génotypage rhésus d fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > j.m. costa...

Génotypage rhésus D fœtal à Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : partir du sang maternel :

apports et limitesapports et limites

> J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA

Paris le 7 novembre 2008

Génotypage rhésus D fœtal Génotypage rhésus D fœtal

Conflits d’intérêts déclarés JM Costa

• Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié

• Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun

• Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®RhD): aucun

Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel

L’ADN fœtal sérique ou plasmatique

(ADN fœtal libre circulant)

Cellules fœtales circulantes

Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel

ADN fœtal libre: difficultés et limites d’analyse

• Ne représente que 3 à 6% de l’ADN

plasmatique

• Analyse restreinte aux séquences

« paternelles »

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD

Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif

Phénotype RhD-positif 85%

Phénotype RhD-négatif 15%

+

+

del

+

del

del 43%

42%

Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe

Génome paternel RhD-positif

Sang maternel

Fœtus RhD-négatif

Génome maternel+

Génome foetal Fœtus RhD-positif

Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD

Génome maternel+

Génome foetal

Ex5 Ex7 Ex10

Les bases moléculaires du système rhésus

Allèle RHD+

Allèle RHD Neg « classique »

Allèle RHD- « RHD»

Allèle RHD- « RHD-CE-Ds»

- + +

- - +

- - -

+ + +

Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe

Ex5 Ex7 Ex10

<1%

<1%

18%99%

Afrique noireCaucase

15%

67%

3-5% 15-17%Fréquence du phénotype RhD-négatif:

Sensibilité + ++ +++


Sang maternel

Les limites

Principe du génotypage Principe du génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang fœtal à partir du sang maternelmaternel

Génome maternel+

Génome foetal Fœtus FAUX-Positif

Ex5 Ex7 Ex10

Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternelmaternel


Sang maternel

Fœtus ?« Unconclusive result »

Les limites

Génome maternel

+Génome foetal

Ex5 Ex7 Ex10

Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal à partir du sang maternel fœtal à partir du sang maternel

Les limites: aucun test ne sera jamais parfait

• Les « unconclusive results »

variants du gène RHD chez la mère

• Les faux-positifs

variants du gène RHD chez le foetus

Procédure de laboratoire (contaminations)

Vanishing twin

• Les faux-négatifs

Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité)

variants du gène RHD

Allo-immunisation 13%

Injection inutile anti-DRisque infectieux 0 (?)


Expériences récentes en Europe

Sanquin IBGRL Pasteur-Cerba CNRHP

NL GB FR FR

Plasma 3ème Plasma 3ème Sérum 1ère Plasma 2ème

Patientes (n=) 2415 1869 2794 893

Terme (SA) 28 28 10-36 7-32

Fœtus RHD négatif 915 (38.4%) 670 (35.9%) 894 (31,9%) 193 (21,6%)

Faux-négatifs 7 (0,26%) 3 (0,16%) 0 (en cours) 4 (0,4%)

Faux-positifs 5 (0,20%) 14 (0,75%) >3 (0,10%) 5 (0,54%)

Unconclusive 2.1% 3.0% 3.3% 5.4%

Pourquoi faut-il proposer le génotypage Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHDRHD fœtal ? fœtal ?

Recommandation du CNOGF 2005

Intérêts

• Cà marche !

• Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang

• Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités)

• Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902)

Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter:

– 278 femmes en l’absence de génotypage

– 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif


Frein à sa généralisation

• Déficit d’information des patientes et des professionnels

• Laboratoires

– Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH

Praticiens agréés par l’Agence de la Biomédecine

• Coût du test

– Remboursement (B700: 189€ par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier2008 (décision CNAM unilatérale)

– Sanquin-NL (149€), Pasteur-Cerba-FR (150€), IGBRL-UK (279€)

– Haute Autorité de Santé saisie début 2008

– Intérêt économique incertain

Intérêt économique du génotypage Intérêt économique du génotypage RHDRHD foetal foetal systématique?systématique?

Etude pilote:

A.Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa

Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris

Suivi de 101 patientes RhD négatives (Caucase.93, Afr.Nord7, Antilles 1)– Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre:

terme moyen 13SA– Pas de prophylaxie systématique à 28SA– Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers

Résultats– Génotypage RHD fœtal

– 2 résultats « unconclusive » (Caucase1,Antilles1)– 75 patientes à risque (fœtus RHD-positif)– 24 patientes avec fœtus RHD-négatif (25%)

– Prophylaxie ciblée: 23 patientes– 12 amniocentèses– 11 saignements et traumatismes

NNé RhD-Positif

Couple à risque

Patiente RhD-négative non immunisée

Conjoint RhD-positif

NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:

Détermination du groupe rhésus

Recherche d’agglutinines irrégulières

Accouchement

Détermination du groupe rhésus NNé

De 12SA à accouchement

• Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer

• RAI: 6ème, 8ème mois

Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

2 Prévention ciblée+systématique

NNé RhD-Positif

Couple à risque



NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:



Accouchement





Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

1Prévention ciblée

27-29SA

Anti-D 300µg: prévention systématique

Conjoint (à documenter)


Coût moyen par patiente:

331€ (+36.8%)


242€

Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématiquesystématique

NNé RhD-Positif

Couple à risque



NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:



Accouchement





Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

27-29SA


Génotypage RHD foetal

X

Test commercial

RHD en duplicate 104€




331€ (+36.8%)


242€

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?


331€ si génotypage 22€/test


599€ si génotypage 279€/testA titre de repère

Test de Kleihauer 19€

PCR Chlamydia UR 27€

PCR Toxo LAMN 169€

Quelle stratégie?Quelle stratégie?

NNé RhD-Positif

Couple à risque



NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:



Accouchement





Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

27-29SA



XCoût moyen par patiente:







331€ (+36.8%)


242€

X






NNé RhD-Positif

Couple à risque



NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:



Accouchement





Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

27-29SA


XX


X




331€ (+36.8%)


242€









NNé RhD-Positif

Couple à risque



NNé RhD-négatif

Premier trimestre

Patiente:



Accouchement





Anti-D 200µg

Test de Kleihauer

27-29SA


XX


X




331€ (+36.8%)


242€













33%

50%

25%

Taux de Fœtus RHD Neg






Peut-on réduire la demande de génotypage?Peut-on réduire la demande de génotypage?

Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B75:25€)

+ + +

del

Fœtus RhD-positif 50%

Fœtus RhD-positif 100%


Questions à réponses variables

• ADN fœtal sérique ou plasmatique?

• Quel délai pour l’acheminement de l’échantillon au laboratoire?

• Quel test proposé:1ère, 2ème ou 3ème génération?

• Doit-on contrôler les résultats négatifs?

• Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse?

• A quel terme?

• A quelle patiente doit-on proposer le test?

– Patientes allo-immunisées

– Patientes devant avoir un geste invasif

– Toutes les patientes RhD négatives

Test de Kleihauer: contrôle de qualitéTest de Kleihauer: contrôle de qualité

Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001

échantillon C: 50 hématies fœtales/ 10.000

0

1

2

3

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Nbre d’injections anti-D

2 3 4 51

génotypage rhésus d fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > j.m. costa...

Documents