experiment the initial use of the paraformaldehyde was justified in order to prevent the penetration

of biotin. Previous work has demonstrated fixation with PFA maintained the morphologic integrity of the

acromosal and plasma membranes while it increasing the post fixation binding of immunoglobulin to the sperm

surface (Haas et al, 1988). Indeed our results revealed difference of tyrosine phosphorylated protein between

sperm in different treatment media when compared to sperm maintain in phosphate buffer saline (PBS).

Although our method is questionable in a specific study of surface proteins, we suggest that fixation with

diluted PFA prevents the penetration of biotin without radically modifying the surface of sperm. However, the

exact effects of fixation on small membrane protein still need to be explores in further studies.

Furthermore this project was only conducted with pig sperm it would be interesting to extend it in other species

affect with capacitation issues as the horse. As membrane composition, fluidity and cholesterol/phospholipid

ratio varies from one species to another, this method would surely need modifications to succeed with horse

sperm (Parks and Lynch, 1992).

4.6.3 Future perspective

This work demonstrates that biotinylation can be used to isolate surface protein from pig sperm without

labeling internal protein. However, the impact of fixing the membrane prior to biotinylation could be

controversial. The optimized protocol may serve as basis for future research to define in vitro capacitation with

problematic species.

107

4.7 Acknowledgments

This research was supported by NSERC of Canada and a scholarship from RQR-CRBR-FQRNT to AM.

108

4.8 References




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111

Chapitre 5 Discussion générale

5.1 Implication générale de la recherche :

Le but principal de ce mémoire est de contribuer à l’étude de la reproduction mâle chez le cheval. Cette

espèce démontre plusieurs lacunes au niveau de la reproduction telles que l’incompétence de réussir la

fécondation in vitro, aussi la difficulté des spermatozoïdes équins de subir la réaction de l’acrosome dans le

tractus femelle ainsi que le faible taux de survie suite à la décongélation. L’ensemble de ces problématiques

sont liés intrinsèquement au contrôle de la capacitation. Afin de parvenir à réguler la capacitation in vitro,

l’étape primaire est de comprendre exactement le fonctionnement de cette dernière avec tous ses tenants et

aboutissants. Bien que les études d’un seul mémoire soit modeste comparativement au but principal de

résoudre le puzzle de la capacitation équine, les travaux effectués dans ce mémoire ont une grande ampleur

pour le secteur de la reproduction équine. La portée de l’initiative de ces études permettra d’améliorer les

techniques de fécondation in vitro spécifique au cheval et également d’améliorer les façons de traiter la

semence équine afin d’augmenter les taux de fécondité des étalons jusqu’à maintenant catégorisés sous-

fertile.

5.2 Étude sur les meilleures conditions afin de promouvoir et

caractériser la capacitation des spermatozoïdes équins in vitro

L’objectif initial étant d’étudier la capacitation des spermatozoïdes équins in vitro, il est primordial d’avoir accès

à de la semence fraîche et ce à raison de plusieurs fois par semaine. Afin de pallier à ces conditions non-

favorables au Québec, j’ai effectué mes études sur les chevaux à l’Université Texas A&M au sein du

laboratoire « Stallion Reproductive Studies » dirigé par les plus grands chercheurs en reproduction équine soit

Dr Dickson Varner, Dr Charles Love, Dr Terry Blanchard, Dr Steven Brinsko ainsi que Dre Katrin Hinrich.

L’opportunité de faire un stage à l’international au sein de cette équipe à la fine pointe de la technologie m’a

permis d’effectuer une étude plus poussée et significative que ce que je n’aurai pas été capable d’effectuer en

sol québécois. Je souhaite que la finalité de ce mémoire permette de démontrer le besoin en recherche sur la

reproduction équine et qu’éventuellement la suite des travaux puisse être effectuée au Québec.

112

5.2.1 Forces de l’étude

Il m’aurait été impossible de faire cette étude au Québec avec le manque de ressources physiques (étalon,

semence), financière pour un tel projet et par le manque de connaissance disponible spécifique à la

reproduction équine. Le milieu scolaire privilégié de mon étude m’a permis d’apprendre énormément sur la

manipulation des étalons, les techniques avancées d’amélioration de la fertilité, de la congélation de la

semence équine ainsi que de participer à des études de cas cliniques. Les résultats de mes travaux ont eu

une portée immédiate au sein de ce laboratoire et ont également déclenché des recherches plus poussées sur

les résultats inédits que j’ai obtenus sur la variation des résultats en la source de calcium. Un autre point fort

de cette étude est que l’expertise acquise au Texas n’est pas disponible au Québec. Je suis apte à

transmettre ces dernières aux chercheurs québécois en reproduction mais également aux vétérinaires et aux

éleveurs désirant participer à des techniques de reproductions avancées.

5.2.2 Faiblesses de l’étude

La fenêtre d’opportunité pour effectuer ce stage fut très courte. Malgré l’intention initiale de performer la

biotinylation des protéines de surface des spermatozoïdes équins, le protocole n’était toujours pas

complètement fonctionnel avec la semence porcine avant mon départ. Ma directrice de mémoire ainsi que

moi-même ont tout de même saisi l’occasion d’accomplir cette formation sachant très bien que les études de

biotinylation sur la semence équine resteraient à l’état de commencement. Bien que mes chapitres 2 et 3

manque de profondeur, j’ai énormément appris lors de ce séjour et mes études ont découlés sur d’autres

débouchées scientifiques. En effet, mes recherches ont permis d’identifier une problématique insoupçonnée

chez cette espèce soit la source de calcium du médium. Ces résultats ouvrent la porte sur d’autres projets

mettant l’emphase sur l’effet comparatif du chlorure de calcium par rapport l’hemilactate de calcium ainsi que

le rôle important du pH sur la capacitation.

5.2.3 Perspectives futures

La prochaine étape serait de valider les conditions établis par mes résultats en les incorporant à un essai de

fécondation in vitro. Somme toute, le pont de transfert de connaissances qui a été mis sur pied entre Texas A

& M et l’Université Laval met la table pour des collaborations futures. Au moment d’écrire ses lignes, l’abattage

de chevaux aux États-Unis est toujours interdit privant les centres de recherches américains de matériel

biologique. Il est plutôt ironique que les plus grands chercheurs en reproduction équine située au Texas

doivent importer des ovaires de juments du Québec. Cette situation facilitera la collaboration entre les centres

113

canadiens et américains. D’un côté les Américains possèdent l’expertise et de l’autre, les Canadiens

possèdent le matériel nécessaire. D’ailleurs Dre Katrin Hinrinch a démontré une grande ouverture à transférer

ses connaissances au laboratoire de Dre Bailey afin que ces travaux soient valorisés. La réalisation future de

la fécondation in vitro équine est plutôt réalisable dans les conditions québécoises maintenant que notre

laboratoire possède les connaissances et les contacts nécessaires pour un projet de cette envergure.

5.3 Étude sur l’optimisation d’un protocole d’isolement de

protéines de surface des spermatozoïdes

Le chapitre 4 de ce mémoire est consacré à l’optimisation d’un protocole d’isolement des protéines de surface

des spermatozoïdes afin d’étudier la surface spermatique durant la capacitation. L’étude du rôle des protéines

de surface est justifiée par l’incapacité des spermatozoïdes équins à féconder un ovocyte in vitro et également

par l’importance de la surface de la membrane plasmique des spermatozoïdes dans l’initiation de cascades de

signalisations cellulaires. Afin de parvenir à cette fin, il fut primordial d’établir des paramètres et des protocoles

fiables de base pour éviter toute contamination et également certifier la véracité des résultats.

5.3.1 Forces de l’étude

Suite à mes travaux, le protocole d’isolation de protéines de surface de la membrane des spermatozoïdes

porcins est désormais efficace et il a été démontré qu’il ne permet pas le marquage des protéines internes.

L’utilisation d’une méthode alternative à l’isolation des protéines de surface fut au final une grande réussite

avec son lot de défis. Désormais, le protocole est facilement transférable à d’autres étudiants afin de l’utiliser

spécifiquement à des études comparatives de protéines de surface durant la capacitation.

5.3.2 Faiblesses de l’étude

Bien que l’objectif initial fût de caractériser les changements protéiques de la surface des spermatozoïdes

équins durant la capacitation, plusieurs facteurs ont rendus cet objectif utopique. La première faiblesse du

chapitre 4 est qu’il a été irréalisable d’optimiser le protocole de biotinylation avec de la semence équine. Vu

l’accès difficile à de la semence d’étalon, cette étude fut réalisé seulement avec la semence porcine. Comme

expliqué précédemment, le délai entre les essais de biotinylation et le départ du stage au Texas fut très court.

C’est avec le sentiment que cette étude n’est pas terminée que j’ai eu le regret de mettre de côté la

caractérisation des protéines de surface des spermatozoïdes par spectrométrie de masse. Toutefois, mes

114

travaux sont une base solide sur lesquels un autre étudiant pourra initier la caractérisation protéique à ce

niveau.

5.3.3 Perspectives futures

Afin de valider le protocole de biotinylation, une expérience de comparaison entre les spermatozoïdes pré et

post capacitation serait de mise. L’idéale serait de comparer des spermatozoïdes fraîchement éjaculés avec

ceux récupérer dans le tractus génital de la jument quelques heures post-bridage in vivo ainsi qu’avec d’autres

conditions de mise en incubation (pH) dans des conditions capacitantes in vitro. Il serait grandement

intéressant de comparer les protéines de la surface des spermatozoïdes entre des étalons considérés fertiles

avec de la semence d’étalons sous-fertiles.

115

Chapitre 6 Conclusion générale

Mon objectif général de ce mémoire était d’étudier les changements protéiques exclusivement de la surface de

la membrane durant la capacitation afin d’améliorer la compréhension de la capacitation équine. Bien que

l’objectif initial fût envisageable, différentes faiblesses de mes études citées plus tôt m’ont empêché de

l’accomplir parfaitement. Somme toute, mes travaux ont permis d’apporter une amélioration considérable à

d’un protocole d’isolation de protéines de surface des spermatozoïdes porcins et aussi d’établir les conditions

idéales favorisant la capacitation in vitro chez les spermatozoïdes équins. Ces acquis sont prêts à être utilisés

par mes pairs et pousser les nouvelles découvertes des processus signalétiques de la capacitation.

En plus, de contribuer à la recherche active en fonction mâle, l’accomplissement de ce mémoire m’a permis

de développer des aptitudes en recherche qui me seront très utiles dans ma vie professionnelle. En cours de

maîtrise je fus engagé comme conseillère en production animale pour la Mauricie par le Ministère de

l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec. Ma profession consiste principalement à effectuer

la veille technologique, vulgariser les nouvelles technologies mais également de préparer et mener à termes

des projets novateurs pour les producteurs agricoles. Avec l’expérience que ce mémoire m’a apportée, je me

sens apte à accomplir ces nouveaux défis professionnels.

117

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