Immunoanal Biol Sp~c (1990) 20, 91-93 91 © Elsevier, Paris

I l l u s t r a t i o n s d e p r o b l e m e s s p e c i f i q u e s

Etalonnage a deux points dans un systeme d'immunodosage

MP Vigier

Ciba Coming, 11, chemin de Ronde, BP 78, 78110 Le V~sinet, France

Introduction

Ciba Corning Diagnostics a d~velopp~ un calcul d'ajustement de courbe & 2 points, adapt~ au syst~me d'lmmunodosage Magic Lite [1]. Cet ajustement s'effectue gr&ce & une courbe mai- tresse de calibration d~finie Iors de la fabrication du lot et & 2 points d'~talonnage inclus dans chaque s~rie de dosages. La plupart des immu- nodosages classiques, non automatisms, n~cessi- tent de 6 & 10 points d'~talonnage. L'utilisation de cet ajustement, par 2 points, permet donc une ~conomie de r~actifs.

Methode

Cette m~thode & 2 points se d~finit par les ~tapes suivantes: - 1 : d~finition de la courbe ma~tresse; - 2: calibration par 2 points; - 3: ajustement des RLU (unit6s de lumi~re relati- ve) de I'~chantillon; - 4: lecture sur la courbe des concentrations de I'analyte.

La r6ponse s'exprime en RLU. Une unit~ RLU se d6finit comme un photon de lumi~re compt~ dans un analyseur de r~f~rence.

Courbe maRresse

La d~finition de la courbe maTtresse est I'une des ~tapes finales de la fabrication de la trousse.

Une courbe standard, comportant 6 & 10 concentrations, est incluse dans plusieurs s~ries (4 ou 5 instruments, 4 & 5 techniciens diff~rents) de fa~on & obtenir 75 & 90 r~sultats pour chaque standard. On d~finit ainsi la forme de la courbe pour un lot donn~ de r~actifs.

Tousles dosages Magic Lite utilisent une cour- be de calibration en spline et subissent une trans- formation Iogit log des r~sultats (RLU). La <<partie li~e>> de I'analyte & doser se d6finit comme suit:

B/Bma x = RLU de I'analyte/RLU au maximum de liaison

La courbe maitresse est sp~cifique pour un lot de r~actifs. Une fiche r~capitulant les caract~ris- tiques de cette courbe se trouve dans chaque trousse de r~actifs. Les donn~es sont entr~es en m~moire dans le luminom~tre Iors de chaque changement de lot de r~actif.

Pour les dosages sandwich (ICMA), le mini- mum de liaison correspond & la concentration z~ro de la substance et le maximum ~. la concen- tration la plus 61ev6e. Pour les dosages par com- petition, le min!mum de liaison se trouve pour une concentration <<infinie>> de I'analyte et le maxi- mum pour la concentration z~ro.

Calibration par 2 points

Cha;que trousse de r~actifs Magic Lite contient 2 points d'~talonnage. La concentration de I'analyte dans chaque ~talon est d~termin6e Iors de la fabrication de chaque lot. Cette concentration est indiqu~e sur I'~tiquette de chaque flacon.

Les valeurs des concentrations sont entr~es en m~moire dans I'appareil en m~me temps que les donn6es de la courbe maitresse puis le syst~me d~termine la partie <<li~e,> pour chaque point en utilisant la courbe maitresse.

Les informations suivantes sont alors dispo- nibles: - pourcentage de liaison pour chacun des points d'6talonnage (~. partir de la courbe maitresse); - RLU de chacun des 2 points d'~talonnage (& partir du dosage).

On obtient donc: Bi/Bma x = (RLUi - NSB)/(RLUma x - NSB) o~J:

- RLUi = RLU du taux i; - NSB = RLU dus & la liaison non sp6cifique; - RLUma x = RLU au maximum de liaison.

Pour les 2 ~talons: B1 = B1/Bma x = (RLU 1 - NSB) / (RLUma x -

NSB)

92 MPVigier

B2 = B2/Bma x =~(RLU2 - NSB) / (RLUma x - NSB)

Nous connaissons B1, B2, RLU 1 et RLU 2 alors que NSB et RLUma x sont inconnus (Syst6me de 2 6quations & 2 inconnues). Nous obtenons, apr~s r6solution du syst~me:

NSB = (B2/B1) x (RLU1 - RLU2) / (B2/B1 - 1 ) RLUma x = (RLU1 - NSB) / B 1 + NSB

Ajustement des RLU pour les taux inconnus

Les valeurs calcul6es du NSB et de RLUma x de la s6rie sont compar6es au NSB o et au RLUma x de la courbe maitresse. On calcule alors un ratio:

ratio = (NSB o - RLUma x o) / (NSB RLUmax) et un facteur:

facteur = ratio x RLUma x - RLUma x o avec: - NSB = NSB de la courbe maitresse; - RLUma x = RLUma x de la courbe maitresse; - N S B = NSB calcul6 d'apr~s la s6rie d e dosages; - RLUma x = RLUma x calcul6 d'apr~s la s6rie de dosages.

Tousles RLU obtenus sur des s6rums inconnus sont ajust6s par le ratio et le facteur d6finis ci- dessus:

RLU' = RLU x ratio + facteur o0 RLU' = RLU ajust6s et RLU = RLU de la

s6rie; ratio = calcul6 & partir de la calibration ~. 2

points; facteur = calcul6 & partir de la calibration & 2

points (tout ceci 6tant calcul6 directement par le programme du luminom6tre).

Calcul de la concentration d'une substance partir de la courbe maitresse

Les valeurs de RLU ajust6s sont utilis6es pour calculer les concentrations de ranalyte directe- ment & partir de la courbe maitresse.

Les RLU des s6rums de patients et des contr61es sont ajust6s en fonction des variations journali~res de comptage ou de liaison (variations de temp6rature, etc.).

R e s u l t a t s

Exemple: Thyroxine Magic Lite

Donn6es de la courbe maitresse: - calibrateur bas = 4 Mg/dl; - B/Bma x = 0,6283; - calibrateur 61ev6 = 17,9/Jg/dl; - B/Bma x = 0,2314; - NSB (dose infinie) = 80 526 RLU; - RLUma x (Bo) = 789 363 RLU.

Contr61es dos6s pendant 2 jours cons6cutifs: - jour 1 :

• RLU calibrateur bas = 318 529 • RLU calibrateur 61ev6 = 101 862 • RLU contr61e = 346 694 • RLU max = 521 439 • NSB = 24 458 • Ratio = 1,29478 • Facteur = 112 285

- jour 2: • RLU calibrateur bas = 170 950 • RLU calibrateur 61ev6 = 51 246 • RLU contrOle = 187 297 • RLU max = 283 054 • NSB = 18 544 • Ratio = 2,350276 • Facteur = 124 109

d'o~J: - RLU ajust6s pour la valeur inconnue (contr61e); - 346 994 x ratio + facteur = 562 460 (jour 1); - 187 297 x ratio + facteur = 564 308 (jour 2); d'o0, apr~s lecture sur la courbe maitresse: - jour 1 = 562 460 -~ 3,02/Jg/dl; - jour 2 = 564 308 ~ 2,99/Jg/dl.

Ainsi, malgr6 des RLU tr~s diff6rents suivant les 2 jours, on obtient le m6me r6sultat pour la concentration sans avoir recours & une standardi- sation totale.

C , I

I

?.

50O

450

4O0 '

300 -

2 '50 -

200 -

150

100 -

. 50 -

oi

..'- ; 7 •

. " o

o ,~O °

4 ,

• 4# ~' •

~- ,J'°

~gt .~-:

. °

/ $0 l oo 150 20"0 ;25O 30O 350 40O

F e r r i t i n e ng/ml - I0 points

i

I

4~0 ~00

Fig 1. Comparaison m6thode par 2 points / m6thode par 10 points.

Etalonnage a deux points dans un syst~me d'immunodosage 93

Correlation avec la standardisation par 10 points

Exemple: ferritine Magic Lite. L a figure 1 montre le diagramme obtenu en

comparant les 2 m~thodes. La r6gression obte- nue est d6finie par: m~thode par 2 point = 1,041 x m6thode par 10 points = 5,9; r = 0,993; n : 258; Syx = 22,3; gamme = 0,9 - 1 378.

Les r~sultats obtenus par la calibration & 2 points sont en parfaite concordance avec ceux obtenus par une standardisation totale par 10 points.

Ciba Corning permet I'utilisation d'une courbe maitresse de calibration pendant toute la dur~e de vie du lot.

Cette m6thode utilise 2 points d'~talonnage pour d~terminer le minimum et le maximum de liaison dans chaque s~rie, puis un ratio et un fac- teur qui sont utilis~s pour ajuster les RLU, m~me dans des conditions provoquant des change- ments importants des RLU.

La performance du dosage est comparable & celle obtenue avec une standardisation totale.

Reference

Conclusion

L'ajustement par 2 points (re-calibration) utilis6 dans le syst~me d'immunodosage Magic Lite

1 Lynch MJ (1989) Extended standard curve stability on the CCD Magic Lite immunoassay system using a two-point adjustement. J Bioluminescence Chemilumi- nescence 4, 615-619