8/8/2019 Gui et al 1994

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 9 1 , p p . 1 0 8 2 4 - 1 0 8 2 8 , N o v e m b e r 1 9 9 4B i o c h e m i s t r y

P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a k i n a s e s p e c i f i c f o r t h e s e r i n e -a n d a r g i n i n e - r i c h pre-mRNA s p l i c i n g f a c t o r sJ I A N - F A N G G U I * t , HELtNE T R O N C H t R E * , SHARON D . C H A N D L E R * f , AND X I A N G - D O N G F U * 4 i* D i v i s i o n o f C e l l u l a r a n d M o l e c u l a r M e d i c i n e , a n d t B i o m e d i c a l S c i e n c e s P r o g r a m , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , S a n D i e g o , 9 5 0 0 G i l m a n D r i v e , L a J o l l a ,CA 9 2 0 9 3 - 0 6 5 1C o m m u n i c a t e d b y C h r i s t i n e G u t h r i e , J u l y 1 9 , 1 9 9 4 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w May 2 0 , 1 9 9 4 )ABSTRACT M e m b e r s o f t h e SR f a m i l y o f p r e - m R N As p l i c i n g f a c t o r s a r e p h o s p h o p r o t e i n s t h a t s h a r e a p h o s p h o -e p i t o p e s p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e d b y m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( m A b )1 0 4 . R e c e n t s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t p h o s p h o r y l a t i o n m a yr e g u l a t e t h e a c t i v i t y a n d t h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e s es p l i c i n g f a c t o r s . H e r e , w e r e p o r t t h e p u r i f i c a t i o n a n d k i n e t i cp r o p e r t i e s o f SR p r o t e i n k i n a s e 1 ( S R P K 1 ) , a k i n a s e s p e c i f i c f o rSR f a m i l y m e m b e r s . We d e m o n s t r a t e t h a t t h e k i n a s e s p e c i f i -c a l l y r e c o g n i z e s t h e SR d o m a i n , w h i c h c o n t a i n s s e r -i n e / a r g i n i n e r e p e a t s . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t d e -p h o s p h o r y l a t e d SR p r o t e i n s d i d n o t r e a c t w i t h m Ab 1 0 4 a n dm i g r a t e d f a s t e r i n S D S g e l s t h a n SR p r o t e i n s f r o m m a m m a l i a nc e l l s . We s h o w t h a t SRPK1 r e s t o r e s b o t h m o b i l i t y a n d m AB1 0 4 r e a c t i v i t y t o a SR p r o t e i n S F 2 / A S F ( s p l i c i n g f a c t o r 2 / a l -t e r n a t i v e s p l i c i n g f a c t o r ) p r o d u c e d i n b a c t e r i a , sugIN t h a tSRPK1 i s r e s p o n s i b l e f o r t h e g e n e r a t i o n o f t h e mAb 1 0 4 -s p e c i f i c p h o s p h o e p i t o p e i n v i v o . F i n a l l y , we h a v e c o r r e l a t e d t h ee f f e c t s o f m u t a g e n e s i s i n t h e SR d o m a i n o f S F 2 / A S F o n s p l i c i n gw i t h t h o s e o n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e p r o t e i n b y S R P K 1 ,s u g g e s t i n g t h a t p h o s p h o r y l a t i o n o f SR p r o t e i n s i s r e q u i r e d f o rs p i c i n . .SR p r o t e i n s a r e a f a m i l y o f p r e - m R N A s p l i c i n g f a c t o r sc h a r a c t e r i z e d b y t h e p r e s e n c e o f R N A b i n d i n g m o t i f s a n d t h eSR d o m a i n , w h i c h c o n s i s t s l a r g e l y o f s e r i n e / a r g i n i n e r e p e a t s( 1 ) . T h e y a r e e s s e n t i a l s p l i c i n g f a c t o r s , p l a y i n g c r i t i c a l r o l e si n t h e i n i t i a t i o n o f s p l i c e o s o m e a s s e m b l y o n p r e - m R N As u b s t r a t e s ( 2 - 6 ) . SR p r o t e i n s a r e f u n c t i o n a l l y s i m i l a r w h e na s s a y e d f o r s p l i c i n g i n v i t r o ( 7 , 8 ) . H o w e v e r , r e c e n t s t u d i e sh a v e s h o w n t h a t e a c h m e m b e r d i s p l a y s a d i s t i n c t s p e c t r u m o fs u b s t r a t e s p e c i f i c i t y t o w a r d p r e - m R N A s ( 5 , 9 - 1 1 ) . SR p r o -t e i n s c a n a l s o a l t e r a l t e r n a t i v e s p l i c e s i t e s e l e c t i o n i n v i t r o b yp r o m o t i n g t h e u s e o f p r o x i m a l 5 ' a n d 3 ' s p l i c e s i t e s i n ac o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( 8 , 1 0 , 1 2 , 1 3 ) . A s e r i e s o fr e c e n t s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t a l t e r n a t i v e s p l i c e s i t eu s a g e i s m e d i a t e d , a t l e a s t i n p a r t , b y d i r e c t b i n d i n g o f a SRp r o t e i n ( s ) t o t h e s i t e o r b y r e c r u i t i n g a SR p r o t e i n ( s ) t o t h e s i t eb y s p e c i f i c a l t e r n a t i v e s p l i c i n g r e g u l a t o r s ( 1 1 , 1 4 , 1 5 ) . T h u s ,a l t e r n a t i v e s p l i c i n g c o u l d , i n p r i n c i p l e , b e r e g u l a t e d b y c o n -t r o l l i n g t h e e x p r e s s i o n a n d / o r a c t i v i t y o f SR p r o t e i n s .T h e l e v e l s o f i n d i v i d u a l SR p r o t e i n s h a v e b e e n r e p o r t e d t od i f f e r a m o n g t i s s u e s ( 1 0 ) . H o w e v e r , t h e q u a n t i t a t i o n o fp r o t e i n e x p r e s s i o n i n t h i s s t u d y d e p e n d s o n t h e u s e o fm o n o c l o n a l a n t i b o d y ( m A b ) 1 0 4 t h a t r e c o g n i z e s a s p e c i f i cp h o s p h o e p i t o p e p r e s e n t i n a l l SR f a m i l y m e m b e r s . T h u s , t h ev a r i a t i o n i n SR p r o t e i n s d e t e c t e d c o u l d r e f l e c t t h e e x p r e s s i o nl e v e l s o f SR p r o t e i n s a n d / o r t h e i r d i f f e r e n t i a l p h o s p h o r y l a -t i o n i n d i f f e r e n t t i s s u e s . T h e SR d o m a i n h a s r e c e n t l y b e e ns h o w n t o b e r e s p o n s i b l e f o r p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n sd u r i n g s p l i c e o s o m e a s s e m b l y ( 6 , 1 6 , 1 7 ) , a n d a m p l e p o t e n t i a lp h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a r e p r e s e n t i n t h e SR d o m a i n . T h u s ,p h o s p h o r y l a t i o n may m o d u l a t e SR p r o t e i n i n t e r a c t i o n s .

T h r e e l i n e s o f e v i d e n c e s u g g e s t t h a t p h o s p h o r y l a t i o n p l a y sa r o l e i n p r e - m R N A s p l i c i n g . ( i ) A U l - s m a l l n u c l e a r r i b o n u -c l e o p r o t e i n p a r t i c l e ( s n R N P ) - a s s o c i a t e d k i n a s e a c t i v i t y h a sb e e n d e s c r i b e d t h a t c o u l d p h o s p h o r y l a t e t h e SR d o m a i n i nt h e SR f a m i l y m e m b e r s p l i c i n g f a c t o r 2 / a l t e r n a t i v e s p l i c i n gf a c t o r ( S F 2 / A S F ) a n d a s i m i l a r m o t i f c o n s i s t i n g o f s e r i n e /a r g i n i n e r e p e a t s i n t h e U1 7 0 - k D a p r o t e i n ( 1 8 ) . I n c o r p o r a t i o no f a n o n h y d r o l y z a b l e h o m o l o g o f ATP i n t o t h e i s o l a t e d U1snRNP b y t h e k i n a s e i m p a i r e d i t s a b i l i t y t o c o m p l e m e n ts p l i c i n g i n a U1 s n R N P - d e p l e t e d n u c l e a r e x t r a c t ( 1 9 ) . ( i i ) I th a s b e e n r e p o r t e d ( 2 0 ) t h a t i n h i b i t o r s t o p h o s p h a t a s e s c a ns p e c i f i c a l l y i n h i b i t s p l i c i n g i n v i t r o , s u g g e s t i n g t h a t d e p h o s -p h o r y l a t i o n i s r e q u i r e d f o r s p l i c i n g . ( i i i ) We h a v e i d e n t i f i e da n d c l o n e d ( 2 1 ) a c e l l - c y c l e - r e g u l a t e d k i n a s e s p e c i f i c f o r SRp r o t e i n s , SR p r o t e i n k i n a s e 1 ( S R P K 1 ) , a n d a h i g h l e v e l o f t h i sk i n a s e c a n i n h i b i t s p l i c i n g . T h u s , t h e s e s t u d i e s s h o w t h a td e p h o s p h o r y l a t i o n i s i m p o r t a n t f o r s p l i c i n g . H o w e v e r ,w h e t h e r o r n o t p h o s p h o r y l a t i o n o f SR p r o t e i n s a n d o t h e rs p l i c i n g f a c t o r s c o n t a i n i n g a s i m i l a r SR d o m a i n i s e s s e n t i a l f o rs p l i c i n g a n d t h e p o s s i b i l i t y t h a t p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s -p h o r y l a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s o c c u r d u r i n g d i f f e r e n t s t a g e s o fs p l i c i n g r e m a i n t o b e a d d r e s s e d .I n t h i s p a p e r , w e r e p o r t t h e p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a -t i o n o f S R P K 1 . We s h o w t h a t t h e p h o s p h o e p i t o p e o n SRp r o t e i n s s p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e d b y mAb 1 0 4 c a n b e r e s t o r e db y SRPK1 t o a b a c t e r i a l l y p r o d u c e d SR p r o t e i n , S F 2 / A S F ,s u g g e s t i n g t h a t SRPK1 i s r e s p o n s i b l e f o r p h o s p h o r y l a t i o n o fSR p r o t e i n s i n v i v o . F i n a l l y , we p r o v i d e e v i d e n c e t h a tp h o s p h o r y l a t i o n o f SR p r o t e i n s b y SRPK1 i s a l s o i m p o r t a n tf o r s p l i c i n g b e c a u s e h i g h l y c o n s e r v a t i v e c h a n g e s i n t h e SRd o m a i n o f S F 2 / A S F , w h i c h w e r e p r e v i o u s l y s h o w n ( 2 3 ) t oa b o l i s h i t s f u n c t i o n i n s p l i c i n g , a l s o a f f e c t e d t h e r e c o g n i t i o na n d p h o s p h o r y l a t i o n o f t h i s s p l i c i n g f a c t o r b y S R P K 1 . F u r -t h e r i n v e s t i g a t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n r e g u l a t i o n o f s p l i c i n gw i l l b e f a c i l i t a t e d b y t h e a v a i l a b i l i t y o f S R P K 1 .

MATERIALS AND M ET H OD SE x p r e s s i o n a n d Q u a n t i t a t i o n o f R e c o m b i n a n t SR P r o t e i n s .We i n i t i a l l y u s e d SR p r o t e i n S C 3 5 a s a s u b s t r a t e f o r SRPK1k i n a s e a c t i v i t y d u r i n g p u r i f i c a t i o n . S C 3 5 w a s e x p r e s s e d i n ab a c u l o v i r u s s y s t e m a n d p u r i f i e d a s d e s c r i b e d ( 5 ) . T h i s p r o t e i nw a s f u r t h e r p u r i f i e d o n a C 4 H P L C c o l u m n f o r t h e k i n a s ea s s a y ( 2 1 ) . S i n c e t h e SR p r o t e i n S F 2 / A S F c o u l d b e e x -p r e s s e d i n b a c t e r i a a s a n u n p h o s p h o r y l a t e d f o r m , a l a r g ea m o u n t o f t h e p r o t e i n w a s p u r i f i e d f o r t h e k i n a s e a s s a y f r o mi n c l u s i o n b o d i e s a s d e s c r i b e d ( 2 2 ) . W i l d - t y p e a n d m u t a n tS F 2 / A S F p r o t e i n s p u r i f i e d f r o m b a c t e r i a ( 2 3 ) w e r e k i n d l yp r o v i d e d b y J . C a c e r e s a n d A . K r a i n e r ( C o l d S p r i n g H a r b o rL a b o r a t o r y ) . We a l s o p r e p a r e d w i l d - t y p e S F 2 / A S F f r o m

A b b r e v i a t i o n s ; SR f a m i l y , s e r i n e - a n d a r g i n i n e - r i c h p h o s p h o p r o t e i nf a m i l y ; S R P K 1 , SR p r o t e i n k i n a s e 1 ; S F 2 , s p l i c i n g f a c t o r 2 ; A S F ,a l t e r n a t i v e s p l i c i n g f a c t o r ; D T T , d i t h i o t h r e i t o l ; M B P , m y e l i n b a s i cp r o t e i n ; A S , a m m o n i u m s u l f a t e .t P e r m a n e n t a d d r e s s : I n s t i t u t e o f H y d r o b i o l o g y , C h i n e s e A c a d e m y o fS c i e n c e s , Wuhan 4 3 0 0 7 2 , P e o p l e s R e p u b l i c o f C h i n a . T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .10824

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 ) 1 0 8 2 5b a c t e r i a a n d q u a n t i t a t e d i t as f o l l o w s . T h e p r o t e i n p u r i f i e df r o m i n c l u s i o n b o d i e s was d i a l y z e d a g a i n s t 5 0 mM T r i s - H C l ,p H 7 . 6 / 5 0 0 mM N a C l / 1 mM d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) / 0 . 2 mMEDTA. T h e p r o t e i n f o r m s a g g r e g a t e s d u r i n g d i a l y s i s . T h ea g g r e g a t e s w e r e p e l l e t e d , w a s h e d once w i t h w a t e r , r e s u s -p e n d e d i n w a t e r , a n d l y o p h i l i z e d . S i n c e a c c u r a t e q u a n t i t a t i o no f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i s e s s e n t i a l f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o fk i n e t i c v a l u e s a n d f o r t h e c a l c u l a t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o nr a t i o s , p u r i f i e d SF2/ASF w a s q u a n t i t a t e d b y p r o t e i n c o m -p o s i t i o n a n a l y s i s a t t h e H a r v a r d M i c r o c h e m i s t r y f a c i l i t y .T h i s S F 2 / A S F p r e p a r a t i o n was u s e d as a s t a n d a r d f o rq u a n t i t a t i o n o f o t h e r SR p r o t e i n s b y t h e B r a d f o r d assay( B i o - R a d ) . M y e l i n b a s i c p r o t e i n ( M B P ) was p u r c h a s e d f r o mS i g m a .K i n a s e R e c t i o n s a n d D e t e r m i n a t i o n o f K i n e t c P a r a m e t e r s .P u r i f i e d S C 3 5 ( 0 . 5 p u g ) or S F 2 / A S F ( 0 . 5 H g ) w a s u s e d as as u b s t r a t e i n a 2 0 - A 4 k i n a s e assay m i x t u r e ( 5 0 mM T r i s H C l ,p H 7 . 4 / 1 0 mM M g C l 2 / 1 mM DTT/2 pM ATP/2 & C i o f[ r 3 2 P ] A T P ) . F o r e a c h f r a c t i o n , t h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b ya d d i n g 2 p l o f t h e c o l u m n f r a c t i o n a n d i n c u b a t e d a t roomt e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n . P r o t e i n s w e r e r e s o l v e d i n a 1 2 . 5 %SDS g e l . A f t e r s t a i n i n g a n d a u t o r a d i o g r a p h y , g e l s l i c e s con-taining r a d i o a c t i v e p r o t e i n s w e r e q u a n t i t a t e d i n a l i q u i ds c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . One u n i t o f SRP K 1 a c t i v i t y was d e f i n e da s 1 p m o l o f p h o s p h a t e t r a n s f e r r e d per m i n u n d e r s t a n d a r dk i n a s e r e a c t i o n c o n d i t i o n s . To measure s t o i c h i o m e t r y , 1 0 0, u & M ATP a n d s a t u r a t i n g SRPK1 ( 5 u n i t s ) w e r e u s e d t op h o s p h o r y l a t e w i l d - t y p e a n d m u t a n t SF2/ASF p r o t e i n s ( 0 . 2 5pM or 5 p m o l ) a t 3 0 0 C f o r 2 h . To d e t e r m i n e t h e k i n e t i c s o fS R P K 1 , p h o s p h o r y l a t i o n o f S F 2 / A S F w a s k e p t l i n e a r w i t hr e s p e c t t o r e a c t i o n t i m e ( 1 5 m i n ) a n d t h e k i n a s e ( 1 u n i t ) . Tod e t e r m i n e t h e K m f o r A T P , si x c o n c e n t r a t i o n s o f ATP ( 1 . 2 5pM, 2 . 5 p M , 5 p M , 2 5 I L M , 5 0 , u M , a n d 2 5 0 , u M ) w e r e t i t r a t e da g a i n s t f o u r c o n c e n t r a t i o n s o f S F 2 / A S F ( 0 . 0 5 pM, 0 . 1 pM,0 . 2 5 pM, a n d 0 . 7 , u M ) . T h e k i n a s e a c t i v i t y ( p m o l / m i n ) w a sm e a s u r e d a t e a c h p o i n t . T h e r e c i p r o c a l k i n a s e a c t i v i t i e s( 1 / u n i t s ) w e r e p l o t t e d a g a i n s t t h e r e c i p r o c a l ATP c o n c e n t r a -t i o n s ( 1 / [ A T P ] ) ( L i n e w e a v e r - B u r k p l o t ) . F o r c o m p a r i s o n ,we o n l y u s e d on e c o n s t a n t c o n c e n t r a t i o n o f ATP ( 1 0 0 p u M )a n d k i n a s e ( 1 u n i t ) t o d e t e r m i n e a p p a r e n t K m a n d r e l a t i v eV. v a l u e s f o r S F 2 / A S F a n d MBP. I n t h i s e x p e r i m e n t ,k i n a s e a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d a t f i v e c o n c e n t r a t i o n s o fS F 2 / A S F ( 0 . 0 5 p M , 0 . 1 p u M , 0 . 2 5 p t M , 0 . 5 , . M , a n d 1 . 0 p M )a n d f o u r c o n c e n t r a t i o n s o f MBP ( 2 . 5 A M , 5 . 0 p M , 1 2 . 5 u M ,a n d 2 5 p u M ) .Purication P r o c e d u r e s . S 1 0 0 e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d asd e s c r i b e d ( 2 4 ) a n d u s e d f o r l a r g e - s c a l e p u r i f i c a t i o n s . A l lp r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t a t 4 0 C . A f t e r r e m o v i n g p a r t i c l e sb y a l o w - s p e e d c e n t r i f u g a t i o n , t h e e x t r a c t ( - 1 5 m g / m l ) w a sl o a d e d a t t h e s p e e d o f 1 m l / m i n d i r e c t l y o n t o a 2 0 - m lp h o s p h o c e l l u l o s e P 1 1 ( W h a t m a n ) c o l u m n e q u i l i b r a t e d i n

b u f f e r A ( 2 0 mM T r i s * H C l , p H 7 . 2 / 5 mM ( 3 - g l y c e r o p h o s -p h a t e / 1 mM EGTA/1 mM D T T / 1 . 5 mM M g C l 2 ) c o n t a i n i n g5 0 mM N a C l . A f t e r w a s h i n g t h e c o l u m n w i t h 4 0 m l o f b u f f e rA c o n t a i n i n g 5 0 mM N a C l , t h e c o l u m n was d e v e l o p e d w i t ha l i n e a r g r a d i e n t f r o m 5 0 mM t o 1 M N a C l . F r a c t i o n s ( 1 0 m l )w e r e c o l l e c t e d a n d 2 1 4 f r o m e a c h f r a c t i o n was a s s a y e d f o rt h e k i n a s e a c t i v i t y u s i n g b a c u l o v i r u s - p r o d u c ed S C 3 5 or b a c -

t e r i a l l y p r o d u c e d SF2/ASF ( S R p r o t e i n s w e r e f o u n d ex-c h a n g e a b l e as s u b s t r a t e s f o r t h e k i n a s e assay d u r i n g t h ep u r i f i c a t i o n o f S R P K 1 ; d a t a n o t s h o w n ) . O n e m a j o r k i n a s ep e a k was i d e n t i f i e d , a n d t h e p e a k f r a c t i o n s w e r e p o o l e d .Ammonium s u l f a t e ( A S ) was a d d e d t o t h e p o o l e d f r a c t i o n s t o1 . 5 M . A f t e r s t i r r i n g f o r 1 h , t h e p r e c i p i t a t e was r e m o v e d b yc e n t r i f u g a t i o n a t 8 0 0 0 rpm i n a S o r v a l l s s 3 4 r o t o r f o r 1 5 m i n .T h e s u p e r n a t a n t was d i l u t e d w i t h b u f f e r B ( 2 5 mM T r i s H C l ,pH 7 . 8 / 1 mM EGTA/1 mM DTT) t o b r i n g t h e AS t o 1 . 2 5 Ma n d d i r e c t l y l o a d e d a t 1 m l / m i n o n t o a 1 - m l P h e n y l - S e p h a r o s e( h i g h p e r f o r m a n c e ) c o l u m n ( P h a r m a c i a ) e q u i l i b r a t e d i n b u f f e rB c o n t a i n i n g 1 . 2 5 M A S . T h e c o l u m n was d e v e l o p e d w i t h al i n e a r g r a d i e n t f r o m 1 . 2 5 M AS i n b u f f e r B t o b u f f e r B o n l y .F r a c t i o n s f r o m t h e k i n a s e p e a k w e r e p o o l e d , d i l u t e d 1 : 1 0 w i t hb u f f e r B , a n d l o a d e d d i r e c t l y o n a F P L C Mono Q c o l u m ne q u i l i b r a t e d i n b u f f e r B p l u s 5 0 mM N a C l . T h e c o l u m n w a sd e v e l o p e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t f r o m 5 0 mM t o 1 M N a C l i nb u f f e r B . F r a c t i o n s f r o m t h e k i n a s e p e a k w e r e p o o l e d , d i l u t e d1 : 1 0 w i t h b u f f e r C ( 3 0 mM M e s - N a O H , p H 6 . 2 / 1 mMEGTA/1 mM D T T ) , a n d l o a d e d d i r e c t l y o n t o a FPLC MonoS c o l u m n e q u i l i b r a t e d i n b u f f e r C p l u s 5 0 mM N a C l . T h ec o l u m n was d e v e l o p e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t f r o m 5 0 mM t o1 M N a C l i n b u f f e r C . T h e k i n a s e - c o n t a i n i n g f r a c t i o n s w e r ea n a l y z e d b y SDS/PAGE f o l l o w e d b y s i l v e r s t a i n i n g .

R E S U L T SP u r i f i c a t i o n o f S R P K 1 , a S p e c i f i c K i n a s e f o r SR P r o t e i n s . T h eSRPK1 a c t i v i t y w a s i n i t i a l l y i d e n t i f i e d i n m i t o t i c e x t r a c t s a n ds h o w n t o b e a k i n a s e s p e c i f i c f o r t h e SR f a m i l y o f p r o t e i n s ( 2 1 ) .I n a s e a r c h f o r m a t e r i a l f o r l a r g e - s c a l e p u r i f i c a t i o n , we f o u n dt h a t t h e S 1 0 0 e x t r a c t ( a c c u m u l a t e d i n our f r e e z e r as a b y p r o d -u c t o f n u c l e a r e x t r a c t p r e p a r a t i o n ) c o n t a i n e d a h i g h l e v e l o f t h ek i n a s e a c t i v i t y a f t e r t h e p h o s p h o c e l l u l o s e P 1 1 f r a c t i o n a t i o ns t e p . As s h o w n i n F i g . 1 A a n d T a b l e 1 , t h e k i n a s e w a sa c t i v a t e d ' - 1 8 - f o l d , w h e r e a s t h e t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e d b y a f a c t o r o f - 5 0 , a c h i e v i n g 9 0 0 - f o l d p u r i f i c a t i o ni n a s i n g l e s t e p . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n w a s a l s o m a d e w i t hw h o l e c e l l e x t r a c t s d e r i v e d f r o m m i t o t i c a l l y a r r e s t e d a n du n s y n c h r o n i z e d HeLa c e l l s ( d a t a n o t s h o w n , see r e f . 2 1 ) . T h ek i n a s e s p u r i f i e d f r o m b o t h sources d i s p l a y e d s i m i l a r e f f e c t s ons p l i c i n g a n d t h e l o c a l i z a t i o n o f s p l i c i n g f a c t o r s ( 2 1 ) . T h i so b s e r v a t i o n i n d i c a t e s t h a t S 1 0 0 may c o n t a i n a n i n h i b i t o r ( s ) t oSRPK1 a n d t h a t S 1 0 0 a n d w h o l e c e l l e x t r a c t s p r o v i d e d s u f f i -c i e n t m a t e r i a l f o r l a r g e - s c a l e p u r i f i c a t i o n .A f t e r t e s t i n g many c o l u m n r e s i n s a n d p u r i f i c a t i o n c o n d i -t i o n s , we d e v e l o p e d a p r o t o c o l t o p u r i f y SRPK1 t o h o m o g e -n e i t y t h r o u g h f o u r c o n s e c u t i v e f r a c t i o n a t i o n s t e p s . T h e c o l -umn p r o f i l e s ar e shown i n F i g . 1 a n d t h e p u r i f i c a t i o n i ss u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . A t e a c h s t e p , a s i n g l e k i n a s e p e a k ,a s s a y e d u s i n g S C 3 5 as a s u b s t r a t e , was i d e n t i f i e d . SRPK1b o u n d t o a p h o s p h o c e l l u l o s e P 1 1 c o l u m n a n d w a s e l u t e d a t0 . 7 M N a C l ( F i g . 1 A ) . T h e k i n a s e f r a c t i o n s w e r e f u r t h e rf r a c t i o n a t e d w i t h AS a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s l o a d e d o n t o aP h e n y l - S e p h a r o s e c o l u mn . T h e f o l d p u r i f i c a t i o n s h o w n i nT a b l e 1 w a s d e r i v e d f r o m b o t h AS f r a c t i o n a t i o n a n d separa-t i o n o n t h e P h e n y l - S e p h a r o s e c o l u m n . A t t h i s p o i n t , a 9 2 - k D ab a n d t h a t w a s d e t e c t e d among many o t h e r p r o t e i n s i n t h eSRP K 1 p e a k was e l u t e d a t 0 . 6 M AS ( F i g . 1 B ) . F u r t h e r

T a b l e 1 . S u m m a r y o f SRPK1 p u r i f i c a t i o n f r o m HeLa c e l l S 1 0 0 e x t r a c t sT o t a l p r o t e i n , T o t a l a c t i v i t y , S p e c i f i c a c t i v i t y , F o l d R e c o v e r y ,S t e p mg u n i t s x 1 0 - 3 p m o l p e r m i n p e r mg p u r i f i c a t i o n %

S 1 0 0 1 2 5 0 1 . 2 5 1 1 1 0 0P 1 1 2 4 2 1 . 6 9 0 0 9 0 0 1 0 0P S 2 . 0 5 . 2 2 . 6 x 1 0 3 2 , 6 0 0 2 4 . 0Mono Q 0 . 2 0 3 . 6 1 . 8 x 1 0 4 1 8 , 0 0 0 1 7 . 0Mono S 0 . 0 1 5 3 . 5 2 . 3 x 1 0 5 2 3 0 , 0 0 0 1 6 . 0P S , P h e n y l - S e p h a r o s e . O n e u n i t o f SRPK1 a c t i v i t y i s d e f i n e d a s 1 p m o l o f p h o s p h a t e t r a n s f e r r e d p e rm i n a t room t e m p e r a t u r e . S p e c i f i c a c t i v i t y i s p m o l o f p h o s p h a t e t r a n s f e r r e d p e r mg o f p r o t e i n p e r m i n .

B i o c h e m i s t r y : G u i e t a l .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 )A Af a - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0 . 5

- T 1 1 1 ! 5 I a -

B w 1 v \ ' l - ' a c t i o r : -

z

F I G . 2 . P r o t e i n c o m p o s i t i o n o f t h e k i n a s e - c o n t a i n i n g p e a k f r a c -t i o n s . ( A ) P r o t e i n s i n p o o l e d k i n a s e c o n t a i n i n g f r a c t i o n s f r o m e a c hc o l u m n w e r e r e s o l v e d i n a 1 0 % o SDS g e l a n d s i l v e r s t a i n e d . ( B ) P r o t e i np r o f i l e o f t h e Mono S f r a c t i o n s a c r o s s t h e SRPK1 a c t i v i t y p e a k . As i n g l e 9 2 - k D a p r o t e i n c o p u r i f i e d w i t h t h e k i n a s e a c t i v i t y .

'

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 ) 1 0 8 2 75 . 8 g M , a n d v e r y l o w V . . v a l u e o f 0 . 0 2 p m o l p e r m i n p e r u n i to f k i n a s e f o r M B P ( F i g . 3 B ) . I n a d d i t i o n , w h i l e s e v e r a lp h o s p h a t e s w e r e t r a n s f e r r e d t o o n e S F 2 / A S F m o l e c u l e ( s e eb e l o w ) ,

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 )b e p r e s e n t i n t h e n u c l e u s . C o n s i s t e n t w i t h t h i s i d e a , t w op o t e n t i a l n u c l e a r - t a r g e t i n g s i g n a l s a r e p r e s e n t i n t h e s e q u e n c ef r o m a cDNA c l o n e f o r SRPK1 ( 2 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , i t s f i s s i o ny e a s t h o m o l o g u e , d s k l , w a s f o u n d t o b e m a i n l y d i s t r i b u t e d i nt h e c y t o p l a s m i n i n t e r p h a s e c e l l s a n d m i g r a t e t o t h e n u c l e u sb e f o r e m i t o s i s ( 2 5 ) . I f t h i s i s a l s o c h a r a c t e r i s t i c o f S R P K 1 , i t sn u c l e a r t r a n s l o c a t i o n may b e a c r i t i c a l s t e p i n t h e r e g u l a t i o no f p r e - m R N A s p l i c i n g i n i n t e r p h a s e c e l l s .A c t i v a t i o n o f SRPK1 d u r i n g p u r i f i c a t i o n s u g g e s t s t h a t ap o t e n t i a l i n h i b i t o r ( s ) h a s b ee n r e m o v ed . P r e l i m i n a r y s t u d i e si n d i c a t e t h a t s u c h a n i n h i b i t o r d o e s e x i s t a n d c a n b e r e c o v -e r e d f r o m a s i n g l e F P L C p e a k ( J . - F . G . , H . T . , a n d X . - D . F . ,u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . I n f i s s i o n y e a s t , t h e s e q u e n c e o fd s k l w a s f o u n d t o c o n t a i n a c y t o p l a s m i c r e t e n t i o n s i g n a l . A tp r e s e n t , i t i s n o t c l e a r w h e r e t h e p o t e n t i a l i n h i b i t o r f o rSRPK1 i s l o c a l i z e d . H o w e v e r , a n i n t r i g u i n g p o s s i b i l i t y i s t h a tt h i s i n h i b i t o r may b e r e s p o n s i b l e f o r t h e c y t o p l a s m i c r e t e n -t i o n o f S R P K 1 .I n c h a r a c t e r i z i n g t h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f S R P K 1 , t h e d a t as u g g e s t t h a t SR p r o t e i n s a r e p h y s i o l o g i c a l s u b s t r a t e s f o rS R P K 1 . T h e e x t r e m e l y l o w K m v a l u e f o r S F 2 / A S F i n d i c a t e st h a t SRPK1 h a s a h i g h a f f i n i t y f o r t h i s SR p r o t e i n , r a i s i n g t h ep o s s i b i l i t y t h a t SRPK1 may b e a s s o c i a t e d w i t h SR p r o t e i n s i nv i v o . R e c e n t l y , a U l - a s s o c i a t e d k i n a s e a c t i v i t y w a s d e s c r i b e d( 1 8 ) t h a t c o u l d p h o s p h o r y l a t e t h e s a m e SR d o m a i n i n S F 2 /ASF t h a t w a s p h o s p h o r y l a t e d b y S R P K 1 . We h a v e a l s oo b s e r v e d t h a t SR p r o t e i n s p u r i f i e d f r o m m a m m a l i a n c e l l s o re x p r e s s e d f r o m b a c u l o v i r u s - i n f e c t e d S f 9 c e l l s c o n t a i n a h i g hl e v e l o f a n a s s o c i a t e d k i n a s e a c t i v i t y ( J . - F . G . , H . T . , a n dX . - D . F . , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . T h e s e o b s e r v a t i o n ss u g g e s t t h a t SRPK1 c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e U l - o r SRp r o t e i n - a s s o c i a t e d k i n a s e a c t i v i t i e s .T o u s e a c a l i b r a t e d s a m p l e o f S F 2 / A S F t o q u a n t i t a t e p h o s -p h o r y l a t i o n , w e f i r s t d e t e r m i n e d a n a c c u r a t e S F 2 / A S F c o n -c e n t r a t i o n b y p u r i f y i n g t h e b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n t oh o m o g e n e i t y f o l l o w e d b y p r o t e i n c o m p o s i t i o n a n a l y s i s . W i t h i nt h e SR d o m a i n o f S F 2 / A S F , t h e r e a r e 1 6 s e r i n e s w i t h i n t h e SRr e p e a t s a n d 4 s e r i n e s o u t s i d e t h e r e p e a t s ( F i g . 5 A ) . E v e n i f w emay h a v e o v e r e s t i m a t e d t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f S F 2 /A S F , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t a t l e a s t h a l f o f t h e s e r i n e r e s i d u e sw i t h i n t h e SR r e p e a t s c a n b e p h o s p h o r y l a t e d . P h o s p h o r y l a t i o no f t h e SR d o m a i n w o u l d c h a n g e t h e r a t i o o f p o s i t i v e a n dn e g a t i v e c h a r g e s , a c o n s e q u e n c e t h a t m a y b e i m p o r t a n t f o rp r o t e i n f o l d i n g , R N A b i n d i n g , a n d / o r p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c -t i o n s d u r i n g s p l i c i n g a n d s p l i c e o s o m e a s s e m b l y .R o t h a n d h i s c o w o r k e r s ( 1 , 2 6 ) h a v e s h o w n t h a t p h o s p h o r -y l a t i o n o f SR p r o t e i n s i s c o r r e l a t e d w i t h t h e i r m o b i l i t y o nSDS g e l s a n d t h e i r r e a c t i v i t y t o mAb 1 0 4 . We h a v e d e m o n -s t r a t e d t h a t b o t h m o b i l i t y o n SDS g e l s a n d r e a c t i v i t y t o mAb1 0 4 c o u l d b e r e s t o r e d t o a b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d SR p r o t e i n b yp u r i f i e d S R P K 1 , i n d i c a t i n g t h a t SRPK1 i s r e s p o n s i b l e f o rp h o s p h o r y l a t i o n o f SR p r o t e i n s i n v i v o . We d o n o t k n o w t h em i n i m a l n u m b e r a n d l o c a t i o n o f p h o s p h o s e r i n e s i n t h e SRd o m a i n t h a t a r e i m p o r t a n t f o r t h e m o b i l i t y s h i f t a n d r e a c t i v i t yt o m Ab 1 0 4 . T h e r e f o r e , t h e p o s s i b i l i t y r e m a i n s t h a t t h e r e a r er e d u n d a n t k i n a s e s i n m a m m a l i a n c e l l s . I n f i s s i o n y e a s t ,o v e r e x p r e s s i o n o f d s k l c a u s e d a c e l l - c y c l e - d e f i c i e n t p h e n o -t y p e , e . g . , a d e l a y i n t h e G 2 - t o M - p h a s e t r a n s i t i o n ( 2 5 ) .H o w e v e r , d i s r u p t i o n o f t h e d s k l g e n e h a d n o e f f e c t o nv i a b i l i t y o r g r o w t h , s u g g e s t i n g t h e e x i s t e n c e o f f u n c t i o n a l l yr e d u n d a n t k i n a s e s . I n t e r e s t i n g l y , o n l y o n e s p l i c i n g f a c t o rc o n t a i n i n g a SR d o m a i n , p r p 2 , a h o m o l o g u e o f h u m a n U 2 A F ,h a s b e e n i s o l a t e d f r o m S c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e , b u t n o ty e t f r o m S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ( 2 8 ) . W h e t h e r t h e p r p 2p r o d u c t f r o m S . p o m b e i s a s u b s t r a t e f o r d s k l a n d SRPK1r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . I f SRPK1 c a n p h o s p h o r y l a t e p r p 2 ,a d d i t i o n a l y e a s t s u b s t r a t e s c o n t a i n i n g a S R - l i k e d o m a i n f r o mb o t h S . c e r e v i s i a e a n d S . p o m b e m a y b e d e t e c t a b l e b i o c h e m -i c a l l y , w h i c h o t h e r w i s e m i g h t h a v e f a i l e d t o b e i s o l a t e dg e n e t i c a l l y b e c a u s e o f t h e i r r e d u n d a n c y .

We d e m o n s t r a t e d i n t h i s p a p e r t h a t t h e e f f e c t s o f c o n s e r -v a t i v e c h a n g e s w i t h i n t h e SR d o m a i n o f S F 2 / A S F o n s p l i c i n gc a n b e a c c o u n t e d f o r b y t h e e f f e c t s o f t h e s e c h a n g e s o np h o s p h o r y l a t i o n b y S R P K 1 , a r g u i n g s t r o n g l y t h a t p h o s p h o r -y l a t i o n i s i m p o r t a n t f o r t h e f u n c t i o n o f SR p r o t e i n s i n s p l i c i n g .I n o u r r e p o r t ( 2 1 ) , w e a l s o s h o w e d t h a t a h i g h l e v e l o f SRPK1w a s i n h i b i t o r y t o s p l i c i n g . T h u s , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h ef u n c t i o n o f SR p r o t e i n s i n s p l i c i n g may b e r e g u l a t e d b yp h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s p h o r y l a t i o n . T h e SR d o m a i n h a sb e e n s h o w n t o p a r t i c i p a t e i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s ( 6 ,1 6 , 1 7 ) . T h u s , p h o s p h o r y l a t e d SR p r o t e i n s may b e r e q u i r e dt o m e d i a t e s t e p s d u r i n g s p l i c e o s o me a s s e m bl y , a n d d e p h o s -p h o r y l a t i o n o f t h e s e SR p r o t e i n s may b e e s s e n t i a l f o r t h ea c t i v a t i o n a n d r e s o l u t i o n o f s p l i c e o s o m e . I d e n t i f i c a t i o n a n dp u r i f i c a t i o n o f S R P K 1 , a k i n a s e s p e c i f i c f o r SR p r o t e i n s , w i l lh a v e a n i m p a c t o n r e f i n i n g t h i s m o d e l a n d u n d e r s t a n d i n g t h er e g u l a t i o n o f p r e - m R N A s p l i c i n g .We t h a n k L . G e r a c e , K . - P . L u , a n d C . G u t h r i e f o r a d v i c e ; J .C a c e r es a n d A . K r a i n e r f o r p r o v i d i n g m u t a n t S F 2 / A S F p r o t e i n s ; W .L a n e a n d R . R o b i n s o n f o r p r o t e i n c o m p o s i t i o n a n a l y s i s ; a n d J .Y e a k l e y a n d J . B e r m i n g h a m f o r c r i t i c a l c o m m e n t s o n t h e m a n u s c r i p t .H . T . i s s u p p o r t e d b y a l o n g - t e r m f e l l o w s h i p f r o m I n t e r n a t i o n a lHuman F r o n t i e r S c i e n c e P r o g r a m . X . - D . F . i s a S e a r l e S c h o l a r . T h i sw o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m C a n c e r R es e a r c h C o o r d i n a t i o nC o m m i t t e e o f t h e U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a a n d t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e so f H e a l t h ( G M 4 9 3 6 9 ) t o X . - D . F .

1 . Z a h l e r , A . M . , L an e , W. S . , S t a l k , J . A . & R o t h , M . B . ( 1 9 9 2 )G e n e s D e v . 6 , 8 3 7 - 8 4 7 .2 . K r a i n e r , A . R . , C o n w a y , G . C . & K o z a k , D . ( 1 9 9 0 ) G e n e s D e v .4 , 1 1 5 8 - 1 1 7 1 .3 . F u , X . - D . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 4 3 , 4 3 7 - 4 4 1 .4 . F u , X . - D . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 9 2 ) P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 8 9 ,1 7 2 5 - 1 7 2 9 .5 . F u , X . - D . ( 1 9 9 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 6 5 , 8 2 - 8 5 .6 . K o h t z , J . D . , J a m i s o n , S . F . , W i l l , C . L . , Z u o , P . , L u h r m a n n ,R . , G a r c i a - B l a n c o , M . A . & M a n l e y , J . L . ( 1 9 9 4 ) N a t u r e ( L o n -d o n ) 3 6 8 , 1 1 9 - 1 2 4 .7 . M a y e d a , A . , Z a h l e r , A . M . , K r a i n e r , A . R . & R o t h , M . B .( 1 9 9 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 , 1 3 0 1 - 1 3 0 4 .8 . F u , X . - D . , M a y e d a , A . , M a n i a t i s , T . & K r a i n e r , A . R . ( 1 9 9 2 )P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 8 9 , 1 1 2 2 4 - 1 1 2 2 8 .9 . K i m , Y . - J . , Z u o , P . , M a n l e y , J . L . & B a k e r , B . S . ( 1 9 9 2 ) G e n e sD e v . 6 , 2 5 6 9 - 2 5 7 9 .1 0 . Z a h l e r , A . M . , N e u g e b a u r , K . M . , L an e , W . S . & R o t h , M . B .( 1 9 9 3 ) S c i e n c e 2 6 0 , 2 1 9 - 2 2 2 .1 1 . T i a n , M . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 9 3 ) C e l l 7 4 , 1 0 5 - 1 1 4 .1 2 . G e , H . & M a n l e y , J . L . ( 1 9 9 0 ) C e l l 6 2 , 2 5 - 3 4 .1 3 . K r a i n e r , A . R . , C o n w a y , G . C . & K o z a k , D . ( 1 9 9 0 ) C e l l 6 2 ,3 5 - 4 2 .1 4 . S u n , Q . , M a y e d a , A . , H a m p s o n , R . K . , K r a i n e r , A . R . &R o t t m a n , F . M . ( 1 9 9 3 ) G e n e s D e v . 7 , 2 5 9 8 - 2 6 0 8 .1 5 . L a v i g u e u r , A . , B r a n c h e , H . L . , K o r n b l i h t t , A . R . & C h a b o t , B .( 1 9 9 3 ) G e n e s D e v . 7 , 2 4 0 5 - 2 4 1 7 .1 6 . A m r e i n , H . , H e d l e y , M . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 9 4 ) C e l l 7 6 , 7 3 5 - 7 4 6 .1 7 . W u , J . Y . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 9 3 ) C e l l 7 5 , 1 0 6 1 - 1 0 7 0 .1 8 . W o p p m a n n , A . , W i l l , C . L . , K o r n s t a d t , U . , Z u o , P . , M a n l e y ,J . L . & L u h r m a n n , R . ( 1 9 9 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 2 1 , 2 8 1 5 - 2 8 2 2 .1 9 . T a z i , J . , K o r n s t a d t , U . , R o s s i , F . , J e a n t e u r , P . & L u h r m a n n ,R . ( 1 9 9 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 6 3 , 2 8 3 - 2 8 6 .2 0 . M e r m o u d , J . E . , C o h e n , P . & L a m o n d , A . I . ( 1 9 9 2 ) N u c l e i cA c i d s R e s . 2 0 , 5 2 6 3 - 5 2 6 9 .2 1 . G u i , J . - F . , L a n e , W. S . & F u , X . - D . ( 1 9 9 4 ) N a t u r e ( Lo n d o n )3 6 9 , 6 7 8 - 6 8 2 .2 2 . G a u l , U . , S e i f e r t , E . , S c h u h , R . & J a c k l e , H . ( 1 9 8 7 ) C e l l 5 0 ,6 3 9 - 6 4 7 .2 3 . C a c e r e s , J . F . & K r a i n e r , A . R . ( 1 9 9 3 ) EMBOJ. 1 2 , 4 7 1 5 - 4 7 2 6 .2 4 . K r a i n e r , A . R . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 2 , 7 2 5 - 7 3 6 .2 5 . T a k e u c h i , M. & Y a n a g i d a , M . ( 1 9 9 3 ) M o l . B i o l . C e l l . 4 ,2 4 7 - 2 6 0 .

2 6 . R o t h , M . B . , Z a h l e r , A . M . & S t o l k , J . A . ( 1 9 9 1 ) J . C e l l B i o l .1 1 5 , 5 8 7 - 5 % .2 7 . Z u o , P . & M a n l e y , J . L . ( 1 9 9 3 ) E M B O J . 1 2 , 4 7 2 7 - 4 7 3 7 .2 8 . P o t a s h k i n , J . , N a i k , K . & W e n t z - H u n t e r , K . ( 1 9 9 3 ) S c i e n c e2 6 2 , 5 7 3- 5 7 5.

1 0 8 2 8 B i o c h e m i s t r y : G u i e t a l .