intégration d’un protocole biologique complet dans des...

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Ecole thématique SMB2009 C. Peponnet CEA/LETI 12/6/09

Intégration d’un protocole biologique complet dans des laboratoires sur puce:

focus sur la préparation d’échantillonsChristine Peponnet

[email protected]

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Plan du cours :

� Introduction� Qu’est ce qu’un laboratoire sur puce ?� A quoi ça sert, quels avantages ?

� Qu’est ce qu’un protocole biologique � Le prélèvement

� Ou ?� Quoi ?� Combien ?

� La préparation de l’échantillon � Stabilisation de l’analyte� Concentration / Purification

� Intégration � Conclusion

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Qu’est ce qu’un laboratoire sur puce ?

C’est la miniaturisation d’un laboratoire d’analyse

patient

Préparationéchantillon

Protocole analytique

Traitement de données

POC

C’est un système d’analyse de terrain qui se

débrouille tout seul Rapprochement du lieu

d’analyse au lieu de prélèvement

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Un protocole

Un utilisateur

Un instrument Un microcomposant

Des réactifs

Qu’est ce qu’un laboratoire sur puce ?

C’est l’ensemble qui fait que le laboratoire sur pu ce fonctionne

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A quoi peut servir un laboratoire sur puce ?

Permet de réaliser des tests délocalisés autonomes

C’est un système d’analyse de terrain aux applications multiples

Diagnosticmédical in-vitro

Life scienceChimie

Monitoring de l’environnement

sécurité

air

eau

agroalimentaire

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Lab on a chip

BiologieMicrotechnologie

Croisement de la physique, chimie & biologie

La miniaturisation apportée par les microtechnologies permettra la mise en œuvre de nouvelles approches pour la biologie, en utilisant

entre autre la maîtrise des écoulements; les forces capillaires, le grand rapport surface sur volume

Microfluidique

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Liquideen litre

AIR m 3

PrélèvementPréparationéchantillon

Analyse

10ml à 10µl

Sang enml ou µl

Une analyse n’est pas juste une étape de détection !

Le point critique est le prélèvement et la préparation d’échantil lonLa taille de l’échantillon doit être statistiquement significa tif !

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Plan du cours :

� Introduction� Qu’est ce qu’un Laboratoire sur puce ?� A quoi ça sert, quels avantages ?

� Qu’est ce qu’un protocole biologique� Le prélèvement


� La préparation de l’échantillon� Stabilisation de l’analyte� Concentration / Purification

� Intégration� Conclusion

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Samplepreparation

Prélèvement : Qu’est ce qu’un échantillon ? � Un échantillon est le milieu dans lequel se trouve l’analyte

� L’analyte est ce qu’on veut détecter

� Les interférents sont des substances qui perturbent le test : � faux positif : problème de spécificité

� faux négatif : problème de sensibilité

� l’échantillon va spécifier toute la chaine analytique

Samplecollection

Analyticalprotocol

detection

Pathogene in river water

DNA purification

PCR & hybridization

Fluorescent detectionof the µarray

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Prélèvement : Ou se trouve l’analyte ?

Legionella est une bactérie ubiquitaire :

� Contrôle industriel : � Taille de l’échantillon : 1 liter

� Eau de TAR : très chargée, épaisse, ….� Eau chaude sanitaire : eau propre

� Sensibilité : 100 cfu

� Diagnostic : Pneumonie atypique : � Urine (quelques ml) ou crachat � Sensibilité : quelques bactéries

� mais aussi dans l’air, les sols, les rivières….

Il faut savoir dans quel milieu : air, liquide ou solide ?

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Le Prélèvement : Stabiliser et solubiliser

Air

Liquide

Solide

Le prélèvement s’il n’est pas liquide doit être sol ubilisé au plus viteAttention à stabiliser l’analyte au plus vite

Réduction en poudre par action

mécanique

Etape difficilement intégrable dans un

microsystème

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Prélèvements aériens: mal maitrisés

� Applications : � Suivi environnemental extérieur : (légionelle, allergen, …)

� Sécurité civile : anthrax (spores), toxines, virus, bacteries …� Suivi des ambiances intérieures :

� hôpitaux, (MRSA, aspergillus), crèches, …

� aéroports, (grippes, SRAS)� Médecine : analyse de la respiration

� Echantillons : recherche de microorganismes� Mesures dans l’air : très mal connus pour particule < 1 µm

� Extérieure : 1m3/min to 10 L / min (Outdoor)

� Intérieure : 10 to 1L / min (respiration 10 L / min)

� Très variable : météo, saisons, (spring & pollens)� Sensibilité (1 pathogen / L d’air)

� Mesures sur surface : 90% des mesures actuelles !

� Non quantitative, non reproductible

Le prélèvement d’air reste très mal maîtrisé et très manuel

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Prélèvements liquides : très manuel

� Applications :� Suivi environnemental extérieur : eau de baignade, rivières, …� Suivi industriel :

� Effluents : eau de TAR� Eau potable� Industrie agroalimentaire : lait, bière, vins, …

� Diagnostic :

�Echantillon :� Suivi environnemental et industriel : GROS et DILUE

� recherche de microorganismes / toxine (allergène alimentaire � Très variable : pH, turbidité, contaminants (biocide, ….)� Très dilué : Ex. Cryptosporidium 1 spore / 10Ld’eau� Présence d’inhibiteurs potentiels inconnus

� Diagnostic : quelques ml à quelques µl� Sang : 90% des analyses dont 90% sur plasma/sérum� Urine : 5% � Transpiration, larmes, salive …. Minimalement invasif� Échantillon très complexe mais homogène et constant� Nécessité de stabiliser rapidement l’échantillon : DNAse, RNase protéase…. � Quantité limité !

Les échantillons liquides « environnementaux » : gros, dilués et variables Les échantillons liquides « diagnostic » : petits, hom ogènes mais complexe

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Prélèvements solides :Très manuel

� Applications :� Suivi industriel : Agro alimentaire :

� Ingrédient : certification d’origine : espèce, OGM,…� Autorisation de mise sur le marché d’un lot :

– Salmonelle, listéria, Allergène �Diagnostic :

� Anapathologie : structure et aspects des tissus� Analyse moléculaire: protéomique, transcriptomique …

�Echantillon :�Industrie : TRES VARIABLE et difficile

� Très variable : chocolat, fraise et viande� Pas toujours soluble : beure, � Problème de représentativité :

– échantillonage multiple, – gros échantillon

� Complexe : Chacun a son mode de préparation…� Diagnostic :

� Echantillons complexes souvent hétérogènes� Quantité limité : biopsie de plus en plus petite (1mm3)

micro-aiguille, cellule micro disséquées au laser � Stabilisation très rapide des tissus

Méthodes de moins en moins invasives pour le diagno stic

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Faux négatif

Fausse concentration

Volume trop important

Taille d’échantillon statistiquement significatif

Ce n’est pas toujours possible de réduire la taille de l’échantillon même quand la limite de détection est très faible

La concentration en analyte est une valeur important e

Prélèvements : Représentativité ou Combien ?

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Quelle taille doit avoir l’échantillon ?

La taille de l’échantillon va dépendre : �Du seuil de sensibilité du test : [ analyte] = risque

�La limite de sensibilité de la méthode de détection :

[analyte]

signal

Détection limit

Pour être plus robuste : la taille de l’échantillon sera augmentée afin de travailler au dessus de la limite de détection du test

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[analyte] et sensibilité des méthodes de détections

Presentation Leti Anual Review 2006 : P. Kaspar, VP BioMerieux, head of the Molecular Biology Business unit

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Le prélèvement : Les prélèvements environnementaux / industriels son t généralement

� Gros : 100 l to 100 ml� Dilués

Les prélèvements biologiques � Sont plus petits allant du ml au µl � Sont de plus en plus petits avec une forte pression pour aller

vers le moins invasif : µbiopsies � Ont une tendance à servir à plus de tests : plus d’in formations

avec moins de matériels

Stabilisation de l’échantillon le plus rapidement p ossible

Le prélèvement dimensionne toute la chaîne analytiq ue

Il doit être statistiquement significatif

Le prélèvement est très souvent laissé de côté car très manuel alors que c’est un verrou majeur dans l’intégration

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Plan du cours :






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Sample prep : Quel est l’analyte ? Eg. HIV�HIV sérology : Detection de la réponse immune

� Plasma (quelques µl)� Faible sensibilité� réponse post infection (2 à 3 mois)� Test le plus répandu : test Elisa

�Charge virale : détection d’acides nucléiques HIV (RNA)� Plasma (2ml)� Grande sensibilité (20 pathogènes/ml)� Détection précoce de l’infection / suivi de patient� Analyse par RT PCR

�Suivie de traitement et progression de l’infection :� Globules blancs (cellules) � comparaison du nombre de CD4/CD8+� comptage de cellules : cytométrie de flux

Quel est l’analyte à doser? Comment le stabiliser au plus vite ?

Protéines

ADN/ARN

Cellules

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�La plupart des protocoles sont basés sur des étapes de reconnaissance moléculaire comme par exemple :

� les reconnaissances protéines/protéines (Ac/Ag)� les mesures d’activité enzymatique

�Il faut donc conserver les structures spatiales des analytes or : � les protéines sont des molécules fragiles :

� Dégradées par des protéases, pH, sels, inhibiteurs, solvants….�Les acides nucléiques sont dégradés par des DNase ou RNase�Tissus / Cellules / micro organisms :

� Analyse microbiologique : maintient de la viabilité et prolifération � Ana-pathology : Maintient de la structure des cellul es

�Le prélèvement étant souvent décorélé de l’analyse e n temps et en lieu, il est important de stabiliser l’analyte dès le prélèvement jusqu’au lieu d’analyse

�La miniaturisation et l’intégration de l’analyse su r le lieu du prélèvement peuvent être un réel avantage en terme de reproduct ibilité !

Réaliser dès que possible la stabilisation de l’ana lyte

Pourquoi stabiliser l’analyte ?

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Sample Prep ou la préparation d’échantillon ?

� Ces étapes visent à améliorer la détection :� Augmentation du signal (concentration)� Diminution du bruit de fond (purification)

� Trois grandes fonctions existent :

� La concentration/ purification� Concentration non spécifique � Capture par affinité� Le tri particulaire

� L’amplification de l’analyte

� Volume d’entrée allant du litre au nl

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Sample prep ? C’est quoi ?

�LA préparation d’échantillon comprend en général au moins une étape :

�De concentration�De purification

Echantillon

ConcentrationPurification

Enchainement d’étapes complexes successives : • Changement de volumes• Changement de réactifs

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Sample prep ? Pourquoi concentré et purifié ?

�Concentration : augmente la sensibilité de détection (signal)

�Purification : diminue le bruit de fond (bruit)

Concentration et purification sont souvent réalisés en une seule étape La plupart des protocoles ont souvent une successio nd’étapes différentes de purification et de concentr ation

Échantillon

ConcentrationPurification

[analyte]

signal

Détection limit

1 2 3

1

2

X

X

X

3

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Sample prep : concentration non spécifique�Concentration non spécifique:

�Evaporation : élimination du solvant � Concentration de toutes les espèces

– Contaminants, analytes, ….sels

�Filtration : discrimination par la taille� Concentration de toutes les espèces

dont la taille est au dessus du seuil de coupure � Très utilisé pour les échantillons environnementaux

�Centrifugation : discrimination par la densité� Très utilisé pour les échantillons biologiques

– Concentration des particules solides– Clarification du surnageant

Sang 1:20

Pour le sang, difficile de faire mieux en µsystème que la centrifugation

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�Electrophorèse : discrimination en fonction du char ge / masse

� Très efficace pour des échantillons de faible compl exité� Pour de petits échantillons l’électrophorèse capill aire est très efficace (Agilent):

� Forte résolution � Analyse rapide � Système intégrable dans un microsystème

Sample prep : concentration spécifique

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�Specific concentration : Chromatographie :

Sample prep : concentration / purification

HPLC-ChipMS (Agilent)

Méthode très utilisée en µsystème, S/V important et maitrisée compatible petit échantillon

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Structuration parfaitement ordonnée

Simulation du flux hydrodynamique à travers un canala) avec un remplissage de billes b) avec une structuration parfaitement ordonnée

Amélioration des performances en pilier versus bill e

Module d’affinité, module de séparation

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� interactions très spécifiques entre deux molécules : �Protéine Ligand : Anticorps/ antigène, Enzyme/ substr at�Acide nucléique / acide nucléique (hibridation)

�Les µArrays :

�Les billes / billes magnétiques

L’efficacité de la capture dépend du rapport surface sur Volume S/V

Sample prep : Capture par affinité

CaptureAddition of coated particles

Pellet Splitting

Dilution ElutionSplitting ….

Example of a solid phase concentration/ purificatio n protocol for DNA :

DNA label hybridized on a Microarray probe Microarray with 3 probes

DNA Label

Example of a Microarray


DNA Label



DNA Label

Microarray with 3 probes

DNA Label


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Purification d’une protéine à partir d’une goutte de sang

Tampon de lavage

Lavages Révélation

Gouttes 65 nl

SORTIE: Culot de billes avec TpnI

ENTREE:

échantillon + réactifs (2µl)

aimant

Capture TpnI sur billes magnétiques

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�La sample prep consiste en général en une succession d’étapes de : � concentration plus ou moins spécifique � de purification

�Stabiliser votre échantillon dès le prélèvement et tout au long de l’analyse.

�Les captures par affinités sur surface solide sont énormément utilisées car : � Il existe une panoplie importante de réactifs commerciaux� Elle permettent des changements de tampons et des lavages aisés � elles apportent des facteurs de concentration très élevés

�Les billes (magnétiques) sont très utilisées car elles : �Offrent un rapport surface / volume incroyable�La quantité de billes peut être dimensionnée en fonction du volume de prélèvement et de la concentration de l’analyte.

Les microsystèmes peuvent être utiles pour les écha ntillons : � Gros et très dilué ou il faut fortement concentrer� Extrêmement petit ou il ne faut pas diluer

Sample Prep : Conclusion

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Plan du cours :






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Le challenge de l’intégration :

Microtechnologies & microfluidiques doivent permettre de miniaturiseret d’intégrer toutes les étapes d’un protocole d’analyse biologique

La difficulté réside dans l’intégration d’un protocole complexe : • Nombre d’entrées et de sorties (réactifs)• Nombre d’étapes• Temps de l’analyse• Changement de volume

Collecte de l’échantillon(sang, eau, air, biopsie…)

Collecte de l’échantillon(sang, eau, air, biopsie…) ExtractionExtraction purificationpurification

Reconnaissancemoléculaire

Reconnaissancemoléculaire DetectionDetection Analyse

données

Analysedonnées

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Quand intégrer la préparation de l’échantillon ?

•Pour des échantillons tout petits :• éviter les dilutions et les pertes de matériels• pour des prélèvements peu invasifs• quand plus d’information est nécessaire avec moins de matériel

• Pour de gros échantillons dilués : • Nécessité de très gros facteurs de concentration :

• augmentation de la sensibilité• systèmes plus robustes• résultat plus rapide

• Analyse en continu ou semi continu

•Pour la délocalisation des analyses sur le terrain • pas de manutention par des personnes spécialisées• besoin de reproductibilité (élimination du facteur h umain) • rapidité du résultat

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Enjeux et difficultés de l’intégration:

Micro

Module 1

Module 2

Connections macro –micro :

� l’intégration du prélèvement et des étapes préanalytiques :

� La taille des volumes est souvent macro� Passer du macro au micro le plus rapidement possible pour :

� Faciliter l’intégration microfluidique

� Limiter la consomation de réactif� Travailler rapidement avec des espèces concentrées.

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Point of care: analyse génomique PCR

Détection( fluorescence)

Détection( fluorescence) Analyse de données

Analyse de donnéesHybridationsur puce

Hybridationsur puce

AmplificationADN (PCR) + MARQUAGE

AmplificationADN (PCR) + MARQUAGE

Amplification PCR « in-chip »Résistance chauffante

CY3 cible 10 nM

CY3 Cible 1 pM

DNA chip

Module thermique (TCS)

Canaux enterrés (3 µl)

lecteur

Injection échantillon

MICROFLUIDIQUE

Spotting des sondes

Puce sur PCB

Maladie infectieuse(H5N1, septis…)

vétérinairel

sécurité

MST

Agro-alimentaire

APPLICATIONS

entréet

sortie

DNA chip

PCR

lecteur

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Preuve de concept : un microsystème totalement intégré

e-sensorµarrays

CMS

Plastic ; circuit fluidique

PCB : circuit Électrique (jaune)

P.Grodzinski & al. Motorola labs. Anal.chem. 76, 1824, 2004

MicrovalvesEn paraffin

close-open

open-close-open

Detection( electrochimique)

Detection( electrochimique) Data analysis

Data analysisHybridationSur puce

HybridationSur puce

AmplificationADN (PCR)

AmplificationADN (PCR)LyseLysecapture

cellules

capture cellules

Sang total

Sang total

ml de sang

Capture par billes magnétiques

Time d’analyse: 3.5h

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� Protocole Leti basé sur l’utilisation de billes magnétiques : protocole générique pour la purification d’AN à partir d’ un échantillon de 10 ml avec pathogènes

� Optimisé en tube pour l’automatisation:� Petits volumes� Pas de variation de T°� Durée minimale

Capture pathogènessur billes

Lyse despathogènes

Elution ANSolution pure ANEchantillon

Protocole générique purification AN

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Protocole mis au point

� Protocole T°amb-37°C

� Concentration : x3000

� ~20 min

Volume1mL

10µL

55µL

55µL

260µL

55µL

55µL

15µL10µL

Chambre 1

Chambre 2

0 Echantillon + billes

ADN pur

Volume

10mL Aimant

50µL

200µL

50µL

50µL

10µL

3µL

Chambre 1

Chambre 2

Temps

0

20 mn

Lyse 1

Capture des bactéries

Lavage ADNRT

37°°°°C

60°°°°C70°°°°C

Chambre 1 Chambre 2

Lyse 2+ élution

Capture ADN

Elution ADN

Capture des bactéries

Lavage ADN

RT

37°°°°C

60°°°°C70°°°°C

Chambre 1 Chambre 2

Lyse + Elution

Capture ADN

Elution ADN

ADN pur

Tp Lyse

Tp Capture+ billes

Tp Lavage

US

Tp LavageUS

Tp Elution

10µL

2.5µL

� Capture générique des pathogènes sur billes n°1

� Lyse chimique

� Capture AN sur billes n°2

� Lavages et élution Tris 10mM

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Validation du protocole : purification d’ADN en multiplexeP

répa

ratio

n d’

écha

ntill

on

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

E. Coli

ad2

phiX

Légio

nelle

Baculov

irus

S. Pne

umon

iae

Bacillu

s

UG

/ é

chan

tillo

n

échantillon

protocole Leti

Qiagen

� Rendement et Comparaison avec Protocole QIAGEN

� Rendement moyen 50% sur plusieurs expériences et pl usieurs pathogènes pour Leti et Qiagen (méthode de ref.)

� Validations sur des échantillons très différents: e au « propre »; eau de rivière; eau de TAR; collecte d’air CIP; mucus a rtificiel;

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Exemple de Maquette 1 ère Version:

Maquette totalement automatisée : � Rendement moyen maquette: 43%� Rendement moyen tube : 61,5%

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Couplage au Système EWOD :

� Un système très intégré facile d’utilisation

Préparation d’échantillon

Détection

~L

~µL

10 mL

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Validation sur différents modèles biologiques

Mucoviscidose DF508

Génotypage humainE. Coli

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

10 15 20 25 30 35 40

nbre de cycles

fluo

norm

alis

ée

Blé

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

10 15 20 25 30 35 40

nbre de cycles

fluo

norm

alis

ée

Puce : 500 copies/goutteTube : 10000 copies/µl

Puce : 4 copies/goutteTube : 80 copies/µl

Détection allergènes alimentaires

Identification pathogènes

PCR puce CFTR 13.06.

0,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

20 30 40 50

Nombr e c y c le s

Flu

o (u

.a.)

del/del FAM

w t/w t VIC

w t/del VIC

w t/del FAM

w t/w t FAM

del/del VIC

PCR sur puce très robuste pour multiples applicatio ns

Identification d'espèces biologiques

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Conclusion :Le prélèvement et la préparation de l’échantillon F ONT partie de l’analyse

Le prélèvement : � La taille de l’échantillon dépend :

� Le seuil de détection du risque (et non du système d’analyse)� De la limite de détection du système d’analyse � L’échantillon doit être représentatif

� La réalité est ce qu’elle est : les échantillons peuvent être GROS

La préparation d’échantillon� La préparation de l’échantillon enchaine plusieurs étapes de purification (diminution du

bruit) et de concentration (augmentation du signal) � Il est essentiel de stabiliser les analytes tout au long du protocole

L’intégration dans des µsystème: � Les étapes de prélèvement et de préparation d’échantillons sont peu présentes dans

les µsystème très polarisé sur la détection !!!� Quand elles existent, c’est pour des petits échantillons nécessitant méthodes de

préparation simples. � Pour le diagnostic : importance du couplage avec des prélèvements minimalement

invasifs

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For more information : www.leti.fr

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11th Leti Annual Review

JuneJuneJuneJune 22222222----23, 200923, 200923, 200923, 2009

at MinatecMinatecMinatecMinatec

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1 Microstructuration des réacteurs, des canaux, des vannes...

2 Fermeture

Capotage Si, Verre, pyrex

Oxydation / épitaxie

Couche Sacrificielle

Dry etching (Silicon)

3 Technologie Hybride

Silicium+verre+plastique+…

Connection fluidique

Puce à puce ou wafer à wafer

4 Connectique - Packaging

fluidique : collage de capillaires, de connecteurs, de joints

- Electrique

- Thermique

- Optique

CEA-Silicon Biosystem

5 System

Interface macro-micro

Stckage des réactifs

Instrumentation / data acquisition

Une vaste palette de matériaux (Si, verre,

plastique, ….) et de techniques de fabrication .

Attention au packaging

Fabrication des Laboratoires sur Puce

Les laboratoires sur puces sont complexes à fabrique r

intégration d’un protocole biologique complet dans des...

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