inhibition enzymatique.pdf

Université de Montréal

Faculté de Médecine Département de biochimie

Inhibition des réactions enzymatiques



Abréviations utilisées

2

AS : activité spécifique AT : activité totale E : enzyme libre EF : enzyme à l’état fondamental EI : complexe enzyme-inhibiteur EP : complexe enzyme-produit ES : complexe enzyme-substrat ESI : complexe enzyme-substrat-inhibiteur ET : enzyme à l'état de transition I : inhibiteur Ic : inhibiteur compétitif Iirr : inhibiteur irréversible kcat : constante catalytique Ki : constante d'inhibition Km : constante de Michaelis P : produit

S : substrat Sc : substrat compétitif TO : turn-over TP : triphosphate U : unité enzymatique (UI) Vmax : vitesse maximale : vitesse initiale 0v

BCM 2505



Cinétique de Michaëlis-Menten (rappels) :

E + S ESk

1

k-1

E + Pk

2

3

1. Présentation

1.1. Généralités

1

21m

k

kkK

Constante de Michaelis-Menten

[S]

[S]V

s

max0

K

v

Vitesse initiale

cat2 kk

1

1

[ES]

[E][S]

k

kKS

Constante de dissociation de ES en E + S

1. Équilibre rapide entre E + S et ES et k2 lente :

2. Hypothèse de l’état quasi-stationnaire :

[S]

[S]V

m

max0

K

v

Équation de Michaelis-Menten

Km = KS si k2 « k-1

[E]T = [ES] + [E]

Vmax = kcat[E]T

vo = kcat[ES]

BCM 2505



Inhibiteur d’enzyme (I) :

-Entité l’activité enzymatique ( la vitesse d’une réaction enzymatique) :

-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :

• empêcher la fixation de S au site actif,

• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et

rendre l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.

-L’affinité d’I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :

• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),

4

• Lorsque [I] = Ki , la moitié des sites enzymatiques est occupée,

• + Ki est petit, + l’affinité d’I pour E est grande,

[EI]

[E][I]

i

i-i

k

kKE + I EI

ki

k-i

0

I

0 vv

BCM 2505

Inhibiteur « idéal » :

• forte affinité (Ki petit) pour E

• forte sélectivité vs S (Km/Ki grand).



5

Types de cinétiques d’inhibitrices

Inhibiteurs réversibles :

-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes EI,

ESI).

-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement

inhibée :

• Inhibiteurs compétitifs

• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)

• Inhibiteurs non-compétitifs purs

• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes

Inhibiteurs irréversibles :

-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)

-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation l’enzyme est irréversiblement inhibée) :

• Marqueurs d'affinité

• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)

• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité : inhibition

non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding inhibitors)

BCM 2505



6

50%

100%

[I] IC50

Mesure du paramètre IC50

IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle v0 mesurée i.e. sans inhibiteur

(mesure réalisée généralement à [S] = Km)

+

+

+

+

+ +

+

BCM 2505

2pour[I]IC 0

I

050 vv

0

I

0 %50 vv

00 / vv I



IC50 pour des types différents d’inhibition réversible

BCM 2505 7

Compétitive

𝐼𝐶50 =𝐾𝑖𝐾𝑚

𝑆 + 𝐾𝑖 𝐼𝐶50 > 𝐾𝑖

si 𝑆 = 𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 2𝐾𝑖 si 𝑆 = 2𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 3𝐾𝑖 etc.

Incompétitive

𝐼𝐶50 = 𝐾𝑖 +𝐾𝑖𝐾𝑚𝑆

𝐼𝐶50 > 𝐾𝑖

si 𝑆 = 𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 2𝐾𝑖 si 𝑆 = 2𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 1.5𝐾𝑖 etc.

Non-compétitive (simple)

𝐼𝐶50= 𝐾𝑖



Variation de IC50 pour différents types d’inhibition

BCM 2505 8

Graphique sommaire de la variation en IC50

Notez que l’IC50 = Ki en trois cas : 1. inhibition non-compétitive (simple) 2. inhibition compétitive lorsque [S] 0 3. inhibition incompétitive lorsque [S]

• La valeur d’IC50 varie en fonction de la concentration de substrat selon le mode d’inhibition. • Bien que Ki soit constant, la fraction d’enzyme inhibée peut varier considérablement,

dépendante de la concentration de substrat et du mécanisme d’inhibition.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

[S] / KM

0

2

4

6

8

10

12

14

16IC

50 / K

i

compétitive

incompétitive

non-compétitive

[S] / Km

incompétitive

non-compétitive

compétitive IC50 / Ki



9

2. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme

2.1. Inhibiteurs analogues de substrats

• Leur structure ressemble à celle du S (ou cofacteur) dans son état fondamental

• Ils sont reconnus par E, sans être transformés (sauf dans le cas des substrats compétitifs)

• Les + courants et les + faciles à concevoir

• Cinétique d'inhibition compétitive

• N'exploitent que l'étape de reconnaissance de S (≠ aux analogues de l'état de transition)

• Sauf cas particulier, sont en général peu efficace (Km/Ki < 10)

• Souvent, il faut [I] >> [S] pour pouvoir entrer en compétition avec le S

Caractéristiques principales :

BCM 2505



10

Structure des inhibiteurs analogues de substrat :

• La fonction réactive de S peut être supprimée ou remplacée par un groupe ne pouvant être transformé : I compétitif classique

• Un groupement de S autre que la fonction réactive peut être supprimée ou remplacée :

- soit I n'est pas transformé : I compétitif classique - soit I est transformé : I compétitif particulier = S compétitif

N

OHOP

O

-O

O- CH3

I analogue du cofacteur

N

OHOP

O

-O

O- CHO

PLP (cofacteur)

fonction réactive

CHO

H

OH

OH

OH

CH2OH

H

H

H

H

I analogue de S (2d-G6P)

CHO

OH

OH

OH

OH

CH2OH

H

H

H

H

CH2OH

O

OH

OH

OH

CH2OH

H

H

H

PGI

G6P F6P

fonction réactive

BCM 2505



11

Inhibition de la dihydroptéroate (DHP) Synthase

• Enzyme présente uniquement chez les bactéries (exemple : M. leprae) : cible idéale ! • Impliquée dans la biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique nécessaire à la synthèse des bases purines, pyrimidines (ADN) et de certains aa • Inhibiteurs : dérivés sulfonamides (sulfamides)

Sulfaméthoxazole® (Bayer)

I compétitif : Ki = 0,03 mM

Km/Ki = 20 ! Bon inhibiteur analogue de S,

et de plus, spécifique (la DHP Synthase

n'existe pas chez l'homme !)

J. Bacteriol. 1999,181, 6814-6821

N

N

N

H N H 2 N

O H

P 2 +

N

N

N

H N H 2 N

O H

H N C O O -

Dihydroptéridine acide p-aminobenzoïque

Dihydroptéroate

P 2 DHP Synthase

Km = 0.6 µM

autre fonction remplacée

NH2 SO2NH

N O

BCM 2505



12

Inhibition de la dihydrofolate réductase

-Biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique (suite) -Enzyme présente chez l'homme et les bactéries (exemple : M. tuberculosis)

Trimethoprim

Km = 20 mM

Km/KI = 3

N

N

N

H N H 2 N

O H

H N C O O -

Dihydroptéroate

G l u

Dihydrofolate Synthase

N

N

N

H N H 2 N

O H

H N C O N H

Dihydrofolate Réductase

Dihydrofolate

N A D P H

N A D P +

N

N

N H

H N H 2 N

O H

H N

Tétrahydrofolate

C H C O O -

( C H 2 ) 2

C O O -

C O N H C H C O O -

( C H 2 ) 2

C O O -

Km = 4 µM

Km/Ki = 0,5

Mauvais I, mais sélectivité > efficacité !

H. sapiens : Km = 3 µM, Ki = 41 µM : Km/Ki = 0,07 FEMS Microbiol Lett. 2004, 232, 101-105

I compétitif sélectif de

l'enzyme bactérienne : Ki = 8 mM

NNH2

N

NH2

OMe

OMe

OMe

fonction réactive remplacée

sélectivité

(pas d’effets secondaires chez l’homme)

BCM 2505



13

Résumé de la biosynthèse du tétrahydrofolate chez les bactéries

acide p-aminobenzoïque

Dihydroptéroate

Dihydrofolate

Tétrahydrofolate

DHP Synthase

DHF Synthase

DHF Réductase

acide folique

(vitamine B9) mammifères

X

X Trimethoprim®

Sulfaméthoxazole®

Purines Pyrimidines Aminoacides

Sulfaméthoxazole® +

Trimethoprim® Bactrim®

S1

S2

I1

I2

Bithérapie antibiotique

BCM 2505



14

Methotrexate® (anticancéreux à effets secondaires importants). -I compétitif "spécial", dit "à forte affinité".

Inhibition de la dihydrofolate réductase (suite)

Methotrexate® I compétitif : Ki = 6 pM !

Dihydrofolate Km = 3 µM

Km/Ki = 500 000 !

-En réalité, bien que cet I compétitif soit a priori analogue au S, des études structurales ont montré qu'il se fixait dans le site actif de la DHF réductase à l'envers vs S, du fait d'interactions très favorables fortuites !

Arch. Biochem. Biophys. 1971, 142, 417-425

NH

NN

N

NH

NH2

OH

O

O

O-

NH

O

O-

N

NN

N

N

NH2

NH2

O

O

O-

NH

O

O-

CH3

inhibe aussi la DHFR des cellules saines

BCM 2505



C H O

C H O

C O O - , N a +

C O O - , N a +

Éthylène glycol Oxalate

alcool déshydrogénase

+

+

C H O

C H 3

Éthanol Acétaldéhyde

C O O -

C H 3

Acétate

non toxique

S

I

15

Inhibition de l'alcool déshydrogénase par un substrat compétitif

-Alcool déshydrogénase (ADH) : enzyme à NAD+/NADH -Intoxication à l'éthylène glycol (S de l'ADH) : 50 décès / an -Cette réaction peut être inhibée compétitivement par ingestion d'un excès d'éthanol… si l'intoxication est traitée à temps !

-L'éthanol, S naturel de l'ADH, est un I compétitif particulier : c'est un S compétitif de la transformation de l'éthylène glycol

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH3

précipite dans les reins !

BCM 2505



16

Inhibition de la transcriptase inverse du VIH

2’-deoxythymidine-5’-TP (dTTP)

3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine-5’-TP (AZT-TP)

O

N

N

NH

O

OHO

NN+-

3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine (AZT, 1985, BW) (Jérôme Horwitz, 1964)

• AZT-TP (issu de l'AZT) : I compétitif (S compétitif) ~ spécifique de la transcriptase inverse du VIH, analogue du S dTTP • AZT-TP est utilisé par l'enzyme, mais termine la réplication de l'ADN virale (arrêt de chaîne → Ic) • Effets secondaires importants :

- AZT-TP vs. ADN polymérases humaines ? - AZT vs. thymidine kinase (TK) humaine ?

O

O H

N

N H

O

O O P O P

O

O

O

O - O -

P

O - O

O - O

N

N

N H

O

O O P O P

O

O

O

O - O -

P

O - O

O -

N N + -

fonction réactive remplacée

enzyme propre aux rétrovirus

in

out

+ TKs

BCM 2505



17

Inhibition de l'ADN-polymérase virale

-Aciclovir/Ganciclovir : Ic/Sc spécifiques de la thymidine kinase du virus de l'Herpès-VZV, analogues de la déoxyguanosine.

Ki TKhumaine/Ki TKvirale = 3000 (aciclovir)

-Les dérivés TP formés, Ic/Sc de l'ADN-polymérase, terminent la réplication de l'ADN viral (→ Ic).

Ki ADN-Phumaine/Ki ADN-Pvirale = 100 (aciclovir-TP)

NO

OH

OH

N

NHN

NH2

O

NO

O

OH

N

NHN

NH2

O

NO

O

OH

N

NHN

NH2

O

P PPPTKvirale TKcell.

ADN-polym.

Ganciclovir Ganciclovir-TP

NO

OH

OH N

NHN

NH2

O

Aciclovir Aciclovir-TP

NO

OH N

NHN

NH2

O

aucun effet secondaire

2’-Déoxyguanosine (dG)

BCM 2505



18

Aciclovir – Modèle du « dead-end complex » en présence du prochain dNTP (Cf. Barbara Selisko, Univ. Aix-Marseille II)

Liu et al., J. Biol. Chem. (2004), 281, 18193 BCM 2505



19

2.2. Inhibiteurs analogues de l'état de transition

• I analogues de ET : analogues stables de S à l'ET (espèce instable !)

• Leur structure et ppts électroniques ressemblent à celles du S à l'état de transition (ET)

ou d'un intermédiaire réactionnel de haute énergie (IHE)

• La plupart des I dits "analogues de ET" sont en fait des I "analogues d'IHE" plus proche

de l'ET que de l'EF

• Ils sont reconnus par E, sans être transformés

• Conception rationnelle (si mécanisme connu ou postulé)

• Cinétique d'inhibition compétitive

• Exploitent l'étape de reconnaissance de S et l'étape catalytique

• Sont en général très efficaces (Km/Ki très grand)

• Même si [I] << [S], I peut entrer en compétition avec S

Caractéristiques principales :

• E a beaucoup plus d'affinité pour le substrat à l'ET (S≠) que pour le substrat à l'EF (S) E doit avoir bcp + d'affinité pour un I qui ressemble (mime) à S≠ plutôt qu'à S

BCM 2505



20

• I très efficace (Km/Ki très grand) ne signifie pas automatiquement que I est analogue de ET/IHE (ex. : Methotrexate®). Pour cela, il faut en plus :

-Structures X d’ET comparatives kcat , Km’ Ki

-log Ki = f[log(Km/kcat)] ≈ linéaire pour ≠ S et I analogues de l'ET correspondants :

O

NH

H CH2CH(CH3)2

O

YHN

R

NH

H CH2CH(CH3)2Y

HN

R

HO O-

PNH

H CH2CH(CH3)2

O

YHN

R

O O-

Substrats

IHE tétrahèdriquesO

I analogues de ET(phosphonamides)

Biochemistry (1983) 22, 4618-4624

log Ki

log(Km/kcat)

-5 -4 -3

-8

-7

-6

-5

S

IHE

I

= G# (E+S→ES#)/RT

BCM 2505

RT

‡ΔG

obs eh

kTk



21

Exemples d'inhibiteurs analogues de l'ET/IHE :

Inhibition de la triosephosphate isomérase (TIM) de levure

La TIM a 100 x plus d’affinité pour le PGH que pour le DHAP

CH2OPO3

2-O

OHH

HB

CH2OPO3

2-

OH

O-

BH+

CH2OPO3

2-

O-

OH

BH+

CH2OPO3

2-OH

H O

B

DHAP IHEs 1,2-cis-ènediolate G3P

Km = 1,5 mM

O

CH2OPO3

2-O

-

Phosphoglycolate

NHOH

CH2OPO3

2-O

- H+

CH2OPO3

2-O

-N OH

Acide phosphoglycolohydroxamique (PGH)

Ki = 30 µM Km/Ki = 50

Ki = 15 µM Km/Ki = 100

enzyme glycolytique

BCM 2505



22

Inhibition des glycosidases

O R 2 O

O H

H O X

H

O R 1

X = OH, NHAc R 1 = glycoside R 2 = H, glycoside

O R 2 O

O H

H O X H

O R 2 O

O H

H O X H

R 1 OH O R 2 O

O H

H O X

H

O H

IHE oxocarbonium stabilité par -COO - du site actif :

-par liaison électrostatique (inverting glycosidases : a→b, b→a)

-par liaison covalente (retaining glycosidases : a→a, b→b)

C anomère trigonal (plan) sp 2

O R 2 O

O H

H O X O

H 2 O

H N H O

O H

H O H O O H

H N H O

O H

H O O H H

H

gluconolactones

X = NHAc, R 2 = H

K i = 5x10-7

M ( b -N-Ac-glucosaminidase)

Km/K i moyen = 40 000

Km = 1 à 3 10 -3 M

nojirimycine

K i = 6 x10-10

M ( sucrase)

Km/K i moyen = 3x106 !

+

+

+

sp3 sp2 sp2 sp3

sp2 sp2

BCM 2505

http://fr.wikipedia.org/wiki/Glycoside_hydrolase

http://fr.wikipedia.org/wiki/Glycoside_hydrolase



23

Inhibition de la neuraminidase virale par le Tamiflu®

Oseltamivir® (Tamiflu®)

out in

O COOH

O R

OH

OH

OH

OH

H

AcHN

O+ COOH

OH

OH

OH

OH

H

AcHN

O COOH

OH

OH

OH

OH

OH

H

AcHN+ R OH

COOEt

NH2

OH

AcHN

COO-

NH2

OH

AcHN

IHE

I analogue IHE

sp2

sp2

acide sialique (acide N-acétyle-neuraminique)

Virus « accroché »

Virus « libre »

BCM 2505

Prodrogue

• Bloque les fonctions de la neuraminidase, l’enzyme de surface des virus A et B de la grippe, qui détache des glycoconjugués des résidus acide N-acétyle neuraminique (= acide sialique).

• Cette hydrolyse dont la fonction est incomplètement comprise est une étape nécessaire à la diffusion de l’infection virale.



24

Inhibition des protéases

R

O

HN

R'

Nu

R

O-

Nu

NHR'

H+

R

O

Nu + R'NH2

IHE tétraèdriqueNu = OH-, SerO-, CysS-

R

O

OR'

Nu

R

O-

Nu

OR'

H+

R

O

Nu+ R'OH

IHE tétraèdriqueNu = OH-, SerO-, CysS-

Activ ité estérase

Activ ité peptidase

sp2

sp2

sp2

sp2 sp3

sp3

RCOOH

RCOOH

BCM 2505



25

Quelques types d'analogues de l’IHE des protéases

R H

O

R

H O N u

H

a ldéhydes

R C F 2 R '

O

R

H O N u

C F 2 R '

cétones α-difluorées

R B

O H

O H

R B

H O N u

O H

acides boroniques/boronates

-

phosphates

R O P O R '

O

O -

phosphonates

R P O R '

O

O -

phosphinates

R P R '

O

O -

phosphonamidates

R P N H R '

O

O -

fluorophosphates (gaz Sarin)

R O P F

O

R ' O

NuH NuH NuH

RO P N u

O NuH H F

(inhibition irréversible) R

H O H

R '

alcools secondaires (Ritonavir® vs. protéase du VIH)

R’O

1

2

3

L’espèce tétraédrique I anal. de l’IHE est formée par réaction réversible de l’E → complexe EI stable anal. de ES#

I anal. de l’IHE « classiques » (tétraédriques)

I anal. de l’IHE « irréversibles »

BCM 2505

R

H O N u

N H R '

( Nu H = H 2 O , SerOH, CysSH )



HN

O

N

ONHR'

HN

N

ONHR'HO O-

RHN

O

HN

ONHR'

OH

+

O

N

S

HN

HO H

NH

O

OHN O

NS

N

O

R

O

R

HN

HO H

O

N

O NH

H

H

NH

O

N

H2NOC

Ritonav ir

Saquinav ir

26

Inhibition de la protéase du VIH (protéase à acides aspartiques)

sp2

R-Phe–Pro-R’

sp3

sp3

sp3

Alcools secondaires : liaison C–C très stable, non-hydrolysable !

BCM 2505



27

Stereoview of the overlay of the inhibitor bound to HTLV-1 protease with the

clinical inhibitors of HIV-1 protease.

Li et al. PNAS (2005)102,18332-18337

Amprenavir, Ritonavir, Nelfinavir, Saquivavir, Indivavir

BCM 2505



28

3. Inhibiteurs irréversibles

3.1. Marqueurs d'affinité

• Principaux types d'inhibiteurs irréversibles : marqueurs d'affinité et inhibiteurs suicides • Inhibiteurs irréversibles non-spécifiques du site actif (réactifs dits « résidus-spécifiques »)

[EI]

[E][I]

i

i-i

k

kKE + I EI E-I

k-i

ki kinact

complexe covalent

inactif

• Marqueur d'affinité = Réactif chimique formant une liaison covalente stable avec un résidu

du site actif de l'enzyme (réactifs spécifiques du site actif ou « site-spécifique »)

• "active-site irreversible inhibitors"

• L'enzyme est protégée de l'inhibition par le S (ou cofacteur) ou un I compétitif

• Modification irréversible (covalente) de l'enzyme par l'inhibiteur

• Un I irréversible présente un équilibre de fixation (Ki) avec l'enzyme, avant l'étape de

l'inactivation proprement dite (kinact)

BCM 2505



Marqueurs par affinité

BCM 2505 29

• Réactifs démontrent la spécificité envers un

groupement fonctionnel des acides aminés du site actif – analogues de substrat pour favoriser la liaison aux sites actifs

– contient un groupement réactif (pharmacophore) • typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le

site actif

• réagissant de façon covalente à un seul site saturable

et de manière stœchiométrique (1 mol d’I / mol d’E)



Marquage par affinité

• L’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou

le cofacteur)

• La perte d’activité suit une cinétique de 1er ordre, vu que

l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction

• L’inhibition est accompagnée par la modification covalente

irréversible de l’enzyme : – l’enzyme demeure inactive après la séparation de l’excès de l’inhibiteur

– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou filtration sur gel, et

même après la dénaturation de l’enzyme

BCM 2505 30



O

Cl

CH2Ph

HNS

O

OO

HN

O

NH

R

CH2Ph

R'

31

Exemple de marquages par affinité

Histidine du site actif de la Chymotrypsine :

Substrat Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone (TPCK)

-I irr. analogue de S (mime de S + gpe réactif) - également sur Cys du site actif de la papaïne (Cys-S- 100 x plus réactif que His)

a-halocétone

Liaison covalente stable : His du site actif de la chymotrypsine est irréversiblement modifiée

Ts

O

Cl

CH2Ph

N

N

His

H

Ts

O

CH2Ph

N+

N

His

H

Ts

O

CH2Ph

N

N

His

BCM 2505



32

Sérine (activée) du site actif des protéases (acétylcholinestérase) :

-I irr. analogue de l’IHE (mime de IHE + gpe réactif)

O

O

NMe3

+

H2O AcOH

OHNMe3

acétylcholine choline

E impliquée dans la régulation de la transmission des impulsions nerveuses aux muscles (notamment respiratoires) !

O

O-

NMe3

OSer

+

IHE

O P

O

F

O O P

O

F

Gaz Sarin diisopropylphosphofluoridate

OSer

H

N

N

His

H

O P

O

F

O O P

O

O

O

Ser

N+

N

His

H

H

F-

Forte affinité d’E pour I + Ser irréversiblement inactivée : inactivation rapide de l’enzyme

Paralysie respiratoire (asphyxie)

BCM 2505



33

Triosephosphate isomérase :

I irr. analogues des S (mimes de S + gpe réactif)

• Nombreux autres exemples • Peu utilisés en thérapeutique, car forte réactivité chimique (armes chimiques !)

O

N

N

His OPO3

2-

HO

O

OPO32-

TIMO OPO3

2-OH

DHAP G3P

I

O

OPO32-

vs His du sa

OPO32-

vs Asp du sa

O

OH

OPO3

2-O

O

Asp

BCM 2505



34

3.2. Inhibiteurs suicides

• Inhibiteurs basés sur le mécanisme : « mechanism-based inhibitors » (1978) : 1) Au départ, la réactivité de l'inhibiteur est cachée : il agit comme un substrat. 2) Ensuite, l'enzyme, par son activité, génère l'espèce inhibitrice active EI*.

• Caractéristiques d'inhibition analogues à celles des marqueurs d'affinité, si ce n'est la participation

de l'étape catalytique au processus d'inactivation (effet isotopique sur la cinétique de l'inhibition).

• Présentant une sélectivité encore meilleure que celles des marqueurs d'affinité

• Absence de réactivité intrinsèque initiale : agents thérapeutiques de choix

• Autorise la génération de fonctions très réactives, inaccessibles aux marqueurs d'affinité

• Très nombreux exemples, notamment dans le cas des enzymes à PLP dont le mécanisme implique la

formation d'un carbanion, stabilisé par le PLP. En effet, le substrat "inhibiteur suicide" restant lié au

coenzyme, n'aura pas la tendance à diffuser en dehors du site actif.

E EI EI*E-I+ I

I*E +

ki

k-i

k3k-3

kcat kinact

BCM 2505



35

Inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO (enzyme régulatrice de la biosynthèse des polyamines)

H2N

NH2

HCOOH

enzyme

PLPH2N

NH2

HH + CO2

• La difluorométhylornithine (DFMO) est un inhibiteur suicide de cette enzyme • Le DFMO est reconnu comme substrat (voir inhibition compétitive par l'α-méthylornithine) • L'espèce réactive formée au cours de la réaction (imine conjuguée, EI*) est un accepteur de

Michaël qui va réagir avec un nucléophile du site actif (Cys)

H 2 N

N H 2

C F 2 H C O O H H 2 N

N H 2

CH3 COOH H 2 N

NH+

H

F

α-méthylornithine EI*

1. - COOH , 2. - F-

DFMO

BCM 2505



36

DFMO + PLP

R

N+

CF2H

H

N+

H

O-

OP

O

O-

O-

O

O H B R

N+

H

N

H

O-

OP

O

O-

O-

F

HF

HB+

H2O CO2

R

N+

H

N+

H

O-

OP

O

O-

O-

F

H

H S Cys

B

R

N+

H

N

H

O-

OP

O

O-

O-

S

HF

Cys

HB+

HF

B

R

N+

H

N+

H

O-

OP

O

O-

O-

S Cys

F HH

Mécanisme d’inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO

1. - COOH 2. - F- 3. + CysS- 4. + H+

accepteur de Michaël (EI*) Liaison C–S stable : Cys irréversiblement

modifiée → enzyme inactivée

BCM 2505



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% a

cti

vit

é

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Temps (min)

en absence de substrat

en présence de substrat

Mécanisme d’inactivation • si la cinétique d’inactivation est de second ordre, l’inactivation

se fait entre E et I en solution

• si la cinétique d’inactivation est de premier ordre, l’inactivation

a lieu à partir du complexe E•I

• si l’enzyme est protégé par le substrat, l’inhibiteur se lie au site

actif de l’enzyme :

protection partielle; inhibition irréversible

BCM 2505 37



Mécanisme cinétique de l'inhibition irréversible

• L’inhibiteur irréversible présente un équilibre rapide de fixation (KI)

avec l'enzyme avant la formation lente et irréversible, proprement dite

kinact, d’un complexe inactif :

BCM 2505 38

• la proportion d’enzyme sous forme complexe binaire E•I augmente avec

la concentration d’I

• Le complexe binaire E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre

𝐾𝐼 =𝑘−1𝑘1

Complexe covalent

inactif



Analyse cinétique de l'inhibition irréversible

BCM 2505 39

Les paramètres à utiliser pour évaluer un inhibiteur

irréversible sont: k2 et Ki

𝑑 𝐸−𝐼

𝑑𝑡= 𝑘2 𝐸 ∙ 𝐼 et avec 𝐾𝑖 =

𝐸 𝐼

𝐸 ∙ 𝐼 𝐸 = 𝐸 ∙ 𝐼 ×

𝐾𝑖𝐼

Alors, 𝐸 0 = 𝐸 + 𝐸 ∙ 𝐼 = 𝐸 ∙ 𝐼 1 +𝐾𝑖

𝐼

qui donne 𝐸 ∙ 𝐼 =𝐸 0

1+𝐾𝑖𝐼

𝑑 𝐸 − 𝐼

𝑑𝑡=

𝑘2 𝐸 0

1 +𝐾𝑖𝐼

= 𝑘𝑜𝑏𝑠 𝐸 0 𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2 𝐼

𝐾𝑖 + 𝐼

Équilibre rapide




BCM 2505 40

• La perte d'activité de l'enzyme mesurée en fonction du temps à des concentrations différentes d’I suit une cinétique du premier ordre :

avec

- La représentation double réciproque de 1/kobs = f(1/[I]) permet de déterminer les paramètres Ki et kinact :

ln𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑟é𝑠𝑖𝑑𝑢𝑒𝑙𝑙𝑒

𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙𝑒= 𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡

𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡

1 +𝐼𝐾𝑖

1

𝑘𝑜𝑏𝑠=

1

𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡+

𝐾𝑖𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡

1

[𝐼]

1/k

ob

s

1/[I]

+

+

+

+ -1/Ki

1/kinact

pente = Ki/kinact




BCM 2505 41

En pratique, l’inhibition de la vitesse est suivie en présence du substrat:

𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2[𝐼]

𝐾𝑖 1 +[𝑆]𝐾𝑚

+ [𝐼]




BCM 2505 42

• Dans le cas d’un inhibiteur irréversible, la formation de produit en fonction du

temps n’est pas linéaire, et suit une cinétique correspondant à une réaction de

premier ordre:

A – amplitude; kobs - constante de vitesse de

premier ordre (s-1); offset - correction pour signal

initial (ex: fluorescence résiduelle provenant du

milieu de réaction)

[P]

t

Courbe de progrès d’une réaction à 1er ordre

𝑃 = 𝐴 1 − 𝑒−𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡 + 𝑜𝑓𝑓𝑠𝑒𝑡

• Pour caractériser un inhibiteur irréversible, il faut déterminer kobs à diverses [I].



BCM 2505 43

• Si [I] << Ki, seulement le ratio

k2/Kiapp sera déterminé

• Il faut corriger par le facteur

(1 + [S]/KM) ou utiliser des [S]

<< KM, afin d’obtenir k2/Ki

𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2 𝐼

𝐾𝑖 1 +𝑆𝐾𝑚

+ 𝐼

• k2 et Kiapp obtenu par régression

non-linéaire avec

𝑘𝑜𝑏𝑠 ≈𝑘2𝐾𝑖

𝐼

1 +𝑆𝐾𝑚

kobs (s-1)

[I]

kobs (s-1)

[I]

Si [I] << Ki


𝐾𝑖𝑎𝑝𝑝

= 𝐾𝑖 1 +𝑆

𝐾𝑚



Rappel: Cinétique d’inhibition irréversible

• Pour les inhibiteurs réversibles, le Ki

sert comme un indice de l’efficacité de

l’inhibition

• Pour les inhibiteurs irréversibles, le

kinact et le Ki ensemble déterminent

l’indice de l’efficacité de l’inhibition

BCM 2505 44



Inhibiteurs dits à interaction lente

• Inhibition non-covalente et quasi-irréversible

• L’équilibre de liaison avec l’enzyme est atteint

lentement par l’inhibiteur – Des secondes ou minutes pour atteindre l’état stationnaire au lieu des

millisecondes

– L’affinité forte (Ki faible) est possible, cependant les constantes de

vitesses des étapes de liaison et dissociation ont des petites valeurs

BCM 2505 45

Cstes petites 𝐾𝑖 = 𝑘2𝑘1

k1 = 107 M-1s-1 et k2 = 10 s-1 ou k1 = 104 M-1s-1 et k2 = 0.01 s-1 conduit à la même Ki

interaction lente



Effet cinétique de la liaison lente

• établissement lent de l’équilibre entre la forme libre E et le complexe E•I :

BCM 2505 46

liaison rapide [P]

Temps

sans I

Formation d’EI

Dissociation d’EI

+ I

+ I

Sans pré-incubation avec inhibiteur ; réaction initiée avec enzyme

Enzyme pré-incubée avec inhibiteur ; réaction initiée avec substrat



Inhibition de la liaison lente

BCM 2505 47

Détermination des paramètres cinétiques

1) Mesurer la vitesse à l’état stationnaire et analyser les données (ex: méthode de Lineweaver-Burk)

2) Analyser le progrès de la réaction, [P] vs temps, dans la région préstationnaire:

vs - vitesse à l’état stationnaire; vo - vitesse initiale; kobs - constante de vitesse de premier ordre

caractérisant la période pré-stationnaire

𝑃 = 𝑣𝑠𝑡 − 𝑣𝑠 − 𝑣0 1 − 𝑒−𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡 𝑘𝑜𝑏𝑠 Le cas sans préincubation avec inhibiteur ; réaction initiée avec enzyme



Inhibition de la liaison lente

BCM 2505 48

𝐾𝑖 = 𝑘4 𝑘3

𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘4 + 𝑘3[𝐼] 1 + [𝑆] 𝐾𝑚

si [S] >> [E],

Rappel:



Cas: Inhibition de la liaison lente

BCM 2505 49

Concentration utilisable pour la caractérisation

Note: une cinétique d’inhibition lente ne dit pas toujours que l’inhibiteur se lie lentement à l’enzyme; la dissociation pourrait être lente uniquement

Mécanisme précédent: 𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘4 + 𝑘3[I] 1 + [S] 𝐾𝑚

Si [S] << Km → 𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘3[I] + 𝑘4

For [I] = 10-5 M kobs = 102 s-1 t1/2 = 0.0069 s

= 10-7 M kobs = 1 s-1 t1/2 = 0.69 s

= 10-9 M kobs = 0.01 s-1 t1/2 = 69 s

= 10-11 M kobs = 2 x 10-4 s-1 t1/2 = 3450 s

= 10-15 M kobs = 10-4 s-1 t1/2 = 6900 s

𝑘3 = 107𝑀−1𝑠−1

𝑘4 = 10−4𝑠−1 ( ≈ 1 x 3 heures )

𝐾𝑖 =𝑘4𝑘3

= 10−11𝑀 (10 𝑝𝑀)

Mettons

et



Inhibition à forte affinité

BCM 2505 50

Un “inhibiteur à forte affinité” ne se lie pas nécessairement à l’enzyme avec

une forte affinité !

• “forte affinité” est un terme plutôt subjectif

• Il faut mieux parler de comportement “forte affinité” pour le profil cinétique

observé aux conditions de l’essai.

Pour un inhibiteur avec Ki = 1 µM

1) Essai effectué à [E] = 1 nM [I] sera toujours >> [E]

• la “perte” d’inhibiteur lié à E est négligeable; [I]libre = [I]T

• inhibition classique, les conditions “Michaelis-Menten” s’appliquent

2) Essai effectué à [E] = 1 µM [I] [E]

• la perte d’inhibiteur est significatif; [I]libre [I]T

• comportement “forte affinité”



Inhibition par liaison à forte affinité

• inhibition classique : – haute concentration en I par rapport de [E]

• [I] >> [E] et [S] >> [E]

– [I] libre [I] totale (équilibre rapide et constant)

– v [E], en absence et en présence de l’inhibiteur

• inhibition de forte affinité : – Faible concentration en I – similaire à [E]

• [I] [E] (l’inhibiteur est efficace à [I] [E]), cependant [S] >> [E]

– [I] libre [I] totale (la formation de E•I réduit [I] libre, on ne peut pas

considérer que [I] est cste)

– v vs [E] n’est pas linéaire

BCM 2505 51



Inhibition à forte affinité

BCM 2505 52

• Pour un inhibiteur compétitif à forte affinité, le Ki est obtenu par

régression non-linéaire de l’équation:

• Une autre façon d’obtenir le Ki est de diminuer la concentration

d’enzyme utilisée lors de l’essai (par exemple en utilisant un essai plus

sensible), pour avoir [I] >> [E]

• On peut alors utiliser un graphique de Lineweaver-Burk, par exemple,

pour obtenir le Ki

𝑣𝑖 =𝑘𝑐𝑎𝑡 𝑆

2 𝐾𝑚 + 𝑆𝐾𝑖 + 𝐼 𝑇 + 𝐸 𝑇

2 − 4[𝐸]𝑇[𝐼]𝑇− 𝐾𝑖 + 𝐼 𝑇 − 𝐸 𝑇



Identification de l’inhibition à forte affinité

1. les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur

sont similaires

2. le Ki est comparable à [E] dans l’essai cinétique très faible

3. l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par ex. par

dialyse ou filtration de gel)

4. le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme

(IC50 [E])

5. les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas

linéaires

BCM 2505 53



Courbes de Ackermann-Potter

BCM 2505 54

Ki classique Ki très élevé

[I] = 0 [I] = x [I] = 0

vi

[I] > [E]

[I] [E]

[I] < [E]

[E]T x

Inhibition de forte affinité [I] [E];

à [I] constante, v est f([E]) non-linéaire due à la formation significative de [EI]

Inhibition classique [I] >> [E];

à [I] constante, v [E]

concentrations similaires

Perte de l’activité due

à la formation de [EI]

Ki [E]



Courbes de Ackermann-Potter • à Ki > [E] et [I], faible déviation de la linéarité :

BCM 2505 55

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100v n

orm

alis

ée

Ki = 6 nM

[I] = 0 nM 1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM



Courbes de Ackermann-Potter • à Ki < [E] et [I], forte déviation de la linéarité :

BCM 2505 56

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100v n

orm

alis

ée

Ki = 0.6 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM



Courbes de Ackermann-Potter

• à Ki << [E] et [I], très forte déviation de la linéarité :

BCM 2505 57

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100v n

orm

alis

ée

Ki = 0.06 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM



Courbes de Ackermann-Potter • à Ki <<< [E] et [I], on a le titrage stœchiométrique :

BCM 2505 58

0 1 2 3 4

[E]T (nM)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100v n

orm

alis

ée

Ki = 0.006 nM

[I] = 0 nM

1.5 nM

4.5 nM

3.0 nM

pas d’inhibition; v [E] à [E]>[I]

décalée par [I]



Exemple de l’inhibition lente à forte affinité

• Les enzymes effectuent la catalyse en stabilisant l’état de transition d’une

réaction; alors, elles démontrent une grande affinité pour des analogues

d’état de transition

• 5'-méthylthioadenosine/S-adenosylhomocystéine nucléosidase catalyse

l’hydrolyse du nucléoside 5'-méthylthioadenosine en adénine et thioribose.

Singh V, et al. Femtomolar transition state analogue inhibitors of 5'-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase from Escherichia coli. J Biol Chem. 2005 May 6;280(18):18265-73.

BCM 2505 59




BCM 2505 60

• Des études mécanistiques suggèrent les aspects chimiques spécifiques à l’état de transition de la réaction

• Modélisation / enzymologie computationnelle facilite ensuite la conception des analogues appropriés




• Les analogues de l’état de transition montrent souvent de

l’inhibition lente due au fait que l’enzyme change sa conformation à

celle propice pour la catalyse (recherche d’une conformation rare):

très stable

BCM 2505 61



Équations pour IC50 (forte affinité)

• IC50 pour les trois modes d’inhibition réversible :

BCM 2505 62

N.B. : IC50 ½ [E]T

Mode d’inhibition Équation

compétitif

incompétitif

non-compétitif (simple)

[S]]E[IC Mi

iT21

50

KKK

iT21

50 ]E[IC K

]S[]E[ICM

iiT2

150

K

KK



BCM 2505 63

Classe

d’inhibiteur

Relation entre

[E]T et [I]T

Équilibre

Traites

caractéristiques

classique [I]T >> [E]T Rapide (ms)

IC50 ne dépend pas de [E]T ;

v vs [E]T linéaire

[P] vs temps linéaire

« tight-binding » [I]T [E]T Rapide (ms)

IC50 dépend de [E]T ;

v vs [E]T non-linéaire

[P] vs temps linéaire

« slow-binding » [I]T >> [E]T Lent (s à min)

IC50 ne dépend pas de [E]T ;

v vs [E]T linéaire

[P] vs temps non-linéaire

« slow, tight-

binding » [I]T [E]T Lent (s à min)

IC50 dépend de [E]T ;

v vs [E]T non-linéaire

[P] vs temps non-linéaire

Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles



Remerciements

Pr Jeffrey Keillor, Département de chimie, Université

d’Ottawa, 10 Marie-Curie, Ottawa, ON K1N 6H5

Dr Robert Menard (défunt), Chef de groupe, Institut de

recherche en biotechnologie du CNRC, 6100, avenue

Royalmount, Montréal, QC H4P 2R2

Pr Laurent Salmon & Dr Casimir Blonski, Institut de Chimie

Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO), Université

Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex, France

BCM 2505 64

inhibition enzymatique.pdf

Documents