hôpital a trousseau · d’après monaghan et feldman, prenat diagn 1999; 19:604-609 fréquences...
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MucoviscidoseMucoviscidose
Historique : Maladie hHistorique : Maladie héérrééditaire ditaire –– Modifications ioniques : ElModifications ioniques : Eléévation du Cl et du Na sudoralvation du Cl et du Na sudoral(di (di SantSant’’AgneseAgnese, , AmAm J J MedMed, 1953), 1953)
Maladie hMaladie héérrééditaire frditaire frééquente quente –– Transmission mode ARTransmission mode AR–– GraveGrave–– FrFrééquentequente–– Grande variabilitGrande variabilitéé dd’’expressionexpression–– Due Due àà une atteinte du gune atteinte du gèène CF codant la protne CF codant la protééine CFTRine CFTR–– Diagnostic et dDiagnostic et déépistage de la maladiepistage de la maladie
Delphine FeldmannLaboratoire de Biochimie,Biologie MoléculaireHôpital A Trousseau
fréquence à la naissance fréquence hétérozygotes
Caucasiens 1/2 500 (1/1 800 à 1/3 500) 1/251/4 300 1/33
Moyen-Orient 1/4 400 1/33Hispaniques 1/8 500 1/46Noirs Américains / Africains 1/20 000 1/70Asiatiques 1/32 400 1/90
d’après Monaghan et Feldman, Prenat Diagn 1999; 19:604-609
Fréquences en fonction des populationsFréquences en fonction des populations
insuffisance pancréatiquefonction pancréatique conservée
formes “monosymptomatiques”de l’adulte
- Absence bilatérale des canaux déférents- Bronchectasies diffuses- Pancréatite chronique- Atteinte rhino-sinusienne chronique atypique
atteinte respiratoire variable
test de la sueur : test de la sueur : + + intermédiaire négatifintermédiaire négatif
Variabilité phénotypiqueVariabilité phénotypiquepathologie du gène pathologie du gène CFTRCFTR
iléus méconial
Identification du gèneIdentification du gène--Clonage positionnelClonage positionnel--1989, Science, 1989, Science, TsuiTsui et Collinset Collins
localisationchromosomique
localisationchromosomique
fine
cartographie physique
recherche de gènes(clonage)
contig gène
identification de mutation→ implication du gène
mutation
AAATATCATTGGTGTTTCC
TCT
F508delexon 10
Etude de marqueurs ADN dans les familles :
étude de liaison génétique
cartographie génétique
Du gène à la protéine CFTRDu gène à la protéine CFTR
Gène : 7q31 – 200 kb
Protéine : 1480 aamb apicale des cellules des épithéliums sécrétoires
ARNm : 6,5 kb
Régulation de l’expression mal connue
ORCC
Cl-
sécrétion
biosynthèse
Inflammationglutathion, HCO3-
autres molécules ?
récepteur de bactéries ?ENaC
Na+
CFTR
CFTR CFTR -- fonctionsfonctions
noyau
Cl-
REGolgi
PKa, PKcAMPc
ATP
exocytose
CFTRCFTR
FonctionsFonctions–– Canal Cl limitantCanal Cl limitant–– RRéégulateur dgulateur d’’autres canaux ioniquesautres canaux ioniques–– Favorise lFavorise l’’exocytoseexocytose–– RRéégulation du pH intracellulairegulation du pH intracellulaire–– RRôôle dans lle dans l’’inflammationinflammation
protprotééine ine «« rrééseau seau »»
CFTRCFTR
Expression Expression –– PPôôle apical des cellules le apical des cellules éépithpithèèlialesliales
Canaux pancrCanaux pancrééatiques et biliairesatiques et biliairesCyptes Cyptes intestinalesintestinalesArbre Arbre trachtrachééoo--bronchiquebronchiqueTubules rTubules réénaux, appareil gnaux, appareil géénital, glandes nital, glandes sudoriparessudoriparesPas de corrPas de corréélation entre le taux dlation entre le taux d’’expression et la expression et la pathologiepathologie
CFTRExons 3
E60XG85E
394delTT
4
R117HY122X
621+1G>T
5 6a 7 9 10 11Intron 11
12 13 14a14b 16 17b 18 19
Intron 1920 21
G178R711+1G>T
L206WL227R
1078delTR334WR347HR347P
1342-6(5T/6T/7T)D443YA445E
Q493X1609delCAI507delF508del1677delTA
1717-1G>AG542XS549RG551DQ552XR553X
G576XG576AE585X
1898+1G>A1898+1G>T1898+5G>T
R668C2143delTG673X
2183AA>G2184insAK710XR792X
W846X2789+5G>A
3120+1G>A
3272-26A>GY1092XL1065PR1066C
D1152H
R1158XR1162X3659delC
G1144ES1251N3905insTW1282X
4005+1G>A 4016insTN1303KQ1313X
1811-1,6kbA>G 3849+10kbC>T
Mutations du gène Mutations du gène CFTRCFTR
1 2 6b 8 15 17a 22 23 24
1500 mutations tout le long du gène
E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil
16%
faux-sens47,5%
13%
20%
épissage
frameshift
non-sens
grands réarrangements
2% autres (en phase ins/del, promoteur)
2%
sévères
Types de mutations du gène Types de mutations du gène CFTRCFTR
sévères/modérées/neutres ?E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil
Répartition des mutations en EUROPERRéépartition des mutations en EUROPEpartition des mutations en EUROPE
UK DF508 UK DF508 DF508 : 80% DF508 : 80% BELGIQUE DF 508BELGIQUE DF 508 G551D G551D G542X G542X ALLEMAGNEALLEMAGNE G542X G542X N1303K N1303K DF508DF508 ESPAGNE 621+1G>T ESPAGNE 621+1G>T 17171717--1 G>A R553X1 G>A R553X DF 508 1717DF 508 1717--1 G>A 1 G>A 2184 2184 deldel A G542X A G542X G542X (R117H) G542X (R117H) W1282X W1282X G551DG551D N1303K (R553X) N1303K (R553X) R347PR347P R1162X (1898+1 G>A) R1162X (1898+1 G>A) N1303KN1303K 711+1 G>T (N1303K) 711+1 G>T (N1303K) R334W R334W ITALIE DF 508ITALIE DF 508 G85E G85E N1303K N1303K
FRANCE DF 508 FRANCE DF 508 G542XG542X G542X G542X 17171717--1 G> A1 G> A N 1303 K N 1303 K R 1162XR 1162X W 1282 X W 1282 X W1282X W1282X 1717 1717 --1 G> A 1 G> A R553XR553X G551 D G551 D 45% 45% (621+1 G> T) (621+1 G> T)
Phénotype cliniqueGénotype CFTR
Mutations de classes
Corrélations génotypeCorrélations génotype--phénotypephénotype
Mucoviscidose-Insuffisance pancréatiquesévère / sévère
Mucoviscidose-Fonction pancréatique conservéesévère / modérée
Formes mono-symptomatiquesde l’adultesévère / très modérée
modérée / modérée
CorrCorréélations glations géénotypenotype--phphéénotypenotype
((++) avec la fonction pancr) avec la fonction pancrééatiqueatique((--) avec l) avec l’’atteinte respiratoireatteinte respiratoire
Facteurs intervenant dans la variabilité clinique ?
Facteurs génétiques Facteurs génétiques modificateurs modificateurs
de la mucoviscidosede la mucoviscidose
Variabilité aussi au sein de fratries
gènes modificateurs
Variabilité phénotypique pour un même génotypeautres mutations du gène CFTRfacteurs environnementaux
Expression phénotypique de la mucoviscidose variable(âge de début, gravité de l’atteinte pulmonaire, positivité du test de la sueur…)
nature des mutations
mutations CFTR / gènes modificateurs
voies respiratoirescomplications hépato-biliaires
intestinpancréas endocrinepancréas exocrine
glandes sudoriparestractus génital
… La description d’allèles complexes est de plus en plus fréquente (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), avec même l’association de plusieurs polymorphismes qui aurait un effet synergique ou cumulatif délétère, et qui pourrait rendre compte de formes monosymptomatiques de l’adulte.
AllAllèèles complexes du gles complexes du gèène ne CFTRCFTR
SSéévvééritritéé
F508del + F508del + R553QR553Q identique mais identique mais test de la sueur test de la sueur
normalnormalR334WR334W + R1158X+ R1158X
--102T>A102T>A + S549R+ S549R
R74WR74W + D1270N+ D1270N
G576A + R668C + G576A + R668C + D443YD443Y
R347H + R347H + D979AD979A
R117H +R117H + IVS8IVS8--5T5T
5’ 3’8 9 10F508del
TTTTTGA(TG)mTnTnAAACAG GGATTTGGG
8 9 10 ARNm CFTR normal7T ou 9T
ARNm CFTR délété de l’exon 98 105T5T
Modulation du phénotype par le variant d’Modulation du phénotype par le variant d’épissageépissage de de l’intron 8l’intron 8
1 génotype : F508del / R117H → 2 phénotypes (Kiesewetter et al., Nature Genet 93)
F508del / R117H + IVS8-5T5T → mucoviscidose Test de la sueur NlF508del / R117H + IVS8-7T → infertilité masculine par absence bilatérale
des canaux déférentsou mucoviscidose très modéréeou asymptomatique
?
(TG)mT5
Diagnostic de la mucoviscidoseDiagnostic de la mucoviscidose
CritCritèères pour res pour éétablir le diagnostic de la tablir le diagnostic de la mucoviscidose mucoviscidose ((RosensteinRosenstein andand CuttingsCuttings JPediatr.1998)JPediatr.1998)
–– Un ou plusieurs signes cliniquesUn ou plusieurs signes cliniques–– Ou un frOu un frèère ou une sre ou une sœœur atteintur atteint–– Ou un Ou un ddéépistage npistage nééonatal positifonatal positif
Et un Et un test de la sueur positif test de la sueur positif àà au moins 2 au moins 2 reprisesreprisesOu Ou 2 mutations du g2 mutations du gèène CFTRne CFTROu une Ou une diffdifféérence de potentiel nasale anormalerence de potentiel nasale anormale
Test de la sueur (1)Test de la sueur (1)ElEléément indispensable du diagnosticment indispensable du diagnosticGibson et Cooke, Gibson et Cooke, PediatricsPediatrics, 1959., 1959.–– Stimulation de la sudation : Stimulation de la sudation : iontophoriontophorèèsese àà la la
pilocarpinepilocarpine
+ --
K2SO4Pilocarpine
Test de la sueur (2)Test de la sueur (2)
Stimulation de la sudationStimulation de la sudationRecueil de la sueurRecueil de la sueur–– Papier filtre, Papier filtre, ExsupatchExsupatch, , MacroductMacroduct, , NanoductNanoduct–– DurDuréée : 20 e : 20 --30 30 mnmn, , NanoductNanoduct : 3: 3--5 5 mnmn
DDéébit de sueur 1g/m2/bit de sueur 1g/m2/mnmn (70mg)(70mg)
Dosage des ionsDosage des ions–– Cl spCl spéécifique : titrimcifique : titriméétrie, trie, coulomcouloméétrietrie, ,
potentiompotentioméétrietrie ((ExsudoseExsudose))–– Ions : Ions : conductimconductiméétrietrie ((WescorWescor, , NanoductNanoduct))
Test de la sueur (3)Test de la sueur (3)Cl spCl spéécifiquecifique
Normal < 40 Normal < 40 mmolmmol/l /l nvnv nnéé < 30 < 30 mmolmmol/l/l
IntermInterméédiaire 30, 40 diaire 30, 40 –– 60 60 mmolmmol/L/L
PathologiquePathologique > 60 > 60 mmolmmol/L/L
ConductimConductiméétrietrieNormal < 50 Normal < 50 -- 60 60 mmolmmol/l /l
IntermInterméédiaire 50 diaire 50 –– 90 90 mmolmmol/L/L
PathologiquePathologique > 80 > 80 -- 90 90 mmolmmol/L/L
InterprInterpréétationtationAge de lAge de l’’enfantenfantDDéébit de sueur bit de sueur MMééthode de dosagethode de dosageAbsence de Absence de
contaminationscontaminations
très rares
Faux négatifs
Faux positifsDénutrition,desydratation,fiévre,eczema
Tr corticostéroides
Outils dOutils d’é’étude du gtude du gèène ne CFTRCFTR
Méthodes de détection cibléetrousses (20-30 mutations)
Méthodes de balayage d’exons
Gène CFTR190 kb 27 exons> 1000 mutations ponctuellesdistribution et fréquence variables selon l’origine géographique
Recherche de remaniements(délétions, duplications,
insertions)
Analyse de microsatellites- étude indirecte pour cas urgents- exclusion du gène - détection de délétions, disomies uniparentales- diagnostic prénatal
CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS
CF (12) m PCR kit CF (12) m PCR kit -- La technologie La technologie ARMSARMS
La PCR n'a lieu que lorsque la sLa PCR n'a lieu que lorsque la sééquence cible est prquence cible est préésente dans l'sente dans l'ééchantillon chantillon Primer ARMS spPrimer ARMS spéécifique de la scifique de la sééquence cible P Primer communquence cible P Primer commun Extension par la Extension par la TaqTaq PolymPolyméérase Pas d'extensionrase Pas d'extension
SSééquence ADN cible Squence ADN cible Sééquence d'ADN non quence d'ADN non -- ciblecible
P 3' 5' P 3' 5' 3' 3' 5'5'
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'
PRODUITS de PCR PRODUITS de PCR PAS PAS dede PRODUITS de PCRPRODUITS de PCR
CF (12) m PCR kit - La technologie ARMS
CF (12) m PCR kit CF (12) m PCR kit -- La technologie La technologie ARMSARMS
TUBE A TUBE A DNADNA TUBE BTUBE B RRééaction ARMS 1 action ARMS 1 -- Primer normal RPrimer normal Rééaction ARMS 2 action ARMS 2 -- Primer mutantPrimer mutant commun commun commucommunn
n n mm Si sSi sééquence normale dans le DNA Si squence normale dans le DNA Si sééquence mutquence mutéée dans le DNAe dans le DNA
Produit de PCR aProduit de PCR analysnalyséé sur gelsur gel
Normal Homozygote HNormal Homozygote Hééttéérozygote Homozygote mutantrozygote Homozygote mutant Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 2 Tube 1 Tube 22 Tube 1 Tube 2 nn m m nn m m n n mm
CFTRExons 3
E60XG85E
394delTT
4
R117HY122X
621+1G>T
5 6a 7 9 10 11Intron 11
12 13 14a14b 16 17b 18 19
Intron 1920 21
G178R711+1G>T
L206WL227R
1078delTR334WR347HR347P
1342-6(5T/6T/7T)D443YA445E
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G576XG576AE585X
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N1303KQ1313X
1811-1,6kbA>G 3849+10kbC>T
Mutations du gène Mutations du gène CFTRCFTR
1 2 6b 8 15 17a 22 23 24
KIT Elucigene CF 30 mutations FranceDétection de 81 à 85 % des allèles mutésDe la population française caucasienne
0 50 100 150 200 250 (kb)
5 '- 3 '
1 2 3 4 5 6a 6b 7 8910 13 14a14b 15
1617a17b 1819 20 2111 12 22 2324
dele2* dele19dele14a
dele14b-18 (20kb)
dele17a-18 (8.6kb)
dele2,3 (21kb)
dele4-10 (40kb)
dele4-7 (10kb) + 11-18 (40kb)
dele16-17b
dele17b-18
dele2-10 (95,7kb)
dele21dele17b
dele22-23*
dele11-16
dele4-6a
dele4dele1*
dele17b
dele14b-17b (10kb)dele17a-17b (2.5kb)
dele3-10,14b-16
deleCFTR (>3Mb)
dup4-8
dele2-6b
dup11-13
Remaniements du gène Remaniements du gène CFTRCFTR
2% des anomalies mais 20% des mutations non identifiéesE. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil
La phénylcétonurie (PCU) avec le test de Guthrie depuis 1972
L'hypothyroïdie congénitale (1978)
La drépanocytose depuis 1989 dans les Dom-Tom et 1995 en métropole
L'hyperplasie congénitale des surrénales depuis 1995.
La Mucoviscidose mis en place courant 2002
DEPISTAGE NEONATALDEPISTAGE NEONATAL5 maladies rares5 maladies rares–– ddéébut asymptomatique but asymptomatique –– traitables, traitables,
systsystéématique matique Il est effectuIl est effectuéé sur chaque bsur chaque béébbéé entre son 3entre son 3èème me et 4et 4èème jour de vie.me jour de vie.Objectif : bObjectif : béénnééfice direct et immfice direct et imméédiat diat àà un enfant un enfant qui se rqui se réévvéélera malade.lera malade.CritCritèères stricts : res stricts : critcritèères de Wilsonres de Wilson ddééfinis en finis en 1965 puis confirm1965 puis confirméés en 1989 lors de la dernis en 1989 lors de la dernièère re confconféérence de consensus organisrence de consensus organiséée au Canada.e au Canada.
IRT > 65 μg/L
Recherche 30 mutations
M/M M/X X/X
Test de la sueur
Positif négatiflimite
IRT > seuil 3
Laboratoirede dépistage
Laboratoire degénétique moléculaire 1
Laboratoire degénétique moléculaire 2
Laboratoirede biochimie
Balayage du gène CFTR
CRCM Prise en charge + conseil génétique
DEPSTAGE NEONATAL DE LA MUCOVISCIDOSE
Prise en charge + conseil génétiquePrise en charge + conseil génétiquePrise en charge + conseil génétique
DDéépistagepistage
AvantagesAvantages–– Organisation en CRCMOrganisation en CRCM–– Suivi des patients standardisSuivi des patients standardisééssLimitesLimites–– Faux nFaux néégatifsgatifs–– DDéépistage des hpistage des hééttéérozygotesrozygotes–– DDéépistage des formes frustres pistage des formes frustres
STRATEGIE D’ETUDE PATIENT Né AVT 2003
Symptomes cliniquesTest de la sueur
Positf X2 Négatif X2Intermédiaire X2
BM 30 mutations
-/- -/-ConsanguinsPopulation particulière
+/-
Screening du gène
CRCM
-/-
arret
+/- +/+
+/+
CRCM
arrêtSymptômesCliniques +++
?D.Feldmann, Trousseau, Paris
Indications d’étude du gène Indications d’étude du gène CFTRCFTR
Approche directe uniquement2 - Aide au diagnostic
Mucoviscidose- formes atypiques- iléus méconial- suspicion chez le fœtus sur signe
d’appel échographique
Formes mono-symptom.de l’adulte- stérilité masculine par ABCD- dilatation des bronches- pancréatites chroniques
1 - Conseil génétique
3 - Dépistage néonatal
Encadrement particulier
cas index + parents
Diagnostic prénatalrisque de mucoviscidose = 1/4
Couples à risque
Recherche du statut de porteur sain chez
les apparentés
Recherche du statut de porteur sain chez
les conjoints
E. Girodon, Hôpital H Mondor, Créteil