gmp 2004 j.m.scherrmann inserm u26 et cppk département - université paris 5 inserm institut...

GMP 2004

J.M.SCHERRMANN

INSERM U26

et

CPPK département - Université Paris 5

InsermInstitut nationalde la santé et de la recherche médicale

Le point sur les transporteurs et leur impact dans le développement cinétique du

médicament

GMP 2004

TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUEETAT DES CONNAISSANCES EN 1987

Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987

"Drug transport in the intestine occurs mainly by diffusion"....

" Intestinal drugs carriers contribution seems to be of minor importance."

"The liver is the organ where carrier-mediated drug transport predominates"

Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

GMP 2004

TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUEETAT DES CONNAISSANCES EN 1987

Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987

Four hypothetical carrier systems for hepatocellular drug uptake

Carrier 1 Carrier 2 Carrier3 Carrier4

Bile acidsEstronesulfateEstradiol glucuronide

BilirubinBromosulphophtaleinANSIndocyanine green

MorphineNalorphine

Ouabain

Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

"bile acid carrier" "organic anions" "organic cations"

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TRANSPORTEURS ET ADME EN 1996A. TSUJI, Carrier-mediated Intestinal Transport of Drugs, Pharm. Res., 1996

PepT1

MCT1

MDR1

Absorption et sécrétion intestinales

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TRANSPORTEURS RENAUX EN 1997

K.j. ULLRICH, Renal transporters for organic anions and organic cations, J. Membrane Biol, 1997

MDR1

Oatp1

MRP

OCT1

Sécrétion et réabsorption rénales

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TRANSPORTEURS HEPATIQUES EN 1997

D. K. MEIJER, Adv. Drug Deliv. Rev., 1997

Métabolisme et excrétion biliaire

GMP 2004

Le transport en 2004 ?

GMP 2004

Vers l’identification et la cartographie cellulaire des protéines de transport impliquées dans

ADME

et

de nombreuses questions sur leur rôle fonctionnel et leur impact sur les stratégies

de développement du médicament

Vers la vectorisation des processus cinétiques de ADME

GMP 2004

ENZYMES/TRANSPORTEURS : SIMILITUDES

Protéines

Expression ubiquitaire

Inhibition (domaine des Km, Ki du nM au mM)

Induction (voies de transcription communes : PXR, CAR, FXR…)

Polymorphismes Génétiques

(CYP 3A –ABCB1 (P-gp))

Polyspécificité des substrats transformés ou transportés

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• Exon 26 C 3435 T

C 3435 T

mutation silencieuse

Polymorphisme génétique de la P-gp

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Polymorphisme génétique de la P-gp : effets sur l’absorption intestinale de la digoxine

• CD-TT > CD-CC

• AUC TT > AUC CC 38%

• En relation avec niveau expression P-gp des entérocytes (barrière intestinale)

– TT : faible niveau d’expression

– CC : fort niveau d’expression

Extrait de Hoffmeyer et al., 2000

GMP 2004

Polyspécificité des substrats transportés

Cations organiques amphiphatiques ABCB1, ABCC1, ABCG2

Substrats communs entre ABC protéines

vbl

dox

col

pra

ABCB1

ABCG2

ABCC1

From LITMAN et al. CMLS 2001

GMP 2004

Le tandem cinétique enzyme - transporteur

Déterminisme ou Stochastisme ?

M M-OH M-OCM-OCM

Phase 0 Phase 1 Phase 2 Phase 3

TUGTsCYPs

ex : couplage CY3A / P-gp au niveau intestinal régulation coordonnée des gènes ?

T

GMP 2004

ENZYMES/TRANSPORTEURS : DIFFERENCES

ENZYMES TRANSPORTEURS

fonction biotransformation chimique transport

expressioncellulaire

organitesintracellulaires

membranes plasmique, mitochondriale, nucléaire

co-facteursde la réaction

NADPH, Fe,… ATP, GSH, H+, HCO

3

GMP 2004

Polarisation de l’expression des transporteurs sur les cellules épithéliales et endothéliales

MDR1P-gp

MDR3P-gp

MRP1 cMOAT(MRP2)

MDR 3

Application du concept dans les modèles in vitro

Pôle apical

Pôle basal

GMP 2004

- 2004 –UNE TRENTAINE DE TRANSPORTEURS D’INTERET EN ADME

REINBARRIERES : BHE, placenta, prostate

INTESTIN

PROTEINES ABC(7)

Pep T 1/2

MCT 1/2

OCTs (5)

OATs (4)

OATPs (9)

FOIE

ENTs (8)

BEAUCOUP D’AUTRES IMPLIQUES EN PK-PDex : bioamines cérébrales (sérotonine, dopamine……)polymorphisme génétique du transporteur 5 HTT

GMP 2004

Noms ABC1 MDR

P-gp

MRP ALD OABP GCN20 White

BCRP

Sous-familles

ABCA ABCB ABCC ABCD ABCE ABCF ABCG

Membres 12 11 13 4 1 3 5 (+1?)

49 transporteurs ATP – Binding Cassette chez l’Homme

La super famille des protéines ABC

Transport actif primaire uniport

• théorie « flippase », « vacuum cleaner »(P-gp)

• co-transport avec GSH (MRPs)

GMP 2004

MRPs : ABCCs

COOH

COOH

Core (Pgp-like) TMD0 L0

ATP

COOH NH2

Extracellulaire MRP9

MRP1

MRP5

MRP9

Intracellulaire

NH2

ATP ATP

ATPATP

NH2

D’après Borst et al.(2000) et Bera et al.(2002)

extra

extra

intra

intra

• MRP1: 190kDa.

930 (MRP9) à 1545 aa (MRP2).

•Transporteurs ABC

•Dépendent du GSH (co-transport)

Inhibiteurs :

Probénécide, indométacine, MK571

Substrats :

composés anioniques, conjugués au glutathion, aux sulfates et à l’acide D-glucuronique.

Ex: leucotriène C4, oestradiol-17--D-glucuronide.

GMP 2004

- superfamille « membrane solute carrier », famille SLC21A/slc21a

- transport actif secondaire (GSH, anions inorganiques)

- rat /souris / homme : 11/8/9 représentants caractérisés

- 643 à 722 aa., 12 TDMs

N-glycSignature de la famille Substrats : anions organiques de

PM >450Da.

ex: sels biliaires, DHEA, digoxine, taurocholate, agonistes des récepteurs opioïdes (DPDPE)…

Inhibiteurs : digoxine, PSC833, probénécide.

Transporteurs d’anions organiques polypeptides : OATPs/oatps (SLC21A)

La super famille des protéines SLC

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- Transport actif secondaire- 4 représentants caractérisés (OAT1 à OAT4)- Distribution tissulaire : rein et foie- Cerveau : BHEBHE : OAT3 sur la membrane luminale des

cellules endothélialesBHLBHL : OAT1 et OAT3 sur la membrane apicale

des cellules épithéliales des PC

D’après sweet et al., 2001

- Substrats : acide p-aminohippurique, céphalosporines, AINS, fluorescéine, pesticides, herbicides.

- Inhibiteur : probénécide

Transporteurs d’anions organiques : OATs(SLC22A)


GMP 2004

Transporteurs des cations organiques : OCTs (SLC22A)


D’après Koepsell, 1998

• transport actif secondaire potentiel dépendant : OCT1, OCT2, OCT3, +H dépendant : OCTN1, OCTN2

• distribution : rein et foie intestin, cœur, cerveau, placenta

•substrats : amines endogènes (acétylcholine, choline, dopamine, épinéphrine…) cimétidine, morphine, vérapamil, quinine, quinidine, paraquat

GMP 2004

Vers le savoir…

GMP 2004

Expression et régulation de quatre transporteurs ABC impliqués dans les mécanismes de multirésistance médicamenteuse, P-gp, Mrp1, Mrp5 et

Mxr, chez les rongeurs: le modèle astrocytaire.

La MRP1 ou l’ABCC1

NBD1 NBD2TMD0 TMD1 TMD2

Claire Mercier, Doctorat de l’Université Paris5, 9 décembre 2003

Expression dans des organes pluricellulairesexemple : cerveau et protéines ABC

GMP 2004

Expression de la Mrp1 sur les barrières cérébrales chez le rat adulte

Ependyme, Astrocytes ss ép.

Méninges Glie limitante

Plexus choroïdesEpendyme

Cap

M

MCapCP

Ep

V

F1

CP

V

EpVEp

V

Cap

BHE

Mrp

1G

FA

PExpression dans des organes pluricellulaires

exemple : cerveau et protéines ABCC. Mercier et al, Brain Res. (soumis)

GMP 2004

BHE

Plexus choroïdes

Ventricule

Méninges

Neurone

Astrocyte

Ependyme

Parenchyme cérébral

Astrocyte

Mrp1Abcg2P-gp Mrp5

Expression dans des organes pluricellulairesexemple : cerveau et protéines ABC

GMP 2004

JONCTION SERREE

PERICYTE

ASTROCYTE

NEURONE

CELLULE ENDOTHELIALE

Membrane basale

SANG

PgpMrp1

Induction des protéines de transportexemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC

GMP 2004

PUR et DOX provoquent : transcription du gène mdr1b de manière dose- et temps-dépendante

0 0 50 500

GPN

T

cont

rôle

4 h

50 500

12 h

24 h

48 h

50 500 50050

A

GAPDH

ARNm mdr1b

B

5000 0 50 500 50 5050500 500 500

+ 72

h w

P-gp

HL60

cont

rôle

4 h

12 h

24 h

48 h

48 h

Effets de la puromycine sur l’expression de mdr1b dans les cellules endothéliales RBE4P. Demeuse, J. Neurochem., 2004

Effet de la doxorubicine sur l’expression de mdr1b chez l’astrocyte de ratC. Mercier, J. Neurochem., 2003

Induction des protéines de transportexemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC

GMP 2004

Régulation de l’expression de la P-gp dans les astrocytes de rat

Activité fonctionnelle, 24 h d’exposition à la vincristine

contrôle 50 ng/mL 500 ng/mL

contrôle PSC833

** ******

P-gp fonctionnelle et inhibée par PSC833.

Corrélation entre l’expression des ARNm, de la protéine et de la fonctionnalité.

C. Mercier, J. Neurochem., 2003

GMP 2004

Fanchon Bourasset, Doctorat de l’Université Paris5, 17 décembre 2003

Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par le M6G

Implication des transporteurs d’influx et d’efflux dans la neuropharmacocinétique des xénobiotiques

cavéoline

La P-gp ou l’ABCB1

GMP 2004


Problématique : pourquoi l’activité analgésique du morphine-6 glucuronide (M6G) est supérieure à celle de la morphine alors que sa perméabilité membranaire est dix fois plus faible ?

Données bibliographiques :

Inhibition du passage de la BHE par le PSC 833 et le vérapamil (BBB in vitro, Huwyler, 96, 98; in vivo, Lötsch, 02)

Effet analgésique identique entre mdr 1a (-/-) et mdr 1a (+/+) pour le M6G (Lötsch, 00) mais différent pour la morphine (Thompson, 00)

GMP 2004


1.1. Rôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6GRôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6G :

souris sauvages / déficientes en P-gp (mdr1a (-/-)), +/- digoxine, PSC833

2.2. Rôle de transporteurs d’anions organiquesRôle de transporteurs d’anions organiques

- Mrp1 (souris sauvages / mrp1 (-/-))

- oatps, souris sauvages +/- digoxine, PSC833

3.3. Rôle de GLUT-1Rôle de GLUT-1

Hypothèses testées par la méthode de perfusion cérébrale in situ

GMP 2004

0,00001

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

100

1000

0,000001 0,0001 0,01 1 100 10000P/MM

1/2

Kin

(µl/g

/s)

Kin expérimental Kin prédit

D-glc

M6G

TXD258vinblastine

vincristine

diazépam

morphine

S18986 imipramine

sucrose


GMP 2004

Na+

GLUT 1LAT 1

A, B0+ ASC

NUTRIMENTS

SANG

CERVEAU

CATIONS ORGANIQUES

membrane abluminale

membraneluminale

P-gp

ATP

OCT?

ANIONS ORGANIQUES

OATP Aoatp 2

MCT1

OAT

?


GMP 2004

• P-gp non impliquée

• Mrp1 non impliquée

GLUT-1GLUT-1

• Transporteur Transporteur sensible à la digoxine sensible à la digoxine et PSC833et PSC833 : oatp2?: oatp2?

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Témoins PSC833 (3µM)

Digoxine (25µM)

D-glucose(30 mM)

14C

-M6

G, K

in (

µl/g

/s)

mdr1a (+/+) mdr1a (-/-)

**

** **

****

***

NS NSNSNS

0

0,01

0,02

0,03

0,04

mrp1(+/+) mrp1 (-/-)14 C

-M6G

, K

in (

µl/g/s

)

NS


Transport du M6G à travers la BHE par:

F. Bourasset et al, J. Neurochem, 2003

GMP 2004

GLUT 1SANG

CERVEAU

membrane abluminale

membraneluminale

P-gp

ATP

OATP Aoatp 2


X

GMP 2004

SANG

CERVEAU

membrane abluminale

membraneluminale

P-gp

ATP

OATP Aoatp 2

Multiplicité des transporteurs et inhibition croiséeexemple : passage de la BHE par la digoxine et les

enképhalines (DPDPE)

PSC 833

Etudes fonctionnelles de protéines ABC ( P-glycoprotéine, Mrp1, Bcrp) au niveau de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs

Salvatore Cisternino, Doctorat de l’Université Paris5, 19 décembre 2003

Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo)

TMDNBD

OUT

IN

La MXR ou l’ABCG2

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La perfusion cérébrale in situ

• Isole le cerveau /organisme• Parfait contrôle du milieu

de perfusion• Sensible• Simple • Possibilité de vérification

de l’intégrité de la BHE• Applications: • Rat (Takasato et coll., 1984)

• Souris (Dagenais et coll., 2000)

1

On

2Off

Saccharose* + molécule étudiée *Tampon physiologique

GMP 2004

Mesure du transport cérébral en trans-influx zéro :

Souris Mrp1(-/-) vs. Souris sauvages

0

0,1

0,2

0,3

Vincristine Etoposide Doxorubicin

Kin

(µl

/s/g

)

E2 17G Doxorubicine

mrp1(+/+)mrp1(+/+)

mrp1(-/-)mrp1(-/-)

Pas d’effet de la Mrp1 sur le transport cérébral de ces molécules (idem 99mTc-Sestamibi; Cattelotte et coll.,2004)

(S. Cisternino et al, Pharm. Res., 2003)

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ESPACE VASCULAIRE

PARENCHYME CEREBRAL

(P-gp)

ATP

Membraneabluminale

Membraneluminale

ABCB1

(MRP 1)

ATP

ABCC1

Influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral au niveau de la BHE chez la souris

ATP

?

(BCRP)

ABCG2

Eisenblatter et coll., 2002; 2003 Cooray et coll., 2002Zhang et coll., 2003

X

GMP 2004

La BCRP (ABCG2 ou MXR)Structure:72 Kda (monomère) protéine ABC sous famille G6 segments, 1 TMD, 1 NBDHomodimérisationPhénotype MDR

Localisation:Physiologique et tumoralerein, intestin, placenta, BHESubcellulaire: Apicaleco-localisation avec la P-gp (polarisé)

BHE In vitro : cellules endothéliales de porc, homme In vivo : pas de données

Substrats: Mitoxantrone, prazosine, SN38, 3TCModulateurs:GF120918, Fumitrémorgine C

Étude menée in vivo pour déterminer l’influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral

GMP 2004

Souris :Sauvage &

Mdr1a(-/-)

Composés :[3H]Mitoxantrone

[3H]Prazosine

[3H]Vinblastine

[14C]Sucrose

GF120918PSC833

Methodologie : Perfusion cérébrale in situ chez la souris

Mesure du transport cérébral:Substrat mixte P-gp/Bcrp:[3H]-Mitoxantrone (MX)[3H]-PrazosineNon substrat de la Bcrp:[3H]-Vinblastine

Influence de la P-gp :-comparaison sauvage / Mdr1a(-/-)-PSC833 (modulateur de la P-gp)

Influence de la Bcrp :- GF120918 (modulateur mixte Bcrp/P-gp)

GMP 2004

Méthodologie : Etude de biologie moléculaire

Déplétion Capillaire (Triguero et coll., 1990):

1. Perfusion cérébrale in situ avec un tampon (rincer le cerveau du sang)2. Déplétion – homogénéisation mécanique–centrifugation3. Culot (capillaires cérébraux) souris sauvage / mdr1a(-/-)

RT-PCR quantitative en temps réel (cortex; capillaire cérébral) :

abcg2 ARNm gapdh ARNm (référence) Spécificité (gel d’agarose, courbe de dissociation)

GMP 2004

Étude du transport cérébral de la [3H]-prazosine chez la souris

souris sauvage

souris mdr1a(-/-)

**

***

††

1

2

3

4

[3 H]-

Pra

zos

ine

Kin

(µ

l s-1

g-1

)

0

Témoins PSC833(3 µM)

GF120918(2 µM)

***

Prazosine(30 µM)

Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de prazosine Efflux indépendant de la P-gp (GF120918, prazosine), surexpression ?

GMP 2004

Étude du transport cérébral de la [3H]-mitoxantrone chez la souris

Témoins MX 100 µM

0

1

2

3

4

5

6

[H3 ]-

Mit

ox

an

tro

ne

Kin

(µ

l s-1

g-1

)

Souris sauvage

Souris mdr1a(-/-)

††

***

***

††

PSC833(3 µM)

GF120918(2 µM)

Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de MXEfflux indépendant de la P-gp (GF120918), surexpression ?

GMP 2004

Transcrits d’abcg2 dans le cortex et les capillaires du cerveau de souris par Q-RT-PCR

abcg2 ARNmgapdh

sauvage

mdr1a (-/-)

Cortexcérébral

1.0 0.2

ND

Fractions deCapillairescérébraux

680 50

2200 200

Enrichissement d’abcg2 au niveau des capillaires cérébraux

Compensation de mdr1a par l’abcg2

GMP 2004

3) Ce transport n’est pas sensible au PSC833 (pas d’effet sur la Bcrp)

5) Abcg2 est surexprimée au niveau des capillaires de souris mutantes mdr1a(-/-)

1) GF120918 inhibe un transporteur d’efflux autre que la P-gp et impliqué dans le transport de la MX et de la PRA

2) Inhibition par le GF120918 est plus forte pour les souris mdr1a(-/-) que pour les souris sauvages pour le transport de MX et de PRA

4) RT-PCR confirme la présence et l’enrichissement des transcrits d’ abcg2 au niveau du capillaire cérébral

Conclusions

GMP 2004

Synergie entre ABC protéines et physiopathologies

Progressive FamilialIntrahepatic Cholestasis(PFIC type 3)

PFIC Type 2

(MDR 1, PGP)

B 1

(MRP 2) C2

DUBIN-JOHNSONSYNDROME

G5/G8

BilirubineConjugates and Drugs

B 11 ( BSEP)

B 3 (MDR 3)

Phospholipids

SITOSTEROLEMIA

PMG and MDR

Bile salts

Cholesterol

MicellesDrugs

Canalicule biliaire

GMP 2004

Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo)

Quel modèle d’étude du transport ?A quel stade du développement ?Quelle réponse?

modèles stade de développement réponses

Systèmes transfectés

précoce(HTS)

substrat O/Ninhibiteur O/N, a

Monocouches cellulaires

précoce( ± HTS)

polarisation du transport, a

Tissus, organes isolés In situ

candidatsélectionné

impact sur A/M ou D/M ou E/M, a

Animal entier candidatsélectionné

Impact sur ADME

a) Possibilité de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax, KT…)

GMP 2004

Synergie entre modèles vitro-vivo

Pharmacocinétique des systèmes intégrés et physiopathologiques

Pharmacocinétiquemoléculaire et cellulaire

Vers le futur …

GMP 2004

RemerciementsC. Mercier, F. Bourasset, S. Cisternino, E. Niel

gmp 2004 j.m.scherrmann inserm u26 et cppk département - université paris 5 inserm institut...

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