faculté : sciences de la nature et de lavie département de ... · 3.1.1 formes monogénique de...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN 1 AHMED BENBELLA

Faculté : SCIENCES DE LA NATURE ET DE LAVIE Département de

BIOTECHNOLOGIE

Thèse en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat

Option : BIOLOGIE MOLECULAIRE

Présentée par:

Melle

ASMA AMRANI

Thème

ETUDE D’ASSOCIATION ENTRE CERTAINS POLYMORPHISMES

GENETIQUES DU SYSTEME RENINE ANGIOTENSINE ALDOSTERONE ET

L’HYPERTENSION ARTERIELLE AU SEIN D’UN ECHANTILLON DE LA

POPULATION ORANAISE

Soutenue le …………………………………………..

Devant le jury composé de :

Président :

Examinateurs :

SIDAHMED CHAWKI LAMARA

KEBIR BOUCHERIT

KAMEL GADDOUR

Professeur

Professeur

Professeur

Université d’Oran

Université de TLEMCEN

Université de Monastir, Tunisie

FAOUZIA ZEMANI FODIL MCA Université des Sciences Technologiques d’Oran

Encadreur :

Co-encadreur :

MOHAMED BEY BABAHAMED

FARIDA MESLI TALEB BENDIAB

Professeur

Professeur



Année Universitaire : 2014/2015

Remerciements Je tiens à exprimer mes vifs remerciements aux membres du jury, qui ont accepté d’évaluer

mon travail de thèse :

A Monsieur Lamara Sidahmed Chawki, Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia, d’avoir

accepté de présider le jury de cette thèse.

A Mme Zemani-Fodil Fouzia, Maitre de conférences à l’USTO, que je remercie très vivement

d’avoir accepté de participer à ce jury et de juger ce travail.

A Monsieur Boucherit Kebir, Professeur à l’université de Tlemcen, que je remercie vivement

d’avoir pris part à ce jury malgré ses lourdes responsabilités administratives.

A Monsieur Gaddour Kamel, Professeur à l’université de Monastir en Tunisie, qui accepté de

m’honorer en examinant cette thèse.

A Monsieur Baba Hamed bey Mohamed, Professeur à l’université d’Oran, d’avoir été mon

directeur de thèse. Merci de m’avoir donné l’occasion de réaliser cette thèse qui m’était si

chère. Je le lui suis reconnaissante pour ses précieux conseils de tous ordres, sa disponibilité

et sa confiance et surtout son extrême gentillesse. Que cette thèse soit un témoignage de mon

estime et me permettra de le lui exprimer ma profonde gratitude.

A Mme Mesli-Taleb bendieb Farida, Professeur à l’université d’Oran, d’avoir accepté de co-

encadrer ce travail malgré sa lourde tache administrative de chef de département. Je la

remercie énormément pour son assistance ainsi que pour ses précieux conseils et son extrême

sympathie. Ses encouragements et sa confiance en moi resteront gravés dans ma mémoire.

Qu’elle trouve ici ma sincère reconnaissance.

A Monsieur Xavier Jeunemaitre, Professeur à l’université de Paris Descartes et Chef de

service de génétique des maladies artérielle à l’hôpital Pitié-Salpêtrière, un éminent chercheur

à l’INSERM de renommée mondiale dans la génétique des maladies artérielle. Je le remercie

vivement pour tous ses précieux conseils tout au long de ses années et d’avoir accepté de

m’accueillir dans son laboratoire en France.

A Mme Bouatia-Naji Nabila, un éminent chercheur à l’INSERM à Paris, très dévouée pour la

recherche, membre de grands projets sur les études pangénomiques Je la remercie vivement

pour son extrême gentillesse et d’avoir mobiliser toute une équipe pour mon travail dont Mme

Cyrielle et Mer Romuald Kiando que je remercie énormément pour leur serviabilité.

Je remercie également toute ma famille pour leur patience et soutien durant ces cinq dures

années pleines d’embuches et de sacrifices.

Ce travail a fait l'objet des communications et des publications suivantes :

COMMUNICATIONS

Amrani A, BabaHamed M.B, Lamara S .C, Mesli Taleb bendieb F. « Contribution à une étude

sur la prévalence de l’Hypertension artérielle dans un échantillon de la population

Oranaise » : Journées internationales de l’Hypertension Artérielle, Paris 16-17 Décembre

2011.

Amrani A, Baba Hamed M.B, Lamara S .C, Mesli Taleb bendieb F. « The prevalence of

Arterial Hypertension in Algerian Population : Inherited Aspect » : Journées Européennes de

l’Hypertension Artérielle : Londres ,29-30 Avril 2012.

PUBLICATIONS

Asma Amrani, Mohamed bey baba hamed, Farida mesli. The prevalence of arterial

hypertension in sample of Algeria population inherited aspect. Annals of clinical and

laboratory research. 2014.Vol. 1 No. 1:2. DOI: 10.3823/1401

Asma Amrani, Mohamed bey Babahamed, Farida Mesli. The relationship between T174M

polymorphism and essential hypertension in sample of Algerian hypertension: case control

study” J.Med.Sci.2014.DOI: jms.2014.168.173

Asma Amrani, Farida Mesli, Mohamed bey Babahamed. Genetics of hypertension: the lack of

evidence. Annals of clinical and laboratory research .2013.Vol. 1 No. 1:3 DOI: 10.3823/1402.

Asma Amrani, Mohamed bey Babahamed, Farida Mesli. Association study between some

Renin-Angiotensin System gene variants and essential hypertension in a sample of Algerian

population: Case control study. Annals de biologie clinique, 2014.In press

Table des matières INDEX DES FIGURES

INDEX DES TABLEAUX

LISTE DES ABREVAIATIONS

INTRODUCTION………………………………………………………………………….…1

1 Pression artérielle 4

1.1 Définition 4

1.2 Régulation de la pression artérielle 4

1.2.1 Régulation neuronale de la pression artérielle 4

1.2.2 Régulation hormonale de la pression artérielle : Le système rénine 6

angiotensine aldostérone circulant (SRAA)

1.2.3 Les systèmes rénine angiotensine aldostérone tissulaires 22

1.2.4 Angiotensine II, aldostérone et retentissement cardiovasculaire 25

1.2.5 Endothélines 29

1.2.6 Monoxyde d'azote (NO) 31

1.3 Dysfonction endothéliale 36

2 L’Hypertension artérielle 37

2.1 Définition 37

2.2 Les différents types de l’HTA 37

2.3 Epidémiologie et prévalence de l’HTA 38

2.4 Facteurs de risque de l’hypertension artérielle 39

2.4.1 Age 39

2.4.2 Sexe 39

2.4.3 Origine ethnique 40

2.4.4 Géographie 40

2.4.5 Mesures anthropométriques 41

2.4.6 Effet sur la pression artérielle d'un régime alimentaire riche en sodium et 41

pauvre en potassium et en calcium

2.4.7 Consommation d’alcool 42

2.4.8 Consommation du tabac 43

2.4.9 Antécédents familiaux 43

2.5 Hypertension et dysfonction endothéliale 44

2.6 Hypertension et stress oxydant 44

3 Héritabilité génétique de l’hypertension artérielle 45

3.1 Les formes mono et polygéniques de l’hypertension arterielle et approches 45

employées pour les révélées

3.1.1 Formes monogénique de l’HTA 45

3.1.2 Formes polygéniques de l’HTA 47

3.1.3 Approche gène candidat 48

3.1.4 Approche pangénomique 49

3.2 La part d’ombre de l’héritabilité génétique de l’hypertension artérielle 55

3.2.1 Variants génétiques rares 55

3.2.2 Variabilité du nombre de copies d'un gène 55

3.2.3 Interactions gène-environnement 56

3.2.4 Interactions gène-gène (épistasie) 57

3.3 Epigénétique 57

3.3.1 Modèle théorique de l’épigénome cardiovasculaire 59

3.3.2 Méthylation d’ADN et maladies cardiovasculaires 59

3.3.2.1 Méthylation d’ADN et HTA 59

3.3.2.2 Méthylation d’ADN et transcriptome 60

4 Structure des gènes étudiés 61

4.1 Le gène de la rénine REN 61

4.2 Gène de l’angiotensinogène (AGT) 62

4.3 Gène de l’enzyme de conversion de l’angiotensine I (ACE) 62

4.4 Structure du gène de la eNOS 62

CHAPITRE II MATERIELS ET METHODES

I Population à l’étude 64

I.1 Description de la population étudiée 64

II Méthodes 64

II.1 Analyse des polymorphismes génétiques d’intérêts 64

II.1.1 Extraction d’ADN 64

II.1.2 Etude quantitative et qualitative de l’ADN 65

II.1.3 Génotypage de la population étudiée 66

II.1.3.1 Détection du polymorphisme T174M par PCR-RFLP 67

II.1.3.2 Détection du polymorphisme M235T par PCR-RFLP 68

II.1.3.3 Détection du polymorphisme ACE I/D par Nested PCR 69

II.1.3.4 Détection du polymorphisme NOS -786T/C par PCR/RFLP 70

II.1.4 Lecture des génotypes et exploitation des résultats épidémio-génétiques 70

CHAPITRE III RESULTATS

I RESULTATS 72

I.1 Caractéristiques socio-démographiques et cliniques de la population étudiée 72

(T174M)

I.1.1 Etude de la corrélation entre les différents paramètres cliniques de la 72

population étudiée (T174M)

I.1.1.1 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et l’IMC 72

I.1.1.2 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et les 75

antécédents familiaux d’HTA (T174M)

I.1.2 Comparaison des fréquences génotypiques entre cas et témoins (T174M) 75

I.1.2.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du 79

polymorphisme T174M

I.1.2.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA 79

(T174M)

I.1.2.3 Corrélation entre les différents génotypes et les paramètres cliniques étudiés 79

(T174M)

I.2 Caractéristiques socio-démographiques et cliniques de la population étudiée 81

(M235T/ACEI/D)

I.2.1 Etude de la corrélation entre les différents paramètres cliniques de 81

l’échantillon étudié (M235T/ACEI/D)

I.2.1.1 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et l’IMC 81

(M235T/ACEI/D)

I.2.1.2 Corrélation entre les pressions artérielles systolique et diastolique et les 84

antécédents familiaux d’HTA (M235T/ACEI/D)

I.2.2 Comparaison des fréquences génotypiques entre cas et témoins (I/D ACE et 84

M235T). I.2.2.1 Le polymorphisme I/D du gène d’ACE 84

I.2.2.1.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du 88

polymorphisme ACE I/D

I.2.2.1.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA 88

(ACEI/D)

I.2.2.1.3 Corrélation entre les différents génotypes et les paramètres cliniques 88

étudiés (ACE I/D)

I.2.3 Le polymorphisme M235T du gène de l’angiotensinogène 90

I.2.3.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du 90

polymorphisme M235T de l’AGT

I.2.3.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA 93

(M235T)

I.2.3.3 Corrélation entre les génotypes et les paramètres cliniques étudiés (M235T) 93

I.3 Etude de l'impact du polymorphisme –786T/C du gène de la eNOS sur le 95

risque d'HTA

CHAPITRE IV DISCUSSION GENERALE

II Discussion générale 97

II.1 Polymorphisme T174M du gène d’AGT 97

II.2 Polymorphisme M235T du gène d’AGT et l’ACE I/D du gène de l’ACE 100

II.3 Polymorphisme –786T/C du gène de la eNOS 103

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……………… ………………..106

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………………………………108

ANNEXES………………………………………………………………………………..…128

Résumé

L’Algérie traverse, depuis quelques années déjà, une phase de transition épidémiologique, qui est

accompagnée d’une augmentation de l’incidence des maladies cardiovasculaires. En effet, 35% de la

population algérienne est hypertendue. L’hypertension artérielle (HTA) est une pathologie complexe,

multifactorielle, dont le déterminisme est associé à des facteurs environnementaux et génétiques. C’est

dans ce contexte que cette étude a été menée dont l’objectif était d’identifier certains déterminants

génétiques majeurs de l’hypertension artérielle dans un échantillon de la population oranaise. En

retenant, la stratégie dite des gènes candidat. En particulier, des polymorphismes des gènes codant des

protéines du système rénine-angiotensine (SRA) dont le gène de l’angiotensinogène (AGT) avec ses

deux variants : le T174M et le M235T, le polymorphisme du gène de l’enzyme de conversion de

l’angiotensine II (ACE) ainsi que le polymorphisme du gène de la eNOS (-786T/C). Les résultats

obtenus nous ont permis d’associer les polymorphismes ACE I/D de l’enzyme de conversion et le

polymorphisme NOS -786T/C du gène de eNOS avec le risque d’hypertension artérielle (NOS -

786T/C : OR= 0.62 ; 95% CI (0.4-0.95) ; ACE I/D : OR=0.456 ; 95%CI (0.275-0.755)). En revanche,

aucune association n’a été révélée entre le M235T, T174M et l’HTA. Il ressort de cette étude, que

parmi les 4 polymorphismes génétiques étudiés, le NOS -786T/C et l’ACE I/D s’avèrent être des

marqueurs de risque de l’HTA dans cet échantillon alors que le M235T et T174M ne le sont pas.

Mots clés : HTA, polymorphismes génétiques, SRAA, M235T, T174M, ACE I/D, NOS -786C/T,

population oranaise.

Abstract

Since the last years, Algeria has passed through an epidemiological transition characterized with a

high prevalence of the cardiovascular disease. In fact, 35% of the Algerian population is hypertensive.

Essential hypertension is a multifactorial complex trait, with genetic and environmental determinism.

The aim of the present study was to study the possible association between some RAAS and NOS

polymorphisms and essential hypertension in a sample of the Algerian population. Thus, a candidate

gene approach was used, where we studied two variants of the angiotensinogen gene: T174M and

M235T polymorphisms besides angiotensin-converting enzyme (ACE) polymorphism and finally

NOS -786 T/C polymorphism. Our results showed that ACE I/D variant of the converting enzyme

gene and the NOS -786 T/C of the eNOS gene are associated with essential hypertension (NOS -786

T/C; OR= 0.62 ; 95% CI (0.4-0.95and OR=0.456 ; 95%CI (0.275-0.755) for ACE I/D)). While, there

was no association of the M235T and T174M with hypertension. Through the 4th

studied

polymorphisms; NOS-786T/C and ACE I/D seem to be genetic markers of the essential hypertension

in this sample while the M235 and T174M are not.

Keys words: HTN, Genetic polymorphisms, M235T, T174M, ACE I/D, NOS -786T/C, Algerian

population.

INDEX DES FIGURES Figure 1 : Régulation neuronale de la pression artérielle (Chauvet et al.,

2012)…………….…………………………………………………………………………. 5

Figure2: Système Rénine Angiotensine Aldostérone…………………………...……………7

Figure 3 : Dégradation de l’angiotensine II et synthèse des angiotensines III, IV et (1-

7)…………………………………………………………………………………………….. 13

Figure 4: Actions de l’Ang II responsables d’une augmentation de la pression

artérielle……………………………………………………………………………………. .. 15

Figure 5 : Signalisation intracellulaire par l’angiotensine II sur ses récepteurs de type 1

(AT1) et des effets engendrés. ……………………………………………………...…..17

Figure 6 : Principales localisations de formes tissulaires des systèmes rénine-

angiotensine…………………………………………………………………………………..22

Figure 7. Synthèse des mécanismes pouvant expliquer comment un dérèglement des actions

de l’aldostérone peut contribuer au développement de pathologies cardiovasculaires……. .... 27

Figure 8 : Effets de l’angiotensine II (Ang II) sur la dégradation du monoxyde d’azote (NO),

via l’action de la NADH/NADPH oxydase, et l’augmentation du stress oxydatif…………......…….28

Figure 9 : Le système de l’endothéline, production, fonction et intéraction avec ses récépteurs

au niveau de la paroi vasculaire……………………………………………………………. ... 30

Figure 10: Métabolisme de la L-arginine…………………………………………….………32

Figure 11: La dysfonction endothéliale…………………………………………..………….36

Figure 12: Répertoire des signaux d’association révélés par les études pangénomiques

publiées jusqu’au jour……………………………………………………………….………...50

Figure 13: Vingt-neuf single nucleotide polymorphisms dans 28 loci associés (P≤ 5x10-8

)

avec la pression artérielle………………………………………………………….………….53

Figure 14 : La corrélation entre la PAS et l’IMC chez les hypertendus (T174M)……….….74

Figure 15 : La corrélation entre la PAS et l’IMC chez les témoins (T174M)…………… …74

Figure 16 : La corrélation entre la PAD et l’IMC chez les hypertendus (T174M)…………..74

Figure 17 : La corrélation entre la PAD et l’IMC chez les témoins (T174M)………… ……74

Figure 18 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les hypertendus (T174M) .77

Figure 19 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les témoins (T174M)…...77

Figure 20 : Profile électro phorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique par Nco I (T174M)…………………………………………………………. .. 78

Figure 21 : La corrélation entre la PAS et l’IMC chez les hypertendus (M235T/ACEI/D... 83

Figure 22 : La corrélation entre la PAS et l’IMC chez les témoins (M235T/ACEI/D)… …..83

Figure 23 : La corrélation entre la PAD et l’IMC chez les témoins (M235T/ACEI/D)……. 83

Figure 24 : La corrélation entre la PAD et l’IMC chez les hypertendus (M235T/ACEI/D)..83

Figure 25 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les hypertendus

(M235T/ACEI/D)……………………………………………………………………………86

Figure 26 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les témoins

(M235T/ACEI/D) ……………………………………………………………………………86

Figure 27 : Profile électro phorétique sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification de

l’ACE I/D…………………………………………………………………………………….87

Figure 28 : profile électro phorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique de M235T par Tth111I……………………………………………………………….92

Figure 29: Profile électro phorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique du NOS-786C/T par MspI………………………………………………...…96

INDEX DES TABLEAUX Tableau I: Classification des niveaux de PA selon l’OMS (1999)………………………………. 37

Tableau II : Formes monogéniques d’hyper ou d’hypotension artérielle……………………….. 46

Tableau III : Quelques gènes candidats (probablement) impliqués dans la régulation de la

pression artérielle…………………………………………………………………………………. 47

Tableau IV: Méta-analyse des dix meilleurs single nucleotide polymorphisms associés avec

la pression et l'hypertension artérielles dans 2 consortiums CHARGE et Global

Bpgen…………………………………………………………………………………………………………. 52

Tableau V: Les caractéristiques générales de la population étudiée (T174M)…………………. 73

Tableau VI : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle systolique et l’index de

masse corporel (T174M)…………………………………………………………………………. 73

Tableau VII: Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle diastolique et l’index

de masse corporel (T174M) )………………………………………………………………………. 73

Tableau VIII : Corrélation entre la PAS et les antécédents familiaux d’HTA (T174M)…………. 76

Tableau IX: Corrélation entre la PAD et les antécédents familiaux d’HTA(T174M) )…………... 76

Tableau X: La distribution du polymorphisme T174M chez les cas et les témoins………………. 76

Tableau XI : Distribution des génotypes selon le sexe chez les hypertendus et les témoins

(T174M) ................................................................................................................................................. 78

Tableau XII : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (T174M)………………….. 78

Tableau XIII: Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (T174M)…………………... 78

Tableau XIV Les caractéristiques de l’échantillon étudié (M235T/ACEI/D)…………………….. 82

Tableau XV: Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle systolique et l’index de

masse corporel (M235T/ACEI/D) ……………………………………………………………… 82

Tableau XVI : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle diastolique et l’index 82

de masse corporel (M235T/ACEI/D)………………………………………………………………

Tableau XVII : Corrélation entre la PAS et les antécédents familiaux d’HTA (M235T/ACEI/D) 85

Tableau XVIII : Corrélation entre la PAD et les antécédents familiaux d’HTA (M235T/ACEI/D 85

Tableau XIX: Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme ACE I/D entre cas

et témoin…………………………………………………………………………………………… 85

Tableau XX: Distribution allélique du polymorphisme ACE I/D chez les hommes et les

femmes…………………………………………………………………………………………….. 89

Tableau XXI : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (ACEI/D)………………

89

Tableau XXII : Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (ACE I/D)………………. 89

Tableau XXIII: Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme M235T de

l’AGT entre cas et témoins……………………………………………………………………….. 91

Tableau XXIV: Distribution alléliques du polymorphisme M235T chez les hommes et les

femmes……………………………………………………………………………………………. 91

Tableau XXV : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (M235T)………………. 94 Tableau XXVI : Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (M235T) ……………….. 94

Tableau XXVII: Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme–786T/C du gène

de la eNOS entre cas et témoins 95

Tableau XXVIII : Les études impliquées dans la méta analyse sur le polymorphisme T174M de 99

l’AGT………………………………………………… …………………………………………..

Tableau XXIX : La fréquence du polymorphisme ACE I/D dans différentes populations 105

LISTE DES ABREVIATIONS

ACE Angiotensin Converting Enzyme

ACTH hormone adrénocorticotrope

ADC Arginine DéCarboxylase

ADMA Asymetric DiMethyl Arginine

ADP Adenosine DiPhosphate

AGT Angiotensinogène

Amp Aminopeptidases

AMPc Adénosine Monophosphate Cyclique

AMPK AMP–Activated Protein Kinase

Ang I Angiotensine I

Ang II Angiotensine II

AOMI artériopathies oblitérantes des membres inférieurs

AP-1 Activator protein-1

ApoB Apolipoprotéine B

ApoE Apolipoprotéine E

ARAs antagonistes des récepteurs de l’angiotensine II

ARG1 ARGinase de type 1

ARG2 ARGinase de type 2

ASL ArginoSuccinate Lyase

ASO Allele Specific Oligonucleotide

ASS ArginoSuccinate Synthase

AT1R Type-1 Angiotensin 2 Receptor

AT2R Type-2 Angiotensin 2 Receptor

AT4R Angiotensine IV Receptor’

AVC Accident Vasculaire Cérébral

BH4 tétrahydrobioptérine

CAGE chymostatin-sensitive angiotensine II-generating enzyme

CAT-1 Cationic Amino-acid Transporter-1

Cbp Carboxypeptidases

CPS 1 Carbamoyl-Phosphate Synthase 1

DAG diacylglycérol.

D-Amp Dipeptidulaminopeptidase I-III

EC 2 Enzyme de conversion 2

EC Enzyme de conversion

ECE Endothelin Converting Enzyme

EDHF Endothelium-derived hyperpolarizing factor

EDRF Endothelial-Derived Relaxing Factor

ENaC Canaux sodium amiloride-sensibles

eNOS NO Synthase endothéliale

EPN Endopeptidase neutre

ERE Elément de réponse aux estrogènes

ERO Espèces Réactives de l’Oxygène

ET Endothéline

ET-1 Endothéline-1

ET-2 Endothéline-2

ET-3endothéline-3

GMPc Guanosine monophosphate cyclique

HDL High Density Lipoproteins

HTA HyperTension Artérielle

HVG hypertrophie ventriculaire gauche ICAM-

1 InterCellular Adhesion Molecule-1 IDM

Infarctus Du Myocarde

IEC Inhibiteur de l’Enzyme de Conversion

IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1

IL InterLeukine

IMC Indice de la Masse Corporelle

iNOS NO-Synthase inductible

IRAP Insulin Regulated Aminopeptidase

KO Knock-Out

LDL Low Density Lipoprotein

LFA-1 Leucocyte Function Antigens-1

MAP mitogen activated protein

MAPK Mitogen Activated Protein Kinase

MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1

MCSF Macrophage-Colony Stimulating Factor

MCV Maladies CardioVasculaires

MEC Matrice ExtraCellulaire

MEK MAPK Kinase

MMP-1 métalloprotéinase 1

MONICA Multinational mONItoring of trends and determinants of CArdiovascular diseases

MTA MethylThioAdenosine

NFκB Nuclear Factor kappa B

nNOS NO Synthase neuronale

NO monoxyde d’azote

O2-. anion superoxyde

OAT Ornithine AmidinoTransférase

OAZ1 Ornithine décarboxylase AntiZyme 1

ODC Ornithine DéCarboxylase

OMS Organisation Mondiale de la Santé

ONOO-. peroxynitrite

OR Odds-Ratio

OTC Ornithine TransCarbamylase

PA Pression artérielle

PAD Pression Artérielle Diastolique

PAI-1 Plasminogene activator inhibitior type 1

PAO PolyAmine Oxydase

PAS Pression Artérielle Systolique

PCR Polymerase Chain Reaction

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PEP Prolylendopeptidase.

PGI2 prostacycline

PKC protéine kinase C

PLA2 phospholipase A2

PLC phospholipase C

PLD phospholipase D,

PP Pression Pulsée

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism

SAM S-AdénosylMéthionine

SHR Spontaneously Hypertensive Rat

SNA Système nerveux sympathique

SNP Single Nucleotide Polymorphism

SR Scavenger Receptor

SRAA Système rénine angiotensine aldostérone

SSAT Spermidine/Spermine AcétylTransférase

StAR steroidogenic acute regulatory

STATs Signal transducers and activators of transcription

TGFβ Transforming Growth Factor beta

TIMP-1 tissue inhibitors of metalloproteinases-1

t-PA tissue-Plasminogen Activator

TXA2 ThromboXane A2

VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

INTRODUCTION

INTRODUCTION

1

L’Algérie traverse, depuis quelques années déjà, une phase de transition épidémiologique qui

désigne cette inversion qui voit, dans une population donnée, les maladies chroniques non-

transmissibles se substituer aux maladies infectieuses transmissibles comme cause principale

de morbi-mortalité (Omran, 2001).

Les affections cardio-vasculaires, l'hypertension artérielle, le diabète, les cancers et l'obésité

comptent parmi les maladies non transmissibles les plus prévalentes. En 2030, les maladies

cardiovasculaires (MCV) seront à l’origine de 23,56 millions de décès et représenterons

toujours la principale cause de mortalité au niveau mondial selon les prévisions de

l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). L’Institut National de la Santé Publique

Algérien, en collaboration avec l’Union Européenne, a mené en 2002 une enquête

épidémiologique nommée TAHINA (Transition Health Impact In North Africa). Les résultats

de cette étude montrent que les maladies non-transmissibles représentent la première cause de

mortalité en Algérie, avec un taux de 62.0%. Les maladies périnatales, transmissibles,

maternelles, les traumatismes, et les maladies nutritionnelles représentent respectivement

13.3%, 8.1%, 5.5%, 1.2%, 1.0%. Concernant les affections non transmissibles, les décès de

maladies cardiovasculaires (MCV) occupent le premier rang (46.2 %), suivis des décès par

tumeurs malignes (14.6%), par affections des voies respiratoires (7.2%) et du diabète non

insulino-dépendant (8.2%). Cependant, il est intéressant de noter que, parmi les maladies

cardiovasculaires, les formes les plus étroitement liées à l’hypertension, en particulier les

maladies cérébro-vasculaires et les cardiopathies hypertensives, sont les causes les plus

fréquentes de décès, avec respectivement 7.5% et 6.6% (www.ands.dz/insp/synthese-

mortalite-finalpdf1.pdf).

L’hypertension artérielle (HTA) est une pathologie complexe, multifactorielle, dont le

déterminisme est associé à des facteurs environnementaux et génétiques. Dans 90% à 95% des

cas, la cause exacte de l’HTA n'est pas connue. On parle alors d'HTA « essentielle » ou

primaire (par opposition à l’HTA secondaire). Il est maintenant bien admis que l’héritabilité

de la pression artérielle est pour environ 30 à 60% (Kupper et al., 2006). Grâce aux progrès

considérables de la recherche, les bases génétiques de certaines formes mendéliennes de

l’hypertension ont pu être élucidées (Gong et Hubner, 2006). En revanche, les formes

polygéniques de la maladie sont largement méconnues.

http://www.ands.dz/insp/synthese-

http://www.ands.dz/insp/synthese-

INTRODUCTION

2

Actuellement il existe plus de 100 gènes candidats pour l'HTA essentielle, identifiés grâce aux

études de liaison et/ou d'association chez l'homme ou grâce aux études expérimentales chez

l'animal. En général, il s'agit de gènes impliqués dans la production de métabolites vaso-actifs

et qui sont connus pour leur nature polymorphe. Ainsi, il a été montré que les composants du

système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA), jouent un rôle important dans la régulation

de la pression artérielle, de l’équilibre hydro-sodée de l’organisme (Mac Gregor et al, 1981 ;

Gardes et al, 1989), et modulent la croissance et la réparation des tissus au niveau du cœur,

des reins et des vaisseaux (Wolf et Neilson, 1993 ; De Mello et al., 2000). Pour ces raisons,

les gènes codant les composants de ce système sont d’un intérêt capital dans l’étude des

facteurs de prédisposition à l’HTA, aux MCV et aux affections rénales. Néanmoins, les gènes

du SRAA ne sont pas les seuls à être incriminés dans la régulation de la pression artérielle, il

existe, en effet, d’autres gènes candidats qui y sont impliqués dont les gènes codant pour la

NO synthase, productrice de monoxyde d’azote et connue pour son principal rôle dans

physiopathologie artérielle. Comme pour la plupart des gènes candidats étudiés dans l'HTA,

les études de liaison et/ou d’association qui ont porté sur les gènes du SRAA et de la eNOS en

relation avec l’HTA ont souvent révélé des données assez contradictoires. Certains auteurs ont

rapporté des associations entre ces marqueurs et l’HTA (Caulfield et al., 1994 ; O’Donnel et

al., 1998 ; Bonnardeaux et al.,1994, Nakayama), par contre d'autres n’ont pas trouvé

d’association (Rotimi et al., 1994 ; Jeunemaitre et al., 1992a ; Schmidt et al., 1997). Parmi les

polymorphismes génétiques couramment décrit, on a les polymorphismes du gène de

l’angiotensinogène dont le M235T et T174M, le polymorphisme du gène de l’enzyme de

conversion une (ACE I/D) ainsi que le polymorphisme du gène de la eNOS (-

786C/T).Cependant, aucun gène n’a été définitivement établi chez l’Homme comme

marqueur génétique responsable des variations de la PA, ou comme gène prédisposant à

l’HTA (Soubrier, 1998). Vu que les avis sont controversés, il est important de déterminer le

rôle des différents marqueurs génétiques dans la survenue de l’HTA au sein de chaque

population. De plus, en tenant compte de la diversité génétique des populations, les données

disponibles ne peuvent pas être extrapolées d’une population à une autre.

Cette étude se veut donc être une contribution à la connaissance sur l’implication des

marqueurs génétiques dans la survenue des affections cardiovasculaires, particulièrement de

l’hypertension artérielle en Algérie où 35% de la population algérienne sont des hypertendus

et ce en utilisant l’approche du gène candidat basée sur une étude d’association de type cas-

témoin.

INTRODUCTION

3

Dans la première partie de notre travail, nous ferons une revue de la littérature sur les bases

physiologiques du fonctionnement du SRAA et du système endothélial ainsi que leur rôle

dans la pathologie hypertensive, et les données actuelles concernant son implication dans le

déterminisme génétique de l’HTA, et dans le retentissement cardiovasculaire associé.

Dans la seconde partie de notre travail, nous décrirons les travaux réalisés ainsi que les

résultats obtenus tout au long de ce travail.

Enfin une troisième et dernière partie sera consacrée à une discussion des résultats de nos

travaux.

CHAPITRE I

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE I REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

4

1 Pression artérielle

1.1 Définition

La pression artérielle (PA) est définie comme la force exercée par le sang sur les parois

vasculaires. Elle dépend notamment du débit cardiaque et de la résistance vasculaire. Chez

l’humain, chaque contraction cardiaque envoie 70mL de sang vers les organes via le réseau

artériel. Cette propulsion périodique fait qu’il y ait une pression exercée sur les parois vasculaires

qui est appelée systole, et la diminution de cette dernière après le passage du sang et entre deux

contractions ventriculaires, est appelée diastole (Wang et Oliver, 2010, Lifton et al., 2001).

1.2 Régulation de la pression artérielle

La pression artérielle (PA) est régulée par différentes voies qui contrôlent le volume sanguin, la

résistance vasculaire ainsi que le débit et la fréquence cardiaque. Cette régulation peut être à court

ou à long terme; ce sont, respectivement, les régulations neuronales et hormonales de la PA

(Lifton et al., 2001).

1.2.1 Régulation neuronale de la pression artérielle

La régulation neuronale de la PA est assurée notamment par deux types de récepteurs (figure 1) ;

les barorécepteurs situés au niveau des artères qui sont capables de détecter l’étirement des parois

vasculaires, et les chimiorécepteurs qui détectent des changements des niveaux de CO2, de l’O2 et

du pH dans le sang (Boron, 2005, Campese, 1997, Szczepanska-Sadowska, 2006). Le message de

ces récepteurs est capté par le centre cardiovasculaire du système nerveux autonome (SNA) qui,

en réponse, fait soit abaisser la fréquence cardiaque par une stimulation parasympathique via le

nerf vague, soit l’augmenter par une stimulation sympathique (Sladek et Song, 2008).

La transmission du signal par les voies efférentes se fait par la libération de neurotransmetteurs

tels que l’adrénaline (ou épinéphrine), la noradrénaline (ou norépinephrine), qui vont se lier à des

récepteurs adrénergiques, et l’acétylcholine qui se lie aux récepteurs cholinergiques présents au

niveau des cellules cibles. Il existe deux types de récepteurs adrénergiques : α et β qui sont

subdivisés en sous types α1, α2, β1 et β2 (Boron, 2005, Estanol et al., 2009, Berg et al., 2010).

Lors d’une stimulation sympathique, la fréquence cardiaque est augmentée via les nerfs

accélérateurs du cœur et il y a activation des récepteurs α-adrénergiques par la noradrénaline et

l’adrénaline qui entraînent la vasoconstriction.


5

Plus encore, la stimulation sympathique joue aussi un rôle important sur la réabsorption du

sodium au niveau des reins, alors que la stimulation parasympathique, par l’intermédiaire de

l’acétylcholine, entraîne une diminution de la fréquence cardiaque ainsi qu’une vasodilatation

(Boron, 2005, Zanutto et al., 2010).

Figure 1 : Régulation neuronale de la pression artérielle (Chauvet et al., 2012)


6

1.2.2 Régulation hormonale de la pression artérielle : Le système rénine angiotensine

aldostérone circulant (SRAA)

La première étape dans l’histoire du système rénine-angiotensine (SRA) fut la mise en évidence

en 1898 par Tigerstedt de l’effet presseur d’un extrait aqueux de rein de Lapin (Tigerstedt,

1898). Plus tard, Ruyter et Oberlin, respectivement en 1925 et 1927, décrivent pour la première

fois l’appareil juxtaglomérulaire du rein de mammifère, et notent la présence de grains de

sécrétion dans les cellules myoépithélioïdes des artérioles préglomérulaires. Dans les années 1930

de grandes avancées ont été faites avec les découvertes de Goldblatt et Pickering qui montrèrent

qu’un rein ischémique induisait une hypertension artérielle systémique, et que la substance

responsable de cet effet, était une substance humorale sécrétée par l’appareil juxtaglomérulaire :

la rénine. L’activité enzymatique de cette dernière fut découverte au début des années quarante

par les groupes de Page, et de Nunoz et Braun-Menendez. Les expériences qu’ils menèrent

montraient que le substrat de la rénine, l’angiotensinogène, était présent dans le plasma et que

l’élévation de la pression artérielle observée était due au produit de la réaction rénine + substrat.

D’abord connue sous le nom d’hypertensin, l’angiotensine I (Ang I), fut isolée, puis séquencée

par l’équipe de Skeggs au milieu des années cinquante (Skeggs, 1954). Ils montrèrent que la

séquence de l’Ang I correspondait aux 10 acides aminés N-terminaux de l’angiotensinogène, et

que l’Ang I était inactive mais avait la capacité de se cliver en un peptide plus petit, vasoactif,

l’angiotensine II (Ang II) dont la séquence fut publiée par la même équipe en 1956. Dans les

années qui suivirent le lien fut établi entre l’Ang II et la sécrétion de l’aldostérone, hormone

isolée en 1954 par l‘équipe de Simpson et Tait (Simpson et al., 1954). La régulation de la réponse

pressive à l’Ang II par le niveau initial de rénine et d’angiotensinogène fut mise en évidence

dans la même période, et au début des années 60, grâce aux travaux de Gross et de Genest, la

boucle de régulation hormonale entre la charge sodée, le système rénine-angiotensine et la

sécrétion d’aldostérone était décrite. En effet, le système rénine-angiotensine-aldostérone

(SRAA) joue un rôle majeur dans la régulation de la pression artérielle. Ce système est composé

d’une cascade enzymatique (figure 2) aboutissant à la synthèse de l’angiotensine II.


7

De nombreuses études ont montré qu’il existe, en plus du SRAA plasmatique, un SRAA tissulaire.

Le SRAA tissulaire exerce des fonctions autocrines et paracrines, contrôlant ainsi le tonus

vasculaire, l’hypertrophie, l’hémodynamique rénale et la contractilité cardiaque. La plupart de ces

effets sont imputés au récepteur AT-1 de l’angiotensine II. L’activation du SRAA est responsable

ou associée à de nombreuses pathologies cardiovasculaires.

Figure 2: Système Rénine Angiotensine Aldostérone.

(http://www.memobio.fr/html/bioc/bi_resra.html)

http://www.memobio.fr/html/bioc/bi_resra.html


8

1.2.2.1 La rénine et sa régulation

La rénine appartient à la famille des aspartyl protéases, enzymes qui agissent en présence d’une

molécule d’eau et qui hydrolysent leur substrat, sans le lier de manière covalente. Ces enzymes

sont constituées de 2 domaines délimitant un sillon catalytique hydrophobe au fond duquel sont

localisés les aspartates et le site actif de l’enzyme, ce qui explique la nécessité d’un substrat

également hydrophobe.

La rénine a la particularité d’avoir un pH optimum (5 à 7,5 pour la rénine humaine) beaucoup

plus alcalin que les autres aspartyl protéases qui agissent habituellement dans des conditions de

pH comprises entre 2 et 4. Par ailleurs. la rénine possède un substrat spécifique,

l’angiotensinogène, alors que les autres aspartyl protéases ne présentent pas cette spécificité

d’action (Gould et Green, 1971).

La rénine rénale est synthétisée sous forme de pré-prorénine. Ce segment « pré- » est un

peptide signal qui permet l’ancrage de la molécule dans les structures

membranaires de l’appareil de Golgi où la molécule subit une maturation qui la transforme en

prorénine. Cette forme inactive peut être sécrétée telle quelle ou subir une dernière

maturation dans les granules de sécrétion, qui aboutira à la forme active de la rénine. La

maturation de la prorénine en rénine active est spécifique des cellules myoépithélioïdes, des

artérioles afférentes des glomérules rénaux et in vivo il n’existe pas d’activation périphérique

de prorénine inactive en rénine active (Toffelmire et al., 1989). Le taux de sécrétion de la rénine

par le rein constitue le déterminant majeur de l’activité du système rénine–angiotensine. La

stimulation aiguë de la sécrétion de rénine s’accompagne d’une dégranulation immédiate des

cellules myoépithélioïdes, aboutissant à une décharge de rénine active dans le plasma. C’est la

sécrétion de rénine active qui est régulée, et elle est contrôlée par :

La barosensibilité rénale : Les barorécepteurs rénaux, situés dans l’artériole afférente,

ont pour fonction de contrôler en permanence la perfusion rénale et de déclencher la

sécrétion de la rénine dans le cas d’une baisse de pression artérielle rénale. Les cellules

juxtaglomérulaires joueraient elles aussi un rôle dans la détection des variations de

perfusion rénale, grâce à une possible sensibilité à l’étirement. En dessus d’une valeur

seuil, aux environs de 80 mmHg, les variations de pression de perfusion rénale n’ont peu

ou pas d’effet sur la quantité de rénine sécrétée. Par contre, une fois la valeur seuil

franchie, la sécrétion de la rénine est déclenchée et elle augmente ensuite de manière


9

linéaire proportionnellement à la chute de pression (Reid, 1998).

La macula densa : Il a été montré que l’influence du régime sodé sur la sécrétion de la

rénine passe par la macula densa, qui agit comme un capteur sensible au sel (Skott et

Briggs, 1987). La proximité anatomique de la macula densa et de l’artériole afférente

explique les interactions fonctionnelles entre ces deux composantes de l’appareil

juxtaglomérulaire. La macula densa détecte les variations de concentration de NaCl du

contenu du tubule distal et modifie en conséquence la sécrétion de la rénine dans les

cellules myoépithélioïdes de l’artériole afférente (Schnermann, 1998).

Le système nerveux sympathique : Comme tous les autres composants vasculaires et

tubulaires du rein, les cellules juxtaglomérulaires sont innervées par des neurones post-

ganglionnaires sympathiques. Il a ainsi été montré que la sécrétion de rénine est

étroitement liée au tonus sympathique rénal. Elle augmente lors de la stimulation des nerfs

orthosympathiques rénaux et au contraire diminue quand les reins sont dénervés (DiBona

et Kopp, 1997, Grandjean et al., 1978). Les effets du système nerveux sympathique sur la

sécrétion de rénine sont médiés par des décharges locales de noradrénaline qui, en se

liant à des récepteurs β1-adrénergiques, activent une voie de transduction du signal

via l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Le tonus sympathique peut également

agir indirectement sur la sécrétion de rénine en stimulant les récepteurs α-adrénergiques,

ce qui conduit à une vasoconstriction de l’artériole afférente. Cette vasoconstriction active

les barorécepteurs rénaux et stimule la macula densa aboutissant à une augmentation de la

sécrétion de rénine.

Rétrocontrôle exercé par l’angiotensine II : L’angiotensine II inhibe la sécrétion de

rénine tout d’abord par ses propriétés vasoconstrictrices, en augmentant la pression

artérielle mais elle agit aussi directement sur les cellules de l’appareil juxtaglomérulaire

pour diminuer la sécrétion de rénine. L’angiotensine II exerce donc un rétrocontrôle

négatif sur la sécrétion de rénine (Reid, 1998).

1.2.2.2 Angiotensinogène (AGT)

L’angiotensinogène, est une glycoprotéine appartenant à la famille des inhibiteurs des sérine-

protéases (serpines) qui sont des protéines hépatiques jouant un rôle dans l’inflammation,

comme l’α1-antitrypsine, l’antithrombine III et l’ovalbumine (Doolittle, 1983).

L’angiotensinogène est principalement synthétisé et sécrété dans le foie.


10

Il existe néanmoins d’autres lieux de synthèse d’angiotensinogène comme le cerveau, le rein, le

cœur et la glande surrénale. Cependant, les quantités ainsi produites restent minimes (environ 4 %

de la synthèse hépatique pour le cerveau et 1 à 1,5 % pour les autres tissus).

La protéine mature humaine comporte 452 acides aminés et les 10 premiers acides aminés amino-

terminaux correspondent à l’angiotensine I. La rénine clive son substrat entre l’acide aminé en

position 10 (leucine) et celui en position 11 (leucine ou valine chez l’homme) pour libérer

l’angiotensine I. La molécule protidique résiduelle, des-AI-angiotensinogène, ne semble pas avoir

de fonction propre. Il n’y a pas de processus de stockage de l’angiotensinogène et son taux de

sécrétion est donc principalement régulé au niveau transcriptionnel. Les oestrogènes, les

glucocorticoïdes, les hormones thyroïdiennes et l’angiotensine II augmentent la sécrétion

d’angiotensinogène. Etant une serpine, l’angiotensinogène peut voir son taux de production

augmenter jusqu’à 70 % dans les situations de stress inflammatoire. Cette réponse aiguë est

sans doute médiée par des cytokines d’origine leucocytaire et potentialisée par la présence de

glucocorticoïdes. Si le taux circulant d’angiotensinogène dépend principalement du taux de sa

synthèse hépatique et de sa consommation par la rénine, il faut noter que l’expression du gène de

l’angiotensinogène dans les autres tissus que le foie, peut être stimulé par d’autres facteurs

(Doolittle, 1983).

1.2.2.3 Les angiotensines

L’angiotensine I (Ang I) est le produit de la réaction de la rénine sur son substrat

l’angiotensinogène. Ce peptide, dont la séquence correspond aux 10 acides aminés NH2

terminaux de l’angiotensinogène, est une molécule inactive, qui peut être clivée par différentes

enzymes pour produire des peptides biologiquement actifs, dont l’angiotensine II (Ang II),

considérée comme l’effecteur majeur du SRA sur le système cardiovasculaire (Doolittle, 1983).

1.2.2.3.1 Synthèse de l’angiotensine II

Il existe différentes voies pour la synthèse de l’angiotensine II dont :

a. Voie de l’enzyme de conversion : L’enzyme de conversion (EC) est une dipeptide-

carboxypeptidase très répandue chez les mammifères et très largement distribuée dans

l’organisme puisqu’elle est présente dans presque tous les tissus. Sa fonction principale est

d’hydrolyser les deux derniers acides aminés de l’extrémité carboxy-terminale des peptides.


11

L’activité de cette métallo-enzyme à zinc nécessite la présence d’anions, en particulier le chlore.

On lui connaît plusieurs substrats dont les enképhalines, la substance P, les bradykinines et le

plus important, l’Ang I. Il existe 3 formes d’enzyme de conversion, une membranaire, la plus

répandue, une circulante et une testiculaire. La biosynthèse de l’EC, quelle que soit sa forme, est

sous le contrôle d’un seul gène, composé de 7 exons et 8 introns situé sur le chromosome 17q23

chez l’homme (Mattei, 1989).

b. Autres voies de synthèse : Outre la voie de synthèse classique, mettant en jeu l’enzyme de

conversion, il existe des voies de synthèse de l’Ang II alternatives. Ces voies métaboliques

permettent la production d’Ang II soit à partir de l’Ang I, soit directement à partir de

l’angiotensinogène. Bien qu’il reste sans doute beaucoup à découvrir sur ces productions

parallèles d’Ang II, un certain nombre d’enzymes sont d’ores et déjà connues, il s’agit notamment

de l’α-chymase, de la CAGE (chymostatin-sensitive angiotensine II-generating enzyme) et des

cathepsines G et D. Ces voies de synthèse non-classiques semblent particulièrement

impliquées dans la synthèse d’Ang II dans les SRA locaux (Lavoie et Sigmund, 2003). Ainsi

chez l’homme l’α-chymase jouerait un rôle prépondérant dans la synthèse d’Ang II cardiaque

(Balcells et al., 1997, Urata et al., 1993).

1.2.2.3.1.1 Dégradation de l’Ang II et synthèse des angiotensines III, IV et (1-7)

L’Ang II est rapidement retirée de la circulation, et dégradée par des carboxypeptidases, des

endopeptidases et des aminopeptidases très largement distribuées dans l’organisme. Leur

présence au niveau du rein en fait un lieu privilégié de la dégradation de l’Ang II filtrée.

L’aminopeptidase A joue un rôle crucial dans cette dégradation, elle hydrolyse l’asparagine NH2-

terminale de l’Ang II, ce qui aboutit à la formation d’angiotensine (2-8) ou angiotensine III (Ang

III). Cette molécule peut se lier aux récepteurs de l’Ang II et bien qu’elle ne possède environ que

10 % de son activité biologique, elle reste suffisamment active pour induire une vasoconstriction

ou stimuler la synthèse d’aldostérone. C’est l’aminopeptidase B qui est responsable en grande

partie de la dégradation de l’Ang III en angiotensine (3-8) appelée angiotensine IV (Ang IV)

(figure 3). Cette molécule a tout d’abord été considérée comme un peptide inactif, avant que des

études, en nombre croissant au cours des dernières années, ne mettent en évidence des propriétés

vasoactives, et surtout des effets importants au niveau cérébral, en particulier concernant les

processus mnésiques (Wright and Harding, 2004, Bohlen und, 2003).


12

De manière locale, l’Ang II peut également être le substrat d’une enzyme découverte récemment,

l’enzyme de conversion 2 (EC 2), qui catalyse la production d’un peptide vasoactif, l’Ang (1-7)

(Donoghue et al., 2000, Tipnis et al., 2000).

L’EC 2 est localisée principalement dans les myocytes cardiaques, les cellules endothéliales et

tubulaires rénales ainsi que dans les testicules (Chappell et al., 1998). Cette enzyme utilise

également, dans une moindre mesure, l’Ang I comme substrat pour former un peptide inactif,

l’Ang (1-9), elle- même transformée en Ang (1-7) par l’EC. L’Ang (1-7) peut également être

produite à partir de l’Ang I, sous l’action de propyl-endopeptidases et d’endopeptidases neutres.

En contribuant à la dégradation de l’Ang I, la formation de l’Ang (1-7) tend donc à concurrencer

la biosynthèse de l’Ang II.

Par ailleurs, il semble que les effets physiologiques de ce peptide soient globalement opposés à

ceux de l’Ang II. Il a en effet été montré que l’Ang (1-7) tend à stimuler la synthèse de

monoxyde d’azote (NO) et la sécrétion de prostaglandines ; elle potentialiserait également

l’action des bradykinines, en diminuant leur dégradation par l’EC ( C a r e y a n d S i r a g y,

2003a ) .


13

Figure 3 : Dégradation de l’angiotensine II et synthèse des angiotensines III, IV et (1-7)

1.2.2.3.1.2 Effets physiologiques de l’angiotensine II

Il paraît assez difficile d’identifier clairement tous les effets de l’Ang II, du fait des nombreuses

voies de transduction cellulaires activées par l’Ang II, et de l’existence des deux types de

récepteurs AT1 et AT2, antagonistes. Par ses différentes actions, l’Ang II permet une réponse

intégrée à une baisse de pression artérielle, grâce à son action vasoconstrictrice et à son action

sur le métabolisme hydrosodé. L’Ang II agissant à la fois sur la volémie et les résistances

périphériques, il est souvent dit que « l’Ang II agit sur le contenu et sur le contenant »

(figure 4). Ces effets correspondent à la réponse rapide à l’Ang II. Les principales cibles

d’action de l’Ang II sont les cellules musculaires lisses, le cortex des glandes surrénales

et le rein. Elle joue également un rôle dans l’activation du système nerveux sympathique

et agit directement sur des zones spécifiques situées dans le cerveau (Goodfriend et


14

al., 1996). Un des effets majeurs de l’Ang II est d’induire une rétention d’eau et de sodium en

réponse à une déplétion en sodium ou à une baisse du volume plasmatique. Cette rétention

hydrosodée est stimulée par des actions directes de l’Ang II sur le rein, mais surtout par ses

effets sur la zone glomérulée du cortex surrénalien, où elle stimule la sécrétion

d’aldostérone, hormone qui joue un rôle majeur sur le métabolisme hydrosodé. Elle favorise

aussi la rétention hydrosodée au niveau du rein en agissant à la fois sur les vaisseaux sanguins

et sur différents transporteurs ioniques des tubules rénaux. D’un point de vue hémodynamique,

l’Ang II provoque une constriction de l’artériole efférente qui réduit le flux sanguin rénal et

augmente la pression capillaire glomérulaire, aboutissant à la majoration de la filtration

glomérulaire. La fraction de filtration étant augmentée, la pression oncotique dans les

vaisseaux péritubulaires augmente également, alors que la pression hydrostatique diminue.

Ces modifications de pression dans les vaisseaux péritubulaires favorisent les mouvements

de sodium et d’eau depuis les tubules proximaux vers l’interstitium, puis la circulation générale.

Par ailleurs l’Ang II diminue le flux sanguin médullaire et donc la pression hydrostatique

interstitielle rénale, ce qui réduit l’excrétion de sodium et d’eau (Brewster et Perazella, 2004).

An niveau cellulaire, l’Ang II favorise la réabsorption de sodium en agissant sur la membrane

luminale des cellules du tubule proximal où elle stimule l’activité du transporteur anti-port Na+

/H+

(Garvin, 1991, Liu et Cogan, 1989). La réabsorption sodée est également favorisée par

l’augmentation de l’activité de la pompe Na+

/K+

et du co-transporteur Na+

/HCO3-

sur

la membrane basolatérale des cellules du tubule proximal ( G a r v i n , 1 9 9 1 , W a n g e t

G i e b i s c h , 1 9 9 6 ) . L’angiotensine II agit également sur la pompe Na+

/K+

dans les cellules

de la branche ascendante de Henlé et sur les canaux sodium amiloride-sensibles (ENaC) dans

les tubules collecteurs corticaux (Wang et Giebisch, 1996, Peti-Peterdi et al., 2002).


15

Figure 4: Actions de l’Ang II responsables d’une augmentation de la pression artérielle.


16

1.2.2.3.1.2.1 Actions vasoconstrictrices de l’angiotensine II

La vasoconstriction induite par l’Ang II est rapide médiée par les récepteurs AT1. Elle est

principalement due aux actions directes exercées par l’Ang II circulante sur les vaisseaux, mais

aussi pour une part aux actions pressives centrales de l’Ang II.

L’Ang II agit sur les cellules musculaires lisses des vaisseaux, via l’activation de la PLC, qui agit

sur le réticulum sarcoplasmique et les canaux calciques membranaires pour induire une

augmentation du calcium intracellulaire. La légère alcalinisation du milieu intracellulaire produite

par l’activation des échangeurs Na+

-H+

par la PKC est un élément important de la réponse

vasoconstrictrice des CML vasculaires. Il est possible que les Src kinases jouent aussi un rôle

important dans la réponse contractile des cellules musculaires lisses à l’Ang II, mais cette voie

reste encore pour beaucoup à explorer (Touyz et al, 2000). Au niveau périphérique, l’Ang II

agit aussi comme un neuromodulateur : elle favorise la transmission ganglionnaire

sympathique et au niveau des terminaisons nerveuses, augmente la libération de noradréanaline

tout en diminuant son recaptage. L’Ang II exerce également des actions pressives centrales,

particulièrement en agissant sur l’area postrema et l’organe subfornical. Ces actions centrales sont

modulées par le régime sodé, et notamment augmentées par un régime pauvre en sel.

1.2.2.3.2 Récepteurs des angiotensines

Les travaux de Peach et de Devynk et Meyer ont montré que des tissus-cible tels que la glande

surrénale ou les artères avaient des affinités différentes pour les trois peptides Ang I, Ang II et

Ang III. Les études menées pour connaître la structure de ces récepteurs se sont basées sur la

spécificité de liaison des récepteurs, et ont testé un grand nombre d’agonistes et d’antagonistes

synthétiques. A la fin des années 1980, les travaux menés en parallèle par trois laboratoires

aboutirent à une première nomenclature où les récepteurs sensibles au Losartan (DuP753) étaient

nommés 1, B ou α alors que les récepteurs qui ne présentaient aucune affinité pour cette

molécule étaient nommés 2, A ou β (de Gasparo et al., 2000). Dans un but de simplification

une seule nomenclature fut proposée en 1991(Bumpus et al., 1991) et mise à jour en 1995(de

Gasparo et al., 1995) ne gardant que l’appellation AT1 et AT2 pour les récepteurs à

l’angiotensine II de type 1 et 2, respectivement.


17

Ces récepteurs, aujourd’hui connus pour médier les principaux effets de l’Ang II, appartiennent à

la super famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires, couplés à une protéine G.

1.2.2.3.2.1 Récepteurs AT1

Chez l’homme il n’existe qu’un seul type de récepteur AT1, contrairement aux rongeurs chez qui

il existe des récepteurs AT1a et AT1b. Ces récepteurs AT1 présentent un intérêt tout

particulier et ont été les plus largement étudiés, dans la mesure où il a été montré qu’ils médient la

plus grande partie des effets physiologiques de l’Ang II, principalement sur le système

cardiovasculaire (Matsusaka et Ichikawa, 1997). Les récepteurs AT1 sont présents à la surface

des cellules de nombreux tissus, les principaux étant le rein, le cœur, les vaisseaux, le cerveau.

Les récepteurs AT1 sont couplés à différentes isoformes de protéines G telles que Gq/11,Gi,Gα12

et Gα13, qui ont en commun d’être activées par la liaison du ligand sur le récepteur. Les cascades

de réactions cellulaires déclenchées par la liaison du ligand sont variées et sont notamment

différentes selon l’isoforme de la protéine G à laquelle le récepteur AT1 est couplé. Il existe

sous des formes inactive, intermédiaire ou active, pouvant ainsi rendre compte de sa capacité à

activer plusieurs voies de signalisation (Thomas et Mendelsohn, 2003). Les différents

mécanismes de transduction font intervenir (figure 5) :

Figure 5 : Signalisation intracellulaire par l’angiotensine II sur ses récepteurs de type 1 (AT1) et

des effets engendrés. PLC : phospholipase C, PLD : phospholipase D, PLA2 : phospholipase


18

A2. DAG : diacylglycérol. PKC : protéine kinase C. MAP : mitogen activated protein (Michel,

2004)

La voie de la phospholipase C permettant, entre autres, l’augmentation des flux calciques

intracellulaires, et responsable de la vasoconstriction ;

La voie des tyrosines-kinases, avec activation des voies des MAP-kinases, conduisant à la

transcription de gènes à l’origine de facteurs de croissance;

La voie influençant le statut oxydant de la cellule, directement couplé à la fonction

endothéliale et à la genèse des radicaux libres (Wagenaar et al., 2002).

La plupart des effets de l’angiotensine II sont médiés par le récepteur AT1R :

L’augmentation de la sécrétion d’aldostérone, et donc la rétention sodée et l’effet

antidiurétique, concoure à augmenter la volémie ;

La contraction des vaisseaux sanguins associée à l’hypervolémie aboutit à une

augmentation de la pression artérielle ;

Au niveau des cellules endothéliales et musculaires lisses, les effets directs de

l’angiotensine II se traduisent par l’hypertrophie et la prolifération cellulaire, la formation

de la matrice extracellulaire, le stress oxydant et les réactions inflammatoires. Les effets

trophiques de l’angiotensine II sont initiateurs, au niveau des cellules vasculaires,

cardiaques et rénales, respectivement d’athérogenèse, d’hypertrophie ventriculaire gauche

et de néphropathie, avec une implication possible des SRA intrinsèques ;

Au niveau central, l’angiotensine II, introduite dans des zones cérébrales particulières lors

d’expérimentations animales, provoque une hypertension artérielle par stimulation du

système sympathique et libération de noradrénaline, une augmentation de la sécrétion de

vasopressine et d’hormone adrénocorticotrope (ACTH).

Cette apparente prépondérance fonctionnelle des récepteurs AT1R dans la plupart des effets

actuellement connus de l’angiotensine II pose le problème de la signification physiologique des

récepteurs AT2R.


19

1.2.2.3.2.2 Récepteurs AT2

Cette forme de récepteur à l’Ang II est particulièrement exprimée dans les tissus fœtaux et son

expression décroît assez rapidement après la naissance. Cependant chez l’adulte des

récepteurs AT2 sont encore détectés dans de nombreux tissus tels que le pancréas, le cœur,

les reins, les glandes surrénales, le myomètre, les ovaires, le cerveau et également les vaisseaux

(Nahmias et Strosberg, 1995). Ces récepteurs sont réexprimés dans certaines conditions

pathologiques et notamment lors des processus de remodelage cardiovasculaire (Touyz et

Berry, 2002). Le rôle fonctionnel ainsi que les signaux de transduction cellulaire qui sont

associés à ces récepteurs AT2 restent pour beaucoup à explorer. Il semble cependant qu’en

conditions physiologiques les effets médiés par ces récepteurs, tendent à contrebalancer ceux

médiés par les récepteurs AT1 ( H o r i u c h i e t a l . , 1 9 9 7 , d e G a s p a r o e t a l . ,

1 9 9 5 ) . Parmi ces effets, on peut citer l’inhibition de la croissance cellulaire, l’induction de

l’apoptose et la synthèse de monoxyde d’azote (NO) (Blume et al., 2001).

La production de NO, induite par l’Ang II via les récepteurs AT2, a pour conséquence une

augmentation de la concentration cellulaire de GMPc (guanosine monophosphate cyclique),

second messager dont les principaux effets sont la vasodilatation, la natriurèse et l’inhibition de la

croissance cellulaire. Les récepteurs AT2 pourraient être impliqués dans les processus de

remodelage cardiaque post-infarctus mais leur rôle exact reste encore controversé.

Cependant des résultats récents montrent que ces récepteurs seraient activement impliqués

dans la prévention de l’hypertrophie cardiaque (Collidge et al., 2004, Metcalfe et al., 2004).

1.2.2.3.2.3 Récepteurs aux angiotensines III, IV, et (1-7)

Les actions de l’Ang III semblent principalement médiées par les récepteurs AT1 et AT2, sur

lesquels elle se fixe avec une affinité cependant moindre que l’Ang II. L’existence d’un

récepteur spécifique AT3 a également été suggérée, il n’a cependant pas encore été cloné et

son rôle fonctionnel reste encore à déterminer (de Gasparo et al., 2000). Les récepteurs AT1 et

AT2 n’ont que très peu d’affinité pour l’Ang IV. Des sites de fixation spécifiques pour ce peptide

ont été mis en évidence dans différents tissus, et principalement dans le cerveau. Ce site de

liaison spécifique a été nommé AT4, et récemment identifié par Albiston et coll. comme un

insulin-regulated membrane aminopeptidase (IRAP) (Albi ston et al., 2003, Thomas et


20

Mendelsohn, 2003). La liaison de l’Ang IV sur son récepteur AT4 serait impliquée dans

certains processus mnésiques, cognitifs, ainsi que dans des fonctions motrices et sensorielles

(Bohlen und, 2003). L’Ang IV agirait également au niveau du cœur et du rein, en favorisant

l’hypertrophie cardiaque et l’inhibition de la réabsorption tubulaire de sodium(Carey and Siragy,

2003a). Il semble que l’Ang (1-7) agisse, pour une part, via les récepteurs AT1 et AT2, mais

l’existence d’un site de liaison spécifique est probable, bien que pour l’instant aucun

récepteur n’ait été cloné ( C a r e y e t S i r a g y , 2 0 0 3 b , S a n t o s e t a l . , 2 0 0 0 ) .

Récemment, il a été suggéré que l’Ang (1-7) puisse se lier à un récepteur Mas couplé à une

protéine G, mais les voies de signalisation déclenchées par l’Ang (1-7) restent à clarifier (Pinheiro

et al., 2004, Santos et al., 2000).

1.2.2.4 L’aldostérone

L’aldostérone est un minéralocorticoïde, dérivé du cholestérol, dont la synthèse a longtemps été

considérée comme étant limitée à la zone glomérulée du cortex surrénalien. Les résultats de

nombreuses études menées au cours de la dernière décennie ont apporté des arguments en faveur

d’une synthèse extra-surrénalienne de l’aldostérone, notamment dans le cerveau, le cœur et les

vaisseaux (Funder, 2001). Il semblerait que les processus de régulation et les étapes de

biosynthèse de l’aldostérone soient comparables dans la glande surrénale et dans les tissus

périphériques. Les trois dernières étapes de la synthèse de l’aldostérone sont catalysées par

l’aldostérone synthase, une enzyme qui appartient à la famille des cytochromes P450. Cette

enzyme a la particularité de posséder trois activités enzymatiques : 11β-hydroxylase, 18-

hydroxylase et 18-oxydase qui lui permettent de transformer la déoxycorticostérone en

aldostérone.

1.2.2.4.1 Régulation de sa synthèse et de sa sécrétion

La régulation de la synthèse d’aldostérone dépend principalement du taux d’expression du gène

codant pour l’aldostérone synthase, CYP11B2, situé chez l’homme sur le chromosome 8q24.3

( T a y m a n s e t a l . , 1 9 9 8 ) . Classiquement cette sécrétion est contrôlée par la concentration

plasmatique d’Ang II, et de potassium ( A gu i l e r a , 1 9 9 3 ) . L’hormone adénocorticotrope

(ACTH) joue également un rôle sur la synthèse d’aldostérone, bien que celui-ci soit encore mal

défini.


21

Il est possible de diviser en deux phases, aiguë et chronique. De quelques minutes à quelques

heures après un stimulus, la synthèse d’aldostérone reflète les mouvements du cholestérol qui se

déplace dans les mitochondries pour être métabolisé. Ce processus est en partie médié par les

protéines steroidogenic acute regulatory (StAR). A plus long terme (quelques heures à quelques

jours) la production d’aldostérone est régulée par le niveau d’expression du gène CYP11B2

(Quinn et Williams, 1988).

L’Ang II est connue pour être le principal régulateur de la synthèse d’aldostérone. Cette fonction

majeure de l’Ang II est médiée par les récepteurs AT1, largement présents dans la zone

glomérulée de la glande surrénale, et semble impliquer plusieurs voies de signalisation. La voie la

plus importante et la mieux décrite est celle de la phospholipase C, dont l’activation induit la

libération d’IP3 qui permet de mobiliser les stocks de calcium intracellulaire, qui joue un rôle

majeur dans la stimulation de la synthèse d’aldostérone, via sa protéine de liaison, la calmoduline

(CaM), et les CaM kinases (CaMKs). Parmi les CaMKs connues il semble que celles impliquées

dans la stimulation de la production d’aldostérone soient la CaMK I et/ou la CaMK IV (Condon

et al., 2002). Ces protéines kinases activent des récepteurs nucléaires et d’autres facteurs de

transcription qui se lient ensuite sur des séquences spécifiques du promoteur de CYP11B2 pour en

induire la transcription (Condon et al., 2002, Bassett et al., 2004). La phospholipase C induit aussi

la libération de DAG, qui permet lui-aussi d’augmenter la synthèse d’aldostérone, non pas en

activant l’expression de CYP11B2, mais vraisemblablement en diminuant l’activité de l’enzyme

CYP17, ce qui augmente la biodisponibilité des précurseurs de l’aldostérone. Le fait que des

inhibiteurs des CaM et CaMKs diminuent de manière seulement partielle la production

d’aldostérone induite par l’Ang II a suggéré que cette voie de signalisation intracellulaire,

bien que fondamentale, n’est pas unique (Pezzi et al., 1996).


22

.

1.2.3 Les systèmes rénine angiotensine aldostérone

tissulaires

Le SRA classiquement décrit est le SRA circulant, connu, comme nous venons de le voir, pour sa

fonction de régulation du tonus vasculaire et du volume intravasculaire. Cependant la possibilité

de l’existence de SRA locaux a émergé dès la fin des années 1960 avec la mise en évidence de

rénine dans le cerveau et les glandes surrénales. Par la suite, les effets bénéfiques des inhibiteurs

de l’enzyme de conversion (IEC) et des antagonistes des récepteurs de l’angiotensine II (ARAs)

observés sur le rein, le cœur et les vaisseaux, indépendants, au moins en partie, de leur effet anti-

hypertenseur, a soulevé la possibilité d’une synthèse locale de l’Ang II aux côtés de la forme

circulante. Les SRA locaux attirent de plus en plus l’attention et de nombreux résultats publiés

dans les dix dernières années ont permis de mettre en évidence différents composants du SRA

dans de nombreux tissus (figure 6), notamment le rein, le cœur, les vaisseaux, le cerveau et

plus récemment dans le tissu adipeux (Engeli et al., 2003)

Figure 6 : Principales localisations de formes tissulaires des systèmes rénine-angiotensine.

REN: rénine, AGT: angiotensinogène, ACE: enzyme de conversion, Ang-II :

angiotensine II, AT-1/2 : récepteur à l’angiotensine II de type 1/2.


23

1.2.3.1 SRA rénal

Historiquement, le SRA intrarénal est le premier à avoir été décrit, à la fin des années 70 par

l’équipe de Carey et coll.(Kimbrough et al., 1977, Levens et al., 1981, Levens et al., 1983). Il a

été montré que tous les éléments nécessaires à la synthèse d’Ang II sont présents dans le rein.

L’angiotensinogène synthétisé localement serait ainsi transformé en Ang I et/ou en Ang II,

grâce à l’action de la rénine et des enzymes alternatives. L’EC, présente sur la bordure en

brosse des cellules du tubule proximal, permet la transformation de l’Ang I en Ang II. La large

distribution des récepteurs de l’Ang II, notamment dans les artérioles rénales, les cellules

mésangiales glomérulaires, et le tubule proximal, suggère que l’Ang II joue un rôle paracrine très

important dans la régulation de la fonction rénale (Carey and Siragy, 2003a).

1.2.3.2 SRA cardiaque

Il a été montré que le cœur possède un SRA quasi complet. L’angiotensinogène semble synthétisé

dans l’ensemble du cœur et des résultats expérimentaux ont montré que des cardiomyocytes et

des fibroblastes en culture avaient également la capacité de sécréter cette molécule. L’EC serait

principalement synthétisée dans les fibroblastes et l’endothélium cardiaque (Bader, 2002). Si la

synthèse cardiaque d’Ang II est maintenant avérée, l’existence d’une véritable sécrétion de

rénine dans le cœur reste débattue. Certains considèrent que la rénine est le seul composant

manquant du SRA cardiaque, alors que d’autres ont mis en évidence des ARNm de rénine dans le

coeur, mais en quantités très limitées. Finalement, la rénine sécrétée localement, si elle existe, ne

serait pas la source principale de rénine cardiaque. En effet, des études ont montré que le cœur est

capable de capter la rénine et la pro-rénine circulantes et il a été proposé que la synthèse

cardiaque d’Ang II serait donc rendue possible par l’activation locale de pro-rénine et le captage

de rénine circulante. La synthèse cardiaque d’Ang II est également en partie indépendante des

composants « classiques » du SRA. Il a été mis en évidence dans le cœur une enzyme, l’α-

chymase, qui permet de convertir l’Ang I en Ang II, sans avoir recours à l’EC. Cette enzyme

serait particulièrement active dans les ventricules et serait responsable de 90 % de la conversion

de l’Ang I en Ang II (Balcells et al., 1997, Swynghedauw, 1999). D’autres enzymes, telles que les

cathepsines et la tonine, sont également présentes dans le cœur ; elles permettent de produire de

l’Ang II directement à partir de l’angiotensinogène, mais leur rôle semble néanmoins limité dans

le coeur (Bader, 2002).


24

Les deux types de récepteurs AT1 et AT2 sont présents dans le cœur, où ils interagissent et/ou

opposent leurs effets. Les proportions des deux types de récepteurs peuvent être modifiées,

notamment dans certaines conditions pathologiques (Blume et al., 2001). Ainsi les fibroblastes,

dans lesquels seuls les récepteurs AT1 sont présents, réexpriment des récepteurs AT2 dans

l’insuffisance cardiaque (Ohkubo et al., 1997, Wharton et al., 1998). Au niveau cardiaque, des

récepteurs MR ont également été identifiés, suggérant que le cœur est une cible pour

l’aldostérone (Lombes et al., 1992). Il a aussi été montré que l’équipement enzymatique

nécessaire à la synthèse d’aldostérone était présent dans le cœur, et qu’une synthèse

d’aldostérone cardiaque existait chez le Rat ( F a r d e l l a a n d M i l l e r , 1 9 9 6 ,

F u n d e r e t a l . , 1 9 7 3 , L o m b e s e t a l . , 1 9 9 2 , S i l v e s t r e e t a l . ,

1 9 9 8 ) Des études complémentaires ont apporté des arguments tendant à montrer que la

régulation de la synthèse locale d’aldostérone serait identique à celle observée dans la glande

surrénale ( D e l c a y r e e t a l . , 2 0 0 0 ) . Chez l’Homme des résultats récents montrent qu’il

existe une synthèse d’aldostérone cardiaque dans l’insuffisance cardiaque et l’hypertension

artérielle (HTA) (Mizuno et al., 2001, Yamamoto et al., 2002, Yoshimura et al., 2002).

1.2.3.3 SRAA vasculaire

Alors que de petites quantités d’angiotensinogène sont synthétisées dans la paroi artérielle, il

n’existe pas de quantité détectable d’ARNm de la rénine dans la paroi vasculaire, ce qui

n’est pas en faveur d’une production de rénine à ce niveau. Il est probable que celle-ci soit

prélevée dans la circulation par les cellules endothéliales (Hilgers et al., 2001). L’Ang I, mise

en évidence dans les vaisseaux, serait donc produite à partir de l’angiotensinogène

vasculaire grâce à l’action de la rénine captée dans la circulation, puis transformée en Ang II

grâce à l’EC ou la CAGE, présentes dans les vaisseaux. Cependant ces deux enzymes n’ont pas la

même localisation, ce qui pourrait refléter des différences fonctionnelles. Dans l’endothélium la

synthèse d’Ang II semble être principalement liée à l’EC, alors que la CAGE pourrait être

prédominante dans l’adventice (Okunishi et al., 1987).


25

1.2.3.4 SRA surrénalien

Des cultures de cellules de la zone glomérulée de la glande surrénale ont permis de mettre en

évidence une synthèse locale d’ARNm de rénine et d’angiotensinogène, ainsi que la production

d’Ang II (Mulrow and Franco-Saenz, 1996). La synthèse surrénalienne de rénine est localisée

à 90 % dans la zone glomérulée, et peut être stimulée par des modifications du régime sodé,

indépendamment des fluctuations de la concentration de la rénine circulante (Rubattu et al.,

1994).

1.2.3.5 SRA cérébral

L’Ang II exerce des actions centrales qui peuvent être attribuées à l’Ang II circulante puisque

des récepteurs AT1 et AT2 sont localisés dans des zones où la barrière hémato-encéphalique

(BHE) est interrompue, principalement dans les organes circumventriculaires. Mais des

récepteurs AT1 et AT2 ont également été mis en évidence dans des structures possédant une

BHE intègre. Ces récepteurs sont responsables de la médiation des effets paracrines ou

autocrines de l’Ang II produite localement. De plus, comme mentionné précédemment, l’Ang IV

agit dans le cerveau et serait notamment impliquée dans des processus mnésiques (Wright et

Harding, 2004).

1.2.4 Angiotensine II, aldostérone et retentissement cardiovasculaire

L’Ang II et l’aldostérone, dont les actions premières sont de maintenir une pression de

perfusion adaptée aux besoins des différents organes, possèdent également des propriétés

trophiques, hyperplasiques, pro-fibrosantes et pro-inflammatoires. Ces propriétés sont

initialement mises en jeu lorsque le système cardiovasculaire doit faire face à une situation

nécessitant des adaptations fonctionnelles et/ou structurales, définissant un processus de

remodelage. Cependant lorsque ces actions dépassent le stade adaptatif, elles peuvent être à

l’origine d’altérations du système cardiovasculaire, faisant de l’Ang II et de l’aldostérone de

véritables facteurs de risque cardiovasculaire. Il semblerait que les formes locales des composants

du SRAA soient particulièrement impliquées dans ce retentissement cardiovasculaire. Les effets

de l’Ang II sur la croissance et la prolifération cellulaire, sur la fibrose et l’hypertrophie de

certains organes ont été mis en évidence par l’utilisation de substances bloquant la formation

d’Ang II (IEC) ou bloquant l’activation de ses récepteurs (ARA). Des résultats expérimentaux et

cliniques ont montré que ces substances permettent de retarder, ou de faire régresser,


26

l’hypertrophie ventriculaire gauche (HVG) et la rigidification artérielle induite par l’hypertension

artérielle.

1.2.4.1 Angiotensine II et retentissement cardiaque

Chez l’homme le remodelage cardiaque est caractérisé par une augmentation du dépôt des

composants de la matrice extra-cellulaire, une prolifération des fibroblastes, une hypertrophie des

myocytes cardiaques, et une altération de l’expression des gènes cardiaques (Manabe et al., 2002,

Swynghedauw, 1999, Sugden and Clerk, 1998). Ces modifications, qui ont pour but de préserver

la fonction systolique, induisent à long terme une diminution de la compliance du ventricule

gauche et favorisent la dysfonction diastolique. L’Ang II possède d’importantes propriétés

profibrosantes, liées en grande partie à une altération du métabolisme du collagène. La fibrose

se définit par un excès de fibres de collagène pouvant être dû à une augmentation de synthèse ou

à une dégradation insuffisante du collagène. Une collagénase importante dans le cœur est la

métalloprotéinase 1 (MMP-1), dont l’activité est régulée par une enzyme appelée TIMP-1 (tissue

inhibitors of metalloproteinases-1).

In vitro il a été montré que l’Ang II augmente la synthèse du collagène par les

cardiofibroblastes et diminue sa dégradation en inhibant les MMP-1 et en augmentant la

concentration de TIMP-1(Border and Noble, 1994, Edwards et al., 1987). Il est intéressant de

noter qu’un déséquilibre semblable entre l’activité des MMP-1 et celle des TIMP-1 a été mis en

évidence dans l’HTA essentielle, l’utilisation de Losartan permet de rétablir une dégradation

correcte du collagène de type I (Laviades et al., 1998).

1.2.4.2 Facteurs influençant l’impact cardiovasculaire de l’aldostérone

Les effets de l’aldostérone sur le retentissement cardiovasculaire ne semblent pas s’exercer dans

des conditions physiologiques. Par ailleurs, le sodium est un élément important qui

potentialiserait les effets directs de l’aldostérone sur les organes cibles. Le sodium est impliqué

dans les processus de remodelage vasculaire, et certains résultats expérimentaux, utilisant des

perfusions d’aldostérone, montrent que l’épaississement de la paroi vasculaire induit par

l’aldostérone ne se produit que lorsqu’il y a une charge sodée associé (Lacolley et al., 2002)

Takeda et coll. ont montré qu’une augmentation modérée de sodium, diminue la sécrétion

d’aldostérone plasmatique, alors qu’elle est responsable d’une augmentation de la synthèse


27

cardiaque d’aldostérone et d’une hypertrophie cardiaque (Takeda et al., 2000). Cependant les

résultats d’Iglarz et coll. sont plus contrastés. Ils suggèrent en effet que l’aldostérone aurait des

effets délétères modérés sur les organes cibles même en absence de sodium. Ces effets seraient

néanmoins majorés par l’augmentation de la prise de sel (Iglarz et al., 2004). Les effets de

l’aldostérone sur la structure et la fonction cardiovasculaire sont résumés dans la figure 7.

Figure 7. Synthèse des mécanismes pouvant expliquer comment un dérèglement des actions de

l’aldostérone peut contribuer au développement de pathologies cardiovasculaires (Struthers et

MacDonald, 2004).


28

.

1.2.4.3 Angiotensine II et vaisseaux

Les substances vasoactives, telles que l’Ang II et le monoxyde d’azote (NO), sont d’importants

déterminants de la structure et de la fonction vasculaire. En effet, ces substances

interagissent en permanence pour moduler la prolifération et la mort cellulaires.

L’intégrité de la structure et de la fonction vasculaire repose sur un équilibre entre les

substances vasoconstrictrices et les substances vasodilatatrices. Une perturbation de cette balance

contribue à une dysfonction endothéliale, et à des modifications structurales de la paroi vasculaire

(remodelage) (Dzau, 2001, Gibbons, 1997, Neutel, 2004).

L’Ang II altère la structure et la fonction cardiovasculaire par ses effets délétères sur

l’endothélium, principalement en diminuant la biodisponibilité du NO(Irani, 2001). L’Ang II agit

en augmentant le stress oxydatif dans l’endothelium, via l’activation des NADH/NADPH

oxydases, enzymes qui jouent un rôle majeur dans la production de formes réactives de l’oxygène

(Griendling et al., 1994) (figure 8). Ces formes réactives, notamment l’anion superoxyde,

réagissent avec le NO et le rendent inactif. Cette augmentation du stress oxydatif dans

l’endothelium vasculaire est pathogène et favorise l’HTA, l’insuffisance cardiaque et

l’athérosclérose (Gibbons, 1997, Ruiz-Ortega et al., 2001).

2 •O2- + NO Æ ONOO-

Ang II

Figure 8 : Effets de l’angiotensine II (Ang II) sur la dégradation du monoxyde d’azote (NO), via

l’action de la NADH/NADPH oxydase, et l’augmentation du stress oxydatif. La forme réactive de

l’oxygène •O2-

réagit avec le NO pour donner une forme inactive ONOO- (Touyz, 2003)


29

1.2.5 Endothélines

En 1988, Yanagisawa a découvert l’endothéline-1 (ET-1), premier représentant d'une famille de

peptides fortement vasoconstricteurs. L’ET-1 est constituée de 21 acides aminés, comprenant

deux chaînes disulfures, et une extrémité C-terminale identique de 6 acides aminés, nécessaire à

son activité biologique. En 1989, deux peptides ont été identifiés différant d’ET-1 par trois acides

aminés et ont été appelés respectivement, endothéline-2 (ET-2) et endothéline-3 (ET-3) (Miyauchi

et Masaki, 1999). Les endothélines sont produites majoritairement, mais non exclusivement, par

les cellules endothéliales (Schiffrin, 2003). Plus largement, les endothélines sont d’importants

régulateurs des fonctions cardiovasculaires et elles jouent un rôle dans la contraction des cellules

musculaires lisses. Elles sont également impliquées dans les fonctions du tractus digestif, des

glandes endocrines, des systèmes génito-urinaire, rénal et nerveux (Schiffrin, 2003). Les trois

isoformes d’endothéline, ET-1, ET-2 et ET3, proviennent chacune d’un gène distinct, codant pour

un précurseur spécifique. Les précurseurs des endothélines sont clivés par deux protéases pour

produire les endothélines matures et actives.

1.2.5.1 Mécanisme d’action des endothélines

Il existe deux récepteurs par lesquels agissent les endothélines : ETA et ETB (figure 9). Ces

derniers sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G

permettant différentes réponses physiologiques. Leur voie de signalisation cellulaire implique

l’activation de la phospholipase C, la mobilisation du calcium intracellulaire, l’activation de la

protéine kinase C, la stimulation de l’anti-porteur Na+/H+ et l’alcalinisation intracellulaire

(Schiffrin, 2003). Le récepteur ETA est activé préférentiellement par l’ET-1 et l’ET-2. Ce

récepteur est exprimé surtout dans l’aorte, le cœur, le rein et les cellules musculaires lisses.

L’affinité de ce récepteur pour les peptides ET-1 et ET-2 est de l’ordre de la nanomole et celle

pour l’ET-3 est plus faible de deux ordres de grandeur. En revanche, le récepteur ETB possède la

même affinité pour l’ET-1, l’ET-2 et l’ET-3 ; il est majoritairement exprimé sur les cellules

endothéliales et son activation conduit à la production de NO et de prostacycline (PGI2)(Schiffrin,

2003) ; il préviendrait l’apoptose et augmenterait la clairance de l’ET-1 (Alonso and Radomski,

2003). L’ET-1 exerce une influence paracrine en agissant au niveau des cellules musculaires

lisses, par sa fixation sur les récepteurs ETA et ETB, ce qui a pour effet de provoquer une

vasoconstriction (Schiffrin, 1995, Hopfner et Gopalakrishnan, 1999).


30

Figure 9 : Le système de l’endothéline, production, fonction et intéraction avec ses récépteurs au

niveau de la paroi vasculaire

L’ET-1 exerce aussi des fonctions autocrines en se fixant au récepteur ETB situé à la surface des

cellules endothéliales vasculaires, ce qui induit une vasodilatation (Schiffrin, 2003). Ces actions

antagonistes suggèrent que l’ET-1 joue un rôle important dans le maintien du tonus vasculaire et

de la pression artérielle dans les conditions physiologiques. De plus, l’ET-1 est un puissant

mitogène et stimule l’hypertrophie des cellules musculaires lisses, des myocytes et des cellules

mésangiales probablement via l’augmentation de l’expression de c-fos et c-myc (Haynes and

Webb, 1998, Schiffrin, 2003). Elle stimule également la production de cytokines comme le TNF-

α, l’IL-1 et l'IL-6 par les monocytes, lui conférant une action dans le mécanisme de

l’inflammation. Enfin, l’ET-1 est un puissant agent profibrosant en stimulant la synthèse de

matrice extracellulaire et en diminuant l’activité des collagénases (Eddy, 2000). Au niveau rénal,

l’ET-1 permet une vasoconstriction rénale et une diminution de la réabsorption d’eau et de sel. On

reconnaît à l’ET-1 un rôle dans l’homéostasie hydrosodée.


31

Elle préviendrait la réabsorption de sodium en inhibant la pompe Na+/K+ ATPase des tubules

proximal et collecteur (Lariviere et Lebel, 2003). Au même titre que l’angiotensine II stimule sa

synthèse, il a été démontré que l’ET-1 active le système rénine-angiotensine suggérant une boucle

de rétroaction positive entre ces deux facteurs dans certaines conditions pathologiques (Haynes et

Webb, 1998). Par ailleurs, chez les patients hémodialysés, il a été rapporté une élévation des

concentrations d’ET-1 plasmatiques corrélant avec une élévation de la pression artérielle (Lebel et

al., 1994). Récemment, il a été démontré chez le rat néphrectomisé une production vasculaire et

rénale accrue d’ET-1 jouant un rôle crucial dans le développement de l’hypertension artérielle. Le

blocage des récepteurs ETA freine la progression de cette hypertension et le déclin de la fonction

rénale, démontrant clairement l’implication de l’ET-1 dans ces processus pathologiques (Dumont

et al., 2001). De plus, l’expression du gène codant l’ET-1 est augmenté dans les artères résistives

des sujets présentant une hypertension artérielles essentielles (Schiffrin et al., 1997).

Un polymorphisme G/T dans l’exon 5 du gène codant pour la prépoET-1, substituant une lysine

en une asparagine en position 198, a été associé à une augmentation du risque d’hypertension

artérielle (Tiret et al., 1999). L’impact de ce polymorphisme sur un changement de la réactivité

vasculaire dans les artères mammaires de patients hospitalisés pour un pontage a été étudié. Les

patients porteurs de l’allèle T ont une potentialisation augmentée de la réponse à la phényléphrine

par l’endothéline (Iglarz et al., 2002).

1.2.6 Monoxyde d'azote (NO)

Le NO est synthétisé à partir de la L-arginine. Cet acide aminé est également le précurseur de la

proline, de l’ornithine, de la créatine, des polyamines aliphatiques et de l’agmatine. La

méthylation de l'arginine permet enfin la formation de la diméthylarginine asymétrique

(ADMA)(Wu et Meininger, 2000). Principalement apportée par les protéines de l’alimentation

(essentiellement d’origine végétale), la disponibilité de l’arginine consommée est néanmoins

limitée : 40% de l’arginine absorbée est immédiatement dégradée au niveau de l’intestin grêle par

l’arginase entérocytaire (Wu et Meininger, 2000). Concernant le catabolisme de l’arginine, quatre

types d'enzymes utilisent l’arginine comme substrat : les arginases, l’arginine/glycine

aminotransférase (AGAT), l’arginine décarbamylase (ADC) et les NO synthases (endothéliale,

neuronale et inductible) (figure 10).


32

Figure 10: Métabolisme de la L-arginine (Mori and Gotoh, 2000).

Le cycle citrulline-NO comprend l’argininosuccinate synthase (ASS), l’argininosuccinate lyase

(ASL) et la NOsynthase(NOS). Le cycle de l’urée comprend la carbamyl-phosphate synthase I

(CPS 1), l’ornithine transcarbamylase (OTC), l’arginosuccinate synthase (ASS), l’arginosuccinate

lyase (ASL) et l’arginase I. CPS 1 I et OTC sont présentes uniquement dans le foie et les cellules

épithéliales intestinales. CAT-1-3 : acide aminé cationique transporteur-1-3 ; OAT : ornithine

aminotransférase ; P5C : pyrroline-5-carboxylate.

Les arginases catalysent la formation d’urée et d’ornithine par hydrolyse de l’arginine. Cette

réaction intervient dans le cadre du cycle de l’urée, localisée dans le foie, mais il a été montré que

cette réaction avait également lieu de façon significative dans l’intestin grêle (Wu, 1998). Cette

enzyme permet la libération d’une molécule d’urée et d’ornithine, précurseur des polyamines, de

la proline et de glutamate. L’arginine est enfin le substrat des NOS, responsables de la formation

du NO et de citrulline. La citrulline est recyclé en arginine après l’action de l’argininosuccinate


33

synthase (ASS) et de l’argininosuccinate lyase(ASL). Comme il a été décrit précédemment, la L-

arginine est dotée d’un potentiel biologique remarquable qui repose sur la multiplicité de ses

métabolites biologiquement actifs, en tout premier lieu le monoxyde d'azote.

1.2.6.1 Fonctions biologiques du NO

La relaxation artérielle induite par l’acétylcholine dépendait d’un endothélium intact qui

produisait une substance pouvant diffuser et agir sur les cellules musculaires lisses (Furchgott et

Zawadzki, 1980). Cette substance fut nommée Endothelial-Derived Relaxing Factor (EDRF)

jusqu'à ce que Palmer et al (1987)(Palmer et al., 1987) la caractérisent et découvrent qu’il

s’agissait du NO. Le NO est une molécule gazeuse, hydrosoluble et liposoluble, de faible poids

moléculaire. Ces propriétés physicochimiques lui permettent d’agir à l’intérieur comme à

l’extérieur des cellules et de posséder un large spectre d’actions physiologiques, tant au niveau

rénal que cardiovasculaire, pulmonaire et gastro-intestinal. Le NO présente un électron libre, ce

qui lui confère une grande instabilité chimique, caractéristique commune à tous les radicaux libres

(Ducrocq et al., 2001). La demi-vie du NO est de quelques secondes ; il est rapidement converti en

nitrite et nitrate, lesquels sont des produits stables du métabolisme du NO(Moncada, 1992).

1.2.6.2 Biosynthèse et mode d’action du NO

Le NO est produit, entre autres, par les cellules endothéliales, les cardiomyocytes, les cellules

musculaires lisses, les macrophages, les plaquettes, les hépatocytes, les cellules mésangliales

rénales, les cellules osseuses et les neurones de l’hippocampe (Papapetropoulos et al., 1999,

Ducrocq et al., 2001, Domenico, 2004). Le NO est synthétisé par des enzymes nommées NOS

(Nitric Oxide Synthase), dont il existe trois isoformes : deux isoformes sont constitutives, la NOS

endothéliale (eNOS ou NOS3) et la NOS neuronale (nNOS ou NOS1), alors qu’une isoforme est

inductible (iNOS ou NOS2). Toutes ces isoformes utilisent comme substrats la L-arginine et

l’oxygène moléculaire pour synthétiser le NO. La réaction libère un coproduit, la L-citrulline. Le

NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate), la tétrahydrobioptérine (BH4), la

Ca2+/Calmoduline, le FAD (Flavine-Adénine Dinucléotide) sont des cofacteurs nécessaires au

processus catalytique (Xia et al., 1998).

Au niveau cellulaire, le NO se lie à une guanylate-cyclase soluble intracellulaire, l’unique cible

connue du NO, et augmente son activité enzymatique de 400 fois, catalysant la conversion de


34

GTP (guanosine triphosphate) en GMPc (guanosine monophosphate cyclique), qui assure des

fonctions de second messager intracellulaire. Ce mécanisme d’amplification de signal permet

donc d’obtenir un effet biologique important à partir de quantités particulièrement faibles de NO,

de l’ordre de la nanomole (Negrerie et al., 2001).

1.2.6.3 Rôle physiologique du NO

Dans la paroi vasculaire, le NO diffuse de l’endothélium vers la cellule musculaire lisse, cellule

effectrice d’élection, en traversant librement les membranes des cellules. Les effets biologiques du

NO sur le système cardiovasculaire sont nombreux. Au niveau de la cellule endothéliale, il inhibe

la production de l’ET-1, l’oxydation des LDL, l’expression de molécules d’adhésion et, par

conséquent, l’adhésion des leucocytes et des plaquettes. Il inhibe l’agrégation plaquettaire,

empêche la prolifération des cellules musculaires lisses, module la perméabilité vasculaire ainsi

que les mécanismes inflammatoires (Shaul, 2002).

On confère au monoxyde d’azote de nombreuses fonctions, en particulier un puissant effet

vasodilatateur. Sur ce point, le tonus vasculaire musculaire lisse dépendant du NO est déterminé

par de nombreuses voies métaboliques :

1. L’ouverture de canaux potassiques ATP-dépendants conduisant à l’hyperpolarisation cellulaire

2. Une diminution des concentrations intracellulaires de Ca2+ via l’inhibition de canaux calciques

associée à une réduction de la libération du Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique ;

3. Une inhibition de la phospholipase C ;

4. Une phosphorylation de protéines accélérant la relaxation et l’inhibition de la kinase Rho

En plus de ces actions directes sur les cellules, il a été démontré que le NO favorisait la

vasorelaxation indirectement en diminuant la dégradation de l’adénosine monophosphate (AMP)

via l’inhibition de la phosphodiestérase II, en inhibant la production d’ET-1 ainsi que la synthèse

de la rénine (et par conséquent d’angiotensine II), et en désactivant les anions superoxydes (O2-)

et autres ROS. Par ailleurs, le NO est impliqué dans les mécanismes antithrombotiques, donc de

protection vasculaire, et possède un rôle de neurotransmetteur en plus d’agir sur le système

immunitaire. Dans le diabète, un déficit en NO est associé aux dommages vasculaires

inflammatoires, athérosclérotiques et prothrombotiques qui augmentent le risque d’infarctus du

myocarde (Endemann et Schiffrin, 2004).


35

Plusieurs modèles ont été élaborés pour approfondir l’étude des effets physiopathologiques du

NO in vivo. Des souris déficientes pour eNOS présentent une hypertension, suggérant que

l’organisme ne peut compenser cette déficience par d’autres mécanismes régulateurs de la

pression sanguine et du tonus vasculaire. Par ailleurs, chez le rat spontanément hypertendu (SHR),

l’administration d’un plasmide contenant la séquence codant la NOS endothéliale humaine

provoque une baisse de pression artérielle significative pendant 5 à 6 semaines (Lin et al., 1997).

1.2.6.4 NO-synthases et risque vasculaire

Actuellement, il est bien établi que la NO-synthase endothéliale joue un rôle athéroprotecteur

(Bredt et Snyder, 1994, Shimokawa, 1999). En effet, les souris déficientes pour le gène eNOS

montrent une accélération dans la formation de la plaque (Moroi et al., 1998, Yogo et al., 2000) et

des anomalies du remodelage vasculaire (Rudic et al., 1998). Par contre, la surexpression de

eNOS chez les souris transgéniques réprime la formation de la lésion. Le rôle de iNOS dans

l’athérogenèse reste difficile à déterminer. En effet, la délétion du gène iNOS chez les souris

exacerbe le remodelage vasculaire (Yogo et al., 2000). Inversement, chez les souris déficientes

pour le gène de l’apolipoprotéine E (KO-APOE), la délétion du gène iNOS inhibe la formation de

la lésion riche en lipide (Kuhlencordt et al., 2001). Cette divergence peut être expliquée en partie

par les propriétés à la fois oxydantes et antioxydantes de iNOS (Goss et al., 1997). En effet, dans

certaines conditions, telles qu'un déficit en L-arginine ou en cofacteur BH4, les NO-synthases, et

en particulier iNOS, produisent des quantités importantes de peroxynitrites et favorisent ainsi le

stress oxydant (Vasquez-Vivar et al., 1998, Wang and Giebisch, 1996). Récemment, il a été

proposé que nNOS possède un effet anti-athérogène. En effet, des souris déficientes pour le gène

nNOS (KO-nNOS) montrent une accélération de la formation de la plaque d’athérosclérose

(Tsutsui, 2004). En conclusion, dans les maladies cardiovasculaires, la biodisponibilité du NO

peut être réduite par la diminution de l’expression de eNOS, par la présence d'inhibiteurs

endogènes, par un défaut de substrat ou des cofacteurs de l'enzyme, ou par l’augmentation de la

dégradation du NO par les espèces réactives de l’oxygène. Il est actuellement bien établi que le

NO joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie vasculaire dans les cellules

endothéliale et la perte de bioactivité du NO est associée à la dysfonction endothéliale.


36

1.3 Dysfonction endothéliale

L’endothélium vasculaire est la couche la plus interne des vaisseaux sanguins en contact avec le

sang et il forme avec la membrane basale l’intima. En conditions normales, l’endothélium

participe à la réaction immunitaire, contrôle la coagulation sanguine en participant à la fois à

l’hémostase et à la fibrinolyse, exerce également un rôle prépondérant dans le contrôle du tonus

vasculaire, de l’inflammation et du stress oxydatif en plus de moduler la migration et la

prolifération cellulaire (Marteau et al., 2005). La dysfonction endothéliale est un état

pathologique systémique de la paroi interne des vaisseaux sanguins qui est due à un déséquilibre

entre la production des facteurs vasodilatateurs et vasoconstricteurs, la résultante détermine alors

le tonus vasculaire (figure 11). Il en résulte une augmentation de la perméabilité de

l’endothélium vasculaire aux cellules du sang périphérique (telles que les monocytes, les

lymphocytes T et les granulocytes) et aux lipoprotéines suite à la production de E- selectin

(SELE). Cette dernière est une molécule d'adhésion cellulaire exprimée par les cellules

endothéliales activées par les cytokines inflammatoires. Par conséquent, elle est considérée

comme biomarqueur de la dysfonction endothéliale (Marteau et al., 2005).

Figure 11: La dysfonction endothéliale.


37

2 L’Hypertension artérielle

2.1 Définition

Le terme «hypertension artérielle» définit une condition clinique où la tension artérielle est

supérieure à une norme qui correspond à un risque cardiovasculaire élevé. Cette définition est

toutefois controversée. C’est une élévation permanente de la pression du sang dans les artères au-

dessus de la normale, c’est-à-dire supérieur à 140/90mmHg (14/9). C’est un facteur de risque

majeur des maladies cardio-vasculaires et rénales (Kearney et al., 2005).

2.2 Les différents types de l’HTA

Dans 95 % des cas, l’HTA ne reconnaît aucune étiologie et on parle d’HTA essentielle. Elle

constitue un des éléments du risque cardiovasculaire, justifiant sa prise en charge thérapeutique,

par contre l’HTA secondaire concerne 5 % des HTA, son étiologie est surrénalienne, rénale ou

toxique ; sa mise en évidence autorise un traitement spécifique pouvant permettre la cure de

l’HTA, Au-delà de ces chiffres, l’Organisation Mondiale de la Santé définit plusieurs grades de

valeurs normales et pathologiques de la pression artérielle (tableau I).

Tableau I: Classification des niveaux de PA selon l’OMS (1999).

Catégories PA systolique (mm Hg) PA diastolique (mm Hg)

PA optimale

PA normale

PA normale haute (pré-

HTA)

HTA grade1 (légère)

HTA grade2 (modérée)

HTA grade3 (sévère)

< 120 et

120-129 et/ou

130-139 et/ou

140-159 et/ou

160-179 et/ou

≥ 180 et/ou

< 80

80-84

85-89

90-99

100-109

≥ 110

HTA systolique isolée ≥ 140 et < 90

PA : Pression Artérielle ; HTA : Hypertension Artérielle


38

Cette classification est basée sur la moyenne d’au moins deux mesures effectuées lors de chacune

de deux consultations suivant l’examen de dépistage, en position assise, après 5 minutes de repos

(Guidelines Subcommittee, 1999). Cependant, ni la distribution de la pression artérielle dans la

population, ni la relation existant entre la pression artérielle et le risque cardiovasculaire ne

justifient de limite nette entre normotension et hypertension.

2.3 Epidémiologie et prévalence de l’HTA

2.3.1 Dans le monde

En 2000, on estimait à environ 26,4% la population d’hypertendus (26,6% des hommes et 26,1%

des femmes). Parmi les 972 millions d’adultes hypertendus, 333 millions (34,3%) proviennent des

pays « développés » et 639 millions (65,7%) sont issus des pays « en développement ». Le

nombre d’adulte hypertendus d’ici 2025 pourrait augmenter de 60% et atteindre 1,56 milliard

(Kearney et al., 2005). L’hypertension artérielle serait responsable d’un peu moins de 8 millions

de décès par an dans le monde et de près de 100 millions de jours d’invalidité (Lawes et al.,

2008). Elle serait la cause de près de la moitié des accidents vasculaires cérébraux et des accidents

cardiaques.

2.3.1.1.1 En Algérie

L'étude TAHINA réalisée par le ministère de la santé en collaboration avec l'Organisation

mondiale de la santé (OMS) révèle que la prévalence des HTA en Algérie est de 27 à 33% et

touche généralement les sujets âgés de 50 à 80 ans (Temmar et al., 2007). Les statistiques

avancent que plus de 30% de la population adulte atteinte par cette maladie est soumise à un

traitement, mais des sources médicales avancent que seules 6% parmi ce taux suivent une

thérapie stricte. Toutefois, indique l'étude, que cette maladie affecte de plus en plus les personnes

jeunes de moins de 40 ans, en raison de la mauvaise nutrition, la sédentarité et le stress.


39

2.4 Facteurs de risque de l’hypertension artérielle

2.4.1 Age

La pression artérielle est significativement plus basse chez les enfants comparés aux adultes, et

augmente fortement pendant le début de la seconde décade de la vie (Kiefe et al., 1997). Les

études épidémiologiques ont montré que l'augmentation progressive des pressions artérielles avec

l'âge se poursuit chez l'adulte, en particulier en ce qui concerne la pression systolique. Par

exemple, dans l’étude MONICA, réalisée chez 32.422 hommes et 32.554 femmes âgés entre 35 et

64 ans, la pression artérielle systolique et diastolique augmentait respectivement de 0.29 et 0.91

mmHg par an chez les hommes et de 0.60 et 1.31 mmHg chez les femmes, et cette augmentation

était linéaire (Wolf et al., 1997). Après 50 ans, il est possible d'observer une diminution

progressive de la pression diastolique, ce qui n'est pas observé pour la pression systolique

(Franklin et al., 1997). Cela se traduit par une augmentation de la pression pulsée, définie comme

la différence entre la pression systolique et la pression diastolique, considérée comme facteur de

risque des maladies cardiovasculaires. Cette tendance est observée chez les deux sexes et dans la

plupart des ethnies (Burt et al., 1995).

2.4.2 Sexe

De nombreuses études épidémiologiques ont montré une évolution des pressions artérielles en

fonction de l'âge différente chez les hommes et les femmes. En effet, avant la ménopause, les

femmes présentent une pression artérielle moins élevée que les hommes ; après la ménopause, les

pressions artérielles deviennent plus élevée chez les femmes que chez les hommes (Kannel et al.,

1981). En d'autres termes, chez les individus âgés de 60 ans et plus, la moyenne des pressions

artérielles sont plus élevées chez les femmes que chez les hommes (Hajjar et al., 2001). Dans une

étude d’épidémiologie de l’hypertension réalisée dans la population espagnole, menée sur 15.212

hommes et 13.936 femmes, les valeurs de pressions artérielles ont été significativement plus

élevées chez les femmes que les hommes (Banegas et al., 2008).


40

2.4.3 Origine ethnique

Les américains d’origine africaine présentent la prévalence d’hypertension artérielle la plus élevée

dans le monde (Stamler et al., 1976, Cushman et al., 2002). Selon une étude épidémiologique

menée entre 1987 et 1989, la prévalence de l’hypertension chez les américains d’origine africaine

était de 56% comparés à 27% chez les caucasiens (Nieto et al., 1995). Aux Etats-unis, cette

disparité de prévalence entre les noirs et les caucasiens a diminué entre 1960 et 1990, mais a

augmenté de1999 à 2002. De nombreux facteurs de risque ont été impliqués dans l’élévation de la

prévalence de l’hypertension chez les noirs américains tels que l’obésité, les facteurs

socioéconomiques, le régime alimentaire et les facteurs génétiques. Par ailleurs, la prévalence

élevée de l'hypertension était spécifique aux américains d’origine africaine ou des caraïbes vivants

sur le territoire américain. En effet, les sujets noirs américains nés à l’étranger et vivants dans

d’autres pays présentaient une prévalence d’hypertension similaire à celle des autres ethnies

(Hicks et al., 2003).

2.4.4 Géographie

Il existe une variation géographique de la prévalence de l’hypertension à l’intérieur d’un même

pays. En effet, dans plusieurs pays développés, les régions rurales tendent à avoir une prévalence

d’hypertension plus basse que les régions urbaines (Ibrahim et al., 1996, Duprez et al., 2002,

Ragoobirsingh et al., 2002). Aux Etats-Unis, la prévalence de l’hypertension est plus élevée chez

les habitants du Sud par rapport aux résidents des autres régions. Ce gradient Nord-Sud a été

également observé dans de nombreuses populations d'origine ethnique différente et n'est pas

influencée par le sexe (Kiefe et al., 1997, Obisesan et al., 2000). Cette particularité est notamment

frappante chez les noirs américains. Par exemple, chez les hommes, 42.2% de noirs américains

résidant dans le sud des Etats-Unis sont hypertendus contre 34.1% de noirs américains habitant le

nord du pays. De même, chez les femmes, 42.7% des femmes noires américaines résidant dans le

sud sont hypertendues contre 37.2% des femmes noires américaines habitant dans le nord (Hicks

et al., 2003). Des différences de régime alimentaire entre les deux régions pourraient, au moins en

partie, contribuer à ces prévalences contrastées. Ainsi, selon l'étude NHANES-III, les habitants du

sud des Etats-Unis consomment significativement plus de sodium et moins de potassium, de

calcium et de magnésium comparés aux autres régions.


41

2.4.5 Mesures anthropométriques

L’IMC est un facteur fortement corrélé aux valeurs de pression artérielle et à la prévalence de

l’hypertension (Sever et al., 1980, Bruce et al., 1993, Must et al., 1999, Flegal, 2000). L’étude

épidémiologique NHANES-III a révélé que, chez les deux sexes, la prévalence de l’hypertension

est plus élevée chez les sujets en surpoids ou obèses que chez les sujets normopondéraux (Must et

al., 1999). Chez les enfants, l'augmentation de la pression artérielle est aussi liée au surpoids ou à

l'obésité (Rosner et al, 2000 ; Sorof et al, 2002). Le risque d’hypertension est ainsi trois fois plus

élevé chez les enfants obèses que chez les enfants non obèses ((Sorof et al., 2002, Sorof and

Daniels, 2002). Dans les études longitudinales, l’augmentation de l’incidence de l’hypertension

est également associée à la prise du poids (Paffenbarger et al., 1983, Vasan et al., 2001). Dans

l’étude Framingham, une prise de poids de 5% est associée à une augmentation de 20% à 30% de

l’incidence de l’hypertension (Vasan et al., 2001). A l'inverse, la perte du poids est associée à une

diminution de la pression artérielle et de l’incidence de l’hypertension, justifiant les

recommandations faites en la matière auprès des sujets hypertendus (Whelton et al., 1997, He et

al., 2000, Stevens et al., 2001). Dans une étude cas-témoins de l’hypertension, l’OR (95%CI) du

risque d’hypertension associé à l’obésité est de 3.01 ([95%CI] :1.67-5.44 ; p<0.001) chez les

hommes et, est de 2.82 ([95% CI] : 2.05-3.86 ; p<0.001) chez les femmes. Toutefois, seules les

valeurs de l’IMC au-dessus de 25Kg/m2 sont associées à l’augmentation du risque d’hypertension

chez les hommes, alors que toutes les valeurs de l’IMC sont positivement associées à

l’hypertension chez les femmes (Mishra et al., 2006).

2.4.6 Effet sur la pression artérielle d'un régime alimentaire riche en sodium et pauvre en

potassium et en calcium

La dose journalière conseillée de la consommation de chlorure de sodium (NaCl) est de 1500 mg.

Dans les pays industrialisés, la moyenne de la consommation de NaCl est entre 3000 et 4500

mg/jour (Karppanen et al., 2005). Cette consommation excessive de NaCl contribue à l’apparition

de plusieurs maladies chroniques telle que l’hypertension.

En effet, les résultats de plusieurs études épidémiologiques et cliniques montrent une association

entre la consommation de NaCl et l’augmentation des valeurs de pressions artérielles (Cook,

2008).


42

L’effet du NaCl sur la pression artérielle augmente avec l’âge, le degré d’hypertension artérielle et

chez les personnes normotensives présentant des antécédents familiaux d’hypertension (Overlack

et al., 1993). En effet, les résultats d’une méta-analyse de 56 études cliniques ont montré qu’une

réduction de la consommation de NaCl de l’ordre de 95 mmol/ jour est corrélée à une réduction de

la pression artérielle systolique de 3.7 mm Hg chez les hypertendus et de 1 mm Hg chez les

normotendus (Midgley et al., 1996). Des méta-analyses d'études cliniques ont montré qu'un

régime alimentaire supplémenté en potassium diminue significativement les pressions artérielles

systolique et diastolique (Dickinson et al., 2006). Cet effet est plus intense chez les personnes

hypertendues que les sujets normotendus, et plus prononcé chez les individus qui consomment des

quantités élevées de NaCl. Il existe une corrélation inverse entre la quantité de calcium

consommée et la pression artérielle. En effet, la consommation de faibles quantités de calcium

(600 mg/jour) est associée à une prévalence plus importante de l’hypertension q'une

consommation importante (1400 mg/jour). Selon l’étude NHANES III, la consommation

quotidienne d’une dose au-dessus de 1200 mg peut diminuer l’incidence de l’hypertension

artérielle systolique dans la population générale (Hajjar et al., 2003). Récemment, il a été rapporté

que la différence de la consommation de NaCl, de calcium et de potassium entre trois groupes

d’origines ethniques différentes au sud d’Afrique (noir-Africains, Caucasiens et métisses)

contribue à la différence de la prévalence de l’hypertension entre ces trois ethnies (Charlton et al.,

2005).

2.4.7 Consommation d’alcool

Plusieurs travaux ont montré que la relation entre la consommation d’alcool et la pression

artérielle est en forme de J (J-shaped)(Klatsky et Friedman, 1995). Les consommateurs modérés

d'alcool (équivalent en alcool de un à deux verres de vin par jour) ont une pression artérielle plus

basse que les sujets ne consommant pas d’alcool (Victor et Hansen, 1995). En revanche, les sujets

consommant quotidiennement l'équivalent en alcool de trois verres de vin ou plus présentent un

risque d'hypertension augmenté de 5 à 7% par rapport aux sujets ne consommant pas d'alcool

(Hajjar et al., 2006).


43

2.4.8 Consommation du tabac

Il est actuellement bien établi que la consommation de tabac est un facteur de risque majeur des

maladies cardiovasculaires. Cependant, l’association entre la consommation de tabac et

l’hypertension artérielle reste très débattue. Plusieurs arguments sont en faveur de l’existence

d’une relation entre ces deux facteurs de risque cardiovasculaires. La consommation de tabac et

l’hypertension artérielle sont deux facteurs de risque artériel dont les actions se potentialisent.

L’étude de Framingham a montré qu’un sujet hypertendu qui cesse de fumer réduit rapidement

son risque cardiovasculaire de 35% à 40%. Toutefois, l’hypertension artérielle et la consommation

de tabac peuvent également agir de façon indépendante sur le risque cardiovasculaire. Kannel et

Higgins (1990) ont montré que la consommation de tabac augmente le risque cardiovasculaire

quel que soit le niveau de la pression artérielle. Dans le cas de la consommation de tabac de façon

occasionnelle mais aiguë, chaque cigarette fumée entraîne une augmentation de la pression

artérielle systolique (Winniford, 1990).

2.4.9 Antécédents familiaux

Les antécédents familiaux d’hypertension sont associés à une augmentation du risque

d’hypertension (Galderisi et al., 1993, van der Sande et al., 2001). Dans une étude réalisée chez

5.329 adultes, l’histoire familiale de l’hypertension est, en particulier, associée à une

augmentation de la pression artérielle diastolique, à l'IMC (Indice de Masse Corporelle), à la

cholestérolémie et à l’obésité (van der Sande et al., 2001). De plus, les jeunes enfants de parents

hypertendus ont un risque élevé d’être hypertendus (Lauer et Clarke, 1989) et ils présentent une

pression artérielle systolique élevée comparés aux jeunes enfants de parents non hypertendus

(Munger et al., 1988).


44

2.5 Hypertension et dysfonction endothéliale

Il est encore difficile, à l’heure actuelle, de déterminer si la dysfonction endothéliale est une cause

ou une conséquence de l’élévation de la pression artérielle (Taddei and Salvetti, 2002, Sciacqua et

al., 2005). Cependant, l’hypertension artérielle expérimentale réduit les réponses relaxantes

dépendantes de l’endothélium, aussi bien au niveau des gros troncs artériels que des artères de

résistance. Cette altération est présente dans la plupart des modèles expérimentaux

d’hypertension, en particulier chez le rat spontanément hypertendu (SHR) (Clozel et al., 1990,

Richard et al., 1996), le rat Goldblatt (two-kidney one-clip) (Nakamura and Prewitt, 1992, Heitzer

et al., 1999), et le rat Dahl sensible au sel ((Luscher et al., 1987, Hayakawa et al., 1997). Pour

autant, les mécanismes de la dysfonction endothéliale diffèrent selon le modèle d’hypertension et

le vaisseau considéré, et semblent impliquer de façon générale soit une baisse de la production du

monoxyde d’azote (NO) (rat Dahl), soit une augmentation des facteurs vasoconstricteurs (rat

SHR). Chez l’Homme, l’hypertension artérielle est également associée à une dysfonction

endothéliale. Elle a été caractérisée expérimentalement par une baisse de la dilatation des

vaisseaux de résistance en réponse à l’acétylcholine (Linder et al., 1990) et par une diminution des

réponses vasoconstrictrices induites au niveau de ce même territoire par un inhibiteur de NO, la

N(G) monométhyl-L-arginine. De plus, la production d’endothéline, molécule vasoconstrictrice,

par les petites artères apparaît normale chez les patients légèrement hypertendus, alors qu’elle est

accrue chez les patients atteints d’hypertension modérée ou grave (Schiffrin et al., 1997).

2.6 Hypertension et stress oxydant

Actuellement, il est bien établi que le stress oxydant est impliqué dans la physiopathologie de

plusieurs phénotypes liés aux maladies cardiovasculaires, y compris l’hypertension (Cai et

Harrison, 2000). Cependant la nature de la relation entre le stress oxydant et l’hypertension

artérielle n’est pas bien définie. Dans les modèles expérimentaux d’hypertension, en particulier

chez les rats spontanément hypertendus (SHR), l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène

(ERO) est associée à une diminution de production NO (Racasan et al., 2005). Chez l’Homme,

une diminution dans la biodisponibilité du NO et l’augmentation du stress oxydant sont présentes

chez les hypertendus (Touyz, 2004). Récemment, Minuz et al (2002) ont montré que le stress

oxydant est largement augmenté chez les patients hypertendus souffrant d’une maladie

rénovasculaire comparés aux patients avec une hypertension essentielle et les sujets normotendus.


45

A partir de ces observations, ces auteurs ont suggéré que l’augmentation du stress oxydant pouvait

être corrélée à une sténose de l’artère rénale et à l’activation du système rénine angiotensine

(SRA)(Minuz et al., 2002).

3 Héritabilité génétique de l’hypertension artérielle

L'HTA essentielle est un trait polygénique ayant une héritabilité (variance phénotypique

imputable à la variation génétique) estimée entre ≈31 à ≈68 % (Ehret, 2010). D’autre part, les

formes rares sont des traits monogéniques causées par des mutations exerçants un large effet

phénotypique (Ehret, 2010, Lifton et al., 2001). La contribution génétique dans l’HTA

essentielle se présente sous la forme de plusieurs allèles géniques (de nombres et nature

inconnus) qui pourront altérer la fonction et/ou l'expression des protéines codées, et par

conséquence créer des phénotypes intermédiaires qui se compliqueraient en HTA (Harrap,

2003). Les études familiales d’HTA essentielle ont montré que son héritabilité est de≈31 %

(mesure unique de la PAS et PAD), ≈57 % (moyenne à long terme du phénotype PAS

et PAD) et ≈68 % (profil de la PAS et de la PAD sur 24 heures)(Ehret, 2010).

3.1 Les formes mono et polygéniques de l’hypertension artérielle et approches employées

pour les révéler

3.1.1 Formes monogéniques d’hypertension artérielle

Une dizaine de formes héréditaires rares d’HTA (formes mendéliennes) ont été identifiées depuis

les années soixante. Les formes les plus connues sont montrées dans le Tableau II avec leurs

phénotypes et leurs mutations. Il s’agit souvent de mutations de gènes impliqués dans les

mécanismes de réabsorption de sel au niveau des reins, et leur découverte a aidé à mieux

comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de la PA (Rice et al., 2002). Les

formes monogéniques sont caractérisées par des mutations à haute pénétrance (à savoir une

forte probabilité de développer la maladie chez la personne concernée), résultant en une perte ou

un gain de fonction important (tableau II).


46

Tableau II : Formes monogéniques d’hyper ou d’hypotension artérielle (Cowley, 2006)

Hypertension artérielle Mode de

transmission Gene Mutations

et conséquences

fonctionnelles

Phénotype

Hyperaldosteronisme de type 1 (glucocorticoid

remedial aldosteronism)

Autosomique dominante

Fusion de CYP11b1et

CYP11b2

Gène chimérique sous contrôle d’ACTH

Hypertension, hypokaliémie, hyperaldostéronisme,

PRA↓ ,18-hydroxycortisol↑

Hyperaldosteronisme de type 2


Locus

chromosome

7p22

Surproduction

d’aldostérone dans

glandes surrénaliennes

Hypertension, hypokaliémie,

hyperaldostéronisme, PRA↓,

hyperplasie/adénome glandes

surrénaliennes

Syndrome de Liddle Autosomique dominante

SCNN1B SCNN1G

Activation constitutive d’ENaC (canal sodique

épithéliale dans le tube

distal/collecteur)

Hypertension, hypokaliémie, hypoaldosteronisme, PRA↓

Hyperplasie congénitale surrénalienne

Autosomique récessive

CYP11B1 Déficit de désactivation de cortisol

Hypertension, hypokaliémie,

hypoaldostéronisme, PRA↓,

déoxoycortisone↑

Deficit d’11 b-OH steroid dehydrogénase type

2(apparent

mineralocorticoid excess)

Autosomique recessive

HSD11B1 Déficit de désactivation de cortisol

Hypertension, hypokaliémie, hypoaldosteronisme, PRA↓

Pseudohypoaldosteronis me type II (syndrome de

Gordon)


WNK1 WNK4

Activation constitutive du cotransporteur Na/Cl

dans le tube distale

Hypertension, hypokaliémie, hypoaldosteronisme, PRA↓,

acidose métabolique

Mutations de recepteur PPAR-g


PPARG Loss-of-function mutation du recepteur

Hypertension, résistance à l’insuline, diabète

Syndrome d’hypertension artérielle, hypercholestérolémie,

hypomagnésémie

Mitochondriale Non identifié Transmission maternelle d’une mutation causant

une substitution de

cytidine dans les ARNt

mitochondriaux

Hypertension,

hypercholestérolémie,

hypomagnésémie

Syndrome de Bartter (type1-5)


SLC12A1(1), KCJN1(2), CLCNKA(3),

BSND(4),

CASR(5)

Désactivation du

cotransporteur Na-K-2Cl de l’anse d’Henle

Hypotension, hypokaliémie, hyperaldostéronisme, PRA↑, polyurie, alkalose

metabolique, hypercalciurie

Syndrome de Gitelman Autosomique récessive

SLC12A3 Désactivation du

cotransporteur Na/Cl du

tube distal

Hypotension, hypokaliémie,

hyperaldosteronisme,

PRA↑,hypocalcurie,

hypomagnésémie

Pseudohypoaldosteronis me type 1


SCNN1A,

SCNN1B, SCNN1G

Perte de fonction D’ENaC

Hypotension, hypokaliémie, hyperaldosteronisme,

hypovolémie, transpiration

excessive


47

3.1.2 Formes polygéniques d’hypertension artérielle

Elles représentent 95% des cas d'HTA (Levy et al., 2009). Il existe à l’heure actuelle plus de 110

gènes candidats d’HTA essentielle, identifiés grâce aux études de gène candidat chez l’Homme.

L’un des plus étudiés est probablement le gène angiotensin I converting enzyme (ACE). Les

personnes portant le génotype Délétion/Délétion ont une concentration plasmatique d’enzyme de

conversion de l’angiotensine deux fois plus élevée que les personnes portant un génotype

insertion/insertion ou insertion/délétion (Rigat et al., 1990). Le Tableau III montre une liste de

quelques gènes candidats trouvés associés avec la PA.

Tableau III : Quelques gènes candidats (probablement) impliqués dans la régulation de la

pression artérielle.

Mécanisme Symbole du

gène

Localisation Nom du gène

Système rénine-

angiotensine-

aldostérone

ACE 17q23 Angiotensin converti ng enzyme

AGT 1q42-q43 Angiotensinogen AGTR1

AGTR2

CYP11B1

CYP11B2

REN

3q21-q25

Xq22-q23

8q22

8q24.3

1q32

Angiotensin II receptor,type1

Angiotensin II receptor,type2

Cytochrome P450,family11,subfamily B,polypeptide 1

Cytochrome P450,family11,subfamily B,polypeptide 2

Cytochrome P450,family11,subfamily B,polypeptide 2; aldosterone synthase renin

Système nerveux ADRB1 10q24-q26 Adrenergic, beta-1-,receptor

sympathique ADRB2 5q32-q34 Adrenergic, beta-2-,receptor

ADRB3 8p12-p11.2 Adrenergic, beta-3-,receptor

DRD1 5q35.1 Dopamine receptor D1

DRD2 11q23 Dopamine receptor D2

DRD3 3q13.3 Dopamine receptor D3

DBH 9q34 Dopamine beta-hydroxylase (dopamine beta-mono-

oxygenase)

NPY 7p15.1 Neuropeptide Y

NPY1R 4q31.3-q32 Neuropeptide Y receptor1

PNMT 17q21-q22 Phenylethanolamine N-methyltransferase

Transporteurs de

sodium

SCNN1A

SCNN1B

SCNN1G

12p13

16p13-p12

16p13-p12

Sodium channel, nonvoltage-gated1alpha (alpha EnaC)

Sodium channel, nonvoltage-gated1beta (beta EnaC)

Sodium channel, nonvoltage-gated1gamma (gamma

EnaC)


48

SLC12A3

SLC12A1

16q13

15q15-q21.1

Solute carrier family 12(sodium/chloride transporters),member 3 NaCl cotransporteur

Solute carrier family 12(sodium/chloride

transporters),member 1 Na-K-2Cl cotransporteur

Stéroïdes HSD11B2

NR3C2/MLR

16q22

4q31.1

Hydroxysteroid (11-beta) dehydrogenase 2

Nuclear receptor subfamily 3,group C, member 2:mineralocorticoid receptor

Peptides

natriurétiques

NPPB

NPPA

NPPC

NPR3

1p36.2

1p36.21

2q24-qter

5p14-p13

Natriuretic peptide precursor B

Natriuretic peptide precursor A

Natriuretic peptide precursor C

Natriuretic peptide receptor C/guanylate cyclase C

Divers ABCB1(MDR 1)

ADD1

ADD2

ADD3

CYP3A5

GNB3

EDN-1

LPL

NOS3

PPARG

7q21.1

4p16.3

2p14-p13

10q24.2-q24.3

7q22.1

12p13

6p24.1

8p22

7q36

3p25

ATP-binding cassette, sub-family (MDR/TAP), member 1

Adducin 1(alpha)

Adducin 2(beta)

Adducin 3(gamma)

Cytochrome P450 family 3, subfamily A, polypeptide 5

Guanine nucleotide binding protein (G protein),beta

polypeptide 3

Endothelin-1

Lipoprotein lipase

Nitric oxide synthase 3 (endothelial cell)

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

3.1.3 Approche gène candidat

Les gènes candidats sont des gènes codant pour des protéines pouvant être impliquées dans la

régulation de la PA (Delles et al., 2010). L’approche gène candidat implique l’utilisation des

techniques épidémiologiques classiques, les études transversales et longitudinales de population

pour les traits continus (PA) et les études cas-témoins pour les traits dichotomiques (HTA). Cette

approche peut se concentrer sur un ou plusieurs gènes et a pour but de déterminer si

l’HTA est associée à certains marqueurs génétiques, constitués le plus fréquemment de SNPs

(Delles et al., 2010).


49

3.1.4 Approche pangénomique

Les études d’association pangénomique ou genome-wide association studies (GWAS) utilisent

des cartes denses de SNPs localisés sur l’ensemble du génome humain (sauf le chromosome Y)

afin de rechercher des associations entre ces différents variants génétiques et le phénotype étudié

( E h r e t , 2 0 1 0 ) . Contrairement à l’approche gène candidat qui cible un ensemble de gènes

potentiels, les GWAS investiguent une grande partie du génome sans aucun a priori sur

l’identité des gènes impliqués ( E h r e t , 2 0 1 0 ) . Cette approche présente l'avantage de

permettre la découverte de nouvelles connaissances sur les SNPs causaux non identifiés

auparavant ( E h r e t , 2 0 1 0 ) . Le concept des GWAS est basé sur l’idée suivante : ‘une maladie

commune, des variants génétiques communs’, ce qui implique que les maladies complexes

communes sont gouvernées par plusieurs SNPs présents chez plus de 1-5% de la population

étudiée ( E h r e t , 2 0 1 0 ) . Le nombre de SNPs que nous pouvons étudier simultanément grâce à

des puces d’ADN a rapidement augmenté ces dernières années et, actuellement, un million de

SNPs sont génotypés simultanément dans les GWAS( E h r e t , 2 0 1 0 ) . Ainsi, les GWAS ont

permis un grand pas en avant par rapport aux études de liaison génétiques, car elles ont été

conduites sur des milliers d’individus ethniquement homogènes, en identifiant des centaines de

milliers de SNPs à la fois ( E h r e t , 2 0 1 0 ) . A ce jour, le catalogue des GWAS a répertorié 1,596

études effectuées sur 249 traits (Figure 12)(Hindorff et al., 2009). Quant aux GWAS, une valeur

de P inférieure à 0,05 (seuil habituellement utilisé en statistique) entre un SNP et un trait testé, ne

suffit pas pour être considérée comme significative. Celle-ci doit avoir une valeur inférieure au

seuil Bonferoni, et donc Pvalue 5x10-8

(Marteau et al., 2005).


50

Figure 12: Répertoire des signaux d’association révélés par les études pangénomiques publiées

jusqu’au jour.


51

En 2009, une GWAS effectuée par le Global BPgen consortium, incluant 34,433 individus

Caucasiens, a pu identifier une association entre la PA et 8 loci. Ces loci étaient CYP17A1,

CYP1A2, MTHFR, SH2B3, PLCD3, ZNF652, FGF5 et c10orf107. Seul le gène CYP17A1 codant

pour une protéine qui régule l’activité de l’enzyme stéroïde 17 –hydroxylase essentielle pour la

synthèse de minéralo et glucocorticoïdes, était auparavant associé à une forme rare d’HTA

monogénique. Le gène MTHFR a été déjà associé à l’HTA essentielle chez l’homme. Par contre,

CYP1A2, SH2B3, ZNF652, FGF5 et c10orf107 étaient de nouveaux gènes, qui auparavant

n’avaient jamais été impliqués dans l’HTA essentielle (Newton-Cheh et al., 2009). De même,

CHARGE consortium (Levy et al., 2009), incluant 29,136 individus, a identifié plusieurs régions

génomiques pour contenir des gènes candidats, plus précisément treize SNPs ont été associés

avec la PAS, 20 avec PAD et 10 avec l’HTA (P< 4×10−7

) (Levy et al., 2009). Ce même

consortium a fourni une méta-analyse des 10 loci montrant les plus fortes associations avec la PA

et l’HTA dans CHARGE et Global BPgen consortiums (Levy et al., 2009). Il a pu identifier, de

façon reproductible (P-value< 5×10−8

), 4 loci associés avec la PAS (ATP2B1, CYP17A1,

PLEKHA7 et SH2B3), 6 loci associés avec la PAD (ATP2B1, CACNB2, CSK-ULK3, SH2B3,

TBX3-TBX5 et ULK4) et un seul locus (ATP2B1) associé avec l’HTA (Tableau IV). Récemment

en 2011, une GWAS conduite sur 200,000 individus caucasiens a révélé que 29 SNPs dans 28 loci

étaient associés à la PA (Ehret et al., 2011) (figure 13). Parmi les 29 SNPs, 13 étaient

précédemment décrits dans les GWAS de Levy et al (Levy et al., 2009) et Newton Cheh et al

(Newton-Cheh et al., 2009). En plus des 18 gènes décrits ci-dessus, 10 SNPs inter-géniques

appartenant à 10 loci différents ont été identifiés par (E hre t e t a l ., 2011 ).Ces loci étaient ,

CYP1A1–ULK3, CYP17A1- NT5C2, GNAS-EDN3, FLJ32810-TMEM133, FURIN-FES,

MTHFR-NPPB,NPR3-C5orf23.


52

Tableau IV: Méta-analyse des dix meilleurs single nucleotide polymorphisms associés avec la pression et l'hypertension artérielles dans 2

consortiums CHARGE et Global Bpgen (d’après (Levy et al., 2009)).

SNP

ID

chr Position Gene à

proximité

Allèles

(F/M)

FAF Beta e s P Beta e s P Beta e s P

PAS Méta-analyse CHARGE Méta-analyse Global Bpgen Méta-analyse CHARGE et Global

Bpgen

rs12046278 1 10,722,164 CASZ1 T/C 0,64 −0,84 0,18 1,84x10−06 −0,29 0,15 5,71x10−02

−0,53 0,12 4,77x10−06

rs7571613 2 190,513,907 PMS1 A/G 0,82 −0,96 0,19 7,24x10−07 −0,23 0,16 1,59x10−01

−0,54 0,13 1,90x10−05

rs448378 3 170,583,593 MDS1 A/G 0,52 −0,71 0,15 1,28x10−06 −0,36 0,13 4,76x10−03

−0,51 0,1 1,18x10−07

rs2736376 8 11,155,175 MTMR9 C/G 0,13 −1,08 0,23 1,90x10−06 −0,06 0,19 7,36x10−01

−0,48 0,15 9,15x10−04

rs1910252 8 49,569,915 EFCAB1 T/C 0,18 −0,93 0,19 1,70x10−06 −0,07 0,17 6,80x10−01

−0,43 0,13 6,13x10−04

rs11014166 10 18,748,804 CACNB2 A/T 0,66 0,74 0,16 2,11x10−06 0,33 0,13 1,31x10−02

0,5 0,1 7,03x10−07

rs1004467 10 104,584,497 CYP17A1 A/G 0,9 1,2 0,25 1,99x10−06 0,94 0,21 1,08x10−05

1,05 0,16 1,28x10−10

rs381815 11 16,858,844 PLEKHA7 T/C 0,26 0,84 0,17 5,76x10−07 0,52 0,14 2,72x10−04

0,65 0,11 1,89x10−09

rs2681492 12 88,537,220 ATP2B1 T/C 0,8 1,26 0,19 3,01x10−11 0,5 0,17 4,07x10−03

0,85 0,13 3,76x10−11

rs3184504 12 110,368,991 SH2B3 T/C 0,48 0,75 0,15 5,73x10−07 0,45 0,13 6,36x10−04

0,58 0,1 4,52x10−09

PAD

rs13423988 2 68,764,770 GPR73-

ARHGAP25 T/C 0,17 0,59 0,12 1,09x10−06 0,11 0,11 3,22x10−01

0,33 0,08 5,00x10−05

rs13401889 2 190,618,804 MSTN T/C 0,79 −0,54 0,11 9,70x10−07 −0,10 0,11 3,55x10−01

−0,31 0,08 4,82x10−05

rs9815354 3 41,887,655 ULK4 A/G 0,17 0,6 0,12 7,80x10−07 0,4 0,11 3,79x10−04

0,49 0,08 2,54x10−09

rs7016759 8 49,574,969 EFCAB1 T/C 0,83 0,57 0,12 1,87x10−06 0,06 0,11 5,79x10−01

0,3 0,08 2,29x10−04

rs11014166 10 18,748,804 CACNB2 A/T 0,66 0,46 0,09 8,69x10−07 0,28 0,09 1,46x10−03

0,37 0,06 1,24x10−08

rs11024074 11 16,873,795 PLEKHA7 T/C 0,72 −0,50 0,1 2,83x10−07 −0,17 0,09 6,82x10−02

−0,33 0,07 1,20x10−06

rs2681472 12 88,533,090 ATP2B1 A/G 0,83 0,64 0,12 3,74x10−08 0,36 0,12 2,43x10−03

0,5 0,08 1,47x10−09

rs3184504 12 110,368,991 SH2B3 T/C 0,48 0,5 0,09 1,68x10−08 0,45 0,09 2,83x10−07

0,48 0,06 2,58x10−14

rs2384550 12 113,837,114 TBX3- TBX5 A/G 0,35 −0,48 0,09 1,32x10−07

−0,23 0,09 1,06x10−02 −0,35 0,06 3,75x10−08

rs6495122 15 72,912,698 CSK-ULK3 A/C 0,42 0,45 0,09 8,05x10−07 0,35 0,09 3,98x10−05

0,4 0,06 1,84x10−10


53

SNP ID HTA Chr Position

Gen

e à

Allèles

(F/M) FAF Beta e P Beta e P Beta e P

rs1780613 2 190,416,5 PMS1 A/G 0,1 0,14 0, 1,14x10−0 0,04 0,0 2,87x10−0

0,1 0,0 4,70x10−0

rs305489 3 11,986,1 SYN2 A/G 0,5 0,1 0, 4,20x10−0 0,01 0,0 7,75x10−0

0,06 0,0 1,70x10−0

rs7640747 3 37,571,8 ITGA9 C/G 0,6 −0,1 0, 4,81x10−0 −0,0 0,0 4,12x10−0

−0,0 0,0 1,24x10−0

rs1177533 8 10,109,0 MSRA A/G 0,3 0,1 0, 1,03x10−0 0,05 0,0 5,86x10−0

0,08 0,0 4,05x10−0

rs899364 8 11,366,9 54

FAM16

7A-

BLK

T/G 0,3 2

−0,1 0

0, 0 2

6,95x10−0

6

−0,0 4

0,0 3

1,32x10−0

1

−0,0 8

0,0 2

1,01x10−0

5

rs1101416 10 18,748,8 CACNB A/T 0,6 0,11 0, 7,79x10−0 0,07 0,0 1,06x10−0

0,09 0,0 5,72x10−0

rs268147 12 88,533,0 ATP2B A/G 0,8 0,16 0, 1,65x10−0 0,13 0,0 2,15x10−0

0,15 0,0 1,75x10−

rs278126 12 118,620,1 C T/G 0,2 0,11 0, 8,34x10−0 −0,0 0,0 6,72x10−0

0,06 0,0 1,74x10−0

rs1161289 3

12 129,290,5 72

FZD

10- T/G 0,1 −0,1

9 0, 0

7,62x10−0

6

−0,0 4

0,0 6

4,19x10−0

1

−0,1 4

0,0 3

5,50x10−0

5

rs1698252

0

20 57,192,1

15

ZNF8

31-

ED N3

A/G 0,8

8

−0,1

4

0,

0

3

4,95x10−0

6

−0,1

1

0,0

4

7,44x10−0

3

−0,1

3

0,0

2

1,59x10−0

7

La GWAS d’HTA a été réalisée uniquement dans CHARGE consortium.

PAS : pression artérielle systolique, PAD : pression artérielle diastolique, HTA : hypertension artérielle, chr : chromosome, M/F :

mineur/fréquent, FAF : fréquence de l’allèle fréquent, e.s : erreur standard, Beta : coefficient de régression linéaire


Figure 13: Vingt neuf single nucleotide polymorphisms dans 28 loci associés (P≤ 5x10-8

) avec la pression artérielle (d’après (Ehret et al., 2011)

Les valeurs Genome-wide-log10 sont montrées pour la PAS (A) et la PAD (B). Les SNP des loci atteignants le seuil de significativité sont

étiquetés en rouge pour la PAS et en bleu pour PAD. Les SNPs proches des loci non confirmés sont de couleur noire. La ligne horizontale

pointill ée correspond à un P< 2.5x10-8

. Les effets estimés de chaque allèle mineur des 29 SNP associés avec la PAS (rouge) et la PAD (bleu)

54


55

3.2 La part d’ombre de l’héritabilité génétique de l’hypertension artérielle

Les GWAS ont certes mis en évidence un nombre important de nouveaux loci candidats de

régulation de la PA et de l’HTA (jamais une technique n’en avait révélé autant, en si peu de

temps). Cependant, tous les SNPs identifiés avaient un faible effet sur le risque de survenue

d’HTA. Vingt neufs SNPs répertoriés jusqu’à aujourd’hui n’expliquent que 0,9% de la

variabilité de ce phénotype (Ehret et al., 2011). Ce qui laisse 99,1% de part d’ombre ou

‘dark matter’ dans l’étiologie de la PA.

3.2.1 Variants génétiques rares

Une grande partie de «l’héritabilité manquante» pourrait être dévoilée par l’étude des SNPs

rares et de faibles fréquences alléliques. Ce type d’études n'a pas été illustré jusqu'à présent.

Les GWAS classiques ont jusqu’à présent examiné les SNPs fréquents (fréquence allélique>

5% dans la population générale). Ceux ayant de faibles fréquences alléliques (entre 0,5%-

5% dans la population générale) et ceux ayant des fréquences alléliques rares (< 0,5%

dans la population générale), censés avoir un plus grand effet, ont été ignorés.

Contrairement aux SNPs fréquents, qui sont apparus précocement dans l'histoire de

l'humanité, les variants rares sont plus récents et ne sont donc pas répandus

géographiquement. Récemment, le séquençage à haut débit (nouvelle génération) a révélé

une myriade de SNPs rares délétères. La prochaine étape sera d’évaluer leurs associations à

un risque accru de morbidité et mortalité CV de façon à mieux comprendre leurs

implications. L’étude des SNPs rares par GWAS nécessite de très grandes populations

et l’utilisation de méthodes statistiques adaptées. Ces dernières devraient analyser

l’ensemble des variants génétiques dans un locus entier au lieu de tester individuellement

chaque SNP. La prochaine génération de puces à haute résolution rendra cet objectif possible

grâce à une couverture de l’ensemble de l'échelle génomique.

3.2.2 Variabilité du nombre de copies d'un gène

La variabilité du nombre de copies d'un gène ou copy number variation (CNV), désigne en

génétique une forme particulière de polymorphisme dans laquelle le nombre de copies d'un

ou plusieurs gène(s) est variable entre les individus d’une même espèce.


56

La présence de différentes copies de gènes est due aux événements de duplication et de

délétion locaux. Les CNVs sont des régions génomiques rares de grande taille (>500kb) qui

modifient l'expression génique et par conséquent celle des voies moléculaires. Elles pourront

être soumises à la pression de la sélection naturelle. En effet, le CNV modifie la quantité de

protéines produites dans une cellule. L'augmentation ou la diminution du nombre de

copies peut donc être sélectionnée au sein d'une espèce ou d'une population en fonction des

contraintes environnementales ( P e r r y e t a l . , 2 0 0 7 ) . Ainsi, nous observons une

augmentation du nombre de CNVs du gène Amy1 (gène codant pour une enzyme salivaire

responsable de la dégradation de l'amidon) dans les populations humaines ayant un régime

plus riche en amidon. Il semblerait que cette augmentation ait été le fruit de la pression de

sélection ( P e r r y e t a l . , 2 0 0 7 ) . Les CNVs surviennent à une fréquence allélique de <

0,05% et sont présentes dans environ 8% de la population générale, ce qui les rend rares

mais collectivement communes. Les résultats publiés suggèrent que les CNVs modifient

fortement l'expression génique, un évènement moléculaire affectant l'épissage et la

transcription génique.

3.2.3 Interactions gène-environnement

Les interactions gène-environnement (GxE) sont également considérées comme des

éléments clés contrôlant la PA et l’HTA. L’intégration des GxE dans les GWAS pourrait

aider à mettre en évidence de nouveaux loci modifiant le risque d’HTA. Cette stratégie

nécessitera la mise en place de grands consortiums. Au-delà des difficultés habituelles

soulevées par les GWAS, une étude GWAS-GxE doit essentiellement prendre en compte la

taille de l'échantillon, l’évaluation et l’hétérogénéité de l'exposition. Ainsi, les GWAS-GxE

nécessitent de très larges populations. Smith et Day (Smith et Day, 1984) expliquent que

les GWAS-GxE doivent avoir un échantillon au moins 4 fois supérieur à celui nécessaire

pour les GWAS classiques, ceci étant critique pour détecter une interaction GxE d'une

ampleur comparable à celle d’un SNP unique (Smith et Day, 1984). Bien que difficile,

l’étude des interactions GxE nous aidera à mieux comprendre les résultats d’associations

génétiques contradictoires de PA et d’HTA dus à l'exposition hétérogène.


57

3.2.4 Interactions gène-gène (épistasie)

L’épistasie est définie comme une interaction entre deux ou plusieurs loci. Elle est

importante, du fait que son existence peut modifier ou même masquer l'effet d'un locus.

L’épistasie peut également identifier des gènes non trouvés par l’approche consensuelle à

locus unique. Ce concept a été largement revu par les méthodes paramétriques et non

paramétriques qui ont été développées au cours de ces dernières années pour détecter ce type

d’interactions. Selon la littérature, les interactions épistasiques jouent un rôle dans la

prédisposition au cancer et aux maladies auto-immunes. Cependant, leur investigation à

l'échelle génomique (genome-wide coverage), y compris l’étude de tous les SNPs

imaginables, reste un défi crucial en absence de logiciels adaptés et d’une large population.

3.3 Epigénétique

Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus évident que la

compréhension du génome ne s'arrête pas avec l’élucidation du code génétique (Nzietchueng

et al., 2011). Des informations régulatrices sont nécessaires pour déterminer les parties

génomiques actives, et pour former un système de mémoire transmissible au cours des

divisions cellulaires (Feinberg, 2008). Cette information qui sous-tend la régulation

héréditaire des gènes est connue sous le terme épigénétique. L’épigénétique est l’étude des

altérations transmissibles des phénotypes et de l’expression des gènes qui ne s’accompagnent

d’aucune modification des séquences nucléotidiques (Baccarelli et al., 2010). Les

mécanismes sous-tendant les phénomènes épigénétiques font intervenir des facteurs

génomiques flexibles qui peuvent non seulement modifier la fonction du génome en

réponse à l’environnement, mais aussi fournir un substrat moléculaire permettant la

transmission stable de l’expression des gènes d’une génération cellulaire à l’autre (Baccarelli

et al., 2010). Bien que l'épigénétique soit considérée comme un nouveau domaine de

recherche, la première mention de ce terme remonte à plus de soixante ans. En 1942, Conrad

Hal Waddington (1905-1975) a utilisé le terme épigénétique pour décrire ce qu'on appelle

aujourd'hui la biologie du développement (Baccarelli et al., 2010). Il décrit «qu’aussi bien

le phénotype que les propriétés morphologiques et fonctionnelles d'un organisme se posent de

manière séquentielle dans un programme défini par le génome et soumis à l'influence de

l’environnement» (Baccarelli et al., 2010).


58

Le processus épigénétique le mieux connu est la méthylation de l’ADN (mADN), une

mADN est maintenue pendant la division cellulaire, chez les mammifères seulement, aux

dinucléotides CpG, en vertu de l'enzyme ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) (Rao et al.,

2003). Cela se produit du fait que pendant la réplication d'ADN, un dinucléotide CpG

méthylé sur le brin d'ADN parental est apparié à un CpG non méthylé nouvellement

synthétisé sur le brin fils. Par conséquent, la DNMT1 cherche l’ADN hémi-méthylé et

ajoute un groupement méthyle sur le nouveau dinucléotide CpG (Rao et al., 2003).

La mADN est présente au niveau des sites CpG, connue sous le nom methylation variable

position (MVP) et considérée comme l'équivalent épigénétique d'un SNP (Rakyan et al.,

2011). Une fois la mADN altérée dans de multiples sites CpG adjacents, elle est considérée

comme région différemment méthylée ou differentially methylated region (DMR).

Les DMRs varient considérablement en longueur : elles sont généralement de longueur

inférieure à 1kb, mais peuvent dépasser parfois les 1 Mb. Jusqu'à ce jour, les MVPs et les

DMRs ont été principalement étudiés au niveau des promoteurs principaux et des ilôts CpG,

mais il devient de plus en plus clair que la mADN est très dynamique, même en dehors de ces

régions (Rakyan et al., 2011) . Un second exemple bien étudié du processus épigénétique est

la modification de la chromatine, ou plus précisément des modifications covalentes au

niveau des histones qui font partie des nucléosomes, autour desquels la double hélice d'ADN

est enroulée (Feinberg, 2008). Les histones sont de petites protéines pouvant subir une

modification post-traductionnelle au niveau des résidus d’acides aminés spécifiques. Ces

processus modifient la manière dont l’histone considérée interagit avec l’ADN et les autres

protéines nucléaires. En conséquence, selon leur type et la position du résidu d’acide aminé

intéressé, les modifications subies par les histones ont pour effet de réprimer la transcription

ou, au contraire, de l’activer. Contrairement à la mADN, le mécanisme de maintien des

modifications de la chromatine pendant la division cellulaire reste très peu compris (Rao et

al., 2003). Aucune enzyme n’a été identifiée pour pouvoir reconnaître les modifications de la

chromatine de la cellule mère et les reproduire dans la cellule fille (Rao et al., 2003). Un lien

important de l'épigénétique avec l'environnement, est que la source des

groupements méthyle dans cette réaction est la méthionine. Un acide aminé essentiel est

converti en donneur de groupements méthyle par un mécanisme impliquant l'acide folique.

CHAPITREI REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

59

3.3.1 Modèle théorique de l’épigénome cardiovasculaire

L’épigénomique constitue un lien majeur entre le codage génomique et l’expression

phénotypique qui subit l’influence aussi bien des caractéristiques génétiques sous-jacentes

que des facteurs environnementaux (Evans et al., 2006). A la différence du

génome, l'épigénome est soumis, tout au long de la vie, à des modifications dynamiques

pouvant promouvoir et entretenir des états adaptatifs et déviants dans l’expression des

gènes(Evans et al., 2006). Certaines données suggèrent que les facteurs de RCV pourraient

affecter et remodeler les profils épigénomiques (Evans et al., 2006). Ces profils sont

susceptibles de contribuer à la survenue de troubles CV (Evans et al., 2006). L’épigénome

est, par son essence-même, en liaison avec la génétique dans la mesure où les modifications

épigénétiques peuvent altérer l’expression des variations génétiques, lesquelles représentent

l’un des processus clé conditionnant la mADN et les remaniements des histones (Evans et al.,

2006).

3.3.2 Méthylation d’ADN et maladies cardiovasculaires

Les études animales ont démontré que la mADN joue un rôle majeur dans le développement

de l’athérosclérose et des MCV (Evans et al., 2006). Chez les souris privées de gènes qui

codent normalement pour les enzymes méthylantes telles que les DNMT ou la méthylène-

tétrahydrofolate réductase (MTHFR), nous constatons une hypo-mADN. (Evans et al., 2006)

Les leucocytes des souris ne possédant pas de DNMT expriment plus intensément les

médiateurs d’inflammation (Timberlake et al., 2001). Il a également été établi que, chez la

souris dépourvue du gène MTHFR, l’hypo-mADN précède la formation des stries graisseuses

aortiques (Manolio et al., 2009) .

3.3.2.1 Méthylation d’ADN et hypertension artérielle

Plusieurs observations directes et indirectes soutiennent la participation d'une composante

épigénétique dans l’étiologie d’HTA. En effet, dans les leucocytes du sang périphérique des

patients HT, des études ont objectivé une diminution globale des processus de méthylation au

sein du génome (Smolarek et al., 2010) ainsi qu’une hyper-méthylation du gène HSD11B2


69

(Friso et al., 2008). De plus, Il a été établi que l’âge et le sexe influent sur le profil de

mADN (Feinberg, 2008, Bollati et al., 2009), par conséquent, la méthylation différentielle liée

à l’âge et au sexe pourrait modifier la réponse génique face à l’HTA. Cependant, aucune

information concernant le rôle de la mADN dans la régulation de la PA et de l’HTA n’est

dévoilée à l’échelle génomique

3.3.2.2 Hypertension artérielle et transcriptome

Le génome humain contient un ensemble complet des gènes nécessaires à la construction d'un

être humain fonctionnel (Eleftheria, 2011). Toutefois, le génome n'est qu'une source

d'information. Pour fonctionner, il doit être exprimé (Eleftheria, 2011). La transcription d’un

gène pour produire l'ARN constitue la première étape de l'expression génique. Le

transcriptome est donc l'ensemble des transcrits d'ARN produits par le génome à un moment

donné (Eleftheria, 2011). Contrairement au génome, le transcriptome est extrêmement

dynamique. La plupart de nos cellules contient un génome identique quels que soient le type

cellulaire, le stade de développement ou les conditions environnementales (Eleftheria, 2011).

Inversement, le transcriptome varie considérablement dans des circonstances différentes en

raison de différents modèles d'expression génique. L'étude du transcriptome est donc une

manière globale de regarder les profils d'expression génique dans les maladies complexes

(Eleftheria, 2011). Un SNP peut modifier l’expression d’un ou plusieurs transcrits conduisant

au changement d’un phénotype donné (Eleftheria, 2011). Malgré leurs avantages, les études

d’associations SNP-ARNm pourront avoir des résultats discordants, ou même contradictoires

(Eleftheria, 2011). Toutefois, ces associations non répliquées doivent être considérées avec un

œil critique. L’approche transcriptomique apporterait une information intermédiaire entre des

gènes et leurs protéines, une étape essentielle pour identifier des cibles physiopathologiques

d'intérêt thérapeutique dans l’HTA (Eleftheria, 2011).


61

4 Structure des gènes étudiés

4.1 Le gène de la rénine REN

Le gène de la rénine (REN) a été le premier gène du SRA étudié. Bien que plusieurs

polymorphismes aient été identifiés, aucune liaison ou association n’a été mise en évidence

entre le locus de la rénine et l’HTA, chez l’homme (Naftilan et al., 1989, Jeunemaitre et al.,

1992).

4.2 Gène de l’angiotensinogène (AGT)

Le gène de l’angiotensinogène est localisé sur le chromosome 1q42-43, à proximité du gène de

la rénine. Il s’étend sur 12 kpb et comprend 5 exons. Au niveau de la séquence protéique de

l’angiotensinogène, les séquences spécifiques du peptide signal et de l’angiotensine I libérées

par la rénine sont codées par l’exon 2. Deux signaux de polyadénylation sont présents dans

l’exon 5. Ces derniers permettent la synthèse de deux ARNm différant uniquement par la

présence ou l'absence de192 nucléotides en région 3’ non codante. La structure biochimique de

l’AGT est similaire à celles des α1-antitrypsines, α1- antichymotrypsines et antithrombines, ce

qui suggère que ces protéines aient évolué à partir d’un gène ancestral. Si l’AGT appartient à la

famille des serpines (inhibiteurs de sérine protéase), il n’est néanmoins pas certain que l’AGT

possède lui-même une activité d’inhibiteur de sérine protéases (Lautrette et al., 2005). Selon la

base de données du NCBI, le gène AGT présenterait au moins 148 polymorphismes répartis tout

au long du gène (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp). Parmi ces polymorphismes, deux sont

localisés dans l’exon 2 : le polymorphisme T174M (substitution d’une thréonine, en

position174, par une méthionine) et le polymorphisme M235T (substitution d’une méthionine,

en position 235, par une thréonine). Ces deux mutations sont en déséquilibre de liaison

complet, l’allèle 174M étant préférentiellement associé à l’allèle 235T, mais l’estimation de

leur fréquence respective par des méta-analyses montre que la fréquence de l’allèle 235T

(52.1%) est significativement plus élevée que celle de l’allèle 174M (11.0%) (Staessen et al.,

1999). Trois autres mutations (-20A/C, -18C/T et -6G/A) ont été caractérisées dans la partie

proximale du gène, et plus particulièrement dans une région susceptible de modifier la fixation

du facteur de transcription AGCE1 (AngiotensinoGen Core promotor Element binding factor

1). Par contre, d’autres mutations ont été détectées, dans la région promotrice du gène, dont les

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) -1074G/T, -830T/A, -793G/A, -776C/T et-532C/T,

mais aucun des cinq SNPs ne semble être localisé dans une séquence susceptible d’affecter

l’expression du gène. Dans notre travail de thèse, nous avons choisi d’étudier le polymorphisme

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp)


62

AGT M235T et le T174M. Au niveau du gène de l'AGT, cette substitution d'acide aminé est la

conséquence de la transition d’une thymine en cytosine à la position +704 de l’exon 2 (Wang et

Staessen, 2000).

4.3 Gène de l’enzyme de conversion de l’angiotensine I (ACE)

L’enzyme de conversion de l’angiotensine I (ACE), ou kininase II, est une dipeptidyl

carboxypeptidase. Elle joue un rôle important dans la régulation de la pression artérielle par

l’hydrolyse de l’angiotensine I en angiotensine II. Cette enzyme est aussi capable d’inactiver la

bradykinine, qui est considérée comme une protéine vasodilatatrice. Le gène de l’ACE est situé

sur le chromosome 17q23 ; il s'étend sur 12 kpb et contient 26 exons (Rigat et al., 1990). Le

polymorphisme d'insertion/délétion (I/D), le plus étudié, est lié à la présence ou l'absence d’une

séquence Alu de 287 pb dans l’intron 16 du gène de l’ACE. L'association entre ce

polymorphisme et les concentrations plasmatique et tissulaire d’ACE a été démontrée (Rigat et

al., 1990, Costerousse et al., 1993). Ces résultats ont suggéré que le polymorphisme I/D puisse

moduler l’expression du gène d’ACE. Cette hypothèse a été validée par une étude quantitative

par RT-PCR : l’allèle D a été associé à une augmentation de la transcription du gène de l'ACE

comparé à l’allèle I (Suehiro et al., 2004).

4.4 Structure du gène de la eNOS

Marsden et al (1993) furent les premiers à cloner et déterminer l’organisation structurale du

gène codant la eNOS chez l'Homme. Ce gène est localisé sur le chromosome 7q35-36. Il

contient 26 exons et s’étend sur 21 kpb. La taille de l'ARNm est de 4052 nucléotides. La région

promotrice du gène est dépourvue de boîte TATA mais contient des sites de fixation de facteurs

de transcription tel que des motifs GATA. Cette structure est compatible avec l’expression

constitutive du gène eNOS. Plusieurs polymorphismes ont été identifiés dans le gène de la

eNOS, en particulier le polymorphisme +894G/T, localisé dans l’exon 7.

La traduction de cette mutation entraîne le remplacement d'un résidu glutamate à la position

298 par un résidu aspartate. Certains auteurs ont suggéré que cette mutation puisse altérer la

stabilité de la protéine (Tesauro et al., 2000). Par ailleurs plusieurs travaux ont rapporté une

association significative entre ce polymorphisme et le risque de maladies cardiovasculaires. Au

niveau de la région promotrice, un autre polymorphisme, noté786T/C, a été associé au risque de

maladie coronaire dans plusieurs populations (Alvarez et al., 2001, Rossi et al., 2003, Colombo

et al., 2003, Kim et al., 2007). Dans les cellules endothéliales en culture, l’allèle C du


63

polymorphisme -786T/C a été associé à une réduction de 50% de l’activité du promoteur du

gène codant la eNOS (Nakayama et al., 1999).

Objectif du travail :

Notre travail se concentre plus particulièrement sur des gènes candidats susceptibles

d'intervenir dans la régulation de la pression artérielle. Ces gènes codent notamment

l’angiotensinogène (ANG) avec ses deux variants : M235T, T174M, l’enzyme de conversion de

l’angiotensine (ACE), le, la NO-synthase endothéliale (NOS3). La caractérisation de

polymorphismes dans ces gènes nous permet :

d’évaluer l’impact de ces polymorphismes sur le risque de survenue de l’hypertension

artérielle dans la population oranaise ;

de rechercher d’éventuelle interaction entre ces polymorphismes et les facteurs de

risque conventionnels de l’hypertension artérielle.

CHAPITRE II

MATERIELS ET METHODES

CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES

64

I Population à l’étude

I.1 Description de la population étudiée

Une étude rétrospective de type cas-témoin a été entreprise de 2010 à 2011 chez 350 sujets

âgés de 23 à 70 ans, résidant à Oran. Chaque sujet consentant a rempli un questionnaire

concernant l'histoire personnelle et familiale d’exposition aux risques cardiovasculaires et les

principales variables anthropométriques ont été recueillies (taille, poids) (annexe 1). La

pression artérielle a également été mesurée dans les conditions suivantes : deux mesures de

pression artérielle ont été notées pour chaque individu. Le recrutement du groupe des témoins

a été fait au sein du centre de transfusion sanguine de l’hôpital universitaire d’Oran (CHUO).

Pour le groupe des cas hypertendus, le recrutement a été fait au niveau du service de

cardiologie du (CHUO) et de l’hôpital militaire régional universitaire d’Oran (l’HMRUO).

Tous les sujets éligibles étaient des deux sexes. Les sujets présentant une hypertension

secondaire, hypertension gravidique, les personnes présentant des insuffisances rénales, des

maladies hépatiques ou un syndrome inflammatoire ont été exclus de cette étude.

Pour l'ensemble des sujets, cas et témoins, inclus dans l'étude, les prélèvements sanguins ont

permis de réaliser le bilan lipidique ainsi que l’extraction de l’ADN pour les études

génétiques. Le dosage des paramètres lipidiques a été réalisé au laboratoire de biologie

médicale du Dr Chabane Ghaouti. L’extraction de l’ADN a été réalisée au laboratoire de

Biologie Moléculaire et Génétique d’Oran et au laboratoire de génétique artérielle à INSERM

Paris.

II Méthodes

II.1 Analyse des polymorphismes génétiques d’intérêts

II.1.1 Extraction d’ADN

4 à 5 ml du sang totale ont été prélevés par les infermières spécialisées dans des tubes EDTA

et conservé à -20°C jusqu’à l’extraction de l’ADN. L’extraction d’ADN génomique a été

effectuée à partir du sang total à l’aide du kit de STRATEGENE modifié (annexe 2).


65

Le protocole de l’extraction se base sur la technique du Salting-out et comporte les étapes

suivantes :

1. Lyse des globules rouges et lavage des cellules

On décongèle les tubes contenant le sang total et on leur ajoute un volume de solution

de lyse des globules rouges (annexe 2), on mélange par retournement et on agite

pendant 10min ensuite on centrifuge pendant 6 min à 3000trs/min. On vide le

surnageant et on refait cette étape 2 à 3 fois. Après cette étape, on lave les cellules

avec 15ml de solution 1 (annexe 2), on agite pendant 10min ensuite on centrifuge

pendant 6 min à 3000trs/min. On refait cette étape de lavage plusieurs fois jusqu'à

l’obtention d’un culot blanchâtre.

2. Lyse des globules blancs et protéolyse

On reprend le culot avec 1,5 ml de solution 2 (annexe 2) et après on ajoute 4 µl de

pronase (protéinase K 225ng/µl), on remet en suspension le culot et on incube au bain

marie pendant 1h à 65°C. Ensuite, on met les tubes à température ambiante et après on

les met dans la glace pendant 10 min.

3. Précipitation des protéines avec le NaCl et élimination des ARNs

On ajoute 500µl de solution 3 (annexe 2) dans chaque Falcon, on agite bien et on

homogénéise et on laisse dans la glace pendant 30 min, on les répartit dans des

Eppendorf ensuite on les centrifuge pendant 15 mn à 4°C, 10000 trs/min. Le

surnageant est transféré dans un autre tube Falcon auquel est ajouté 2 microlitre

d’RNase, après agitation on les incube à 37°C pendant 15min au bain marie.

4. Précipitation de l’ADN à l’éthanol absolu

On ajoute à la solution 2 × le volume avec l’éthanol absolu (à –20°C), on agite

doucement par retournement, on met à –20°C pendant 1h à 2h. Ensuite, On récupère

la méduse à l’aide d’une pipette Pasteur scellée, on la lave avec de l’éthanol à 70% et

on la place dans un tube Eppendorf. Apres on va la dissoudre dans 200-500µl de TE

10/1. On laisse les tubes à température ambiante pendant au moins 24h sous agitation

lente, pour une dissolution totale.

II.1.2 Etude quantitative et qualitative de l’ADN

La concentration en ADN de l’échantillon est estimée par spectrophotométrie. Les acides

nucléiques présentent un pic d’absorption dans l’UV. Le maximum de cette absorption se situe

à 260 nm. Une unité de densité optique (DO) à 260 nm correspond à une solution homogène


66

d’ADN pur, double brin, de concentration 50 μg/ml. On extrait entre 20 à 30 μg d’ADN/ml de

sang (annexe 3).

II.1.3 Génotypage de la population étudiée

La caractérisation génétique de l’ensemble des polymorphismes des gènes candidats étudiés

dans notre travail a été réalisée par la technique PCR (Polymerase Chain Reaction). La PCR

permet d’amplifier spécifiquement in vitro une ou plusieurs séquences d’ADN spécifiques à

partir d'un échantillon d'ADN, ici génomique (Saïki et al, 1985). Cette amplification

spécifique est obtenue par l’utilisation de deux amorces oligonucléotidiques comprenant le

plus souvent de 15 à 30 nucléotides. Ces dernières, lorsqu’elles sont ajoutées à l’ADN

dénaturé, se fixent spécifiquement aux séquences d’ADN complémentaires flanquant la

région cible, par exemple celle dans laquelle est recherché le polymorphisme étudié. La

synthèse de nouveaux brins d’ADN est assurée par une ADN polymérase thermostable (Taq

polymérase), en présence des quatre désoxyribonucléosides triphosphates constitutifs de

l'ADN : dATP, dCTP, dGTP et dTTP. La PCR est une réaction en chaîne car les brins d’ADN

néosynthétisés servent de matrices pour la synthèse de nouvelles molécules d’ADN au cours

des cycles suivants.

Après environ 30 cycles de synthèse, les produits de la PCR comportent, en plus de l’ADN de

départ, environ 106

copies de la séquence amplifiée, quantité que l’on peut facilement

visualiser, par électrophorèse en gel d’agarose ou de polyacrylamide, sous la forme d’une

bande unique de la taille de la séquence ciblée. L'ensemble de la réaction implique une

succession de cycles de température composés de trois étapes :

une dénaturation de l'ADN matrice, habituellement réalisée à 90°-95° C quand la

matrice est composée d’ADN génomique humain ;

une hybridation des amorces, menée à des températures habituellement comprises

entre50°C et 70°C en fonction de la richesse des amorces en cytosine et guanine ;

une extension des amorces, correspondant à la synthèse de l’ADN, réalisée

habituellement à environ 70-75° C qui correspond à la température optimale de l'ADN

polymérase utilisée.

Après l’amplification de la région polymorphe, la détection du polymorphisme dans la

séquence d'intérêt peut être réalisée par au moins deux techniques : la digestion par une

enzyme de restriction ou l’hybridation d’oligonucléotides spécifiques d’allèles (Allele

Specific Oligonucleotides, ASO). Certes, des techniques de séquençages ou de caractérisation


67

de polymorphismes à haut débit ont récemment fait considérablement évoluer la stratégie de

recherche de mutations. Toutefois, ces techniques restent d'un accès, notamment économique,

encore limité.

Après l’amplification de la région polymorphe, la détection du polymorphisme dans la

séquence d'intérêt peut être réalisée par au moins deux techniques : la digestion par une

enzyme de restriction qui est technique qui permet de détecter des polymorphismes de site de

restriction (RSP) à l’aide d’enzyme de restriction et la PCR nichée qui se base sur l’utilisation

de deux jeux de cycles d’amplification avec 4 amorces, désignées amorces externes et

internes. En général, les épreuves de PCR nichée procurent une sensibilité et une spécificité

analytiques supérieures par rapport aux épreuves de PCR conventionnelles.

II.1.3.1 Détection du polymorphisme T174M de l’AGT par

PCR-RFLP

Le génotypage du polymorphisme T174M d e l ’ A G T a été effectué en utilisant la

réaction de polymérisation en chaine, en utilisant des amorces spécifiques, suivi d’une

digestion enzymatique (PCR-RFLP). Cette technique utilise des amorces spécifiques, dont

la séquence anti-sens est : (5’-CAG CCT GCA TGA ACC TGT CAA TCT-3’) et la

séquence sens est : (5’-TGG CAC CCT GGC CTC TCT CTA TCT-3’). La réaction de PCR

a été effectuée dans un volume final de 25μl, contenant 200 ng d’ADN, dNTP (0.2 mM ),

amorce sense et amorce anti-sense (0,2 μM), 75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)

2SO4, 0.01% Tween 20,et 0.2 U de Taq DNA polymerase (Fermentas Life Sciences).

L’amplification de l’ADN s’est effectuée dans un thermocycleur (Master cycler, Eppendorf,

Germany). Le profil thermique retenu a été adapté à partir de la littérature (Hilgers et al,

1999). Il s’agit d’un protocole touch down qui utilise une température d’hybridation

supérieure de 5°C à la Tm des amorces. Cette température est ensuite diminuée d’1°C par

cycle jusqu’à atteindre une température optimum. Cette technique permet d’augmenter la

spécificité de la PCR.

Pré-dénaturation 5' à 95°C

Dénaturation 40’’ à 95°C

Hybridation 1' à 65°C (-1°C jusqu'à 55°C)

Elongation 40’' à 72°C

Elongation terminale 10' à 72°C

37cycles

Apres vérification de la bonne qualité de l’amplification par migration des amplicons sur gel

d’agarose à 2%, les produits PCR ont été digérés par NcoI (TAKARA, Japan) selon les


68

conditions expérimentales suivantes :


69

Volume de 25µl :

0.5µl (NcoI)

15µl produit PCR

2µl BSA (Albumine de sérum bovin)

2µl Tampon de digestion

qH20

Ensuite, ce volume réactionnel est incubé à 37°C pendant 2 heures. Après incubation, la

réaction de digestion est arrêtée par un réactif spécial fourni avec l’enzyme.

II.1.3.2 Détection du polymorphisme M235T de l’AGT par

PCR-RFLP

La détection de ce polymorphisme a aussi été faite par PCR en utilisant la séquence des

amorces suivantes : amorce sens 5’CCGTTTGTGCAGGGCCCTGGCTCTCT3’et l’amorce

anti sens 5’CAGGGTGCTGTCCACACACTGGACCCC3’dans un milieu réactionnel de 25µl

contenant 500 ng d’ADN, 0, 2 μM de chaque amorce, 0.2mM de dNTP, 67mM Tris-HCl

(pH=8.8), 16mM (NH4)2SO4, 0.01%Tween 20, 1.5mM MgCl2 and 1.25 U de Taq polymerase

(Ozyme, France). L’amplification s’est déroulée dans un thermocycleur de type Eppendorf

avec le programme suivant :



Hybridation 1' à 68°C (-1°C jusqu'à 58°C)

Elongation 40’' à 72°C


35 cycles

Les fragments amplifiés sont analysés par une électrophorèse sur gel d’agarose 2 % en TBE

1X. La bande correspondante à la séquence amplifiée est visualisée directement en lumière

UV grâce à la présence dans le gel du BET. Après vérification de la bonne qualité de

l’amplification, les amplicons sont digérés par une enzyme de restriction Tth111I (TAKARA,

Japan) en utilisant le milieu réactionnel suivant :


70

Pour un volume de 25µl :

5 Unités de Tth111I

15µl produit PCR

2µl BSA (annexe)

2µl Tampon de digestion

qH20

On incube ce mélange réactionnel à 37°C pendant 1h.

II.1.3.3 Détection du polymorphisme ACE I/D par Nested PCR

La caractérisation de ce polymorphisme a été effectuée par PCR nichée en utilisant le premier

couple d’amorces dont les séquences sont les suivantes : 5’-

CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’et 5’-

GATGTGGCCATCACATTCGTCACGTCAGAT 3’ et avec le même milieu réactionnel que le

M235T. Le programme de l’amplification etait le suivant:


Dénaturation 1’ à 94°C

Hybridation 40’' à 58°C

Elongation 1’ à 72°C


35 cycles

Un autre couple d’amorce a été utlisé pour les personnes ayant un génotype DD. Les

séquences des amorces sont comme suit : 5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC3’ et 5’-

TCGCCAGCCCTCCCATGCCC-ATAA-3’. L’utilisation de ce couple d’amorce est pour

éviter la confusion entre les hétérozygotes ID et les homozygotes DD (Shanmugam et al.,

1993). Le programme de PCR utilisé est le suivant:



Hybridation 45’' à 67°C

Elongation 2’ à 72°C


30 cycles


70

Prédénaturation : 96°C 7 min

Dénaturation : 96°C

Hybridation :58°C

45 sec

45 sec

35 cycles

Elongation : 72°C 45 sec

Elongation finale : 72°C 7 min

Avec ces conditions, nous obtiendrons un amplicon de 335 bp pour la presence de l’allele I et

absence d’amplicon pour l’allele D (Ramachandran et al., 2008).

II.1.3.4 Détection du polymorphisme NOS -786T/C par PCR/RFLP

Le génotypage des sujets de l'étude pour le polymorphisme -786T/C a été réalisé par PCR-

RFLP au laboratoire de génétique des maladies artérielles à l’INSERM (Paris) dirigé par Pr

Xavier Jeunemaitre et sous la supervision du Dr Nabila-Bouatia Naji. Les séquences des

amorces utilisées sont les suivantes : 5’-CACAGAACTACAAACCCC-3’ et 5’-

GCAGGTCAGCAGAGAGACTA -3’ dans un milieu réactionnel contenant une concentration

de 5µM de chaque amorce, une concentration de 25ng/µl d’ADN et d’un master mix de type

Red'Y'Star (Eurogentec). L’amplification s’est déroulée dans un thermocycleur de type

Eppendorf avec le programme suivant :

L’amplification de l'ADN était suivie d'une étape de digestion par l’enzyme de restriction

MspI (5U) dans un volume réactionnel de 20 µl contenant :

Msp I (5U) 1µL

Tampon 10X 2 µL

BSA 0.1% 2 µL

EUP 5 µL

Produit PCR 10 µL

On incube à 37°C pendant 3H, on arrête après la digestion à 80°C pendant 20 min

II.1.4 Lecture des génotypes et exploitation des résultats épidémio-génétiques

Apres la digestion par les enzymes de restriction pour les polymorphismes M235T et T174M,

NOS -786C/T et l’amplification pour ACE I/D, les fragments obtenus ont été déposés dans

un gel d’agarose à 2 % additionné du BET pour le M235T, T174M, ACE I/D (150V pendant

50 min) et sur un gel d’agarose à 3% pour NOS -786C/T (200V pendant 1H). Pour bien

évaluer la taille des fragments obtenus, nous avons utilisés un marqueur de taille de 50 pb

(Biolabs) et « O’Gene RulerTM»

. Après migration, le gel était directement lu sur une plaque


71

UV, ce qui permettra de visualiser les produits de digestion enzymatiques et la lecture des

génotypes, les allèles dont ; 174T, 235M,-786C, correspondent à l’allèle sauvage et les allèles

174M, 235T,-786T, correspondent à l’allèle muté, tandis que l’allèle I correspond à l’insertion

d’une séquence d’Alu de 287pb et l’allèle D correspond à la délétion de la même séquence.

L’exploitation des résultats de l’analyse épidémio-génétique a été faite par des méthodes

statistiques dont les statistiques descriptives qui ont été utilisées pour analyser toutes les

variables étudiées tels que : les caractéristiques socio-démographiques, mesures

anthropométriques, les paramètres biologiques ainsi que la fréquence des polymorphismes

étudiés. Les résultats sont présentés en ± écart type. Nous avons vérifié la distribution

gaussienne de la population étudiée en utilisant les tests de Skewness and kurtosis et Shapiro-

Wilk. Le test t de Student et l’analyse de la variance (ANOVA) sont utilisés pour comparer

les moyennes des variables entre deux échantillons indépendants ou le test de Mann-Whitney

pour les variables n’ayant pas une distribution normale. Des tableaux croisés de contingence 2

x 2 ont été établis pour le calcul des Odds Ratio (OR). Le test du Khi carré a été utilisé pour

vérifier l’équilibre de de Hardy-Weinberg chez les cas et les témoins oranais et afin de

déterminer les différences entre les variables qualitatives dichotomiques, entre patients et

témoins ainsi qu’entre les hommes et les femmes en codant les variables avec des chiffres. Ce

dernier test a contribué à la comparaison des fréquences alléliques et génotypiques entre

groupes ainsi que l’éventuelle association des polymorphismes étudiés avec l’HTA. Afin de

mesurer la force de l’association, nous avons pris en considération le coefficient phiɸ et le V

de Cramer ainsi que le coefficient de contingence. Pour augmenter la puissance statistique des

différents tests, les sous-groupes de génotypes de l’allèle rare ont été regroupés. L’association

des différents polymorphismes avec le risque d’HTA a été évaluée par l’analyse de régression

logistique. L’étude de l’éventuelle association entre deux variables quantitatives a été faite par

le test de corrélation en prenant en compte le coefficient de corrélation de Bravais-Pearson.

L’effet des génotypes sur les pressions artérielles a été évalué avec le model linéaire

généralisé avec un ajustement sur le sexe, âge et IMC. Le model de régression linéaire

multiple a été fait avec PAS, PAD comme variable dépendantes et le sexe âge, IMC et

génotypes comme variable indépendantes. Pour tous les tests une valeur de P˂0.05 est

considéré comme statistiquement significative. L’analyse statistique a été réalisée par le SPSS

17.

72


I RESULTATS

I.1 Caractéristiques socio-démographiques et cliniques de la population étudiée

(T174M de l’AGT)

Afin de chercher l’éventuelle association entre le polymorphisme génétique T174M de

l’angiotensinogène et l'hypertension artérielle essentielle dans un échantillon de la population

algérienne de la ville d’Oran, un total de 350 individus comprenant 180 hypertendus et 170

témoins a été impliqué dans cette étude et les caractéristiques générales de la population

étudiée sont présentées dans le (tableau V, page 73). D’après ce tableau, nous remarquons que

44.4 % des hypertendus sont des hommes et 55.5 % sont des femmes, tandis que chez les

témoins 47.05 % sont des femmes et 52.94 % sont des hommes, cette différence n’est pas

statistiquement significative (P>0.05) entre les cas et les témoins. Une différence

statistiquement significative entre les hypertendus et les témoins a été constatée en ce qui

concerne l'âge, la pression artérielle systolique (PAS) et diastolique (PAD), l’indice de masse

corporelle (IMC) ainsi que les antécédents familiaux d’HTA(P˂0.0001). Cependant,

aucune différence statistiquement significative n’a été rapportée entre les cas et les témoins en

termes de glycémie, cholestérol total, HDL-C, LDL-C, TG (P > 0.05).

I.1.1 Etude de la corrélation entre les différents paramètres cliniques de la population

étudiée (T174M de l’AGT)

I.1.1.1 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et l’IMC

Les tests de corrélation de Pearson-Bavarois et de régression linéaire ont été utilisés afin de

déterminer le degré de liaison entre les variables dépendantes dont la pression artérielle

systolique et diastolique d’une part et l’indice de masse corporelle d’autre part chez les

hypertendus et les témoins, les résultats sont rapportés dans les tableaux (VI, VII, page 73) et

les figures (14, 15, 16, 17, page 74). Une absence de multi-colinéarité a été observée d’après

les tableaux ci-dessous entre les variables étudiées étant donné que le VIF est inférieur à 10 et

que la valeur du test de Durbin-Watson est proche de 2, ceci montre aussi que les résidus ne

sont pas corrélés et que le modèle de régression est valide. En ce qui concerne l’association

entre les variables explicatives et expliqués, nous observons que la valeur du R2

n’était pas

importante dans le tableau VI, VII ajouté à la valeur du coefficient Beta qui est inférieure à

0.29, ce qui montre l’effet faible de l’IMC sur la pression artérielle systolique et diastolique.

73


Tableau V: Les caractéristiques générales de la population étudiée (T174M)

Paramètres Hypertendus

(n=180)

Normotendus P

(n=170)

Sexe, Homme/Femme 80/100 90/80 NS

Age (ans) 50.14±2.1 47.02±3.2 P˂0.0001

IMC (Kg/m2

) 28.29±2.38 25.55±3.41 P˂0.0001

PAS (mmHg) 134.04±11.21 119.06±7.86 P˂0.0001

PAD (mmHg) 80.97±9.28 69.82±7.11 P˂0.0001

Histoire familiale

d’hypertension (%)

120 (66.6%) 30 (17.64%) P˂0.01

Glycémie (mmol/L) 3.4±0.7 3.1±0.8 NS

CT (mmol/L) 5.2±0.8 5.4±0.2 NS

LDL-C (mmol/L) 2.9±0.03 2.7±0.05 NS

HDL-C (mmol/L) 1.2±0.02 1.3±0.04 NS

TG (mmol/L) 1.4±0.4 1.4±0.5 NS Valeurs sont présentées en ± écart type. PAS, PAD; pression artérielle systolique et diastolique ; IMC ; Indice de masse corporelle; TG,

triglycerides; TC , cholesterol total l; HDL-C, high density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low density lipoprotein cholesterol; NS, non

signifiant.

Tableau VI : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle systolique et

l’indice de masse corporelle (T174M)

R R2

Sig Coeffici VIF t P Coefficient Durbin-

ent Beta (ANOVA) de Pearson- Watson

Bavarois Coef

Hypertendus 0,150a 0,023 0.044 -,150 1,000 -2,024 0.044ɯ

-,150* 2.134

n=180

Normotendus 0,044 a

0,002

0,571

0,044

1,000

0,568 0,571 ɯ

0,044

1.89

n=170

Tableau VII : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle diastolique et

l’indice de masse corporelle (T174M)

R R2

Sig Coeffici

ent Beta

VIF t P

(ANOVA)

Coefficient

de Pearson-

Durbin-

Watson

Hypertendus 0,094a

0,003

0.211

-,366

1,000

-1,257

0.211ɯ

Bavarois

-,094

Coef

1.69

n=180

Normotendus 0,045 a 0,002 0,560 -,045 1,000 -,558 0,560 ɯ -,045 1.80

n=170

74


Figure: La corrélation entre la PAS et l’IMC chez les hypertendus et les témoins

Figure 14 : La corrélation entre la PAS et

l’IMC chez les hypertendus (T174M)

Figure 15 : La corrélation entre la PAS et l’IMC

chez les témoins (T174M)

Figure 16 : La corrélation entre la PAD et

l’IMC chez les hypertendus (T174M)


l’IMC chez les témoins (T174M)

75


I.1.1.2 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et les antécédents

familiaux d’HTA (T174M)

Le modèle de régression linéaire généralisé accompagné d’une ANOVA ont été utilisés dans

l’objectif de déterminer l’influence des antécédents familiaux d’HTA sur l’augmentation de la

pression artérielle systolique et diastolique, et les résultats sont rapportés dans les tableaux

(VIII, IX, page 76) et les figures (18 et 19, page 77). La validité du modèle de régression a

été confirmée à travers la valeur du test de Durbin-Watson et l’absence de multicolinearité

entre les variables. Cependant, nous observons une absence de liaison entre l’augmentation de

la pression artérielle systolique et diastolique avec la présence des antécédents familiaux

d’HTA malgré leur forte prévalence dans l’échantillon étudié, ceci est confirmé par la non

significativité du P de l’ANOVA ainsi que les coefficients de régression.

I.1.2 Comparaison des fréquences génotypiques entre cas et témoins (T174M)

Afin d’étudier l’impact du polymorphisme T174M du gène de l’AGT sur le risque de

survenue de l’hypertension artérielle, nous avons comparé la fréquence des trois génotypes de

ce polymorphisme entre 180 hypertendus et 170 témoins. Pour augmenter la puissance

statistique des différents tests, les sous-groupes de génotypes de l’allèle rare ont été regroupés

(tableau X, page 76). Selon ce tableau, la fréquence du polymorphisme T174M de

l’angiotensinogène dans tous les sujets était de 60.2 % pour les homozygotes pour l’allèle

sauvage (64.4 % pour hypertendus et 55.8 % pour normotendus) et 20 % pour les

hétérozygotes (20.5 % pour hypertendus et 19.4 % pour normotendus) et enfin 19.4 % pour

les homozygotes pour l’allèle muté (15 % pour hypertendus et 24.7 % pour normotendus).

Dans la présente étude, la distribution des fréquences alléliques et génotypiques du

polymorphisme T174M du gène de l’AGT est dans l'équilibre de Hardy-Weinberg.

Néanmoins, aucune différence statistiquement significative de la distribution des fréquences

génotypiques entre cas et témoins n’a été trouvée (tableau X) (OR=1.05; 95%CI [0.583-

1.932]; X2

=5.298; P > 0.05; TT : 64.4 %; TM : 20.5 %; MM 15 % contre. TT 55.88 %; TM

19.41; MM : 24.70) de même pour les fréquences alléliques pour allèle T (0.74 contre 0.66) et

pour allèle M (0.26 contre 0.34) chez les hypertendus et les témoins respectivement. La

(figure 20, page 78) montre le profile electrophoretique de l’ADN amplifié des hypertendus

et des témoins après digestion enzymatique avec Nco I. Les sujets avec la bande 353pb

représentent l’allèle TT, ceux avec les bandes 353pb, 155pb et 198pb représentent l’allèle

MT.

76


Tableau VIII : Corrélation entre la PAS et les antécédents familiaux d’HTA (T174M)

R R2

Sig Coefficient Beta

VIF t P (ANOVA) Durbin-

Watson

Coef

Hypertendus 0,044a 0,002 0.561 0,566 1,000 0,546 0.561

ɯ 2.103

n=180 Normotendus 0,122 0,009 0,114 -2,50 1 ,000 -1,587 0,114

ɯ 1.934

n=170 a

Tableau IX : Corrélation entre la PAD et les antécédents familiaux d’HTA(T174M)

R R2 Sig Coefficient Beta

VIF t P (ANOVA) Durbin- Watson

Coef

Hypertendus 0,005a ,000 0.946 0,044 1,000 0,582 0.946

ɯ 1.666

n=180 Normotendus 0,070 0,005 0,367 0,070 1 ,000 0,904 0,367

ɯ 1.805

n=170 a

Tableau X: La distribution du polymorphisme T174M chez les cas et les témoins

Population n Distribution Génotypique (%) Fréquence Allélique

TT TM MM T M

Hypertendus 180 116 37(20.5%) 27(15%) 0.74 0.26

(64.4%)

Normotendus 170 95(55.8%) 33(19.4%) 42(24.7%) 0.66 0.34

X2

Value X2 =5.298 X

2 =4.124

P Value P>0.05 P>0.05

TT TM+MM X2

OR

HTN 116 (64.4%) 64 (35.55%)

NT 95(55.8%) 75 (44.11%)

X2 = 2.46

P>0.05

1.41 :0.92-2.16

77


Figure 18 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les hypertendus

(T174M)

Figure 19 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA chez les

témoins (T174M)

78


M TT MT

353pb

155pb

198pb

Figure 20 : Profile électrophorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique par Nco I (T174M)

M : Marqueur de taille.

MT : Hétérozygote (puit 1,4)

TT : Homozygote pour l’allèle sauvage (puit 2 ; 3, 4,5)

79


I.1.2.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du

polymorphisme T174M

Nous avons aussi évalué l'effet du sexe sur la distribution génotypique chez les cas et les

témoins (tableau XI, page 80). Aucune différence statistiquement significative n’a été

constatée entre les génotypes des hommes et des femmes chez les cas et les témoins (X2

=3.745; P>0.05).

I.1.2.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA (T174M)

Une forte prévalence des antécédents familiaux d’HTA (ATCDFHTA) a été observée chez les

hypertendus comparés aux normotendus (66.6% vs 64%) et afin de savoir s’il existe une

association entre les génotypes et les ATCDF HTA, le test du chi carré a été utilisé et les

résultats sont présentés dans le (tableau XII, page 80). D’après ce tableau, aucune différence

statistiquement significative n’a été rapportée entre les génotypes et la présence ou l’absence

d’antécédents familiaux d’HTA.

I.1.2.3 Corrélation entre les différents génotypes et les paramètres cliniques étudiés

(T174M)

A l’aide du modèle linéaire généralisé et du test d’One Way ANOVA, l’influence des

génotypes sur certains paramètres cliniques dont la PAD, PAD, âge, IMC a été estimée et les

résultats sont présentés dans le (tableau XIII, page 80) où aucun des génotypes n’est associé à

une augmentation des paramètres cliniques cités ci-dessous (P>0.05).


80

Tableau XI : Distribution des génotypes selon le sexe chez les hypertendus et les témoins

(T174M)

Génotypes Hypertendus Normotendus Total

Homme Femme Homme Femme Homme Femme

MM 10 17 32 10 42 27

MT 14 23 18 15 32 38

TT 56 60 40 55 96 115

Total 80 100 90 80 170 180

X2

Value X2 =3.745

P Value P>0.05

Tableau XII : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (T174M)

Génotypes

Hypertendus Normotendus

Absence

TT

48

TM

6

MM TT

6 76

TM MM 33 31

Présence 68 31 21 19 0 11

X2

X2=9,758 X

2=9.543

P P=0.008 P=0.008

Tableau XIII : Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (T174M)


TT

TM

MM

P

TT

TM (n=33)

MM

P

(n=116) (n=37) (n=27) (n=95) (n=42)

Age 50.55±0.74 50.62±1.62 47.70±1.53 0.22 40.35±

10.25

39.58±8.14 39.74 0.902

PAS 133.07±1.03 134.13±1.83 138.03±2.14 0.114 118±7.93 121.21± 119.76± 0.103

7.39 7.80

PAD 80.28±0.28 83.73±1.51 80.11±1.77 0.17 69.47±7.34 69.69±7.82 70.71±6.01 0.640

IMC 28.21±0.22 28.08±0.39 28.94±0.45 0.22 25.43±3.41 25.92±3.44 25.53±3.47 0.779


81

I.2 Caractéristiques socio-démographiques et cliniques de la population

étudiée (M235T/ACEI/D)

Dans l’objectif de vérifier l’association entre ces deux polymorphismes avec l’HTA, un

échantillon de 75 hypertendus et 70 témoins, caractérisé par une forte prévalence

d’antécédents familiaux d’HTA a été sélectionné et les caractéristiques de cet échantillon sont

représentées dans le tableau (XIV, page 82). Aucune différence statistiquement significative

n’a été observée entre les cas et les témoins concernant le sexe, l’IMC, la glycémie,

triglycérides, cholestérol total, LDL-C, HDL-C. Cependant, nous observons une différence

statistiquement significative entre les cas et les témoins en termes de PAS, PAD, ATCDF

HTA et âge.

I.2.1 Etude de la corrélation entre les différents paramètres cliniques de l’échantillon

étudié (M235T/ACEI/D)

I.2.1.1 Corrélation entre la pression artérielle systolique, diastolique et l’IMC

(M235T/ACEI/D)

Afin de déterminer le facteur biaisant qui contribue à l’augmentation de la pression artérielle,

un test de corrélation entre certains paramètres cliniques a été effectué, et les résultats sont

présentés dans les (tableaux XVI, XVII, page 82) et les figures (21, 22, 23, 24, page 83).

D’après ces tableaux, nous confirmons la validation du modèle de régression linéaire mais

nous avons remarqué une absence de corrélation entre la PAS, PAD et l’IMC.


82

Tableau XIV: Les caractéristiques de l’échantillon étudié (M235T/ACEI/D)

Parameters Hypertendus

(n=75)

Normotendus P

(n=70)

Sexe,

Homme/Femme

30/45 45/25 NS

Age (ans) 48.14±1.5 43.10±1.4 P˂0.0001

IMC (Kg/m2) 24.29±1.20 21.32±2.31 NS

PAS (mmHg) 154±9.8 112±5.6 P˂0.0001

PAD (mmHg) 90.97±5.18 71.82±7.11 P˂0.0001

ATCDF d’HTA (%) 40(53.33%) 10 (14.28%) P˂0.01

Glycémie (mmol/L) 2.5±0.1 2.7±1.2 NS

CT (mmol/L) 5.1±0.8 5.2±0.1 NS

LDL-C (mmol/L) 2.6±0.07 2.5±0.03 NS

HDL-C (mmol/L) 1.1±0.04 1.4±0.02 NS

TG (mmol/L) 1.2±0.5 1.3±0.4 NS Valeurs sont présentées en ± écart type. PAS, PAD; pression artérielle systolique et diastolique ; IMC ; Indice de masse corporelle; TG,

triglycerides; TC , cholesterol total l; HDL-C, high density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low density lipoprotein cholesterol; NS, non

signifiant.

Tableau XV : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle systolique et

l’indice de masse corporelle (M235T/ACEI/D).

R R2

Sig Coefficient

Beta VIF t P

(ANOVA)

Coefficient de

Pearson-

Bavarois

Durbin-

Watson

coef

Hypertendus

n=75

Normotendus

n=70

,051 ,003 ,663 ,051 1,000 ,437 ,663a

,051 1.755

,197 ,039 ,103 ,197 1,000 1,655 ,103a

,197 1.715

Tableau XVI : Corrélation et régression linéaire entre la pression artérielle diastolique et

l’indice de masse corporelle (M235T/ACEI/D)

R R2

Sig Coefficient

Beta VIF t P

(ANOVA) Coefficient

de Pearson-

Bavarois

Durbin-

Watson

coef

Hypertendus

n=75

,154a

0,024 ,187 -1,254 1,000 - 1,331

,187a

,-154 1.084

Normotendus

n=70

,225a

,051 ,061a

,225 1,000 1,902 ,061a

,225 1.245


83

Figure 21 : La corrélation entre la PAS

et l’IMC chez les hypertendus

(M235T/ACEI/D)

Figure 22 : La corrélation entre la PAS

et l’IMC chez les témoins

(M235T/ACEI/D)

Figure 23 : La corrélation entre la PAD

et l’IMC chez les témoins

(M235T/ACEI/D)


l’IMC chez les hypertendus

(M235T/ACEI/D)


84

I.2.1.2 Corrélation entre les pressions artérielles systolique et diastolique et les

antécédents familiaux d’HTA (M235T/ACEI/D)

Dans l’objectif de déterminer l’influence des antécédents familiaux d’HTA sur

l’augmentation de la pression artérielle systolique et diastolique, nous avons utilisé un modèle

de régression linéaire généralisé accompagné d’une ANOVA et les résultats sont représentés

dans les tableaux (XVII, XVIII, page 85) et les figures suivantes (25, 26, page 86). D’après

les tableaux et les figures ci-dessus, nous confirmons la validité du modèle de régression

linéaire avec une corrélation entre la présence d’antécédents familiaux d’HTA et

l’augmentation de la PAS et PAD, P˂0.05 (tableau XVII, XVIII, page 85). Néanmoins, cette

influence est très infime, étant donné que le R2

chez les hypertendus est de 0.15, ce qui

explique seulement 15% la variabilité de la PAS et 0.6% la variabilité de la PAD.

I.2.2 Comparaison des fréquences génotypiques entre cas et témoins (I/D ACE et

M235T).

I.2.2.1 Le polymorphisme I/D du gène d’ACE

Le tableau XIX présente la distribution des fréquences génotypiques et alléliques du

polymorphisme ACE I/D chez 75 cas et 70 témoins oranais. Pour augmenter la puissance

statistique des différents tests, les sous-groupes de génotypes de l’allèle rare ont été regroupés.

Selon le (tableau XIX, page 86) la fréquence du polymorphisme de l’ACE I/D dans tous les

sujets était 65.34 % pour l’allèle homozygote sauvage (33.33 % pour hypertendus et 61.42 %

pour normotendus) et 61.40 % pour l’allèle hétérozygote (53.33 % pour hypertendus et 35.71

% pour normotendus), 11.15 % pour l’allèle homozygote pour l’allèle muté (13.33 % pour

hypertendus et 2.85 % pour normotendus). Dans la présente étude, la distribution génotypique

de l'ACE I/D dans la population algérienne diffère significativement entre les cas et les

témoins (tableau XIX) (X2

=13.98, P ˂ 0.05; II : 33.33 %; ID: 53.33 %, DD : 13.33 % chez

les hypertendus contre II : 61.42 %; ID: 35.71 %; DD : 2.85 % pour les témoins). Le même

résultat positif a été observé pour les fréquences alléliques (OR=0.456; 95%CI [0.275-0.755];

X2 =12.66; P ˂ 0.05) avec une fréquence pour l’allèle I de 0.60 contre 0.78 et pour l’allèle D

de 0.40 contre 0.20 chez les cas et contrôles respectivement. La (figure 27, page 87) montre le

profile électrophorétique des ADN d’hypertendus et des témoins. Les sujets avec la bande

494pb représentent l’allèle II, ceux avec les bandes 494pb, 190pb représentent l’allèle ID.

Ceux avec la bande 190pb, représentent l’allèle DD.


85

Tableau XVII: Corrélation entre la PAS et les antécédents familiaux d’HTA

(M235T/ACEI/D)

R R2

Sig Coefficient

Beta VIF t P (ANOVA) Durbin-

Watson coef

Hypertendus ,393 ,154 ,000 ,393 1.000 3.64 ,000 1.239 n=75 Normotendus

,181

,033

,033

-,181

1.000

-1.514

,033

1.247

n=70

Tableau XVIII : Corrélation entre la PAD et les antécédents familiaux d’HTA

(M235T/ACEI/D)

R R2

Sig Coefficient

Beta VIF t P (ANOVA) Durbin-

Watson coef

Hypertendus

n=75

Normotendus

,081

,021

,006

,000

,000

,864

,081

-,021

1,000

1,000

,691

-,172

,000

,000

1.781

1.716

n=70

Tableau XIX : Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme ACE I/D entre

cas et témoin

Génotypes

HTN

(n=75)

n(%)

NT

(n=70)

n(%)

II 25(33.33) 43 (61.42)

ID 40 (53.33) 25(35.71) DD 10(13.33) 2 (2.85)

P X2=13,982

P=0.001*

Alleles I 90 (60) 111(79.28) D 60(40) 29 (20.71)

X2

value

P

Odds ratio

(95% Intervalle de confiance)

X2= 12.661

P=0.0002*

0.456 (0.275-0.755)

II 25(33.33) 43 (61.42)

ID+DD 50(68.66) 27 (38.56)

P P˂ 0.05

Odds ratio 5.23 (1.1-24.27)

(95% Intervalle de confiance)


86

Figure 25 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA

chez les hypertendus (M235T/ACEI/D)

Figure 26 : La corrélation entre la PAS et les ATCDFHTA

chez les témoins (M235T/ACEI/D)


87

MT 1 2 3 4 5 6 7 8

494p

b

190pb

Figure 27 : Profile électrophorétique sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification de

l’ACE I/D


ID : Hétérozygote (puit 2,7)

II : Homozygote pour l’allèle sauvage (puit 3,5, 6, 8)

DD : Homozygote pour l’allèle muté (puit 1, 4)


88

I.2.2.1.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du

polymorphisme ACE I/D

Le tableau XX représente la distribution du polymorphisme ACE I/D parmi les hommes et

femmes chez les cas et les témoins. Selon ce tableau, aucune différence statistiquement

significative n’est constatée par rapport aux fréquences génotypiques entre les hommes et les

femmes malgré la forte prévalence de l’allèle D chez les femmes hypertendus comparée aux

hommes (P > 0.05) (Tableau XX, page 89).

I.2.2.1.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA

(ACEI/D)

Lors de cette étude, nous avons trouvé que 53.33% des hypertendus avaient des antécédents

familiaux d’HTA (ATCDFHTA) contre seulement 14.28% chez les normotendus et afin de

savoir s’il existe une association entre les génotypes et les ATCDF HTA, nous avons utilisé le

test du chi carré et les résultats sont rapportés dans le (tableau XXI, page 98) où une

différence significative entre cas et témoins a été observée selon les génotypes et les ATCDF

HTA. Cependant la présence d’antécédents familiaux d’HTA n’est pas associée à la présence

de l’allèle polymorphe.

I.2.2.1.3 Corrélation entre les différents génotypes et les paramètres cliniques étudiés

(ACE I/D)

Le modèle général linéarisé et le test de One Way ANOVA, ont permis d’estimer l’influence

des génotypes sur certains paramètres cliniques dont la PAD, PAD, âge, IMC et les résultats

sont présentés dans le (tableau XXII, page 98). D’après ce tableau, nous observons une

différence statistiquement significative entre les génotypes pour la PAS et l’IMC pour les cas

et les témoins, PAD pour les cas seulement et enfin aucune différence statiquement

significative entre les génotypes pour la variable « âge ».


89

Tableau XX: Distribution allélique du polymorphisme ACE I/D chez les hommes et les

femmes

Allèles

HTN NT

(n=75) (n=70)

Homme Femme Homme Femme

I 18 17 23 12 D 12 28 22 13

X2

value

Signifiance

X2= 3.571 X

2 = 0.062

P= 0.05 P=0.80

Tableau XXI : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (ACEI/D)

Génotypes

II

HTA

ID

DD

II

NT

ID

DD

Absence 0 25 10 33 25 2

Présence 25 15 0 10 0 0

X2 37.33 7.326

P 0.000* 0.026*

Tableau XXII : Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (ACE I/D)


II

(n=25)

ID

(n=40)

DD

(n=10)

P

II

(n=43)

ID

(n=25)

DD

(n=2)

P

Age 49±8.10 49±7.95 42.50±8.59 0.067 41.91± 46.52±9.95 34± 0.049

8.59 1.41

PAS 157.60± 154.70± 130.30± 0.000* 114.65±5 118.28± 125± 0.032*

18.77 18.20 16.15 .49 9.29 7.07

PAD 89.20± 90.38±1.33 84.90± 0.006* 75.21± 76.56±5.24 75± 0,630

4.00 11.21 5.85 7.07

IMC 23.22± 25.07±2.31 27±2.10 0.000* 21.97± 23.36±2.15 25 0.001*

1.85 1.37


90

I.2.3 Le polymorphisme M235T du gène de l’angiotensinogène

Nous avons regroupés les résultats des fréquences génotypiques de ce polymorphisme dans le

(tableau XXIII, page 91). Pour augmenter la puissance statistique des différents tests, les

sous-groupes de génotypes de l’allèle rare ont été regroupés. Les résultats de la présente étude

portant sur l’analyse du polymorphisme M235T de l’AGT, ont révélé que la fréquence de

l’allèle homozygote muté dans tous les sujets était 27.64 % (18.66 % pour hypertendus et

21.42 % pour normotendus) et 36.57 % pour l’allèle hétérozygote (17.33 % pour hypertendus

et 35.71 % pour normotendus) finalement 73.68 % pour le type sauvage homozygote (64 %

pour hypertendus et 42.85 % pour normotendus). Les fréquences alléliques et les distributions

génotypiques de la variante M235T étaient dans l'équilibre Hardy-Weinberg. Nous avons

remarqué qu’il y avait une différence statistiquement significative dans la distribution des

génotypes entre les hypertendus et les témoins (tableau XXIII); (X2

= 7.815; P ˂0.05; MM :

64 %; TM : 17.33 %, TT : 18.66 % chez les hypertendus contre MM : 42.85 %; TM : 35.71

%; TT : 21.42 % pour les témoins) et même dans fréquences alléliques (X2 = 4.671; P ? 0.05;

OR=1.64; 95%CI [1.007-2.69]) avec une fréquence pour l’allèle M de 0.72 contre 0.60 et

pour l’allèle T de 0.27 contre 0.39 chez les cas et les témoins respectivement. La figure (28,

page 92) montre le profile electrophoretique des ADN de patients hypertendus et de témoins

normotendus après digestion enzymatique avec Tth111I. Les sujets avec la bande 165pb sont

porteurs de l’allèle sauvage (M), ceux avec la bande 141pb sont porteurs de l’allèle muté (T)

et enfin ceux avec les bandes 165pb et 141pb sont des hétérozygotes.

I.2.3.1 L’influence du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques du

polymorphisme M235T de l’AGT

L’effet du sexe sur la distribution des fréquences génotypiques a aussi été réalisé chez les cas

et les témoins et les résultats sont présentés dans le tableau (XXIV, page 91). D’après ce

tableau, aucune différence statistiquement significative n’a été relevée entre les hommes et les

femmes en termes de fréquences alléliques (P>0.05).


91

Tableau XXIII : Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme M235T de

l’AGT entre cas et témoins

Génotypes

HTN

(n=75)

n(%)

NT

(n=70)

n(%)

MM 48 (64) 30 (42.85)

MT 13 (17.33) 25 (35.71) TT 14(18.66) 15(21.42)

P X2= 7.815

P= 0.02*

Allèles M 109 (72.66) 85 (60.71) T 41 (27.33) 55(39.28)

X2

value

P

Odds ratio

(95% Intervalle de

Confiance)

X2=4.671

P=0.0307*

1.64 (1.007-2.69)

MM 48 (64) 30 (42.85)

MT+TT 27(36) 40(57.1)

P P˂ 0.05

Odds ratio

(95% Intervalle de

Confiance) .

2.37 (1.22-4.62)

Tableau XXIV: Distribution alléliques du polymorphisme M235T chez les hommes et les

femmes

Allèles

HTN

(n=75)

Homme Femme

NT

(n=70)

Homme Femme

T 14 30 21 18 M 16 15 24 7

X2

value

Signifiance

X2

= 2.969 X2

= 4.18

P=0.084 P=0.04


92

M 1 2 3 4 5

165pb

141pb

Figure 28 : Profile électrophorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique de M235T par Tth111I.


MT : Hétérozygote (puit 1)

MM : Homozygote pour l’allèle sauvage (puit 5)

TT : Homozygote pour l’allèle muté (puit 2, 3 ,4)


93

I.2.3.2 L’association entre les génotypes et les antécédents familiaux d’HTA (M235T)

Dans l’objectif de déterminer la corrélation entre les génotype et la présence ou absence

d’ATCDF HTA, un test de chi carré a été utilisé et les résultats sont présentés dans le (tableau

XXV, page 94). Selon ce tableau, nous observons une différence statistiquement significative

entre les cas et les témoins pour les différents génotypes et ce en fonction de la présence ou

l’absence des antécédents familiaux d’HTA (P˂0.05). Cependant, chez les hypertendus, la

présence d’ATCDF HTA est plus importante chez les porteurs de l’allèle sauvage comparé à

ceux avec l’allèle muté.

I.2.3.3 Corrélation entre les génotypes et les paramètres cliniques étudiés (M235T)

A l’aide du GLM et du One Way ANOVA, nous avons pu estimer l’influence des génotypes

sur certains paramètres cliniques dont la PAD, PAD, âge, IMC et les résultats sont présentés

dans le (tableau XXVI, page 94). D’après ce tableau, nous observons une différence

statistiquement significative entre les génotypes pour la PAS, PAD et l’IMC pour les cas et

les témoins, âge pour les témoins seulement et enfin aucune différence statiquement

significative entre les génotypes pour la variable « âge » pour les cas.


94

8 13 14 20 25 15

40 0 0 10 0 0

48.21 0.000*

15.55 0.000*

Tableau XXV : L’association entre les génotypes et les ATCDF HTA (M235T)

Absence Présence

X2

P

Génotypes

HTA NT

MM MT TT MM MT TT

Tableau XXVI : Influence des génotypes sur les paramètres cliniques (M235T)


Age

MM

(n=48)

48.40±8.12

MT

(n=13)

50.23±6.97

TT

(n=14)

45.36±

P

0.297

MM

(n=30)

40.47±

MT

(n=25)

44±8.44

TT

(n=15)

47.93±

P

0.034

9.68 8.63 10.54

PAS

160.17±

17.19

144.23±

18.01

133.14.96

0.000*

114.33±

5.68

115.20±

7.70

121.80±

7.56

0.030

PAD

89.79±3.08

90.38±1.38

86.36±

4.96

0.048

73.80±

6.08

78±4.08

75 .60±

5.76

0.02

IMC

24.22±2.25

24.76±2.20

26.35±

2.73

0.014

21.76±

1.13

22.92±

1.91

23.53±

2.26

0.003


95

I.3 Etude de l'impact du polymorphisme –786T/C du gène de la eNOS sur le risque

d'HTA

Le (tableau XXVII, page 95), présente la distribution des fréquences génotypiques du SNP –

786T/C du gène de la eNOS chez 102 cas et 85 témoins dont l’âge moyen a été apparié à l’âge

des cas. D’après ce tableau, nous remarquons que la fréquence de l’allèle sauvage est de 43%

(45.88% chez les hypertendus et 40.19% chez les normotendus) et 40.53% pour l’allèle

hétérozygote (45.88% pour les normotendus et 35.29% pour les hypertendus) et enfin 16.36%

pour les homozygotes pour l’allèle muté (8.23% pour les normotendus et 24.50 pour les

hypertendus). Dans la présente étude, la distribution des fréquences alléliques et génotypiques

du polymorphisme NOS-786C/T chez les cas et les témoins est dans l’équilibre de Hardy-

Weinberg. Nous avons trouvé une différence statistiquement significative entre cas et témoins

(OR=0.62 (0.4-0.95)). Ce résultats suggère que l’allèle -786C a un effet significatif sur le

risque de survenue de l’HTA. La (figure 29, page 96) montre le profile electrophoreitique de

l’ADN amplifié des hypertendus et des témoins après digestion enzymatique avec MspI. Les

sujets avec la bande 176pb représentent l’allèle TT, ceux avec les bandes 135pb et 41pb,

représentent le génotype CC et enfin les trois bandes à 176pb, 135pb et 41pb représentent

l’allèle CT.

Tableau XXVI : Comparaison des fréquences génotypiques du polymorphisme–786T/C du

gène de la eNOS entre cas et témoins

Génotypes

Témoins (n=85)

n(%)

Hypertendus (n=102)

n(%)

TT 39 (45.88) 41 (40.19)

TC 39 (45.88) 36 (35.29)

CC 7 (8.23) 25 (24.50)

X2

P

X2= 8.82

P=0.012*

Allèles

T 117 (68.82) 118 (57.84)

C 53 (31.17) 86 (42.15)

X2

value

P

X2=4.79

P˂0.05

OR (95% Confidence

intervalle)

0.62 (0.4-0.95)

TT 39 (45.88) 41 (40.19)

TC+CC 46(54.11) 61(59.80)

P P>0.05 OR (95% Confidence interval) 0.79 (0.44-1.41)


96

Figure 29: Profile électrophorétique sur gel d’agarose à 2% des produits de digestion

enzymatique du NOS-786C/T par MspI

97


II Discussion générale

II.1 Polymorphisme T174M du gène d’AGT

Les résultats de l’analyse statistique des différents paramètres socio-démographiques et

cliniques n’ont révélés aucune association avec l’hypertension artérielle. En effet, nos

résultats ne concordent pas avec les travaux de certains auteurs qui confirment la forte

corrélation de l’IMC aux valeurs de pression artérielle et à la prévalence de l’hypertension

(Sever et al., 1980, Bruce et al., 1993, Must et al., 1999, Flegal, 2000). Le même résultat a été

rapporté par une étude épidémiologique de type NHANES-III chez les deux sexes où, ils ont

trouvé que la prévalence de l’hypertension est plus élevée chez les sujets en surpoids ou

obèses que chez les sujets normopondéraux (Must et al., 1999). De plus, nous n’avons pas été

en mesure d’associer la présence d’antécédents familiaux d’HTA avec l’augmentation de la

pression artérielle. Alors que, beaucoup d’études ont associés les antécédents familiaux

d’hypertension à l’augmentation du risque d’hypertension (Galderisi et al., 1993, van der

Sande et al., 2001). En effet, une étude réalisée chez 5.329 adultes a montré que l’histoire

familiale de l’hypertension est, en particulier, associée à une augmentation de la pression

artérielle diastolique, à l'IMC (Indice de Masse Corporelle), à la cholestérolémie et à l’obésité

(van der Sande et al., 2001).

Les résultats de l’analyse statistique du polymorphisme génétique T174M de

l’angiotensinogène ont montré que la fréquence de l’allèle 174M chez les hypertendus était

de 0.26, cette fréquence est plus importante que celle trouvée dans la population caucasienne

d’origine française (0.13) (Marre et al., 1997) et danoise (0.12) (Tarnow et al., 1996). Dans la

présente étude, nous avons relevé une forte prévalence des antécédents familiaux d’HTA

(66.6% vs 17.4%) associée à une forte fréquence de l’allèle T (0.74 vs 0.66) chez les

hypertendus comparée aux normotendus. Le même résultat a été confirmé par les travaux de

(Martinez et al., 2002) qui ont montré que chez la population caucasienne d’origine

espagnole, les allèles 235T et 174T sont plus associés aux antécédents familiaux d’HTA que

l’allèle 174M. De même, cette même association a été rapportée chez les sujets de race noir et

les japonais respectivement (Rotimi et al., 1997, Iso et al., 2000).

Chez les oranais, le polymorphisme T174M ne présente aucun effet significatif sur le risque

d’hypertension artérielle (OR=1.05 (95%IC : 0.583-1.932)). L’absence d’association entre ce

98


polymorphisme et l’HTA a aussi été rapportée dans différentes populations. En effet, dans les

populations caucasiennes d’origine espagnole (Fernandez-Llama et al., 1998), française

(Lesage et al., 1997), turque (Agachan et al., 2003), allemande (Renner et al., 2005),

australienne (Wang et al., 1999) aucune association entre ce polymorphisme n’a été trouvé

avec l’HTA. De même, d’autres études portant sur d’autres ethnies telles que la population

asiatique (Wang et al., 2002, Nair et al., 2003) , arabe (Frossard et al., 1998) ont rapportées le

même résultat négatif. Cependant, il existe d’autres études qui ont confirmé cette association

(Marco et al., 2005, Vasku et al., 2002, Tiret et al., 1998, Kurland et al., 2001, Jeunemaitre et

al., 1992). Afin de pallier à ces résultats divergents, une récente méta analyse de 2188

hypertendus et 2459 témoins, impliquant 9 études de type cas -témoin (tableau XXVIII, page

99) a été entreprise et les résultats de cette étude n’ont révélé aucune association entre ce

polymorphisme et l’HTA chez la population caucasienne ou asiatique avec un (OR 0.92, 95%

CI 0.62–1.37) (Liao et al., 2014).

En revanche, les résultats de cette dernière étude ne concordaient pas avec la méta analyse de

(Pereira et al., 2008) où ils étudièrent une population composée de 26 818 sujets à partir de 46

études en analysant 4 variants dont le T174M, A-6G, A-20C, et G-217A, ils démontrèrent

ainsi une association entre le T174M ( [OR]: 1.19; 95% CI: 1.07-1.33; P=0.002) ; G-217A

(OR: 1.37; 95% CI: 1.17 to 1.59; P=0.00006) et l’HTA chez les asiatiques et même chez des

populations mixtes à l’exception des descendants de la population caucasienne. L’allèle -20C

a aussi été associé à la diminution du risque d’HTA chez les populations mixtes et les

descendants européens (OR: 0.64; 95% CI: 0.44-0.92; P=0.02 ; OR: 0.77; 95% CI: 0.65-0.91;

P=0.003, respectivement) ainsi qu’une réduction de 24% de ce risque chez la population

asiatique (OR: 1.24; 95% CI: 1.04 -1.48; P=0.02). Tandis qu’aucune association n’a été

observée pour le variant A-6G. Les auteurs expliquent ces divergences par les variations inter

et intra-ethnique ainsi que les interactions gènes- environnement.

Dans notre échantillon, nous n’avons pas pu trouver une différence statistiquement

significative entre les génotypes des cas et des témoins en fonction du sexe P>0.05. Notre

résultat ne concorde pas avec les travaux de (Mohana et al., 2012) qui ont signalé une forte

prévalence de l’allèle 174M chez les femmes hypertendus comparé aux femmes normotendus

(0.2 vs 0.12 ; P=0.059).

99


Tableau XXVIII: Les études impliquées dans la méta analyse sur le polymorphisme T174M

de l’AGT (Liao et al., 2014)

Etudes impliquées Année Pays Ethnie Taille

d’échantillon

(Iso et al., 2000)

2000

Japon

Asiatique

Cas

229

Témoins

690

(Jiang, 2009) 2008 Chine Asiatique 220 235

(Nair et al., 2003) 2003 Inde Asiatique 134 131

(Nejatizadeh et al.,

2008)

2008 Inde Asiatique 450 358

(Sato et al., 2000)

2000

Japon

Asiatique

180

195

(Tsai et al., 2003) 2003 Chine Asiatique 408 286

(Vasku et al., 2002) 2002 République

tchèque

Européenne 189 201

(Wang et al., 2002) 2002 Chine Asiatique 107 96

(Yuan et al., 2009)

2009

Chine

Asiatique

271

267


100

II.2 Polymorphisme M235T du gène d’AGT et l’ACE I/D du gène de l’ACE

Dans cet échantillon de 75 cas et 70 témoins, nous n’avons pas été en mesure de faire une

corrélation entre les valeurs de pressions artérielles systolique, diastolique et l’IMC. Ces

résultats sont en désaccord avec d’autres études (Sever et al., 1980, Bruce et al., 1993, Must et

al., 1999, Flegal, 2000). Cependant, une association significative a été trouvée entre

l’augmentation de la pression artérielle et la présence des antécédents familiaux d’HTA

(P˂0.05). Ce résultat concorde avec différentes études (Galderisi et al., 1993, van der Sande et

al., 2001).

La fréquence de l’allèle 235T chez les hypertendus était de 0.27 et de 0.39 chez les

normotendus. La fréquence de cet allèle chez les hypertendus est plus faible que celle décrite

chez les malaisiens et les français (0.45) (Say et al., 2005, Jeunemaitre et al., 1992). D’autres

études ont rapporté une forte fréquence de cet allèle chez les normotendus allant de

0.31(Johnson et al., 1996) à 0.49 (Caulfield et al., 1994), ce qui est confirmé par notre

résultat. L’association entre le polymorphisme M235T et l’HTA a largement été étudiée

depuis les premiers travaux de l’équipe du Pr Xavier Jeunemaitre où ils ont trouvé que la

fréquence de l’allèle T était plus importante chez les hypertendus avec 47% comparé à 36%

chez normotendus et 51% chez les hypertendus sévères (Jeunemaitre et al., 1992). En effet,

une méta analyse de 5493 sujets de la population caucasienne a révélé une association entre

l’allèle 235T et l’HTA avec un OR de 1.2 (95%IC : 1.11-1.29) qui augmentait à 1.42

(95%IC : 1.25-1.61) chez les sujets ayant des antécédents familiaux d’HTA (Kunz et al.,

1997, Staessen et al., 1999). D’autres travaux ont confirmé cette association chez les

populations caucasiennes d’origine slovaque (Krizanova et al., 1997), turc (Agachan et al.,

2003) et Malaisienne (Say et al., 2005). De même, les résultats d’une méta-analyse réalisée

sur 25 publications montrent que les sujets porteurs du génotype 235TT (n=1853) ont un

risque d’hypertension artérielle élevé (OR [IC95%]=1.21 [1.11;1.32]) comparés aux sujets

porteurs du génotype MM (n=3442) (Mondry et al., 2005). Une autre méta-analyse de 71

études établies dans la population chinoise sur un échantillon de 10 547 hypertendus et 9217

témoins a révélé une association significative de cet allèle avec l’HTA odds ratio 1.54 (95%

IC : 1.16-2.03, P = 0.002)(Ji et al., 2010). En revanche, dans notre population, nous n’avons

pas pu trouver une association entre l’allèle (235T) et l’HTA, en effet, l’allèle T est plus

fréquent chez les normotendus (0.39) que les hypertendus (0.27) avec un OR=1.64 (95%IC :


101

1.0-2.69), on suggère ainsi que les allèles MM/MT prédisposent plus à l’HTA que l’allèle

235T.

Ces constatations ont été aussi rapportées dans la population libanaise (Saab et al., 2011) et

population de race noire (Bloem et al., 1997). De même, notre résultat a été confirmé dans la

population asiatique (Iwai et al., 1994, Nishiuma et al., 1995, Chiang et al., 1997, Sato et al.,

2000, Kato et al., 1999) et même chez les noirs (Rotimi et al., 1994, Cooper and Rotimi, 1997,

Caulfield et al., 1995, Borecki et al., 1997). Par contre, nous avons noté une forte prévalence

de l’allèle T chez les femmes hypertendues comparées aux femmes normotendus. Notre

résultat a été confirmé par plusieurs auteurs qui affirment que l’allèle 235T est plus élevé chez

les femmes hypertendus (Jeunemaitre et al., 1992). Une récente étude en Inde portant sur 211

témoins et cas et analysant 4 variants du système rénine angiotensine aldostérone dont :

AGT M235T (rs699), ACE I/D (rs4340) et le G2350A (rs4343), ainsi que AGTR1 A1166C

(rs5186) a révélé une association significative entre l’allèle 235T et l’HTA (OR-CI = 2.62

(1.24–5.76), soulignant aussi la forte fréquence du même allèle chez les femmes hypertendus

comparé aux normotendus (OR-CI = 0.401 (0.224–0.718)).(Dhanachandra Singh et al.,

2014).

Dans de nombreuses populations, l’association entre l’allèle 235T et les maladies

cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde (IDM) a été étudiée, les résultats de ces

études étaient divergents.

En effet, une association significative a été révélée entre l’allèle 235T et l’IDM dans les

populations caucasiennes d’origine italienne (Fatini et al., 2000, Olivieri et al., 2001)

espagnols (Fernandez-Arcas et al., 2001), turcs (Ozisik et al., 2005) et les espagnols des Iles

Canaries (Rodriguez-Perez et al., 2001). Une méta-analyse portant sur 38 publications

regroupant près de 13.284 cas de maladie cardiovasculaire et 18.722 témoins d’origine

ethnique différente montre que le risque d’infarctus du myocarde associé à l’allèle AGT 235T

est de 8% (OR 1.08 [95%CI (1.01-1.15), p=0.02] (Zafarmand et al., 2008). Ces auteurs ont

suggéré que cette faible association puisse être expliquée par le fait que dans certaines

populations étudiées, ce polymorphisme n’est pas en équilibre de Hardy Weinberg, ainsi que

les différences de moyennes d’âge des cas entre les différentes études.

Depuis quelques années, des recherches ont été entreprises sur le polymorphisme dans le gène

de l’ECA, qui semble être un excellent marqueur du risque cardiovasculaire. Ce

polymorphisme I/D est le fait de la présence ou de l'absence d'un fragment de 287 pb au

niveau de l'intron 16 de ce gène. La relation entre le génotype DD et l'HTA a fait l'objet de

quelques études européennes, sud-américaines et asiatiques.


102

La fréquence de ce polymorphisme dans différentes populations est présentée dans le tableau

(tableau XXIX, page 105). Comme il a été montré dans la littérature, dans la présente étude,

une association significative a été trouvée entre l’allèle D et l’HTA avec un OR=0.456(0.275-

0.755). De même, cette association a été confirmée dans différentes populations dont la

population asiatique d’origine chinoise (Jeng et al., 1997, Ji et al., 2010), japonaise (Daimon

et al., 2003), taiwanaise (Hsieh et al., 2000), bangladaises (Morshed et al., 2002), croates

(Barbalic et al., 2006), afro-caribéennes (Barlay et al, 1996) et afro-américaines (Sagnella et

al., 1999). Par ailleurs, il a été montré que les sujets de génotype DD semblent avoir un risque

de 1.56 [1.05;2.33] de développer une hypertension artérielle comparés aux sujets porteurs de

l’allèle I(Bautista et al., 2008). En effet, (Tripathi et al., 2006) ont rapporté une fréquence

élevée de l’allèle D et le génotype DD chez les hypertendus (87%) comparée à II+ID (65%).

Parallèlement à ce résultat, (Ramachandran et al., 2008) ont trouvé une forte fréquence de

l’allèle D chez les hypertendus (60.92%) comparée à seulement 22.86% chez les

normotendus. Cette forte fréquence a aussi été rapportée par (Rallidis et al., 2009), qui ont

trouvé que les hypertendus avaient une forte fréquence de l’allèle D (62.5%) comparée aux

normotendus (35.6%) avec un P=0.01.

Plusieurs études se sont intéressées à l’impact du polymorphisme ACE I/D sur les maladies

cardiovasculaires dont l’infarctus du myocarde. En effet, dans la population tunisienne, le

risque d’IDM associé à l’allèle ACE D a été estimé par un Odds ratio de 1.85 (P<0.05) (Mehri

et al, 2005). De même, l’allèle D a été associé à l’infarctus du myocarde dans plusieurs

populations caucasiennes d’origines slovaques (Krizanova et al., 1997), américaines (Ludwig

et al., 1997), italiennes (Fatini et al., 2000) et turques(Karaali et al., 2004). De plus, dans une

population méditerranéenne d’origine espagnole, le risque d’IDM associé au génotype DD est

3.64 [2.37;8.07] (p=0.00000055) (Mata-Balaguer et al., 2004). Dans la population française,

les résultats sont contrastés puisque, dans l'étude princeps de (Cambien et al., 1992) réalisée à

Lille, Strasbourg et Toulouse, l'allèle D a été associé au risque d'infarctus du myocarde alors

que dans l'étude (Canavy et al., 2000), réalisée à Marseille, cette association n'est pas

retrouvée. Comparé au génotype ACE II, le risque d’IDM associé au génotype ACE DD a été

trouvé plus élevé dans 6 études regroupées réalisées dans les populations asiatiques (OR

[IC95%]=2.73 [2.03;3.67]) que dans 31 études regroupées réalisées dans les populations

caucasiennes (OR [IC95%]=1.29 [1.16;1.44])(Wang and Staessen, 2000). Trois autres méta-

analyses se sont aussi intéressées à évaluer l’impact du polymorphisme ACE I/D sur le risque

de la survenue de l’infarctus du myocarde.


103

Une première méta-analyse portant sur 15 publications et regroupant près de 3.400 cas

d’infarctus du myocarde a montré que la valeur de l’OR [IC95%] associé au génotype DD est

de 1.26 [1.15;1.39] (p<0.0001) (Samani et al., 1996). En revanche, d’autres études ont montré

une absence d’association entre l’allèle D et l’IDM telles que dans les populations

australienne (van Bockxmeer et al., 2000), espagnole (Fernàndez-Arcàs et al, 2000), et

irlandaise (Sayed-Tabatabaei et al., 2005).

II.3 Polymorphisme –786T/C du gène de la eNOS

La pathogénèse de l’hypertension artérielle essentielle est déterminée par des facteurs

environnementaux et génétiques, avec une héritabilité entre 30 et 50% (Newhouse et al.,

2005). De nombreux gènes candidats sont impliqués dans la régulation de la pression

artérielle dont le gène du eNOS qui comporte plusieurs polymorphismes dont le

polymorphisme -786T/C de la région promotrice de l’exon 7 et qui a fait l’objet de plusieurs

études d’association réalisées dans différentes populations. Cependant, les résultats de ces

études sont particulièrement hétérogènes et contradictoires.

La fréquence de ce polymorphisme dans cet échantillon de la population oranaise est de

31.17% chez les normotendus. La fréquence de l’allèle -786C la plus faible est décrite chez

les coréens (8.6%) (Kim et al., 2007) et les japonais (9.2%) (Asakimori et al., 2003). Chez les

afro-américains, la prévalence de l’allèle-786C est de 29% (Sandrim et al., 2006). Dans les

populations caucasiennes, la fréquence de l’allèle -786C varie entre 38% et 39.6% (Agema et

al., 2004, Hassan et al., 2004, Fatini et al., 2004).

Dans notre échantillon, le polymorphisme -786T/C présente un effet significatif sur le risque

de survenue de l’hypertension artérielle avec un OR= 0.62 et IC 95% (0.4-0.95). Plusieurs

études ont confirmés ou infirmés ce résultat. En effet, l’allèle -786C est associé à l’HTA chez

les canadiens : le risque d’hypertension associé au génotype -786CC était de 2.1 (IC95%=

[1.3-3.7]) (Hyndman et al., 2002) et c’est ce qui a été aussi confirmé dans la population

américaine (Pacanowski et al., 2009). Néanmoins, de nombreux travaux ont infirmés cette

association. A cet effet, une importante méta-analyse de 53 études impliquant 40413

personnes a révélé une absence d’association entre l’allèle -786C et l’HTA (Pereira et al.,

2007). Ce même résultat a été rapporté chez les populations japonaise (Kajiyama et al., 2000),

afro-américaine et caucaso-américaine (Sandrim et al., 2006). En effet, les auteurs suggèrent

des études plus approfondies prenant compte les analyses haplotypiques ainsi que les

interactions gènes-environnement afin de réduire ces divergences. D’autre part, le

polymorphisme -786C/T a fait l’objet de plusieurs travaux en association avec l’IDM. Ce


104

polymorphisme n’a pas été associé à l’infarctus du myocarde dans deux populations

caucasiennes d’origine australienne (Granath et al., 2001) et taïwanaise (Wang et al., 2001).

Cependant, six études sur un ensemble de sept ont rapporté des associations significatives

entre le polymorphisme -786T/C et les maladies cardiovasculaires.

En effet, l’allèle -786C a été associé au risque cardiovasculaire chez les italiens (Rossi et al.,

2003), les caucasiens originaires du nord de l’Espagne (Alvarez et al., 2001), de l’Ukraine

(Dosenko et al., 2005) de la Turquie (Tangurek et al., 2006) et de la Corée (Kim et al., 2007).

Par contre, ce polymorphisme n’a pas été associé au risque cardiovasculaire dans la

population britannique (Leeson et al., 2002). En 2004, une méta-analyse de 26 études cas-

témoins de maladies cardiovasculaires regroupant près de 9.867 cas et 13.161 témoins

d’origine asiatique et non asiatique, a conclu à l’absence d’association entre le

polymorphisme -786T/C et les maladies cardiovasculaires (Casas et al., 2004). Par contre, les

résultats issus d’une autre méta-analyse de 14 études caucasiennes et 6 études asiatiques ont

montré que l’OR [IC95%] de maladies cardiovasculaires associé à ce polymorphisme est de

1.17 [1.07;1.28] (Casas et al., 2006). Les auteurs de cette méta-analyse ont constaté que les

études à effectif réduit peuvent affecter l’association de ce polymorphisme avec les maladies

cardiovasculaires.

En conclusion, l’ensemble de nos résultats concernant tous les polymorphismes étudiés dans

cette thèse, confrontés aux résultats très contrastés rapportés dans la littérature, ne permet pas

d’exclure ou d’inclure l'implication de modifications génétiques de l’AGT, l’ACE, eNOS

dans le risque d’HTA. Cette divergence peut être la conséquence de plusieurs facteurs tels que

la différence de taille des populations étudiées, l’origine ethnique de la population étudiée, les

critères de sélection des cas et des témoins ainsi qu’aux phénomènes d’épigénétiques.


105

Tableau XXIX : La fréquence du polymorphisme ACE I/D dans différentes populations

Ethenies Fréquence du polymorphisme ACE

I/D

I D

Nombre

d’individus

Tunisienne (Comas et al., 2000) 0.24 0.76 47

Algérienne (Comas et al., 2000) 0.27 0.73 48

Somalienne (Bayoumi et al., 2006) 0.27 0.73 53

Omanienne (Bayoumi et al., 2006) 0.29 0.71 127

Nigérienne (Barley et al., 1994) 0.41 0.59 80

Caucasienne(Cambien et al., 1992) 0.54 0.46 733

Indienne (Saha et al., 1996) 0.54 0.46 166

Japonaise (Nomura et al., 1994) 0.65 0.35 136

Chinoise (Lee, 1994) 0.71 0.29 189

Marocaine(Comas et al., 2000) 0.30 0.70 300

Emiratienne (Frossard et al., 1997) 0.34 0.66 159

Soudanaise (Bayoumi et al., 2006) 0.36 0.64 121

Samoanienne (Barley et al., 1994) 0.91 0.09 70

CONCLUSION GENERALE ET

PERSPECTIVES

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Dans le présent travail, nous nous sommes intéressés à l’analyse de l’impact des

polymorphismes génétiques de gènes candidats impliqués dans la régulation de la pression

artérielle sur le risque de la survenue de l’hypertension artérielle. Nous avons également

évalué l’impact de l’interaction de ces polymorphismes avec les facteurs de risque

environnementaux conventionnels des MCV sur le risque de la survenue de l’HTA. Les

polymorphismes étudiés sont localisés sur des gènes candidats intervenants dans les deux

principaux systèmes impliqués dans la régulation de la pression artérielle : le système rénine-

angiotensine et le métabolisme de la L-arginine. Ces polymorphismes ont fait l’objet de

nombreuses études réalisées dans des populations d’origines ethniques différentes mais les

résultats que nous présentons sur la population algérienne sont originaux.

Notre travail nous a permis d’évaluer les fréquences alléliques de l’ensemble des

polymorphismes étudiés et nos résultats nous ont permis de suggérer que dans notre

population :

Le polymorphisme T174M de l’angiotensinogène analysé sur un échantillon de 180

patients hypertendus (qui présentent une forte prévalence d’antécédents familiaux

d’HTA) et 170 témoins normotendus, n’est pas associé ni à l’hypertension artérielle ni

à certains facteurs de risque conventionnels de l’HTA.

L’analyse du deuxième variant du gène de l’angiotensinogène dont le M235T, qui a

été faite sur un échantillon de 75 cas et 70 témoins n’a montré aucune association

entre l’allèle T avec l’hypertension artérielle et ce malgré la force de l’association

statistique. En revanche, notre analyse du polymorphisme I/D de l’enzyme de

conversion testé sur un échantillon de 75 cas et 70 témoins a révélé que ce SNP est un

des marqueurs de prédisposition à l’HTA. Par contre, aucune association n’a été

relevée entre ces deux polymorphismes (M235T et l’ACE I/D) avec les facteurs de

risques conventionnels de l’HTA.

Le polymorphisme NOS -786C/T du gène de eNOS testé sur un échantillon de 102

cas et 82 témoins est associé à l’HTA essentielle.

La comparaison de nos résultats avec ceux rapportés dans différentes autres populations

montre qu’il existe une certaine divergence quant à l’association des polymorphismes T174M

et le M235T avec l’HTA dans cet échantillon de la population oranaise. Par contre, nos

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

résultats convergent avec ceux de la littérature quant à l’association des polymorphismes ;

ACE I/D et le NOS-786C/T avec l’HTA.

Ainsi en fin de cette thèse, nous constatons que les objectifs suivants ont été atteints :

La constitution d’une banque d’ADN composée de plus de 350 ADN d’oranais

hypertendus et normotendus.

La caractérisation épidémio-génétique de 350 individus, ce qui nous a renseignée sur

les marqueurs génétiques les plus prédisposant à l’hypertension artérielle dans la

population étudiée.

Les perspectives envisagées pour compléter cette étude sont les suivantes :

Etudier au sein d’un même gène, plusieurs sites polymorphes. En effet, l’étude de

plusieurs locus d’un même gène, augmente les chances de mettre en évidence une

relation entre le gène entier et le trait étudié (Jeunemaitre, 2003);

Augmenter la taille d’échantillon ;

S’orienter vers l’étude des interactions existant entre plusieurs gènes candidats.

Etudier les interactions gènes-environnement, en prenant en compte, l’étude du gène

UMOD ;

Meilleure compréhension de l’épigénétique en relation avec l’HTA ;

Meilleure analyse des variants rares, qui pourront être très informatifs Finalement, cette étude nous a permis d’acquérir certaines compétences dans le domaine de

l’épidémiologie génétique, que nous pourrons mettre à profit pour étudier la prédisposition

génétique de notre population à d’autres maladies cardiovasculaires dont le prolapsus de la

valve mitrale. Cette étude rentrera dans le cadre d’un projet de recherche entre notre équipe

algérienne composée de cardiologues et de généticiens et une équipe du centre de recherche

de maladies cardiovasculaires.

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.

ANNEXES

Annexe 1

Questionnaire

I ) Etat civil :

Nom et prénom :

Situation familiale :

Tel (facultatif) :

Age :

Adresse :

sexe :

II) Facteurs de risques cardio-vasculaires :

1. Tabac : oui nombre de paquets/année Non sevrage : date :

1.1. Tabagisme passif : 2. Alcoolisme :

3. Poids :

5. Sédentarité :

oui non

Fréquence :

4.Surcharge pondérale :

6 .HTA oui ancienneté :

6.1. Présence de facteurs

7. TA :

d’hérédité :

oui quel membre :

8. Diabète : oui non

8.1. Age de l’attente :

Présence de FH :

Quel membre :

9. Dyslipidémie : oui non

9.1. Age de l’attente : Présence de FH : Quel membre :

10. Facteurs nutritionnels :

10.1. Consommation en sel :

10.2. Consommation de produits gras saturés d’origine laitière :

10.3. Viandes et charcuterie :

11. Facteurs psychosociaux et environnementaux :

11.1. Stress :

11.2. Niveau de vie (économique) :

13. Les traitements hormonaux :

13.1. Les contraceptifs oraux :

13.2. Traitement hormonal de la ménopause :

14. ATCD familiaux de MCV : oui non sexe :

Quel membre : Age de l’attente :

15. ATCD familiaux de MR : oui non sexe

Quel membre Age de l’attente :

16. ATCD chirurgicaux :

III. Traitement :

IV. Groupage sanguin :

V. Types d’atteinte cardio-vasculaire et autres :

VI) Biologie :

Glycémie à jeun :

Cholestérol : total : LDL Chol : HDL chol:

Triglycérides : Ionogramme

Créât sanguine chimie des urines :

Taux de CRP :

Annexe 2 : Protocole d’extraction d’ADN selon le kit STRATAGENE

Sample Volume: 5–10 ml of Whole Blood

Fresh blood extractions yield 30–100 μg of DNA. The yield depends on the source and freshness of blood. Lower yields will occur with blood that has been stored for a few days.

1. Add 40–45 ml of 1× Solution 1 (prepared by mixing 15 ml of 3× concentrate and 30 ml of ddH2O) to the blood sample to yield a final volume of 50 ml.

2. Incubate the sample on ice for 2 minutes.

3. Spin the sample for 15 minutes at 350 × g (1500 rpm using a Beckman

JS-5.2 rotor) at 4°C. Discard the supernatant and save the pellet; while removing the supernatant, be careful to not discard the gelatinous- appearing pellet.

4. Resuspend the pellet in 11 ml of Solution 2.

5. Add pronase (0.44 μl stock/ml sample) to the suspension to yield a

final concentration of 100 μg/ml.

6. Incubate with shaking at 60°C for 1 hour, or at 37°C overnight.

7. Chill the tube on ice for 10 minutes.

8. Add 4 ml of Solution 3 to the tube. Invert several times to mix, then place the sample on ice for 5 minutes.

9. Pellet the protein precipitate by spinning for 15 minutes at 2000 × g

(3400 rpm using a Beckman JS-5.2 rotor) at 4°C.

10. Using a large-bore pipet, carefully transfer the supernatant to a sterile 50-ml conical tube.

Note Avoid removing any flocculent material when transferring the

supernatant.

11. Add RNase (2 μl stock/ml sample) to the supernatant to yield a final

concentration of 20 μg/ml.

12. Incubate at 37°C for 15 minutes.

13. Precipitate the DNA by adding 2 volumes of 100% ethanol to the supernatant. Gently invert until the DNA precipitates (strands of a white, flocculent material will form).

14. Remove the DNA by spooling with a sterile glass rod.

15. Rinse the DNA while still on the rod with 70% ethanol. Dry the spooled DNA by briefly touching to a Kimwipe.®

16. Carefully resuspend the DNA in 500 μl of 10 mM Tris, 0.1 mM

EDTA buffer, by gently inverting the tube. Do not vortex or pipet sample. Store at 4°C.

17. To calculate yield and concentration of your DNA

sample,

1 OD260 = 50 μg/ml.

Note To avoid shearing the genomic DNA, use wide-bore tips during manipulations.

Annexe 3: Dosage de l’ADN

Deux lectures de densité optique ont été effectuées après une dilution de l’ADN extrait 1/300

(10µl d’ADN et 2990µl d’eau distillé) une à λ=260 nm qui correspond à la longueur d’onde

d’absorption maximale des acides nucléiques, et une autre à λ=280 nm qui correspond à la

longueur d’onde d’absorption maximal des protéines qui absorbent également à 260 nm.

Dans le but d’estimer la pureté de l’ADN extrait le rapport R= Do 260/280 doit être compris

entre 1,8 et 2. Si R est inférieur à 1,7 alors des protéines contaminent probablement la

solution. Une valeur supérieure à 2 indique une probable contamination par des ARN.

L’estimation de la concentration d’ADN extrait est donnée par la formule suivante :

[C] = DO260nm x 50 x facteur de dilution

50 : unité de densité optique à 260nm de l’ADN double brin.

Le facteur de dilution est de 300.

iMedPub Journals http://journals.imedpub.com ANNALS OF CLINICAL AND LABORATORY RESEARCH

2013 Vol. 1 No. 1:3

doi: 10.3823/1402

Abstract

Genetics of hypertension:

The lack of evidence

Amrani A1 , F.Mesli 2,M.B.Babahamed

1

1 Biotechnology department, Faculty of

Sciences, University of Oran, Algeria.

2 Biology department, Faculty of

Sciences, University of Oran, Algeria.

The silent killer or essential hypertension, is an important risk factor

for cardiovascular disease, it affects 20% to 30% of the population

worldwide and will alarmingly rise to 1.5 billion by 2020. Its heritability

is around 31 to 68%, besides affecting environmental factors. Com-

paring to the last years, there have been a substantial progress in the

understanding of the Blood pressure and HTN etiology. We provide

an overview of the current findings of the GWAS aiming to contribute

in the understanding of the pathophysiology of Blood pressure and

HTN. From the fact that only a fraction of the phenotypic variability

of BP can thus far be explained by the recently discovered common

genetic polymorphisms from GWAS, therefore, we tried to highlight

the major role of rare and structural variants, epigenetics in the miss-

ing heritability of HTN.

Key words: epigenetics, essential hypertension, heritability, GWAS.

Introduction

Hypertension is a chronic elevation of blood pressure, defined by sys-

tolic/diastolic blood pressure (SBP/DBP) above 140/90 mmHg. It affects

20% to 30% of the population worldwide and will alarmingly rise to

1.5 billion by 2025. Its importance as the most prevalent risk factor

for the development of cardiovascular disease such as coronary artery

disease and stroke has been consistently demonstrated across various

population.

Hypertension is the result of the interaction between many risk genes

with an estimated heritability ranging from 31% to 68%, and with

Corresponding author:

[email protected]

Dr. A. Amrani

Address: 1524 Elmnaouar Street, Oran.

Tel.: 00213770567917

© Copyright iMedPub This article is available from: www.aclr.com.es 1

http://journals.imedpub.com/

mailto:[email protected]

http://www.aclr.com.es/

2013 Vol. 1 No. 1:3

doi: 10.3823/1402

ANNALS OF CLINICAL AND LABORATORY RESEARCH

environmental factors such as: Dietary salt intake,

alcohol consumption, smoking and ethnicity.

Various family and twin studies have estimated the

clinic heritability of systolic blood pressure and the

diastolic blood pressure in the range of 15 to 40%

and 15 to 30% respectively)[5, 6], whereas for am-

bulatory night-time systolic and diastolic blood pres-

sure the heritabilities are 69% and 51% [7). The

sibling recurrent risk of hypertension is in the range

of 1.2 to 1. [8), whichsindicate a phenotype with a

modest genetic effect. Blood pressure is regulated

by a complex network of interactive physiological

pathways involving cardiac contractility and vascu-

lar tone through renal, neural or endocrine system,

extracellular fluid volume homeostasis and any per-

turbation in these pathways can arise from genetic

or environmental factors or both of them [9).

Fifty years ago after the Pickering-Platt’s debate,

little is known about the aetiology of such complex

risk factor. In this review, we try to provide a gen-

eral view of the major strategies done worldwide in

these lastsyear’s aiming to understand the complex-

ity of such important trait.

Genome-Wide Studies on Blood Pressure and Hypertension

Linkage studies

The linkage studies were the first genome-wide

studies on human hypertension and blood pres-

sure. They aim to find a physical linkage between a

marker and a gene. These studies deal with family

design, and refer to co-transmission of polymorphic

genetic markers or traits linked on the same chro-

mosome from parents to off-spring, using two well

known statistical methods: Lod-score and affected

sib-pairs

In 1995, the National Heart, Lung, and Blood In-

stitute (NHLBI) shave established a collaboration

of 4 multicenter networks: GenNet (University of

Michigan), GENOA (University of Texas at Houston),

HyperGEN (University of Utah), and SAPPHIRe (Stan-

ford) known as the “Family Blood Pressure Program

(FBPP)”. This collaboration aimed to investigate the

genetic determinants of inter-individual blood pres-

sure variation in Asians, African Americans, Mexican

Americans, and Caucasians [10) The FBPP collabora-

tion yielded statistical power and unmatched diver-

sity in any individual study [11). The complete FBPP

resource includes 13.516 individuals with microsat-

ellite genotype data from two distinct temporally

study phases (phase 1 and 2 were conducted from

1995-2000 and 2000-2005, respectively). The find-

ings of this study were: five quantitative trait loci

(QTLs) detected on chromosomes 6p22.3, 8q23.1,

20q13.12, 21q21.1, and 21q21.3 based on signifi-

cant linkage evidence defined by logarithm of odds

(LOD) score ≥3 in at least one meta-analysis and

LOD scores ≥1 in at least 2 subgroups defined by

network and race. The chromosome 8q23.1 locus

was supported by Asian, Caucasian, and Mexican-

American-specific meta-analyses [12].

Another important linkage study is the British Ge-

netics of Hypertension (BRIGHT) study; where al-

most 2.010 affected sibling pairs from 1599 severely

hypertensive families were genotyped completing a

10cM genome-wide sca [8). This study reported a

principal locus on chromosome 6q with a lod score

of 3.21 that reached genome wide significance

(P=0.042). After assessment under locus–count-

ing analysis, three locus have been identified on

chromosome 2q, 5q and 9q with lod scores higher

than 1.57, showing a genome-wide significance

(P=0.017). However, this study presented some limi-

tations such as insufficient sample size and marker

density.

2 This article is available from: www.aclr.com.es


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The availability of all these data, allowed a meta-

analysis of 9 genome wide scans of blood pressure

or HTN done by Koivukoski et al. [13) showing an

evidence of susceptibility regions on chromosome 2

(2p12-q22.1) and 3 (3p14.1-q12.3). Many other ge-

nome wide linkage studies have been performed

in different ethnicities revealing: No linkage with

blood pressure while targetting chromosome 14 in

Chinese population [14) While, in European popu-

lation, Mein et al. [15]) have found a wide genome

linkage on all chromosomes except 13, 20. Addi-

tionaly, a 10 centimorgan genome-wide screen for

systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood

pressure (DBP) performed in 1054 individuals from

188 o rural Nigerian families population, has re-

vealed many susceptibility locus on chromosome 6

and 7 [16].

On the other hand, linkage studied of non-European

ancestry have reported a suggestive linkage detect-

ed for blood pressure on chromosome 2q and 22q

in the population of Samoan islands [17]. There have

been several recent linkage and association stud-

ies such as those performed by Guo et al. [18] us-

ing over 500,000 single nucleotide polymorphisms

(SNPs) genotyped in 328 individuals from Chinese

population, comprising 111 hypertensive probands

and their siblings using a family-based association

test, where they found an association with SNPs

on chromosome 5q31.1 (rs6596140; P<9×10−8) for

hypertension where one candidate gene, PDC, was

replicated, with rs3817586 on 1q31.1 attaining P =

2.5×10−4 and 2.9×10−5 in the within-family tests for

DBP and MAP, respectively. They also identified re-

gions of significant linkage for systolic and diastolic

blood pressure on chromosomes 2q22 too and 5p13,

respectively. Further family-based association analy-

sis of the linkage peak on chromosome 5 yielded

a significant association (rs1605685, P<7×10−5) for

DBP. It is the first combined linkage and association

study of hypertension and its related quantitative

traits with Chinese ancestry.

Despite all the advances in linkage studies, where

more than 30 genome wide linkage studies have

been published on essential hypertension and blood

pressure, but, it still presents some limitations such

as: The need of great number of families, more

knowledge on disease inheritance mode, pene-

trance and frequency fit much better with mono-

genic hypertension than essential hypertension.

Genome Wide Association Studies

Thanks to the modern genotyping techniques such

as chip based genotyping arrays [19, 20] hundreds

of thousands to more than one million SNPs of

variants have been genotyped relying either on the

knowledge of linkage disequilibrium (LD) available

on (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) and the 1000

Genome project (http://www.1000genomes.org)

which provide a catalog of human variants to help

in the identification of disease-causing variants, or

correlation patterns of imputed SNPs with function-

al variants, with fast and low cost.

Genome wide association studies (GWAS) or Hy-

pothesis-free studies are based on the premise that

a causal variant is located on a haplotype, and there-

fore a marker allele in (LD) with the causal variant

should show by proxy an association with a trait of

interest [21]. The approach is therefore said to be

non-candidate-driven in contrast to gene-specific

candidate-driven studies. There have been many

reviews about the understanding of the GWAS [21,

22, 23].

In 2007, two large GWAS have been identified by

Levy et al. [24] and the Wellcome Trust Consor-

tium Case Control (WTCCC) [25], the former was

based on Framingham heart study families with

100.000 polymorphic markers, using the Affyme-

trix 100Kchip, associating BP at two different time

points and long term averaged BP. None genome

wide significance was obtained, the latter was char-

© Copyright iMedPub 3

http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.1000genomes.org/

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acterized by a better marker density, with 500.000

genetic markers using the Affymetrix (500Kchip), it

was based on 2000 unrelated hypertensive subject

from BRIGHT study [8] each for 7 complex diseases

of major public health importance; bipolar disorder,

coronary artery disease, Crohn’s disease, hyperten-

sion, rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, and type

2 diabetes. These were compared with 3000 shared

common controls that came from two sources: 1500

from the 1958 British Birth Cohort and1500 blood

donors that were recruited for the project, over the

entire genome there were 21 SNPs identified with

P-values lower than the genome wide significance

threshold of 5 × 10−7. Unfortunately, from all the

seven disease studied, no genome wide significance

was obtained for hypertension, may be not due to

the absence of association but to the study design

which caused underperformance of HTN, or may

be due to the undiagnosed of the controls, where

it has reported that the misclassification of 5% of

controls would translate to a loss of power equiva-

lent to a 10% reduction in sample size [26].

To overcome these weaknesses, two important con-

sortia were born, being more fruitful such as: The

Global Blood Pressure Genetics (Global BPgen) con-

sortium study, conducted by Newton-Cheh et al. [27]

and the Cohorts for Heart and Aging Research in

Genome Epidemiology (CHARGE) consortium study,

conducted by Levy et al. [28]. The former tested 2.5

million imputed SNPs for association with SBP or

diastolic BP in 34.433 subjects of European ances-

try, there were eight loci associated with either DBP

or SBP, with a genome wide significance, the vari-

ants were near CYP17A1, CYP1A2, FGF5, SH2B3,

MTHFR, ZNF652, PLCD3 gene and chromosome 10

open reading frame 107 (c10orf107). It was also

reported that these loci were associated with HTN,

after a secondary analysis (N range = 57.410–99,

802). The latter studied 2.5 million imputed SNPs

for association in 29.136 subjects of European an-

cestry, a genome wide significance (P<4×10-7) was

achieved for 13SNPs with SBP and 20 for DBP, 10

for hypertension [28].

To increase the power to detect association signals,

a meta-analysis study [27] was performed including

the two consortia (Global BP gen and CHARGE),

the results showed a genome wide significance

(P<5×10-8) for CYP17A1, ATP2B1, PLEKH7, SH2B3,

CACNB2, CSK-ULK3, TBX3-TBX5 and ULK4 for as-

sociation with SBP or DBP or HTN. Despite this huge

study, the effect sizes were very small, approximate-

ly 1mmHg change in SBP per allele or 0.5mmHg

change in DBP per allele. Other important studies

performed in 200.000 European individuals have

developed a risk score from 29 genome wide sig-

nificant variants where it has been associated with

HTN and related target organ [29].

On the other hand, there were few published GWAS

in individuals of non-European ancestry where we

report some of them. A case control study of Han

Chinese with 175 hypertensive cases and 175 nor-

motensive controls using Affymetrix 100K, failed

to identify genome-wide associated loci [30], fol-

lowed by another Japanese GWAS Takushichi et al.

[31] of 1.526 individuals including 403 cases and

452 controls, using Illumina Infinium HumanHap550

BeadArray, similarly did not reveal significant loci

associated with HTN. However a meta-analysis of

over 16.000 Korean individuals identified a BP-asso-

ciated SNP (rs17249754, P = 1 × 10−7 in combined

meta-analysis) near the ATP2B gene, the region also

identified in the CHARGE Consortium [28, 32, 33].

These studies had limited statistical power due to

study size and the restricted focus on HTN.

An important approach done in Japan called the

Millennium projects which aimed to achieve bold

technological innovation in three areas of vital im-

portance to Japan: Information utilization, aging

society and the environment. Among them, ge-

nome research in five fields of genetics, namely



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disease genes, human genome variation, the rice

genome, bioinformatics, and development/differ-

entiation/regeneration. Two different approaches

were launched, genome-wide association analysis

using single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and

microsatellite markers, and systematic candidate

gene analysis, under the hypothesis that common

variants have an important role in the etiology of

common diseases. These multilateral approaches

identified ATP2B1 (gene which encodes the plasma

membrane calcium ATPase isoform 1, which re-

moves bicalcium ions from eukaryotic cells against

very large concentration calcium homeostasis) as a

gene responsible for hypertension in not only Japa-

nese but also Caucasians [34].

From the other side of the globe, and despite the

high prevalence of HTN in African Americans, there

have been few published studies on BP, for exam-

ple, one important GWAS in individuals of African

ancestry included in the discovery sample of 509

hypertensives and 508 normotensive controls en-

rolled in Washington DC [16], in addition to another

genetic association study performed by Fox et al.

[35] in the same population, but both of them did

not identify any genome-wide significant signals af-

ter the replication stages. Additional GWAS involv-

ing larger number of US minority participants are

currently underway, including the Women’s Health

Initiative minority sample (WHI-SHARe) and the

Candidate Gene Association Resource (CARe).

The findings from the GWAS, followed by the meta-

analysis, have positively contributed to the under-

standing of a small part of the pathophysiology of

HTN and BP, but didn’t uncover yet the bottom of

the iceberg.

Rare variants

Although, there have been a huge progress in the

discovery of variants associated with the BP /HTN

trait, the effect of these variants still too small with

a modest contribution on BP in the range of 0.5 to

1mmHg per allele. This may lead us to support the

Platt’s model, pointing out the major role of highly

penetrant rare variants with large effect on BP trait

[36]. Mendelian forms of Hypertension account only

for 1% of human hypertension; however, they con-

tribute to the understanding of the pathogenesis

of hypertension. There have been many published

studies about the Mendelian forms of hypertension,

one of the important discoveries in these last years

was the description of the mutations in the WNK1

(in the case of a gain function mutation) and WNK4

(loss function mutation) which are the cause of the

Gordon syndrome (PseudohypoaldosteronismII) [37]

this latter is an autosomic dominant form of HTN,

characterized with hyperkalemia, an increase in salt

absorption by the kidney, metabolic acidose. From

different studies, it has been noticed that the vari-

ants of WNK1 gene are associated with blood pres-

sure variation in a severely hypertensive [38] and in

the general population [39].

In the contrast, mutations which cause reduce in

salt retention are mainly associated with Bartter

syndrome (SLC12A1, KCNJ1, CLCKB, BSND, CaSR,

CLCK-A), and with Gitelman syndrome (SLC12A3).

These latter are implicated in the lowering of BP and

protecting against the development of HTN [37, 40].

The resequencing of these three genes in the Fram-

ingham Heart Study population (1.985 subjects and

1.140 relatives) has identified novel variation in these

genes and defined the frequency of such variation

in this population [40]. Thus, it has been identified

46 synonymous substitutions, 89 missense substitu-

tions, one nonsense mutations and two frameshift

mutations. These mutations appear to reduce the

risk of hypertension by 60% at age of 60. In addi-

tion to these findings, one suggestive SNP (CASZ1,

also replicated in a Japanese study) and one gene

expression–associated SNP (BLK-GATA4 region)

have reached genome-wide significance after me-


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ta-analysis combining the Women’s Genome Health

Study with prior study results of CHARGE [41]. A

novel locus for HTN (ZFATI), not tagged by SNPs, and

replicated in an independent sample, has been iden-

tified by a recent Wellcome Trust Case Control Con-

sortium (WTCCC) investigation [42]. However, the

replication was not in the same block suggesting a

role for multiple rare variants within the gene/region

influencing the susceptibility to HTN. It is possible

that a multitude of highly penetrant, low-frequency

alleles affecting a variety of pathways involved in BP

regulation explain a substantial proportion of the

remaining heritability [43].

Novel pathway: UMOD gene’s variant

The UMOD gene located on chromosome 16,

encodes the Tamm-Horsfall protein (THP) or Uro-

modulin, most abundant protein in the urine, an

extracellular protein anchored by a glycosyl phos-

phatidylinositol (GPI), produced by the thik ascend-

ing limb of the loop of Henle. According to Vyletal

et al. [44], this protein plays a major role in the

defense against urinary tract infections and in the

formation of the kidney stones, particularly in au-

tosomal dominant hyperuricemic nephropathy. It is

also involved in progression of kidney disease and

renal fibrosis [45, 46] serving as a marker in kid-

ney disease [47]. In a large GWAS of extreme BP

phenotypes and kidney function, where case and

control subjects were recruited from the far needs

of BP distribution in the general population it was

reported that a variant in the 5’ end of UMOD has

been associated with HTN [48].

The Post GWAS

Structural variants

Common variants have been extensively character-

ized by GWAS but little is known about structural

variations which refer to DNA segments that dif-

fer in copy number between individuals and they

include insertions–deletions (indels), inversions, du-

plications, and other copy number variations (CNV)

[49]. These kinds of variants are suspected to be in-

volved in the missing heritability. The WTCCC study

also investigated effects of common CNVs on eight

complex diseases, including hypertension in Cauca-

sians. The study replicated three loci where copy

number variations were associated with various dis-

eases, but not for the HTN trait. It has been noticed

from this study that common CNVs tend to be well

tagged by GWAS chips; therefore, it supposes that

they don’t contribute widely in the understanding

of the pathophysiology of BP and HTN. Interest-

ingly, Conrad et al. [50] recently showed that 474 of

1.521 polymorphic trait associated SNPs identified

in GWAS of individuals of European ancestry fell

within a recombination hotspot interval that also

contained a copy number variation with correla-

tions of 0.5 or higher. Knowledge of the involve-

ment of indels in complex disease is limited, as no

high-throughput detection technology is available.

Examples of Alus exhibiting replicated association

with BP are the classic polymorphic Alu-insertion

(rs4646994: I/D) located in intron 16 of the ACE

gene [51] and a recently discovered AluYb8 insertion

in intron 10 of the WNK1 gene [52].

The role of the CNVs in other disease such as schizo-

phrenia (SCZ) [53, 54] and autism [55, 56] myocar-

dial infarction [57] has been promising.

Epigenetics

Not all gene regulation is encoded in the DNA se-

quence; BP genes can also be differentially regu-

lated by epigenetic mechanisms, including methyla-

tion, histone modification, and miRNAs.



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miRNAs

A small nucleotides (~22), regulatory, singlestranded

RNA molecules, which function by reducing the ex-

pression of specific target genes, endogenous in

origin and are transcribed as longer precursor RNA

molecules that are processed into mature miRNAs

capable of reducing the translation levels from the

targeted mRNA and/or causing its degradation [58].

Currently, more than a thousand miRNAs have been

identified in humans [59].

They participate in proliferation, differentiation, and

cell death. Many models of tissue or cell-type specific

dicerknockout mice have been created for vascular

smooth muscle cells (VSMCs) [60], juxtaglomeru-

lar cells [61] and podocytes. The loss of miRNAs in

juxtaglomerular cells and VSMCs causes significant

reductions of BP. In case of juxtaglomerular cells,

this difference can be attributed to reduced renin

production [61] whereas in VSMCs the reduced BP

is due to decreased vascular contractility, which can

be attributed to a large extent (but not entirely)

to the lack of miR-145 [60, 61]. For example, Mice

lacking miR-143 and miR-145 develop significant re-

ductions in BP resulting from modulation of actin

dynamics [62].

In addition, an observational study showed that

human cytomegalovirus (HCMV) seropositivity and

titers are positively associated with essential hyper-

tension independently of other HTN risk factors [63]

and the infection of mice with mouse cytomegalo-

virus can alone elevate blood pressure [64] besides

their role in maintaining vascular contractility, they

can also control many components of the renin-

angiotensinaldosterone system where it has been

found in experimental study that mineralocorticoid

receptor gene NR3C2 is downregulated by miRNAs

miR-135a and miR-124 [65] added to several genes

in the RAAS which are regulated by miRNAs [65,

66]. These findings point out the major role of the

miRNAs in regulating BP, but there is much more to

uncover in the future, there have been many recent

reviews focucing on this part [67, 68].

Histone modification

Another aspect of epigenetics is the histone modi-

fications which are indicators of active or repressed

chromatin, and the “histone code” hypothesis pro-

poses that combinations of specific histone modi-

fications define chromatin regulation and gene

transcription [69, 70]. It has been found that modi-

fication in histone plays an important role in the

epigenetic of epithelial sodium channel-α subunit

(ENaCα) gene expression and modulation of WNK4

transcription in the development of salt sensitive

HTN. For the former, Zhang et al. [71] have found

that a nuclear repressor complex can regulate his-

tone H3 Lys-79 methylation of chromatin associated

with the ENaCα promoter and suppress its tran-

scriptional activity.

For the latter, Mu et al. [72] have found in mice

on a high salt diet showed that histone modifica-

tion plays an important role in decreasing transcrip-

tion of the WNK4 gene induced by β2-adrenergic

receptor stimulation where isoproterenol-induced

transcriptional suppression of the WNK4 gene is

mediated by histone acetylation in the promoter

region of the WNK4 gene via inhibition of histone

deacetylase-8 activity (HDAC8), which in turn can

stimulate thiazide-sensitive Na+-Cl+ cotransporter

(NCC/SLC12A3) providing that sympathetic nerve

activity can increase BP partly by activating NCC [11].

DNA methylation

This process is intrinsically linked to the regulation

of gene expression. Methylation changes of genes

have recently been linked to a wide range of com-

plex, often age-related diseases, including hyper-

tension [73], diabetes [74], autoimmune disorders


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[38], obesity [75], heart disease [76], and mental dis-

order [77]. More than 1.000 hypermethylated CpG

sites were identified in the kidneys of salt-sensitive

rats compared with normotensive Brown Norway

rats, pyrosequencing of the promoter of renin genes

showed that 10 CpG sites were significantly hyper-

methylated in saltsensitive rats, consistent with the

reduced renin expression in this strain. An example,

Loss-of-function mutations of 11beta-hydroxyster-

oid dehydrogenase type 2 (11β-HSD2) genes lead

to a form of salt-sensitive monogenic hypertension

[78]. Methylation modulation of this gene has re-

cently been demonstrated in both a rodent model

and cultured human cell lines [79]. A recent study

[80] also showed increased methylation of several

CpG promoter sites of HSD11B2 in kidneys from rat

offspring suffering from intrauterine growth restric-

tion.

The cis-regulation of DNA methylation by genetic

variation may reflect the existence of a common

pathway that acts on both genetic and environmen-

tal effects and represents a potential mechanism for

gene-envirnment interaction.

Future Challenges

Although the recent advances in the GWAS includ-

ing meta analysis of BP extremes, exome sequenc-

ing, The discovery of KLHL3 as a cause of pseu-

dohypoaldosteronism type II, [81] the increasing in

the sample size of this latter which may lead to the

identification of 116 common variants for BP that

have the same effect sizes as those identified al-

ready, but all this with a small contribution (2.2%) in

the understanding of the BP heritability. In addition

to the above-mentioned clues to understand or to

uncover the pathophysiology of Hypertension and

blood pressure, there is still some big challenges in

finding answers to the missing heritability problem

by a better focusing on epigenetic aspect, a better

understanding of the gene-environment interaction

(i,e: taking account the UMOD gene variant, some

features of epigenetics and their relationship with

environment), gene-gene interaction, accurate phe-

notyping (accurate BP measurement by ambulatory

monitoring or home-measurement), a special fo-

cus on intermediate phenotype such as endothelial

function, vascular stiffness besides associated phe-

notypes (body weight, renal function),translation

findings from animals to man, a better focusing on

rare and structural variants. When we will overcome

all these challenges, then we can talk about transla-

tion of genetic findings into clinical practice.



2013 Vol. 1 No. 1:3

doi: 10.3823/1402


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ASSOCIATION STUDY BETWEEN SOME RENIN-

ANGIOTENSIN SYSTEM GENE VARIANTS AND

ESSENTIAL HYPERTENSION IN A SAMPLE OF

ALGERIAN POPULATION: CASE CONTROL STUDY

ASMA AMRANI*1, MOHAMED BEY BABA HAMED

1, FARIDA MESLI

2

1Département of Biotechnology, Faculty of Sciences, University of Es-Sénia, Oran, Algeria

2Département de Biology, Faculty of Sciences, University of Es-Sénia, Oran, Algeria

Address for correspondence: Dr. A. Amrani, E-mail:[email protected]

Address: 1524 Elmnaouar Street, Oran

Tél: 00213770567917

ABSTRACT

Essential hypertension is an important risk factor for the development of cardiovascular

disease. We aim in this study to analysis the relationship between AGT M235T gene variant and

ACE I/D gene variant with essential hypertension in a sample of the Algerian population of the

Oran city.

METHODS:

A case-control study has been performed in 145 subjects including; 75 hypertensives and 70

controls from Algerian population of Oran city. Polymerase chain reaction (PCR) combined with

restrictive fragment length polymorphism (RFLP) was used to detect the M235T variant of

angiotensinogen (AGT) gene and a nested PCR to determine ACE I/D gene variant.

RESULTS:

The genotypic and allelic distribution of the M235Tvariant of the AGT gene did not differ in

hypertensives and normotensives group (X2

=7.815, P˂0.05; X2

=4.671, respectively) thus there was no association between the T allele and hypertension (OR=1.64; 95%CI [1.007-2.69]). The genotypic and allelic frequencies of the ACE I/D variant did differ significantly between

hypertensives and controls (X2

=13.982, P˂0.05; X2

=12.66, P˂0.05, respectively) where a significant association between the D allele of the ACE I/D gene and essential hypertension has been observed (OR=0.456; 95%CI [0.275-0.755]). We reported a high prevalence of the D and T allele in hypertensives female.

CONCLUSION:

This study shows that the M235T variant of the AGT gene is not associated with essential

hypertension while a significant association has been reported with the D allele in this sample of

Algerian population of the Oran city.

KEYWORDS:

Renin Angiotensin system, angiotensinogen gene; M235T gene polymorphism; insertion/deletion

polymorphism, converting enzyme, essential hypertension, Algerian population

mailto:[email protected]

Background

Hypertension (HTN) is major public health burden worldwide and it is a big concern in Algeria

where around 35% of the population aged from 18 to 60 years old is hypertensive (Temmar et al.,

2007). Essential hypertension is a multifactorial complex disease caused by genetic and

environmental factors causing severe damage to human health(Lifton et al., 2001). The renin-

angiotensin aldosterone system (RAAS) is an important system in the regulation of the blood

pressure and the electrolyte balance (Corvol and Jeunemaitre, 1997). Genome-wide association

studies have identified over 100 quantitative trait loci attributed to essential hypertension across

the genome, especially in chromosomes 1, 2,3,17 and 18 (Cowley, 2006). Most of these candidate

genes are involved directly or indirectly in the regulation of the blood pressure, especially the

genes of the renin angiotensin aldosterone system (Kato, 2002, Matsubara, 2000). The

angiotensinogen (AGT) gene and angiotensin-converting enzyme (ACE) gene have an important

role in the RAAS and they have been widely studied as candidate genes for the onset of HTN. The

angiotensin gene (AGT) is located on chromosome 1q42-q43(Isa et al., 1990). It comprises five

exons and four introns (Gaillard et al., 1989, Jeunemaitre et al., 1992a). From the identified fifteen

molecular variants, only three have so far been reported to have a possible genetic association with

hypertension (Jeunemaitre et al., 1992a, Jeunemaitre et al., 1993). One of these variants encodes

threonine instead of methionine at position 235(T235) (Jeunemaitre et al., 1993, Caulfield et al.,

1994) the others encode methionine instead of threonine at position 174. ACE (dipeptidyl

carboxypeptidase) is a metalloenzyme which catalysis the conversion of angiotension I to a potent

vasoconstrictor which is the angiotensin II and inactivates a potent vasodilator. ACE gene has

been mapped to chromosome 17q23 and it contains 26 exons and 25 introns. Insertion/deletion

(I/D) variant of a 287bp Alu repeat sequence in the exon 16 of the ACE gene has been strongly

associated with ACE plasma and cellular levels (Rigat et al., 1990). Many studies have showed the

association of the D allele of ACE gene with hypertension (Kennon et al., 1999, Jeng et al., 1997)

while others did not (Chiang et al., 1997b). The controversial results may be due to in the large

part to the ethnic and gender differences. However, there is a lack of information concerning the

relationship between polymorphisms of the RAAS and essential hypertension in the Algerian

population. This has leads us to check an eventual association between AGT (M235T) gene

variant and ACE (I/D) gene variant in a sample of Algerian population of the Oran city.

Materials and methods:

Population study

A case-control study of a 145 Algerian subjects of the Oran city, who have already given their

written consent to participate in the study. The recruitment of the 75 hypertensive subjects has

been done in the Cardiology service. This study was a part of hypertension project (Amrani et al.,

2014). All hypertensive patients included in the study had been diagnosed as suffering from

primary hypertension. Hypertensives defined as having an elevated systolic blood pressure

SBD 140mmHg and sustained diastolic blood pressure DBP≥90mmHg, or who were currently

receiving antihypertensive therapy. Hypertensives subjects whose parents both had hypertension

were considered to have a positive family history of hypertension. The control group was

composed of 70 normotensive subjects who were selected from local blood donors. Any subjects

with possibility of a secondary hypertension and with diabetes type 2 were excluded.

Normotensive was defined as those with a blood pressure of less than 140/90mmHg; those with a

positive family history of hypertension were excluded. Both groups with subjects under the

influence of estrogen, thyroid, and cortisol hormones were excluded. Anthropometric

measurements, clinical and biological examinations as well as prevalence of risk factors were

systematically recorded in a standardized questionnaire.

Analysis of the AGT M235T and ACE I/D variants

Genomic DNA was extracted from five millitres of blood samples using DNA isolation kit

(Stratagene Inc., Canada) and quantified following spectrophotometric analysis. DNA fragments

including the M235T polymorphism of AGT gene and ACE I/D gene were amplified by

polymerase chain reaction. To determine the I/D polymorphism of ACE gene, a nested PCR has

been done using the following primers were used 5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-

3’and 5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCACGTCAGAT 3’. The cycling conditions were:

initial denaturation for 5 min at 95°C followed by 35 cycles of denaturation at 94°C for one

minute, annealing at 58°C for 40 seconds and chain elongation at 72°C for one minute followed

by final extension at 72°C for ten minutes. Using Agarose gel (1.5%)-electrophoresis enabled

genotypic determination of ACE I/D allele as II, ID and DD genotype. Amplicons with sizes of

490 bp and 190 bp were designated as ID genotype, of 490bp for II and 190bp as DD genotype. .

The mistyping of ID heterozygotes as D homozygotes may appear, this is why we used an

inserting-specific primer pair 5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC3’ and 5’-

TCGCCAGCCCTCCCATGCCC-ATAA-3’ used in each sample with DD genotype (Shanmugam

et al., 1993). PCR conditions were performed with 1 minute initial denaturation at 94°C, followed

by 30 cycles of denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 67°C for 45 seconds and

extension at 72°C for 2 minutes. Under these conditions, the reaction showed the presence of an I

allele at a 335 bp amplicon and no products in samples that were homozygous for DD genotype

(Ramachandran et al., 2008).

To detect M235T polymorphism, we used a PCR followed by restrictive fragment length

polymorphism (RFLP). The following primers were

used:5’CCGTTTGTGCAGGGCCCTGGCTCTCT3’and5’CAGGGTGCTGTCCACACACTGGA

CCCC3’ PCR for both detection was performed in a final volume of 25 µl containing 500 ng

DNA, 0, 2 μM of each of two primers, 0.2mM of dNTP, 67mM Tris-HCl (pH=8.8), 16mM

(NH4)2SO4, 0.01%Tween 20, 1.5mM MgCl2 and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Ozyme). DNA

amplification was performed in thermal cycler (Master cycler, Eppendorf). A PCR touch down

program was used to detect M235T variant. The ¨PCR products was digested by 5U of Tth111I

(Takara, Japan) for one hour at 37°C. Using Agarose gel (1.5%)-electrophoresis enabled

genotypic determination of ACE I/D allele as II, ID and DD genotype. Amplicons with sizes of

498 bp and 264 bp were designated as II genotype, of 498 bp, 264 bp and210 bp as ID genotype

and of 210 bp as DD genotype. While a 3% agarose gel electrophoresis stained with ethidium

bromure was done to reveal M235T polymorphism.

Statistical analysis

All genotype groups obeyed the Hardy-Weinberg equilibrium. Data analysis was done with the

help of an (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) version 21.0. Clinical characteristics of all the

subjects are expressed as means ±SD. Continuous variables were compared between the groups by

using two-tailed student’s t-test. Allele frequencies were calculated from genotype frequencies and

were compared using chi-squared (X2) statistics. P value<0.05 was considered statistically

significant.

Results

Baseline characteristics

In order to evaluate the possible association between AGT (M235T) gene variant and ACE (I/D)

gene variant in a sample of Algerian population of the Oran city, a total of 145 subjects including

75 hypertensives (60 % women; 40 % men) and 70 controls (35.71% women; 64. 28% men) were

included in this study.

The mean age of patients was 48.14±1.5 versus 43.10±1.4 in the control group and it was

statistically different between the two groups (P˂0.0001). The present study showed also a

significant difference between hypertensives and controls with respect to SBP, DBP, while there

was no statistical significant differences between case and controls in term of BMI, fasting blood

glucose, HDL-C, LDL-C, TG (P>0.05). In the present study 53.33% of the patients had a family

history of hypertension vs. 14.28% for the controls (Table 1).The patients with family history of

HTN were taken from a previous investigation study done in a large sample of 620 from the city

of Oran (Amrani et al., 2014). The aim of this choice was to check if in this category, the fact of

having a family history of hypertension an association can be linked to the polymorphism and the

pathology. The baseline characteristics of all the subjects enrolled in this study are shown in Table

1.

Table 1: Baseline characteristics of all the subjects

Parameters HTN

(n=75)

NT P

(n=70)

Gender, M/F 30/45 45/25 NS

Age (Years) 48.14±1.5 43.10±1.4 P˂0.0001

BMI (Kg/m2

) 24.29±1.20 21.32±2.31 NS

SBP (mmHg) 154±9.8 112±5.6 P˂0.0001

DBP (mmHg) 90.97±5.18 71.82±7.11 P˂0.0001

Family history of

hypertension (%)

40(53.33%) 10 (14.28%) P˂0.01

FBG (mmol/L) 2.5±0.1 2.7±1.2 NS

TC (mmol/L) 5.1±0.8 5.2±0.1 NS

LDL-C (mmol/L) 2.6±0.07 2.5±0.03 NS

HDL-C (mmol/L) 1.1±0.04 1.4±0.02 NS

TG (mmol/L) 1.2±0.5 1.3±0.4 NS Values are given as mean ± SD. HTN, hypertensives; SBP and DBP, systolic and diastolic blood pressures; FBG, fasting blood glucose; TG,

triglycerides; TC , total cholesterol; HDL-C, high density lipoprotein cholesterol; LDL-C, low density lipoprotein cholesterol; NS, non-significant.

Genotypes and allele frequencies

To evaluate the impact of the two polymorphisms (M235T and ACE I/D) on the risk of

developing hypertension in this sample of Algerian population of the Oran city. We compared the

genotype and allelic frequencies characterized in 75 hypertensives and in 70 controls. All the

genotype distributions were in accordance with the Hardy-Weinberg Equilibrium.

ACE I/D polymorphism analysis

According to table 2, the prevalence of ACE I/D variant in all subjects was 65.34% for

homozygous wild type (33.33% for hypertensives and 61.42% for normotensives) and 61.40% for

heterozygous mutation (53.33% for hypertensives and 35.71%) for normotensives), 11.15 % for

homozygous mutation (13.33 % for hypertensives and 2.85 % for normotensives). In the present

study, the genotypic distribution of the ACE I/D in the Algerian population did significantly differ

between case and control subjects (Table 2) (X2

=13.98, P˂0.05; II: 33.33%; ID: 53.33%, DD:

13.33% in hypertensives vs. II: 61.42%; ID: 35.71%; DD: 2.85% for controls). The same positive

result was observed in allelic frequency (OR=0.456; 95%CI [0.275-0.755]; X2 =

12.66; P˂0.05)

with a frequency for I allele of 0.60 vs. 0.78 and for D allele of 0.40 vs. 0.20 in cases and controls

respectively.

Table 2: The distribution of ACE I/D genotype and allele frequencies in case and control

population

Genotypes

HTN

(n=75)

n(%)

NT

(n=70)

n(%)

II 25(33.33) 43 (61.42)

ID 40 (53.33) 25(35.71) DD 10(13.33) 2 (2.85)

Significance X2=13,982

P=0.001*

Alleles I 90 (60) 111(79.28) D 60(40) 29 (20.71)

X2

value

Significance

X2= 12.661

P=0.0002*

Odds ratio

(95% Confidence Interval)

0.456 (0.275-0.755)

Key:*Significant value obtained through chi-squared test as compared to controls.

M235T polymorphism analysis

The results of the present study concerning the M235T variant revealed that the prevalence of the

homozygous mutation in all the subjects was 27.64% (18.66% for hypertensives and 21.42% for

normotensives) and 36.57% for heterozygous mutation (17.33% for hypertensives and 35.71% for

normotensives) finally 73.68% for homozygous wild type (64% for hypertensives and 42.85 % for

normotensives). The allele frequencies and genotype distributions of the M235T variant were in

the Hardy-Weinberg equilibrium. There was a statistically significant difference in genotype

between hypertensives and controls (table 3); (X2= 7.815; P˂0.05; MM: 64%; TM: 17.33%, TT:

18.66% in hypertensives vs. MM: 42.85%; TM: 35.71%; TT: 21.42% for controls) and even in

allele frequencies (X2= 4.671; P˂0.05; OR=1.64; 95%CI [1.007-2.69]) with a frequency for M

allele of 0.72 vs. 0.60 and for T allele of 0.27 vs. 0.39 in cases and controls respectively.

Table 3: The distribution of AGT M235T genotype and allele frequencies in case and control

population

Genotypes

HTN

(n=75)

n(%)

NT

(n=70)

n(%)

MM 48 (64) 30 (42.85)

MT 13 (17.33) 25 (35.71) TT 14(18.66) 15(21.42)

Significance X2= 7.815

P= 0.02*

Alleles M 109 (72.66) 85 (60.71) T 41 (27.33) 55(39.28)

X2

value

Significance

X2=4.671

P=0.0307*

Odds ratio

(95% Confidence interval)

1.64 (1.007-2.69)

Key:*Significant value obtained through chi-squared test as compared to controls.

The effect of gender on HTN was also considered in this study in respect of ACE I/D and M235T

polymorphism. Table 4 shows the distribution of the I/D and M235T polymorphism among male

and female in cases and controls. There was no statistically differences between male in female in

relation with the two studied genetic variants (P>0.05)

.Table 4: Genotypic distribution of ACE I/D and M235T in male and female

HTN

(n=75)

NT

(n=70)

Alleles Male Female Male Female

I 18 17 23 12 D 12 28 22 13

X2

value X2= 3.571 X

2 = 0.062

Significance P= 0.05 P=0.80

T 14 30 21 18 M

X2

value

16

X2

= 2.969 15 24

X2

= 4.18 7

Significance P=0.084 P=0.04

Discussion Hypertension is the result of the interaction between many risk genes and environmental factors

with an estimated heritability ranging from 31% to 68% (Hottenga et al., 2005, Kupper et al.,

2005). The renin-angiotensin aldosterone system (RAAS) is an important system in regulating

blood pressure and electrolyte balance (Niu et al., 1999). RAAS gene variants have been widely

studied to determine the genetic susceptibility to HTN (Schmidt et al., 1995). The AGT and ACE

gene are important genes of this system; they have been widely studied for their implication with

essential hypertension (Qu et al., 2001, Jeunemaitre et al., 1992a, Jeunemaitre et al., 1992b). For

the ACE gene, the I/D polymorphism of a 287bp Alu repeat sequence in intron 16 of the ACE

gene is highly associated with plasma and cellular ACE levels (Rigat et al., 1990).The same

observations was done in concern with AGT plasma level which is associated with the blood

pressure (Gardes et al., 1982, Menard et al., 1991). Mice with the AGT gene duplicated have

blood pressure and plasma AGT levels positively correlated with the number of gene copies (Kim

et al., 1995).

In the present study, we tried to evaluate the possible association between ACE I/D and M235T

gene polymorphisms with essential hypertension in a sample of Algerian population where around

35% of the population is hypertensive (Temmar et al., 2007).

Our results showed a higher frequency of the D allele which was 0.40 in hypertensive subjects as

compared to the 0.20 of the control group, with an odd ratio (OR) 0.456, (95%CI 0.275-0.755).

Our findings saw some agreement in some populations as in the North Indian population where it

was reported a high prevalence of the D allele in hypertensives (87%) compared to the controls

(Tripathi et al., 2006). Similarly, other studies performed in different populations such as in

Malaysian and Hellenic subjects have found that the allele D was more prevalent in hypertensives

with a percentage of 60.92% and 62.5% respectively compared to the controls (Ramachandran et

al., 2008, Rallidis et al., 2009).

Additionally, a statistically significant association with essential hypertension was identified for

DD genotype of ACE I/D polymorphism (odds ratio 1.61, 95% confidence interval 1.32-1.98, P <

0.0001) in Han Chinese population (Ji et al., 2010).

Furthermore, various reports have focused on the association between the DD genotype, elevated

blood pressure and high ACE serum level. They showed that individuals with DD genotype have

serum ACE levels and intracellular ACE activity higher than those with II genotype (Rigat et al.,

1990). An elevated level of ACE activity increases the angiotensin II level and the

vasoconstriction activity leading to the establishment of the hypertension.

On the other hand, the present study did not show a significant association between the T allele of

the M235T gene and essential hypertension. The frequency of the T allele was statistically higher

in control subjects than in hypertensive group (0.39 vs. 0.27), with an odd ratio (OR) 1.64 (95%CI

1.007-2.69). Our results are in agreement with other studies where it has been noticed that the T

allele was more frequent in normotensives than in hypertensives (4.6% vs. 2.7%, P = .08)

(Mondry et al., 2005, Saab et al., 2011). The association studies in the Africans /African-

Americans mostly found a negative association (Rotimi et al., 1994, Caulfield et al., 1995). The

discrepancies may be due to the sample size and to ethnic differences.

Nevertheless, Jeunemaitre and associates were the first to report the linkage of the molecular

variants M235T with hypertension in the Whites/Caucasians (Jeunemaitre et al., 1992b). These

results have also been supported by other studies (Schmidt et al., 1995, Tiret et al., 1995).

Additionally, meta-analysis of 12 studies have reported 20% increase risk of hypertension in

Caucasians with T allele and TT genotype. OR of T vs. M was 1.2 (95% CI = 1.11 -1.29) (Kunz et

al., 1997). OR TT vs. MM was 1.31 (Staessen et al., 1999) OR 1.36 for TT genotype and 1.98 for

T allele (Say et al., 2005). Positive association of T allele was also found on several studies done

on Japanese population (Hata et al., 1994, Nishiuma et al., 1995, Yugar-Toledo et al., 2011) and in

Chinese and Taiwanese population (Ji et al., 2010, Niu et al., 1999, Chiang et al., 1997a). Besides

the genotype, several studies have reported the association between the AGT serum level and

hypertension (Rotimi et al., 1997, Bloem et al., 1997).

In this study, the significantly higher prevalence of the T allele and D allele in female

hypertensives is in agreement with other studies. For the T allele, it has been reported that it was

more prevalent among female hypertensives than in controls (0.51 vs. 0.37; X2=16.9, P˂0.001)

(Jeunemaitre et al., 1992b). However, other studies have reported that the T allele is more frequent

in males than females (Freire et al., 1998) while Pereira and associates reported no association

between the T allele and gender (Pereira et al., 2003).

Conclusion

In this case-control study, the D allele of the ACE I/D gene is associated with essential

hypertension in this sample of Algerian population in the Oran city while the T allele of the

M235T gene is not associated with onset of hypertension. However, this study may be improved

with further studies with well-designed larger sample size subjects involving other polymorphisms

in RAAS genes in relation with essential hypertension.

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