etude phytochimique et biologique de leea guinensis (leeaceae)

UNIVERSITE JOSEPH FOURIER – GRENOBLE I

U.F.R. DE PHARMACIE

Année 1999 Thèse N°

THESEprésentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER –

GRENOBLE I

SPECIALITE : Chimie Moléculaire

Option : Sciences Pharmaceutiques

Présentée et soutenue publiquement le 14 décembre 1999

Par

Philippe OP de BECK

ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE

LEEA GUINEENSIS G. DON (LEEACEAE)

JURY

M. LECLERC G. Professeur à l’Université de Grenoble I Président

M. BARRON D. Professeur à l’Université de Lyon I Rapporteur

M. DAVID B. Docteur, Institut de Recherche Pierre FABRE Rapporteur

M. HOSTETTMANN K. Professeur à l’Université de Lausanne

Mme MARIOTTE A.M. Professeur à l’Université de Grenoble I

1

Mme DIJOUX-FRANCA M.G. Maître de Conférence à l’Université de Grenoble I

2

A ma sœur Christelle.

A ma famille, sources constantes d’encouragement, de soutien, de confiance et d’affection.

A Perrine, pour le soutien et l’aide si précieuse que tu m’apportes au quotidien.

A mes amis.

3

Remerciements

Nous tenons tout d’abord à remercier les Laboratoires Pierre FABRE et notamment :

Monsieur André CASSAN, Président de l’Institut KLORANE.

Nous avons été très sensible à votre appui, au financement que nous avons bénéficié ainsi

qu’à la confiance que vous nous avez témoignée. Veuillez recevoir ici notre profonde

reconnaissance et tous nos remerciements.

Au membre du jury :

A Monsieur le Professeur Kurt HOSTETTMANN, Professeur de Pharmacognosie et de

Phytochimie de l’Université de Lausanne.

Nous vous remercions d’avoir accepté de juger ce travail malgré vos nombreuses

sollicitations. Nous sommes honorés par votre présence à notre jury.

A Monsieur le Docteur Bruno DAVID, Directeur du Département Phytochimie du Centre de

Recherches sur les Substances Naturelles de l’Institut de Recherche Pierre FABRE à

Ramonville.

Nous exprimons nos vifs remerciements pour avoir accepté de juger ce travail. D’un contact

toujours aimable, vous avez répondu présent à nos nombreuses demandes malgré vos

multiples taches Vos remarques et discussions ainsi que l’aide efficace que vous nous avez

apportées dans la réalisation de ce travail ont été très appréciées. Soyez en vivement remercié.

A Monsieur le Professeur Denis BARRON, Professeur de Biochimie Végétale à l’Université

Claude Bernard Lyon I.

Soyez remercié d’avoir bien voulu accepté de juger ce travail. Sachez aussi que vos travaux

sur les flavonoïdes sulfatés nous ont beaucoup inspirés et que nous sommes très sensibles à

l’honneur que vous nous faite d’être rapporteur.

4

A Monsieur le Professeur Gérard LECLERC, Professeur de Chimie Organique à l’UFR de

Pharmacie de Grenoble et Directeur du Département de Pharmacochimie Moléculaire.

Nous sommes sensible à l’intérêt que vous portez à juger notre travail. Recevez ici le

témoignage de ma gratitude.

A Madame le Professeur Anne-Marie MARIOTTE, Professeur de Pharmacognosie à l’UFR

de Pharmacie de Grenoble.

Votre accueil dans votre laboratoire m’a permis de faire mes premiers pas dans la recherche

sur les substances naturelles. Recevez ici, mes sincères remerciements.

A Madame le Docteur Marie-Geneviève DIJOUX-FRANCA, Maître de Conférence en

Pharmacognosie à l’UFR de Pharmacie de Grenoble.

Qu’il me soit ici permis de te remercier pour l’autonomie dont j’ai bénéficiée ainsi que pour

les conseils et ta disponibilité pour l’apprentissage de l’enregistrement des spectres RMN. Tu

m’as aussi réconcilié avec l’anglais, bravo ! En témoignage de ma profonde gratitude, trouves

ici mes plus vifs remerciements.

Aux personnes qui ont participé "de près ou de loin" à son élaboration :

A Monsieur Jean Marie BESSIERE, Professeur à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de

Montpellier.

Je vous remercie pour les analyses CG/SM que vous avez effectuées ainsi que pour le

constant suivi du devenir de ces composés volatils. Comme vous le dites si bien, on touche au

but !

A Mesdames M.-F. ARIES, C. VAISSIERE, A. BEL et C. CHARVERON du Département

Evaluation et Exploration Fonctionnelle et Cutanée, Laboratoire de Biologie Cellulaire de

l’Institut de Recherche Pierre FABRE de Toulouse.

Nous vous remercions pour les analyses effectuées au sein de votre unité.

5

A Monsieur Claude BOSSO, Directeur de l’unité de Spectrométrie de Masse du Centre

d’Etude et de Recherche sur les Macromolécules Végétales de Grenoble.

Soyez remerciez pour la réalisation et les analyses des spectres de masse. Vos conseils

judicieux et votre disponibilité ont été très appréciés.

A Monsieur François TOMASSON, Ingénieur recherche, responsable du service commun de

RMN de l’UFR de Pharmacie, pour m’avoir donner la possibilité de manipuler l’AC200.

L’obtention généreuse de ces précieuses unités RMN pour les soirées, les WE ou les vacances

ainsi que vos discussions à propos de nos travaux scientifiques ou en ce qui concerne nos si

belles montagnes ont été fortement appréciées.

A Monsieur Gilbert CARTIER, le "Géotrouvetout" du Laboratoire de Pharmacognosie pour

la préparation des extraits et leur lyophilisation. Je vous remercie pour votre disponibilité et

votre enthousiasme très communicatif.

A Messieurs DEBOUZY et BRAHME du Laboratoire de Biophysique du Centre de

Recherche du Service de Santé des Armées de Grenoble, pour nous avoir donné la possibilité

d’effectuer des analyses spectrales (RMN, MS/MS).

A Monsieur Achoundong, Botaniste au Cameroun, pour la récolte de Leea guineensis. Sans

vous point d’étude !

A Monsieur Jean Marc NUZILLARD, Directeur de Recherche CNRS au Laboratoire de

Pharmacognosie de l’Université de Reims pour avoir passer un échantillon sur le 500 MHz

tant rêvé !

A Monsieur Ahcène BOUMENDJEL, Maître de Conférence au Laboratoire de

Pharmacognosie, pour tes conseils, ton intérêt à nos travaux et nos discussions éclectiques.

6

A Monsieur Patrick RAVANEL, Professeur de Biologie Végétale, Directeur du Laboratoire

Ecosystèmes et Changements Environnementaux de Grenoble, pour tes encouragements tout

au long de ce travail, ton aide et ta disponibilité. J’ai aussi beaucoup aimé tes diapos sur les

plantes toxiques de France, il va de soit que ta narration avec l’accent d’la Yaute y sont pour

quelque chose !

A Madame Claude VIAL, pour sa gentillesse et sa disponibilité pour les nombreuses

recherches en ligne que nous avons effectuées.

A Diderot Noungoue Tchamo, je te remercie, entre autre, pour m’avoir offert ton amitié et

amené Leea guineensis. Reçois ici, toi qui es devenu Maître de Conférence à Yaoundé, un

témoignage de ma profonde amitié.

A Gilles BRUN, "le Dupont bis", ton travail sur Catharanthus roseus, nous aura confronté

aux mêmes situations. Reçois ici un témoignage de mon Amitié.

A toutes les personnes du Laboratoire de Pharmacognosie, pour l’ambiance chaleureuse

rencontrée et leur vive sympathie.

A Stéphane, thésard au Laboratoire de Chimie bioorganique pour avoir enregistré les spectres

au 300 MHz au CEA cet été !

A Jin, Médecin Pharmacologue de l’Université de Shanghai, en stage chez nous qui a essayé

de mettre au point un test antioxydant pour l’analyse de nos produits ainsi que pour les

résultats préliminaire sur la relaxation des muscles lisses.

Au Laboratoire de Pharmacologie Médicale de l’UFR de Médecine pour les premiers résultats

sur la recherche d’une activité relaxante sur les veines saphènes humaines.

A ma sœur Muriel et son entreprise O de Gamme pour avoir eu la gentillesse de me scanner

les planches et dessins de Leea.

7

Liste des abréviations

13C J modulé spectre carbone 13 réalisé avec J modulationBAW Butanol-Acide acétique-EauBuOH butanolC(x) Solvant de Chromatographie de type (x)C-18 Chromatographie sur support en phase inverse C-18CCM Chromatographie sur Couche MinceCCMprep Chromatographie sur Couche Mince PréparativeCDCl3 chloroforme deutériéCD3OD méthanol perdeutériéCG/SM couplage Chromatographie Gazeuse-Spectrométrie de MasseCHCl3 chloroformecHex cyclohexaneCH2Cl2 dichlorométhaneCLMP Chromatographie Liquide Moyenne PressionCO chromatographie sur Colonne OuverteCOLOC XH shift Correlation by Long range CouplingCOSY Correlated SpectroscopYCPG Chromatographie en Phase GazeuseCV Composés VolatilsDCI Desorption by Chemical IonisationDIC Degré d’Insaturation et de CycleDMSO diméthyl sulfoxydeDMSO-d6 diméthyl sulfoxyde hexadeutériéE(x) Elution de type xEI Electronic ImpactEtOAc acétate d’éthyleEtOH éthanolFAB Fast Atom BombardementF () ST Flavonol SulfotransféraseJ (Hz) constante de couplage exprimé en HzL. LeeaLH-20 chromatographie sur gel de Sephadex LH-20MeOH méthanolm/z masse/charge électroniquend non déterminéPM Poids Moléculaireppm partie par millionRdt rendementrel relatifRf Rapport frontalRha RhamnosylRMN Résonance Magnétique NucléaireRP Phase InverseSi et SiO2 support chromatographique en siliceSM Spectrométrie de Masse

8

ST Sulfotransféraseuma unité de masse atomiqueUV Ultra-VioletVisiprep Colonne prête à l’emploi de type VisiprepVLC Vacuum Liquid ChromatographyXHCORR XH shift CORRelated 2D NMR (ppm) déplacement chimique exprimé en ppmmax longeur d’onde d’absorbance maximale

9

TABLE DES MATIERES

PAGE

Introduction 2

Première Partie – Bibliographie 4

Chapitre I - Etude Botanique 5

I- Position systématique 5

A) Historique de la taxonomie du genre Leea 5

B) Position systématique de la famille des Leeaceae 7

C) Conclusion 9

II- Généralités sur le genre Leea 11

A) Classification et composition du genre 11

B) Principaux caractères botaniques 14

C) Répartition géographique 15

III- Généralités sur l’espèce Leea guineensis G. Don 17

A) Dénomination et synonymies 17

B) Noms vernaculaires 20

C) Répartition géographique 21

D) Description botanique 22

E) Divers 26

Chapitre II – Etudes phytochimique et biologique des Leeaceae 27

I- Etude phytochimique 27

A) Criblage phytochimique 27

B) Huile essentielle 28

C) Composés phénoliques 28

10

II- Etude biologique des Leea 31

A) Activités des différentes espèces de Leea 31

B) Activités de Leea guineensis 35

C) Conclusion 39

Chapitre III - Les Flavonoïdes Sulfatés 40

I- Introduction 40

II- Classification, Structure 40

A) Les flavones sulfatées 42

B) Les flavonols sulfatés 45

III- Distribution 49

IV- Fonctions 50

A) Détoxification 51

B) Transfert d’ion 51

C) Bioactivation 51

D) Régulation du transport de l’auxine 52

V- Enzymologie 52

VI- Métabolisation et Bioconversion 54

A) Métabolisation 54

B) Bioconversion 55

VII- Propriétés biologiques des flavonoïdes sulfatés 55

A) Activité Antiallergique 55

B) Activité Mutagène – Carcinogène 56

C) Inhibition des déshydrogénases 57

D) Inhibition de l’aldose réductase 57

E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire 60

F) Chimioprévention des cancers du sein 61

Conclusion 63

11

Deuxième Partie - Travaux Personnels 64

Chapitre I - Matériel végétal et Chimie Extractive 65

I- Matériel végétal 65

II- Chimie extractive 65

A Extraction solide-liquide des feuilles 65

B Extraction liquide-liquide 65

C Hydrodistillation 66

Chapitre II - Isolement des composés 68

I- Extrait hexanique 68

II- Extrait dichlorométhane 69

III- Extrait acétate d’éthyle 70

IV- Extrait butanolique 71

V- Extrait aqueux 72

Chapitre III - Analyse Structurale 73

A- Etude des composés volatils 73

I- Analyse 73

II- Discussion 77

B- Etude des Terpénoïdes 80

I- Identification de Terp-1 80

II- Identification de Terp-2 83

III- Identification de Terp-3 87

IV- Identification de Terp-4 89

12

V- Identification de Terp-5 91

VI- Identification de Terp-6 95

VII- Identification de Terp-7 100

C- Etude des Flavonoïdes 103

I Identification de Flav-1 103

II Identification de Flav-2 105

III Identification de Flav-3 107

IV Identification de Flav-4 109

V Identification de Flav-5 115

VI Identification de Flav-6 118

VII Identification de Flav-7

120

D- Etude des composés divers 125

I Identification de Ac Ph-1 125

II Identification de Ac Ph-2 126

III Identification de AG-1 128

Chapitre IV – Activités Biologiques 130

A– Evaluation des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la

viabilité cellulaire 130

I- Introduction 130

II- Résultats 131

III- Conclusion 132

B– Activité du palmitate de -amyrine et des extraits EtOAc,

BuOH, H2O sur la production de prostaglandines 6KF1 133

I- Introduction 133

II- Résultats 134

III- Conclusion 136

13

C– Activité du palmitate de -amyrine sur l’expression de

l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 137

I- Introduction 137

II- Résultats 138

III- Conclusion 138

D– Activité antiradicalaire des extraits EtOAc, BuOH, H2O et

de certains composés 139

I- Introduction 139

II- Résultats 140

III- Conclusion 142

Discussion 144

Conclusion 155

Bibliographie 159

Annexes 173

Matériels et Méthodes 174

I Lyophilisation 174

II Matériel chromatographique 174

A Chromatographie analytique en couche mince (CCM) 174

B Chromatographie préparativeB Chromatographie préparative

174174C Chromatographie en phase gazeuse (CPG) 176

14

III Méthodes chromatographiques177

A Extrait hexanique 177

B Extrait dichlorométhane 179

C Extrait acétate d’éthyle 181

D Extrait butanolique 182

E Extrait aqueux 183

IV Mesures spectrales 184

A spectre UV184

B Spectre de masse (SM) 184

C Spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) 184

D Pouvoir rotatoire184

V Méthodes chimiques 185

A Recherche de tanins185

B Recherche d’alcaloïdes185

C Recherche de saponines185

D Hydrolyse du palmitate de -amyrine185

VI Tests biologiques 186

A Evaluation de la viabilité cellulaire 186

B Evaluation de la production de prostaglandines 6KF1 par les kératinocytes humains 188

C Evaluation de l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1

189

D Evaluation d’une activité antiradicalaire191

VII Fiches produits 193

VIII Liste des noms usuels des flavones 210

15

IX Liste des noms usuels des flavonols 210

X Liste des figures 211

XI Liste des tableaux 213

16

Philippe OP de BECKEtude Phytochimique et Biologique de Leea guineensis G. Don (Leeaceae)

Mots Clés :Leea guineensis G. Don, Leeaceae, Composés volatils, Flavonoïdes, Flavonols sulfatés, Terpènoïdes, Triterpènes acylés, Acides phénoliques, Anti-inflammatoire, Cardiovasculaire, Antiradicalaire, RMN, CG/SM

Résumé :Très peu étudiée, Leea guineensis G. Don appartient à la famille monogénérique des

Leeaceae. Elle est utilisée en médecine traditionnelle notamment dans les domaines cardiovasculaire et anti-inflammatoire. Pou ces raisons, l’étude phytochimique et biologique de cette plante est intéressante.

Dans une première partie, nous avons rappelé les données bibliographiques concernant la classification et la description botanique de cette plante, ses utilisations en médecine populaire et les études phytochimiques déjà réalisées.

Une deuxième partie présente les résultats de notre propre étude phytochimique et biologique. Ainsi, 73 composés volatils et 17 métabolites provenant de cinq extraits (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et eau) des feuilles ont été identifiés. L’utilisation conjointe de plusieurs méthodes spectroscopiques (CG/SM, UV, RMN 1D et 2D, SM) a ainsi mis en évidence 7 terpénoïdes dont 3 triterpènes acylés, 7 flavonoïdes dont 3 flavonols sulfatés, 2 acides phénoliques et 1 acide gras.

La présence de flavonoïdes sulfatés et de terpénoïdes dans cette famille est recensée pour la première fois. Le coriolate de -amyrine, la quercitrine 3’-sulfate et la quercétine 3,3’,4’-trisulfate sont isolés pour la première fois du règne végétal.Les activités anti-inflammatoire et antiradicalaire ont été recherchées sur les extraits polaires et quelques composés purs. L’activité anti-inflammatoire, mesurée par la production de prostaglandines, est peu significative pour les extraits alors que le palmitate de -amyrine s’est montré actif. Par ailleurs ces mêmes extraits ainsi que les acides phénoliques et les flavonols non sulfatés présentent une activité antiradicalaire.

Abstract :The Leeaceae is a monogeneric family close to the Vitaceae. Leea guineensis is a

widespread shrub that grows in tropical climate. It was reported to be used in traditional African medicine for its cardiac and antalgic properties.

Our phytochemical investigations led to the identification of 73 volatils compounds from the wood and leaves, and of 17 compounds coming from five different extracts from leaves (hexane, dichloromethane, ethylacetate, butanol and water). They were identified by means of their spectroscopic data (GC/MS, UV, NMR, SM) and especially 2D NMR experiments, as 7 terpenoids (including 3 acylated triterpens), 7 flavonoids (including 3 sulphated flavonols), 2 phenolic acids and 1 fatty acid.

Sulphated flavonoids and terpenoids have never reported previously in the Leeaceae. Coriolic ester of -amyrine, quercitrine 3’-sulphate and quercetine 3,3’,4’-trisulphate are reported for the first time in the plant kingdom.

Biological activity of the polar extracts and of some pure compounds have been evaluated on prostaglandins production and metalloproteinase expression in keratynocyts. Besides these anti-inflammatory activities, a potential antiradicalar property was mesured.

17

INTRODUCTIONINTRODUCTION

18

INTRODUCTION

Au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire, unité mixte de recherche

CNRS/UJF (5063), dont la thématique de recherche est la conception, la synthèse et le

criblage de molécules à activités antioxydante et cardiovasculaire, le Laboratoire de

Pharmacognosie a pour objectif, l’isolement, l’identification et l’hémisynthèse de molécules

naturelles actives.

Dans cette optique, il m’a été confié l’étude d’une plante camerounaise, Leea

guineensis (Leeaceae). Celle-ci est notamment utilisée en médecine traditionnelle pour ses

effets anti-inflammatoires et antihypertensifs.

Or, l’analyse de la littérature montre que la famille des Leeaceae a été très peu

étudiée. On ne répertorie, de 1959 à 1991, qu’une vingtaine de dérivés phénoliques

(flavonoïdes et acides phénoliques), et quelques criblages préliminaires faisant apparaître des

tanins, des alcaloïdes et des saponines pour certaines espèces.

L’étude entreprise sur Leea guineensis offre deux intérêts majeurs. Premièrement,

toute l’analyse phytochimique sera nouvelle pour cette espèce, car avant nous, aucun travail

n’a été entrepris. L’identification des constituants majoritaires permettra aussi de mieux

connaître la famille et de la situer dans la systématique moderne. Deuxièmement, une étude

des propriétés biologiques des extraits ainsi que des composés isolés, permettront de valider

les usages de cette plante en médecine traditionnelle ou d’apprécier de nouvelles propriétés.

La première partie, bibliographique, est consacrée à une étude botanique très générale

de la famille des Leeaceae, et de l’espèce Leea guineensis G. Don. L’étude phytochimique et

biologique des Leeaceae fait l’objet d’un second chapitre. Cette étude bibliographique est

complétée par un troisième chapitre consacré aux flavonoïdes sulfatés. L’isolement de ces

composés n’ayant encore jamais été rencontrés chez les Leeaceae, il paraît intéressant de

rappeler leurs principales caractéristiques.

19

La deuxième partie est consacrée aux travaux personnels. Dans un premier temps,

nous exposons comment à partir de la préparation de différents extraits de polarité croissante,

nous avons purifié les composés. Puis nous analyserons les principaux composés obtenus par

hydrodistillation du bois et des feuilles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse. L’étude des extraits provenant des feuilles, a permis, après des

fractionnements successifs sur différents supports chromatographiques, d’isoler et d’identifier

des composés essentiellement de nature terpénique et phénolique. L’identification de ces

molécules est obtenue par l’analyse conjointe de plusieurs techniques spectrales comme l’UV,

la spectrométrie de masse, la résonance magnétique nucléaire RMN 1D et 2D (COSY,

COLOC, XHCORR).

Le chapitre suivant présente les recherches menées sur les activités biologiques des

extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles, ainsi que de quelques composés

purifiés, ceci afin de vérifier l’utilisation de la plante en médecine traditionnelle. Les activités

anti-inflammatoire et antiradicalaire sont ainsi déterminées.

20

Première PartiePremière Partie ::

BibliographieBibliographie

Botanique

Phytochimie et biologie des Leeaceae

Flavonoïdes sulfatés

21

Chapitre I - Etude Botanique

Ce chapitre présente les données générales de l’évolution historique au sein de la

systématique du genre Leea et de la famille des Leeaceae, ainsi que les difficultés

rencontrées pour classer cette famille dans la taxonomie actuelle. Une étude des

caractéristiques botaniques du genre Leea et de l’espèce étudiée, Leea guineensis G. Don, est

ensuite présentée, suivie d’une revue bibliographique concernant la phytochimie et les

diverses activités biologiques de cette famille et plus particulièrement de notre espèce.

I- Position systématique

Pour la plupart des auteurs, Leea guineensis G. Don appartient aux Dicotylédones

Dialypétales, à l’ordre des Rhamnales, à la famille des Leeaceae. Cette hypothèse soutient la

thèse de Cronquist [1988]. Cependant la position taxonomique du genre Leea van Royen ex

L. a subi diverses modifications au cours du temps.

A) Historique de la taxonomie, positionnement du genre Leea :

Les recherches de Suessenguth [1953], Nair [1968] et Ridsdale [1975] montrent toutes

les difficultés rencontrées pour classer le genre Leea au sein de la systématique. Les

premières traces "pré-Linnéenne" montrent que le genre était connu par Rheede (vers 1678-

79), qui fut le premier à le décrire et l’illustrer sous le nom de Nalugu. Plus tard, Rumphius

(1743) décrit et représente deux espèces provenant d’Ambon, une île d’Indonésie. Ces taxons

sont aujourd’hui connus comme étant L. aculeata et L. aequata. Ce n’est que depuis 1767 que

cette famille est monogénérique et a pour nom de genre, Leea. Ce genre a été nommé ainsi en

l’honneur de James Lee (1715-1795), horticulteur qui a créé une pépinière à Hammersmith à

Londres et qui avec son collègue William Malcolm a été le premier à cultiver les Leea en

Europe dès 1767. Les collections de ces spécimens cultivés sont préservées au British

Museum. Quant à la famille Leeaceae, sa création est attribuée à Dumortier (1829), qui place

cette famille près des Sapotaceae. Cela n’empêchera pas au cours de l’histoire de voir les

Leea ballottées dans différentes familles et sous-familles.

22

Tableau 1 : Classement taxonomique du genre Leea

Classement Auteurs Annéesgenre Nalugu Rheede 1678genre Leea Lee 1767

genre Staphylea Burm. 1768genre Aquilicia Mantissa 1771

genre « Sapotis affinia » De Jussieu 1789Leea dans une tribu Ampelideae De Candolle 1824

famille Leeaceae Dumortier 1829Leea dans famille Meliaceae Mérat et De Lens 1829

famille monogénérique Leeaceae Bartling 1830Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Lindley 1833Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Bentham et Hooker 1862

Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) (relation avec Meliaceae) Le Maout, Decaisne 1876Leea hors des Vitaceae Planchon 1887

Leea dans sous-famille Leeoïdeae à côté des Vitioïdae dans famille Vitaceae

Gild 1896

famille Leeaceae Gagnepain 1910Leeoïdae élévés en famille Leeaceae Gild, Brandt 1912

famille Leeaceae (relation avec Buettnerinae des Sterculiaceae) Suessenguth 1953genre Leea hors des Vitaceae Periasamy 1962

Leea inclus dans Vitaceae Hutchinson 1973famille Leeaceae à côté des Vitaceae Behnke et Dahlgren 1976

famille Leeaceae Cronquist 1988sous-famille Leeoïdae dans les Vitaceae Thorne 1992

famille Leeaceae Takhtajan 1997

Aujourd’hui, le genre Leea est placé dans la famille des Leeaceae proche des

Vitaceae. Mais si on remonte dans la systématique, on se rend compte que le choix

d’appartenance à un ordre est tout aussi difficile. En effet, la place des Leeaceae a subi aussi

diverses modifications.

23

B) Position systématique de la famille dans un ordre

La famille des Leeaceae, tout en étant étroitement liée à celle des Vitaceae, est

généralement placée dans l’ordre des Rhamnales. Or cette position est parfois contestée. Ainsi

même s’il existe des différences entre les graines de Leeaceae et de Vitaceae, celles-ci sont

trop différentes de celles des autres familles de l’ordre des Rhamnales pour justifier cette

inclusion [Corner 1976].

De même Behnke et Dahlgren [1976] montrent que les Vitaceae et Leeaceae ont des

plastides de type P (avec des protéines cristalloïdes polygonales) alors que chez les

Rhamnaceae, ils sont de type S (avec de l’amidon). Ainsi, il faut séparer clairement ces deux

groupes de familles. Cronquist sépare les Leeaceae des Vitaceae, et les place aux côtés des

Rhamnaceae [Cronquist 1988]. Ces trois familles sont placées dans l’ordre des Rhamnales.

Plus récemment, Takhtajan [1986, 1997], sépare le groupe des Leeaceae et Vitaceae de la

famille des Rhamnaceae, et place celui-ci dans un même ordre, les Vitales, issu du superordre

des Vitanae. En effet, les Leeaceae et Vitaceae diffèrent, entre autres, des Rhamnaceae par la

présence de raphides (absence chez les Rhamnaceae), de fruits qui sont des baies, (drupes

chez les Rhamnaceae), de plastides de type P (type S chez les Rhamnaceae) et par l’anatomie

des graines.

Ces derniers critères sont aussi ceux que Cronquist utilise pour étudier l’ordre très diversifié

des Rhamnales. Et bien que les Leeaceae et les Vitaceae soient très proches, ces deux familles

sont bien distinctes des Rhamnaceae.

L’évolution de la position des Leeaceae dans la systématique moderne peut être résumée dans

le tableau suivant :

Tableau 2 : Situation des Leeaceae dans la systématique moderne

AuteurAnnée

Hutchinson1973

Dahlgren1989

Cronquist1988

Thorne1992

Takhtajan1986 - 1997

Superordre Santaliflorae VitanaeOrdre Rhamnales Vitales Rhamnales Cornales Vitales

Sous-ordre VitinaeFamille

Sous-famille(Nbre d’espèces)

Vitaceae(Leeaceae incluse)

Vitaceae Leeaceae

(70)

Vitaceae

Leeoideae(34)

Leeaceae

(70) en 1986(34) en 1997

24

Cet historique sur la taxonomie des Leea nous aura permis de les placer dans une

famille monogénérique, les Leeaceae, proche des Vitaceae. A l’heure actuelle, il est

préférable de placer ces deux familles dans un même ordre, celui des Rhamnales. Cette

classification est simple et a l’avantage de grouper des familles proches dans un même ordre,

tout en les séparant distinctement.

Mais comme nous avons pu le remarquer, la position systématique des Leea a été

quelque peu controversée. Des affinités ont même été suggérées avec les Sapotaceae

[Suessenguth 1953], les Meliaceae [Le Maout 1876] et les Sterculiaceae [Nair 1968].

Néanmoins, c’est surtout avec les Vitaceae qu’elles ont été longtemps classées. Or, les

Leeaceae semblent avoir suffisamment de caractères distinctifs pour en être séparées (Tableau

3), (Figure 1). Ce sont les études sur l’anatomie florale, l’embryologie, la palynologie et la

chimiotaxonomie qui ont permis de classer en tant que famille monogénérique les Leeaceae,

et de les séparer des Vitaceae [Gagnepain 1911, Suessenguth 1953, Nair 1957 et 1968,

Tarnavschi 1968, Ridsdale 1975, Corner 1976, Patil 1984, Gerrath 1990, Umadevi 1991,

Verdcourt 1993, Thakhtajan 1997].

Tableau 3 : Différences essentielles entre les Leeaceae et les Vitaceae :

Différences Vitaceae LeeaceaePort lianescent droitVrilles présence absenceInflorescence extra-axillaire terminaleTube staminal absent présentNombres de carpelles par ovaire 2 + de 2Nombre de loges simple double

(3-8)(par la formation de

fausse cloison)Nombre d’ovule dans chaque loge 2 au moins 1Graines 1-3

ovoïdesruminées

4-6triangulaires-ovalées

très ruminées(souvent à 5 croissances)

Nombre de chromosomes 2n=38 ou 402n=24 pour quelques Cissus

2n=24

Stomates gros, peu nombreux petits et nombreux

25

Figure 1 : Différents types de graines de Vitaceae et Leeaceae [Ridsdale 1975]

C) Conclusion sur la systématique

Bien qu’il y ait de très fortes affinités avec les Vitaceae, les Leea ont suffisamment de

caractères distinctifs pour être considérées comme une famille monogénérique à part entière ;

les Leeaceae, appartenant à l’ordre des Rhamnales.

D’après tous ces critères, et avant d’aborder les généralités propres aux Leea, nous

pouvons situer dans la systématique la plante qui fait l’objet de ce travail, Leea guineensis G.

Don (Figure 2).

26

Caryophyllidae

Magnoliidae Hamamelidae

Dilleniidae

Rosales

Fabales Proteales Podostemales Haloragales

Myrtales Rhizophorales

Cornales Santalales

Rafflesiales Celastrales Euphorbiales Linales

Polygalales Sapindales Geraniales Apiales

Rhamnaceae(900 espèces)

Vitaceae(700 espèces)

Liliopsida(Monocotylédones)

55000 espèces

Magnoliophyta(Angiospermes)220000 espèces

Magnoliopsida(Dicotylédones)165000 espèces

Rosidae116 familles

(60000 espèces)

Rhamnales3 familles

(1700 espèces)

Leea

Leea guineensis G. Don

Leeaceae(70 espèces)

Asteridae

Sous-embranchement

Classes

Sous-classes

Ordres

Familles

Genre

Espèce

Figure 2 : Situation dans la systématique de Leea guineensis G. Don (selon Cronquist 1988)

27

II- Généralités sur le genre Leea

Avant d’aborder les principaux caractères des Leea, nous discuterons des possibilités

de division du genre.

A) Classification et composition du genre Leea

Ce genre a été divisé par Clarke en 1881 en deux séries en fonction de la couleur des

fleurs (Tableau 4). Puis, ces séries furent sous-divisées en sections contenant une ou plusieurs

espèces. Les sections dressées par Clarke consistent à grouper les espèces parentes, mais sont

insuffisantes pour former des séparations formelles entre elles [Suessenguth 1953, Ridsdale

1975].

Tableau 4 : Classification selon Clarke (1881)

Séries Sections Espèces typiquesRubiflorae(fleurs rouges)

EdgeworthiaeLaetaeRubrae

L. alataL. laetaL. rubra

Viridiflorae(fleurs vertes)

PycnoneuraePaucifoliolosaeSambucinaeAequatae

L. crispaL. macrophyllaL. sambucinaL. aequata

Cette division du genre en deux séries n’est pas satisfaisante et d’autres caractères plus

importants sont à prendre en compte pour la connaissance et la description des espèces.

Gagnepain [1910] a lui aussi tenté de classer les différentes Leea. Il commence l’analyse par

les caractères floraux qui, bien que très homogènes dans la famille, montrent des variations

très précises de l’androcée suivant les espèces. Il sépare ainsi en 4 groupes les Leea. A ces

caractères floraux, il ajoute l’analyse des feuilles (simples, composées, glabres ou plus ou

moins velues), et la coloration des fleurs pour distinguer 19 espèces de Leea asiatiques.

Selon les travaux de Burt (1935), on peut séparer le genre en subdivisions reposant sur

le type structural de la fleur (pentamère ou tétramère). Cette suggestion est pratique pour les

taxas des Philippines (qui présentent par ailleurs de nombreux types de graines). C’était un

28

bon moyen pour séparer le genre en groupes distinctifs, mais de récentes collections montrent

par exemple que L. tetramera est une espèce qui peut être tétra ou pentamère [Ridsdale 1975].

Kirtikar et Basu [1975] distinguent quant à eux 3 groupes selon les feuilles de

quelques Leea asiatiques :

Tableau 5 : Classification selon Kirtikar et Basu [1975]

Groupe Feuilles EspècesA Feuilles simples L. macrophyllaB Feuilles simplement pennées

(le plus souvent)L. crispa

C Feuilles bi- ou tripennéesglabres

faces inférieures velues

L. indica

L. robustaL. diffusaL. asperaL. hirta

Ces différentes études montrent, qu’il est difficile de diviser de façon formelle le

genre, aussi est-il préférable de parler de famille monogénérique. La détermination des

différentes espèces se fera sur l’utilisation d’une clef du type de celle mise au point par

Ridsdale [1975].

Ridsdale [1975] a fait une révision complète de la famille, dans laquelle il reconnaît

34 espèces. 32 se rencontrent dans l’aire Indo-Malaisienne, et 2 sont limitées dans l’aire Afro-

Malgache. Il a remarqué qu’il était très difficile de différencier certaines espèces sur les seuls

critères des feuilles et des fleurs (la séparation des espèces n’étant possible qu’en considérant

de grosses différences dans la longueur de certains organes).

29

Voici la liste des différentes espèces qu’il reconnaît :

L. aculeata Bl. ex Spreng.

L. acuminatissima Merr.

L. aequata L.

L. alata Edgeworth

L. amabilis Masters

L. angulata Korth. ex Miq.

L. compactiflora Kurz

L. congesta Elm.

L. coryphantha Laut.

L. crispa van Royen ex L.

L. curtisii King.

L. gonioptera Laut.

L. grandifolia Kurz

L. guineensis G. Don

L. heterodoxa K. Schum. & Laut.

L. indica (Burm f) Merr.

L. krukoffiana Ridsd.

L. macrophylla Roxb. ex Hornem.

L. macropus K. Schum. & Laut.

L. magnifolia Merr.

L. papuana Merr. & Perry

L. philippinensis Merr.

L. quadrifida Merr.

L. rubra Bl. ex Spreng

L. saxatilis Ridl.

L. setuligera Clarke

L. simplicifolia Zoll. & Moritzi

L. smithii Koorders

L. spinea Desc.

L. tetramera Burtt.

L. thorelii Gagnep.

L. tinctoria Baker

L. unifoliata Merr.

L. zippeliana Miq.

Par ailleurs, il recense trois espèces douteuses :

L. erecta Voll. & Brade qui serait une espèce non reconnue en botanique,

L. humilis Hassk. qui serait probablement L. aequata

L. javanica Bl. ex Spreng. qui serait une espèce dont on ne retrouve plus trace.

Il exclue aussi 6 espèces :

L. cordata Wall. qui devient une espèce de Vitis (Vitaceae).

L. dielsii Léveillé qui est Ampelopsis chaffanjoni (Léveillé) Rehder (Vitaceae).

L. laevis Heyne ex Wall. qui est Trichilia connaroides (W. & A.) Bentv. (Meliaceae).

L. odontophylla Wall. qui est Ampelopsis latifolius (Wall.) Planch. (Vitaceae).

L. spinosa Spreng. qui est Aralia chinensis L. (Araliaceae).

L. theifera Léveillé qui est Ampelopsis cantoniensis (Hook. & Arn.) Planch.

(Vitaceae).

30

Avec le nouveau mode de communication qu’est Internet, on retrouve d’autres espèces

[Phytochemical and ethnobotanical database, GRIN database]. Peut-être s’agit-il de noms

synonymiques non répertoriés ?

L. coccinea Boj.

L. guinensis

L. hirta Banks ex Roxb.

L. robusta

L. sambucina Schum. et Thonn.

Cette famille monogénérique Leea Royen ex Linn., Mant. I, 17, (1767), 124.

comprend à ce jour plus de 70 espèces réparties dans différentes régions d’Afrique, d’Asie,

d’Australie et d’Océanie.

B) Principaux caractères botaniques [Descoings 1967]

Les Leea peuvent être des plantes herbacées, des arbres, ou des arbustes de 2 à 10 m

de hauteur.

Les tiges et les feuilles

Les tiges sont droites, ramifiées ou non, généralement lenticellées, parfois munies de fortes

épines, sans vrille, à feuilles généralement groupées aux extrémités.

Les feuilles sont composées, pennées, bi- ou triternées, à rachis caniculé, à pétiole élargi et

embrassant à leur base. Les stipules sont soudées aux pétioles, et caduques.

Les folioles

Les folioles de forme et de taille variables, sont généralement simples, à bord crénelé ou

denté, à nervation simple, pennée.

31

Les inflorescences

Elles sont grandes, corymbiformes et sont opposées aux feuilles supérieures.

Les fleurs

Elles sont rouge ou jaune verdâtre, de taille réduite (5-6 mm) et pédicellées.

Les fruits

Ce sont des baies globuleuses, côtelées faiblement charnues, à 4-6 graines avec la présence de

raphides.

Les graines

Elles sont ovales, anguleuses, à section transversale triangulaire par compression latérale et

présentent sur les faces latérales des dessins ou un léger creux. Elles sont constituées d’un

embryon linéaire à radicule infère, avec un albumen ruminé montrant de profondes fossettes.

C) Répartition géographique

On rencontre les Leea principalement dans les zones tropicales d’Asie et d’Afrique

alors qu’elles ne sont pas présentent sur le continent américain. Le genre est centré sur la

Malaisie et s’est développé vers l’ouest en Afrique et Madagascar, et vers l’est aux îles Fiji

[Suessenguth 1953, Harriman 1991, Ridsdale 1975].

Les espèces afro-malgaches ont des similitudes bien établies avec celles présentes en

Asie et en Indonésie. Cela laisse présumer une origine orientale fondée sur la théorie

wegenerienne de la dérive des continents plus qu’à un moyen de dispersion par les courants

marins [Cadet 1980].

32

Les Leea sont rencontrées dans des zones humides ne dépassant guère 900 m

d’altitude et de formations forestières ombragées. De plus, certaines d’entre-elles comme L.

indica, semblent jouer un grand rôle dans l’embroussaillement des trouées forestières car elles

sont à croissance rapide et à tempérament grégaire. Leur bois est tendre. Elles constituent

donc rapidement des fourrés denses dépassant 2m de hauteur à l’âge de 2 à 3 ans en présence

d’autres espèces telles que Trema orientalis (Ulmaceae) et Macaranga roxburghii

(Euphorbiaceae) [Blasco 1971].

Figure 3 : Répartition géographique des Leea [Suessenguth 1953]

33

___zone de répartitiondes Leea

III- Généralités sur l’espèce Leea guineensis G. Don

Figure 4 : Représentation de Leea guineensis [Lavergne 1990]

A) Dénomination et synonymies

Appelée Leea guineensis G. Don, Gen. Hist. I (1831) 712, on retrouve plusieurs noms

synonymiques pour cette espèce, qui peuvent être à l’origine de nombreuses confusions :

L. sambucina auct. non Will., L. maculata Desf., L. arborea Telf. ex W. & A., L. arborea

Sieber ex Boj., L. sambucina Willd. var. arborea Miq., L. manillensis Walp., L. aurantiaca

Zoll. & Mor., L. coccinea Planch., L. lucida Linden ex Planch., L. punctata Desf. ex Planch.,

L. cuspidifera Baker, L. javanica auct. non Bl., L. speciosa Sieb. ex Miq., L. laeta Wall., L.

sanguinea Wall., L. acuminata Wall., L. cumingii Clarke, L. pumila auct non Kurz, L. wightii

Clarke, L. parva Elm., L. negrosense Elm., L. palawanensis Elm., L. euphlebia Merr., L.

parvifoliola Merr., L. papillosa Merr., L. luzonensis Elm., L. robusta auct. non Roxb., L.

dentata Craib, L. schomburgkii Craib, L. brunoniana auct. non Clarke, L. pallidifolia

Kanehira, L. bulusanensis Elm.

34

Il faut noter que cette espèce présente de nombreuses variabilités dues à sa répartition

géographique ou écologique. C’est en partie pour cela que cette espèce est répertoriée sous

plus de 30 noms synonymiques car bien des travaux ont décomposé cette espèce en plusieurs

entités. Or la plupart de ces taxas ne sont séparés que par des différences végétatives

mineures. Ainsi, même entre des espèces africaines et asiatiques telles que L. guineensis et L.

manillensis, il n’existe qu’une petite différence de couleur du tube staminal (due semble-t-il

aux habitats différents) ; les caractères morphologiques des feuilles et des fleurs sont en tous

points identiques [Ridsdale 1975].

Ainsi, le mauvais usage des synonymies peut être illustré par l’exemple de L. rubra

sensu auct. non Blume ex. Sprengel et L. sambucina sensu auct. non Willd [Staples 1996].

Des horticulteurs ont employé L. rubra pour désigner une forme de L. guineensis ayant des

feuilles rougeâtres, alors que L. rubra est une authentique espèce déjà existante. Quant à L.

sambucina, c’est une espèce dont le nom a été mal employé dans la littérature, car L.

sambucina est un des synonymes de L. indica.

Toutefois certaines différences ont permis à Descoings [1967] lors de son étude sur la

flore de Madagascar d’observer des variétés locales bien distinctes :

L. guineensis G. Don

- var. longifoliolata Desc.

Folioles supérieures très grandes, jusqu’à 25 X 6cm, oblongues, très

étroites, de largeur plus grande vers la base, acuminées au sommet, à bords crénelés.

Folioles inférieures de taille réduite et de forme variable.

Dans les marais à raphias et bas fonds.

- var. monticola Desc.

Folioles petites, 7-11 X 2-3.5cm, oblongues-elliptiques, oblongues-

lancéolées, de largeur plus grande vers le milieu, à base en coin, à sommet acuminé, à bords

crénelés.

Dans les régions montagneuses.

35

- var. spiculata Desc.

Folioles de taille moyenne à faible, 9-12 X 3-4cm, elliptiques, oblonges

elliptiques, acuminées, à bords présentant 5-7 paires de lobes très atténués, terminés par une

dent en spicule courte, épaisse, fortement saillante vers l’extérieur.

Plateaux calcaires.

- var. truncata Desc.

Folioles grandes, 12-15 X 4.5-11cm, oblongues-ovales, de largeur plus

grande dans la partie supérieure, à base en coin, à sommet tronqué, largement arrondi,

terminé par un long acumen, à bords crénelés.

Forêts ombrophiles.

- var. cuspidifera Desc. –L. cuspidifera Bak.

Pubescence cuspidée des tiges, pétioles rachis et ramifications, surtout

aux insertions.

Folioles elliptiques ou elliptiques-lancéolées, 4-18 X 2-8cm, à base en

coin ou obtuse, à sommet en acumen long et étroit (10-30 X 1.5-3 mm) obtus, à bords

crénelés ou dentés.

Forêts tropophiles, sur sables et calcaires.

- var. comoriensis Desc.

Folioles grandes, 10-15 X 4.5-6cm, ovales-elliptiques, elliptiques, à

base obtuse ou arrondie, à sommet longuement acuminé, à bords crénelés, à pubescence

généralement nettement concentrée aux confluents des nervures.


- var. orientalis Desc. Endémique

Folioles oblongues-elliptiques, elliptiques, 8-16 X 3-6cm, à base en

coin, à sommet acuminé, à bords finement dentés, à pubescence régulièrement répartie.


36

Pour notre plante, l’échantillon présente une foliole supérieure très grande 18 X 6 cm,

acuminée au sommet, des folioles inférieures de taille réduite de forme variable, acuminées.

De plus, celle-ci provient d’une forêt à raphiales marécageuse ou périodiquement inondée.

Bien qu’aucune variété ne soit décrite pour Leea guineensis au Cameroun [Descoings 1972],

notre échantillon fait penser à la variété longifoliolata rencontrée à Madagascar.

Figure 5 : Feuille séchée de Leea guineensis provenant du Cameroun

B) Noms vernaculaires

La liste n’est pas exhaustive, car chaque tribu a sa propre appellation. Nous n’en

donnerons que quelques exemples :

La Réunion bois de source, bois de sureau

Inde karkatajihva (sanscrit)

République Centrafricaine gamboula (gbaya)

Gabon mopaga-poga (apindji), debole-nyembaka (bakele)

Madagascar fanamboavanana, mahimboavana, sadrakidraky

Côte d’Ivoire diawa (guimini), koulateo (guéré)

Cameroun essong, n’top fitta, utua-bisson (yaoundé), wabozeende (mabea)

C) Répartition géographique

37

L. guineensis pousse dans les forêts humides, les galeries forestières, notamment dans

les raphiales marécageuses, les forêts marécageuses ou périodiquement inondées et dans le lit

des ravines - d’où peut-être l’appellation de Bois de Source - des zones tropicales.

Elle est présente en Afrique tropicale, en Angola, au Bénin, Burkina Faso, Burundi,

Cameroun, Congo, Côte d’Ivoire, Gabon, Guinée, Kenya, Madagascar, Malawi, Mali, île

Maurice, Nigeria, Ouganda, île de La Réunion, République Centrafricaine, République

Démocratique du Congo, Sierra Leone, Soudan, Tanzanie, Togo, Zambie.

On la rencontre aussi en Asie : Ceylan, Cambodge, Chine, Inde, Indonésie (Java,

Sumatra, Nlle

Guinée), Laos, Malaisie, Népal, Philippines, Taïwan, Thaïlande.

Figure 6 : Répartition géographique de L. guineensis.

38

zone de répartition de L. guineensis

D) Description botanique (Figure 8) [Descoings 1967]

C’est un arbuste de 2 à 5 m, à tiges droites, peu ramifiées, renflées aux nœuds, à

lenticelles nombreuses, petites, à feuilles groupées aux extrémités.

Les feuilles bi- ou triternées atteignant 30 X 30 cm avec :

- un rachis (30-60 cm) et des ramifications (20-40 cm) ± caniculées sur le dessus

et présentant de petits tubercules vers la base, glabres ou faiblement pubescents

aux insertions ;

- pétiole renflé et ± engainant ;

- stipules épaisses rapidement caduques (Figure 7).

Figure 7 : Schéma d’une stipule de L. guineensis

[Ridsdale 1975]

Les folioles sont de forme très variable : elliptiques, ovales-elliptiques, ovales

oblongues, oblongues, oblongues-elliptiques, avec :

- toujours la base en coin, rarement obtuse, et le sommet à acumen long, étroit,

obtus ;

- les bords crénelés ou dentés; de 7-25 X 3-11 cm; 8 à 10 paires de nervures

secondaires, peu saillantes en dessous, assez fortement sur le dessus ;

- le réticulum presque plan à la face supérieure, en léger relief sur la face

inférieure ;

- une pubescence pratiquement nulle, sauf parfois quelques poils aux intersections

des nervures.

- le limbe plan, assez épais, vert luisant sur les deux faces.

Les inflorescences sont opposées aux feuilles du sommet, très grandes :

- en corymbes de 10-16 cm de diamètre ;

- au pédoncule et ramifications épais, ± cylindriques, sillonnés, munis de quelques

rugosités, à pubescence lâche, courte, irrégulièrement répartie et rapidement

caduque ;

- aux bractées ovales, deltoïdes, aiguës, de 1-1,5 X 1-1,5 mm, minces,

faiblement pubescentes, rapidement caduques.

39

1 -représentation d’un rameau avec son inflorescence x1/3 ; 2 -détail du bord du limbe x1 ; 3 -fleur mature x8 ;

4 -bouton floral x8 ; 5 -coupe schématique de la fleur fermée (étamines omisent) x8 ; 6 -anthère (vue arrière)

x15 ; 7 -agrandissement de la couronne étalée x8 ; 8 -fruit x2 ; 9 -graine x5 ; 10 -section transversale médiane

de la graine x5

Figure 8 : Représentation de L. guineensis [Descoings 1972, Verdcourt 1993]

40

Les fleurs de ± 5 mm de long, ± 3 mm de diamètre sont glabres avec (Figure 9) :

- un bouton floral ovale ou conique ;

- un pédicelle de 1-2 mm de long, cylindrique, nettement épaissi sous le

calice, faiblement pubescent.

- un calice rouge corail, de 2-2,5 mm de haut, ± 2,5 mm de diamètre, épais,

rigide, généralement glabre, à dents deltoïdes, aiguës.

- une corolle rouge corail à l’extérieur, plus pâle à l’intérieur, de ± 4 mm de

long, en tube dans la partie inférieure sur ± 1,5 mm de hauteur.

- aux segments oblongs-ovales, rétrécis vers la base, à plus grande largeur

vers le tiers inférieure, au-dessus longuement atténués en coin, aigus au

sommet et nettement cucullés, de ± 1,6 mm de large, épais.

- une coronule blanche, rose ou citrine, de 2,5-3 mm de hauteur et 2-2,5 mm

de diamètre ;

- aux lobes de ± 2 X 0,8 mm, oblongs, épais, un peu élargis dans la partie

supérieure, présentant deux petites dents obtuses ; sinus très minces,

profonds, échancrés jusqu’à 0,8-1,2 mm en dessous du sommet des

lobes ;

- le talon ne descend pas au fond de la fleur et entoure à sa base le style

seulement, de 0,6-0,8 mm de haut, épais sauf dans sa partie inférieure,

fortement aminci du côté interne avec juste au-dessus un très fort

bourrelet en saillie vers l’extérieur, horizontal ou ± oblique,

généralement très net.

- les étamines à filets blancs, sont fixées un peu au-dessus du milieu du

connectif ;

- les connectifs sont oblongs, étroits, ± bilobés au sommet, aigus à la base,

de ± 1,8 X 0,6 mm, dépassant un peu les loges au sommet.

- l’ovaire est 5-côtelé, de ± 1 mm de diamètre, ± 0,6 mm de haut, glabre ;

- le style de ± 1,5 mm de long, cylindrique, isodiamétrique ;

- et stigmate capité peu distinct.

41

Figure 9 : Diagramme floral [Gerrath 1990]

42

Les baies rouges à maturité, sont glabres, à péricarpe mince, bourrées de raphides

comprimées sur les faces supérieure et inférieure. Elles ont 8 à 10 mm de diamètre, 6-7 mm

de longueur.

Les graines de ± 5 X 4 mm, sur leurs faces latérales présentent des dessins très nets en

lignes larges, épaisses, saillantes, beaucoup plus visibles en creux sur l’albumen mis à nu,

(une ligne courbe concave avec parfois 1-3 petites ramifications simples et peu prononcées du

côté ventral, et du côté dorsal, 1-5 ramifications courtes et simples).

E) Divers

Leea guineensis G. Don est considérée comme plante fétiche par plusieurs ethnies de

Côte d’Ivoire et du Burkina Faso : le charbon de racines constitue un fard bénéfique. Il est

recommandé, lorsqu’on part pour un long voyage, de se munir de bâtonnets de tiges qui,

sucés pendant la route, préservent des accidents et des mauvais sorts toujours possibles

[Kerharo 1950]. La population locale au Cameroun s’en sert aussi comme bois de chauffage.

L. guineensis dans un dialecte africain, le "baoulé du sud", se nomme adiapokou-

adiabrien et traduit une onomatopée rappelant le bruit de la navette (y’a-t-il un lien avec le

métier à tisser ?). On la retrouve aussi sous le nom de akohima-tui, ces deux mots voulant

dire coq et fusil. Traduit comme "fusil du coq" (est-ce la sarbacane ?) [Garnier 1976].

Le développement morphologique de L. guineensis est maintenant connu, tant du

point de vue du développement végétatif [Lacroix 1990] que floral [Gerrath 1990].

Par ailleurs, L. guineensis ou "Bois de sureau" est un arbuste très élégant, de part ses

grandes feuilles composées, sa jolie floraison, et ses fruits décoratifs. S’acclimatant à de

faibles conditions lumineuses, il peut être cultivé en zone humide et ombragée comme plante

ornementale d’extérieure ou d’intérieure [Lavergne 1990, Gerrath 1997].

43

Chapitre II – Etudes phytochimique et biologique des Leeaceae

Les plantes de la famille des Leeaceae sont très peu étudiées, sans doute parce qu’elles

ont été souvent intégrées dans la famille des Vitaceae qui comprend plus de 700 espèces

(Vitis vinifera...).

Néanmoins, quelques études relativement récentes ont été faites sur la phytochimie de

différentes Leea.

I- Etude phytochimique

A) Criblage phytochimique

Les données présentées ici doivent être considérées avec une certaine réserve, car ce

sont essentiellement des tests d’orientation. Ces tests ont été réalisés pour trois espèces

différentes, et ont montré la présence de saponosides, d’alcaloïdes, de flavonoïdes et de

tanins :

Tableau 6 : Criblage de quelques Leea

Plantes(partie utilisée si connue)

Sap Alc Tri St Flav Ta Référence

L. indica + - - - [Bin Rahmani 1985]L. compactiflora (Kurz)racines

- + + - [Brahman 1989]

L. indica (Burm. F) Merr.tiges, feuilles et fruits

- - - - [Brahman 1989]

L. guineensis G. Donfeuilles

- - - - + +cat

[Lavergne 1990]

Sap=saponines, Alc=alcaloïdes, Tri=triterpènes, St=stéroïdes, Flav=flavonoïdes, Ta=tanins, cat=catéchiques

Test phytochimique positif (+) ou négatif (-)

Par ailleurs, l’étude de Lavergne [1990] montre pour L. guineensis G. Don, plante

médicinale de l’Ile de la Réunion :

-la présence de phénols, de flavanes et de proanthocyanidols.

-l’absence d’anthraquinones libres ou hétérosidiques, de coumarines et

d’anthocyanes.

-l’absence d’alcaloïdes (réactions négatives aux tests de Mayer, de Dragendorff

et silicotungstique).

44

B) Huile essentielle

C’est en 1953 que Gupta et Chopra isolent pour la première fois une huile essentielle

d’une plante appartenant à la famille des Leeaceae : L. hirta Roxb. Les seules données sont

les caractéristiques physiques et biochimiques. Cette huile essentielle provient d’une

hydrodistillation avec un rendement de 0,15 %. Elle est odorante, se solidifie à température

ambiante et présente une activité tuberculostatique [Gupta 1953].

C) Composés phénoliques (Figure 10 p 30)

C’est la classe de composés la plus étudiée (Tableau 7 p 29).

Bates-Smith [1959] a entrepris une recherche de constituants phénoliques, après

hydrolyse, dans les feuilles de nombreuses Dicotylédones afin de rechercher des liens

chimiotaxonomiques. Ainsi par chromatographie sur couche mince il a montré l’existence

dans les feuilles de L. coccinea Planch. de 5 composés phénoliques : kaempferol (1),

quercétine (2), myricétine (3), delphinidine (7), cyanidine (8).

Chez L. rubra Blume, on recense dans les feuilles un flavonoïde et trois acides

phénols : la myricétine 3-O--rhamnosyl (6), l’acide p-hydroxybenzoïque (12), l’acide

syringique (14) et l’acide gallique (17), et dans les tiges une leucoanthocyane, le

leucocyanidol (10) [Yem Yok Siv 1971].

Hegnauer [1990] cite pour les Leea, en plus des composés déjà cités pour L. coccinea

Planch (kaempferol (1), quercétine (2), myricétine (3), leucodelphinidine (7), leucocyanidine

(8)), la présence de tanins dans les fruits de L. rubra Blume, et dans les feuilles et les racines

de L. sambucina Willd.

L’étude de la taxonomie des Vitaceae a permis une analyse de quatre Leea qui sont L.

herbaceum Wall., L. indica Merrill., L. macrophyla Roxb. et L. sambucina Willd où l’on

recense un grand nombre de flavonoïdes et d’acides phénoliques [Umadevi 1991].

45

Les résultats de ces travaux sont reportés dans le tableau ci-dessous :

Tableau 7 : Principaux métabolites secondaires identifiés des différentes Leea

ComposésL.

herbaceumWall.

a

L.indica

Merrill.a

L.macrophyla

Roxb.a

L.sambucina

Willd.a

L.coccineaPlanch.

b

L.rubraBlume

ckaempferol (1) + +quercétine (2) + + +myricétine (3) + + + + +3’-OMe-quercétine (4) + + +3’,4’-di-OMe-quercétine (5) + + +3-O-rhamnosyl de myricétine (6) +delphinidine (7) +cyanidine (8) +proanthocyanidine (9) + + + +leucocyanidol (10) +acide gentisique (11) + +acide p-hydroxybenzoïque (12) + + + +acide vanillique (13) + + + +acide syringique (14) + + + +acide mélilotique (15) + +acide protocatéchuique (16) +acide gallique (17) + + + + +acide cis-p-coumarique (18) + +acide trans-p-coumarique (19) + +acide férulique (20) + + +glycoflavone +tanins + + + + +alcaloïdes +

Références : a) [Umadevi 1991], b) [Bates-Smith 1959], c) [Yem Yok Siv 1971] et [Hegnauer 1990].

46

(1) R1=R3=H, R2=OH

Kaempferol

(2) R1=R2=OH, R3=H

Quercétine

(3) R1=R2=R3=OH

Myricétine

(4) R=H

3’-OMe-quercétine

(5) R=Me

3’,4’-diOMe-quercétine

(6)

3-O-rhamnosyl de myricétine

(7) R=OH

Delphinidine

(8) R=H

Cyanidine (9)

Proanthocyanidine

(10)

Leucocyanidol

(11) R1=R3=R4=H, R2=R5=OH

Acide gentisique

(12) R1=R2=R4=R5=H, R3=OH

Acide p-hydroxybenzoïque

(13) R1=R4=R5=H, R2=OCH3, R3=OH

Acide vanillique

(14) R1=R5=H, R2=R4=OCH3, R3=OH

Acide syringique

(16) R1=R4=R5=H, R2=R3=OH

Acide protocatéchuique

(17) R1=R5=H, R2=R3=R4=OH

Acide gallique

(15)

Acide mélilotique

(18) R=H, cis

Acide cis-p-coumarique

(19) R=H, trans

Acide trans-p-coumarique

(20) R=OCH3, trans

Acide férulique

Figure 10 : Les structures chimiques identifiées chez différentes Leea :

47

II- Etude biologique

Les différentes activités biologiques seront présentées pour chaque espèce connues

(avec leur synonymies), puis nous recenserons les activités propres à Leea guineensis G. Don.

A) Activités des différentes espèces de Leea (Tableau 8 p 38)

La plupart des données sur ce sujet sont assez récentes, mais en règle générale les

espèces du genre ont des propriétés calmantes, émollientes et astringentes [Kirtikar 1975].

L. sp. :

-l’extrait aqueux de feuilles de L. sp. présente des propriétés antifongiques

avec 100% d’inhibition contre Drechslera oryzae [Ganesan 1994].

L. aequata L. :

- au Népal, les tubercules et les tiges de L. aequata Linn. sont astringentes et

mucilagineuses [Suwal 1970] ;

- utilisée en cas de blessures, elle est calmante, antiseptique, bactéricide. Elle

est aussi préconisée pour soigner la fièvre, la dysenterie, la dysurie, la neuralgie, la paralysie,

la pleurésie, la pneumonie, la tuberculose, les rhumatismes [Phytochemical and

Ethnobotanical Database].

L. hirta Roxb. ex Hornem (syn. L. aequata Linn.) :

- l’huile essentielle (0,15 %) inhibe la croissance de Mycobacterium

tuberculosis, Staphylococcus aureus et Pasteurella pestis aux concentrations de 10 g/ml, 100

g/ml et 50 g/ml respectivement [Gupta 1953] ;

- en Inde les tubercules et les tiges sont utilisées pour leur activité astringente

et sont riches en mucilages [Chopra 1956] ;

- les racines sont amères, âcres, épicées, et sont dotées de propriétés

anthelmintique, vulnéraire, antipyrétique, “ alexitérique ”, anesthésique locale. Elles sont

utilisées en cas de bronchite, de dyspepsie, de fièvres nauséeuses, de lèpre, de démangeaisons

et d’ulcères tuberculeux (Ayurveda) [Kirtikar 1975] ;

48

- on retrouve les même indications sur Internet que l’espèce précédente

[Phytochemical and Ethnobotanical Database].

L. angulata Korth. :

- comme répellant du tigre à Java [Phytochemical and Ethnobotanical

Database].

L. crispa Linn :

- en Inde et au Bengal, les feuilles sont froissées et appliquées sur les blessures.

Les tubercules sont un remède contre le vers de Guinée [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ;

- comme larvicide et contre les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical

Database].

L. curtisii King :

- contre l’alopécie [Phytochemical and Ethnobotanical Database].

L. gigantea Griff. (syn L. indica Merr.) :

- des travaux sur des extraits méthanoliques de plantes de Malaisie, montrent

que les feuilles de L. gigantea ont une activité modérée contre Bursaphelenchus xylophilus à

10 mg/ball [Mackeen 1997] ;

- est préconisée contre les douleurs d’estomac, la fièvre, les blessures


L. indica Merrill :

- une des premières traces d’une activité biologique potentielle, remonte à

1829 [Mérat 1829]. Il est dit de Leea sambucina Willd. (appelé autrefois Aquilicia) que :

“ Aquilicia sambucina , arbrisseau de l’Inde, contient des baies à suc violent et caustique. La

décoction de ses racines est employée contre les douleurs de l’estomac ; celle du bois, contre

la soif ; ses feuilles broyées, torréfiées et appliquées sur la tête, soulagent le vertige et la

faiblesse du cerveau ; la vapeur de leur décoction suspend les douleurs de la goutte ; le suc,

exprimé de ses feuilles tendres, pris en boisson, aide la digestion... ”. Plus loin, “ ...La

décoction de ses feuilles est usitée en Guinée pour les femmes enceintes dont le ventre est

douloureux ; elle dissipe les nausées. La poudre de l’écorce sert à frotter les parties enflées. ”.

49

- en Inde, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les diarrhées, la

dysenterie et sont sudorifiques. La décoction de racines est prescrite contre les coliques,

comme rafraîchissant et soulageant de la soif. Les feuilles grillées sont appliquées sur la tête

contre les vertiges [Chopra 1956] ;

- en Inde, dans le Goa, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les

diarrhées et dysenteries chroniques. Le jus de jeunes feuilles est digestif [Kirtikar 1975] ;

- en Malaisie, l’intérêt porté aux plantes utilisées en médecine indigène montre

que l’extrait éthanolique de feuilles de L. indica a une activité antivirale contre le virus herpes

simplex de type 1 (HSV1) à 0,05 mg/ml [Ali 1996] ;

- on retrouve l’usage de L. indica contre les maux de tête, les piqûres de

chenilles, les dermatoses, les furoncles, la colique, les diarrhées, la dysenterie, les vertiges, les

verrues. Elle est apaisante et sudorifique [Phytochemical and Ethnobotanical Database].

L. linearifolia :

- les racines de cette herbe de saveur froide, insipide selon la médecine

bouddhique traditionnelle Theravada, neutralisent les fièvres « supérieures », le vent

« Sandan », cause de coliques chroniques [Phou Ngeun Souk-Aloun 1995].

L. macrophylla Roxb.ex Hornem. :

- en Inde, les racines sont connues pour être astringentes, et utilisées contre la

teigne, et le vers de Guinée. Réduites en poudre, elles sont appliquées sur les blessures pour

les cicatriser ou sur la peau pour soulager les douleurs [Chopra 1956] ;

- ses racines sont un bon alexipharmaque1 (antidote Ayurveda). Elles sont

astringentes et réputées être un remède de la pelade. Les Birmans l’appliquent sur les

blessures pour stopper les effusions de sang [Kirtikar 1975] ;

- au Népal, on retrouve les mêmes activités qu’en Inde, si ce n’est que les

feuilles et les fruits sont connus pour être comestibles [Suwal 1970] ;

- la plante est indiquée comme étant calmante, astringente, cicatrisante,

larvicide et vermifuge. Elle est préconisée contre la dysenterie, le vers de Guinée (ou

dracunculose), les fractures vétérinaires, les neuralgies, la pleurésie, la pneumonie, la teigne,

les douleurs, et les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical Database].

L. robusta Roxb. (syn. L. macrophylla Roxb.)

1 Du grec alexein (défendre contre), c’est un antidote actif contre les poisons et les venins.

50

- en Inde et dans le Chota Nagpur, les racines (molles et charnues) sont

appliquées localement pour apaiser les douleurs et sont données au bétail pour soigner les

diarrhées [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ;

- au Bengale, à Orissä et au Bihär, la médecine vétérinaire utilise 25 ml

d’extrait aqueux de racine en association avec 20 mg de gingembre pour le traitement des

diarrhées et dysenteries des buffles, vaches et moutons. De plus, 15 ml de cet extrait avec la

poudre de 7 grains de poivre noir et d’une petite quantité de sel est administré en cas de

fièvre, aux chèvres et moutons [Pal 1980] ;

- au Népal, on retrouve les mêmes propriétés, mais il est fait mention de

l’utilisation des racines contre la dysenterie [Suwal 1970] ;

- la plante est aussi indiquée pour soigner les diarrhées, la dysenterie


L. rubra Blume :

- au Cambodge, les racines bouillies constituent une boisson contre les coliques

[Douk 1966] ;

- cette plante est aussi employée comme diurétique [Yem Yok Siv 1971] ;

- l’irritation provoquée par les baies a été mise en relation avec la présence de

raphides (cristaux d’oxalate de calcium) [Sakai 1984] ;

- elle soigne la dysenterie, les intoxications. Elle est aussi taenifuge


Sur Internet, on trouve les résultats d’un sreening effectué par le NCI (National

Cancer Institute) fait sur quatre extraits de Leeaceae (espèce(s) non précisée(s) !) sur diverses

cellules tumorales humaines. Ils montrent une inhibition significative de la croissance des

cellules tumorales de leucémie, du colon et du sein. La DL50 n’est pas significative ou est

modeste pour les cellules tumorales du sein, et du colon [Cancer cell line screening data].

51

B) Activités propres à Leea guineensis

Lavergne [1990] relate l’ancien usage médical de L. guineensis G. Don. Il remonte à

Pingre (1761) qui, sous le terme de “ Sureau de Bourbon l’employait en topique contre

l’hydropisie et la difficulté d’uriner. Sa seconde écorce guérirait également les brûlures ”.

Ce nom de "Bois de Sureau" est à l’origine de quelques ambiguïtés, car certains auteurs se

sont aventurés à lui attribuer les mêmes vertus que le Sureau d’Europe.

Pour Leclerc (1864), la décoction de tiges et de feuilles du "Bois de Sureau" est

“ journellement employée ” pour des bains et des fomentations2, contre les érysipèles et “ les

engorgements qui surviennent aux pieds et aux jambes ”.

Contre le tambave3, Leclerc cite le “ remède de la bonne femme Olivette ” préparé à Maurice.

C’est une association de Bois de sureau, de Lingue café (Mussaenda arcuata Poiret

(Rubiaceae)), de Cochléria du pays (Centella asiatica L. (Apiaceae)), de Petit Tamarin blanc

(Phyllanthus amarus (Euphorbiaceae)), de Gros Indigo (Sophora deneduta (Leguminosae)),

de Guérivite (Siegesbeckia orientalis (Asteraceae)), d’Herbe la mare (Cyperus sp.

(Cyperaceae)) et de Cadoque (Caesalpinia bondue (Caesalpiniacae)).

Daruty (1886 et 1889) accorde à cette Leeaceae des vertus antiseptiques et détersives

lorsqu’elle est appliquée sur les plaies et les ulcères. Il conseille de râper l’écorce et d’en

répandre la poudre sur les plaies préalablement détergées avec une décoction de Guérivite

(Siegesbeckia orientalis (Asteraceae)).

A la Réunion, Cordemoy (1895) n’attribue que des effets néfastes au Bois de Sureau. “ Le

suc de ses baies est caustique. Une personne qui en avait écrasé et manié une certaine quantité

pour en faire une encre de couleur vit une heure après sa main rougir, puis se tuméfier. Elle

éprouva une forte douleur, et un sentiment de brûlure. Un érysipèle se déclara, qui fut suivi

de démangeaisons pendant trois semaines ”.

Selon Ducheman (1900), la décoction de fleurs ou de feuilles de Bois de Sureau “ combat

l’éléphantiasis par bain chaud ”. Plus tard, Bosse (1977) et Bersez (1983) reparleront de

l’éléphantiasis, alors que cette parasitose est oubliée dans l’île de la Réunion.

Les racines quant à elles, sont connues pour être sudorifiques [Kirtikar 1975].

2 Fomentation : action d’appliquer la chaleur comme moyen thérapeutique.3 Affection tropicale des jeunes enfants dont les principaux symptômes sont : diarrhée rebelle, selle verdâtre, éruptions cutanées (et du cuir chevelu). L’enfant est amaigri et couvert de petits boutons.

52

L’utilisation de L. guineensis est aujourd’hui plus restreinte [Lavergne 1990]. Une

recette consiste en l’association de Bois de sureau, Bois de reinette (Dodonea viscosa

(Sapindaceae)), Bois puant (Foetidia mauritiana (Lecythidaceae)), Patate à durand (Ipomoea

pescaprae (Convolvulaceae)), Eucalyptus (Eucalyptus sp. (Myrtaceae)), Pignon d’Inde,

Thombé (Leucas lavandulaefolia (Lamiaceae)) et marc de Café pour soigner les rhumatismes.

D’autres tisaneurs considèrent le Bois de sureau comme rafraîchissant. Ainsi, il est prescrit

également pour les troubles circulatoires, les douleurs articulaires, les douleurs dentaires et

contre les refroidissements. Les bains aux Bois de sureau sont également indiqués contre les

rhumatismes, les douleurs, la polynévrite.

Certains la préconisent pour soigner le tambave, d’autres l’utilisent en boisson et en bain,

contre la goutte et “ l’enflure ”, ou pour des tisanes dites de « refroidissement et

saisissement ».

Au Cameroun, les tradipraticiens utilisent L. guineensis principalement pour soigner

les problèmes inflammatoires et l’hypertension.

En Côte d’Ivoire et au Burkina Faso, L. guineensis G. Don. est utilisée en lavement

à base du jus des feuilles pour guérir les maux de reins et les crises d’épilepsie. Le macérât de

feuilles, bu le matin à jeun, calmerait les maux de ventre des femmes enceintes, tandis que les

frictions avec la pulpe de feuilles serait un bon remède contre les rhumatismes [Kerharo

1950]. De plus, nous pouvons retenir son action analgésique et calmante sur les douleurs

musculaires et articulaires, son emploi comme fortifiant, à caractère parfois aphrodisiaque, et

enfin son utilisation lors de certains accouchements difficiles [Bouquet 1974].

Au Gabon, les jeunes pousses, en association avec la graine de Xylopia aethiopica

(Anonaceae) sont ingérées en cas de palpitations cardiaques [Adjanohoun 1984].

En République Centrafricaine, la décoction de l’écorce de tige est employée en

lavement pour combattre la constipation. Les feuilles sont utilisées pour soigner la

conjonctivite des nouveau-nés ; la préparation consiste à ramollir les feuilles au feu, les

froisser, les presser et administrer l’extrait dans les yeux [Aké Assi 1985].

53

Dernièrement, Leea guineensis est citée dans le catalogue des plantes médicinales

majeures de l’Afrique. Les parties utilisées sont les feuilles et les racines, qui sont anti-

infectieuses, analgésiques, antidiabétiques, et aphrodisiaques [Iwu 1993].

Plus récemment, l’utilisation comme diurétique de L. guineensis à la Réunion a été

mis en relation avec l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). On note

90 et 100% d’inhibition de l’ACE respectivement pour les extraits acétonique et éthanolique

des feuilles [Adsersen 1997]. Cette inhibition enzymatique est également à rapprocher de son

usage contre les troubles cardiovasculaires.

On lui attribue aussi des effets contre les maux de dents, les coliques, les convulsions,

la dyspepsie, l’épilepsie, la blennorragie, les rhumatismes, les enflures, les vertiges et les

problèmes liés à la grossesse. Elle est aussi purgative et apaisante [Phytochemical and

Ethnobotanical Database].

On peut remarquer que les utilisations traditionnelles se retrouvent d’un pays à un

autre. De plus, il existe de nombreuses similitudes entre les activités propres de L. guineensis

et celles des autres espèces. Ceci est un bon argument pour reconnaître la pertinence des

renseignements car les espèces proviennent aussi bien d’Asie que d’Afrique.

54

Tableau 8 : Différentes activités biologiques décrites pour le genre Leea

Activités

L. aequata L.

L. crispa Linn.

L.curtissi King

L. gigantea Griff

L. hirta Roxb.

L. indica Merr.

L. macrophylla R

oxb.

L. robusta Roxb.

L. rubra Blum

e

L. linearifolia

L. gu

ineensis G

. Don.

analgésique - antalgique + + + + + + +antiseptique - cicatrisant - vulnéraire - contre blessures et brûlures

+ + + + + +

antiarthritique - antirhumatismal - goutte

+ + + +

anti-inflammatoire(pleurésie, pneumonie, bronchite, polynévrite, blennorragie, conjonctivite, brûlure)

+ + + +

antidermatique – antiprurigineux(dermatose, teigne, pelade, érysipèle, alopécie)

+ + + +

antidiarrhéique - tambave + + + + +antidysentérique + + + + + +anti-infectieux - anticontagieux(lèpre, tuberculose, érysipèle)

+ + +

anthelminthique - parasiticide - larvicideantifongique - bactéricide - vers Guinée

+ + + + + + +

digestif - dyspepsique + + +diurétique + +dysurie + + +contre hydropisie astringent elephantiasis

+ + + + +

antihemmoragique +anti-ulcéreux + +anti-arythmique - antihypertensif - trouble circulatoire

+

antipyrétique + + + + + +sudorifique + +anesthésique local +antidiabétique +neuralgie - paralysie + + +vertige - nausée - maux de tête + +épilepsie - convulsions +accouchement difficile - maux de ventre des femmes enceinte

+ +

aphrodisiaque +mucilagineux + +contre intoxications +contre soif - rafraîchissante + +refroidissements +

55

L’intérêt pour les Leeaceae semble justifié par leurs capacités à soigner les problèmes

d’ordre infectieux, inflammatoire, digestif, urinaire et circulatoire. Leea guineensis a aussi

ses activités. Les tradipraticiens la préconisent essentiellement pour ses vertus

antirhumatismale, antalgique, antihypertensive et diurétique.

C) Conclusion

En résumé, cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan chimique que

biologique.

Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de flavonoïdes, d’acides

phénoliques et de tanins.

L’utilisation en médecine traditionnelle montre que le genre a des propriétés

essentiellement calmante, anti-infectieuse, anti-inflammatoire, antidysentérique,

antirhumatismal et cardiovasculaire.

Ainsi, une étude phytochimique et pharmacologique sur les extraits et les composés

qu’ils contiennent semble intéressante afin d’établir un lien avec ces utilisations en médecine

traditionnelle.

56

Chapitre III - Les Flavonoïdes Sulfatés

I- Introduction

Les flavonoïdes sont connus pour être d’importants métabolites synthétisés par les

plantes, responsables entre autres de la pigmentation et de la protection des plantes en réponse

à un stress d’irradiation UV, ou d’attaque microbienne (les phytoalexines). Récemment, ces

molécules ont été impliquées dans l’induction et l’inhibition des gènes de nodulation du

Rhizobium ou comme régulateur du transport de l’auxine (phytohormone de croissance)

[Varin 1992a].

Dès 1975, tous ces composés possédant un ou des groupements sulfates ont été

classés dans un groupe appelé flavonoïde sulfaté [Harborne 1975a]. Une récente étude a

recensé toutes les données concernant ces composés (distribution, méthodes générales

d’extraction, de purification, d’analyse structurale, et de synthèse) [Barron 1988a, 1987c,

1988b, c]. Aussi, nous n’avons pas souhaité reprendre ici ces travaux, mais préférons plutôt

effectuer une « mise à jour » à partir de 1988 de ces données bibliographiques.

II- Classification, Structure

En 1988, Barron répertorie 101 flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a]. A ce jour, nous

avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés dans la littérature, qui se répartissent en 131 flavones

et flavonols sulfatés. On dénombre 74 flavonols sulfatés dont 19 structures sont nouvelles et

57 flavones sulfatées dont 12 nouvelles (Tableaux 9 p 42 et 10 p 45). A cela, nous pouvons

ajouter 2 anthocyanes sulfatées extraites de Babiana stricta (Iridaceae) (Figure 11) et 1

dihydroflavonol sulfaté, isolé de Myrica rubra (Myricaceae) (Figure 12).

57

R= H 3-glucosyl-5-(2’’-sulfatoglucosyl)-malvidineR= malonyl 3-glucosyl-5-(2’’-sulfato, 6’’-malonylglucosyl)-malvidine

Figure 11 : Antocyanes sulfatées isolées de Badiana stricta (Iridaceae) [Toki 1994]

3-galloyl-3’-sulfate-dihydromyricitine ou myricatine

Figure 12 : Dihydroflavonol sulfaté isolé de Myrica rubra (Myricaceae) [Nonaka 1983]

58

A) Les flavones sulfatées

Tableau 9 : Les flavones sulfatées

Position de Sulfatation

Apigénine

Hispiduline

Isoscutellaréine

Lutéoline

Chrysoeriol

Diosm

étine

6-OH

Lutéoline

Népétine

Nodiflorétine

Jaceosidine

Hypolaétine

Tricétine

Tricine

Vitéxine

Isovitéxine

Orientine

Iso-Orientine

Génine Monosulfatée6 +7 + + + + + + + + + + + + +8 +3’ + + +4’ + +

Génine Disulfatée6, 7 + +7, 3’ + + +7, 4’ + +3’, 4’ +

Sulfatoglycosylée6-sulfatoglucoside 7-sulfatoglucoside + + + + + +7-sulfatogalactoside + 7-sulfatoglucuronoside + + +7-sulfatorutinoside + +7-disulfatoglucuronoside +7-disulfatoglucoside

Glycosylée et sulfatée3’-glucuronoside, 7-sulfate +3’-rutinoside, 7-sulfate +8-glucoside, 7-sulfate 8-glucoside, 3’-sulfate +

Divers7-OMe, 3’-sulfatoglucuronoside 7-OMe, 3’-sulfatogalactoside 4’-OMe, 8-Glucoside, 3’-sulfate +4’-OMe, 8-(2’’-sulfatoglucoside)

7,4’-diOMe, 3’-sulfate = produits nouvellement recensés depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 13 p 44)

D’après ce tableau qui présente 17 génines de base ;

- 20 flavones sont monosulfatées sur la génine, pour la plupart en position 7 (excepté

pour l’hypolaétine, la tricétine, la tricine et l’isoscutellaréine).

- 8 sont disulfatées sur la génine.

- 20 autres flavones sont sulfatées sur la partie osidique (constituée d’un glucose, d’un

galactose, d’acide glucuronique, ou d’un rutinose). Il y a 7 nouvelles structures :

59

- la lutéoline et le chrysoériol 7-disulfatoglucoside isolés de Phoenix

dactylifera (Palmae) [Tomás Lorente 1988],

- le chrysoériol 7-sulfatoglucuronoside isolé de Meeboldinama hysanantha

(Restionaceae) [Williams 1998].

- le premier sulfatoglucoside, fixé en position 6 sur l’hydroxylutéoline a été

isolé chez Tradescanta (Commelinaceae) [Del Pero Martìnez 1993].

- trois sulfatoglycosides de l’hypolaétine ont été isolés chez des Restionaceae

[Williams 1998], les 7-sulfatoglucoside et 7-sulfatogalactoside chez

Leptocarpus elegans (Restionaceae), ainsi que le 7-sulfatoglucuronique chez

Meeboldinama hysanantha (Restionaceae).

- On ne recense que 4 flavones dont la génine est à la fois sulfatée et glycosylée. Une

seule structure de ce groupe est nouvelle, c’est l’hypolaétine 8-glucoside, 7-sulfate

toujours isolée d’une Restionaceae, l’Hypolaena fastigiata (Restionaceae)

[Williams 1998].

- Dans le dernier groupe, 4 flavones sulfatées sont nouvelles car elles sont à la fois

méthoxylées et sulfatées ou sulfatoglycosylées. Nous avons :

- l’isoscutellaréine 4’-méthoxy, 8-(2’’-sulfatoglucoside) de Althaea

officinalis (Malvaceae) [Gudej 1991],

- la lutéoline 7,4’-diméthoxy, 3’-sulfate [Harborne 1994], toujours des

Restionaceae,

- deux hypolaétines, la 7-méthoxy, 3’-sulfatoglucuronoside de Leptocarpus

elegans (Restionaceae), et la 7-méthoxy, 3’-sulfatogalactoside de

Leptocarpus tenax (Restionaceae) [Williams 1998].

60

R1= disulfatoglucosyl, R2= OH, R3= OH 7-disulfatoglucosyl-lutéoline

R1= OMe, R2= OSO3-; R3= OMe 7,4’-diméthoxy-3’-sulfate-lutéoline

R1= disulfatoglucosyl, R2= OMe, R3= OH 7-disulfatoglucosyl-chrysoériol

R1= sulfatoglucuronyl, R2= OMe, R3= OH 7-sulfatoglucuronyl-chrysoériol

R1= sulfatoglucosyl, R2= OH, R3= H, R4= OH 6-sulfatoglucosyl-lutéoline

R1= OH, R2= OSO3-, R3= glucosyl, R4= OH 7-sulfate-8-glucosyl-hypolaétine

R1= OH, R2= sulfatoglucosyl, R3= OH, R4= OH 7-sulfatoglucosyl-hypolaétine

R1= OH, R2= sulfatogalactosyl, R3= OH, R4= OH 7-sulfatogalactosyl-hypolaétine

R1= OH, R2= sulfatoglucuronyl, R3= OH, R4= OH 7-sulfatoglucuronyl-hypolaétine

R1= H, R2= OMe, R3= OH, R4= sulfatoglucuronyl 7-méthoxyl-3’-sulfatoglucuronyl-hypolaétine

R1= H, R2= OMe, R3= OH, R4= sulfatogalactosyl 7-méthoxy-3’-sulfatogalactosyl-

hypolaétine

Isoscutellaréine 4’-méthoxy, 8-(2’’-sulfatoglucosyl)

Figure 13 : Structure des nouvelles flavones sulfatées

61

B) Les flavonols sulfatés

Tableau 10 : les flavonols sulfatés

Position de Sulfatation

Kaem

pferol

Kaem

pferide

Rham

nocitrine

6-OH

Kaem

pferol

Eupafoline

Eupalitine

Quercétine

Rham

nétine

Isorhamnétine

Tam

arixétine

Rham

nazine

Om

buine

Quercétagétine

Patulétine

Eupatolitin

Spinacetine

Jaceidine

Veronicafoline

Eupatine

Gossypétine

Myricétine

Génine Monosulfatée3 + + + + + + + + + + + + + + + +7 + + +3’ 4’ +

Génine Disulfatée3, 7 + + +3, 3’ + + +3, 4’ + +

Génine Trisulfatée3,5,4’

3, 7, 3’ +3, 7, 4’ + + +

Génine Tétrasulfatée3, 7, 3’, 4’ +

Sulfatoglycosylée3-sulfatoglucoside 3-(3’’-sulfatoglucoside) + +3-(4’’-sulfatorutinoside) 3-(6’’-sulfatoglucoside) +3-(6’’-sulfatogentiobioside) +3-sulfatorhamnoside + + +3-sulfatorutinoside + + +

Glycosylée et sulfatée3-glucuronoside, 7-sulfate + + +3’-glucuronoside, 3,5,4’-trisulfate +8-glucuronoside, 3-sulfate +8-glucoside, 3-sulfate +3-glucoside, 7-sulfate +3-rhamnoside, 3’-sulfate 3-glucuronoside, 3’-sulfate

Divers3’-OMe, 3-sulfate 7,4’-diOMe, 3-sulfate + 6-OMe, 3-sulfate 6,7,4’-triOMe, 3-sulfate 7,3’,4’-triOMe, 3-sulfate 3-OMe, 7-sulfate + +3,7-diOMe, 4’-sulfate 3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate +6,3’,4’-triOMe, 3-sulfate +3-glucoside, 4’-OMe, 7-sulfate 3-OMe, 5-glucoside, 3’-sulfate 7-OMe, 3,3’-disulfate

= produits nouveaux depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 14 p 47 et 48)

62

Dans le tableau précédent, nous avons recensé 21 flavonols comme structure de base dont :

- 24 sont monosulfatés sur les génines, la plupart en position -3. Il existe trois

exceptions (jacéidine (qui porte un méthoxyl à cette position), quercétagétine et

myricétine). Dans ces dérivées monosulfatés, il y a 4 nouvelles structures ;

- le kampferide 3-sulfate isolé de Tamarix spp. (Tamaricaceae) [Tomàs-

Barberan 1990],

- le 6-hydroxykaempferol 3-sulfate d’Inula britanica (Compositae) [Öksüz

1987]

- la quercétine 7-sulfate isolée chez Frankenia pulverulenta (Frankeniaceae)

[Harborne 1975b],

- et la quercétine 3’-sulfate de Hypericum elodes (Guttiferae) [Seabra 1991].

- 14 flavonols sont polysulfatés, avec le plus souvent, la quercétine comme génine. Il

y a une seule génine tétrasulfatée, 8 génines disulfatées, 5 trisulfatées dont 1 est

nouvelle ;

- la rhamnétine 3,5,4’-trisulfate de Tamarix aphylla (Tamaricaceae)

[Harborne 1988]. Ce composé semble provenir de la rhamnétine 3’-

glucuronyl-3,5,4’-trisulfate [Saleh 1975].

- Tout comme pour les flavones, il y a 12 flavonols sulfatoglycosylés (les oses

rencontrés sont le glucose, le gentiobiose, le rhamnose et le rutinose). Les 2

nouvelles structures dans ce groupe, sont :

- la quercétine 3-sulfatoglucoside isolée de Phoenix dactylifera (Palmae)

[Tomás Lorente 1988]

- et l’isorhamnétine 3-(4’’-sulfatorutinoside) de Zygophyllum dumosum

(Zygophyllaceae) [Li 1996].

- Par ailleurs, nous avons recensé 9 structures qui étaient à la fois glycosylées et

sulfatées, dont 2 sont nouvelles :

- la quercétine 3-glucuronyl-3’-sulfate isolée de Hypericum elodes

(Guttiferae) [Seabra 1988]

- la quercétine 3-rhamnosyl-3’-sulfate ou quercitrine 3’-sulfate isolée de

Leea guineensis (Leeaceae) [Op de Beck 1998].

- De plus, on dénombre 15 composés méthoxylés et sulfatés et parfois même

glycosylés. C’est d’ailleurs dans ce groupe que l’on recense le plus grand nombre

63

de structures nouvelles. Il s’élève à 10 dont la plupart dérive de la quercétine. Nous

avons :

- le 6-méthoxykaempferol 3-sulfate isolé de Flaveria chloraefolia

(Compositae) [Ibrahim 1995],

- le 6-hydroxy-7,4’-diméthoxykaempferol 3-sulfate, le 6,7,4’-

triméthoxykaempferol 3-sulfate, et la 6,7,4’-triméthoxyquercétagétine 3-

sulfate isolés chez Brickellia longifolia (Compositae) [El-Sayed 1990].

- Enfin, nous comptons 6 nouveaux dérivés de la quercétine, la 3’-

méthoxyquercétine 3-sulfate ou percicarine et la 3-glucosyl-4’-

méthoxyquercétine 7-sulfate isolées de Polygonum hydropiper

(Polygonaceae) [Haraguchi 1996], la 7,3’,4’-triméthoxyquercétine 3-sulfate

et la 3,7-diméthoxyquercétine 4’-sulfate de Ipomoea regnellii

(Convolvulaceae) et la 7-méthoxyquercétine 3,3’-disulfate isolée d’une autre

Convolvulaceae Argyreia mollis [Mann 1999], la 3-méthoxy-5-

glucosylquercétine 3’-sulfate isolée de Calorophus elongatus (Restionaceae)

[Williams 1998].

3-sulfate de kaempferide

R1= OH, R2= OH, R3= OH 3-sulfate-6-hydroxykaempferolR1= OMe, R2= OH, R3= OH 6-méthoxy-3-sulfate de kaempferolR1= OH, R2= OMe, R3= OMe 6-hydroxy-7,4’-diméthoxy-3-sulfate de kaempferolR1= OMe, R2= OMe, R3= OMe 6,7,4’-triméthoxy-3-sulfate de kaempferol

Figure 14 : Structure des nouveaux flavonols sulfatés

64

R1= OH, R2= OSO3-, R3= OH, R4= OH 7-sulfate de quercétine

R1= OH, R2= OH, R3= OSO3-, R4= OH 3’-sulfate de quercétine

R1= sulfatoglucosyl, R2= OH, R3= OH, R4= OH 3-sulfatoglucosyl de quercétineR1= 4’’-sulfatorutinosyl, R2= OH, R3= OMe, R4= OH 3-(4’’-sulfatosulfatorutinosyl) d’isorhamnétineR1= glucuronyl, R2= OH, R3= OSO3

-, R4= OH 3-glucuronyl-3’-sulfate de quercétineR1= rhamnosyl, R2= OH, R3= OSO3

-, R4= OH 3’-sulfate de quercitrineR1= OSO3

-, R2= OH, R3= OMe, R4= OH 3-sulfate-3’-méthoxy de quercétineR1= glucosyl, R2= OSO3

-, R3= OH, R4= OMe 3-glucosyl-4’-méthoxy-7-sulfate de quercétineR1= OSO3

-, R2= OMe, R3= OMe, R4= OMe 3-sulfate-7,3’,4’-triméthoxy de quercétineR1= OMe, R2= OMe, R3= OH, R4= OSO3

- 3,7-diméthoxy-4’-sulfate de quercétineR1= OSO3

-, R2= OMe, R3= OSO3-, R4= OH 3,3’-disulfate-7-méthoxy de quercétine

6,7,4’-triméthoxy-3-sulfate de quercétagétine

3-méthoxy-5-glucosyl-3’-sulfate de quercétine

3,5,4’-trisulfate de rhamnétine

Figure 14 (suite) : Structure des nouveaux flavonols sulfatés

65

III- Distribution

Les flavonoïdes sulfatés bénéficient d’une large distribution. C’est pour cette raison

que nous ne pouvons pas parler de traceur chimiotaxonomique au sens strict. Leur répartition

fait d’avantage référence à leur situation géographique et écologique (milieux salins et/ou

marécageux). En 1988, les travaux de Barron dénombraient 250 espèces réparties dans 17

familles des Dicotylédones et dans 15 familles des Monocotylédones [Barron 1988a]. Depuis,

nous avons dénombré, 3 nouvelles familles chez les Dicotylédones (Cf. Tableau 11 ).

Quelques espèces sont représentées chez les Ptéridophytes, comme Adiantum capillaris-

veneris (Adiantaceae), Asplenium filix-foemina, A. fontanum, A. septentrionale

(Aspleniaceae) et Cystopteris fragilis (Athyriaceae). Par contre, aucun flavonoïde sulfaté n’a

encore été rencontré chez les Bryophytes et les Gymnospermes.

On peut cependant noter que les flavonoïdes sulfatés permettent de séparer les espèces

en groupes distincts dans certaines familles comme les Cyperaceae, les Palmae ou les

Zosteraceae [Ibrahim 1995].

De même, les flavonoïdes sulfatés rencontrés chez les espèces de Flaveria

(Compositae) peuvent être classés en étroite relation avec les 4 groupes déjà créés selon leurs

modèles photosynthétiques [Hanoufa 1994].

On rencontre par exemple pour le modèle photosynthétique de type C3, des monosulfates de

quercétine et patulétine. Pour le type C3-C4, des mono et disulfates principalement de

quercétine et de patulétine. Pour le type C4-like, des mono, di, tri et tétrasulfates

principalement de quercétine. Et pour le type C4, des mono, di et trisulfates de kaempferol,

d’isorhamnétine et d’apigénine [Hannoufa 1994].

A petite échelle, ces flavonoïdes sulfatés peuvent donc jouer un rôle dans la

systématique.

66

Tableau 11 : Répartition des flavonoïdes sulfatés dans les Magnoliophyta (Angiospermes)

Classe Sous-classe Ordres FamillesMagnoliopsida(Dicotylédones)

Hammamelidae Myricales MyricaceaeCaryophyllidae Caryophyllales Chenopodiaceae

Polygalales PolygonaceaePlumbaginales Plumbaginaceae

Dilleniidae Dilleniales DilleniaceaeTheales GuttiferaeMalvales MalvaceaeViolales Bixaceae

CistaceaeFrankeniaceaeTamaricaceae

Rosidae Rosales DavidsoniaceaeRosaceae

Myrtales OnagraceaeRhamnales Leeaceae Sapindales Zygophyllaceae Apiales Umbelliferae

Asteridae Solanales Convolvulaceae Lamiales VerbenaceaeAsterales Compositae

Liliopsida(Monocotylédones)

Alismatidae Alismatales AlismataceaeHydrocharitales HydrocharitaceaeNajadales Zamielelliaceae

ZosteraceaeArecidae Arecales Palmae

Arales AraceaeCommelinidae Commelinales Commelinaceae

Cyperales CyperaceaeGramineae

Restionales RestionaceaeJuncales Juncaceae

Zingiberidae Zingibérales MarantaceaeLiliidae Liliales Liliaceae

IridaceaeOrchidales Orchidaceae

IV- Fonction

En dépit des récentes avancées en phytochimie, le rôle des flavonoïdes sulfatés dans

les plantes reste encore mal connu. On peut cependant, avancer quatre hypothèses :

67

A) Détoxification

Tout comme dans le règne animal, la sulfatation des flavonoïdes peut être considérée

comme un mécanisme de détoxification, en rendant hydrosolubles les produits en vue de leur

stockage dans des compartiments cellulaires hydrophiles. Il s’agit notamment de détoxifier la

plante à l’égard des groupes hydroxyles des flavonoïdes très réactifs, et de pouvoir excréter,

tout comme les mécanismes de glycosylation, les flavonoïdes afin d’éviter leurs interactions

avec des sites enzymatiques [Harborne 1977].

B) Transfert d’ions

La sulfatation peut aussi être un moyen de séquestrer les ions sulfates, et ainsi de jouer

sur le dynamisme de la balance ionique. En effet, la plupart des plantes qui synthétisent ces

dérivés, vivent dans un environnement écologique aquatique et/ou salin. La plante aurait donc

par ce système, la possibilité de stocker l’excès d’ions sulfates présents dans son

environnement. Ce phénomène pourrait également servir de transfert de groupes sulfates ou

de soufre inorganique à une forme organique. Une expérience consistant à l’incorporation de 35SO4

2- dans les tissus de Zostera (Zosteraceae) a révélé que 36 heures après, 50% de la

radioactivité était présente dans la fraction contenant les flavonoïdes [Nissen 1964, Harborne

1975a, 1977].

C) Bioactivation

On sait aussi que la sulfatation dans le règne animal est un moyen de bioactivation

d’un certain nombre de composés comme les hormones stéroïdiennes, et les

neurotransmetteurs, pour la modulation des activités biologiques. La sulfoconjugaison est

même impliquée dans l’activation des prodrogues (c’est le dérivé sulfaté du Minoxidil® agent

antihypertenseur, qui est actif) [Falany 1997]. Il en est de même chez certaines plantes,

comme le Limonium (Plumbaginaceae), qui, en réponse à un stress de salinité, accumule du

sulfate de choline, ou chez le Mimosa (Fabaceae), dont l’acide 4-(6’-sulfoglucosyl)-gallique

est responsable des mouvements seismonastique et nyctinastiques [Varin 1997].

68

D) Régulation du transport de l’auxine

La croissance des plantes est régulée par l’accumulation d’auxine, phytohormone de

croissance. L’auxine est elle-même stimulée par la quercétine et d’autres flavonoïdes. Or, les

dérivés 3-, 7- et 3’-sulfate de la quercétine bloquent cette stimulation [Faulkner 1992].

Cette hypothèse est confirmée par le fait que l’on rencontre les plus fortes concentrations en

flavonols sulfatés et en sulfotransférase (ST) dans les zones en croissance de la plante, alors

qu’elles sont les plus faibles dans les tissus âgés [Hannoufa 1991]. De plus, chez Flaveria

bidentis (Compositae), la régulation de la flavonol 3-ST par l’auxine a été démontrée. Cela

suggère donc que la sulfatation chez Flaveria, joue un rôle dans le contrôle du transport de

l’auxine [Ibrahim 1995].

V- Enzymologie

Dans les plantes il existe peu de sulfatases. Ce n’est que très récemment que des

flavonols sulfotransférases (F-ST) ont été identifiées à partir de Flaveria (Compositae) : la

flavonol 3-sulfotransférase (3-ST), ainsi que la 3’-ST, la 4’-ST et la 7-ST [Varin 1989, 1991,

1992b]. Ces enzymes sont très spécifiques, ainsi, la 3-ST ne reconnaît que la position 3 des

flavonols pour produire exclusivement le flavonol 3-sulfate selon une préférence allant de la

rhamnétine, l’isorhamnétine, la quercétine, la patulétine au kaempferol.

La 3’ et 4’-ST ne reconnaissent que les flavonols 3-sulfate, et la 7-ST que les

flavonols 3,3’-disulfate ou 3,4’-disulfate. Cette constatation a permis d’établir une séquence

enzymatique de sulfatation pour expliquer la présence des flavonols déjà isolés dans cette

espèce (Figure 15). La première étape étant la sulfatation en position 3 [Varin 1992a].

69

Quercétine

Quercétine-3-sulfate

3-ST

Quercétine-3,3'-disulfate Quercétine-3,4'-disulfate

4'-ST3'-ST

Quercétine-3,7,4'-trisulfateQuercétine-3,7,3'-trisulfate

Quercétine-3,7,3',4'-tetrasulfate

7-ST 7-ST

3'-ST4'-ST

Sulfatase

Quercétine-3,7,3'-trisulfate/3,7,4'-trisulfate

Sulfatase

Quercétine-3,7-disulfate

Fla

veri

a bi

dent

is

Flavéria chloraefolia

Figure 15 : Modèle biosynthétique des flavonoïdes sulfatés des espèces de Flaveria (Compositae) [Varin

1992a]

La réaction se fait par un mécanisme BI-BI qui utilise la PAPS (3’-Phosphoadénosine

5’-sulfate) comme premier substrat, puis vient le flavonol. Il y a réaction et libération du

flavonol sulfate puis du PAP.

Tableau 12 : Caractéristiques des flavonols sulfotransférases (F-ST) de Flaveria [Varin 1992a]

Propriétés F 3-ST F 3’-ST F 4’-ST F 7-STKm Flavonoïdes (µM) 0,2 0,29 0,36 0,24Km PAPS (µM) 0,2 0,35 0,38 0,33pH optimum 6,0 ; 8,5 7,5 7,5 7,5pI apparent 5,4 6,0 5,1 6,5Poids moléculaire (D) 35 000 35 000 35 000 35 000Substrat Quercétine (Q) Q-3-sulfate Q-3-sulfate Q-3,3’-disulfate

Il y a de très fortes homologies de séquences entre les ST [Varin 1992a, 1997]. Ainsi

entre la 3-ST et la 4’-ST il y a 70% d’homologie de séquence entre elles et environ 30% avec

les ST animales, justifiant ainsi la présence de régions très conservées.

70

Flaveria chloraefolia

Par mutagénèse, on connaît à présent les sites de fixation du flavonol spécifique et du

co-substrat [Marsolais 1997, 1998]. L’activité de ces ST est fortement liée au développement

végétatif de la plante [Hannoufa 1991].

On localise même les flavonols sulfatés dans le compartiment nucléaire, et de manière

transitoire dans le cytosol. Une protéine nucléaire qui a d’ailleurs une forte affinité avec la

quercétine 3-sulfate (85 nM) est en cours d’étude [Grandmaison 1996]. Tout cela suggère une

fonction probable de régulation. Rappelons que les flavonoïdes activent l’expression du gène

nod du Rhizobium [Harborne 1994], et que chez les mammifères, les métabolites sulfatés sont

impliqués dans la croissance et le développement cellulaire.

VI- Métabolisation et Bioconversion

A) Métabolisation

Il est maintenant admis que les flavonoïdes sont métabolisés par les cellules de

mammifères et excrétés dans la bile et/ou l’urine sous forme de dérivés glucuronoconjugués

ou sulfatés [Harborne 1982, 1994]. La sulfatation enzymatique joue un grand rôle dans la

détoxification des métabolites endogènes et des xénobiotiques, mais cette sulfatoconjugaison

est aussi impliquée dans la bioactivation. Ainsi, la quercétine est métabolisée par le foie et

donne des dérivés monosulfatés ainsi que des dérivés sulfatés et glucuronoconjugués [Shali

1991]. De plus, la quercétine, au pouvoir antioxydant reconnu, est administrée par sonde

intragastrique à des rats. Le sang prélevé au bout d’une heure, puis de six heures, de l’aorte

abdominale ne contient plus de quercétine libre, mais plusieurs de ses métabolites, dont des

dérivés sulfatés et sulfoglucuronés. Le plasma de rat contenant ces métabolites inhibent

d’avantage la peroxydation lipidique induite par le sulfate de cuivre, que le plasma contenant

seulement de la quercétine [da Silva 1998]. Aussi, la liquiritine (7,4’-dihydroxyflavone) qui a

une activité antihépatotoxique in vivo par voie orale chez le rat est métabolisée en 5 composés

dont les dérivés sulfatés suivants : 7,4’-disulfate, 7-sulfate-4’glucuronoside et 7-

glucuronoside-4’-sulfate. Le rein participe aussi à la métabolisation en dérivé 7,4’-disulfate

[Shimamura 1993]. Il en est de même pour la génistéine qui est connue pour son activité

inhibitrice de la protéine tyrosine kinase ou pour son activité oestrogénique. Ces activités sont

essentiellement dues à ces dérivés sulfatés. En effet, l’administration de génistéine par voie

71

orale chez le rat est rapidement suivie d’une métabolisation, conduisant à l’élimination par

voie urinaire et biliaire de la génistéine 4’-sulfate et de son dérivé glucuroné en –7

essentiellement [Yasuda 1996].

B) Bioconversion

Les synthèses spécifiques de dérivés sulfatés ne sont pas toujours faciles [Barron

1988a]. Aussi, la bioconversion semble avoir un avenir certain par l’obtention de réaction

spécifique avec de bons rendements.

Par exemple, Streptomyces fulvissimus est capable, en suspension, de biotransformer

la 5-hydroflavone en son dérivé 4’-sulfate [Ibrahim 1989].

De même, dans la flore intestinale humaine, il existe une arylsulfotransférase qui

sulfate des polyphénols comme les xanthones, chalcones et flavonols. Ainsi, la bactérie isolée

de la flore intestinale (Eubacterium A-44) peut catalyser par exemple, le transfert d’un sulfate

sur la quercétine à partir du sulfate de p-nitrophenyl ou PNS (et non pas à partir du PAPS).

Cette enzyme bactérienne est plusieurs milliers de fois plus active que les enzymes d’origine

animale ou végétale. Si le PNS est en excès, on obtient les dérivés 3,3’-disulfate et 3,3’,7-

trisulfate. Lorsque le PNS est mis dans des conditions équimolaires ou en léger excès, seul le

dérivé 3,3’-disulfate est obtenu [Koizumi 1990].

Cette étude montre aussi qu’administrée oralement, la quercétine peut être sulfatée par

les bactéries intestinales et devenir plus hydrosoluble et par conséquent moins absorbable.

Par ailleurs, il est connu que la quercétine est mutagène in vitro mais ne semble pas

être carcinogène in vivo [Fukuoka 1980]. La sulfatation de la quercétine par la flore

intestinale entraînerait-elle cette détoxification ?

VII- Propriétés biologiques des flavonoïdes sulfatés

A) Activité antiallergique [Nagai 1975]

La baicaléine est un flavonoïde antiallergique peu soluble, isolée de la racine de

Scutellaria baicalensis (Lamiaceae) utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise lors des

crises allergiques ou d’asthme. Deux dérivés plus hydrosolubles ont été synthétisés. Il s’agit

72

des sels de sodium de la baicaléine 6-sulfate (BSS) et de la baicaléine 6-phosphate (BPS),

testés pour leur activité antiallergique.

R=OH Baicaléine

R=OSO3Na Baicaléine 6-sulfate de sodium

Il existe trois groupes de réactions d’hypersensibilité allergique :

- L’hypersensibilité de type I ou hypersensibilité immédiate se produit lorsqu’un

allergène est reconnu par une IgE qui active un mastocyte. Le mastocyte activé

libère de l’histamine qui provoque la réaction allergique. Lorsque l’allergène

pénètre dans les bronches, l’hypersensibilité peut se manifester par une crise

d’asthme avec diminution du volume d’air inhalé.

- L’hypersensibilité de type II est liée à la présence d’anticorps dirigés contre les

membranes et d’antigènes cellulaires qui activent le complément.

- L’hypersensibilité de type III est le résultat du dépôt du complexe immun (Ac-Ag)

sur les parois des vaisseaux et dans les tissus provoquant la destruction de ceux-ci

par la libération par les phagocytes de dérivés actifs de l’oxygène. Cette

hypersensibilité est mise en évidence par la réaction d’Arthus qui est une réaction

cutanée qui se présente sous forme d’une zone rouge et gonflée après injection

intradermique de l’antigène.

Cette étude a montré que BPS et BSS inhibent les hypersensibilités de type I et II,

mais qu’ils n’ont aucun effet sur l’hypersensibilité de type III (responsable de la polyarthrite

rhumatoïde ou du lupus érythémateux disséminé entre autres).

B) Activité Mutagène - Carcinogène [Fukuoka 1980]

Les extraits aqueux de feuilles et de graines d’Anethum graveolens et d’A. sowa

(Umbelliferae) comestibles présentent une activité mutagène sur les souches TA98 et TA100

de Salmonella typhimurium. Les auteurs ont recherché le principe mutagène, et examiné

73

l’effet carcinogène chez le rat en complémentant son alimentation durant 450 jours, par un

apport de 33% de poudres de feuilles ou de graines.

Après fractionnement et purifications successives, les auteurs montrent que ce sont la

persicarine (isorhamnetine 3-sulfate) et la quercétine 3-sulfate qui sont responsables de cette

activité mutagène.

R=CH3 Persicarine ou Rhamnétine 3-sulfate

R=H Quercétine 3-sulfate

Ils soulignent bien que ces flavonols sulfatés sont mutagènes in vitro mais pas

carcinogènes in vivo ! Avec un apport journalier de 33% de poudres de feuilles et de graines,

le taux de flavonols sulfatés n’est pas suffisant pour induire des tumeurs.

C) Inhibition des déshydrogénases

Les dérivés de la quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate et 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate inhibent

la réduction des groupes carbonyles catalysés par les alcool déshydrogénase ainsi que lactate

et malate déshydrogénases [Pérez 1986].

D) Inhibition de l’aldose réductase [Varma 1986]

L’aldose réductase est une enzyme clé dans la voie de synthèse des polyols via le

métabolisme des sucres :

74

Figure 16 : Métabolisme des polyols

L’aldose réductase est présente dans de nombreux tissus dont le cristallin. Chez les

diabétiques, cette enzyme produit beaucoup de sorbitol, et cette accumulation dans le

cristallin est responsable de la cataracte. Ce sont ces polyols qui sont responsables de

l’opacification du cristallin car ils diffusent mal à travers les membranes cellulaires et

provoquent une importante entrée d’eau dans les cellules par osmose. Ce phénomène serait

responsable de certaines rétinopathies et neuropathies périphériques associées au diabète

humain.

La recherche de composés inhibiteurs de l’aldose réductase est d’un grand intérêt

thérapeutique dans la lutte contre les complications du diabète. Certains flavonoïdes inhibent

cette enzyme comme la quercitrine notamment qui a une CI50 de 10-7M. Mais la limitation de

l’usage de ces flavonoïdes en thérapeutique est leur faible hydrosolubilité. Pour cela, les

Laboratoires Zyma© (Nyon Suisse) ont synthétisé des dérivés sulfatés pour les rendre plus

hydrosolubles. Il s’avère que ces flavonoïdes sulfatés sont les composés les plus actifs (CI50

10-8M).

Tableau 13 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin obtenus par

synthèse

Composés % d’inhibition à 10-8MQuercitrine 0Quercétine 3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate 70Quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate 55Quercétine 3,5-diacétyl, 7,3’,4’-trisulfate 75Quercétine 5,7,3’-triacétyl, 3,4’-disulfate 75

75

Cette action a été également démontrée pour d’autres flavonoïdes sulfatés isolés de

Polygonum hydropiper (Polygonaceae) sur l’aldose réductase du cristallin de porc [Haraguchi

1996].

Tableau 14 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin isolés de Polygonum

hydropiper

Composés IC50 (M) de l’aldose réductaseQuercétine 50,1Quercétine-3-sulfate 50,9Isorhamnétine >95,0Isorhamnétine-3-sulfate 69,0Isorhamnétine-3,7-disulfate 1,8Rhamnazine >91,0Rhamnazine-3-sulfate 30,1Isoquercitrine 16,0Tamarixétine-3-glucoside-7-sulfate 5,0

Ce tableau montre que les dérivés sulfatés les plus actifs sont l’isorhamnétine-3,7-

disulfate (IC50 =1,8 mol.l-1) et la tamarixétine-3-glucoside-7-sulfate (IC50 = 5,0 mol.l-1). La

sulfatation de l’hydroxyle en 7 semble être un facteur important dans l’inhibition de l’aldose

réductase. On remarque aussi que l’introduction d’un groupement sulfate sur une génine

augmente son activité de façon non négligeable. Ainsi l’activité de la rhamnazine-3-sulfate

(IC50 = 30,1 mol.l-1) est trois fois plus importante que la génine correspondante (IC50 >91,0

mol.l-1).

R1 = Rhamnosyl, R2 = OH, R3 = OH, R4= OH, R5 = OH Quercitrine

R1 = OSO3-, R2 = OH, R3 = OSO3

-, R4= OSO3-, R5 = OSO3

- Quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate

R1 = Acétyl, R2 = OH, R3 = OSO3-, R4= OSO3

-, R5 = OSO3- Quercétine 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate

R1 = Acétyl, R2 = Acétyl, R3 = OSO3-, R4= OSO3

-, R5 = OSO3- Quercétine 3,5-diacétyl-7,3’,4’-trisulfate

R1 = OSO3-, R2 = Acétyl, R3 = Acétyl, R4= Acétyl, R5 = OSO3

- Quercétine 5,7,3’-triacétyl-3,4’-trisulfate

R1 = OSO3-, R2 = OH, R3 = OSO3

-, R4= OMe, R5 = OH Isorhamnétine 3,7-disulfate

R1 = Glucosyl, R2 = OH, R3 = OSO3-, R4= OH, R5 = OMe Tamarixétine 3-glucosyl-7-sulfate

76

E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire

Antiradicalaire [Brasseur 1987]

La rutine est un des flavonoïdes majeurs de la thérapeutique, utilisée notamment dans

les troubles de la circulation veineuse, de l’athérosclérose, de l’hypertension et les

radiodermites (souvent associé à l’acide ascorbique).

Malheureusement peu soluble dans l’eau, des dérivés solubles ont été hémisynthétisés dont la

rutine sulfate sous forme de sel sodique. Afin de savoir si ses dérivés ont conservé l’activité

de la molécule originale, les auteurs ont effectué différents tests.

R=H Rutine

R=OSO3Na Rutine sulfate

Tableau 15 : Activité comparée de la rutine et de la rutine sulfate (exprimés en %)

Action Concentration M Rutine Rutine sulfateradical DPPH

% de capture du radical3.10-6 36 7

radical OH

% de dégagement d’éthylène formé par réaction entre le radical et le KMB* soumis à irradiation

10-4 20 17

antilipoperoxydante% d’inhibition de formation de lipoperoxyde

10-3 25 2

antioxygène% de la teneur résiduelle en acide ascorbique

10-4 67 40

biosynthèse des prostaglandines% de stimulation de la biosynthèse

10-3 248 186

*KMB : acide méthyl-4-oxo-2 butyrique

On observe que la rutine reste la plus active. Les auteurs soulignent tout de même que

le sulfate de rutine qui est testé, bien que majoritaire, contient des impuretés ( notamment des

dérivés de rutine dont le système ortho-dihydroxyl du cycle B n’est plus libre).

77

Antioxydante [Yagi 1994]

Isolés de Polygonum hydropiper (Polygonaceae), la quercétine 3-sulfate,

l’isorhamnétine 3,7-disulfate et la tamarixétine 3-O--glucoside 7-sulfate ont montrés une

forte activité antioxydante.

La méthode au thiocyanate ferrique montre que ces trois flavonoïdes ont une activité

supérieure à celle de la quercétine et de l’-tocophérol (ces derniers étant connus pour être de

très bons antioxydants naturels).

R1=OSO3K R2=OH R3=OH R4=OH Quercétine 3-sulfate

R1=OSO3K R2=OSO3K R3=OCH3 R4=OH Isorhamnétine 3,7-disulfate

R1=O-Gluc R2=OSO3K R3=OH R4=OCH3 Tamarixétine 3-glucosyl, 7-sulfate

De même, la méthode utilisant l’anion superoxyde montre qu’ils sont plus actifs que la

quercétine pour capter ces anions induits par le système xanthine-xanthine oxydase (l’IC50

étant en dessous de 10 ppm).

F) Chimioprévention des cancers du sein [Peterson 1996, Wong 1997]

Des études épidémiologiques ont montré le très faible taux de cancer chez les

personnes ayant une alimentation riche en isoflavones (asiatiques,…). Bien que ce soit des

génines non sulfatées qui sont consommées, celles-ci sont métabolisées en dérivés sulfatés par

l’organisme. Ce sont ses dérivés qui sont fortement impliquées dans le processus d’inhibition

de la croissance des tumeurs mammaires.

En effet, dans les cellules de cancer du sein MCF-7, la génistéine est métabolisée en

dérivés sulfatés dont la génistéine 7-sulfate. Ces métabolites sont rapidement excrétés,

entraînant une chute de la concentration intracellulaire en génistéine. Ce processus permet

d’inhiber la croissance mammaire.

78

De même, la biochanine A, active les cellules MCF-7 par la métabolisation en génistéine puis

conversion en génistéine 7-sulfate.

R1=H R2=OH R3=OH daidzéine

R1=OH R2=OH R3=OH génistéine

R1=OH R2=OH R3=OMe biochanine A

R1=OH R2=OSO3- R3=OH génistéine 7-sulfate

R1=H R2=OH R3=OSO3- daidzéine 4’-sulfate

R1=H R2=OSO3- R3=OSO3

- daidzéine 7,4’-disulfate

Une autre voie dans la prévention des cancers du sein est celle de l’inhibition

d’enzyme spécifique comme la stérol sulfatase.

En effet, les stéroïdes oestrogéniques jouent un rôle dans l’évolution cancéreuse. Ces

stéroïdes sont véhiculés sous forme de sulfoconjugués, inactifs sous cette forme. La stérol

sulfatase les activent en les désulfatant. C’est cette désulfatation qui entraîne l’évolution

cancéreuse. Or, les dérivés sulfatés de daidzéine inhibent la stérol sulfatase. La daidzéine 4’-

sulfate et 7,4’-disulfate ont une IC50 de 6 et 1,5 M respectivement, alors que le Tamoxifen®

(et ses métabolites non-sulfatés), principal antioestrogène, inhibe cette même enzyme à 270

M. La génistéine ou la biochanine A ont une IC50 de 1,2 M alors que la daidzéine n’inhibe

pas cette enzyme. Notons aussi que la daidzéine et la génistéine inhibent une enzyme de

synthèse de l’œstrogène et des androsténédiols ce qui a pour conséquences de diminuer leurs

concentrations dans les cellules mammaires et donc de diminuer l’évolution cancéreuse.

79

Conclusion

Depuis 1988, nous avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés, dont 33 sont nouveaux (la

plupart étant à la fois méthylés et/ou glycosylés et sulfatés). Hormis une flavone sulfatée chez

les Malvaceae, notons que les nouvelles flavones sulfatées, proviennent des

Monocotylédones. Nous avons vu aussi que les flavonoïdes sulfatés sont présents dans 38

familles avec trois nouvelles familles chez les Dicotylédones et que leur répartition est liée au

milieu dans lequel ces plantes poussent (salin ou marécageux).

La plupart des propriétés décrites sont les mêmes que celles des flavonoïdes en

général. Mais le fait que les flavonoïdes se métabolisent en dérivés sulfatés hydrosolubles et

les travaux effectués montrent que les propriétés citées pour les flavonoïdes sont étroitement

liées aux activités de ces dérivés sulfatés.

80

Deuxième PartieDeuxième Partie ::

Travaux personnelsTravaux personnels

Chimie extractive

Isolement des composés

Analyse structurale

Activités biologiques

81

Chapitre I Chimie Extractive

I- Matériel végétal

Toute l’étude a été effectuée sur l’espèce Leea guineensis G. Don. Celle-ci a été

récoltée en avril 1995 au Cameroun à Bella au sud d’Edea (3°14’N, 10°13’E) par le botaniste

le Dr Achoundoung. Un échantillon de la plante est conservé à l’Herbier National de

Yaoundé sous le numéro 3145 : Achoundoung.

Les feuilles et le bois provenant du même arbuste ont été séchés séparément à

l’ombre pendant une quinzaine de jours, puis ont été respectivement broyés. Les poudres de

feuilles 1,5 Kg et de bois 1,5 Kg ont alors été envoyés au laboratoire de pharmacognosie de

Grenoble.

II- Chimie extractive

A Extraction solide-liquide des feuilles

1 Kg de poudre de feuilles est soumis à une extraction à l’hexane (25 L) pendant

11H dans un appareil de type Soxhlet. Les marcs sont séchés et épuisés au dichlorométhane

(25 L, 15H). Ces deux extraits obtenus sont ensuite concentrés alors que les marcs subissent

une extraction hydroalcoolique 50% (30 L pendant 4 jours à température ambiante) (Figure

17 p 67).

B Extraction liquide-liquide

L’extrait hydroalcoolique est concentré sous vide afin d’obtenir 10 L de solution,

dont 1 L est prélevé après homogénéisation et lyophilisé. Le reste subit une succession

d’extraction liquide-liquide avec les solvants de polarité croissante suivants :

dichlorométhane, acétate d’éthyle et butanol.

82

L’extraction est réalisée plusieurs fois pour chaque solvant. Les solutions extractives sont

alors concentrées. Les résidus des extraits EtOAc et BuOH sont repris dans l’eau et

lyophilisés (Figure 18 p 67).

Au total, nous obtenons 7 extraits dont les rendements d’extraction sont les suivants :

Tableau 16 : Rendements d’extraction

Typed’extraction

Extraits Quantitéen g

Rdt / ExtraitEtOH-H2O

Rdt total/ Feuilles

ExtractionSolide-Liquide

Hexane 26 2,6Dichlorométhane 42 4,2Hydroalcoolique 143 100 14,3

ExtractionLiquide-Liquide

Dichlorométhane 7 5 0,7Acétate d’éthyle 38 27 3,8

Butanol 15 10 1,5Aqueux résiduel 36 25 3,6

Tous les extraits ont été analysés.

C Hydrodistillation

La recherche des composés volatils (CV) de L. guineensis G. Don, est menée par un

entraînement classique à la vapeur d’eau à partir d’échantillons de 100g de feuilles ou de bois

sec.

Le protocole utilisé est celui de la Pharmacopée Française Xèmeéd. [1983]. La durée

d’hydrodistillation a été de 4H pour les feuilles et le bois.

Les distillats obtenus dans les deux cas sont de couleur jaune foncée et sont plus légers

que l’eau.

Les rendements sont :

CV des feuilles : Rdt = 0,3%

CV du bois : Rdt = 0,4%

83

FEUILLES broyées1Kg

ExtraitHexanique

2,6 %

ExtraitHydroalcoolique

14,3 %

ExtraitDichlorométhane

4,2 %

Marc

Marc

Marc

Soxhlet Hexane 25 L, 11H

Soxhlet dichlorométhane 25 L, 15H

Macération EtOH-H2O 50:50 30 L, 4J, TA

Extrait H2O10 L

ExtraitDichlorométhane

0,7 %

ExtraitButanol1,5 %

ExtraitAcétate d’éthyle

3,8 %

PhaseH2O

Concentration

EtOAc 3 x 20 L

BuOH 5 x 8 L

Extrait EtOH-H2O30L

CH2Cl2 1 x 25 L

PhaseH2O

ExtraitAqueux final

3,6 %

Prélèvement d’ 1L lyophylisé

ConcentrationLyophylisation



concentration

Figure 17 : Extraction solide – liquide des feuilles

Figure 18 : Extraction liquide – liquide

84

Extrait hexaniqueExtrait hexanique

A BCLMP SiE3

CO charbonE1

CLMP SiE3

Terp-5(1g)

Terp-5(1g)

Aa Ab Ba

Aaa AbaBaa

Ca

C

5 g

20 g CO SiE2

CLMP C18E4

CCMP SiC1

CLMP SiE5

CLMP SiE5

CLMP C18E4

CLMP C18E4

CLMP C18E4

Aaaa Abaa

CCMP SiC2Visiprep SiE7

CLMP C18E4

112B

Visiprep SiE6

Terp–7(6mg)

Terp–7(6mg)

CCMP SiC7

Terp-5(500mg)Terp-5

(500mg)

Terp-2(25mg)Terp-2(25mg)

Terp-3(9mg)

Terp-3(9mg)



Terp-3(1mg)

Terp-3(1mg)

Terp-6(9mg)

Terp-6(9mg)

E1 CH2Cl2

E2 CHCl3

E3 gradient cHex-CHCl3-MeOH

E4 gradient MeOH-CHCl3

E5 gradient cHex-CHCl3

E6 gradient cHex-EtOAc

E7 CHCl3-MeOH 9:1

C1 cHex

C2 cHex-EtOAc 7:3C7 cHex-EtOAc 9 :1

Chapitre II - Isolement des composés

I- Extrait hexanique

Cet extrait visqueux et vert foncé contient beaucoup de pigments chlorophylliens.

Pour cela, nous avons chromatographié 20 g de cet extrait sur une colonne ouverte (CO) de

charbon afin de fixer ces pigments sur le support. L’extrait est élué au dichlorométhane. Deux

fractions principales sont obtenues A et B qui seront chacune chromatographiée sur des

colonnes de silice normale et de silice greffée C-18 sous moyenne pression (CLMP). Cet

extrait hexanique conduit à la purification de 7 composés de nature terpénique (Terp-1 à

Terp-7). De plus, le fractionnement classique de 5g d’extrait a conduit à l’isolement de Terp-

2.

Figure 19 : Isolement des composés de l’extrait hexanique

85

Extrait dichlorométhane

Extrait dichlorométhane

A BCO Sephadex LH20E9

VLC siliceE8

CLMP SiE10

Aa Ab Bb

Aaa Aba Bba

6 g

CO CharbonE10

CLMP C18E11 CLMP C18

E13

Aaaa

Ac Ph-2(4mg)

Ac Ph-2(4mg)

Ba

BbabBbaa

CCMP SiC5

Flav-7(3mg)

Flav-7(3mg)

Aaab

CO Sephadex LH20E14

AG-1(30mg)AG-1

(30mg)

E8 gradient cHex-CH2Cl2-MeOH

E9 CHCl3-MeOH 5:5

E10 gradient CHCl3-MeOH

E11 gradient H2O-MeOH

E13 H2O-MeOH 5:5

E14 MeOH

E15 gradient CH2Cl2-EtOAc

C5 EtOAC-MeOH-H2O 100:16,5:13,5

CLMP SiE15

II- Extrait dichlorométhane

Cet extrait verdâtre a subit dans un premier temps une chromatographie sous vide

afin d’obtenir deux fractions enrichies A et B. Une chromatographie d’exclusion diffusion sur

Sephadex© LH-20 de la fraction A conduit à deux fractions importantes Aa et Ab. La fraction

Aa riche en chlorophylle est passée sur charbon avant d’être chromatographiée sur une

colonne de silice. La fraction Ab est chromatographiée sur un support inverse pour conduire à

deux composés. La fraction B, plus polaire subit différentes chromatographies classiques.

Ainsi, de l’extrait dichlorométhane sont isolés 3 composés, un hydrocarbure (AG-1), un

ester phénolique (Ac Ph-2) et un flavonoïde (Flav-7).

Figure 20 : Isolement des composés de l’extrait dichlorométhane

86

Extrait acétate d’éthyleExtrait acétate d’éthyle

A B

CO Sephadex LH20E14

CLMP siliceE17

CLMP C18E11

10 g

C

CLMP C18E18

CLMP C18E11

Aa

CO Sephadex LH20E9

Ba Bb Bc Ca

CMMP SiC5

CMMP SiC5

CMMP SiC5

Visiprep C18E11

Caa

Flav-1(36mg)Flav-1(36mg)



Flav-3Flav-3Flav-4(30mg)Flav-4(30mg)

Flav-3Flav-3Flav-4(8mg)

Flav-4(8mg)

Ac Ph-1(30mg)

Ac Ph-1(30mg)

Ac Ph-1(50mg)

Ac Ph-1(50mg)

E9 CHCl3-MeOH 5:5


E14 MeOH

E17 gradient EtOAc-MeOHE18 gradient H2O-MeOH-CHCl3

C5 EtOAC-MeOH-H2O 100:16,5:13,5

III- Extrait à l’acétate d’éthyle

10 g de cet extrait brunâtre sont chromatographiés sur une colonne de silice sous

moyenne pression, et permettent d’obtenir un composé et 3 fractions majoritaires A, B et C.

Ces fractions subissent ensuite des chromatographies classiques en phase inverse et des CCM

préparatives afin de purifier 5 composés, un acide phénol (Ac Ph-1) et 4 flavonoïdes (Flav-

1 à Flav-4).

Figure 21 : Isolement des composés de l’extrait acétate d’éthyle

87

Extrait butanolExtrait butanol

A B

CO Sephadex LH20E14

VLC siliceE20

2 g

CLMP C18E11

Aa Ba

Baa

Flav-4(6mg)

Flav-4(6mg)

CLMP C18E21

CO Sephadex LH20E14


Flav-6(6mg)

Flav-6(6mg)

Flav-5(3mg)

Flav-5(3mg)

Flav-6(3mg)

Flav-6(3mg)


E14 MeOH

E20 gradient CH2Cl2-MeOH

E21 H2O

CLMP C18E11

IV- Extrait butanolique

Une chromatographie sous vide sur 2 g de cet extrait butanolique conduit à deux

fractions A et B. Celles-ci sont alors chromatographiées sur un gel de Sephadex LH20 et si la

purification n’est pas suffisante, elle est poursuivie par une CLMP en C18. Nous purifions

ainsi 3 flavonoïdes (Flav-4 à Flav-6).

Figure 22 : Isolement des composés de l’extrait butanolique

88

Extrait aqueuxExtrait aqueux

A

CO Sephadex LH20E14

VLC siliceE22

4 g

Aa

Flav-5(6mg)

Flav-5(6mg) CLMP C18

E11

Flav-5Flav-5 Flav-2Flav-2



E14 MeOH

E22 CH2Cl2-MeO-H2O

V- Extrait aqueux

4 g de cet extrait après une chromatographique rapide sous vide, conduit à

l’obtention d’un composé pur et d’une fraction A qui après une CLMP C-18 conduit à une

autre fraction Aa et à deux composés purs. La fraction Aa est alors purifiée sur Sephadex

LH20 pour obtenir un dernier composé. De cet extrait aqueux nous obtenons 3 composés

appartenant à la classe des flavonoïdes (Flav-2, 5 et 6).

Figure 23 : Isolement des composés de l’extrait aqueux

89

Chapitre III - Etude Phytochimique - Analyse Structurale

A- Etude des composés volatils

I- Analyse

L’analyse de la composition de ces distillats est réalisée par chromatographie en

phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG/SM).

La méthodologie ainsi que les caractéristiques de l’appareil sont décrites en annexe :

Matériels et Méthodes p 176.

Figure 24 : Profil chromatographique des composés volatils de bois (a).

90

(a)

Ac.

myr

istiq

ue

Ac.

Lau

riqu

e

Ac.

non

anoï

que

Ac.

cap

riqu

e

Figure 24 (suite) : Profil chromatographique des composés volatils des feuilles (b).

Au total, 69 composés volatils sont recensés. Ils ont été identifiés par leur indice de

rétention [Jenings 1980, Kondjoyan 1996, Davies 1990], leur spectre de masse [Jennings

1980, McLafferty 1989, Stenhagen 1974, Banque informatisée de l’INRA 1997], et après

comparaison avec les données de la littérature [Kim Ha 1989].

On peut remarquer que, pour chaque échantillon, l’huile volatile est un mélange

complexe de plusieurs composés. La classe la plus représentée est celle des hydrocarbures et

de leurs dérivés (51,5% et 39,2% respectivement pour le bois et les feuilles). On retrouve

beaucoup d’acides gras et d’esters (37,3% et 28,7% au total) avec notamment les acides

nonanoïque, caprique, laurique, myristique et pentadécanoïque. Nous avons aussi, dans cette

classe, des alcanes, des alcools, des aldéhydes et des composés cétoniques.

Les autres classes sont celles des terpénoïdes (17,6% et 46,7% comprenant mono-, di-

et sesquiterpénoïdes), des phénylpropanoïdes rencontrés uniquement dans le bois et des

composés divers (9,1% et 0,7%).

91

(b)N

apht

alèn

e

Ane

thol

e

Aci

de n

onan

oïqu

e

Aci

de c

apri

que

géra

nyla

céto

ne

Aci

de la

uriq

ue

Aci

de m

yris

tique

Hex

ahyd

rofa

rnés

ylac

éton

ee

Tableau 17 : Composés volatils de bois et de feuilles de L. guineensis

Composés Indice deRétention

Bois% rel.

Feuilles% rel.

Dérivés d’hydrocarburesa) alcanes, alcools

Undécanol* 1381 - 2,4Tétradécanol* 1677 - 0,4Heptadécane 1700 - 0,2

0,0 3,0b) aldéhydes

Heptanal 882 0,2 -n-octanal 989 0,2 0,2(E)-2-octènal 1042 0,5 -Nonanal 1089 1,2 1,3(E)-2-nonènal 1146 - 0,3Décanal 1188 1,4 0,8(E, E)-2,4-nonadiènal 1193 - 0,8(E)-2-décènal 1249 - 0,5(E, Z)-2,4-décadiènal 1274 0,4 -(E, E)-2,4-décadiènal 1294 10,3 0,4(E)-2-undécènal 1345 - 0,9Pentadécanal 1698 - 0,3

14,2 5,5c) cétones

(E)-3-nonèn-2-one 1122 - 0,2Undécan-2-one 1288 - 0,2Dodécan-2-one 1389 - 0,9Pentadécan-2-one 1683 - 0,3Heptadécan-2-one 1887 - 0,4

0,0 2,0d) acides gras et esters

Acide caproïque (hexanoïque) 1008 1,6 -Acide heptanoïque 1091 0,4 -Caprilate de méthyle 1175 0,3 -Acide caprilique (octanoïque) 1183 1,9 -Acide nonanoïque 1278 4,3 3,8Acide (E)-non-2-ènoïque 1321 0,8 -Acide caprique (décanoïque) 1371 5,3 2,7Acide undécanoïque 1469 1,0 1,0Laurate de méthyle 1508 - 0,5Acide laurique (dodécanoïque) 1566 3,3 7,4Acide tridécanoïque 1668 - 1,0Acide myristique (tétradécanoïque) 1765 10,0 7,3Acide pentadécanoïque 1866 5,1 2,1Palmitate de méthyle 1908 0,9 2,4Acide (Z)-hexadéc-9-ènoïque 1939 2,4 -Acide palmitique 1965 - 0,5

37,3 28,7Terpènoïdes

6-méthyl-hept-5-èn-2-one 973 0,3 0,21,8-cinéole 1024 0,2 -(Z)-linalyloxide 1066 0,4 -(E)-linalyloxide 1079 0,6 0,36-méthyl-3,5-heptadièn-2-one* 1085 0,3 -Linalol 1094 2,9 0,8-terpinéol 1181 1,8 0,3-cyclocitral 1197 - 0,3Vitispirane 1270 - 1,2

92

-ionone 1408 0,7 4,2Géranylacétone 1433 2,3 3,4(E)--ionone 1466 0,3 2,3Dihydroactinidiolide 1490 - 0,5(E, E)-pseudoionone 1563 - 0,34-oxo--ionone 1635 - 0,7Cadalène 1662 - 1,2Hexahydrofarnésylacétone 1836 5,4 28,26,10,14-triméthylpentadéc-3-èn-2-one*

1877 - 1,5

Farnésylacétone* 1895 0,4 0,5Isophytol 1943 2,0 0,3(E)-phytol 1950 - 0,5

17,6 46,7Phénylpropanoïdes

Estragole 1181 1,8 -Anisaldéhyde 1221 1,0 -(E)-cinnamaldéhyde 1239 2,1 -(E)-anéthole 1267 3,5 -Anisylacétone 1350 0,2 -

8,6 0,0Composés divers

Naphthalène 1165 4,8 -Salicylate de méthyle 1174 0,4 --heptalactone 1324 0,5 -Triméthyldihydronaphthalène* 1338 - 0,3Dibenzofurane 1490 0,2 -Benzoate de benzyle 1730 - 0,4Muskolactone 1846 3,2 -

9,1 0,7

total 86,8 86,669 composés 43 47

* isomères non déterminés

Figure 25 : Répartition des différentes classes de constituants des distillats

Ainsi, nous pouvons constater que l’huile volatile du bois diffère significativement de

celle des feuilles. La composition respecte bien les données de la littérature en ce qui

concerne les taux de terpénoïdes et de phénylpropanoïdes en fonction de la partie végétale

étudiée [Engel 1998]. On observe une quantité appréciable de phénylpropanoïdes (8,6%) dans

l’huile volatile de bois, parmi lesquels figurent l’estragole (1,8%), l’anisaldéhyde (1,0%), le

93

cinnamaldéhyde (2,1%), l’E-anéthole (3,5%) et l’anisylacétone (0,2%). Ceux-ci sont absents

dans le distillat de feuilles.

Par contre, le distillat de feuilles est bien plus riche en terpénoïdes (46,7% contre

17,6%). On note un fort taux d’hexahydrofarnésylacétone (28,2%), et la présence de deux

composés à 13 carbones, qui sont des composés rares d’huiles essentielles, le

triméthyldihydronaphthalène (0,3%) et le vitispirane (1,2%).

Ce dernier est un composé important de l’arôme de vanille [Schulte-Elte 1978]. Il a

aussi été identifié dans les composés volatils du jus de raisin, de vin de table et de spiritueux

de vin [Simpson 1977,Tattje 1979].

Pour les calculs, l’analyse est classiquement arrêtée à l’acide palmitique. Cependant,

nous avons pu, après celui-ci, identifier (Rt, SM ) 4 acides gras. Ce sont : l’acide margarique

(C-17), l’acide stéarique (C-18), l’acide oléique (C-18:1) et l’adipate de dioctyle.

II- Discussion

L’analyse des composés volatils de L. guineensis (Leeaceae) a été réalisée car une HE

a été décrite dans une autre espèce de Leea, L. hirta Roxb. La composition de celle-ci n’est

pas connue, par contre, elle aurait une activité tuberculostatique [Gupta 1953].

L’analyse des distillats de feuilles et de bois permet l’identification d’un grand

nombre de composés qui n’ont jamais été décrits dans cette plante, ni même dans la famille.

On remarque toutefois que les acides gras sont les composés majoritaires du bois,

contrairement aux feuilles, où la fraction en terpénoïdes est la plus importante même si on

retrouve aussi en grande quantité ces acides gras.

Par ailleurs, l’identification du vitispirane est un élément important. Ce composé rare,

présent dans les distillats de vin (Vitis vinifera (Vitaceae)) montre une fois de plus la

proximité des deux familles Leeaceae et Vitaceae.

94

-terpinéol vitispirane

linalol -ionone

Hexahydrofarnésylacétone E-anéthole

Figure 26 : Quelques exemples de spectres SM obtenus

95

estragol isophytol

Géranylacétone E-cinnamaldéhyde

Anisaldéhyde

Figure 26 (suite) : Quelques exemples de spectres SM obtenus

96

B- Etude des Terpénoïdes

I- Identification de Terp-1

Ce composé purifié de l’extrait hexanique se présente sous la forme d’une huile

opalescente (20 mg). Sa faible polarité sur CCM et sa coloration violette, après révélation à

l’acide sulfurique et chauffage, laissent penser qu’il s’agit d’un terpénoïde.

Le spectre de masse en DCI indique l’adduit à m/z 314 [M+NH4]+ et l’ion pseudo-

moléculaire à m/z 297 [M+H]+ correspondant à la formule brute C20H40O. Cette formule

indique la présence d’une insaturation ou d’un cycle, DIC de 1 [McLafferty 1980].

Nous observons différents pics identifiables tels que les pics à m/z 296 [M+NH4-H2O]+ et m/z

279 [M-H2O+H]+ qui correspond à la perte d’un hydroxyle par -clivage. Plusieurs pics sont

caractéristiques d’un squelette de type phytol : m/z 81 (C6H9+), 83 (C6H11

+), 97 (C7H13+) et 123

(C9H15+) [Rasool 1991].

Par ailleurs, nous avons un pic m/z 85 (C5H9O+) qui résulte d’un clivage alpha d’un alcène.

L’allure générale du spectre RMN 1H ci-dessous, suggère que le composé est de nature

terpénique.

Figure 27 : Spectre 1H de Terp-1 (200 MHz, CDCl3)

Nous observons à 5,39 (tq, J = 6,9 et 1,2 Hz, 1H), le proton éthylénique H-2

(Tableau 18 p 82). Ce déplacement chimique indique une double liaison trisubstituée. On

97

H-2

H-1

H-4

H-16Me-15Me-7Me-11

H-15

Me-3

note un couplage trans-allylique de 1,2 Hz avec le méthyle déblindé en 3 à 1,65 ppm (sl, 3H)

et un couplage vicinal avec H-1 à 4,13 ppm (d, J = 6,9 Hz, 2H) dont le carbone est hydroxylé.

Ces couplages sont confirmés par le spectre COSY. La troisième substitution est un CH2

déblindé à 1,97 ppm (H-4, t, J = 7,4 Hz) qui couple lui-même avec un RCH2.

Nous pouvons donc dessiner le motif suivant :

On devine vers 1,53 ppm un heptuplet (J = 6,4 Hz, 1H) relatif au proton H-15, qui couple

avec 2 méthyles H-16 et Me-15. Parallèlement, ces deux méthyles résonnent sous forme de

doublets caractéristiques à 0,85 ppm (d, J = 6,5 Hz, 6H).

Les méthyles en 7 et en 11 résonnent quant à eux à 0,83 ppm (d, J = 6,3 et 6,2 Hz, 6H).

En outre, la zone à 1,5-1,0 ppm correspond à 20 protons.

Sur le spectre RMN 13C, de nombreux carbones ont le même déplacement chimique.

Nous confirmons la présence d’une double liaison par les carbones à 140,3 ppm (C-3), 123,1

ppm (C-2) et par le carbone déblindé à 39,9 ppm (C-4) qui est en alpha de celle-ci.

La configuration E de la double liaison est confirmée par les valeurs spectrales et la

comparaison faite avec le géraniol (E) et le nérol (Z) [Breitmeier 1990]. Notons que le

méthyle en position 3 est significativement moins déblindé dans l’isomère E, alors que le

carbone 4 est au contraire plus déblindé.

OH

Géraniol

OH

Nérol

Carbones Terp-1 Géraniol(E)

Nérol(Z)

C-1 59,5 59,3 58,9C-4 39,9 39,6 32,0

Me-3 16,2 16,2 17,6

Nous observons aussi, un carbone hydroxylé (56,5 ppm), 3 groupes de méthyles à

22,7, 19,8 et 16,2 ppm correspondant aux méthyles C-16 et Me-15, Me-7 et Me-11, et Me-3

respectivement.

98

Tableau 18 : données RMN de Terp-1 (200/50 MHz, CDCl3) :

Position 13C 1H (ppm), mult, J (Hz)

1 59,5 4,13 (d, 6,9, 2H)2 123,1 5,39 (tq, 6,9, 1,2, 1H)3 140,34 39,9 1,97 (tl, 7,4, 2H)5 25,26 36,77, 11 32,88, 10, 12 37,49 24,513 24,814 39,415 28,0 1,53 (hept, 6,4, 1H)16, Me-15 22,7 0,85 (d, 6,5, 6H)Me-3 16,2 1,65 (sl, 3H)Me-7, Me-11 19,8 0,83 (d, 6,3, 6H)

Toutes ces données comparées à celles de la littérature [Rasool 1991, Hasan 1991] permettent

d’identifier Terp-1 au E-Phytol :

OH

1

3

711

15

Rappelons par ailleurs, qu’il a été caractérisé dans le distillat des feuilles avec son

homologue l’isophytol.

Il a été isolé pour la première fois en 1907 par Willstätter [Merck Index]. C’est un

diterpène acyclique largement répandu dans le règne végétal qui provient de la décomposition

de la chlorophylle. Il sert à la préparation des vitamines E et K1 [Harborne 1999]. Il est

cependant recensé pour la première fois chez les Leeaceae.

99

II- Identification de Terp-2

Issue de l’extrait hexanique, cette huile incolore, réagit sur CCM comme un dérivé

terpénique (25mg).

Le spectre de masse en mode DCI révèle 2 pics caractéristiques à m/z 411 [M+H]+ et

m/z 428 [M+NH4]+ qui conduisent à une formule brute de C30H50 (6 insaturations ou cycles).

De plus, par clivage alpha-allylique, on identifie différents fragments caractéristiques de la

perte du même motif en C5, à m/z 342 [M-C5H9+H]+, m/z 274 [M-C10H17+H]+, m/z 206 [M-

C15H25+H]+, m/z 138 [M-C20H33+H]+, m/z 70 [M-C25H41+H]+. Ce type de fragmentation est

rencontré dans des structures de type squalène.

Figure 28 : Fragmentation du squalène

L’allure générale du spectre RMN 1H présente 3 régions distinctes (Figure 29, Tableau

19 p 86) :


100

- une zone de protons éthyléniques à 5,10 ppm (m) qui intègre pour 6H,

- une zone des CH2 à 2,10-1,90 (m) qui intègre pour 20H,

- enfin, une zone pour les méthyles avec, à 1,66 ppm, un singulet large qui correspond aux

méthyles trans en bout de chaîne C-1, C-24, intégrant pour 6H, et à 1,58 ppm un singulet qui

intègre pour 18H correspondant aux méthyles Me-2, -6, -10, -15, -19 et -23.

Sur le spectre 13C (J modulé), on observe 12 signaux qui laissent penser que les motifs

en C5 intramoléculaires sont équivalents (Figure 30, Tableau 19 p 86).

Figure 30 : Spectre 13C J modulé de Terp-2 (50 MHz, CDCl3)

On distingue :

-trois carbones quaternaires oléfiniques à 135,1, 134,9 et 131,2 ppm

correspondant à C-6, C-10 et C-2 respectivement,

-deux signaux éthyléniques dont un à 124,4 ppm attribuable à C-3 et un à

124,3 ppm relatif à C-7 et C-11,

-quatre CH2 à 39,7 ppm (C-5 et C-9), 28,3 ppm (C-12), 26,8 ppm (C-4) et 26,7

ppm (C-8),

-trois signaux caractéristiques de carbones méthyliques : le premier à 25,7 ppm

correspond aux méthyles trans (C-1 et C-24) en bout de chaîne qui sont les plus déblindés, le

second à 17,7 ppm est attribuable au Me-2 et enfin celui à 16,0 ppm aux Me-6 et Me-10.

101

C-6, C-19C-10, C-15

C-2C-23

C-3, C-22C-7, C-11, C-14, C-18

C-5, C-9,C-16, C-20

C-4, C-21C-8, C-17

C-1C-24

Me-2Me-23

Me-6Me-10Me-15Me-19

C-12C-13

L’expérience XHCORR permet d’attribuer à partir des protons éthyléniques les

carbones correspondant, et montre également l’existence de deux groupes de méthyles. Le

premier correspondant à C-1 et C-24, le second aux méthyles en -2, -6, -10, -15, -19 et -23.

Figure 31 : XHCORR de Terp-2 (CDCl3)

Avec l’expérience COSY45, on ne peut pas attribuer de manière précise les

corrélations observées du fait de la superposition des signaux. Cependant, des corrélations

existent entre des protons éthyléniques et des CH2. On remarque également un couplage

trans-allylique entre le méthyle en 1 et le proton éthylénique H-3 (4JH1-H3). Comme pour Terp-

1, cela confirme la présence de fragments en C5, et l’enchaînement suivant :

102

C-1C-24

C-2C-23

C-6C-10C-15C-19

1.5 ppm

2.0 ppm

Tableau 19 : Données RMN de Terp-2 (200/50 MHz, CDCl3) :

Position 13C 1H1, 24 25,7 CH3 1,66 (s, 6H)2, 23 131,2 C3, 22 124,4 CH 5,10 (m)4, 21 26,8 CH2 2,0-2,1 (nd)5, 9, 16, 20 39,7 CH2 1,9-2,0 (nd)6, 19 135,1 C7, 11, 14, 18 124,3 CH 5,10 (m)8, 17 26,7 CH2 2,0-2,1 (nd)10, 15 134,9 C12, 13 28,3 CH2 1,95-2,05 (nd)Me-2, 23 17,7 CH3 1,58 (s, 18H)

Me-6, 10, 15, 19 16,0 CH3

Les différents éléments apportés par la RMN confirment les résultats de la

spectrométrie de masse et permettent d’identifier Terp-2 au squalène qui de par son origine

biosynthétique est la répétition d’un même motif isoprénoïde (6 unités). Ces données sont en

accord avec la littérature [Breitmeier 1990] :

2

6 10

15

19 23

C’est un produit cité pour la première fois dans le genre et l’espèce, alors qu’il est

présent dans tout le règne végétal. Il est le précurseur de tous les triterpènes via son

époxydation, sa cyclisation et son réarrangement [Bruneton 1993]. Isolé en 1926 par

Heilbron, il est utilisé dans la synthèse d’un grand nombre de composés pharmaceutiques

[Merck Index]. Notons que le squalène est présent dans l’huile d’olive à 0,1-0,7% [Harborne

1999].

103

III- Identification de Terp-3

Il est isolé sous forme d’aiguilles blanches (10 mg) dans la phase hexanique. Sa

coloration rose puis violette après acide sur CCM laisse penser qu’il s’agit d’un triterpénoïde.

Le spectre de masse en DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 427 [M+H]+

caractéristique de la formule brute C30H50O (6 insaturations ou cycles). Le pic m/z 444

[M+NH4]+ est l’adduit. La présence d’un hydroxyle est signalée par l’observation du pic dû à

la perte d’un hydroxyle par -clivage m/z 409 [M-H2O+H]+. Puis nous constatons la perte

d’un méthyle grâce au pic à m/z 394 [M-H2O-Me+H]+.

Figure 32 : Spectre DCI de Terp-3

Par ailleurs, le spectre montre les fragments classiques des squelettes du type lupane

[Shiojima 1992] (Figure 33). Ainsi, le fragment « a » (m/z 207), par perte de l’hydroxyle

conduit au fragment m/z 190 [a-OH+H]+ et le fragment « g » (m/z 218) perd à son tour un

méthyle et donne le fragment « g-15 » à m/z 203. Nous rencontrons aussi la coupure au

niveau du cycle D qui conduit à un fragment à m/z 136 qui perd un proton pour donner un

fragment à m/z 135 qui perd lui-même un méthyle pour donner le fragment à m/z 121.

104

[M+H]+

[M-H2O+H]+

g

[a-OH+H]+

Figure 33 : Fragmentations classiques d’un squelette de type lupane

Le spectre RMN 1H rappelle bien un squelette de nature triterpénique avec la

particularité de présenter deux protons d’une double liaison disubstituée qui résonnent à 4,67

ppm (H-29a, dl, J = 2,5 Hz, 1H) et 4,55 ppm (H-29b, dd, J = 2,5 et 1,2 Hz, 1H). Notons que

l’expérience COSY révèle un couplage trans-allylique entre le signal à 4,55 ppm et un

méthyle à 1,66 ppm.

Nous observons un proton en alpha d’un hydroxyle à 3,18 (H-3, dm, 10 Hz, 1H), un proton

très déblindé à 2,34 (1H, m, H-19) et 7 méthyles dont un à 1,66 (Me-30, sl, 3H) déblindé

du fait de la double liaison. Ils sont attribués grâce aux données de la littérature [Reynolds

1986].

Le spectre 13C (J modulé) confirme le squelette triterpénique avec 30 carbones

correspondant à la série des lupanes avec deux carbones éthyléniques caractéristiques à 151,0

ppm (C-20, C) et à 109,3 ppm (C-29, CH), un carbone hydroxylé à 79,0 ppm (C-3 CHOH),

27 signaux entre 14 et 56 ppm correspondant à 6 C, 5 CH, 9 CH2 et 7 CH3 (Tableau 22 p

102).

Ces données spectrales sont comparables avec celles de la littérature [Mahato 1994], et

confirment ainsi les données 1H et SM. Ces résultats nous permettent d’identifier Terp-3 au

lupéol :

105

C’est un produit nouvellement cité dans le genre qui est très répandu dans le monde végétal.

Il a été isolé la première fois par Cohen en 1909 [Merck Index].

IV- Identification de Terp-4

Ce sont des aiguilles blanches (20 mg) isolées de l’extrait hexanique, qui sur CCM

présente toutes les caractéristiques d’un triterpène.

Le spectre DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 427 [M+H]+, qui correspond à

une formule brute de C30H50O (6 insaturations ou cycles). Le fragment à m/z 409 [M-H2O+H]+ indique la perte d’un hydroxyle par -clivage. De même, nous rencontrons la perte d’un

méthyle à m/z 412 [M-CH3+H]+.

De plus, nous observons les clivages classiques de triterpènes, caractéristiques d’une structure

oléanène [Shiojima 1992] (Figure 34). Il y a cassure de la liaison C-8-C-14. Le C-14 voisin

de la double liaison est alors chargé positivement. Puis il y a clivage allylique entre C-9-C-11.

Cela conduit aux fragments « g’ » à m/z 218 et « a » à m/z 207. La double liaison semble se

trouver en C-12-C-13 du fait de l’important fragment « g’ ».

Figure 34 : Fragmentations classiques du squelette oléanène

Ce fragment « g’ » perd un groupe méthyle par migration d’un proton et conduit au fragment

« g’-15 » à m/z 203, puis la migration d’un proton entraîne la perte de C-11 d’où le fragment

« g’-29 » à m/z 189. Ce fragment est aussi dû à la perte d’un hydroxyle du fragment « a »

d’où ce même fragment « a-18 » à m/z 189.

106

Le spectre RMN 1H suggère également une structure oléanène hydroxylée.


En effet, le proton éthylénique à 5,17 ppm (H-12, t, J = 3,6 Hz, 1H) est très

caractéristique ainsi que le proton porté par un carbone hydroxylé à 3,21 ppm (H-3, dd, J =

5,4 et 9,9 Hz, 1H). La présence de 7 signaux de méthyles angulaires est caractérisée par des

singulets entre 1,15 et 0,75 ppm (Tableau ci-dessous).

Tableau 20 : Données RMN 1H des méthyles de Terp-4 (200 MHz, CDCl3)

Protons ppm (M, I)Me-23 0,92 (s, 3H)Me-24 0,78 (s, 3H)Me-25 0,95 (s, 3H)Me-26 0,98 (s, 3H)Me-27 1,12 (s, 3H)Me-28 0,82 (s, 3H)Me-29Me-30

0,85 (s, 6H)

Le spectre 13C montre 30 carbones répartis dans des zones caractéristiques (Tableau p

102). Notamment nous avons à 145,2 ppm (C-13, C) et 121,7 ppm (C-12, CH) les

déplacements chimiques des carbones éthyléniques qui correspondent à une structure de type

oléan-12-ène, dont le carbone à 79,0 ppm (C-3, CHOH) est -hydroxylé [Mahato 1994].

107

H-12

H-3

Me-27

Me-26Me-25Me-23

Me-29, Me-30Me-28Me-24

Tableau 21 : Différences essentielles entre le noyau oléan-12-ène et urs-12-ène

Carbones Oléan-12-ène Urs-12-ène3 78,8 78,83 76,4 76,012 121,8 124,313 145,1 139,3

Toutes ces données spectrales correspondent avec celles de la littérature et nous

permettent d’identifier Terp-4 comme étant la -amyrine :

Bien que très largement répandue, la -amyrine est citée pour la première fois dans le

genre. Il semble qu’elle ait été isolée pour la première fois en 1835 de Manila elemi

(Burseraceae) par Rose, et redécouverte par Tschirch en 1902 de Amyris elemi (Rutaceae)

[Radt 1940].

V- Identification de Terp-5

Ce composé se présente sous forme de cristaux en feuillets blancs (+1 g). Produit très

apolaire, il est isolé de l’extrait hexanique et présente sur CCM toutes les caractéristiques

d’un triterpéne.

Le spectre de masse en EI montre l’ion moléculaire à m/z 665 [M]+. Cette erreur de 1

uma est due à un problème de décalage en masse qui a été confirmé par le spectre effectué en

FAB mode négatif où l’on obtient bien le fragment m/z 663 pour [M-H]-. De même, le spectre

en DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 665 [M+H]+ et l’adduit à m/z 682 [M+NH4]+.

Ces données sont cohérentes pour une formule brute de C46H80O2 (7 insaturations ou cycles).

108

Figure 36 : Spectre EI de Terp-5

Nous observons la perte d’un méthyle grâce au fragment à m/z 650 [M-CH3+H]+. Le

fragment à m/z 409 indique la perte de 255 uma correspondant à une chaîne hydrocarbonée en

C16. De plus, nous observons les clivages classiques de la -amyrine rencontrés

précédemment, qui conduisent aux fragments « g’ » à m/z 218, « a » à m/z 207, « g’-15 » à

m/z 203, et enfin « a-18 » et « g’-29 » à m/z 189.

Notons que l’on observe bien la chaîne aliphatique avec les fragments à m/z 257 et

239 relatifs dans un premier temps à une chaîne palmitoyle qui perd un hydroxyle. De plus,

on distingue les premiers fragments dus aux clivages successifs des liaisons C-C du côté

Cterminal de C2H5+ à C10H41

+.

Figure 37 : Fragmentations de Terp-5

109

[M]+

[M-Palm]+

g’

a-18g’-29

Palm+

Sur le spectre RMN 1H, nous observons les signaux obtenus pour la -amyrine avec

entre autres :

- le proton éthylénique H-12 à 5,16 (t, J = 3,5 Hz),

- le proton en alpha d’un hydroxyle, H-3, à 4,49 (dd, J = 7,6 et 8,3 Hz), qui

est plus déblindé que dans la -amyrine. Ce déblindage est caractéristique

d’une estérification de l’hydroxyle géminal.


Par ailleurs, les déplacements chimiques des méthyles sont perturbés par cette chaîne.

Nous avons un méthyle à 1,11 (s, Me-27), 2 méthyles à 0,95 (sl, Me-25 et Me-24 ou Me-

26), 5 méthyles à 0,85 (sl, Me-23, Me-24 ou Me-26, Me-28 , Me-29 et Me-30), et enfin le

méthyle de fin de chaîne du palmitate à 0,81 ppm (Me-16’, s, 3H).

La présence de cette chaîne est très bien indiquée par le triplet caractéristique H-2’ en

de l’ester bien déblindé ( 2,27, t, J = 7,5 Hz, 2H) par rapport aux autres CH2 ( 1,1-2,0,

m).

En ce qui concerne le spectre 13C, seuls les carbones du cycle A de la -amyrine sont

perturbés par la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p 102). L’estérification est caractérisée par le

C-1’ à 173,5 ppm et le carbone C-3 qui est plus déblindé à 80,6 ppm que dans la -amyrine.

110

H-12 H-3

H-2’

Me-27

Me-16’

Figure 39 : Spectre 13C de Terp-5 (50 MHz, CDCl3)

L’expérience XHCORR a permis de confirmer l’attribution de certains carbones

comme par exemple C-2’ (JC2’-H2’). L’attribution des carbones quaternaires C-4, C-8, C-10, C-

13, C-14, C-17, C-20 et C-1’ est en accord avec l’acétate de -amyrine [Mahato 1994]. De

plus, ces données de la littérature ont permis également, grâce aux déplacements des carbones

méthyliques, d’attribuer les signaux correspondants sur le spectre 1H, CH3-27 à 1,1 ppm,

CH3-25, CH3-24 ou CH3-26 à 0,95 ppm, CH3-16’ à 0,81 ppm et les autres à 0,85 ppm.

Sur le spectre COSY 1H-1H, nous observons plusieurs systèmes de spins, H1-H2-H3,

H5-H6-H7, H9-H11-H12, H15-H16, H18-H19, H21-H22. Ces corrélations confirment la

structure de l’amyrine. Nous voyons aussi les premières corrélations (H2’-H3’-H4’-...) qui

appartiennent au grand système de spin que constitue le reste palmitoyle.

Figure 40 : Corrélations COSY de Terp-5

111

C-1’

C-13

C-12 C-3 C-5

C-16’

L’hydrolyse alcaline de Terp-5 a conduit à l’obtention de la -amyrine et de l’acide

palmitique (Annexe p 186) isolés et caractérisés par CCM comparative avec des témoins et

les techniques spectrales RMN, SM.

A la lumière de toutes ces données et par comparaison avec la littérature [Subarnas

1992], nous identifions Terp-5 comme étant le palmitate de -amyrine.

Ce composé majoritaire de l’extrait hexanique est un produit nouveau dans le genre

bien qu’assez répandu dans le monde végétal. Il est aussi appelé balanophorine car il a été

isolé du Balanophora elongata (Balanophoraceae) par Ultée en 1926. C’est un composé que

l’on rencontre souvent dans les plantes à latex [Radt 1940].

VI- Identification de Terp-6

Ce composé très apolaire est isolé sous forme de poudre blanchâtre (10 mg) de

l’extrait hexanique. Son comportement CCM rappelle les caractéristiques des triterpénes

acylés.

Terp-6 présente un maximum d’absorption à 236 nm dans le CHCl3. Cette

absorbance est révélatrice d’un système diène conjugué [Tallent 1966].

L’ion pseudo-moléculaire à m/z 705 [M+H]+ et l’adduit à m/z 722 [M+NH4]+ sur le

spectre DCI conduisent à la formule brute C48H80O3 (9 insaturations ou cycles).

Nous rencontrons la perte d’un méthyle à m/z 690 [M-CH3+H]+ ainsi que probablement une

déshydratation suivie d’un réarrangement à m/z 685 relative à un produit hydroxylé. Comme

pour le palmitate de -amyrine, nous observons les fragments m/z 409, « g’ » à m/z 218, « a »

à m/z 207, « g’-15 » à m/z 203, et enfin « a-18 » et « g’-29 » à m/z 189 qui signent la présence

d’une génine de type oléanène [Shiojima 1992].

112

Figure 41 : Spectre DCI de Terp-6

Les fragments à m/z 409 et 425 de la génine indiquent bien la perte d’une chaîne en

C18. Cette chaîne est clivée au niveau de sa jonction avec la génine et conduit aux fragments à

m/z 295 (C18H31O3+) et 279 (C18H31O2

+) par coupure anté ou post-oxygène. L’-clivage au

niveau des doubles liaisons conduit à deux fragments m/z 167 pour la coupure du côté de la

génine et m/z 71 pour celle du côté C-terminale. Ce dernier fragment à m/z 71 (C5H11+)

implique une position Cterm de type CH3-(CH2)4-CHR’-R. De plus, on observe que les

premiers fragments provenant de clivages successifs des liaisons carbone-carbone du côté

Cterminal tels que C2H5+ à C5H11

+.

Figure 42 : Fragmentations de Terp-6

113

[M+H]+

[M+NH4]+

M-Cor+

g’

C18H31O3+

La démarche et l’analyse des spectres 1H et 13C sont identiques à celles du palmitate de

-amyrine Terp-5. En effet, le spectre 1H a la même allure générale avec, H-12 à 5,16 ppm

(t, J = 3,5 Hz, 1H), H-3 à 4,49 ppm (dd, J = 7,6 et 8,2 Hz, 1H) et H-2’ à 2,27 ppm (t, J = 7,3

Hz, 2H).

Cependant, des signaux supplémentaires sont observés. Ainsi, entre 6,5 ppm et 5,6

ppm quatre protons éthyléniques révèlent la présence d’un système diénique conjugué sur

cette chaîne latérale.


H-11’ est le plus déblindé à 6,47 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,2 et 3J11’-12’ = 15,1 Hz, 1H). Ce

couplage vicinal de 15 Hz est relatif à une configuration E [Stadler 1994].

H-10’ résonne à 5,95 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,1 et 3J10’-9’ = 11,4 Hz, 1H). Ce couplage vicinal de

11 Hz est relatif à une configuration Z [Stadler 1994].

H-12’ est à 5,65 ppm (dd, 3J11’-12’ = 15,2 et 3J12’-13’ = 8,2 Hz, 1H),

H-9’ est à 5,48 ppm (dd, 3J9’-10’ = 11,5 et 3J8’-9’ = 7,5 Hz, 1H).

Ces données 1H comparées au E, E coriolate de méthyle [Kann 1990] et au 9-hydroxy-

5(Z),7(E)-tridécadiènoate de méthyle [de Montarby 1988] suggèrent un diène conjugué de

configuration Z, E.

114

H-11’ H-10’ H-12’ H-9’ H-12 H-3 H-13’

H-2’

Figure 44 : Agrandissement du spectre 1H entre 4,0 et 6,7 ppm de Terp-6 (500 MHz, CDCl3)

(Rem : à 500 MHz, on aperçoit des signaux indiquant que Terp-6 est en mélange avec d’autres composés !)

Parallèlement à ces protons éthyléniques, nous observons un proton à 4,11 ppm (H-

13’, m, 1H) caractéristique d’un proton en alpha d’un hydroxyle. Le spectre COSY révèle un

couplage entre ce dernier proton et un des protons du diène conjugué à 5,65 (H-12’) et des

corrélations successives de H-8’ à H-14’, ce qui confirme l’enchaînement suivant :

Ce type de fragment est rencontré dans l’acide coriolique [Stadler 1994].

Le spectre COSY permet de mieux visualiser ces différents couplages ainsi que ceux

déjà observés pour les amyrines acylées.

115

H-11’ H-10’ H-12’ H-9’

H-12

H-3

H-11’

Figure 45 : Agrandissement de la COSY de Terp-6 (200 MHz, CDCl3)

En ce qui concerne le spectre 13C (J modulé), les déplacements chimiques sont

comparables à ceux du dérivé palmitoylé (Tableau 22 p 102). De plus, nous observons les

carbones éthyléniques du système conjugué de configuration Z, E, à 135,8, 133,0, 127,7, et

125,8 ppm ainsi que celui du carbone hydroxylé CHOH (C-13’) à 72,9 ppm. Par

comparaison, les déplacements chimiques des carbones éthyléniques du E, E coriolate de

méthyle résonnent à 135,9, 133,7, 130,9, 129,5 ppm [Kann 1990].


116

H-11’

H-10’

H-12’

H-9’

H-12

H-3

H-13’

C-13

C-1’

C-12 C-3

C-13’

C-12’

C-9’

C-5 C-9C-18

C-19

C-18’

H-11’ H-10’ H-12’ H-9’ H-12 H-3 H-13’ H-8 H-11 H-2a H-2b H-14’

Carbones Z, E#

Z, ETerp-6

E, E*

1H 1H 13C 1H 13C9’ 5,41 5,48 125,8 5,68 129,5°

10’ 6,02 5,95 127,7° 6,01 130,9°11’ 6,46 6,47 133,0° 6,17 133,7°12’ 5,69 5,65 135,8 5,57 135,9°13’ 4,16 4,11 72,9 4,11 72,9°

* [Kann 1990] 13-hydroxy-9(E),11(E)-octadecadiènoate de méthyle

# [de Montarby 1988] 9-hydroxy-5(Z),7(E)-tridécadiènoate de méthyle

° interchangeable

Les attributions de la -amyrine acylée comparées à Terp-5 ainsi que la présence

d’une chaîne de type acide coriolique [Stadler 1994, Kann 1990, de Montarby 1988] nous

permettent d’identifier Terp-6 au coriolate de -amyrine. Il est, à notre connaissance, isolé

pour la première fois du règne végétal :

VII- Identification de Terp-7

Isolé sous forme de cristaux blancs, ce composé est issu de l’extrait hexanique (6 mg).

Très apolaire sur CCM, il possède un Rf comparable à celui des triterpènes acylés comme

Terp-5 ou Terp-6.

Le spectre de masse en DCI indique l’ion pseudomoléculaire à m/z 665 [M+H]+ qui est

le même que Terp-5, d’où une formule brute de C46H80O2. On retrouve les mêmes fragments

d’un triterpène acylé comme Terp-5 dont le pic à m/z 409 [M-palm+H]+.

117

Le spectre proton ressemble aussi à celui de Terp-5 avec les signaux du proton

éthylénique H-12 à 5,11, du proton H-3 à 4,48 et le signal caractéristique de la chaîne en

alpha de l’ester avec le CH2 à 2,27.

La différence entre Terp-7 et Terp-5 se trouve dans le spectre 13C (Figure 47). En

effet, les carbones de la double liaison C-12 à 124,4 ppm et C-13 à 139,6 ppm sont

significatifs d’un noyau de type urs-12-ène (Tableau 21 p 91) [Mahato 1994]. Après

comparaison avec les données de la littérature, nous pouvons attribuer tous les carbones de la

génine, l’-amyrine estérifiée et quelques carbones de la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p

102).


Comparé avec les données de la littérature [Shankaranarayana 1980], Terp-7 est le

palmitate d’-amyrine. Ce composé est nouvellement recensé chez les Leea. Le palmitate

d’-amyrine et de -amyrine sont souvent rencontrés chez les plantes à latex [Radt 1940].

118

C-13

C-12C-3

C-1’

Tableau 22 : Récapitulatif des données 13C des triterpènes et de leurs esters (50 MHz, CDCl3)

Carbones

en ppm

Lupéol -amyrine Palmitatede

-amyrine

Coriolatede

-amyrine

Palmitated’

-amyrine1 38,7 38,6 38,3 38,3 38,52 27,5 27,3 23,5 23,5 23,73 79,0 79,0 80,6 80,6 80,64 38,8 38,8 37,7 37,8 37,85 55,4 55,2 55,3 55,3 55,36 18,4 18,4 18,3 18,3 18,37 34,3 32,7 32,6 32,6 32,98 40,8 39,8 39,8 39,8 40,19 50,5 47,7 47,6 47,6 47,7

10 37,2 37,0 36,9 36,9 36,811 21,0 23,6 23,6 23,6 23,412 25,2 121,7 121,7 121,7 124,413 38,1 145,2 145,2 145,2 139,814 42,8 41,7 41,7 41,7 42,115 27,5 26,2 26,2 26,2 29,316 35,6 27,0 26,9 27,0 26,617 43,0 32,5 32,5 32,5 33,818 48,4 47,3 47,3 47,3 59,119 47,8 46,9 46,8 46,8 39,620 151,0 31,1 31,1 31,1 39,621 29,7 34,8 34,8 34,8 31,322 40,0 37,2 37,2 37,3 41,623 28,0 28,1 28,1 28,1 28,724 15,4 15,6 16,8 16,8 16,825 16,1 15,6 15,5 15,5 15,726 16,0 16,8 16,8 16,8 16,827 14,5 26,0 25,9 26,0 23,328 18,0 28,4 28,4 28,4 28,129 109,3 33,3 33,3 33,3 17,530 19,4 23,7 23,7 23,7 21,41’ 173,5 173,6 173,62’ 34,8 34,8 34,93’ 25,2 25,3 25,24’ 29,7 29,75’6’7’8’9’ 125,810’ 127,7*11’ 133,0*12’ 135,813’ 29,6 72,9 29,214’ 31,9 31,915’ 22,7 22,716’ 14,1 14,117’ 22,618’ 14,0

* interchangeable

119

C- Etude des Flavonoïdes

I- Identification de Flav-1

Composé isolé sous forme de laque jaune (36 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle. Sur

CCM, l’apparence du spot présente toutes les caractéristiques d’un flavonol. En effet, ce

composé est très jaune sous UV à 366 nm, révélateur d’un 3-OH libre [Mabry 1970].

Cela est confirmé par le spectre UV qui indique une absorbance à max 365 nm pour la

bande I dans le MeOH (Tableau 28 p 124). De plus, le déplacement bathochromique de la

bande II de 9 nm après l’ajout de NaOAc apporte la preuve d’un hydroxyle libre en 7.

L’hydroxyle libre en 4’ est suggéré par le déplacement bathochromique de la bande I de 50

nm qui se décompose rapidement suite au système 3,4’-dihydroxylé [Mabry 1970].

L’ion pseudo-moléculaire à m/z 285 [M-H]- sur le spectre de masse en FAB mode

négatif indique une formule brute de C15H10O6 (11 insaturations ou cycles).

Le spectre 1H correspond à deux noyaux aromatiques différents (Tableau 26 p 123).

Le cycle A avec deux protons aromatiques respectivement à 6,18 ppm (H-6, d, J = 1,9, 1H) et

6,43 (H-8, d, J = 2,0, 1H) ppm. La faible constante de couplage est due à un couplage meta

entre ces deux protons. Quant au cycle B, on remarque deux signaux intégrant chacun pour

deux protons identiques à 8,03 ppm (H-2’ et H-6’, dd, J = 8,9 et 2,6 Hz, 2H) et à 6,91 ppm

(H-3’ et H-5’, dd, J = 8,9 et 2,7 Hz). La grande constante est un couplage ortho alors que la

petite correspond à une constante meta. Au-delà de 9 ppm, on observe les protons des

hydroxyles. La liaison hydrogène de OH-5 avec la cétone en 4 entraîne un fort déblindage

caractéristique localiser à 12,46 ppm.

120

Figure 48 : Spectre 1H de Flav-1 (200 MHz, DMSO-d6)

Le spectre 13C montre 13 carbones. Ceci est dû à la symétrie du cycle B. Ainsi C-2’ et

C-6’ sont à 129,4 ppm et C-3’ et C-5’ à 115,4 ppm. Les autres CH aromatiques résonnent à

98,1 ppm (C-6) et 93,4 ppm (C-8). Les carbones phénoliques, quaternaires résonnent entre

135 et 165 ppm, la fonction cétonique est à 175,9 ppm (C-4) (Tableau 27 p 123). Ces données

sont en accord avec la littérature [Harborne 1982].

Ainsi, nous pouvons identifier Flav-1 comme étant le kaempferol :

Flavonoïde très courant, isolé la première fois de Delphinium consolida

(Renonculaceae) en 1902, il est déjà connu dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith 1959].

121

H-6

H-8

H-3’H-5’H-2’

H-6’

OH-5

OH-7

OHOH

II- Identification de Flav-2

Isolé sous forme de laque jaune (50 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle, son

comportement chromatographique révèle aussi une structure de type flavonol.

La bande I du spectre UV, à 369 nm, dans le MeOH indique un flavonol

polyhydroxylé. La décomposition rapide après addition de base est révélatrice d’un système

3,3’,4’-trihydroxylé. D’ailleurs, le retour de bande de 30 nm suite à l’ajout d’HCl dans AlCl3

indique bien le système ortho-dihydroxyl en 3’,4’ [Mabry 1970].

Le spectre de masse en FAB montre l’ion pseudo-moléculaire que ce soit en mode

positif à m/z 303 [M+H]+ ou en mode négatif à m/z 301 [M-H]-. Cela correspond à une

formule brute de C15H10O7 (11 insaturations ou cycles).

Cette structure est vérifiée avec les données du spectres RMN 1H où l’on observe 2

protons aromatiques H-6 ( 6,17, d, J = 1,6 Hz, 1H) couplant avec une constante meta à H-8

( 6,40, d, J = 1,7 Hz, 1H) sur le cycle A, ainsi que 3 protons aromatiques sur le cycle B, H-

2’ ( 7,66, d, J = 1,8 Hz, 1H) qui a un couplage meta avec H-6’ ( 7,53, dd, J = 8,4 et 2 Hz,

1H), lui-même ayant un couplage ortho avec H-5’ ( 6,87, d, J = 8,5 Hz, 1H) (Tableau 26 p

123).

122


Figure 50 : Spectre 13C de Flav-2 (50 MHz, DMSO-d6)

123

H-6

H-8H-5’

H-6’

H-2’

OH-5

OH-7 OH

OH

OH

C-4

C-7

C-5

C-9

C-4’C-3

C-2

C-3’

C-1’

C-6’C-5’

C-2’

C-10

C-6C-8

Tout comme Flav-1, le spectre 13C de Flav-2 est en accord avec la littérature

[Harborne 1982, Agrawal 1989], et confirme la structure quercétine.

Flavonol très commun, la quercétine est déjà connue dans le genre [Umadevi 1991,

Bates-Smith 1959].

III- Identification de Flav-3

Issu de l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme de laque jaune (20 mg), son

comportement chromatographique laisse supposer un flavonoïde glycosylé. La fluorescence

sous UV à 366 nm en violet sombre suggère une position 3 substituée [Mabry 1970].

Le spectre de masse en DCI indique l’ion pseudo-moléculaire à m/z 449 [M+H]+. Ce

pic, que l’on retrouve en FAB– à m/z 447 [M-H]– (ou FAB+ à m/z 449 [M+H]+) correspond à

un PM de 448, pour une formule brute de C21H20O11 (12 insaturations ou cycles). Après perte

d’un désoxyhexose, on obtient le fragment de la génine correspondante c’est-à-dire la

quercétine à m/z 303 [M-146+H]+. En DCI, on observe également le pic à m/z 146 relatif au

désoxyhexosyl et à son adduit à m/z 164 [M-H2O+NH4]+.

L’analyse des spectres UV conduit à un flavonol tétrahydroxylé (Tableau 28 p 124).

La bande I à MeOH = 347,5 nm confirme la fixation d’un glycosyl en position 3. Les

différences d’absorbance entre MeOH/NaOAc+H3BO3 et AlCl3/AlCl3+HCl certifient la

présence du système 3’,4’-dihydroxylé [Mabry 1970].

Sur le spectre 1H dans le DMSO-d6, on retrouve les données spectrales relatives à la

quercétine où l’on observe cependant que le proton H-2’ ( 7,29 ppm, d, J = 1,9 Hz, 1H) est

124

moins déblindé et se retrouve plus proche de H-6’ ( 7,24 ppm, dd, J = 8,4 et 2,2 Hz, 1H)

(Tableau 26 p 123).


Cette perturbation est due à la fixation en 3 d’un glycosyle et, comme attendu, nous

n’observons plus le proton de l’hydroxyle en 3. Cette unité osidique est confirmée par son

proton anomérique à 5,24 ppm (Rha-1, d, J = 1,1 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4 et 3

ppm et un méthyle doublet à 0,81 ppm (Rha-6, d, J = 5,5 Hz, 3H). Les différentes constantes

de couplage indiquent qu’il s’agit de l’-rhamnose (Tableau 26 p 123).

Le spectre 13C confirme, avec ses 21 carbones, le rhamnose et la présence de la

quercétine comme génine (Tableau 27 p 123). Les carbones C-2 et C-4 en alpha du C-3 sont

plus déblindés que pour la quercétine, alors que ce dernier est plus blindé, indiquent la

fixation en 3 du rhamnose sur une génine de type quercétine.

125

H-2’H-6’

H-5’

H-8H-6

Rha-1

Rha-2

Rha-4 Rha-5

Rha-6

Rha-3

OH-5

OH-7

OH

OH


Ces données spectrales sont en accord avec la littérature [Harborne 1982] et nous

permette d’identifier Flav-3 comme étant la quercitrine :

Ce composé est nouveau dans le genre bien que très répandu dans le règne végétal.

C’est le deuxième flavonol glycosylé isolé des Leea après son homologue la myricitrine ou 3-

O-rhamnosyl-myricétine [Yem Yok Siv 1971]

IV- Identification de Flav-4

Plus polaire que Flav-3, ce composé isolé des extraits à l’acétate d’éthyle, et

butanolique a été isolé sous forme de laque jaune (30 mg). Le spot de Flav-4 sur CCM a

126

C-4

C-7

C-5

C-2

C-9

C-4’

C-3’

C-3

C-6’ C-1’

C-2’C-5’

C-10

Rha-1

C-6

C-8 Rha-4

Rha-3

Rha-2

Rha-5

Rha-6

tendance à « traîner ». Il est aussi violet foncé sous UV à 366 nm, ce qui est significatif d’une

substitution en 3.

Le spectre de masse haute résolution enregistré avec la technique FAB– sur le pic

pseudo-moléculaire à m/z 527 [M-H]– a permis de déterminer la formule moléculaire comme

étant C21H20O14S. Le fragment à m/z 447 correspond à la perte d’un groupe sulfate alors que

le pic à m/z 300 indique les pertes d’un groupe sulfate et d’une unité desoxyhexosyl (Tableau

29 p 124). Il est bien établi qu’en technique FAB négative, nous observons ces

fragmentations typiques des flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a].

Figure 53 : Spectre FAB- de Flav-4

L’analyse des spectres UV de ce flavonoïde conduit à un flavonol substitué en 3

[Mabry 1970] (Tableau 28 p 124). L’addition d’HCl entraîne un déplacement

bathochromique de 13 nm de la bande I révélateur d’une position 3’-O-substituée par un

groupe sulfate [Barron 1988a, 1988b].

Par ailleurs, le fort effet bathochrome de 50 nm sur la bande I avec la base NaOMe indique

clairement que l’hydroxyle en 4’ est libre. L’ajout de H3BO3 après NaOAc ne change rien et

montre que la position 3’ est bien substituée [Mabry 1970].

127

[M-H]-

[M-SO3-H]-

[M-SO3-Rha-H]-

Sur le spectre RMN 1H on observe les 5 protons aromatiques relatifs au flavonol

tétrasubstitué entre 6 et 8 ppm, ainsi que les protons osidiques de 5,2 à 0,81 ppm avec, entre

autres le proton anomérique Rha-1 à 5,2 et le groupe méthyle sous forme de doublet à

0,80 caractéristiques d’un -rhamnopyranosyl (Tableau 26 p 123). Ceci est confirmé par

l’expérience COSY qui attribue totalement les protons osidiques.


La présence du sulfate en 3’ influence les protons en ortho et meta, qui sont plus

déblindés que dans la quercitrine. Notons qu’il y a aussi absence du signal du OH-3’ et que,

par rapport à la quercitrine (Flav-3), les protons aromatiques du cycle A et les protons

osidiques ne sont pas influencés.

D’ailleurs, les déplacements chimiques en 13C des 6 carbones osidiques sont en accord

avec ceux de Flav-3 : 1 carbone anomérique à 102,0, 4 carbones osidiques entre 71,4 et

70,1 et le méthyle à 17,4. Les 15 autres carbones sont comparables à ceux de la génine,

avec pour seules différences significatives, les déplacements chimiques des carbones du

noyau B (Tableau 27 p 123).

128

OH-5

OH-7 OH-4’

H-2’

H-6’

H-5’ H-8

H-6 Rha-1

Rha-6

Rha-2

Rha-3Rha-4Rha-5

Figure 55 : Spectre 13C de Flav-4 (DMSO-d6, 50 MHz)

Ces variations sont connues, et sont attribuées à la présence du groupe sulfate qui

provoque un blindage du carbone qui le porte (C-3’) et un déblindage des carbones ortho (C-

2’ et C-4’). Cet effet étant moindre pour les carbones en meta (C-1’ et C-5’) [Barron 1986,

1987a et 1988a].

Tableau 23 : Effet de la sulfatation en 3’

Carbones cycle B Quercitrine -Quercitrine-3’-sulfate

1’ -2,32’ -5,43’ +4,44’ -3,35’ -1,26’ -4,6

Les expériences RMN bidimensionnelles confirment les attributions des spectres 1H et 13C. Ainsi, l’expérience XHCORR permet d’identifier tous les carbones porteurs de protons.

129

C-4

C-7

C-5

C-2

C-9

C-4’

C-3’

C-3

C-6’

C-2’

C-1’

C-5’

C-10

Rha-1

C-6

C-8

Rha-4

Rha-3

Rha-2

Rha-5

Rha-6

Figure 56 : Spectre XHCORR de Flav-4 (50 MHz, CD3OD)

L’expérience COLOC quant à elle avec ces couplages longues distances à travers 2 ou

3 liaisons, confirme l’attribution des carbones protonés et des carbones quaternaires,

« noyaute » la structure, et surtout, précise la fixation d’un rhamnopyranosyl en position 3 par

la tache de corrélation 3JH-1’’-C-3.

L’expérience COSY comme nous l’avons dit, présente les trois systèmes de spins bien

distincts de la molécule.

130

Rha-6

Rha-2

Rha-3

Rha-4, Rha-5

Rha-1

H-6-C-6

H-8-C-8

H-5’-C-5’

H-2’-C-2’

H-6’-C-6’

Figure 57 : Spectre COSY de Flav-4 (200 MHz, CD3OD)

La comparaison faite avec la quercétine 3-O-glucosyl-3’-sulfate [Sebra 1988] et la

quercétine 3’-sulfate [Sebra 1991], toutes deux isolées chez Hypericum elodes (Guttiferae),

confirme cette sulfatation en 3’ et permet de caractériser Flav-4 comme étant la quercitrine

3’-sulfate :

Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. C’est aussi la première

fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la famille des Leeaceae [Op de Beck

1998].

131

Rha-6

Rha-4Rha-5

Rha-3

Rha-2

Rha-1

H-6H-8

H-5’

H-2’

H-6’

H-2’ H-6’ H-5’ H-8 H-6 Rha-1 Rha-2 Rha-3 Rha-4 Rha-6Rha-5

V- Identification de Flav-5

C’est une laque jaune (20 mg) isolée de l’extrait butanolique et retrouvée également

dans l’extrait aqueux. Produit très polaire, il montre sur CCM toutes les caractéristiques d’un

flavonoïde sulfaté. Il « traîne » sur CCM et semble sous UV être substitué en 3.

De par le pic pseudo-moléculaire en FAB–, à m/z 461 [M-H]–, et comparativement aux

spectres obtenus pour le premier flavonoïde sulfaté isolé (Flav-4), nous pouvons envisager la

formule brute C15H10O13S2. La présence des deux atomes de soufre est suggérée par deux

groupes sulfates qui, génèrent successivement les deux pics à m/z 381 [M-SO3-H]– et m/z 301

[M-2SO3-H]– (Tableau 29 p 124).


Cette filiation est confirmer par une expérience SM/SM où l’on observe la cascade de

désulfatation successive.

Pour les spectres UV, l’addition des différents réactifs et l’analyse des résultats

obtenus permettent de conclure à un flavonol tétrasubstitué [Mabry 1970] (Tableau 28 p 124).

Le déplacement bathochromique de 7 nm par l’ajout d’une base faible (NaOAc) montre bien

132

[M+Na-2H]-

[M-H]-

[M-SO3+Na-2H]-

[M-SO3-H]-

[M-2SO3-H]-

que l’hydroxyle en 7 est libre, alors qu’après l’addition d’une base forte (NaOMe) le

déplacement bathochromique de 56 nm indique que l’hydroxyle en 4’ est libre [Mabry 1970].

L’ajout d’HCl conduit à un déplacement bathochromique de 27 nm, significatif d’une

substitution en 3 et 3’ par des groupements sulfates [Barron 1987b, 1988b].

Sur le spectre RMN 1H, les 5 protons aromatiques du noyau quercétine sont visibles

(Tableau 26 p 123). Les protons H-6 et H-8 ont bien le même déplacement chimique que

ceux de la quercétine alors que H-2’ et H-6’ sont déblindés. Cela est dû à la présence des

groupes sulfates.


De même, sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables,

avec, comme pour Flav-4, des variations provoquées par les groupements sulfates en 3 et 3’.

133

H-6’

H-2’

H-5’H-8 H-6


Tableau 24 : Effet de la sulfatation en 3,3’

Carbones cycle B Quercétine -Quercétine-3.3’-disulfate

2 -9,03 +6,14 -1,8

10 -1,21’ -1,12’ -6,73’ +4,54’ -4,05’ -1,36’ -7,0

Ces différentes données spectrales, sont identiques à celle de la quercétine 3,3’-

disulfate isolée en mélange avec de la patulétine 3,3’-disulfate chez Flaveria chloraefolia

(Compositae) [Barron 1987b], et permettent d’identifier Flav-5 à la quercétine-3,3’-

disulfate :

Ce composé rare est isolé pour la deuxième fois du règne végétal, puisque déjà isolé

de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b].

134

C-4

C-7

C-5

C-9

C-2C-4’

C-3’

C-3

C-6’

C-1’

C-2’

C-5’

C-10

C-6C-8

VI- Identification de Flav-6

Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (6 mg) à partir des extraits

butanolique et aqueux. Tout comme Flav-5, il s’agit d’un flavonol polysulfaté, celui-ci étant

plus polaire.

Le pic pseudo-moléculaire en FAB– à m/z 541 [M-H]– conduit à la formule brute

C15H10O16S3. Comme précédemment les trois groupes sulfates sont perdus successivement

produisant les trois pics caractéristiques à m/z 461 [M-SO3-H]–, 381 [M-2SO3-H]– et 301 [M-

3SO3-H]– (Tableau 29 p 124). Cette filiation a été également validée par un couplage SM/SM.


Outre le fait que l’analyse des spectres UV de ce flavonoïde conduise à un flavonol

tétrasubstitué [Mabry 1970], et que le déplacement bathochromique de 7 nm après addition de

NaOAc montre bien que l’hydroxyle en 7 est libre, c’est la vérification de la trisulfatation qui

est prépondérante (Tableau 28 p 124). En effet, l’ajout d’HCl conduit à un fort déplacement

bathochromique de 57 nm, celui-ci est caractéristique d’une 3,3’,4’-trisulfatation [Barron

1988b].

135

[M-H]-

[M-SO3-H]-

[M-2SO3-H]-

[M-3SO3-H]-

[M+3K-4H]-

[M+2K-4H]-

[M+Na-2H]-

[M+2Na-3H]-

[M-SO3+K-2H]-

Le spectre 1H montre aussi les 5 protons aromatiques de la quercétine. Les protons H-

6 et H-8 ont sensiblement le même déplacement chimique que pour la quercétine alors que les

protons du noyau B (H-2’, H-5’ et H-6’) sont fortement déblindés par la présence des groupes

sulfates tout comme Flav-5 (Tableau 26 p 123).


Sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables (Tableau 27

p 123). Là aussi, les variations sont dues aux trois groupes sulfates en 3, 3’ et 4’, groupements

électroattracteurs.

Tableau 25 : Effet de la sulfatation en 3,3’,4’

Carbones cycle B Quercétine -Quercétine-3.3’, 4’-trisulfate

2 -0,83 +6,54 -1,8

10 -0,11’ -1,62’ -3,63’ +3,34’ +2,55’ -1,96’ -2,6

136

H-2’

H-6’

H-5’H-8

H-6


Ce composé, comparé à la rhamnétine 3,3’,4’-trisulfate issu de la synthèse chimique

[Barron 1988c], a permis d’identifier Flav-6 comme étant la quercétine 3,3’,4’-trisulfate :

Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. Il est le troisième

flavonoïde sulfaté isolé chez Leea.

VII- Identification de Flav-7

Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (3 mg) à partir de l’extrait

dichlorométhane. Son comportement chromatographique rappelle un flavonol glycosylé

comme Flav-3.

Le spectre de masse en DCI confirme cette hypothèse. Nous avons en effet en plus du

pic pseudomoléculaire à m/z 479 [M+H]+, un fragment dû à une perte d’un groupement

137

C-4

C-7 C-9

C-5

C-2

C-4’C-3’

C-3

C-1’

C-6’

C-2’

C-5’

C-10C-6

C-8

desoxyhexosyl à m/z 333 [M-146+H]+. Ce glycosyl est aussi mis en évidence par le pic à m/z

164 [Rha-H2O+NH4]+.

L’analyse des spectres UV confirme le squelette de type flavonol hexahydroxylé

(Tableau 28 p 124). La bande I à MeOH à 337 nm confirme comme pour Flav-3, la fixation du

glycosyl en position 3. Mais contrairement à celui-ci, l’ajout de base indique que l’hydroxyle

en 4’ n’est pas libre. De plus, l’ajout de H3BO3 à NaOAc ne modifie pas le spectre et montre

que nous n’avons pas de système ortho-dihydroxyl sur le cycle B [Mabry 1970].

Le spectre RMN 1H dans le DMSO-d6 est comparable une nouvelle fois à Flav-3 avec

en plus, un méthoxy à 3,72 ppm (s, 3H, 4’-OMe). Les deux protons du cycle A à 6,20 (H-6,

d, J=2 Hz) et 6,37 (H-8, d, J=2 Hz) sont identiques à ceux de Flav-3 (Tableau 26 p 123).

Seuls changent les protons du cycle C. L’apparition du singulet à 6,82 (H-2’ et H-6’, 2H)

montre la symétrie du cycle B et donc la fixation du méthoxy en position 4’. Notons qu’un

méthoxy fixé en 3’ entraîne deux signaux bien distincts pour H-2’ et H-6’ comme dans la

larycitrine par exemple [Hoffmann-Bohm 1992]. Le proton anomérique à 5,13 ppm (Rha-1,

d, J=1,5 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4,1-3,0 ppm et un méthyl doublet à 0,79 (d,

J=5,4 Hz, 3H) sont comparables à ceux de Flav-3 et appartiennent à l’-rhamnose.


138

OH-5

OH-3’OH-5’

H-2’H-6’

H-8 H-6 Rha-2

4’-OMe

Rha-3Rha-4Rha-5

Rha-1

Rha-6OH-5

Le spectre 13C obtenu dans CD3OD permet d’attribuer notre produit à une génine myricétine

qui a, en position 3, la fixation d’un rhamnose et en position 4’, la présence d’un méthoxy à

60,9 ppm [Noreen 1998] (Tableau 27 p 123). Ce déplacement est significatif d’une fixation

en 4’ [Agrawal 1989], alors qu’une fixation en 3’ comme pour la larycitrine, aurait entraîné

un signal plus blindé vers 56 ppm [Guo 1998].

Nos données spectrales sont comparables avec celles de la littérature (UV [Gabetta

1973, Jay 1978], RMN 1H [Hoffmann-Bohm 1992], RMN 13C [Noreen 1998]) aussi, nous

pouvons conclure à l’identification de Flav-7 à la méarnsitrine ou 4’-méthoxy-myricétrine.

Ce flavonol glycosylé et méthoxylé est rare dans le monde végétal, et est

nouvellement identifié dans la famille Leeaceae. Il a été isolé la première fois de chez Acacia

mearnsii (Fabaceae) [Mackenzie 1969].

139

Tableau 26 : RMN 1H des flavonoïdes (200 MHz, DMSO-d6)

Protons Kaempferol Quercétine Quercitrine Méarnsitrine Quercitrine-3’-sulfate

Quercétine-3,3’-disulfate

Quercétine-3,3’,4’-trisulfate

H-6 6,18d (1,9)

6,17d (1,6)

6,20d (2,0)

6,20d (2,0)

6,20d (2,1)

6,16d (2,1)

6,16d (2,0)

H-8 6,43d (2,0)

6,40d (1,7)

6,38d (2,0)

6,37d (2,1)

6,39d (2,0)

6,39d (2,1)

6,33d (2,0)

H-2’ 8,03dd (2,6, 8,9)

7,66d (1,8)

7,29d (1,9)

6,82s

7,76d (2,0)

7,85d (2,1)

8,12d (2,2)

H-3’ 6,91dd (2,7, 8,9)

H-5’ 6,9dd (2,7, 8,9)

6,87d (8,5)

6,86d (8,3)

6,96d (8,1)

6,87d (8,7)

7,59d (8,9)

H-6’ 8,03dd (2,6, 8,9)

7,53dd (8.4, 2,0)

7,24dd (2,2, 8,4)

6,82s

7,52dd (2,3, 8,5)

8,04dd (2,3, 8,6)

8,03dd (2,2, 8,9)

OH-3 10,06 9,55OH-5 12,46 12,46 12,64 12,56 12,59OH-7 10,73 10,76 10,83 10,83OH-3’ 9,26 9,29 9,46OH-4’ 9,33 9,30 9,66 9,62Rha-1 5,24

d (1,1)5,13

d (1,5)5,20

slRha-2 3,96

sl3,98

sl3,98

slRha-3 3,50

dd (3,1, 8,6)3,5-3,0

nd3,55m

Rha-4 3,29-3,21nd

3,5-3,0nd

3,1nd

Rha-5 3,21-3,08nd

3,5-3,0nd

3,0-3,3nd

Rha-6 0,81d (5,5)

0,79d (5,4)

0,80d (5,7)

4’-OMe 3,72s

Tableau 27 : RMN 13C des flavonoïdes (50 MHz, DMSO-d6)

Carbones Kaempferol Quercétine Quercitrine Méarnsitrine*

Quercitrine-3’-sulfate



2 146,8 146,7 156,4 160,0 156,4 155,7 147,53 135,6 138,6 134,2 136,7 134,5 132,5 132,14 175,9 175,8 177,7 179,6 177,6 177,6 177,65 160,7 160,7 161,2 nd 156,7 161,2 160,26 98,1 98,1 98,6 100,0 98,7 98,4 97,37 163,8 163,6 164,1 166,2 164,2 163,9 162,88 93,4 93,3 93,6 94,9 93,6 93,3 92,09 156,1 156,1 157,2 158,7 161,2 156,0 154,810 103,0 102,9 104,0 nd 104,1 104,1 103,01’ 121,6 121,9 120,7 127,1 123,0 123,0 123,52’ 129,4 114,9 115,4 109,8 120,8 121,6 118,53’ 115,4 145,0 145,1 151,9 140,7 140,5 141,74’ 159,1 147,8 148,4 139,4 151,7 151,8 145,35’ 115,4 115,5 115,8 151,9 117,0 116,8 117,46’ 129,4 119,9 121,0 109,8 125,6 126,9 122,5

Rha-1 101,8 103,7 102,0Rha-2 70,3 71,9° 70,1Rha-3 70,5 72,1° 70,6Rha-4 71,1 73,3 71,4Rha-5 70,0 72,1° 70,1Rha-6 17,4 17,8 17,4

4’-OMe 60,9

* dans CD3OD, ° interchangeable

140

Tableau 28 : UV des flavonoïdes avec max dans MeOH

Flavonols bande MeOH +NaOAc +NaOAc+H3BO3

+NaOMe +AlCl3 +AlCl3

+HCl+HCl

Kaempferol III

265365

274302,5, 389

269375

278415déc

268352, 427

268,5350,5, 427

-

Quercétine III

255369

267,5322,5, 389,5

déc

259386

252325déc

271339, 456

268365, 429

Quercitrine III

255347,5

270,5369

259,5365

269,5388,5

273,5383, 429,5

270399,5

255350

Méarnsitrine III

263337,5

271,5360

264330

272361

272,5300s, 337, 391

273338,5, 389

Quercitrine-3’-sulfate

III

265342

268344

269342

272324, 392

273357, 395

274341, 389,5

256355


III

268342

275307s, 387

268349

275328s, 398

276308s, 364, 396s

277349, 395s

255369


III

268311

275356

268313

276360

279307s, 389

277337

325368

déc=décomposition

Tableau 29 : SM des flavonoïdes en FAB (mode négatif, matrice glycérol)

ComposésFragments

Kaempferol Quercétine Quercitrine Quercitrine-3’-sulfate



[M-H]– 285 301 447 527 461 541

[M-SO3-H]– 447 381 461

[M-2SO3-H]– 301 381

[M-3SO3-H]– 301

[M+K-2H]– 499

[M+2K-3H]– 617

[M+3K-4H]– 655

[M+Na-2H]– 483 563

[M+2Na-3H]– 585

[M-Rha-H]– 301

[M-SO3-Rha-H]– 300

[M-SO3+K-2H]– 499

[M-SO3+Na-2H]– 403

141

C- Etude de composés divers

I- Identification de Ac Ph-1

Ce composé a été isolé dans l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme d’aiguilles

blanches. Sur CCM, après pulvérisation à l’acide, il développe une coloration bleue qui vire

au violet.

En DCI, l’adduit à m/z 188 [M+NH4]+ et le pic pseudo-moléculaire à m/z 171 [M+H]+

permettent de déduire un PM de 170 et par conséquent une formule brute de C7H6O5 (5

insaturations ou cycles). On retrouve aussi un pic dû la perte d’un hydroxyle à m/z 153 [M-

H2O+H].

Les absorbances UV à 271,5 et 215 nm sont significatives de l’acide gallique

[Ribéreau-Gayon 1968].

Le spectre 1H révèle un seul singulet aromatique à 7,05 ppm (H-2 et H-5, s),

révélateur de la symétrie de la molécule.

Cette même symétrie entraîne sur le spectre 13C, l’apparition de 5 carbones seulement,

dont la fonction acide libre à 170,4 (C-1’) et 4 carbones aromatiques à 146,4 (C-3 et C-5),

139,6 (C-4), à 122,0 (C-1, Q) et à 110,3 (C-2 et C-6, 2 CH).

Figure 65 : Spectre 13C de AC Ph-1 (50 MHz, CD3OD)

142

C-1’

C-3C-5

C-4

C-1

C-2C-6

Ces données sont en accord avec la littérature [Aldrich 1993], et nous permettent

d’identifier Ac Ph-1 à l’acide gallique :

Composé très courant, il est déjà répertorié dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith

1959, Yem Yok Siv 1971, Hegnauer 1990].

II- Identification de Ac Ph-2

Isolé de l’extrait au dichlorométhane, sous forme d’aiguilles brunâtres, ce composé

réagit sur CCM comme Ac Ph-1 tout en étant moins polaire.

La formule brute de C9H10O5 est suggérée par l’ion moléculaire à m/z 198 [M]+ en EI

(5 insaturations ou cycles). Le pic à m/z 170 est obtenu après la perte d’un radical éthoxy

(C2H5+). Celui à m/z 153 correspond à la perte du groupe ester COOEt.

Les absorbances UV à 273,5 et 215,5 nm rappellent celles rencontrées pour l’acide

gallique.

Par ailleurs, en plus du singulet aromatique caractéristique à 7,01 (H-2 et H-6, s,

2H), on retrouve sur le spectre 1H, le système classique d’un groupe éthoxy : un quadruplet à

4,24 (H-2’, q, J = 7 Hz, 2H) et un triplet à 1,31 (H-3’, t, J = 7 Hz, 3H).

143

Figure 66 : Spectre 1H de Ac Ph-2 (200 MHz, CD3OD)

Sur le spectre 13C, hormis les signaux phénoliques du gallate (Tableau 30), nous

n’observons plus de fonction acide libre (170 ppm), mais plutôt un carbone caractéristique

d’une fonction ester à 168,6 (C-1’) et les deux carbones de la chaîne éthoxy à 61,7 (C-2’)

et 14,6 (C-3’).

Ces données confirment que Ac Ph-2 est le gallate d’éthyle :

Ce composé est nouveau dans le genre.

Tableau 30 : Données RMN des acides phénols (200/50 MHz, CD3OD)

Positions Acide gallique Gallate d’éthyleCarbones ppm

Protons ppm

Carbones ppm

Protons ppm

1 122,0 121,82, 6 110,3 7,05, s 110,0 7,01, s3, 5 146,4 146,54, 139,6 139,71’ 170,4 168,62’ 61,7 4,24, q J = 7 Hz3’ 14,6 1,31, t, J = 7 Hz

144

H-2H-6

H-2’

H-3’

III- Identification de AG-1

Isolé sous forme d’huile blanche (50 mg), AG-1 est issu de l’extrait au

dichlorométhane.

Le spectre EI présente le pic moléculaire à m/z 256 [M]+ confirmant la formule brute

C16H32O2 (1 insaturation ou cycle). On observe une cascade de coupures radicalaires dues à

des pertes successives de 14 uma correspondant à un CH2 comme C3H7+, C4H9

+, C5H11+, etc.

Cela confirme par ailleurs la structure linéaire d’une chaîne grasse [McLafferty 1980].

Figure 67 : Spectre EI de AG-1

Cette chaîne est de nouveau mise en évidence par l’allure générale du spectre 1H, où

seuls les protons en alpha de la fonction acide à 2,33 (H-2, t, J = 7,3 Hz, 2H) sont bien

distincts. Puis le groupe des CH2 et le méthyle de fin de chaîne sont observés respectivement

entre 1,7-1,0 ppm et à 0,86 (H-16, t, J = 7 Hz, 3H).

145

[M]+

Cette chaîne aliphatique entraîne une mauvaise résolution du spectre 13C, où les

signaux de la plupart des carbones se trouvent concentrés entre 29,7 et 29,1 ppm. Néanmoins,

le carbone quaternaire de la fonction acide résonne à 175,6 (C-1) ppm, le méthyle à 14,1

(C-16), le CH2 en alpha de la fonction acide à 33,7 (C-2) et celui en alpha du méthyle à

24,7 (C-15).

Ce composé, AG-1 est l’acide palmitique :

Cet acide gras fait partie des constituants les plus majoritaires obtenus par

hydrodistillation.

146

Chapitre IV - Activités Biologiques

Pour compléter l’étude phytochimique de L. guineensis, il semblait intéressant de

pouvoir vérifier les données ethnopharmacologiques qui lui sont attribuées dans les domaines

cardiovasculaire et anti-inflammatoire, afin d’apporter des éléments pour confirmer l’usage

de la plante en médecine traditionnelle. Ainsi, nous avons eu l’opportunité de rechercher

notamment, après une étude de cytotoxicité, une éventuelle activité anti-inflammatoire sur les

kératinocytes. Précisons qu’il s’agit ici de résultats préliminaires.

A Evaluation des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité cellulaire

I Introduction

L’effet d’un composé sur la viabilité cellulaire peut être étudié in vitro sur culture

cellulaire à l’aide de plusieurs techniques comme l’inclusion de colorants vitaux ou la

métabolisation de réactifs par les cellules vivantes. Parmi ces méthodes, nous avons employé

la technique de métabolisation d’un sel de tétrazolium, le XTT.

Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique du XTT, en un produit

coloré, le formazan. Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules

vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé

hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrométrie à 450 nm.

Figure 68 : Métabolisation du XTT en formazan

147

Nous nous sommes proposés de tester les extraits EtOAc, BuOH et H2O à l’aide du

test du XTT, sur une microplaque, afin d’estimer la population cellulaire vivante, après

l’application durant 48 heures de diverses concentrations de produit.

II Résultats

La métabolisation du XTT exprimée par la Densité Optique (DO) du formazan de

chaque puits, est proportionnelle à la population cellulaire vivante.

Le pourcentage de variation de DO du lot traité par les extraits, retrace les

modifications de la population cellulaire, par rapport à la population cellulaire témoin.

Le pourcentage de variation par rapport à la population témoin est ainsi calculé :

DO témoin - DO traité X 100

DO témoin

Tableau 31 : Taux de viabilité des kératinocytes en culture après 48H d’incubation avec

les extraits

Viabilité cellulaireConcentrations Extrait

EtOAcExtraitBuOH

ExtraitH2O

0,01 µg/ml 5,65 8,19 0,22

0,1 g/ml 2,71 2,34 -1,07

1 g/ml -4,43 -2,95 -0,60

10 g/ml -32,39 -21,94 -10,38

100 g/ml -75,58 -61,19 -28,86

148

Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des kératinocytes humains SVK14

en culture pendant 48H

III Conclusion

Les résultats relatifs à l’activité des trois extraits sont comparables.

L’étude de la viabilité cellulaire effectuée sur les extraits EtOAc, BuOH et H2O révèle

une activité prolifératrice très faible des kératinocytes humains SVK 14 aux concentrations de

0,01 à 1 g/ml. Par contre, à 10 et 100 g/ml, les extraits présentent une cytotoxicité.

Cette évaluation de la viabilité des cellules est indispensable à toute étude ultérieure. Il

est en effet nécessaire de connaître les concentrations cytotoxiques des échantillons, afin de

travailler en dessous de ce seuil pour évaluer d’autres propriétés. De plus cette étude pourrait,

en transposant la méthode sur des cellules tumorales, être la première étape vers la recherche

de principes cytotoxiques [Scudiero 1988].

149

EtOAc BuOH H2O

0.1 g/m

l

1 g/m

l

0.01 g/m

l

100 g/m

l

10 g/m

l

0.1 g/m

l

1 g/m

l

0.01 g/m

l

100 g/m

l

10 g/m

l

0.1 g/m

l

1 g/m

l

0.01 g/m

l

100 g/m

l

10 g/m

l

% d

’act

ivit

é

B Activité du palmitate de -amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur

la production de prostaglandines 6KF1.

I Introduction

Le kératinocyte est la cellule la plus représentée au niveau de l'épiderme. En réponse à

de nombreux facteurs extracellulaires présents dans son environnement, il libère divers

médiateurs biologiquement actifs, notamment les prostaglandines et les leucotriènes qui

jouent un rôle important dans l'initiation et la modulation des réactions inflammatoires

cutanées, et qui interviennent également dans la régulation de la réponse immune.

Le kératinocyte se révèle être un bon modèle d'étude en pharmacologie cutanée ; ce

modèle cellulaire permet de déterminer, in vitro, les capacités de diverses molécules à

moduler la production de ces médiateurs issus du métabolisme de l'acide arachidonique.

Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à une prostaglandine particulière, la

PG6KF1 qui est un des métabolites majeurs produits par le kératinocyte stimulé, et

représentatif de la modulation de la production des métabolites de l'acide arachidonique issus

de la voie de la cyclo-oxygénase.

Nous avons ainsi évalué l'activité de trois extraits et d’un composé purifié majoritaire

de l’extrait hexanique :

- l’extrait acétate d’éthyle

- l’extrait butanolique

- l’extrait aqueux

- le palmitate de -amyrine,

sur la production de PG6KF1 induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de

l'acide arachidonique, l’ionophore calcique A23187.

150

II Résultats

Les résultats sont exprimés en picogrammes de prostaglandine 6KF1 pour 1x106

kératinocytes et par ml de culture.

L'analyse statistique des résultats est réalisée par une analyse de variance et par le test de

Dunnett.

Tableau 32 : Production de prostaglandines 6KF1 après 5 heures de culture avec le palmitate de -amyrine

TRAITEMENTS pg PG6KF1 / 1x106

kératinocytes/ml

% Activité/A23187

Témoin n =3 32 + 4 -A23187 5µM n =3 182 + 25 -Palmitate de -amyrine 10µg/ml+A23187 5µM

n =3 130 + 5 *** -28%

Palmitate de -amyrine 50µg/ml+A23187 5µM

n =3 116 + 7 *** -36%

Palmitate de -amyrine 100µg/ml+A23187 5µM

n =3 96 + 3 *** -47%

*** = Valeurs significativement différentes, au seuil 0,05, du témoin A23187.

Tableau 33 : Production de prostaglandines 6KF1 après 5 heures de culture

TRAITEMENTS pg PG6KF1 / 1x106

kératinocytes/ml

% Activité/A23187

Témoin n = 3 33 + 5 -A23187 5µM n = 3 138 + 6 -Extrait EtOAc 0,1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3125 + 8

-10%

Extrait EtOAc 1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3162 + 19 17%

Extrait EtOAc 5 µg/ml+A23187 5µM

n = 3168 + 7*** 22%

Extrait BuOH 0,1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3138 + 16 0%

Extrait BuOH 1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3151 + 4*** 9%

Extrait BuOH 5 µg/ml+A23187 5µM

n = 3163 + 22 18%

Extrait H2O 0,1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3138 + 12 0%

Extrait H2O 1 µg/ml+A23187 5µM

n = 3137 + 8 -1%

Extrait H2O 5 µg/ml+A23187 5µM

n = 3137 + 14 -2%

*** = Valeurs significativement différentes, au seuil 0,05, du témoin A23187.

151

Figure 70 : Activité du palmitate de -amyrine sur la production de prostaglandine 6KPGF1 par les

kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 M.

Figure 71 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la production de prostaglandine 6KPGF1 par les

kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 M.

152

Témoin A231875 M

10 g/ml 50 g/ml 100 g/ml

Palmitate de -amyrine

Pg P

G6K

F1

/.106

kéra

tino

cyte

s/m

l

Pg P

G6K

F1

/.106

kéra

tino

cyte

s/m

l

Tém

oin

A23187

5 M

EtOAc BuOHH2O

0.1 g/m

l

0.1 g/m

l

0.1 g/m

l

1 g/m

l

1 g/m

l

1 g/m

l

5 g/m

l

5 g/m

l

5 g/m

l

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

III Conclusion

Cette étude in vitro de la modulation de la libération de la prostaglandine 6KF1 par

les kératinocytes stimulés, après exposition à chacun des 3 extraits et du palmitate de -

amyrine, à des concentrations non cytotoxiques, montre que :

- Les extraits EtOAc, BuOH et H2O ne présentent pas d’activité anti-inflammatoire

significative sur ce modèle.

Ce problème peut être dû à une concentration trop faible d’extraits testés, mais nous

ne pouvons pas, comme nous l’avons vu, aller au-delà sans induire une cytotoxicité. Ce

résultat peut paraître même étonnant quand on connaît les vertus anti-inflammatoires de la

plante. L’activité soupçonnée pourrait utiliser un autre mécanisme, pour cela, il conviendrait

d’envisager un modèle anti-inflammatoire plus global.

- Le palmitate de -amyrine présente une activité inhibitrice significative de la

production de PG6KF1 ; cette activité est dose-dépendante : 28%, 36% et 47% d’inhibition

à 10, 50 et 100 µg/ml respectivement ; soit une activité inhibitrice de 47% à 150 M.

Dans les mêmes conditions expérimentales, l’hydrocortisone présente 45% d’inhibition à 7,5

M.

De plus, il est intéressant de remarquer que le palmitate de -amyrine inhibe la

libération de prostaglandines contrairement au palmitate d’-amyrine, qui, lui, n’a pas

d’activité anti-cyclooxygénase mais a une activité sur les collagénases et sur la prolifération

des fibroblastes [Kweifio-Okai 1994b]. Il est d’ailleurs utilisé comme antiarthritique

[Kweifio-Okai 1994a].

Cette activité sur les collagénases mérite d’être rechercher pour le palmitate de -

amyrine.

153

C Activité du palmitate de -amyrine sur l’expression de l’ARNm de la

métalloprotéinase MMP-1

I Introduction

Les métalloprotéinases (MMPs) sont des enzymes impliquées dans tout processus

normal ou pathologique de remodelage de la matrice extracellulaire. Leurs principales

fonctions concernent leur capacité à dégrader les composants de la matrice. Elles permettent

aussi le détachement des cellules de leur support, la libération et l’activation de cytokines

inflammatoires et de facteurs de croissance. Les métalloprotéinases de la matrice sont classées

selon la nature de la matrice extracellulaire qu’elles dégradent, en collagénases, gélatinases ou

stromélysines. Les collagènes fibrillaires sont dégradés, entre autres, par la collagénase

interstitielle exprimée par les fibroblastes dermiques et sécrétés dans la matrice extracellulaire

du derme. Dans le système cutané, l’expression basale des MMPs est relativement faible

mais, est, par contre, induite à la suite d’exposition à divers stimuli comme certaines

cytokines, certains facteurs de croissance (IL1, IL6, TNF) ou une exposition UV.

Dans la présente étude, nous avons suivi, par la technique de Reverse Transcriptase-

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) semi-quantitative, l’expression de l’ARN messager de

la collagénase MMP-1, dans un modèle cellulaire in vitro de fibroblastes humains normaux,

soumis à une stimulation inflammatoire chimique, au "Phorbol Meristate Acetate" (PMA).

Nous avons montré précédemment que le palmitate de -amyrine, présente une

activité anti-inflammatoire significative, en régulant le métabolisme de l’acide arachidonique.

Dans cette étude, nous avons évalué le pouvoir inhibiteur du palmitate de -amyrine, sur

l’induction de l’ARN messager de MMP-1, suite à une stimulation inflammatoire.

154

II Résultats

Figure 72 : Effet du palmitate de -amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1 à la suite d’une

stimulation inflammatoire

Les différents taux d’expression des ARNm de la MMP-1 selon les traitements, sont

représentés sur la figure ci-dessus. Il s’agit d’une observation semi-quantitative.

Le niveau basal d’expression de l’ARNm de la MMP-1 est relativement faible. Sous

stimulation inflammatoire au PMA, nous pouvons observer une induction du taux d’ARNm.

Dans ces conditions expérimentales de préincubation de 24 heures, le palmitate de -

amyrine ne présente aucun effet.

III Conclusion

Cette étude in vitro montre que le palmitate de -amyrine ne semble pas agir

significativement sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 à la suite

d’une stimulation inflammatoire.

155

D Activité antiradicalaire des extraits EtOAc, BuOH et H2O et des

composés phénoliques

I Introduction

Les radicaux libres sont présents dans le monde vivant, où ils sont associés au

métabolisme de l’oxygène et aux réactions d’oxydoréduction.

En général, les radicaux sont piégés par des systèmes enzymatiques tels que

superoxyde dismutase, catalase ou glutathion peroxidase.

Figure 73 : Principales réactions dans l’organisme

Des antioxydants non enzymatiques interviennent aussi dans la défense antiradicalaire

comme la vitamine E, la vitamine C, la vitamine A ou le glutathion.

Mais au cours du vieillissement, par suite d’une diminution de l’activité enzymatique,

ou d’une production radicalaire exagérée par les rayonnements UV, les radiations ionisantes,

les phénomènes de pollution, ou lors de situations pathologiques comme les ischémies, les

cancers ou les inflammations, les systèmes de défenses de l’organisme contre le stress

oxydatif sont débordés, ce qui entraîne les effets toxiques.

Nous nous sommes proposés d’évaluer le pouvoir antiradicalaire de nos extraits et de

composés polyphénoliques isolés. Pour cela, nous avons utilisé la méthode utilisant le DPPH

(2-2-diphényl-1-picrylhydrazyl). C’est un test colorimétrique très utilisé [Blois 1958].

Le DPPH est un radical stable qui présente une absorbance caractéristique entre 500 et

560 nm (violet). Cette couleur violette, disparaît rapidement quand le DPPH rencontre un

piégeur de radicaux libres et devient alors jaune.

156

Structure du DPPH

II Résultats

L’activité antiradicalaire est exprimée par le pourcentage de DPPH dégradé. Celle-ci

est évaluée par comparaison de la Densité Optique (DO) de l’échantillon avec celle de

l’échantillon standard mesurée dans le MeOH :

% de dégradation du DPPH =DO témoin - DO échantillon X 100

DO témoin

Tableau 34 : Pourcentage de dégradation du DPPH par les composés testés en microplaque 96

puits :

Composés CI50 (M)Concentrations

2 M 10 M 50 M 100 M 200 MTrolox (témoin positif) 100Kaempferol 120 0 0 19 41 90Quercétine 49 0 7 51 91 94Quercitrine 88 0 7 29 57 84Quercitrine 3’-sulfate >>200 0 0 0 2 6Quercétine 3,3’-disulfate >>200 0 0 0 2 10Quercétine 3,3’,4’-trisulfate 150 1 2 20 30 70Acide gallique 35 4 16 67 90 92Gallate d’éthyle 67 0 7 39 72 92

157

Figure 74 : Activité antiradicalaire des différents extraits à 20 mg/ml

Figure 75 : Activité antiradicalaire des composés isolés

158

La majorité des composés sont plus actifs que le Trolox.

Le kaempferol, avec un hydroxyl en 4’ sur le cycle B, est moins actif que le Trolox

alors qu’un système ortho-dihydroxyl sur le cycle B (la quercétine), permet une meilleure

activité antiradicalaire.

Mais la glycosylation sur la position 3 diminue cet effet (la quercitrine), et l’annule

quand on perturbe le système ortho-dihydroxyl 3’,4’ (quercitrine 3’-sulfate, quercétine 3,3’-

disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate). Notons que l’on retrouve une légère activité avec le

flavonoïde trisulfaté. L’activité observée est un artefact. En effet, l’analyse sur CCM montre

que le dérivé trisulfaté s’est hydrolysé en partie en quercétine. On retrouve donc le système

ortho-dihydroxyl sur le cycle B responsable de cette activité.

Cela tend donc à montrer que la présence du système ortho-dihydroxyl sur le cycle B

et l’hydroxyle libre en 3 sont nécessaires pour avoir une forte activité antiradicalaire.

Quant aux acides phénoliques, c’est l’acide gallique qui est le plus actif. La présence

de la chaîne éthoxy dans le gallate d’éthyle réduit de moitié son activité antiradicalaire.

III Conclusion

L’étude montre que les trois extraits EtOAc, BuOH, H2O ont une activité

antiradicalaire. Hormis les flavonoïdes sulfatés, cette activité se retrouve dans la plupart des

composés isolés de ces mêmes extraits. Ainsi, l’acide gallique, la quercétine, le gallate

d’éthyle, la quercitrine et le kaempferol ont une activité antiradicalaire.

Cette activité est à rapprocher d’une éventuelle activité anti-inflammatoire. En effet,

l’activité antiradicalaire, en piégeant les radicaux libres, est fortement impliquée dans les

processus anti-inflammatoires au même titre que les inhibitions enzymatiques des

lixopygénases, des cyclooxygénases ou de la xanthine oxydase par exemple. Rappelons

d’ailleurs que la xanthine oxydase qui génère des radicaux O2-, est inhibée par les flavonoïdes

sulfatés non actifs ici [Yagi 1994].

159

DiscussionDiscussion

160

DISCUSSION

Deux méthodes ont été utilisées pour l’étude phytochimique de Leea guineensis G.

Don (Leeaceae).

La première est l’hydrodistillation. Elle a permis d’identifier 47 composés des

distillats de feuilles, et 43 composés des distillats de bois, ainsi que 4 acides gras, soit au total

73 composés. Nous avons montré que la classe la plus représentative des distillats de bois et

de feuilles était celle des hydrocarbures (60% et 45 % respectivement) essentiellement dû au

fort taux d’acides gras et d’esters. Pour les feuilles, la fraction la plus importante est tout de

même celle des terpénoïdes (54%), où l’on rencontre un composé peu commun : le

vitispirane.

La seconde a consisté en l’extraction et en l’isolement des composés à partir des

extraits héxanique, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles. Elle

a conduit après fractionnement sur différents supports chromatographiques à l’isolement de

17 composés qui se répartissent dans quatre classes que sont : les terpènoïdes (7), les

flavonoïdes (7), les acides phénols (2) et les acides gras (1).

Si un bon nombre de ces composés identifiés sont connus (kaempferol, quercétine,

quercitrine, acide gallique, E-phytol, squalène, lupéol, -amyrine), ceux-ci, du point de vue

chimiotaxonomique, sont intéressants.

Chimiotaxonomie

Quatre composés sont déjà connus chez les Rhamnaceae et les Vitaceae. Il s’agit du

kaempferol, de la quercétine, de la quercitrine et de l’acide gallique. Le rapprochement des

Leeaceae des Vitaceae semble justifier par l’existence de composés rares comme le

vitispirane, provenant de l’hydrodistillation, et de raphides (oxalate de calcium). Quant à la

distinction entre les Leeaceae et les Vitaceae, celle-ci pourrait s’expliquer par le fait que l’on

retrouve chez les Leeaceae à la fois des triterpènes à noyaux lupanes, oléananes et ursanes et

qu’ils peuvent être acylés. A notre connaissance, il n’est pas répertorié de noyau lupane chez

les Vitaceae, ni de triterpène acylé. Les Rhamnaceae produisent pour leur part, des triterpènes

majoritairement à noyaux lupanes et dammaranes [Hegnauer 1973]. La présence de

161

flavonoïdes sulfatés est aussi un argument en faveur de la séparation actuelle des Leeaceae

des Vitaceae, (même si, nous l’avons vu, leur répartition fait plus référence à la nature du

biotope). Pour répondre à cette hypothèse, une étude plus vaste, sur d’autres Leea d’Asie et

d’Afrique semble indispensable. Elle permettrait de savoir si la famille possède ou non des

flavonoïdes sulfatés, et si c’est le cas, on pourra peut-être parler de traceur

chimiotaxonomique spécifique pour les Leeaceae.

Tableau 35 : Différents composés rencontrés chez les Rhamnales

Composés Leeaceae Vitaceae Rhamnaceae

Acide gallique

Kaempferol

Quercétine

Quercitrine

et -amyrine

Lupéol

Vitispirane

Triterpènes acylés

Flavonoïdes sulfatés

Oxalate de calcium

Intérêt biologique des composés isolés

Il nous paraît intéressant de recenser les activités des composés isolés au travers des

publications de ces dernières années. Ceci pour deux raisons. La première permet en

connaissant les activités biologiques des composés de comprendre les différentes utilisations

de la plante en médecine traditionnelle. La seconde est de montrer que de petites

biomolécules peuvent être douées de propriétés intéressantes (acide gallique par exemple).

Il serait certes prématuré de relier les activités potentielles des extraits ou des

métabolites purifiés à l’utilisation traditionnelle de Leea guineensis, mais bon nombre de ces

composés ont des activités qui recoupent le champ d’application de cette plante en

ethnopharmacologie, notamment dans les domaines anti-inflammatoire ou cardiovasculaire.

162

Tableau 36 : Liste des terpénoïdes et de leurs propriétés biologiques

ComposésNouveau dans

Propriétés biologiquesFamille Règne

végétalE-phytol Antibactérienne [Rajab 1988]

Anti-inflammatoire [Shimizu 1994]Antispasmodique [Pongprayon 1992]Hypolipémiante [Watanabe 1983]

Squalène Antibactérienne,Antitumorale,Immunostimulante [Harborne 1999]Chimiopréventive (cancers du colon) [Rao 1998]

Lupéol Cytotoxique pour les cellules tumorales Hep-G2, A-431 et H-411E par inhibition de la topoisomérase II [Moriarity 1998]Antitumorale contre le carcinome de Walker,Antihypoglycémiante,Hypotensive [Harborne 1999]Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999]Anti-inflammatoire [Geetha 1998, Akihisa 1996]

-amyrine Aléxitérique [Pereira 1994]Anti-inflammatoire [Harborne 1999, Akihisa 1996]

Palmitatede -amyrine

Antidépressive et sédative [Kitada 1981, Subarnas 1992, 1993a-b]Inhibiteur 1-adrénergique [Subarnas 1993c]

Palmitated’-amyrine

Anti-inflammatoire et anti-arthritique [Kweifio-Okai 1993, 1994a-b, 1995]Pesticide inhibiteur de croissance [Shankaranarayana 1980]Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999]

Mélange de palmitate d’ et de

-amyrine

Protecteur hépatique [Lin 1988]

Coriolatede -amyrine

Non déterminées

163

Tableau 37 : Liste des polyphénols et de leurs propriétés biologiques

Composés Nouveau dans Propriétés biologiques

Famille Règnevégétal

Kaempferol Anti-inflammatoire,Antibactérienne,Antimutagène,Inhibiteur lipoxygénase,Antiradicalaire [Harborne 1999]

Quercétine Comme le kaempferol mais plus actifAntihépatotoxique,Antivirale [Harborne 1999]Aléxitérique [Pereira 1994]Anti-inflammatoire [Robak 1996]Vasorelaxante [Chen 1996]

Quercitrine Comme la quercétineInhibe l’aldose réductase (10-7M)Antimutagène,Anti-ulcéreuse [Harborne 1999]Antidiarrhéique [Gálvez 1995]

Méarnsitrine Inhibe l’aldose réductase [Yoshikawa 1998]Quercitrine3’-sulfate

Non déterminées

Quercétine3,3’-disulfate

Non déterminées

Quercétine3,3’,4’-trisulfate

Non déterminées

Acide gallique Antibactérienne,Antivirale,Antifongique,Antitumorale,Anti-anaphylactique,Antimutagène,Cholérétique,Bronchodilatatrice,Inhibe la dégradation de l’insuline,Relaxante du muscle lisse,Astringent [Harborne 1999]Anti-inflammatoire,Antimutagène, Anticarcinogène [Kroes 1992]

Gallate d’éthyle Antiradicalaire [Masaki 1997]Antibactérienne [Kayser 1997, Sato 1997]Antitumorale [Serrano 1998]Antinociceptive [Filho 1996]Inhibiteur de la 12- et 15-lipoxygénase, ainsi que de la prostaglandine-synthase [Luther 1991, Christow 1991]Inhibiteur de la protéine tyrosine kinase [Serrano 1998]Anti-inflammatoire [Kroes 1992]

164

Les terpénoïdes

Tous les composés de cette classe sont nouvellement identifiés dans la famille

Leeaceae.

Nous avons isolé, entre autres, le E-phytol, le squalène, le lupéol et la -amyrine. Ces

composés sont très répandus dans le règne végétal.

Pour cela, nous discuterons essentiellement des triterpènes acylés que nous avons

isolés : le palmitate de et d’-amyrine et du coriolate de -amyrine. On peut en effet se

poser la question de l’origine des triterpènes acylés. Sont-ils naturels ? Pour certains auteurs,

l’acylation d’alcools triterpéniques en présence de glycérides peut avoir lieu en milieu acide

donnant ainsi à ces composés une origine artefactuelle [Massiot 1996]. Ce n’est pas le cas ici,

car l’extraction à l’hexane ne fait pas intervenir d’acide. Par ailleurs, l’obtention de composés

sensibles à l’acide (flavonoïdes sulfatés) nous laisse penser qu’une augmentation de l’acidité

au cours du processus de séchage de la plante ou du mouillage de celle-ci avant extraction n’a

pu avoir lieu. D’autre part, dans le latex de différentes espèces d’Euphorbia (Euphorbiaceae),

la présence naturelle d’esters de triterpènes a été démontrée par une hypothèse biogénétique

[Warnaar 1987].

Les dérivés palmitoylés d’amyrine ont deux propriétés principales :

Le palmitate d’-amyrine (Terp-7) présente une activité antiarthritique [Kweifio-

Okai 1994a]. L’action antiarthritique est expliquée par une inhibition de la prolifération des

fibroblastes et des collagénases. Cependant, elle n’est pas due à une activité

anticyclooxygénase (car la production de prostaglandines par le test de l'oedème de la patte

induite par la carragennine n'est pas affectée) [Kweifio-Okai 1994b]. De plus, l’examen

histologique de l’articulation des interphalanges proximales de pieds de rats montre une

diminution de la prolifération et de l’invasion synoviale du hyaluronate et des granulocytes

[Kweifio-Okai 1995].

Cette activité anti-inflammatoire et plus particulièrement anti-arthritique du

palmitate d’-amyrine a fait l’objet d’un brevet international [Kweifio-Okai 1993].

Quant au palmitate de -amyrine (Terp-5), il montre une activité antidépressive et

sédative. Cette activité est montrée en mesurant la perte de la mobilité des souris ou des rats

selon le test de la nage forcée [Subarnas 1992, 1993a]. D'après d’autres données

165

pharmacologiques, le palmitate de -amyrine est un antidépresseur au même titre que

l'imipramine et la mianserine [Kitada 1981, Subarnas 1993b]. Ce composé possède des

propriétés sédatives justifiées par une action "mianserin-like" [Subarnas 1993b]. Pour

préciser son mode d’action, le palmitate de -Amyrine a été testé en association avec d’autres

composés :

- phényléphrine (agoniste 1)

- clonidine (agoniste 2)

- apomorphine (agoniste dopaminergique)

- prazosine (antagoniste 1)

- yohimbine (antagoniste 2)

Il ressort de cette étude que le palmitate de -amyrine se comporte comme un inhibiteur 1-

adrénergique [Subarnas 1993c].

Sachant que la -amyrine et le palmitate d’-amyrine possédaient une activité anti-

inflammatoire, nous avons voulu savoir si le palmitate de -amyrine, isolé majoritairement de

l’extrait hexanique dont nous disposions en grande quantité, possédait cette même activité

anti-inflammatoire. Nous avons ainsi pu montrer que le palmitate de -amyrine possédait une

activité anti-inflammatoire modérée et dose dépendante. En effet sur le modèle des

kératinocytes stimulés par l’ionophore calcique, le palmitate de -amyrine inhibe la

production de prostaglandines PG6KF1. Nous avons une réponse représentative à la

modulation de la voie des cyclooxygénases qui métabolise l’acide arachidonique.

De plus, le palmitate de -amyrine peut être extrait d’une suspension de culture

cellulaire, d’Apium graveolens (Umbelliferae) et Tabernaemontana divaricata (Apocynaceae)

[Dyas 1994]. Une transposition de la méthode à l’échelle industrielle peut par conséquent être

envisagée, puisque ce composé représente 33% des terpénoïdes totaux.

Par ailleurs, dans ce groupe des triterpènes acylés, nous avons pu isoler le coriolate de

-amyrine (Terp-6). Ce composé est nouveau dans le règne végétal, il n’a par conséquent pas

d’activité recensée. Cependant, l’acide coriolique isolé d’une culture de Pleurotus

pulmonarius possède une activité nématicide contre Caenorhabditis elegans (DL50 de 5-10

ppm) et antibactérienne contre Bacillus brevis et B. subtilis (CMI de 50 g/ml et 100 g/ml

166

respectivement) [Stadler 1994]. Il serait intéressant de savoir si le couplage -amyrine et

coriolate potentialise cet effet, ou fait apparaître d’autres propriétés ?

Le coriolate ou acide (9Z, 11E)-13-hydroxy-9,11-octadécadiènoïque est un acide gras

assez répandu dans le règne végétal au même titre que l’acide dimorphécolique (9Z, 11Z)

[Rama Rao 1985, Tallent 1966]. Cependant, c’est la première fois que ce type d’acide gras est

fixé à un triterpène.

Les flavonoïdes

La classe des flavonoïdes, est une classe très importante dans la famille des Leeaceae.

Le kaempferol et la quercétine que nous avons isolés sont déjà répertoriés dans la

famille. Ils sont connus pour avoir sensiblement les mêmes activités. Bon nombre de

publications font état de leur activité antiradicalaire. Nous avons montré cette même activité

par le test au DPPH. Par ailleurs, ces composés sont impliqués dans les processus

antimutagène et anticarcinogène. Aussi, il est bon de se rappeler qu’ils sont retrouvés dans

notre alimentation, nous retrouvons par exemple la quercétine dans l’oignon (284-486

mg/kg), le chou (110 mg/kg), et le kaempferol dans le chou (211 mg/kg) … [Hertog 1992].

La quercitrine et la méarnsitrine sont deux flavonols 3-O-rhamnosylé isolés pour la

première fois dans cette famille. La méarnsitrine est un flavonol rare dans le règne végétal.

Isolée pour la première fois de Acacia mearnsii (Fabaceae) [Mackenzie 1969], nous l’avons

recensé seulement dans 7 autres espèces : Landolphia kirkii (Apocynaceae) [Gabetta 1973],

Doliocarpus spraguei (Dilleniaceae) [Gurni 1981], Flemingia stricta (Fabaceae) [Rao 1983],

Lysimachia nummularia (Primulaceae) [Yasukawa 1990], Allophyllus edulis (Sapindaceae)

[Hoffmann-Bohm 1992], Myrcia multiflora (Myrtaceae) [Yoshikawa 1998] et enfin Syzygium

malaccense (Myrtaceae) [Noreen 1998].

Il n’est pas surprenant de trouver ce composé trisubstitué sur le noyau B, avec un méthoxy en

4’ et deux hydroxyles en 3’ et 5’. En effet, nous avons recensé sa génine, la myricétine, dans

5 Leea [Bates-Smith 1959, Umadevi 1991], et un dérivé de la myricétine rhamnosylé en

position 3, la myricitrine, chez Leea rubra [Yem Yok Siv 1971].

167

Toutefois, le groupe le plus intéressant que nous avons rencontré reste celui des

flavonoïdes sulfatés. C’est la première fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la

famille des Leeaceae. Son biotope est un argument pour ce type de constituants. Rappelons

que notre échantillon provient d’une espèce qui pousse dans une forêt à raphiales

marécageuses ou périodiquement inondées du Cameroun.

La quercitrine 3’-sulfate et la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-4 et Flav-6) sont

recensées pour la première fois dans le règne végétal.

La quercitrine 3’-sulfate (Flav-4) a fait l’objet d’une publication [Op de Beck 1998].

Avec la 3-glucuronyl-3’-sulfate de quercétine isolé de Hypericum elodes (Guttifrae) [Seabra

1988], la quercitrine 3’-sulfate est le deuxième flavonoïde sulfaté en position 3’ et possédant

une unité osidique en 3. On ne recense d’ailleurs que 9 flavonols qui sont à la fois sulfaté et

glycosylé.

C’est aussi la deuxième fois que l’on rencontre la quercétine 3,3’-disulfate (Flav-5).

Celle-ci a été isolée de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b]. Les génines

disulfatées sont rares, on en dénombre 8, dont 3 sont sulfatées sur la quercétine en [3,7],

[3,3’] et [3,4’].

En ce qui concerne la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-6), son intérêt est lié à la

position de ces groupements sulfates. En effet, d’après la littérature, on recense que 7

flavonols tri- ou tétra-sulfatés [Barron 1988a, Harborne 1994] (Tableau 10 p 45 ) :

- le kaempferol 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)),

- la quercétine 3,7,3’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),

- la quercétine 3,7,4’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),

- la quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),

- la quercétine 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)),

- la rhamnétine 3’-glucuronique-3,5,4’-trisulfate (Tamarix aphylla (Tamaricaceae)),

- l’isorhamnétine 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)).

Notre composé doit son originalité à la position des groupements sulfates (3, 3’ et 4’).

Généralement, les flavonoïdes trisulfatés ont toujours la position 7 sulfatée et si ce n’est pas

le cas, cette position n’est pas libre mais est le plus souvent méthoxylée (rhamnétine). La

sulfatation s’effectuant dans l’ordre 3>>7>4’>3’pour les flavonols (et 7>>3’>4’>6>8 pour les

flavones) (Varin 1992a).

168

En terme d’activité biologique, nous avons pu voir que les substitutions en 3, 3’ et 4’

par des sulfates diminuent considérablement l’activité antiradicalaire mesurée par le test au

DPPH et sont en accord avec la littérature. Le système ortho-dihydroxyl libre sur le cycle B

ainsi que l’hydroxyl libre en 3 sont indispensables pour l’activité anti-radicalaire. Cependant,

ces flavonols sulfatés mériteraient d’être testés sur l’aldose réductase du cristallin ou sur la

xanthine oxydase, qui rappelons-le, sont fortement inhibés par ce genre de composés. Il

semblerait même que les données biologiques au sujet des flavonoïdes fassent plus référence

à leurs dérivés sulfatés. De plus, l’hydrosolubilité des flavonoïdes sulfatés est d’un grand

intérêt pour envisager des applications biologiques pour lesquelles le problème de solubilité

est souvent une barrière importante. Il convient par contre d’être séléctif sur les positions à

sulfater.

L’intérêt général pour les flavonoïdes restent le domaine anti-inflammatoire. En

effet, ces composés sont impliqués dans plusieurs processus [Robak 1996] :

- Ils sont inhibiteurs d’enzymes (comme la lipoxygénase, la cyclooxygénase) ce

qui entraîne la diminution des produits de la cascade de l’acide arachidonique

(prostaglandines, leucotriènes…),

- Ils chélatent les ions métalliques, la chélation du Fe2+ empêche la réaction de

Fenton qui génère les radicaux oxygénés extrêmement réactifs (OH, O2-),

- Ils ont une action vitaminique P, veino-toniques, ils diminuent la perméabilité

capillaire.

Ce sont ainsi des agents thérapeutiques connus pour palier les problèmes

inflammatoires ou cardiovasculaires.

Les composés phénoliques

On retrouve particulièrement ces composés chez les Leea (nous avons recensé dans la

littérature les acides gentisique, p-hydroxybenzoïque, vanillique, syringique,

protocatéchuique et gallique). De ce fait, l’acide gallique a déjà été trouvé dans la famille, ce

qui n’est pas le cas pour le gallate d’éthyle.

169

Nous pourrions nous poser la question de savoir si ce dernier ne pourrait pas être un

artefact d’extraction ! En effet, l’extrait CH2Cl2 provient d’une extraction liquide-liquide

contre l’extrait hydroalcoolique de départ et obtenu à température ambiante (sur les feuilles

préalablement traitées à l’hexane et au dichlorométhane), puis concentré et lyophilisé.

Des travaux antérieurs ont montré que la formation de différents esters galliques peut

apparaître au cours du procédé d’extraction [Güven 1974]. Ainsi, en utilisant comme solvant

d’extraction l’éthanol, il y a formation de gallate d’éthyle, avec le méthanol, de gallate de

méthyle, et avec le propanol, de gallate de propyle.

L’analyse d’un extrait en CLHP couplée à la SM d’un extrait préparé à partir des

feuilles à l’aide d’un solvant approprié permettrait de lever ce doute.

Rappelons aussi, que les esters galliques sont utilisés depuis longtemps comme

additifs alimentaires. Ils servent d’agents antioxydants dans la prévention du rancissement des

graisses, il s’agit des additifs E310, E311 et E312 qui correspondent aux gallates de propyle,

octyle et lauryle respectivement.

Les extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux n’ont pas montré d’activité anti-

inflammatoire sur la voie des prostaglandines libérées par les kératinocytes. Mais d’après

l’usage en médecine traditionnelle et leurs fortes activités antiradicalaires, il serait intéressant

de poursuivre cette voie avec un modèle d’évaluation plus global. De même, la recherche de

l’activité cardiovasculaire est à rechercher.

Il apparaît aussi que les composés isolés ont contribué à l’étude phytochimique de la

famille. Il conviendrait cependant de faire une recherche plus large des constituants des

différentes espèces et partie de plante dans la famille des Leeaceae. L’étude des baies et des

fleurs pour rechercher la nature de leurs pigments ainsi que la recherche de flavonoïdes

sulfatés sont notamment à étudier.

170

ConclusionConclusion

171

CONCLUSION

Notre travail avait pour objet l’étude phytochimique et biologique de Leea guineensis

G. Don (Leeaceae).

Pour cela, un travail bibliographique a permis de situer la plante et la famille dans la

systématique moderne. Nous avons montré que les Leeaceae bien qu’ayant de très fortes

affinités avec les Vitaceae, ont suffisamment de caractères distinctifs pour être considérées

comme une famille monogénérique à part entière, elle-même appartenant à l’ordre des

Rhamnales.

Nous avons aussi pu remarquer que cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan

chimique que biologique. Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de

flavonoïdes, d’acides phénoliques et de tanins. L’utilisation en médecine traditionnelle

montre que le genre a des propriétés essentiellement calmante, astringente, anti-infectieuse,

anti-inflammatoire, antidysentérique et cardiovasculaire.

La découverte de flavonoïdes sulfatés dans Leea guineensis nous a conduit à effectuer

une mise à jour, et nous a permis de recenser, à ce jour, 134 flavonoïdes sulfatés, dont 32 sont

nouveaux dans le règne végétal, et d’ajouter 3 nouvelles familles renfermant ces produits.

Nos travaux personnels qui ont porté sur l’étude phytochimique et biologique de Leea

guineensis (Leeaceae) ont conduit à l’identification de 90 composés. 73 proviennent des

distillats de bois et de feuilles et 17 composés ont été isolés à partir des extraits hexanique,

dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles.

Ceux-ci ont été caractérisé par des analyses spectrales faisant appel au pouvoir

rotatoire, l’UV, la SM, et surtout la RMN 1D et 2D (COSY, COLOC, XHCORR).

On recense 7 terpénoïdes, 1 diterpène acyclique (E-phytol), 1 triterpène acyclique

(squalène), 2 triterpènes (lupéol et -amyrine), 3 triterpènes acylés (palmitate et coriolate de

-amyrine, palmitate d’-amyrine), tous nouvellement recensés dans la famille.

A ceux-ci, s’ajoute 9 polyphénols, dont 2 flavonols (kaempferol, quercétine) déjà

connus dans la famille, 2 flavonols glycosilés (quercitrine, méarnsitrine) et 3 flavonoïdes

sulfatés (quercétine 3,3’-disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate, quercitrine 3’-sulfate)

nouveaux dans la famille ainsi que 2 acides phénols (acide gallique, gallate d’éthyle). Seul ce

dernier est nouveau dans la famille avec l’acide gras (acide palmitique).

172

3 composés sont isolés pour la première fois du règne végétal, ce sont le coriolate de -

amyrine, la quercétine 3,3’,4’-trisulfate et la quercitrine 3’-sulfate. Ce dernier a fait l’objet

d’une publication [Op de Beck 1998].

Du point de vue phytochimique, nos travaux confirment la présence d’acides

phénoliques et de flavonols déjà rencontrés dans la famille des Leeaceae. Ceux-ci semblent

être importants pour la cohésion du genre Leea. C’est aussi un argument qui montre l’étroite

relation de cette famille avec les Vitaceae, et ce d’autant plus que nous avons caractérisé dans

le distillat des feuilles le vitispirane. Ce composé est très rare et se retrouve essentiellement

dans les composés volatils de jus de raisin et de distillat de vin.

Par ailleurs, nous avons pu identifier pour la première fois des composés volatils chez

les Leea par entraînement à la vapeur d’eau provenant des feuilles et du bois. La

caractéristique principale est que les distillats sont constitués en grande partie

d’hydrocarbures. Cette étude a fait l’objet d’une publication [Op de Beck soumis].

Mais c’est la première fois que l’on montre l’existence de terpénoïdes dans cette

famille. C’est aussi la première fois que l’on met en évidence la présence de flavonoïdes

sulfatés chez les Leeaceae. Ceci est un argument supplémentaire à l’heure actuelle pour

séparer les Leeaceae des Vitaceae.

En ce qui concerne les activités biologiques, nous avons montré que les extraits

EtOAc, BuOH et H2O des feuilles présentent une cytotoxicité à partir de 10 g/ml sur la

viabilité des kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H, une forte activité

antiradicalaire, mais n’ont pas d’activité anti-inflammatoire significative sur la production de

prostaglandines 6KF1 par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore

calcique. En revanche, le palmitate de -amyrine a, quant à lui, une activité anti-

inflammatoire dose dépendante (47% d’inhibition à 100 g/ml), il régule le métabolisme de

l’acide arachidonique, mais il ne semble pas agir sur l’expression de l’ARNm de la

collagénase MMP-1.

D’autre part, les flavonoïdes non sulfatés et les acides phénols sont de très bons

piégeurs de radicaux libres. Cette propriété en fait des candidats potentiels pour palier aux

problèmes impliqués dans le stress oxydatif (peroxidations lipidiques, vieillissement, désordre

cardiovasculaire, etc.).

173

Aussi, nos résultats, associés aux recherches antérieures, et l’intérêt croissant pour les

traitements utilisant la phytothérapie ces dernières années, ne peuvent qu’encourager à

poursuivre les investigations dans cette famille Leeaceae.

Cette famille mériterait bien de sortir des vrilles des Vitaceae !

174

BibliographieBibliographie

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AnnexeAnnexe ::

Matériels et méthodes

Fiches produits

Liste des noms usuels des flavones

Liste des noms usuels des flavonols

Liste des figures

Liste des tableaux

190

MATERIELS ET METHODES

I Lyophilisation

La lyophilisation a été effectuée sur les extraits aqueux, acétate d’éthyle et

butanolique, ainsi que pour des fractions aqueuses. Cependant, les extraits EtOAc et BuOH

ont été concentrés sous pression réduite, et repris progressivement à l’eau jusqu’à

l’élimination des solvants organiques. Les phases aqueuses sont alors congelées à –50°C et

lyophilisées sur les appareils USIFROID® et AIRLIQUID LY5®.

II Matériel Chromatographique

A) Chromatographie analytique en couche mince (CCM)

Les analyses sur plaque CCM sont réalisées en grande partie sur des plaques de silice

60 F254 (200x200x0,15 mm) sur feuilles aluminium (SDS). Plus rarement, nous avons utilisé

des plaques en verre (10x10 cm nano) HPTLC Diol F254, et RP18 F254 (Merck).

L’élution est adaptée en fonction des extraits ou composés analysés. La migration se

faisant dans des cuves de type Desaga Heildelberg.

Les révélateurs utilisés pour mettre en évidence les composés ont été la lumière UV

(254 et 366 nm), l’acide sulfurique dilué à 50% dans du MeOH avec observation sous UV

avant et après chauffage.

B) Chromatographie préparative

a) Chromatographie préparative sur couche mince (CCM prép)

Elles sont réalisées sur des plaques de verre (200 X 200 mm) préparées au laboratoire

avec de la silice 60 F254 (2,5-5 mm d’épaisseur) avec un dépôt d’échantillon inférieur de 10

mg à 30 mg selon l’épaisseur de la plaque.

191

Les plaques sont lavées par élution successive dans du cHex, MeOH et solvant

d’élution chromatographique avant de déposer l’échantillon. L’observation des bandes est fait

sous lampe UV (parfois avec révélation à l’acide d’un coté de la plaque).

b) Chromatographie sur colonne ouverte (CO)

L’appareillage utilisé est classique, cependant nous avons fait en sorte d’utiliser des

dimensions de colonne adéquate à la quantité d’échantillon à séparer (en général le poids de

support sec est de 50 fois celui de l’échantillon).

Plusieurs supports ont été utilisés

Charbon végétal (SDS®)

Silice 60 de granulométrie 63-200 m (SDS®)

Sephadex LH-20 (Pharmacia®)

Les fractions sont collectées et rassemblées si nécessaire après visualisation CCM.

c) Chromatographie sous vide (VLC)

Les échantillons sont déposés après empattage sur un gel de silice 60 placé dans un

verre fritté N°4.

d) Chromatographie liquide de type SPE (Visiprep ® )

Ce sont des colonnes prête à l’emploi sous forme de seringue commercialisé sous le

nom de Visiprep® et remplies par deux types de support différent : silice normale et en silice

greffée C18.

e) Chromatographie sur colonne moyenne pression (CLMP)

Les purifications sont réalisées sur silice (35-70 m) ou sur silice greffée RP-18 (40-

63 m) dans des colonnes Büchi®. La pression est fournie par une pompe moyenne pression

de type Büchi 688. Les colonnes utilisées dépendent de la complexité et de la masse de la

fraction à purifier. La sortie de colonne est couplée à un détecteur UV (Knauer®). La

192

détection se faisant pour la plupart du temps à 254 nm. Les solvants d’élution sont dégazés

avant utilisation.

C) Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Cette méthode a été utilisée avec un couplage à la spectrométrie de masse (SM) afin

d’analyser les composés volatiles des feuilles et du bois.

Ces analyses en CG/SM ont été réalisées à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de

Montpellier par le Pr. J.M. BESSIERE.

L’appareillage est constitué d’un chromatographe HP 5890 en phase gazeuse équipé d’un

détecteur d’ionisation de flamme et d’une colonne Optima 1 (Macherey-Nagel®) 25 m X 0,20

mm X 0,25 m, phase stationnaire polydiméthylsiloxane.

Le gaz vecteur est l’hélium avec un débit constant de 0,6 ml/min.

La température de l’injecteur est de 220°C, celle du détecteur de 250°C. La température de la

colonne est programmée à 50°C pendant 3 min puis augmente jusqu’à 250°C à raison de 3

°C/min.

Le volume d’injection est en général de 0,2 ml.

Le spectromètre de masse couplé est un HP 5791 à potentiel d’ionisation de 75 eV, de vitesse

de balayage de 1,1 s.décade-1 (réitérée dans tout le passage).

Les composés détectés sont présentés dans un tableau en fonction de leurs indices de rétention

de Kováts. Cet indice est établi en comparant le temps de rétention d’un composé à ceux des

deux hydrocarbures les plus proches.

I= 100 X lg[VI/VHi] / lg[VHi+1/VHi] + 100i

I est l’indice de rétention du composé I

Hi est le pic de l’hydrocarbure qui sort immédiatement avant celui du composé I et dont le

nombre d’atomes de carbone est i,

Hi+1 est le pic d’hydrocarbure qui sort immédiatement après celui du composé I.

193

III Méthodes chromatographiques

Toutes les fractions obtenues avec les différentes techniques chromatographiques, pour la séparation, les regroupements et l’isolement des composés ont été contrôlées par CCM.

A) Extrait hexanique – Purification des triterpènes

20 g de l’extrait Hex sont déposés sur une colonne ouverte de charbon (260 X 80 mm) et élués au CH2Cl2 par fractions de 500 ml. Les 3 premiers litres sont regroupés dans la fraction A et les 4 autres dans la fraction B.

Chromatographie de A (9,64g) sur CLMP Si (460 X 70 mm, fractions 500 ml)

Solvants FractionscHex CHCl3 MeOH100 0 0 1-290 10 3-480 20 5-670 30 7-1060 40 11-1250 50 13-1440 60 15-1630 70 17-1820 80 19-2010 90 21-220 100 23-24

Après contrôle CCM et regroupement, la fraction [3] donne Terp-5 (1 g) ; les fractions [4-9] purifiées de nouveau sur CCMprép Si (cHex-EtOAc 9:1) conduisent à Terp-7 (6 mg) ; les fractions [11-15] donnent Aa et la fraction [16-19] Ab.

Chromatographie de Aa (760 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions 20 ml)

Solvants FractionscHex CHCl3

7 3 1-206 4 21-40

Le regroupement de [16-20] conduit à Aaa.

Chromatographie de Aaa (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)

Solvants FractionsMeOH CHCl3

9 1 1-158 2 16-25

Les fractions [14-21] rassemblées conduisent à Aaaa.

194

Chromatographie de Aaaa (30 mg) de nouveau sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)


90 10 1-685 15 7-1580 20 16-21

Les fractions [11-14] conduisent à Terp-6 (9 mg).

Chromatographie de Ab (744 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions 20 ml)

Solvants FractionscHex CHCl3

7 3 1-106 4 11-205 5 21-40

La fraction [30] conduit à Aba.

Chromatographie de Aba (45 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)


9 1 1-108 2 11-30

La fraction [5] conduit à Terp-1 (20 mg) ; les fractions [9-10] à Terp-4 (20 mg) et les fractions [11-12] à Abaa.

Chromatographie de Abaa (6 mg) sur CCMP Si (CHCl3-MeOH 9:1) qui conduit à Terp-3 (1mg).

Chromatographie de B (3,5 g) sur CLMP Si (460 X 70 mm, fraction 40 ml jusqu'à la fraction 186, après fractions de 100 ml)

Solvants FractionscHex CHCl3 MeOH100 0 0 1-3695 5 37-5590 10 56-7580 20 76-9470 30 95-11365 35 114-17460 40 175-18650 50 187-19140 60 192-19620 80 197-2010 100 202-205

50 50 206-209

195

Le regroupement, des fractions [86-119] conduit à Terp-5 (500 mg) et les fractions [206-207] à Ba.

Chromatographie de Ba (200 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)


9 1 1-168 2 17-27

La fraction [14-18] permet d’obtenir Baa.

La chromatographie de Baa (11 mg) sur Visiprep Si avec un gradient cHex-EtOAc, conduit à Terp-3 (9 mg).

5 g d’extrait cHex sont déposés sur une CO Si (400 X 25 mm), et élué au CHCl3. Les 2 premières fractions de 15 ml conduisent à C.

Chromatographie de C (250 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fraction 15 ml)


70 30 1-1965 35 20-

Les fractions [6-7] sont rassemblées et donnent Ca et purifiées sur CCMprép Si (cHex) pour avoir Terp-2 (25 mg).

B) Extrait dichlorométhane – Purification de polyphénols

6 g de l’extrait CH2Cl2 sont chromatographiés par VLC sur verre fritté (60 X 130 mm, fractions de 1 L).

Solvants FractionscHex CH2Cl2 MeOH100 0 0 170 30 250 50 330 70 40 100 5

70 30 650 50 730 70 8

La fraction [6] conduit à A et la fraction [7] à B.

Chromatographie de A (850 mg) sur CO sephadex LH-20 (300 X 70 mm), éluée par CHCl3-MeOH (50:50), fractions de 20 ml.

Les fractions [21-28] conduisent à Aa, et les fractions [34-41] à Ab.

196

Chromatographie de Aa (530 mg) sur CO charbon (70 X 55 mm, fraction 50 ml)

Solvants FractionsCHCl3 MeOH10 0 1-109 1 11-20

Après regroupement, les fractions [11-25] conduisent à Aaa.

Chromatographie de Aaa (460 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 20 ml)

Solvants FractionsCH2Cl2 EtOAc10 0 1-109 1 11-208 2 21-307 3 31-40

Les fractions [9-10] correspond à AGr-1 (30 mg) ; les fractions [15-19] à Aaaa et les fractions [20-24] à Aaab.

Chromatographie de Ab (30 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml)

Solvants FractionsH2O MeOH6 4 1-105 5 11-20

Les fractions [6-10] conduisent à AcPh-2 (4 mg) et la fraction [16] à Aba.

Chromatographie de B (140 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 100 ml)

Solvants FractionsCHCl3 MeOH10 0 19 1 2-4

La fraction [2] conduit à Ba, les fractions [3-4] à Bb.

Chromatographie de Bb (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm), avec un mélange isocratique MeOH-H2O (50:50), fractions de 20 ml. Les fractions [7-9] conduisent à Bba.

Chromatographie de Bba (20 mg) sur CO Sephadex LH-20 (320 X 50 mm), élué au MeOH, fraction de 50 ml. Les fractions [1-3] donnent Bbaa et [8-11] Bbab.

Les fractions Aba et Bbab sont regroupées et chromatographiée sur CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5) pour donner Flav-7 (5 mg).

C) Extrait à l’acétate d’éthyle – Purification de polyphénols

197

10 g de l’extrait EtOAc sont chromatographiés sur CLMP Si (460 X 70 mm), fractions de 500 ml.

Solvants FractionsEtOAc MeOH100 0 1-1490 10 15-2880 20 29-3670 30 37-44

Les fractions [7-16] après regroupement mènent à A, la fraction [19] correspond à Flav-1 (36 mg), les fractions [23-28] à B et les fractions [29-37] à C.

Chromatographie de A (420 mg), sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 100 ml)


Les fractions [5-6] conduisent à Aa ;

Chromatographie de Aa (50 mg) sur CO Sephadex LH-20 (190 X 10 mm) et éluée dans un mélange isocratique CHCl3-MeOH (1:1 ), fractions de 10 ml. Les fractions [4-6] conduisent à Ac Ph-1 (25 mg).

Chromatographie de B (580 mg) sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 250 ml)

Solvants FractionsH2O MeOH100 0 1-390 10 4-680 20 7-1170 30 12-1465 35 15-1760 40 18-2450 50 25-3145 55 32-35

La fraction [4] conduit à Ac Ph-1 (30 mg), les fractions [21-22] à Ba, les fractions [29-30] à Bb et les fractions [31-35] à Bc.

Chromatographie de Ba (70 mg) sur 2 CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5 v:v:v), donne Flav-3 (20 mg) et Flav-4 (30 mg).

Chromatographie de Bb (20 mg) sur CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5), donne Flav-3 (6 mg) ;

Chromatographie de Bc (150 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 X 60 mm), élution MeOH, fractions de 20 ml. La fraction [3] donne Flav-3 (10 mg), et la fraction [4] Flav-2 (50 mg).

198

Chromatographie de C (1 g) sur CLMP C-18 (460 X 70 mm, fractions 100 ml)


Les fractions [6-11] conduisent à Ca (30 mg) qui donne après CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5), Caa qui est purifiée sur Visiprep C-18 pour donner Flav-4 (8 mg).

D) Extrait butanolique – Purification des flavonoïdes

2 g de l’extrait BuOH sont chromatographiés sur VLC Si (130 X 60 mm, fractions 500 ml)

Solvants FractionsCH2Cl2 MeOH80 20 160 40 2-350 50 440 60 5-720 80 8

Les fractions [2-5] donnent A, et les fractions [6-9] donnent B.

Chromatographie de A (500 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 x 60 mm), fractions 20 ml, élution MeOH. La fraction [3] conduit à Flav-4 (6 mg), la fraction [4] donne Flav-5 (20 mg) et les fractions [5-8] donnent Aa.

Chromatographie de Aa sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fraction 20 ml)

Solvants FractionsH2O MeOH100 0 1-1090 10 11-2080 20 21-3070 30 31-40

Les fractions [16-19] donnent Flav-6 (6 mg) et les fractions [22-38] donnent Flav-5 (3 mg).

Chromatographie de B (800 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 X 60 mm) et éluée au MeOH, fractions 100 ml. Les fractions [5-7] conduisent à Ba.

199

Chromatographie de Ba (80 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 100 ml)


Les fractions [3-5] donnent Baa.

Chromatographie de Baa (15 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)


Les fractions [7-9] conduisent à Flav-6 (3 mg).

E) Extrait aqueux – Purification de flavonoïdes

4 g de l’extrait H2O sont chromatographiés sur VLC Si (130 X 60 mm), fractions de 500 ml.

Solvants FractionsCH2Cl2 MeOH H2O20 80 0 10 100 2-3

80 20 4

La fraction [2] correspond à Flav-5 (6 mg), et les fractions [3-4] donnent A.

Chromatographie de A (380 mg) sur CLMP C-18 (230 X15 mm, fractions 100 ml)

Solvants FractionsH2O MeOH100 0 1-495 5 5-1090 10 1-1780 20 18-2370 30 24-2860 40 29-3340 60 34-4220 80 43-48

Les fractions [24-29] donnent Aa, les fractions [31-37] conduisent à Flav-5 et les fractions [38-43] à Flav-2.

Chromatographie de Aa (30 mg) sur CO Sephadex LH-20 (320 X 50 mm) et éluée au MeOH, fractions de 100 ml. Les fractions [20-22] correspondent à Flav-6 (11 mg).

200

IV Mesures spectrales

A) Spectres UV

Les spectres sont enregistrés sur un spectrophotomètre U-2000 (Hitachi®). En général

les spectres sont enregistrés dans le MeOH avec ajout de réactifs spécifiques préparés selon

Mabry [1970].

B) Spectres de masse (SM)

Plusieurs techniques ont été employées : impact électronique (EI), désorption et

ionisation chimique (DCI), matrice NH3+isobutane, bombardement par atomes accélérés

(FAB), matrice glycérol. Les spectres sont enregistrés sur un spectromètre de masse

quadripolaire R 210C couplé à un ordinateur IPC (P2A) MSCAN WALLIS. Les spectres sont

réalisés par le Dr BOSSO (service de spectrométrie de masse du Centre d’Etude et de

Recherche sur les Macromolécules Végétales CERMAV - Grenoble).

C) Spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN)

Les spectres RMN sont enregistrés pour la plupart sur un appareil Bruker AC 200 de

l’UFR de Pharmacie de Grenoble, dont la fréquence nominale du proton est de 200,13 MHz

et celle du carbone 13 de 50,03 MHz. Quelques spectres ont été enregistrés sur un appareil

Bruker AMX 400 (400,13 MHz proton 100,61 MHz carbone 13) (Laboratoire de biophysique

du Centre de Recherche du Service de Santé des Armées CRSSA - Grenoble), sur unappareil

Bruker 500 MHz à Reims, ou sur un 300 MHz (C.E.A. de Grenoble).

Les mesures sont réalisées dans les solvants deutériés suivant : CDCl3, CD3OD,

DMSO-d6 ou D2O. Les valeurs de déplacements chimiques, en ppm, sont exprimées par

rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS).

D) Mesure du pouvoir rotatoire []

Les [] (c = 0,2) sont mesurés sur un polarimètre Perkin Elmer®, de type PE-341,

contre la raie D du sodium à 589 nm à 20,0°C, dans une cuve de 1 ml et de 10 cm de

longueur au laboratoire de Chimie organique de l’UFR de Pharmacie.

201

V Méthodes chimiques

A) Recherche de tanins

50 mg d’extrait EtOAc, BuOH, H2O sont placés respectivement dans un ballon de 100

ml avec 15 ml H2O distillé et 7 ml du réactif de Stiasny (mélange formol-HCl 2:1 v:v). Les

ballons sont portés à ébullition 30 min. L’apparition d’un précipité rouge indique la présence

de tanins condensés. La solution refroidie est filtrée sur papier. Le filtrat recueilli est saturé en

acétate de sodium. Par ajout de quelques gouttes de fer, la solution se colore en bleu-noir,

indiquant la présence de tanins hydrosolubles.

B) Recherche d’alcaloïdes

20g de feuilles sèches sont mouillées dans 25ml de NH4OH aqueux à 20%. Puis, on

ajoute 200ml d’acétate d’éthyle et on laisse macérer 24H. Après lixiviation, les marcs sont

épuisés par trois fois 100ml d’EtOAc. Cette phase EtOAc est extraite à trois reprises par

H2SO4 à 5%. La phase acide est alors alcalinisée par NH4OH jusqu’à pH = 8 puis est extraite

à trois reprise par du CHCl3. La phase chloroformique est rincée à l’eau distillée jusqu’à pH =

7, filtrée sur Na2SO4 et concentrée. De cet extrait (20mg), la mise en évidence des alcaloïdes

par les réactifs classiques de Dragendorff et de Mayer s’avère négative.

C) Recherche de saponines

L’extrait butanolique a la propriété de former après agitation, une mousse persistante

qui signe la présence de saponosides. Or, la présence de tanins et de polysaccharides dans cet

extrait peut être à l’origine de faux positifs. Pour le vérifier, l’extrait butanolique sec a été

repris dans 500ml d’eau distillée et épuisé, trois fois, par 1L de butanol saturé en H2O. Cette

phase butanolique concentrée (4g) est reprise dans un minimum d’eau (30ml). Une

précipitation est alors effectuée par ajout d’acétone (500ml). Sur CCM, la fraction soluble et

le précipité ne montrent pas la présence de saponines, après révélation à l’acide (H2SO4 50%

dans EtOH).

D) Hydrolyse du palmitate -amyrine

50 mg de palmitate -amyrine sont hydrolysés par une solution de KOH à 5% dans

l’EtOH, à reflux pendant 2H. Une extraction au CHCl3 permet d’obtenir 9,4 mg -amyrine.

La phase alcaline est alors acidifiée par ajout de quelques gouttes d’HCl 1N. Une nouvelle

extraction au CHCl3 conduit à l’obtention de 2,5 mg d’acide palmitique.

202

VI Tests biologiques

A) Evaluation des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité cellulaire

Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse)Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et CutanéeLaboratoire de Biologie CellulairePar Mme M.-F. ARIES

Matériel :

Hotte à flux d’air laminaire vertical / GELAIRE® BSB 4A Labo FWWIncubateur à CO2 / Hereaus type B 5060 EK/CO2

Centrifugeuse CRKR BECKMAN®

Microscope inversé Nikon®

Microspectrophotomètre MULTISKAN®

Flacons de culture CORNING®

Plaques de culture 96 puits NUNCLON® DeltaPipettes automatiques de distribution (GILSON® - MICROMAN® / BIOHIT – PROLINE®)Pointes stériles (GILSON® – MICROMAN® Capillaires et Pistons / TREFF)Tubes à centrifuger 50ml : Réf 132593 – 73660 NUNC POLYLABO®

Matériel biologique:

Lignée cellulaire de kératinocytes humains SVK14

Réactifs :

Milieu de culture MEM : Réf 041-01095 M / GIBCO BRLMilieu de culture DMEM sans rouge de phénol : Réf 041-01880M / GIBCO BRLSDS : Sodium dodécyl sulfate : Réf 13760-1000 / MERCKSVF : Sérum de veau fœtal : réf 013967 EUROBIOTampon phosphate PBS sans Ca++ : réf 076-01300N / GIBCO BRLXTT : Sodium 3,3[1[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium bis(4-methoxy-6-nitro)] benzene sulfonic acid hydrate : Réf X4251 / SIGMACoenzyme Q : Réf D9150 / SIGMATrypsine EDTA : Réf 043.05300M / GIBCO BRL

Produits testés :

Extrait à l’acétate d’éthyleExtrait butanoliqueExtrait aqueux

Les produits ont été testés aux concentrations suivantes : 0,01 g/ml, 0,1 g/ml, 1 g/ml, 10 g/ml et 100 g/ml.

203

Selon les échantillons, une solution mère est préparée dans le DMSO à 1 g/ml ou directement dans le milieu de culture à 1 mg/ml.Toutes les dilutions sont réalisées dans le milieu de culture à 1% de SVF.

Protocole :

Le protocole suivi est celui décrit par : Neal W. ROEHM et al., Journal of Immunological Methods, 142, (1991), 257-265.

Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d’un sel de tétrazolium, le XTT, en un produit coloré, le formazan.Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le formazan dosable par spectrométrie à 450 nm.

Protocole opératoire :

La lignée cellulaire SVK 14 est cultivée dans du MEM avec 10% de SVF.

t-18H :

Ensemencement des cellules à raison de 1,5.104 cellules par puits sous un volume de 100 l de milieu de culture à 10% de SVF. Incubation à 37°C durant 18H en présence d’une atmosphère saturée en H2O et à 5% de CO2.

T=0 :

Elimination du milieu de culture et rinçage des microplaques à l’aide de 100 l de PBS par puits.Introduction des différentes concentrations d’échantillons sous un volume de 100 l de milieu de culture avec 1% de SVF.Incubation à 37°C pendant 48H.

T+48H :

Révélation de la viabilité cellulaire,Elimination des surnageants de culture.Rinçage des microplaques à l’aide de 100 l de PBS par puits.Introduction de 50 l par puits d’une solution de XTT (0,5 mg/ml) en présence de coenzyme Q (40 g/ml).Incubation de 3H à 37°C en atmosphère saturée en H2O et avec 5% de CO2.Arrêt de la métabolisation du XTT en ajoutant 100 l par puits d’une solution de SDS à 10%.Lecture de la densité optique au spectrophotomètre Multiskan à 450 nm.

204

B) Activité du palmitate de -amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la production de prostaglandine 6KF1 par les kératinocytes humains

Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse)Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et CutanéeLaboratoire de Biologie CellulairePar Mmes M.-F. ARIES et C. VAISSIERE

Matériel biologique :

Lignée cellulaire : kératinocytes humains SVK14Plaques de culture 6 puits : 30 mm de diamètre

Réactifs :

Milieu de culture MEM : Réf GIBCO 041-01095 MTampon phosphate PBS pH 7,4 : réf GIBCO 076-01300 NTrypsine EDTA : réf GIBCO 043.05300 MSérum de veau fœtal (SVF) : réf DUTSCHER 300121Enzyme Immuno Assay (EIA) System :EUROMEDEXIonophore calcique A23187 SIGMA : réf C7522

Produits testés :

extrait à l’acétate d’éthyleextrait butanoliqueextrait aqueuxpalmitate de -Amyrine (OPA 77C)

Protocole :

- La suspension de kératinocytes (1x106 cellules/2ml) dans le MEM 10% SVF est distribuée

dans les plaques 6 puits (1x106 cellules/puits) et incubée pendant 16 heures à 37°C dans une atmosphère à 5% CO2. Les kératinocytes sont alors rincés avec du PBS pour éliminer les

cellules non-adhérentes puis exposés aux produits à tester inclus dans du MEM sans SVF (qui pourrait interférer dans le dosage).

- Selon les extraits, une solution mère à 1 g/ml d’échantillon est préparée dans le DMSO ou directement dans le milieu de culture à 1 mg/ml. Des dilutions sont réalisées dans du MEM sans SVF.Les extraits sont testés en culture aux concentrations 0,1, 1 et 5 g/ml.

- Le palmitate de -Amyrine est solubilisé dans du DMSO à 200 mg/ml. Une solution mère à 500µg/ml est ensuite préparée dans le MEM sans SVF.L’échantillon est testé en culture aux concentrations de 10, 50 et 100 µg/ml.

Ces concentrations ont été choisies après un test de cytotoxicité et qui n’a révélé aucune toxicité.

205

Pour chaque lot, 3 puits sont réalisés. Les cellules sont pré-incubées pendant 60 mn avec le produit à tester puis un agent stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, l’ionophore calcique (A23187 à 5µM), est ajouté pendant 5 heures.Ce temps écoulé, les milieux de culture de chaque puits sont récupérés, centrifugés à 3000 tr/mn et conservés à -80°C.

La production de prostaglandine 6KF1 pour chacun des essais est mesurée par le Kit Elisa EUROMEDEX.

Les lots suivants ont été réalisés :

- Lot témoin- Lot témoin stimulé A23187 5µM- Extrait acétate d’éthyle 0,1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait acétate d’éthyle 1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait acétate d’éthyle 5 µg/ml + A23187 5µM

- Extrait butanolique 0,1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait butanolique 1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait butanolique 5 µg/ml + A23187 5µM

- Extrait aqueux 0,1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait aqueux 1 µg/ml + A23187 5µM- Extrait aqueux 5 µg/ml + A23187 5µM

- palmitate de -amyrine 10 µg/ml + A23187 5µM- palmitate de -amyrine 50µg/ml + A23187 5µM- palmitate de -amyrine 100µg/ml + A23187 5µM

C) Activité du palmitate de -amyrine sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1

Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse)Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et CutanéeLaboratoire de Biologie CellulairePar Mmes A. BEL et M. CHARVERON

Cellules :

Des fibroblastes humains normaux sont isolés à partir de biopsies cutanées issues de plasties mammaires et cultivés dans du milieu de culture DMEM (Gibco- Ref : 41965-039), supplémenté en sérum de nouveau-né (SNN) (10%) et en antibiotiques Pénicilline/Streptomycine (P/S) (1%).

206

Réactifs et Matériel:

Milieu de culture DMEM (Gibco - Réf : 41965-039)Sérum de nouveau-né (Gibco - Réf : 16010084)Trypsine EDTA (Gibco - Réf : 043-05300)Tampon phosphate (PBS) pH 7,4 : (Gibco - Réf : 076-01300)Phorbol 12-Meristate 13-Acetate (PMA) (Sigma - Réf : P8139)Boîte de culture 60mm (Falcon - Réf : 3004)Kit extraction RNA-PLUS (Bioprobe - Réf : RNAPO2)Kit Access RT-PCR System (Promega - Réf : A1250)Agarose (Promega - Réf : V312A)Bromure d’ethidium (Sigma - Réf : E8751)

Echantillon testé :

palmitate de -amyrine

Protocole :

A confluence, les fibroblastes humains normaux sont décollés à l’aide de la trypsine et sont réensemencés dans des boîtes de 60 mm à un taux d’ensemencement de 0,8x106 cellules dans du DMEM avec 10% SNN, 1% P/S. Les cellules sont incubées pendant 18 heures à 37°C, 5% CO2, atmosphère humide. Les cellules, ici à passage P4, sont ainsi prêtes pour les tests.

Le palmitate de -amyrine est testé à la concentration finale de 100g/ml. Dans du DMEM, 1% SNN et 1% P/S, concentration déjà testée en activité anti-inflammatoire et présentant des propriétés anti-inflammatoires significatives. Les cellules sont préincubées avec les actifs pendant 24 heures. Un témoin est réalisé en parallèle ne contenant que du DMEM avec 1% SNN et 1% P/S. Au bout de 24 heures, les cellules sont rincées au PBS et sont alors mises en contact pendant 24 heures supplémentaires avec la stimulation inflammatoire chimique (PMA à 0,1M), préparée dans du DMEM avec 1% SNN et 1% P/S. En parallèle, un témoin absolu est réalisé n’ayant reçu aucune stimulation inflammatoire. En fin de stimulation, les ARN totaux sont extraits.

Extraction des ARN totaux :L’extraction se fait à l’aide du kit RNA PLUS suivant le protocole indiqué. Les cellules sont lysées par la solution d’extraction du kit, puis les ARN sont extraits par des traitements successifs au chloroforme, à l’éthanol 75% et l’isopropanol. L’ARN est récupéré et dosé par spectrométrie.

RT-PCR :1g d’ARN totaux est utilisé pour la réaction de RT-PCR. A cet ARN est ajouté un mélange de dNTP, d’enzymes Reverse transcriptase et DNA Polymérase, de MgSO4 25mM, de tampon, issu du kit Access RT-PCR System (Promega) et les deux amorces. Celles-ci, issues de la séquence de la MMP-a pour la réaction d’hybridation, sont les suivantes :

amorce 5’ : 5’ CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA 3’amorce 3’ : 5’ AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT 3’

207

Après amplification, les divers échantillons sont déposés dans un gel d’agarose 3% soumis à un champ électrique. En fin de migration, le gel préalablement coloré au bromure d’ethidium est observé sous UV.

D) Mesure d’une activité antiradicalaire

Matériel :

Spectrophotomètre U-2000 (Hitachi) pour les extraitsLecteur de plaques 96 puits pour les composésMicroplaque 96 puits Seroawe Réf : 612F96

Réactifs :

DPPH (radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) : Réf 43180 / Fluka®

TROLOX (acide 6-hydroxy-2,5,8-tetramethylchromane-2-carboxylique, dérivé de la vitamine E) : Réf 56510 / Fluka®

Produits testés :

Extrait EtOAcExtrait BuOHExtrait H2OAcide galliqueGallate d’éthyleKaempferolQuercétineQuercitrineQuercitrine 3’-sulfateQuercétine 3,3’-disulfateQuercétine 3,3’,4’-trisulfate

Les extraits sont testés dans le MeOH à une concentration de 20 mg/L. Les composés quant à eux, ont été testés dans le MeOH aux concentrations suivantes : 200, 100, 50, 10 et 2 M.

Protocole :

-Pour les extraits, le protocole suivi est celui de : Fourneau C. et al., Phytotherapy Research, 10, (1996), 529-530.

L’évaluation de l’activité antioxydante est évaluée en ajoutant 2 ml d’une solution de DPPH (0,25 mmole/L dans MeOH) à 2 ml d’une solution de l’échantillon (20 mg/L dans MeOH). Après agitation, on laisse reposer 1H à l’obscurité puis on mesure à 521 nm contre le MeOH. La dégradation du DPPH est évaluée par comparaison avec l’échantillon standard (2ml de DPPH et 2 ml de MeOH). Il est procédé à trois mesures par échantillon.

-Pour les composés testés, nous ajoutons dans les plaques 96 puits, 100 l de la solution à analyser et 100 l de solution de DPPH à 0,5 mM dans le MeOH (le témoin est effectuer avec

208

100 l de MeOH et 100 l de solution de DPPH). Après agitation, on place la plaque à l’obscurité à TA pendant 30 min, puis on lit l’absorbance à 550 nm. Nous avons procédé à 3 mesures par échantillon.

Les mesures sont effectuées après 30 min, temps au bout duquel l’activité est maximale et stable.Le résultat est exprimé en pourcentage de dégradation du DPPH :

% de dégradation du DPPH = 1- X 100

209

VII FICHES

Terp-1 (E-phytol)

CH2OH

3

1

2711

15

PM = 296 C20H40O

Comportement chromatographique :

CCM SiO2 cHex-EtOAc (9:1 v:v) Rf=0,18

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz :

1H: 5,39 (H-2, 1H, tq, J=1,2 et 6,9 Hz), 4,13 (H-1, 2H, d, J=6,9 Hz), 1,97 (H-4, 2H, t, J=7,4 Hz), 1,65 (Me-3, 3H, sl), 1,53 (H-15, 1H, hept, J=6,4 Hz), 0,85 (H-16 et Me-15, 6H, d, J=6,5 Hz), 0,83 (Me-7 et Me-11, 6H, d, J=6,3 Hz)

13C: 140,3 (C-3), 123,1 (C-2), 59,5 (C-1), 39,9 (C-4), 39,4 (C-14), 37,4 (C-8, C-10 et C-12), 36,7 (C-6), 32,8 (C-7 et C-11), 28,0 (C-15), 25,2 (C-5), 24,8 (C-13), 24,5 (C-9), 22,7 (C-16 et Me-15), 19,8 (Me-7 et Me-11), 16,2 (Me-3)

Données SM DCI (NH3+ isobutane), mode négatif

m/z : 314 [M+NH4]+, 297 [M+H]+, 296 [M+NH4-H2O]+, 279 [M-H2O+H]+, 123 (C9H15

+), 97 (C7H13+), 85 (C5H9O+), 83 (C6H11

+), 81 (C6H9+)

210

Terp-2 (squalène)

2

6 10

15

19 23

PM = 410 C30H50


CCM SiO2 cHexane Rf=0,6CCM C-18 MeOH-CHCl3 (70:30 v:v) Rf=0,6


1H: 5,10 (H-3, H-22, H-7, H-11, H-14, H-18, m), 2,1-2,0 (H-4, H-21, H-8, H-17), 2,05-1,95 (H-12, H-13), 2,0-1,9 (H-5, H-9, H-16, H-20), 1,66 (Me-1 et Me-24, s, 6H), 1,58 (Me-2, Me-23, Me-6, Me-10, Me-15 et Me-19, 18H, s)

13C (J modulé): 135,10 (C, C-6, C-19), 134,89 (C, C-10, C-15), 131,22 (C, C-2,C-23), 124,42 (CH, C-3, C-22), 124,31 (CH, C-7, C-11, C-14, C-18), 39,75 (CH2, C-5, C-9, C-16, C-20), 28,28 (CH2, C-12, C-13), 26,79 (CH2, C-4, C-21), 26,70 (CH2, C-8, C-17), 25,67 (CH3, Me-1, Me-24), 17,66 (CH3, Me-2, Me-23), 16,03 (CH3, Me-6, Me-10, Me-15, Me-19)

Données SM DCI (NH3 + isobutane):

m/z : 428 [M+NH4]+, 411 [M+H]+, 428 [M+H]+, 342 [M-C5H9+H]+

, 274 [M-C10H17+H]+

, 206 [M-C15H25+H]+, 138 [M-C20H33+H]+

, 70 [M-C25H41+H]+

211

Terp-3 (lupéol)

PM = 426 C30H50O


CCM SiO2 cHexane-EtOAc (70:30 v:v) Rf=0,5


1H: 4,67 (H-29a, 1H, dl, J=2,5 Hz), 4,55 (H-29b, 1H, dd, J=2,5 et 1,2 Hz), 3,18 (H-3, 1H, dm, J=10 Hz), 2,34 (H-19, 1H, m), 1,66 (Me-30, 3H, sl), 1,01 (Me-27, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,89 (Me-28, 3H, s), 0,85 (Me-26, 3H, s), 0,74 (Me-24, 3H, s)

13C (J modulé) : 151,0 (C-20), 109,3 (C-29), 79,0 (C-3), 55,4 (C-5), 50,5 (C-9), 48,4 (C-18), 47,8 (C-19), 43,0 (C-17), 42,8 (C-14), 40,8 (C-8), 40,0 (C-22), 38,8 (C-4), 38,7 (C-1), 38,1 (C-13), 37,2 (C-10), 35,6 (C-16), 34,3 (C-7), 29,7 (C-21), 28,0 (C-23), 27,5 (C-2, C-15), 25,2 (C-12), 21,0 (C-11), 19,4 (C-30), 18,4 (C-6), 18,0 (C-28), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26), 15,4 (C-24), 14,5 (C-27)


m/z : 444 [M+NH4]+, 427 [M+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 394 [M-H2O-Me+H]+, 218 (g), 207 (a), 203 (g-15), 190 [a-OH+H]+, 136, 135, 121

212

Terp-4 (-amyrine)

PM = 426 C30H50O


CCM SiO2 cHexane - CHCl3 (5:5 v:v) Rf=0,08cHexane - EtOAc (9:1 v:v) Rf=0,22


1H: 5,17 (H-12, 1H, t, J=3,6 Hz), 3,21 (H-3, 1H, dd, J=5,4 et 9,9 Hz), 2,1-1,0 nd, 1,12 (Me-27, 3H, s), 0,98 (Me-26, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,85 (Me-29 et Me-30, 6H, s), 0,82 (Me-28, 3H, s), 0,78 (Me-24, 3H, s)

13C (J modulé): 145,2 (Q C-13), 121,7 (CH C-12), 79,0 (CHOH C-3), 55,2 (CH C-5), 47,7 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,9 (CH2 C-19), 41,7 (Q C-14), 39,8 (Q C-8), 38,8 (Q C-4), 38,6 (CH2 C-1), 37,2 (CH2 C-22), 37,0 (Q C-10), 34,8 (CH2 C-21), 33,3 (CH3 C-29), 32,7 (CH2 C-7), 32,5 (Q C-17), 31,1 (Q C-20), 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 27,3 (CH2 C-2), 27,0 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 26,0 (CH3 C-27), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 18,4 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-26), 15,6 (CH3

C-24 et C-25)


m/z : 427 [M+H]+, 412 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (g’-29, a-18)

213

Terp-5 (palmitate de -amyrine)

PM = 664 C46H80O2


CCM SiO2 cHexane- CHCl3(50:50 v:v) Rf=0,6cHexane-CH2Cl2-EtOAc (75:20:5 v:v:v) Rf=0,45

CCM C-18 MeOH-CHCl3 (70:30 v:v) Rf=0,63

Pouvoir rotatoire

[] = +58° (c 0,2, CHCl3)


1H: 5,16 (H-12, 1H, t, J=3,5 Hz), 4,49 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 8,3 Hz), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,5 Hz), 2,2-1,2 nd, 1,11 (Me-27, 3H, s), 0,95 (Me-25 et Me-24 ou Me-26, 6H, s), 0,85 (Me-23, Me-24 ou Me-26, Me-28, Me-29 et Me-30, 15H, sl), 0,81 (Me-16’, 3H, s)

13C (J modulé) : 173,5 (COO C-1’), 145,2 (C C-13), 121,7 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 55,3 (CH C-5), 47,6 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,8 (CH2 C-19), 41,7 (C C-14), 39,8 (C C-8), 38,3 (CH2 C-1), 37,7 (C C-4) 37,8, 37,2 (CH2 C-22), 36,9 (C C-10), 34,8 (CH2 C-21 et C-2’), 33,3 (CH3 C-29), 32,6 (CH2 C-7), 32,5 (C C-17), 31,9 (CH2 C-14’), 31,1 (C C-20), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4, 29,3, 29,2, 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 26,9 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 25,9 (CH3 C-27), 25,2 (CH2 C-3’), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 23,5 (CH2 C-2), 22,7 (CH2 C-15’), 18,3 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,5 (CH3 C-25), 14,1 (CH3 C-16’)

Données SM

DCI (NH3 + isobutane):m/z : 682 [M+NH4]+, 665 [M+H]+, 650 [M-CH3+H]+, 409 [M-palm+H]+, 256 (palmitoyl), 239 (palm-OH), 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (a-18 et g’-29)EIm/z : 664 [M].+

214

Terp-6 (coriolate de -amyrine)

PM = 704 C48H80O3


CCM SiO2 cHexane - EtOAc (9:1 v:v) Rf=0,22

Données UV (CH2Cl2) et pouvoir rotatoire :

max = 236 nm[] = +32° (c 0,2, CHCl3)


1H: 6,47 (H-11’, 1H, dd, J=11,2 et 15,1 Hz), 5,95 (H-10’, 1H, dd, J=11,1 et 11,4 Hz), 5,65 (H-12’, 1H, dd, J=15,2 et 8,2 Hz), 5,48 (H-9’, 1H, dd, J=11,5 et 7,5 Hz), 5,16 (H-12, 1H, t, J=3,5 Hz), 4,49 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 8,2 Hz), 4,11 (H-13’, 1H, m), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,3 Hz), 2,1-1,0 nd, 1,12 (Me-27, 3H, s), 0,98 (Me-26, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,85 (Me-29 et Me-30, 6H, s), 0,82 (Me-28, 3H, s), 0,78 (Me-24, 3H, s)

13C (J modulé) : 173,6 (COO C-1’), 145,2 (C C-13), 135,8 (CH C-12’), 133,0 (CH C-11’)°, 127,7 (CH C-10’)°, 125,8 (CH C-9’), 121,7 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 72,9 (C C-13’), 55,3 (CH C-5), 47,6 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,8 (CH2 C-19), 41,7 (C C-14), 39,8 (C C-8), 38,3 (CH2, C-1), 37,8 (C C-4), 37,3 (CH2 C-22), 36,9 (C C-10), 34,8 (CH2 C-21 et C-2’), 33,3 (CH3 C-29), 32,6 (CH2 C-7), 32,5 (C C-17), 31,1 (C C-20), 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 27,0 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 26,0 (CH3 C-27), 25,3 (CH2 C-3’), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 23,5 (CH2 C-2), 22,6 (CH2 C-17’), 18,3 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,5 (CH3

C-25), 14,0 (CH3 C-18’)° interchangeable


m/z : 722 [M+NH4]+, 705 [M+H]+, 690 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 295 (C18H31O3

+), 279 (C18H31O2+), 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (g’-29, a-18), 167,

71 (C4H9+)

215

Terp-7 (palmitate d’-amyrine)

PM = 664 C46H80O2


CCM SiO2 cHexane- CHCl3(50:50 v:v) Rf=0,6CCM C-18 MeOH-CHCl3 (50:50 v:v) Rf=0,5

Pouvoir rotatoire :

[] = +53° (c 0,2, CHCl3)


1H: 5,11 (H-12, 1H, t, J=3,6 Hz), 4,48 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 9,6 Hz), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,5 Hz), 2,2-0,80 nd

13C (J modulé) : 173,6 (COO C-1’), 139,8 (C C-13), 124,4 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 59,1 (CH C-18), 55,3 (CH C-5), 47,7 (CH C-9), 42,1 (C C-14), 41,6 (CH2 C-22), 40,1 (C C-8), 39,6 (CH C-19 et C-20), 38,5 (CH2 C-1), 37,7, 37,8 (C C-4), 36,8 (C C-10), 34,9 (CH2 C-2’), 33,8 (C C-17), 32,9 (CH2 C-7), 31,9 (CH2 C-14’), 31,3 (CH2 C-21), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4, 29,3 (CH2 C-15), 29,2, 28,7 (CH3 C-23), 28,1 (CH3 C-28), 26,6 (CH2 C-16), 26,2, 25,2 (CH2 C-3’), 23,7 (CH2 C-2), 23,4 (CH2 C-11), 23,3 (CH3 C-27), 22,7 (CH2 C-15’), 21,4 (CH3 C-30), 18,3 (CH2 C-6), 17,5 (CH3 C-29), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,7 (CH3 C-25), 14,1 (CH3 C-16’)

Données SM

DCI (NH3 + isobutane):m/z : 682 [M+NH4]+, 665 [M+H]+, 409 [M-palm+H]+, 256 (palmitoyle), 218 (g’)

216

Flav-1 (kaempferol)

PM = 286 C15H10O6


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,8

Données UV (MeOH) :

max = 265 et 365 nm respectivement bande II et I+NaOAc 274, 302,5, 389, +NaOAc+H3BO3 269, 375, +NaOMe 278, 415déc, +AlCl3

268, 352, 427, +AlCl3+HCl 268,5, 350,5, 427

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz :

1H: 12,46 (OH-5, s), 10,73 (OH-7, s)°, 10,06 (OH-3, s)°, 9,33 (OH-4’, s)°, 8,03 (H-2’et H-6’, 2H, dd, J=2,6 et 8,9 Hz), 6,91 (H-3’ et H-5’, 2H, dd, J=2,7 et 8,9), 6,43 (H-8, d, J=2,0), 6,18 (H-6, d, J=1,9)° interchangeable

13C: 175,9 (C-4), 163,8 (C-7), 160,7 (C-5), 159,1 (C-4’), 156,1 (C-9), 146,8 (C-2), 135,6 (C-3), 129,4 (C-2’ et C-6’), 121,6 (C-1’), 115,4 (C-3’ et C-5’), 103,0 (C-10), 98,1 (C-6), 93,4 (C-8)

Données SM FAB: matrice glycérol, mode négatif

m/z : 285 [M-H]-

217

Flav-2 (quercétine)

O

OH

HO

OH O

OH

OH

3

5

9

10

3'

4'

PM = 302 C15H10O7


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,75EtOAc-AcCOOH-HCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v) Rf=0,9BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v) Rf=0,8


max = 255 et 369 nm respectivement bande II et I+NaOAc 267,5, 322,5, 389,5 déc, +NaOAc+H3BO3 259, 386, +NaOMe 252, 325 déc, +AlCl3 271, 339, 456, +AlCl3+HCl 268,365, 429


1H: 12,46 (OH-5), 10,76 (OH-7)°, 9,55 (OH-3)°, 9,30 (OH-4’)°, 9,26 (OH-3’)°, 7,66 (H-2’, d, J=1,8 Hz), 7,53 (H-6’, dd, J= 8,4 et 2,0 Hz), 6,87 (H-5’, d, J=8,5 Hz), 6,40 (H-8, d, J=1,7 Hz), 6,17 (H-6, d, 1,6 Hz)° interchangeable

13C: 175,8 (C-4), 163,6 (C-7), 160,7 (C-5), 156,1 (C-9), 147,8 (C-4’), 146,7 (C-2), 145,0 (C-3’), 138,6 (C-3), 121,9 (C-1’), 119,9 (C-6’), 115,5 (C-5’), 114,9 (C-2’), 102,9 (C-10), 98,1 (C-6), 93,3 (C-8)

Données SM

DCI (NH3+ isobutane), mode négatifm/z : 303 [M+H]+

FAB: matrice glycérol, mode négatifm/z : 301 [M-H]-

218

Flav-3 (quercitrine)

PM = 448 C21H20O11


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,65BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) Rf=0,75EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v) Rf=0,75


max = 255 et 347,5 nm respectivement bande II et I+NaOAc 270,5, 369, +NaOAc+H3BO3 259,5, 365, +NaOMe 269,5, 388,5, +AlCl3 273,5, 383, 429,5, +AlCl3+HCl 270, 399,5, HCl 255, 350

Pouvoir rotatoire :

[] = -158° (c 0,2, MeOH)


1H: 12,64 (OH-5), 10,83 (OH-7)°, 9,66 (OH-4’)°, 9,29 (OH-3’)°, 7,29 (H-2’, d, J=1,9 Hz), 7,24 (H-6’, dd, J=2,2 et 8,4 Hz), 6,86 (H-5’, d, J=8,3 Hz), 6,38 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,20 (H-6, d, 2,0 Hz), 5,24 (Rha-1, d, 1,1 Hz), 3,96 (Rha-2, sl), 3,50 (Rha-3, dd, J=3,1 et 8,6 Hz), 3,29-3,21 (Rha-4, nd), 3,21-3,08 (Rha-5, nd), 0,81 (Rha-6, d, J=5,5 Hz) ° interchangeable

13C: 177,7 (C-4), 164,1 (C-7), 161,2 (C-5), 157,2 (C-9), 156,4 (C-2), 148,4 (C-4’), 145,1 (C-3’), 134,2 (C-3), 121,0 (C-6’), 120,7 (C-1’), 115,8 (C-5’), 115,4 (C-2’), 104,0 (C-10), 101,8 (Rha-1), 98,6 (C-6), 93,6 (C-8), 71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-3), 70,3 (Rha-2), 70,0 (Rha-5), 17,4 (Rha-6)

Données SM

DCI (NH3+ isobutane), mode négatifm/z : 449 [M+H]+, 303 [M-Rha+H]+, 164 (Rha)FAB: matrice glycérol, mode négatifm/z : 447 [M-H]-, 301 [M-Rha-H]-

219

Flav-4 (quercitrine 3’-sulfate)

PM = 527 C21H19O14S


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,4BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) Rf=0,6EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v) Rf=0,5


max = 265 et 342 nm respectivement bande II et I+NaOAc 268, 344, +NaOAc+H3BO3 269, 342, +NaOMe 272, 324, 392, +AlCl3 273, 357, 395, +AlCl3+HCl 274, 341, 389,5, HCl 256, 355

Pouvoir rotatoire :

[] = -10° (c 0,2, MeOH)


1H: 12,59 (OH-5), 10,83 (OH-7), 9,62 (OH-4’), 7,76 (H-2’, d, J=2,0 Hz), 7,52 (H-6’, dd, J=2,3 et 8,5 Hz), 6,96 (H-5’, d, J=8,1 Hz), 6,39 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,20 (H-6, d, J=2,1 Hz), 5,20 (Rha-1, sl), 3,98 (Rha-2, sl), 3,55 (Rha-3, m), 3,1 (Rha-4, nd) 3,3-3,0 (Rha-5, nd), 0,80 (Rha-6, d, J=5,7 Hz)

13C: 177,6 (C-4), 164,2 (C-7), 161,2 (C-9), 156,7 (C-5), 156,4 (C-2), 151,7 (C-4’), 140,7 (C-3’), 134,5 (C-3), 125,6 (C-6’), 123,0 (C-1’), 120,8 (C-2’), 117,0 (C-5’), 104,1 (C-10), 102,0 (Rha-1), 98,7 (C-6), 93,6 (C-8), 71,4 (Rha-4), 70,6 (Rha-3), 70,1 (Rha-2 et Rha-5), 17,4 (Rha-6)


m/z : 527 [M-H]-, 447 [M-SO3-H]-, 300 [M-SO3-Rha-H]-

220

Flav-5 (quercétine 3,3’-disulfate)

O

OSO3-

HO

OH O

OSO3-

OH

910

3'

4'

3

5

PM = 462 si 2H (506 si 2Na) C15H10O13S2


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,15BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v) Rf=0,38


max = 268 et 342 nm respectivement bande II et I+NaOAc 275, 307s, 387 +NaOAc+H3BO3 268, 349, +NaOMe 275, 328s, 398, +AlCl3 276, 308s, 364, 396s, +AlCl3+HCl 277, 349, 395s, HCl 255, 369


1H: 8,04 (H-6’, dd, J=2,3 et 8,6 Hz), 7,85 (H-2’, d, J=2,1 Hz), 6,87 (H-5’, d, J=8,7 Hz), 6,39 (H-8, d, J=2,1 Hz), 6,16 (H-6, d, J=2,1 Hz)

13C: 177,6 (C-4), 163,9 (C-7), 161,2 (C-5), 156,0 (C-9), 155,7 (C-2), 151,8 (C-4’), 140,5 (C-3’), 132,5 (C-3), 126,9 (C-6’), 123,0 (C-1’), 121,6 (C-2’), 116,8 (C-5’), 104,1 (C-10), 98,4 (C-6), 93,3 (C-8)


m/z : 499 [M+K-2H]-, 483 [M+Na-2H]-, 461 [M-H]-, 403 [M-SO3+Na-2H]-, 381 [M-SO3-H]-, 301 [M-2SO3-H]-

221

Flav-6 (quercétine 3,3’,4’-trisulfate)

PM = 542 (si 3H) C15H10O16S3


CCM SiO2 BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v) Rf=0,1


max = 268 et 311 nm respectivement bande II et I+NaOAc 275, 356 +NaOAc+H3BO3 268, 313, +NaOMe 276, 360, +AlCl3 279, 307s, 389, +AlCl3+HCl 277, 337, HCl 325, 368


1H: 8,12 (H-2’, d, J=2,2 Hz), 8,03 (H-6’, dd, J=2,2 et 8,9 Hz), 7,59 (H-5’, d, J=8,9 Hz), 6,33 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,16 (H-6, d, J=2,0 Hz)

13C: 177,6 (C-4), 162,8 (C-7), 160,2 (C-5), 154,8 (C-9), 147,5 (C-2), 145,3 (C-4’), 141,7 (C-3’), 132,1 (C-3), 123,5 (C-1’), 122,5 (C-6’), 118,5 (C-2’), 117,4 (C-5’), 103,0 (C-10), 97,3 (C-6), 92,0 (C-8)


m/z : 655 [M+3K-4H]-, 617 [M+2K-3H]-, 585 [M+2Na-3H]-, 563 [M+Na-2H]-, 541 [M-H]-, 499 [M-SO3+K-2H]-, 461 [M-SO3-H]-, 381 [M-2SO3-H]-, 301 [M-3SO3-H]-

222

Flav-7 (méarnsitrine)

PM = 478 C22H22O12


CCM SiO2 BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) Rf=0,80EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v) Rf=0,75


max = 263 et 337,5 nm respectivement bande II et I+NaOAc 271,5, 360, +NaOAc+H3BO3 264, 330, +NaOMe 272, 361, +AlCl3 272,5, 300s, 337, 391, +AlCl3+HCl 273, 338,5, 389


1H: 12,56 (OH-5), 11,9 (OH-7), 9,46 (OH-3’, OH-5’), 6,82 (H-2’ et H-6’, s, 2H), 6,37 (H-8, d, J=2,1 Hz), 6,20 (H-6, d, 2,0 Hz), 5,13 (Rha-1, d, 1,5 Hz), 3,98 (Rha-2, sl), 3,72 (4’-OMe, s, 3H), 3,5-3,0 (Rha-3, Rha-4 et Rha-5, nd), 0,79 (Rha-6, d, J=5,4 Hz)

13C: 150,7 (C-4’), 108,1 (C-2’ et C-6’), 102,1 (Rha-1), 98,2 (C-6), 93,2 (C-8), 71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-3), 70,3 (Rha-2), 70,1 (Rha-5), 59,8 (4’-OMe), 17,5 (Rha-6)

Données RMN en ppm dans CD3OD

13C: 179,6 (C-4), 166,2 (C-7), 160,0 (C-2), 158,7 (C-9), 151,9 (C-3’ et C-5’), 139,4 (C-4’), 136,7 (C-3), 127,1 (C-1’), 109,8 (C-2’ et C-6’), 103,7 (Rha-1), 100,0 (C-6), 94,9 (C-8), 73,3 (Rha-4), 72,1 (Rha-5° et Rha-3°), 71,9 (Rha-2°), 60,9 (4’-OMe), 17,8 (Rha-6)° interchangeable, C-5 et C-10 non déterminé

Données SM

DCI (NH3+ isobutane), mode négatifm/z : 479 [M+H]+, 333 [M-Rha+H]+, 180, 164 (Rha), 152

223

Ac Ph-1 (Acide gallique)

PM = 170 C7H6O5


CCM SiO2 EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) Rf=0,7CHCl3-MeOH-H2O (60:40:3 v:v:v) Rf=0,6BAW (4:1:5 v:v:v) Rf=0,8

DIOL Hexane-EtOAc (30:70 v:v) Rf=0,4C-18 H2O (100 v) Rf=0,7


max = 271,5 et 215,0 nm

Données RMN en ppm dans CD3OD à 200 (50) MHz :

1H: 7,05 (H-2 et H-6, s)

13C : 170,4 (C-1’), 146,4 (C-3 et C-5), 139,6 (C-4), 122,0 (C-1), 110,3 (C-2 et C-6)

Données SM DCI (NH3+ isobutane)

m/z : 188 [M+NH4]+, 171 [M+H]+, 153 [M-H2O+H]+

224

Ac Ph-2 (gallate d’éthyle)

PM = 198 C9H10O5


CCM SiO2 CHCl3-MeOH (9:1 v:v:) Rf=0,3


max = 273,5 et 215,5


1H: 7,01 (H-2 et H-6, 2H, s), 4,24 (H-2’, 2H, q, J=7 Hz), 1,31 (H-3’, 3H, t, J=7 Hz)

13C: 168,6 (C-1’), 146,5 (C-3 et C-5), 139,7 (C-4), 121,8 (C-1), 110,0 (C-2 et C-6), 61,7 (C-2’), 14,6 (C-3’)

Données SM EI

m/z : 198 [M].+, 170 (M-C2H5)+, 153 (M-COOEt)+

225

AG-1 (acide palmitique)

PM = 256 C16H32O2


CCM SiO2 CHCl3-MeOH (9:1 v:v:) Rf=0,8


1H: 2,33 (H-2, 2H, t, J=7,3 Hz), 1,7-1,0 (CH2, nd), 0,86 (H-16, 3H, t, J=7 Hz)

13C: 175,6 (C-1), 33,7 (C-2), 32,0 (C-3 ou C-14), 29,7-29,1 nd, 24,7 (C-15), 22,7, 14,1 (C-16)

Données SM EI

m/z : 256 [M].+, et pertes successives de 14 uma

226

VIII Liste des noms usuels pour les flavones

Nom OH OMe C-GlucApigénine 5,7,4’Hispiduline 5,7,4’ 6Lutéoline 5,7,3’,4’Chrysoériol 5,7,4’ 3’Diosmétine 5,7,3’ 4’6-hydroxylutéoline 5,6,7,3’,4’Népétine 5,7,3’,4’ 6Nodiflorétine 5,6,7,4’ 3’Jaceosidine 5,7,4’ 6,3’Hypolaétine 5,7,8,3’,4’Tricétine 5,7,3’,4’,5’Tricine 5,7,4’ 3’,5’Vitexine 5,7,4’ 8Isovitexine 5,7,4’ 6Orientine 5,7,3’,4’ 8Iso-orientine 5,7,3’,4’ 6Isoscutellaréine 5,7,8,4’

IX Liste des noms usuels pour les flavonols

Nom OH OMeKaempferol 3,5,7,4’Kaempferide 3,5,7 4’Rhamnocitrine 3,5,4’ 3’6-hydroxykaempferol 3,5,6,7,4’Quercétine 3,5,7,3’,4’Rhamnétine 3,5,3’,4’ 7Isorhamnétine 3,5,7,4’ 3’Tamarixétine 3,5,7,3’ 4’Rhamnazine 3,5,4’ 7,3’Ombuine 3,5,3’ 7,4’Myricétine 3,5,7,3’,4’,5’Patulétine 3,5,7,3’,4’ 6Eupatolitine 3,5,3’,4’ 6,7Spinacétine 3,5,7,4’ 6,3’Jacéidine 5,7,4 3,6,3’Véronicafoline 3,5,4’ 6,7,3’Eupatine 3,5,3’ 6,7,4’Quercétagétine 3,5,6,7,3’,4’Gossypétine 3,5,7,8,3’,4’

227

X Liste des figures

Page

Figure 1 : Différents types de graines de Vitaceae et Leeaceae 9Figure 2 : Situation dans la systématique de Leea guineensis G. Don 10Figure 3 : Répartition géographique des Leea 16Figure 4 : Représentation de Leea guineensis 17Figure 5 : Feuille de L. guineensis provenant du Cameroun 20Figure 6 : Répartition géographique de L. guineensis 21Figure 7 : Schéma d’une stipule de L. guineensis 22Figure 8 : Représentation de L. guineensis 23Figure 9 : Diagramme floral 25Figure 10 : Les structures chimiques identifiées chez différentes Leea 30Figure 11 : Anthocyanes sulfatées isolées de Badiana stricta (Iridaceae) 41Figure 12 : Dihydroflavonol sulfaté isolé de Myrica rubra (Myricaceae) 41Figure 13 : Structure des nouvelles flavones sulfatées 44Figure 14 : Structure des nouveaux flavonols sulfatés 47,48Figure 15 : Modèle biosynthétique pour les flavonoïdes sulfatés chez Flaveria 53Figure 16 : Métabolisation des polyols 58Figure 17 : Extraction solide – liquide des feuilles 67Figure 18 : Extraction liquide – liquide 67Figure 19 : Isolement des composés de l’extrait hexanique

68Figure 20 : Isolement des composés de l’extrait dichlorométhane 69Figure 21 : Isolement des composés de l’extrait acétate d’éthyle 70Figure 22 : Isolement des composés de l’extrait butanolique 71Figure 23 : Isolement des composés de l’extrait aqueux 72Figure 24 : Profils chromatographiques des composés volatiles de bois et de feuilles 73Figure 25 : Répartition des différentes classes de constituants des distillats 76Figure 26 : Quelques exemples de spectres SM obtenus 78,79Figure 27 : Spectre 1H de Terp-1(200 MHz, CDCl3) 80Figure 28 : Fragmentation du squalène 83Figure 29 : Spectre 1H de Terp-2 (200 MHz, CDCl3) 83Figure 30 : Spectre 13C J modulé de Terp-2 (50 MHz, CDCl3) 84Figure 31 : XHCORR de Terp-2 (CDCl3) 85Figure 32 : Spectre DCI de Terp-3 87Figure 33 : Fragmentations classiques d’un squelette de type lupane 88Figure 34 : Fragmentations classiques du squelette oléanène 89Figure 35 : Spectre 1H de Terp-4 (200 MHz, CDCl3) 90Figure 36 : Spectre EI de Terp-5 92Figure 37 : Fragmentations de Terp-5 92Figure 38 : Spectre 1H de Terp-5 (200 MHz, CDCl3) 93Figure 39 : Spectre 13C de Terp-5 (50 MHz, CDCl3) 94Figure 40 : Corrélations COSY de Terp-5 94Figure 41 : Spectre DCI de Terp-6 96Figure 42 : Fragmentations de Terp-6 96Figure 43 : Spectre 1H de Terp-6 (200 MHz, CDCl3) 97

228

Figure 44 : Agrandissement du spectre 1H de Terp-6 (500 MHz, CDCl3) 98Figure 45 : Agrandissement de la COSY de Terp-6

99Figure 46 : Spectre 13C J modulé de Terp-6 (50 MHz, CDCl3) 99Figure 47 : Spectre 13C J modulé de Terp-7 (50 MHz, CDCl3) 101Figure 48 : Spectre 1H de Flav-1 (200 MHz, DMSO-d6) 104Figure 49 : Spectre 1H de Flav-2 (200 MHz, DMSO-d6) 106Figure 50 : Spectre 13C de Flav-2 (50 MHz, DMSO-d6) 106Figure 51 : Spectre 1H de Flav-3 (200 MHz, DMSO-d6) 108Figure 52 : Spectre 13C de Flav-3 (50 MHz, DMSO-d6) 109Figure 53 : Spectre FAB- de Flav-4 110Figure 54 : Spectre 1H de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 111Figure 55 : Spectre 13C de Flav-4 (50 MHz, DMSO-d6) 112Figure 56 : Spectre XHCORR de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 113Figure 57 : Spectre COSY de Flav-4 (DMSO-d6) 114Figure 58 : Spectre FAB- de Flav-5 115Figure 59 : Spectre 1H de Flav-5 (200 MHz, DMSO-d6) 116Figure 60 : Spectre 13C de Flav-5 (50 MHz, DMSO-d6) 117Figure 61 : Spectre FAB- de Flav-6 118Figure 62 : Spectre 1H de Flav-6 (200 MHz, DMSO-d6) 119Figure 63 : Spectre 13C de Flav-6 (100 MHz, DMSO-d6) 120Figure 64 : Spectre 1H de Flav-7 (300 MHz, DMSO-d6) 121Figure 65 : Spectre 13C de Ac Ph-1 (50 MHz, CD3OD) 125Figure 66 : Spectre 1H de Ac Ph-2 (200 MHz, CD3OD) 127Figure 67 : Spectre EI de AG-1 128Figure 68 : Métabolisation du XTT en formazan 130Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des

kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H 132Figure 70 : Activité du palmitate de -amyrine sur la production de prostaglandine 6KPGF1

par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 M 135Figure 71 : Activité des extraits sur la production de prostaglandine 6KPGF1 par

les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 M 135Figure 72 : Effet du palmitate de -amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1

à la suite d’une stimulation inflammatoire 138Figure 73 : Principales réactions dans l’organisme 139Figure 74 : Activité antiradicalaire des différents extraits à 20 mg/ml 141Figure 75 : Activité antiradicalaire des composés isolés 141

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XI Liste des tableaux

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Tableau 1 : Classement taxonomique du genre Leea 6Tableau 2 : Situation des Leeaceae dans la systématique moderne

7Tableau 3 : Différences essentielles entre les Leeaceae et les Vitaceae 8Tableau 4 : Classification selon Clarke (1881) 11Tableau 5 : Classification selon Kirtikar et Basu (1975) 12Tableau 6 : Criblage de quelques Leea 27Tableau 7 : Principaux métabolites secondaires identifiés des différentes Leea 29Tableau 8 : Différentes activités biologiques décrites pour le genre Leea 38Tableau 9 : Les flavones sulfatées 42Tableau 10 : les flavonols sulfatés 45Tableau 11 : Répartition des flavonoïdes sulfatés chez les Magnoliophyta 50Tableau 12 : Caractéristiques des flavonols sulfotransférases (F-ST) de Flaveria

53Tableau 13 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs l’aldose réductase du cristallin obtenus

Par synthèse 58Tableau 14 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin isolé

de Polygonum hydropiper 59Tableau 15 : Activité comparée de la rutine et de la rutine sulfate 60Tableau 16 : Rendements d’extraction 66Tableau 17 : Composés volatils de bois et de feuilles de L. guineensis 75Tableau 18 : données RMN de Terp-1 (200/50 MHz, CDCl3) 82Tableau 19 : données RMN de Terp-2 (200/50 MHz, CDCl3) 86Tableau 20 : Données RMN 1H des méthyles de Terp-4 (200 MHz, CDCl3) 90Tableau 21 : Différences essentielles entre le noyau oléan-12-ène et urs-12-ène 91Tableau 22 : Récapitulatif des données 13C des triterpènes et de leurs esters 102Tableau 23 : Effet de la sulfatation en 3’ sur Flav-4 112Tableau 24 : Effet de la sulfatation en 3,3’ de Flav-5 117Tableau 25 : Effet de la sulfatation en 3,3’,4’ de Flav-6 119Tableau 26 : RMN 1H des flavonoïdes (200 MHz, DMSO-d6) 123Tableau 27 : RMN 13C des flavonoïdes (50 MHz, DMSO-d6) 123Tableau 28 : UV des flavonoïdes (max dans MeOH) 124Tableau 29 : SM des flavonoïdes en FAB (mode négatif, matrice glycérol) 124Tableau 30 : Données RMN des Acides Phénols (200/50 MHz, CD3OD) 127Tableau 31 : Taux de viabilité des kératinocytes en culture après 48H d’incubation

avec les extraits 131Tableau 32 : Production de prostaglandines 6KF1 avec Terp-5 134Tableau 33 : Production de prostaglandines 6KF1 avec les extraits 134Tableau 34 : Pourcentage de dégradation du DPPH par les composés testés 140Tableau 35 : Différents composés rencontrés chez les Rhamnales 145Tableau 36 : Liste des terpénoïdes isolés et de leurs propriétés biologiques 146Tableau 37 : Liste des polyphénols isolés et de leurs propriétés biologiques 147

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etude phytochimique et biologique de leea guinensis (leeaceae)

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