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Induction spécifique deschitinases racinaires pardes souches fongiquesectomycorhiziennes oupathogènesFrédéric Lapeyrie a , Catherine Albrecht a & SabineBrédard aa INRA, Centre de Recherches de Nancy, Laboratoirede Microbiologie forestière , F-54280 , ChampenouxPublished online: 27 Apr 2013.

To cite this article: Frédéric Lapeyrie , Catherine Albrecht & Sabine Brédard(1994) Induction spécifique des chitinases racinaires par des souches fongiquesectomycorhiziennes ou pathogènes, Acta Botanica Gallica: Botany Letters, 141:4,437-441, DOI: 10.1080/12538078.1994.10515180

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Acta bot. GaUica, 1994, 141 (1-), 437411.

Induction specifique des chitinases racinaires par des souches fongiques ectomycorhiziennes ou pathog(mes

par Frederic Lapeyrie, Catherine Albrecht et Sabine Bredard

INRA, Centre de Recherches de Nancy, Laboratoire de Microbiologie forestwre, F-54280 Champenoux

INTRODUCTION

Resume.- Alors que les memes isoformes ayant une activite chitinolytique son! induites par des champignons pathogenes ou mycorhiziens, Ia nature des inducteurs fongiques serait differente. Par ailleurs, parmi les souches symbiotiques etudiees. Ia variabilite du pouvoir inducteur observe, soit in vivo lors de Ia colonisation des racines, soil in vitro apres traitement des racines avec des extraits fongiques, serait attribuable a Ia presence en plus ou moins grande quantile d'inducteurs compatibles avec I' hOte. Des travaux u~erieurs montrent de plus que ces inducteurs mycorhiziens sont spec~iques de Ia plante-hOte.

Summary.- While the same chitinase isoforms were induced following acto­mycorrhizal or pathogenic colonization of Eucalyptus roots, the inducing mole­cules would be structurally d~ferent. Moreover among ectomycorrhizal strains of varied aggressiveness toward Eucalyptus seedling, the level of root chili· nase induction observed in vivo during root colonization or in vitro following treatment with fungal extracts, would be regulated by the availability of an inducing molecule compatible with this host. Recent results are showing that some of these chitinase inducing molecules from ectomycorrhizal fungi are host-plant specific.

Key words : chitinase · ectomycorrhizal fungi - Eucalyptus- Pisolithus tinc­torius.

sous la dependance de facteur de re­connaissance plante-champignon.

Les ectomycorhizes, associations sym­biotiques entre racines et champignons, sont caracterisees par Ia differenciation de tissus specialises, le manteau et le reseau de Hartig. Les mecanismes con­duisant a Ia mise en place de ces strue­tures doivent etre fortcment regules ct

De nombreux auteurs ont suivi Ia mise en place des tissus symbiotiques pour apprecier leur variabilite specifi­que et intraspecifique (Debaud et al., 1988; Lei et al., 1990; Wong et al., 1990). L'expression differentielle de cer­tains genes controles par des signaux

©Societe botanique de France 1994. /SSN 1253-8078.

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echanges entre les symbiontes doit de­terminer certaines des differences ob­servees. Certains gimes de l'hote con­troleraient Ia croissance fongique regu­lant ainsi l'agressivite d'une souche sym­biotique. Par ailleurs, de nombreux travaux ont permis de mettre en evi­dence le role des chitinases racinaires parfois associees aux glucanases lors du controle des infections pathogenes (Trudel et al., 1989; Broglie et al., 1991).

Pour comprendre les interactions precoces entre plantes et champignons ectomycorhiziens, !'evolution des acti­vites chitinases racinaires a done ete suivie au cours des premieres heures de contact entre Eucalyptus globulus ssp. bicostata (Maid. et al.) Kirkp et des souches de Pisolithus tinctorius plus ou moins agressives vis-a-vis de cet hote. La reponse de Ia plante, detectable des 6 heures et au-dela de 7 jours apres inoculation, est d'autant plus intense que Ia souche symhiotique inoculee est agressive (Albrecht et al., 1993, 1994). Des resultats identiques ont ete obte­nus lorsque les plantules sont traitees durant 24 h avec des extraits fongiques prepares a partir de ces memes souches suggerant que l'intensite de Ia reponse est partiellement determinee par la na­ture ou Ia disponibilite des inducteurs fongiques mycorhiziens plutot que par !'infection proprement dite (Albrecht et al., 1994).

De plus, sur gel d'electrophorese mono- ou bidimensionnel les memes iso­formes ont ete observees, que le cham­pignon soit pathogene ou symhiotique (Albrecht et al., resultats non publics). La reponse de Ia plante au contact d'un champignon symbiotique ne differe done pas qualitativement, mais seulement quantitativement de celle observee apres inoculation d'un champignon pathogene ou application des extraits fongiques correspondants.

Afin d'apprecier Ia specificitc des inducteurs issus de champignons myco­rhiziens d'agressivite variable d'une part, et d'autre part des inducteurs de champignons pathogenes, Ia reponse de Ia plante a ete analysee en presence de doses croissantes d'extraits fongiques ainsi qu'apres traitement thermique de ceux-ci.

MATERIEL ET METHODES

Le materiel blologlque les graines de Eucalyptus globulus ssp. bicostata

(Maid. et a/.) Kirl<p. ont ate recoltees a Tumbarumba NSW, Australia (Seedlot : 91/24). les champignons ectomycorhiziens sont deux souches de Pisolithus tinc­torius. La souche H2144 (souche agressive) a ate isolee a partir d'un carpophore recolte en Australia sous Eucalyptus (CSIRO Herbarium, Division of Forestry, Western Australia) et Ia souche 270 (non agressive vis-a-vis de I'Eucalyptus) provient d'un carpophore re­colte aux USA sous Pinus. Une souche pathogene de Phytophthora cinnamomi a ate isolee sur Eucalyptus gunnii (Haute-Garonne, France). Celie souche induit des necroses racinaires apres 2 jours de co-culture puis Ia mort du plant.

Preparation des extralts fonglques et application aux racines

Les extra~s sont prepares a partir de colonies fon­giques agees de 15 jours, homogeneisees dans un mortier en presence de tampon phosphate, 100 mM, pH 7 (5 JJI!nng de matiere fraiche fongique). Apres cen­trifugation et dilution, le surnageant est apports au con­tact des racines durant 24 heures, en conditions steri­les comma decrit par Albrecht eta/. (1994). Des volu­mes croissants d'extraits ont ate apportes aux plantu­les : 0, 50, 100, 150, 200, 250 JJI. le volume finale de Ia solution d'incubation est complete a 300 JJI avec de l'eau dis1illee. Dans certains cas. las extraits fongiques ont ate autoclaves (20 minutes a 120°C) avant tra~e­ment des racines.

separation electrophoretique des chltlnases Les racines excisees sont traitees salon Albrecht et

a/. (1994). Apres separation electrophoretique en con­dition native des proteines racinaires, les activites chiti­nases sont visualisees par des plages noires (non fluo­rescentes sous UV), sur fond de glycol-chitina non hy­drolysee et coloree au Calcofluor White M2R. les pia­gas de lyse correspondant a Ia seconde isoforme raci­naire, Ia plus fortement stimulee au cours de !'infection, ont eta quantifiees par analyse dens~ometrique. Las resultats presentes ont ate obtenus de tac;on repetitive au cours de trois experimentations dis­tinctes.

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RESULTATS

L'activite chitinase de Ia seconde iso­forme racinaire est fortement stimulee 24 h apres application d'extrait de Ia souche agressive (H2144) (Fig. 1a). Cette activite tend cependant vers un niveau maximum, en presence de 200 JII d'ex­trait. Comme precedemment observe (Albrecht et al., 1994), l'extrait produit a partir de Ia souche Ia moins agressive (270) a une capacite a induire l'activite

1400

1200

1000

800

600

400

200

chitinase racinaire beaucoup plus fai­ble lorsque 50, 100 ou 150 JII sont ap­portes. On observe que ce manque d'ef­ficacite peut etre compense integrale­ment par des apports plus important d'extrait. Ainsi pour des apports de 200 JII et 250 JII d'extrait, les deux sou­ches (H2144 et 270) ont le meme pou­voir inducteur. La reponse de Ia plante semble alors avoir atteint un plateau maximum.

Cependant les plantes traitees avec

0~----_.------~------~----~----~

Fig. 1 a et b.- Relation entre Ia concentration en extraits fon­giques (en ~I d'extrait dans 300 ~I de solution d'incuba­tion) des solutions mises au contact de germinations de Eucalyptus globulus ssp. bi­costata et l'activrte chrtinasique de Ia seconde isoforme quan­tifiee 24 heures apres trarte­ment. Una souche ectomyco­rhizienne agressive de Pisoli­thus tinctorius (ll), una sou­che non-agressive (0) et une souche pathogene de Phy­tophthora cinnamomi (D) ont ete comparees.

0 100

Dose d'eliciteur (Jll)

Dose d'eliciteur (Jll)

200

Fig. 1 a and b.- Relationship bet­ween concentration of cell­free fungal extract (in ~I made up to 300 ~I final volume of incubation solution) set in con­tact with Eucalyptus globulus ssp. bicostata seedlings and roots chitinase activity (second isoform) assessed 24 hours later. Aggressive ectomycor­rhizal strain of Pisolithus tinc­torius strain (t>), a non-aggres­sive one (0) and a pathoge­nic strain of Phytophthora cinnamomi (D) were compa­red.

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Fig. 2.- Activit~ chitinase de racines d'Eucalyptus apr~s s~paration ~lectrophor~tique des prot~ines natives aci­des sur gel de polyacrylamide (15 %) (PAGE). La fl~che indique Ia seconde isoforme. les racines ont ~t~ incubees durant 24h en presence d'extraits fongiques autoclaves (20 min., 120°C) de Pisolithus tinctorius (souche agressive : 2144) et de Phytophthora cinnamomi (souche pathog~ne : P63). Trois volumes d'extrans ont ~t~ apport~s (50, 100 and 150 ~JI) dans Ia solution d'incubation (volume final, 3001)1). Chaque ~chantillon contient 0,8 mg poids frais de racines.

Fig. 2.- Chitinase activities of Eucalyptus roots after native 15% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for acidic proteins. Arrow indicates the second isoform. Roots were incubated for 24 h with heat-treated (20 min., 120°C) cell-free fungal extracts from an aggressive strain of Pisolithus tinctorius (2144) and a pathogenic strain of Phytophthora cinnamomi (P63). Three concentrations of cell-free fungal extracts were set in contact and compared (50, 100 and 150 IJI in 300 IJI final volume of incubation solution). Samples contained 0.8 mg fresh weight root material.

des extraits de Ia souche pathogene pre­sentent one activite chitinase maximale de Ia seconde isoforme 4 fois superieurc a celle observee apres induction par des extraits de souches symbiotiques (Fig. 1b).

Apres autoclavage, alors que l'extrait du champignon symbiotique (souche 2144) est toujours capable d'induire une forte reponse de Ia plante queUe que soit Ia dose apportee (50, 100 ou 150 JJI), Ia reponse de Ia plante traitee avec un extrait de souche pathogene est a peine detectable, meme en presence de 150 Jll d'extrait fongique (Fig. 2).

DISCUSSION

S'agissant d'extraits fongiques non pu­rifies, !'induction des chitinascs obscr­vecs ici peut resulter de Ia presence de plusieurs molecules inductriccs distine­tes, presentee simultancment ct even-

tuellement associees a des suppresseurs de l'induction. L'interpretation des re­sultats doit done etre prudente tant que ces inducteurs ou suppresseurs n'au­ront pas ete purifies.

Les resultats presentee suggerent que le pouvoir inducteur contraste des sou­ches 270 et H2144 observe soil in vivo lors de Ia colonisation racinaire par les hyphes, soil in vitro apres traitement des racines avec des extraits fongiques, serait attribuable a Ia pauvrete de Ia souche isolee sous Pinw (270), en in­ducteurs compatibles avec Ia racine d'Eucalyptw. Elle ne serait pas due a Ia presence d'un suppresseur en exces, ou d'inducteurs structurellement ina­daptcs et nc pouvant induirc que des reponscs particlles de Ia plante.

lei, Ia rcponsc de Ia plante, aprcs contact avec des extraits de champi­gnons symbiotiqucs, n'excede pas un certain seuil quclles que soient les do-

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ses d'extraits apportees. II semble done que Ia capacite de Ia plante a percevoir un signal et/ou sa capacite a y repondre soient saturees. Par contre, Ia reponse de Ia plante ne semble pas connaitre les memes limites en presence d'extraits d'une souche pathogene. Ceci suggere que les modes d'action des inducteurs pathogenes ou symbiotiques sont dis­tincts, bien que les memes isoformes soient induites par les champignons pa­thogenes ou mycorhiziens. Cette hypo­these est confortee par le fait que seuls les inducteurs symbiotiques sont ther­moresistants.

Des travaux ulterieurs (Albrecht et al., resultats non publies) ont permis de montrer par ailleurs que les induc­teurs mycorhiziens sont egalement spe­cifiques d'une plante-hote.

Le role endogene de ces chitinases lors de Ia differenciation des tissus ra­cinaires symbiotiques (Broglie et al., 1991 ; DeJong et al., 1992, 1993) ou exogene en direction du champignon, soit pour controler sa croissance et orienter son developpement, soit pour participer a Ia generation de nouvelles molecules signal (Staehelin et al., 1992), reste a determiner.

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