S. Bourgerie 2006-07

L3-BH01Cours n°7

Réparation de l’ADN

Ce cours est présent sur le web à l’adresse suivante :http://www.univ-orleans.fr/sciences/BIOCHIMIE/L/ressources.htm

Introduction

I- Erreurs de la réplication – mécanisme de leur réparationfonction de correction d’épreuve des ADN polymérases

activité 3’-5’ exonucléasique de l’ADN pol Isystème de réparation des mésappariementsmécanisme de réparationméthylation

II- Dommages de l’ADNdommages spontanés

désaminationdépurination

dommages provoquésradiation UV alkylationagents intercalant analogues de bases

III- Systèmes de réparation des dommages de l’ADNréparation par simple réversion

photoréactivationdé-alkylation

B.E.R : ‘base excision repair’N.E.R : ‘nucleotide excision repair’Synthèse translésionnelle

Récapitulatif

Plan

INTRODUCTION

Les mutations

- correspondent à des changements permanents dans la séquence nucléotidique de l’ADN- peuvent aller du remplacement d’une paire de bases par une autre (substitution)

à l’addition ou la délétion d’une ou plusieurs paires de bases (insertion ou délétion)

Mutation silencieuse : mutation touchant un ADN non essentiel ou qui occasionne un effet négligeableMutation favorable : celle qui confère un avantage à la cellule

Le plus souvent les mutations sont néfastes

Toutes les cellules possèdent de multiples systèmes de réparation de l’ADN

Système Enzymes - protéines Type d’altération

Réparation des erreurs d’appariement

Dam méthylaseProtéines MutH, MutL, MutSADN hélicase IISSBADN polymérase IIIExonucléase IADN ligase

Erreurs d’appariement

Réparation directe ADN photolyasesO6-méthylguanine transférase

Dimères de pyrimidineO6-méthylguanine

Réparation par excision d’une base

ADN glycosylasesEndonucléasesADN polymérase IADN ligase

Bases anormalesBases alkykées(dimères de pyrimidine)

Réparation par excision d’un nucléotide

Excinucléase ABCADN polymérase IADN ligase

Lésions de l’ADN qui provoquent des changements structuraux

La correction d’épreuve des ADN polymérases

Un exemple d’accident de la réplication : Transition TA - CG

Transition : remplacement d’une purine par une purineou remplacement d’une pyrimidine par une pyrimidine

Erreurs dans la réplication : un exemple

1er type de réaction catalysée par l’ADN pol I : synthèse d’ADN

Structure de l’ADN polymérase I d’E. coli

Fonction de correction d’épreuves des ADN polymérases

Mise en œuvre d’uneactivité 3’-5’ exonucléolytique

Correction d'épreuve

Fonction de correction sur épreuve de l’ADN polymérase I : modèle

2ème type de réaction catalysée par l’ADN pol I : Exonucléase

Correction de l’ADN pol I : activité 3’-5’ exonucléase

Lorsqu’un nucléotide mal apparié par des liaisons hydrogène est

accidentellement incorporé lors de la synthèse d’ADN, la polymérase

s’arrête, excise le nucléotide en cause et reprend sa copie.

Fidélité de la réplication de l’ADN

ProcessusFréquence d'erreur

cumulée

Appariement des bases10-1 à 10-2

Sélectivité de l'ADN polymérase et action correctrice par activité exonucléase 3'- 5'

10-5 à 10-6

Rôle des protéines accessoires (ssb par exemple)

10-7

Correction postréplicative des mésappariements

10-10

Le système de réparation des erreurs de réplication de l’ADN(système MMR, mismatch repair ou système MutHLS chez E. coli)

Les mésappariements de l’ADN susceptibles d’être réparéspar le système MMR sont, dans la grande majorité descas, la conséquence d’erreurs commises par l’ADN polyméraseau cours du processus de réplication.

Correction des mésappariements suite à la réplication

Les causes de mésappariements

Imperfections de la correction des épreuvesTautomérisation spontanée

Mésappariements provoqués par les formes tautomériques des bases

N

N

O

O

H3C

thymine (céto)

N

N

N

N

adénine (amino)

H

NHH

N

N

O

O

H3C

thymine (énol)

N

N

N

N

guanine (céto)

OH

H

NHH

Appariement standard

Appariement anormal

N

N

HN

O

H3C

cytosine (imino)

N

N

N

N

adénine (amino)

H

NHH

N

N

HN

O

H3C

cytosine (amino)

N

N

N

N

guanine (céto)

OH

H

NHH

Appariement standard

Appariement anormal

Un exemple de substitution par commutation tautomérique type sauvage

…N G N……N C N…

G forme énol

…N G N……N C N…

type sauvage

…N Gé N……N T N…

…N A N……N T N…

mésappariement

type mutant

1ère réplication 2ème réplication

Transition GC-AT

1

2

Système MutHLS (chez E. coli)

La méthylation pour distinguer le brin parental et le brin néoformé

Structure de la protéine MutS fixée à l’ADN

Méthylation et réparation des mésappariements

ADN hémiméthylé

3le brin néosynthétisé est méthyléLes deux brins ne peuvent être distingués

Le brin matrice est méthylé; le brin néosynthétisé ne l’est pas

réplication1

2

DIRECTIONALITE de la réparation : exonucléases intervenantes

(a) Le motif GATC non méthylé est situé en 5’ de la mutation (b) Le motif GATC non méthylé est situé en 3’ de la mutation

Dommages de l’ADN

Mutations par modification chimique des bases

Agents mutagènes

Agents chimiquesqui transforment la base : désamination de la cytosine (en uracile)qui perturbent la réplication en s’intercalant dans l’ADNqui provoquent des transitions (A G)

Agents physiquesradiations (X, γ, UV)

(Mutation spontanée : phénomène rare)

Types de mutations qui entraînent un changement de base

Désamination

N

NH2

ON

O

O

CH2

PO

O

O

O-

NH

O

ON

O

O

CH2

PO

O

O

O-

désamination

cytosine uracile

conséquence

U-A remplace C-G

corrigé par le retrait de U(remplacé par un C)

Dépurination

O

O

CH2

PO

O

O

O-

adénine

N

NN

N

NH2

dépurination

O

O

CH2

PO

O

O

O-

conséquence

Une purine est absente

Correction par insertion

Dimère de thymine

NH

O

O

H3C

N

O

O

CH2

PO

O

O-

NH

O

O

H3C

N

O

O

CH2

PO

O

O-

O

NH

O

O

H3C

N

O

O

CH2

PO

O

O-

NH

O

O

H3C

N

O

O

CH2

PO

O

O-

O

irradiation par les UV

conséquence

correction par excision

Le dimère de thymine déforme le duplex

Alkylation

O

O

CH2

PO

O

O

O-

alkylation

guanine

NH

NN

N

O

NH2

O

O

CH2

PO

O

O

O-

méthyl-guanine

NH

NN

N

O

NH2

CH3

conséquenceLe groupement méthyl déforme la double hélice

correction par désalkylation

Les agents intercalant provoquent des changements de cadre de lecture

NH2N NH2

proflavine

NN N

acridine orange

H3C

CH3

CH3

CH3

BET

Analogues des bases

l’ADN peut incorporer le 5-BU à la place de la Thymine

courant rare

NH

N

O

O

H3C

thymine

NH

N

O

O

Br

5-bromo uracile(forme céto)

N

N

OH

O

Br

5-bromo uracile(forme énol)

N

N

O

O

Br

5-bromo uracile(forme céto)

N

N

N

NNHH

H

adénine

N

N

O

O

Br

5-bromo uracile(forme énol)

N

N

N

NO

guanine

H

NHH

H

Systèmes de réparation des dommages de l’ADN

Modes de réparation

1- réparation directe de la base mutée

2- réparation par excision d’un fragment (la plus courante)(nécessite des nucléases)

Photoréactivation : élimination directe

Réparation des dimères de pyrimidinpar la photolyase

HN

N N

NH

O- O

O O

HN

N N

NH

O O

O O

HN

N N

NH

O- O

O O

FADH2

HN

N

O-

O

HN

N

O

O

N

NH

O

O

N

NH

O

O

dimère de pyrimidine sous forme cyclobutane

.

.

.

FADH2*

radical flavine

Les agents alkylantsl’Ethylméthane Sulfonate (EMS) alkyle la Guanine

Protéines de dé-alkylation : éliminationdirecte

N

N

NH2

O

CH3

N

N

NH2

O

CH2OHN

N

NH2

O

CH2OH

HCHOH

3-méthyl-cytosine

1

4

3

6

5

2

+ +

cytosine

AlkB

αCGO2

succinateCO2

+

Systèmes de Systèmes de réparation par excisionréparation par excision

Tous les systèmes de réparation par excision fonctionnent de la même manière :

Étapes : 1- reconnaissance de la région d’ADN endommagé2- le brin d’ADN endommagé est scindé par une endonucléase3- une exonucléase élimine un fragment du brin endommagé4- une ADN polymérase et une ligase réparent de concert la brèche

Base Excision Repair : vue générale

Réaction de l’uracylglycosylase

Réparation oxoG:A

Réparation par excision de nucléotide : Réparation par excision de nucléotide : Système Système UvrABCUvrABC chezchez E. coliE. coli

Deux molécules de UvrA et une molécule deUvrB forment un complexe.Ce complexe se déplace au hasard le long del'ADN.

Quand le complexe rencontre une lésion, unchangement de conformation se produit qui entraîne une dénaturation locale de l'hélice d'ADNet une pliure de 130°.

Le dimère d'UvrA se dissocie de UvrB et l'endonucléase UvrC (excinuclease) se fixe et coupe le brind'ADN en deux sites séparés de 12 à 13 bases.

UvrB et UvrC se dissocient et une hélicasedéroule la région endommagée et relâche lebrin de 12 nucléotides qui est dégradé. Le trouest comblé par l’ADN polymérase I et recollépar la ligase.

“Nucleotide excision repair” chez E. coli : récapitulatif

Enzyme Protéine Fonction

UvrA (104kDa) scanne l’ADN, se fixe à UvrB

UvrB (78kDa)

UvrC (68kDa)se fixe à UvrB ; clive l ’ADN, 8 nucléotides en amont de la lésion

ADN hélicase UvrD enlève le fragment d’ADNADN polymérase

ADN polymérase I remplit la brèche

ADN ligase Lig scelle

Excinucléasese fixe à l’ADN ; clive l ’ADN, 5 nucléotides en aval de la lésion

Systèmes NER chez E. coli et chez l’Homme

Réparation par recombinaison (ou réparation post-réplicative)

lésion

3’

5’

5’

ba3’

BLOCAGE de la REPLICATIONBLOCAGE de la REPLICATIONpuis reprise, laissant une lacune

Synthèse trans-lésionnelle

RECAPITULATIF

Base modifiée par commutation tautomérique

Réparation des mésappariements

Dérapage réplicatif Réparation des mésappariements

Dépurination Réparation par excision de base

Désamination oxydative Réparation par excision de base

Base remplacée par analogue de base Réparation par excision de base

Alkylation Réparation par réversion directe

Oxydation Réparation par excision de base

Addition Réparation par excision de nucléotides

Pontage interbrin : dimères de T Réversion directe, excision de nucléotides, recombinaison, SOS

Pontage interbrin Réparation par recombinaison

Cassures simple brin Réparation par recombinaison

Quelles sont les conséquences des mutations?

2 conséquences principales des mutations

1- perte de fonction2- gain de fonction

Maladies héréditaires et cancers provoqués par des anomalies du fonctionnement des systèmes de réparation de l’ADN

…et chez les eucaryotes ?

C’est plus complexe…

Systèmes de réparation chez les eucaryotes (cellules de mammifères)

3 principaux :

1- O6-méthylguanine méthyl transférase:-responsable de l’enlèvement de groupements méthyl ajoutés sur les bases par des agents alkylants (mécanisme de réparation directe)

2- Système BER (Base Excision Repair)- répare les dommages causés par l’hydrolyse, les agents alkylant et les radicaux libres- enzymes clés: ADN glycosylases- chacune reconnaît un type spécifique d’altération de base

3- Système NER (Nucleotide Excision Repair)- répare les dommages plus volumineux (ex: dimère pyrimidine)- défaillance associée à certaines maladies (xeroderma pigmentosum)

BER chez les eucaryotes

Les enzymes du système BER :

Différentes glycosylases pour différents types de dommages:

8 glycosylases chez les eucaryotes:

- 4 qui reconnaissent les uraciles dans l’ADN

- 3 qui reconnaissent les lésions de type oxydative

- 1 spécifique pour les purines alkalonisées

NER chez les eucaryotes