III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes

enzymatiquesCP450 (suite)

CP450, mécanisme

Mécanisme concerté vs. 2 étapes

Pas de transposition allylique et rétention de configuration >90%

D

D

D

D

HO

D

D

OH

D

H

Mécanisme concerté

Mécanisme concerté vs. 2 étapes

Mécanisme concerté vs. 2 étapes

+

Horloges radicalaires

H OH

HO

concerté

2 étapes

FeV O

FeIV OH

FeIV OH FeI I I

FeI I I

k

kOH

Horloges radicalaires

Pas de transposition

Pas de transposition

Nitroxyl radical coupling

K. U Ingold

Barton’s PTOC

N S

O

R

O

PhSH (PhSeH)Bu3SnH N SH

O

R

O

R- CO2

RH

Calibration

OO

tBu

O

O NO

N

O Nk k

O-CO2, -

hν

k1

k-1

U R

U' R'

d[R’]/dt = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]

0 = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]

k1[U’] - k-1[R’] = k[R’][P]

k1[U’]/k[R’][P] - k-1[R’]/k[R’][P] = 1

k1[U’]/k[R’][P] = 1

k1 = k[R’][P]/[U’]

k1 = k[R][P]/[U]

Calibration

k k

k1

k-1O

ON

S-CO2

PhSH

2 1O9 s-1

CP450, mécanisme radicalaire?

d[U’]/dt = k[1] - kreb.[U’] - kR[U’]

d[R’]/dt = kR[U’] - kreb.[R’] = 0 ; [U]/[R] = [U’]/[R’]

kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x 7/1 = 1.4 1010 s-1

OFeV O

HH FeIV OH

FeIV OH

FeII I H

FeII IO

H

R

kreb.

kreb.

kR

k

U'

R'

1 U

U/R = 7

Horloges radicalaires

Les rapides Les très rapides

Horloges radicalaires

1.4 1010<kOH< 7 1012

Pourquoi cet écart?

1) Mécanisme mal modélisé

2) Calibration des horloges pas présise

3) Effet stérique et effet de la protéine sur le réarraangement

kOH = 1013 s-1

Il faut remettre les pendules à l’heure

1.4 1010<kOH< 7 1012

Les horloges ne donnent

pas la bonne heure!!!!!

1-2 1013 s-1 > à la vitesse de décomposition d’un état de transition

Trop rapide pour l’existence d’un intermédiaire

Et M. Newcomb propose un mécanisme avec un C+

A la recherche d’une horloge à C+

A la recherche d’une horloge à C+

A la recherche d’une horloge à C+

Mécanisme avec un ion carbénium?

1 à 3%

M. Newcomb persiste et signe

Si radical temps de demie vie de 1.7 10-13 s (trop court pour un intermédiaire)

Si radical rapport B/C plus grand

Conclusion :

mécanisme avec insertion directe de « OH » avec réaction secondaire

0.6%

Nouveau mécanisme

Effet isotopique kH/kD

Effet isotopique kH/kD

D OH

HO

FeV O FeIV OH

FeIV OH FeI I I

FeI I I

kOH

OHHO

D

1

2

CP450, deux oxydants possibles

CP450, deux oxydants possibles

Insertion de « O »

Hydroxylation

Insertion de « OH »

Responsable de la

formation

des produits transposés

CP450, deux oxydants possibles

Insertion de « O »

Hydroxylation

Insertion de « OH »

Responsable de la

formation

des produits transposés

Epoxydation des oléfines

PhMe

H

H

PhMe

H

HO

PhH

H

Me

PhH

H

MeO

PhH

HMe

FeI I I

OO

H

Substrat-suicide

Vérification des hypothèses

appel à la biologie moléculaireMutant thréonine Alanine (T303A)

Hydroxylation vs. epoxydation

FeV=O FeIIIOOH

Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450

P450

P450

T303A

Hydroxylation vs. epoxydation

FeV=O FeIIIOOH

Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450

P450

P450

T303A

Et avec les horloges?

Hydroxylation

Hydroxylation

Hydroxylation des aromatiques,

NIH shift

Hydroxylation des aromatiques,NIH shift

Et avec les horloges?

Hydroxylation

Hydroxylation

Hydroxylation

Rapport R/U élevéRapport R/U faible

Effet isotopique kH/kD

M. Newcomb, le retour

Pas de radical!!!!!!!

Comment Shaik arrive à réconcilier

tout le monde

Shaik serait-il normand?

Low Spin vs. High Spin

•

•

HS LS

Calculs DFT

Low Spin vs. High Spin

CP450, mécanisme radicalaire?

kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x [U]/[R]

OFeV O

HH FeIV OH

FeIV OH

FeII I H

FeII IO

H

R

kreb.

kreb.

kR

k

U'

R'

1 U

U/R = 7

inhibition par fixation covalentesur l'enzyme fuite

Oxydation des amines

Oxydation des amines

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