BIOCHIMIE, 1977 , n ° 59, 6 4 5 - 6 4 8 . Br6ves communications

des l tude du mdtabolisme 6nergdtique

mitochondries hdpatiques de rats carencds en vitamine

P a u l HIGUERET et H e n r i GARCIN O * .

Laboratoire de Physiologie de la Nutr i t ion , Avenue des Facultds, 33405 Talence Cedex.

(30-3-1977).

A.

S u m m a r y . - - We have s tudied the r e s p i r a t o r y m e t a b o l i s m of l iver m i t o e h o n d r i a in cont ro l and v i t a m i n A-deficient ra ts . The a n i m a l s used were w e a n l i n g male *Wistar r a t s and the inves t iga t ions made as soon as the g r o w t h of the deficient r a t s s topped (at the beg inn ing of the p l a t eau of ~veight), a f te r a p p r o x i m a t e l y 10-11 weeks of deficient diet, before the onse t of ocu la r lesions.

Using a po l a rog raph i e t echn ique (oxygraph , Gi lson Medical Electronics) and succinate as s u h s t r a t e we note in the l iver m i t o c h o n d r i a of v i t a m i n A-deficient r a t s a more i m p o r -

F~ ADP t an t up take of O,, at s tate 4 and a s m a l l e r - - " ra t io a n d . - - ~ ra t io as compa r ed to

- E~ O contro ls . In the v i t a m i n A-deficient r a t s the ATPase act iv i ty of the m i t o e h o n d r i a is g rea te r wh i l e th i s act ivi ty af te r DNP p r e i n c u b a t i o n is sma l l e r as compa r ed to cont ro ls . These func t i ona l pecu l ia r i t i es led us to specula te t ha t in the l iver m i t o c h o n d r i a of v i t a m i n A-deficient r a t s there are increased oxygen e o n s u l n p t i o n s and impa i r e d oxidat ive p h o s p h o r y l a t i o n efficiencies.

These modif ica t ions are supp re s sed by the add i t ion of bovine s e r u m a l b u m i n e in to the i ncuba t i on m ed i um . The m a j o r p a r t of the r e su l t s can be ascr ibed to the t hy ro ida l s t a tus of the a n i m a l s : 'we indicated in a n o t h e r s tudy tha t the v i t a m i n A-deficient ra t is hype r thy ro id ic .

INTRODUCTION.

De n o m h r e u s e s modi f ica t ions md tabo l iques on t dtfi ddcrites chez les r a t s carencbs en v i t am i ne A : p lu s g rande c o n s o m m a t i o n d 'oxyg6ne de l ' a n i m a l in toto [11, p lus g rande p roduc t ion de cha l eu r [2], p lus grande c o n s o m m a t i o n d 'oxyg6ne pa r des f r a g m e n t s de d i a p h r a g m e [3] et des h o m o g 6 n a t s de foie [4], mod i - f ications de l 'activit6 d ' enzymes des m i t o c h o n d r i e s h6pa t iques [5]. Ces modi f ica t ions on t fair soupgonne r l ' exis tence au n iveau des m i t oehond r i e s de ces an i - maux , et en pa r t i cu l i e r au n iveau des m i t ochond r i e s h6pa t iques , de ddeouplages en t re les oxyda t ions et les p h o s p h o r y l a t i o n s . Or les rdsu l t a t s ob t enus au cours de l 'btude du m d t a b o l i s m e r e sp i r a to i r e ne son t pas nn ivoques . En effet, si pou r J o h n s o n et Wol f [6], Lyvbovick et GrimahLk [71, G oube rn [81, le r ap-

P por t ~ n ' e s t pas affectd pa r la carence, p o u r Seward et

coll. [9] la carence, c o m m e d ' a i l l eu r s l ' h y p e r v i t a m i - nose A, en t ra ine une d i m i n u t i o n de ce r appor t .

La mul t ip l ic i t6 des condi t ions exp6 r i m en t a l e s (6tat phys io log ique des a n i m a u x carencds, mode d ' a l i m e n - ra t ion des a n i m a u x tdmoins , t e chn iques de mesu re ) peut 8tre h l 'o r ig ine des divergences observdes. C'est pou rquo i , il nous a semhld i n td r e s san t de r e p r e n d r e cette dtude en nous p lagan t darts des condi t ions expd- r i m e n t a l e s r i g o u r e n s e s : a n i m a u x dtudids h u n s tade b ien ddfini de la carence (en ddbut de p la teau de poids) et m e s u r e s de c o n s o m m a t i o n d 'oxyg6ne (r6alisdes se lon

(*) Avec la co l l abo ra t i on t echn ique de J a n i n e Bon- mor t .

O A qui route co r r e spondanee doit 6tre adressde.

les t echn iques mode r ne s d 'oxygraph ie ) compldtdes pa r des m e s u r e s d 'aet ivi td ATPas ique . P a r a i l leurs , s u r les m~mes ra ts , nous avons dosd la t h y r o x i n d m i e et les rdsu l t a t s de ees m e s u r e s [10] cons t i t uen t un i m p o r - t an t dl6ment de d iscuss ion .

MATERIEL ET METHODES.

A n i m a u x .

Cctte e x p S r i m e n t a t i o n a 6t6 rdalisde s u r des r a t s tomes de souche W i s t a r A.F. pr i s au sevrage dans u n dlevage d ' a n i m a u x E.O.P.S. (Evic-Ceba 33290 Blanque- for t ) . Dbs leur arr ivde au l abora to i re , les a n i m a u x (~gds de 2I j o u r s et pesan t 30-40 g) sour placds p a r cage de 5 dans l ' an ima le r i e ( t empdra tu re 21°C, dclai- rage n a t u r e d et reqoivent , ad l ib i tum, u n rdgime semi- syn thd t ique mix te h 18 p. cent de casdine ddpourvu de v i ta in ine A [ l l J . I ts sont pes6s q u o t i d i e n n e m e n t et, apr6s 3 s ema ines de ce r6gime, r~par t i s en 2 lo ts auss i homog6nes que poss ib le : u n lot de r a t s ¢ careneds >> et u n lot de r a t s << tdmoins >>. I ls reqoivent ddsormais , t o u j o u r s ad l ib i lum, u u rdgime s e m i - s y n t h d t i q u e mix t e h 15 p. cent de casdine, sans v i t amine A p o u r les caren- c~s, avec env i ron 250 U.I. de v i t a m i n e A (v i tamine A h y d r o s o l n b I e HOFFMANN LA ROCHE) p a r j o u r et pa r a n i m a l p o u r les t6moins . Deux s ema ines p lus t a rd les a n i m a u x sont placds en cages h m d t a b o l i s m e indi- viduel les . I ls sont pesds q u o t i d i e n n e m e n t et les me- sures effectudes l o r sque les earencds son t en ddbut de p l a t eau de poids aux env i rons de 250 g (les t~moins , du mSme hue, pbsent a lors env i r on 300 g). Dans nos condi t ions expdr imen ta l e s le p l a t eau de poids des ca- renc~s a p p a r a i t apr6s une dizaine de s ema ines de rd-

646 P. Higueret et H. Garcin.

g i m e a lo r s que l e u r s iug6r6s s o n t t r6s v o i s i n s de eeux des t d m o i n s et q u ' i l n ' y a p a s de s y m p t 6 m e s c l i n i q n e s p a r t i c u l i e r s ( n o t a m m e n t p a s de t r o u b l e s o e n l a i r e s a p p a r e n t s ) .

Prdparation des mitochondries hdpatiques.

N o u s a v o n s u t i l i sd la m ~ t h o d e de K l i n g e n b e r M. et S l enc~kan ~W. [12]. La t e n e u r e n p r o t 6 i n e s de la su s - p e n s i o n m i t o e h o n d r i a l e f ina le es t ~valude p a r la m6- t h o d e du b i u r e t modi f l~e [!1',3].

Mesure de la oitesse de consommation d'oxyg~ne.

On d 6 t e r m i n e la r e s p i r a t i o n des m i t o e h o n d r i e s (envi- r o n 2 m g de p ro td ines ) e n m e s u r a n t h l ' a ide d ' u n e dlee- t r o d e de C la rk (*), la d i m i n u t i o n de l ' o x y g 6 n e d i s s o u s d a n s 3 m l du m i l i e u r d a c t i o n n e l ( s a c e h a r o s e 200 mM, T r i s HCI 20 raM, KC1 15 mM, P i n o r g a n i q u e 6 raM, s n e c i n a t e 3 raM, r o t 6 n o n e 10 ~M, pH = 7,2, 25°C). O n e n r e g i s t r e d ' a b o r d la r e s p i r a t i o n en p rdsenee de

en p r o v o q u a n t u n d~couplage p a r le CCCP 3 ~xM (ehlo- r o e a r b o n y l c y a n i d e p h e n y l h y d r a z o n e ) .

Sur les m i t o c t m n d r i e s de q u e l q u e s a n i m a u x les m e s u r e s p r~cdden tes on t 6t~ r e p r i s e s en a j o u t a n t au m i l i e u r 6 a c t i o n n e l 0,3 p. cen t de s d r u m a l b u m i n e b o v i n e [1t5] -

Mesnre de l'activil~ ATPasique. L'ac t iv i td e n z y m a t i q u e es t e x p r i m 6 e p a r la q u a n t i t 6

de p h o s p h a t e i n o r g a n i q u e (Pi) l ib6r6, dos6 grhce h u n a u t o - a n a l y s e u r se lon la m 6 t h o d e de Gal l i s J. et B o u r - d i cbon M. [16].

Les m i t o c h o n d r i e s ( e n v i r o n 1 m g de p ro td ines ) s o n t r a i ses en s u s p e n s i o n d a n s 2, m l de t a m p o n (100 m M s a c c h a r o s e , 50 m M KC1, 0,5 m M E.D.T.A., 10 m M Tr i s - HCI, pH = 7,1, 25°C) et l ' a d d i t i o n d ' A T P (4 mM) d6- c l e aehe la r 6ac t i on d ' h y d r o l y s e .

L ' ac t iv i t6 A T P a s i q u e es t m e s u r 6 e h l ' d t a t s p o n t a n 6 et ap r6s i n c u b a t i o n de 2 m i n u t e s en p r6sence de DNP 0,2 raM. La n a t u r e m i t o c h o n d r i a l e de l ' ac t iv i t6

TABLEAU I.

Etude de la respiration des mitoehondries hdpatiques chez le rat en prdsenee de succinate.

A - Sans sdrUm albumine

Lots

TdmoJns . . . .

E4 n at. 0 / , nn /mg

pr0t.

26 ,56 ~___ 1 , 7 6 (8)

n at. 0 /mn/mg prot.

86 ,88 ~ 4 , 5 3 (9)

Carencds . . . . 32 ,48 ~ 0 ,86 67 ,84 ___ 3 ,87 (8) (7)

T e s t T . . . . . . P ~ 0 ,01 P ~ 0 ,01

E:¢ E4

3 ,19 -q- 0 ,11 (9)

ADP 0

2 ,04 ~ 0 ,16 (9)

2 , 4 2 ~_ 0 ,18 1 ,50 -I- 0 ,07 (9) (8)

P < 0 ,01 0 , 0 2 > P > 0 , 0 1

B - Avec sdrom a lbumine

Lots

T~moins . . . .

Careneds . . . .

T e s t T . . . . . .

E4 n at. 0 / m n / m g

pvot.

18 ,13 ___~ 0 , 9 6 (6)

18 ,59 Jr- 1 , 2 8 (6)

P > 0 , 1 0

E3 n at. 0 / m n / m g

pout.

85 ,27 ~___ 4 , 0 3 (6)

78 ,88 ! 2 , 07 (6)

P > 0 ,10

E 3 E~

3 ,74 -+- 0 ,11 (6)

ADI' 0

1 , 9 3 +- 0 ,08 (6)

3 , 7 7 ~___ 0 ,15 1 ,84 -~- 0 , 09 (6) (6)

P > 0 , 1 0 P > 0 , 1 0

(*) L '6 t a t E, p r i s en c o n s i d e r a t i o n p o u r ce r a p p o r t h la s t i m u l a t i o n p a r I 'ADP.

( ) N o m b r e d ' a n i m a u x . C h a q u e m o y e n n e es t a c e o m p a g n d e de la d ~ v i a t i o n l ' a u a l y s e s t a t i s t i q u e a dr6 rSal isde pal" le t e s t t de

e s t l ' 6 ta t E4 f a i s a n t su i t e

s t a n d a r d h la m o y e n n e ; S t u d e n t .

s u e e i n a t e [ E t a t E4 s e l o n C h a n c e et W i l l i a m s , 14] p u i s on s t i m u l e la r e s p i r a t i o n (Eta t E~) p a r a d d i t i o n a n m i - l i eu r d a c t i o n u e l de 0,3 m o l e d 'ADP. Apr6s p l u s i e u r s e n r e g i s t r e m e n t s de la r e s p i r a t i o n d a n s les 6 ta t s E~ et E3, l 'eff icaci td de la s t i m u l a t i o n p a r I 'ADP es t v6rifide

(*) O x y g r a p h e Gi l son m i s g r a c i e u s e m e n t h n o t r e d i s p o s i t i o n p a r B. GnSr in ( L a b o r a t o i r e de B i o c h i m i e B.B.C., U n i v e r s i t d de B o r d e a u x II) q u e n o u s r e m e r - c ions p o u r ses p rde ieux conse i l s .

BIOCH1M1E, 1977, 59, n ° 7.

A T P a s i q u e es t vdrifi~e p a r u n e i n c u b a t i o n de 2 m i - n u t e s en p r6sence de DNP 0,2 m M et d ' u n e m i n u t e en p r6sence d ' o l i g o m y c i n e (0,5 ~xg/mg de p ro t6 ine ) .

R E S U L T A T S ET DISCUSSION.

1 °) L a pa r t i e A du t a b l e a u I i n d i q u e les r d s u l t a t s o b t e n u s p a r o x y g r a p h i e en l ' a b s e n c e de s d r u m a l b u - m i n e d a n s le m i l i e u :

Mitochondries hdpatiques de rats carencds en v i tamine A. 647

- - l a c o n s o m a t i o n d ' o x y g 6 n e en p r6sence de succ i - h a t e p a r les m i t o c h o n d r i e s h d p a t i q u e s des r a t s c a r e n - c~s es t s u p 6 r i e u r e de 22 p. cen t /t cel le des r a t s td- m o i n s ;

- - la s t i m u l a t i o n p a r I 'ADP es t m o i n s efficace ( ÷ 109 p. cent) p o u r les m i t o c h o n d r i e s des ca renc6s q u e p o u r cel les des t 6 m o i n s ( + 204 p. cent) ;

E3 - - les r a p p o r t s E ~ (contr61e de la r e s p i r a t i o n p a r

ADP I 'ADP) et ~ s o n t i n f 6 r i e u r s chez les ca renc~s

( r e s p e c t i v e m e n t 2,42 et 1,50) /~ ce q u ' i l s s o n t chez les t 6 m o i n s ( r e s p e c t i v e m e n t 3,19 et 2,04).

Les r ~ s u l t a t s de n o s m e s u r e s de r e s p i r a t i o n darts l ' 6 t a t E~ ( m o i n s g r a n d e s t i m u l a t i o n p a r I 'ADP chez les ca renc6s que chez les t d m o i n s ) s o n t v o i s i n s de c e u x o b t e n u s p a r G o u b e r n ['8]. I1 n ' e a e s t p a s de m ~ m e p o u r les r d s u l t a t s c o n c e r n a n t la r e s p i r a t i o n darts l ' 6 t a t E~ (a lors q u e G o u b e r n t r o u v e p o u r les ca renc~s u n e ldgbre d i m i n u t i o n de la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g $ n e , n o u s a v o n s m i s e n dv idence u n e a u g m e n t a t i o n ) . Cet te d ive r - gence p e u t avoi r , /~ n o t r e av is , p l u s i e u r s c a u s e s : o r i - g ine d i f f~ren te des a n i m a u x (E.O.P.S. o u n o n ) , p r 6 sence ou a b s e n c e de r o t 6 n o n e d a n s le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n et, s u r t o u t , s t ade de ca rence t r6s d i f f6rent . E n effet , a l o r s q u e t o u t e s nos m e s u r e s o n t 6t6 f a i t e s s u r des a n i m a u x e n d d b u t de p l a t e a u de po ids , ce l les e f fec tudes p a r G o u b e r n o u t 6t6 f a i t e s ~ u n s t a d e t a r d i f de l a ca rence (au s t a d e a i g u d ' a v i t a m i n o s e , c 'est- /~-dire ap r6s le p l a t e a u de po ids corpore l ) . A c e moment-1/~, de n o m b r e u x t r o u b l e s s e c o n d a i r e s et en p a r t i c u l i e r des i n f e c t i o n s se s u r a j o n t e n t h a b i t u e l l e m e n t a u x mod i f i - c a t i o n s c a r e n t i e l l e s p r o p r e m e n t d i tes .

r a t s ca rencds p r 6 s e n t e n t des capac i t6s r 6 a c t i o n n e l l e s r 6 d u i t e s qu i t r a d u i s e n t u n d6coup lage des o x y d a t i o n s et des p h o s p h o r y l a t i o n s .

3 °) Les v a l e u r s f i g u r a n t s u r la p a r t i e B d u t a b l e a u I m o n t r e n t les r d s u l t a t s o b t e n u s en m i l i e u a l b u m i n ~ :

a) l ' a d d i t i o n de s d r u m a l b u m i n c ~ des m i t o c h o n d r i e s h d p a t i q u e s de r a t s n o r m a u x d i m i n u e l eu r c o n s o m m a - t i on d'O~ d a n s l '~ ta t E~ et a m d l i o r e l eu r contr61e r e sp i - r a t o i r e ce qu i c o n s t i t u e u n e d o n n 6 e g 6 n 6 r a l e m e n t a d m i s e [15, 17] ;

b) en p r6sence de s d r u m a l b u m i n e les p a r a m 6 t r c s 6 tud ids ne s o n t p l u s d i f f6 ren t s chez les ca renc6s de ce qu ' i l s s o n t chez les t 6 m o i n s ( l '6 ta t E, des ca renc6s es t f o r t e m e n t d i m i n u 6 , l e u r contr61e r e s p i r a t o i r e es t a u g - m e n t 6 ) . Ces m o d i f i c a t i o n s p e u v e n t ~tre r a t t a c h 6 e s h ce que l ' o n sa i t m a i n t e n a n t de la p h y s i o l o g i e t h y - r o i d i e n n e des a n i m a u x carencds . N o u s a v o n s , en effet, m o n t r d [:1@] que la t h y r o x i n 6 m i e to t a l e des ca renc6s d tud ids en p l a t e a u de po ids 6 ta i t s u p 6 r i e u r e de 71 p. c en t fi celle des t 6 m o i n s . Or on sa i t q u ' u n e des a c t i o n s de la T+ es t de p r o v o q u e r u n e acc61drat ion de l ' 6 t a t E~ et u n m a u v a i s contr61e r e s p i r a t o i r e [18] e t que cet te a c t i on es t corr igde p a r la s ~ r u m a l b u m i n e [15].

CONCLUSION.

D a n s les c o n d i t i o n s d ' a v i t a m i n o s e A que n o u s a v o n s rda l i sdes , les m i t o c h o n d r i e s h $ p a t i q n e s p r 6 s e n t e n t des a l t 6 r a t i o n s f o n c t i o n n e l l e s q u ' o n p e u t r e l i e r a u x p a r t i - c u l a r i t 6 s p h y s i o l o g i q u e s d6cr i tes d e p u i s l o n g t e m p s su r ces a n i m a u x :

TABLEAU lI .

Activi t~s ATPas iques mi tochondriales du foie de rat. (En n m o l e s de P i / m g de p r o t 6 i n e s / m n ) .

Nature de l 'activit6 T6m0ins Carenc~s C0mparais0u des moyennes

Aet iv i t6 spon tan~e . . . . . . . . . . P < 0 ,001

Apr~s p r6 incuba t ion 2 m n darts l e D N P 0 , 2 m M . . . . . . . . . .

D P N 0,2 m M p u i s o l i g o m y e i n e *

p e n d a n t 1 m n . . . . . . . . . . . .

12 ,77 -~- 1 ,41 21 ,52 "4- 1 , 38 (11) (9)

145 ,80 + 9 ,89 77 ,92 -+- 13 ,52 0 , 0 1 > P > 0 , 0 0 1 (7) (11)

P > 0,1O 7 ,24 -+- 0 , 78 (9)

9 ,70 ~__ 1 ,47 (11)

(*) O l i g o m y c i n e : 0,5 Ixg mg-1 de p ro t6 ine . ( ) N o m b r e d ' a n i m a u x . C h a q u e m o y e n n e es t a c c o m p a g n d e de la d~v i a t i on s t a n d a r d /t la m o y e n n e ; l ' a n a l y s e s t a t i s t i q u e a dt6 r f a l i s 6 e p a r le t e s t t de S t u d e n t .

2 °) Les r ~ s u l t a t s de la m e s u r e des ac t iv i t6s A T P a s i - q u e s ( t a b l e a u II) c o n f i r m e n t n o s d o n n 6 e s p r~c6den te s :

- - l ' ac t iv i t6 A T P a s i q u e s p o n t a n ~ e des m i t o c h o n d r i e s des ca renc6s es t s u p 6 r i e u r e ( + 68 p. cent ) h eel le des t 6 m o i n s ;

- - le DNP a u g m e n t e m o i n s l ' ae t iv i t6 A T P a s i q u e des m i t o c h o n d r i e s des ca renc6s ( + 245 p. cent) q u e celle des t 6 m o i n s ( + 1015 p. cen t ) .

A i n s i les m e s u r e s de r e s p i r a t i o n et d ' ac t iv i t6 A T P - a s i q u e m o n t r e n t que les m i t o c h o n d r i e s h 6 p a t i q u e s des

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 7.

- - u n e 16g6re a u g m e n t a t i o n de la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g 6 n e p a r les m i t o c h o n d r i e s h S p a t i q u e s p o u r r a i t ~trc r e s p o n s a b l e , a u m o i n s en pa r t i e , de l ' a u g m e n t a - t i on de la c o n s o m m a t i o n d ' o x y g 6 n e c o n s t a t ~ e chez l ' a n i m a l in t o t o ;

- - u n d6coup lage des o x y d a t i o n s e t des p h o s p h o r y - l a t i o n s p o u r r a i t ~tre ~ l ' o r i g ine d ' u n e ca lo r i gen6s e acc rue r e s p o n s a b l e de la p l u s g r a n d e d d p e r d i t i o n de c h a l e u r m i s e en ~v idence chez ces a n i m a u x [2]. I1 es t d ' a i i l e u r s fo r t p o s s i b l e que ces m o d i f i c a t i o n s du m ~ t a -

648 P. Higueret et H. Garcin.

bol i sme soient sous contrSle thy ro id i en pu i sque nous avons montr~, chez ees m~mes ra ts earenc6s, l ' ex is - tence d 'une impor t an t e hype r thy rox in6mie .

BIBLIOGRAPHIE.

1. Blaizot, J. ~ Benac, R. (1955) C. R. Soc. Biol., 149, 810.

2. Chevalier, A. ,¢ Baert, H. (1934) C. R. Soc. Biol., Paris, ]J16, 1037.

3. Blaizot, J. a Serfaty, A. (1955) Arch. Sci. Physiol., 9, 1-9.

4. De Luca, H., Manatt , N. ~ Olson, E. (19.63) J. Nutr., 81, 383-386.

5. Vignais, P. V. (1957) Exp. Cell. Research., 13, 414- 416.

6. Johnson , B. ~ Wolf , G. (1960) Vitamins Hormones, ~li8, 457-483.

7. Lyubovich, E. a Grimalyt tk, G. (1963) Ukr. Bio- khim. Zh., ~5, 25-28.

8. Goubern, M. [1976) Thbse Sciences Nature l les , Par is VI.

9. Seward, C., Vaughan Mitchell, G. ~ Hove, E. (1969) Am. J. Clin. Nutr., 22, 8, 1014-1016.

10. Garein, H. ,~ Higueret , P. (1977) C. R. Acad. Sci.. Paris, ~85, s6rie D, n ° 4 (sous presse).

11. Blaizot, S. a Bonmort , J. (1974) Ann. Nutr. Afire., ~8, 385-405.

12. Klingenberg, M. a Slenczkan, W. (19'59) Biochem. Z., 331, 486-495.

13. GornaB, A. G., B~lrdawill, C. T. ~ David, M. M. (1949) J. Biol. Chem., 177, 715-766.

14. Chance, B. a Wi l l i ams , G. (1956) Advances in Enzgmologg, 17, 65.

15. Hoch, F. ~ Motta, M. (1968) Prvc. Natl. Acad. Sci., 59, 118-122.

16. Gallis, J. ,~ Bourdichon, M. (1976) Biochimie, 58, 625-627.

17. Weinbach , E. C. ,~ Garbus, J. (1966) J. Biol. Chem., 2_~1, 169-175.

18. Hoch, F. (1974) Handboo,k of Physiology, section 7, vol. III, p. 391-411.

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 7.