TP1 2016/2017

INTRODUCTION DANS LE DOMAINE

DE L’EXPERIMENTATION SUR LES

ANIMAUX DE LABORATOIRE

PRESENTATION DU LABORATOIRE EXPERIMENTAL

REGLEMENTATION LEGALE CONCERNANT LA SECURITE DE TRAVAIL DANS LE LABORATOIRE EXPERIMENTALE

INTRODUCTION DANS LA TECHNIQUE EXPERIMENTALE

- PESENTATION GENERALE

- LES PRINCIPES D’EXPERIMENTATION SUR ANIMAUX

- LES TYPES D’EXPERIMENTATIONS

- LA MANIPULATION DES ANIMAUX

- L’ADMINISTRATION DES PRODUITS MEDICAMENTEUX ET LA COLLECT D’ECHANTILLONS BIOLOGIQUES

- L ANASTHESIE LOCALE/REGIOLALE ET GENERALE

- LES METHODES D’ENREGISTREMENT DES RESULTATS

- LE PROTOCOLE EXPERIMENTALE

LE CONTENUE

Le personnel dans les laboratoires spécifiques d'enseignement expérimental est protégé par la réglementation de Directive 98/391/EEC.

- Les principes de cette Directive EU sont axés sur la prévention des risques, ce qui nécessite:

- une évaluation des risques par l'enseignant;

- l’obligation de fournir toutes les conditions nécessaires pour mener une pratique sécuritaire.

Ces règlementations ont été prises dans la législation nationale et aussi par les États de l'UE;

- Les états de L’EU sont autorisés à inclure certaines règles supplémentaires ou plus strictes, telles que la restriction de certaines techniques de travail.

LA SÉCURITÉ DE TRAVAIL DANS

UN LABORATOIRE EXPÉRIMENTALE

Les facteurs de risque chimiques

manipulation de substances chimiques dangereuses:

- Intoxication aigue; - Intoxication chronique;

Les facteurs de risque physique:

- Facteurs mécaniques;

- Facteurs électrique; - Facteurs thermiques;

Les facteurs de risque biologiques:

- prélèvement et manipulation des produits biologique (sang, urine etc) provenant des animaux

- infectieux,

- allergique .

REGLEMENTATION LEGALE CONCERNANT LA

SECURITE DE TRAVAIL DANS LE LABORATOIRE

- La directive 98/24/EEC établit les exigences minimales pour la protection des travailleurs, et concerne les effets des agents chimiques qui sont présents au lieu de travail ou découlant des activité de laboratoire.

- La directive 2004/37/EEC qui protégé les employés contre les risques associés à l'exposition à des composés cancérigènes et mutagènes existant dans l'environnement.

- Les directives 91/322 / CEE, 96/94 / CE, 2000/39 / CE, 2006/15 / CE, fixent des limites à l'exposition à des produits chimiques au travail dans les états membres de l'UE.

- La directive 92/58/CEE comprend les qualifications et les règlements d'étiquetage, tels que les étiquettes et les symboles de données de sécurité utilisées pour identifier les substances dangereuses.

LES RISQUÉS CHIMIQUES

les quantités étudiées seront faibles;

ne gère pas près du feu;

réactifs ne doivent pas être placés dans les puits;

uniquement de la vapeur chauffée;

Un objectif important est de prévenir les maladies et les accidents des travaux professionnels causés par les gaz, vapeurs, des poussières, des dispositifs à commande électrique et le contact direct avec des animaux malades.

Des mesures spécifiques pour prévenir les accidents, en plus de l'utilisation d'équipement de protection doit être conforme aux règles d'hygiène:

La manipulation des substances

corrosifs, inflammables et explosifs

Les principales catégories de substances

potentiellement dangereuses utilisées dans

les activités de laboratoire/experimentalles

Tableau 1 Produits chimiques et réactifs couramment utilisés et qui crée un risque d'incendie, d'explosion ou d'intoxication

Catégories de substances Le titre Substances explosives ou qui peuvent former des mélanges explosifs

L'acide picrique, le nitrate de potassium, nitrate de sodium, nitrate de calcium et le chlorate de potassium

Gaz liquéfié et comprimés: - gaz avec le risque d'explosion; - gaz inertes, non-inflammables

L'acétylène, l'hydrogène, l'ammoniac, le chlorure de méthyle, l'oxyde d'éthylène, le propane L'azote, le dioxyde de soufre, CO2

Autocombustion substance dans contact avec l'air et de l'eau

Le potassium, le sodium, le carbure de calcium, du phosphure de calcium et de sodium, la poudre de zinc, le peroxyde de baryum, le phosphore blanc ou jaune

Substances facile inflammable L'essence, le benzène, le disulfure de carbone, l'acétone, essence de térébenthine, le toluène, l'acétate d'éthyle, l'alcool amylique, l'éther diéthylique, etc.

Combustible ou qui peut provoquer un incendie

Le noir de carbone, le soufre, l'acide nitrique, l'acide sulfurique, l'anhydride chromique, permanganate de K.

Poisons et toxique puissant Le chlore, la chloropicrine, du phosgène, le trioxyde d'arsenic, des cyanures

Les substances ayant un potentiel cancérogène

- Arsenic et composés inorganiques de l'arsenic, du chlore et des composés organiques de chrome, la benzidine, le 2-naphtylamine; benzène, dietilstilbestronul, gaz moutarde,, du goudron, les huiles minérales, l'alcool propylique

Facteurs mécaniques: pparticulièrement lors de la contention ou de l’ immobilisation de l’animal. - Lié à l’animal: Morsures, griffures; - Lié à l’expérimentation: port de charge,coupures, piqures;

Facteurs électriques: - Choc électrique: c’est l ’effet physiopathologique résultant du passage d’un courant électrique à travers le corps; - Contact direct: contact de personne avec une partie active d’un circuit électrique; - Contact indirect: , contact de personne avec une masse mise sous tension par suite d’un défaut d’isolement . - Le foudroiement: est un électrotraumatisme mortel dû à la foudre (effet d’arc).

Facteurs Thermiques: - Les expériences conduites à température élevée et l ’uti lisation de substance cryogéniques doivent également faire l ’objet d’une mise en évidence des dangers associés par un affichage indiquant les températures ou les substances impliquées

FACTEURS DE RISQUES PHYSIQUE

LES RISQUES BIOLOGIQUE

La directive 2000/54/CE établit les définitions:

-Les agents biologiques: définis comme des micro-organismes pathogènes, y compris les organismes génétiquement modifiés, des cultures cellulaires, des bactéries pathogènes, des endo/ectoparasites qui peuvent causer une infection, une allergie ou endo-intoxication.

-Microorganismes - définie comme entité microbiologique, cellulaire ou non cellulaire, capable de se reproduire ou de transférer du matériel génétique.

Cette directive réglemente dispositions minimales destinées à garantir un meilleur niveau de sécurité pour les chercheurs qui sont exposés ou potentiellement exposés à des agents biologiques pathogènes.

- Le groupe 1 - des agents biologiques qui ont un faible

potentiel de causer des maladies chez les humains ou animaux;

- Le groupe 2 - des agents biologiques qui peuvent causer des

maladies chez les humains et chez d'autres espèces animales, mais

moins susceptibles de se propager dans l 'environnement.

- Il existe un traitement efficace et la prévention;

- Le groupe 3 - des agents biologiques qui peuvent causer des

maladies sévères, avec un risque accru de maladie pour les

opérateurs, et avec le risque de propagation dans l 'environnement;

- aucune moyens de prophylaxie et de traitement ne

sont pas efficaces dans le cas de cette catégorie de pathogènes.

- Le groupe 4 - des agents biologiques qui peuvent causer des

maladies graves, avec un risque considérablement accru de maladie

pour les opérateurs présentant un risque élevé de propagation;

- i l n’existe aucune thérapie efficace ou des mesures

préventives contre les agents pathogènes de cet type (ex: l ’anthrax)

Les agents biologiques

sont classés en 4 groupes

Exemple sur les risques infectieux

Voies de transmission Affections Espèces animales

Infections à Herpes virus B Singe asiatique

Morsures Fièvre par morsure de rat Rongeurs (surtout rats)

Pasteurellose

Rongeurs, chiens, chats

Rage Tous mammifères

Leptospirose Rongeurs, chiens

Cutanée (sans effraction) Tularémie Lagomorphes, rongeurs

Mycoses

Tuberculose Primates et nombreux mammifères

Herpes virus B Singe asiatique

Griffure ou piqûre Tularémie Lagomorphes

Pasteurellose

Rongeurs, chiens, chats

Erysipéloïde Poissons, porcs

Hépatite B Primates

Projections Tuberculose Primates et nombreux mammifères

conjonctivales Tularémie Lagomorphes, rongeurs

Psittacose Oiseaux, psittacidés (oiseaux grimpeurs)

Inhalations (aérosols Chorioméningite lymphocytaire Rongeurs

infectieux) Encéphalomyocardite Rongeurs

Fièvres hémorragiques Rongeurs

Amibiase, shigellose, yersiniose, Primates

Ingestion Hépatite A Primates et nombreux mammifères,

Salmonellose Serpents

Morsures ou piqûres de Certaines arboviroses Rongeurs, tiques

tiques Borrélioses, rickettsioses Tiques

Actions génératrice d’aérosols

Action Mode d’exposition Prévention

A l’ouverture du tube

Laisser reposer la suspension avant ouverture

Centrifugation

Ouvrir sous PSM

Tube cassé Equilibrage des tubes

Ultracentrifugation

A l’ouverture du rotor, en cas Ouvrir le rotor sous PSM

d’utilisation de tubes non bouchés

Homogénéisation au vortex Aérosol si tube ouvert Utiliser des tubes bouchés

Placer l’appareil dans une enceinte

Sonication, broyage

Aérosol si contenant (tube, Utiliser des contenants fermés flacon de culture…) ouvert Laisser reposer la suspension avant ouverture

Ouvrir sous PSM

Pipetage

Aérosol dû à la présence d’air Ne pas expulser violemment le liquide de la pipette.

dans la pipette

Laisser couler le liquide le long du tube

Flambage (pipette, anse Génération d’aérosol lors du Ne pas flamber (car peu efficace) d’ensemencement) passage à la flamme Utiliser du matériel jetable

Manipulation de litières Génération de poussières lors Porter des masques de protection FFP2 ou 3

contaminées par un pathogène

du changement des litières

Tableau 5 : Modes d’exposition aux aérosols et prévention

Les produits biologiques provenant d'animaux - sang et l'urine, liquide céphalo-rachidien - sont potentiellement infectés ou infestés de germes ;

- tests de goût est strictement interdit pour les substances utilisées en laboratoire ou des échantillons biologiques expérimentaux et l'utilisation de la verrerie de laboratoire interdite pour préparation d'eau potable ou de la nourriture;

- pipetage des liquides toxiques ou de produits biologiques est faite en utilisant la fiche de sécurité de la bulle pipette fournie de coton ou de la soufflante, ce qui éliminerait toute possibilité de contact avec la muqueuse;

Les travaux pratiques qui présente un danger d’éclaboussure avec substances toxiques ou de produits biologiques infectés doivent être effectuées dans la niche de personnel spécialisé ;

La manipulation des produits

biologiques récoltés des animaux

Éliminer le r isque en changeant le produit, et s’ i l n’est pas possible, la

substance toxique pour être remplacé par des produits non dangereux;

Lorsque les risques ne peuvent pas être évités, des mesures de

contrôle doivent être prises pour éliminer ou réduire les risques:

L'uti l isation des équipements et matériels d'une manière appropriée,

afin de réduire le risque de dégagement de substances dangereuses ;

Des mesures de protection collective dans les zones à risque;

L'application de mesures de protection individuelle, y compris

l 'équipement de protection individuelle;

La meilleure façon de prévenir les accidents dans le laboratoire doit

être formé et informé regarder les matériaux que vous travaillez ;

Assurez-vous que vous êtes protégé avec l 'équipement de protection

personnelle si l 'exposition ne peut être empêchée par d'autres moyens

Planifiez votre travail et suivez les instructions. Si vous ne savez pas

comment faire un certain travail, demander l 'aide du superviseur ;

Que peut-on faire pour prévenir

les accidents dans le laboratoire?

INTRODUCTION DANS LE DOMAIN DE

L’EXPERIMENTATION SUR DES ANIMAUX

Les principes de la médecine expérimentale

Il faut éviter de soumettre les animaux à des souffrances ou à des angoisses inutiles.

La technique d'expérimentation doit leur assurer toute la protection possible qu'il s'agisse

- de recherche scientifique,

- d'enseignement;

- de techniques d'expérimentation;

Les coûts et la convenance ne doivent pas avoir la préséance sur le bien-être physique et mental de l'animal.

EXPERIMENTATION SUR LES ANIMAUX

- On utilise les animaux de laboratoire dans des recherches expérimentale pour les raisons didactiques et de la recherche scientifique

Des animaux choisis pour expérimentes:

- Rongeurs de laboratoire: Rats, souris, lapins,

- Cochons d’inde,

- Primates non humain,

- Chats et Chien

Règles et procédures pour protéger les animaux de souffrance produit par les activités expérimentales.

INTRODUCTION DANS LA TECHNIQUE

EXPÉRIMENTALE DE PHYSIOPATHOLOGIE

Expérimente aigue:

- se déroule dans un court laps de temps – on produis une lésion intense et on évalue les réactions locale et régionales.

Ex: le réaction inflammatoire;

Expérimenté chronique:

- se déroule dans une période long de temps (semaine, mois, ans) – permet l’évaluation des réactions générale de l'organisme a l’action des facteurs pathogènes.

Ex: le cancer expérimentale.

TYPES D’EXPÉRIMENTATION

EXPÉRIMENTÉ CHRONIQUE

(LE CANCER EXPÉRIMENTALE)

La situation impliquant l'immobilisation des animaux, présentée ci-dessous, afin d'éviter les accidents (ex: morsures, égratignures, etc.) en cas de recours à des mesures d'aide pour éviter l'infection ou la transmission de zoonoses.

Dans ce contexte, il accordera une attention particulière pour surveiller la santé des animaux de laboratoire, en particulier en ce qui concerne:

- les maladies transmissibles à l'homme,

- les spécificités du travail

Si les animaux utilisées sont malades seront pris des mesures supplémentaires de protection du travail, par l'utilisation de gants en caoutchouc etc.

LE CONDITIONEMENT DES ANIMAUX

Tableau synoptique des techniques de prélèvement

de sang à recommander, acceptables ou à rejeter

chez les rongeurs de laboratoire et les lapins

L’ ANESTHESIE LOCALE

L’ ANESTHESIE REGIONALE

L’ ANESTHESIE GENERALE

LES TECHNIQUES D’ANESTHESIE

L’anesthésie locale s’obtient soit par:

- une administration topique,

- une injection sous-cutanée

ou intradermique d’anesthésique local.

L’anesthésie locale est utilisée pour des chirurgies mineures de courte durée:

- la suture d’une plaie.

ANESTHÉSIES LOCALES

L’anesthésie générale procure une perte complète de la sensibilité et de la conscience.

- par l’inhalation d’un produit gazeux;

- par l’utilisation de drogues injectables.

Un bon anesthésique doit entraîner une perte de conscience, une bonne analgésie, une bonne relaxation musculaire et une faible dépression cardio-respiratoire. I

l peut être nécessaire d’utiliser une combinaison de produits anesthésiques et analgésiques afin de procurer une anesthésie sécuritaire et complète chez certains animaux.

ANESTHÉSIES GÉNÉRALES

L’anesthésie aux agents volatils (ex: l’isoflurane) est la méthode de choix pour toute les formes d’anesthésie de rongeur.

Le gaz anesthésique est administré à l’aide d’un masque placé sur son museau.

Lorsque il est possible:

- un tube endo-trachéal est utilisé;

- pour augmenter l’efficacité de l’anesthésie et diminuer les pertes.

INHALATION D’UN GAZ ANESTHÉSIQUE

L’anesthésie aux injectables peut être utilisée lors

de chirurgies mineures, de courte durée ou lorsqu’il est

impossible d’utiliser l’anesthésie par inhalation.

- il est fortement recommandé d’utiliser

l’anesthésie aux injectables seulement lors de procédure

terminale (ex: perfusion).

- Le jeûne pré-anesthésique n’est pas nécessaire.

- Une source de chaleur (tapis chauffant à eau

circulante, lampe ou autre) doit préférablement être mise

en place pour éviter l’hypothermie.

- Un protocole d’analgésie adéquat doit aussi être

mis en place pour toutes procédures chirurgicales.

- L’administration de fluides tièdes à l’animal

durant et après l’anesthésie est recommandée.

L’anesthésie par inhalation d’ isoflurane est la

méthode choix pour toute anesthésie de rongeurs.

L’anesthésie aux injectables doit être utilisée

seulement si on ne peut utiliser l’anesthésie par inhalation

pour une cause scientifique ou une procédure terminale.

Une attention particulière:

- au poids de l’animal;

- aux doses administrées;

- à la voie d’administration doit être portée pour éviter

le surdosage et les complications.

Lors d’anesthésie aux injectables, l’administration

d’O2 facilitera le maintien des fonctions vitales de l’animal.

La profondeur anesthésique et les effets secondaires

d’une anesthésie aux injectables sont moins prévisibles.

ADMINISTRATION DE DROGUES INJECTABLE

Les types d’anestesiques injectables

L’ANALGESIE CHEZ LES RATS

L’anestesie par inhalation chez les rats

L’anestesie par inhalation/injectable chez les rats

L’ANESTESIE CHEZ LES SOURIS

L’anesthésie par hypothermie est facile à util iser chez les nouveau-nés (âgés de 1 à 3 jours) puisque ceux ci ne possèdent pas de duvet.

- Placer l ’animal en contact avec la glace;

- Afin de protéger l ’animal contre les brûlures potentielles que pourraient occasionner un contact direct entre la peau et la glace, i l est recommandé de créer une barrière de protection entre l ’animal et les glaçons.

- Placer l ’animal dans un gant, compresse humide, pellicule de plastique (saran wrap) posé sur la glace;

- Une fois l ’animal anesthésié (2-3 minutes), ce dernier est placé sur une boîte de pétri en verre remplie de glaçon afin d’assurer un maintien de l’anesthésie;

- La procédure peut durer 15-20 minutes de façon assez sécuritaire - les risques de mortalité augmentent;.

- Le réveil de l’animal s’effectue graduellement sur un coussin chauffant à une température de 3739 C.

ANESTHESIE DES NOUVEAU-NÉS

Une vérification du matériel disponible doit toujours être effectuée avant l’anesthésie :

- équipement d’anesthésie,

- équipement de surveillance,

- médications,

- personnel.

Un examen physique de l’animal doit être fait avant de débuter afin de s'assurer que celui-ci est en bonne condition pour supporter

- l'anesthésie,

- la procédure chirurgicale.

La pesée de l’animal est essentielle pour un dosage adéquat des drogues à administrer et pour le suivi postopératoire.

L’ÉVALUATION PRÉ-ANESTHÉSIQUE

L’induction peut être faite par:

- l’administration d’anesthésiques injectables;

- l’utilisation d’une chambre à induction.

Dès que l’animal est inconscient, il est important de lui appliquer un onguent ophtalmique dans les yeux afin d’éviter l’assèchement de ceux-ci.

- si des procédures expérimentale douloureuses sont prévues sur l’animal durant son anesthésie (ex : chirurgie, injection, etc.), une dose de médicament analgésique (ex: buprénorphine) doit être administrée à l’animal afin de:

- prévenir la douleur;

- diminuer le stress lors du réveil.

INDUCTION OU L’ÉTAPE DANS

LAQUELLE L’ANIMAL TOMBE INCONSCIENT

Le maintien est l’étape de l’anesthésie qui permet d’obtenir une profondeur d’anesthésie nécessaire à l’intervention chirurgicale.

La surveillance anesthésique vas être effectuée:

- couleur des muqueuses,

- fréquences respiratoires et cardiaques,

- type de respiration,

- réflexes,

- réponse à un stimulus douloureux,

- température.

Le niveau d’anesthésie doit être ajusté en fonction de la profondeur d’anesthésie nécessaire.

Ces paramètres sont des bons indicateurs de la profondeur d’anesthésie de notre animal :

MAINTIEN ET SURVEILLANCE ANESTHÉSIQUE

À surveiller :

- Respiration régulière ou non;

- Respiration rapide ou non;

- Respiration profonde ou non;

- Amplitude de la respiration :

- normale ou difficile et abdominale.

La FR va augmenter lorsque l’anesthésie est moins profonde et/ou que l’animal perçoit une sensation suite à un stimulus douloureux.

- la respiration est diminuée et devient difficile et abdominale lorsque l’anesthésie est plus profonde

Fréquence respiratoire et type de respiration

FUNCTION CARDIAQUE ET LE RESPONSE AUX STIMULUS

REFLEXES ET TEMPERATURE

Le suivi de l’état de l’animal doit se poursuivre

durant la phase de réveil;

- on doit s’assurer que les voies respiratoires ne

sont pas obstruées par la langue.

Lors du réveil, l’animal doit être placé dans une

cage propre près d’une source de chaleur afin de

diminuer les risques d’infection et d’hypothermie.

RÉVEIL ET SOINS POSTOPÉRATOIRES

L’examen clinique:

- fréquence cardiaque;

- fréquence respiratoire;

- temperature centrale/rectale;

- les reflexes.

L’examen de laboratoire:

- determination hematologiques;

- determination biochimiques;

- determination enzimatiques;

Techniques d’imagerie medicale:

- radiographie/ radioscopie;

- resonance magnetique nucleaire;

- scintigraphie, echographie, etc.

L’ENREGISTREMENT DES RESULTAT

Titre de l’experimente ou du projet;

Le but de l’experiment

Les materiaux necessaire

- materiaux biologique – les animaux;

- matériel de laboratoire;

- reactives, substances, colorants etc

La technique de travail

L’enregistrement des resultats

L’interpretation des resultat

Les conclusion

Les références de la littérature

LE PROTOCOL EXPERIMENTALE

L'ÉVALUATION DES ACTIVITÉS DE LABORATOIRE: Semaine 7 - la première vérification des connaissance: - test rédactionnel sur les TPs; Semaine 13 – la deuxième vérification des connaissance: - test de compétences pratiques. Semaine 14 – Présentation de l’essay bibliographiques