evaluation comparative de la mrd de lal en cytométrie en flux (4 couleurs) (n. robillard, r.garand,...
TRANSCRIPT
Evaluation comparative de la MRD de LALen Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand,
CHU, Nantes)
et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris)
• CMF: 151 patients (345 prélèvements) • PCR: 120 patients (202 prélèvements)
1 aout 2007
• Nantes: 128 patients (300 prélèvements) Patients consécutifs, non sélectionnés
• Extérieurs: 23 patients (45 prélèvements)(7 centres)
Patients testés en CMF car PCR problématique
• N.Nés: 14 cas, Enfants: 127 cas, Adultes: 10 cas
hyper CD10++ instable 53%hypo CD20- (10+) médiocre 42%hyper CD22++ médiocre 30%hyper CD34++homogène médiocre 50%hypo CD24+diminué bon 31% (84)
hypo CD38+diminué bon 54%hypo CD45+diminué bon 37%hyper CD58++ bon 73%hyper CD123++ bon 60% (66)
asynchro. CD21+ CD10+ bon 14% (85)
asynchro. CD20+/79b+ CD34+ bon 13%illégitime My (13,15,33,117) bon 29%illégitime T (2/4/5/7) bon 3%
marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL B(Nantes; dg: 2000-2007)(n= 225)
1 aout 2007
nombre de LAP pour
MRD(n= 112)
n
LAP
CD10+
n=96
CD10-
n=16
2 94% 100%
#1Hématones
CD58-PE
CD10-FITC
CD123-PE
#2 LAL-B-CD10+
#3 LAL-B-CD10+Gate: CD19+
0%
99%
99%
95%
99%
CD38-PE
99%
5%
95%
99%
99%
90%
1 aout 2007
hypo CD2- CD4- CD8- moyen (<0,1%) 33%
hyper CD4+ CD8+ moyen (<0,2%) 21%
immaturité CD3- cCD3+ CD5+ moyen (<0,1%) 63%
immaturité CD45+dim bon (<0,01%) 60%
hyper CD99+ bon (<0,01%) 77%
immaturité CD34++ bon (<0,05%) 30%
immaturité TdT+ bon (<0,01%) 70%
immaturité CD1a+ bon (<0,01%) 42%
illégitime CD10 bon (<0,01%) 21%
illégitime My (13,15,33,117) moyen (<0,1%) 30%
marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL T(Nantes+ext.; dg: 2003-2007)(n= 43)
1 aout 2007
n LAP LAL-T (n=43)
2 96%
Ly (CD45++) Blastes T (CD45+interm.)
CLO Fab LALTIII CD3-
cCD3-APC
CD99-PE
cCD3-APC
TdT-FITC
72%
92%
98%
79%
1 aout 2007
Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-B de l ’enfant
Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 96% des prélèvements
3(4) Ac.Mo. Constants, conjugués APC, PerCP & FITC
• CD19APC – CD45perCP – CD10FITC*
(* si LAL-B CD10-: ajout du CD20FITC)
4e Ac.Mo. Variable, conjugué PE
• contrôlePE
• CD20PE / CD34PE / CD38PE / CD58PE / CD123PE
• CD11a / CD21PE / CD22PE / CD24PE / CD79bPE
• CD2PE / CD4PE / CD5PE
• CD13PE / CD33PE / CD36PE / CD117PE
1 aout 2007
Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-T de l ’enfant
Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 76 / 85 (90%) des prélèvements
LAL-T CD3-• cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-contrôlefitc
• cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-TdTfitc
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-contrôlepe
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD99pe
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD34pe
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD1ape
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD10pe
• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD13/33/117pe
LAL-T CD3+Combinaisons « à la carte ». Incluant, par exemple: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, TdT, CD56, CD99, T…
1 aout 2007
• Marquage à 4 couleurs (PerCP, APC, PE, FITC) • (FACScalibur, BD, USA) • En acquisition sélective (« live-gating »):
- des cellules CD19+ totales si LALB - des cellules cCD3+ totales si LALT CD3- ou CD3+ totales si LALT CD3+
• Puis quantification par fenêtrages successifs des cellules leucémiques
*Selon Campana D, Constan-Smith E, Cytometry 38:139, 1999
Méthode*
1 aout 2007
1e étape: exemple d’une LAL-B CD10+
• Réglages et compensations• Traçage de la fenêtre de sélection (live gate) CD19+ • Calcul du % de cellules B (hors débris)
95% 2,3%
10.000 évènements
cell. B totales (R1xR2): 2,2% cell. Nuclées totales
1 aout 2007
2e étape: exemple d’une LAL-B CD10+ avec MRD négative• sélection des cell. B totales du tube (live gate CD19+) puis repérage et comptage des blastes leucémiques par multi-fenêtrage
Blastes leucémiques (MRD)=%Btot.x (R2xR3xR4xR6)=
2,2% x 0,00% (<20 events)= 0%=> MRD-LAL= <0,01%
(seuil de sensibilité maxi.)
22.000 évènementssélectionnés (/ 106 cell.)
R6
Blastes leucémiquesCD10+CD38+CD45-<0,01% cellules totales
HématogonesCD10+CD38++CD45+/++2,1% cellules totales
1 aout 2007
LAL-B CD10+ testée avec 6 combinaisons (+ 1 contrôle)
MRD
MRD MRD
MRD MRD
MRD
MRD
38+faible
34++homogène
10++fort 10++fort
10++fort 10++fort
10+
10++fort
45+faible
Blastes leuc. : 76,3% des cell.B tot(Phénotype: CD10++ CD13+ CD20- CD22+ CD34++ CD38+ CD45-/+
CD58+)MRD: 0,58% cellules totales
MRD LAL - Faisabilité
Technique Origine des
patients
Éval./total Faisabilité
CMF Nantes* 123 / 128 96%
Autres** 22 / 23 96%
total 145 / 151 96%
PCR Nantes* 101 / 116 87%
IGH/TCR Autres** - ** - **
* Patients consécutifs, non sélectionnés** Patients testés en CMF pour MRD problématique en PCR
1 aout 2007
MRD LAL - Faisabilitéselon le type immunologique*
Type Immunologique Éval./total Faisabilité
CMF B - CD10+ 84 / 87 97%
B – CD10- (MLL+: 12 / 13)
13 / 13 100%
T – imm. (TI, TII) 8 / 8 100%
T – mat. (TIII, TIV) 19 / 21 90%
PCR B - CD10+ 78 / 82 95%IGH/TCR B – CD10- (MLL: 10 / 11) 5 / 11 45%*
TCR T – imm. (TI, TII) 4 / 7 57%TCR T – mat. (TIII, TIV) 18 / 20 90%
Patients de Nantes (consécutifs, non sélectionnés), uniquement *p<0.001
1 aout 2007
MRD LAL - FaisabilitéCause des échecs de la détermination de la MRD en
CMF (9 prélèv.(3%); 6 patients (4%))# EGIL cause Pt de MRD inéval.
N1 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis. (2LAP:22++,34++)
Excès d’hématogones (7%)
1 / 2 (J70)
(J35: OK)
N2 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis.(1LAP: CD20-)
Excès d’hématogones (4-13%)
3 / 4 (J70,227,372)
(J35: OK)
N3 B2 / CD10+ Absence de LAP 1 / 1 (J35)
N4 T4 / CD3+T+
Sensib. Insuffis.(CD2- T+)
Excès de T+ normaux
1 / 3 (J117 post-allo.)
(J34,J57: OK=MRD++)
N5 T4 / CD3+T+
Sensib. Insuffis.(T+)
Résultats trop incertains
2 / 3 (J59,101)
(J31: OK=MRD++)
E5 T3 CD3-
/CD3+T+
2 clones de phénotype
impossible à distinguer
1 / 1 (J182)MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements
1 aout 2007
MRD LAL - Faisabilité de la CMF en cas de PCR IGH/TCR problématique
Type
Immuno.
B-CD10+
B–CD10-
T–immature / TCR-*
T–mature / TCR+*
Total
CMF évaluable
Total PCR problèm.
n. (%)
Cas
n.
prélèv
9 (26%) 20
9 (26%) 28
9 (26%) 29
7 (22%) 14
34 91
32 88
97%*surface T-cell receptor (CD3/T/T
1 aout 2007
MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le type immunologique
- nombre de prélèvements= 328/337 (97%)* -
Type n MRD négative MRD positive
Immuno. <0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1%
B-CD10+ 181 125
69%
19
10%
13 14
21%
10
B–CD10- 40 14
35%
4
10%
6 9
55%
7
T 107 66
55%
15
19%**
9 10
24%
7
Total 328 205
62%
38
12%
28
9%
33
10%
24
7%*prélèvements inévaluables en CMF exclus – n= 9 (3%) **comparaison MRD <0,1% LALT v LALB (tout type) p=0,03 (X2 test)1 aout 2007
MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le point de suivi (nombre de prélèvements= 342*)
*prélèvements inévaluables en CMF exclus, **biaisés (fait en cas de pb clinique ou de cyto)***comparaison MRD1 v MRD2: p=0.01 (X2 test)
Pt de suivi n MRD négative MRD positive
<0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1%
MRD-J21**
(Per-induc.)
MRD-J35(post-induc.)
15
120
8
53%
75
63%
0
0%
7
6%
0
9
3
47%
13
31%
4
16
MRD-J90 (conso.1)
97 60
62%
18
18%***
9 5
20%
5
MRD3**
(tardif)
76 50
66%
8
10%
5 11
24%
2
MRD4**
(post-allo.)
34 21
62%
4
12%
4 4
26%
1
1 aout 2007
MRD LAL - Fiabilité de la CMF Comparaison des résultats de MRD des prélèvements étudiés
en PCR IGH/TCR et en CMF parallèlement (tandem study)(nombre de prélèvements évaluables= 165)
Concordance
CMF=PCR
155 94%
Discordance
CMF<PCR
7 4% B-CD10+ (3 LAP)
B-CD10+ (2 LAP) B-CD10+ (1 LAP)
T1 (4 LAP)
T3ab (2LAP)
MRD1: CMF+:0,7% /PCR+>1%
MRD4: CMF+:0,07% /PCR+ 0,1-0,5%
MRD4: CMF+:0,01% /PCR+ 0,1%
MRD1: CMF+:0,25% /PCR+>1%
MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,5-1%
MRD1: CMF+:0,32% /PCR+>1%
MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,1-0,5%
Discordance
CMF>PCR
3 2% T3ab (3LAP)(Rech.)
B-CD10+ (3LAP)
MRD1: CMF+:0,20% /PCR+<0.1%
MRD2: CMF+:0,32% /PCR+<0,1%
MRD1: CMF+:0,34% /PCR+<0.1%
1 aout 2007
Conclusions• Excellente concordance des résultats de MRD en CMF-4 couleurs et PCR IGH-TCR compétitive (94%)
• En cas de discordance, le niveau de MRD en CMF est généralement plus faible qu’en PCR
• Applicabilité de la CMF supérieure à celle de la PCR (95% versus 87%), particulièrement pour les LAL-B CD10- et les LAL-T immatures
• CMF-4 couleurs plus rapide, plus simple (et moins coûteuse?) que la PCR quantitative
• mais fiabilité des résultats dépendant du nombre et, surtout de la qualité (sensibilité et stabilité) des marq. leucémiques testés, tant en CMF, qu’en PCR
• limites de la CMF: Qualité des prélèv. (viabilité cellulaire++) & Reproductibilité inter-labo. de la CMF?