enzymologie

Universit Pierre et Marie Curie

Enzymologie lmentaire

Objectifs au cours de

Rvisions Biochimie PCEM2

Rvisions Biochimie mtabolique

2002 - 2003

Pr. A. Raisonnier ([email protected])

Mise jour : 19 juin 2002

Relecture : Pr. A. Raisonnier

2/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Plan du cours

Plan du cours2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 3/131

3 Plan du cours

7 Objectifs

9 Partie I : Les enzymes

11 Chapitre 1 : Dfinitions

12 1.1 Enzyme13 1.2 Exemple denzyme : lanhydrase carbonique15 1.3 Substrat16 1.4 Produit

17 Chapitre 2 : La raction enzymatique

18 2.1 Raction enzymatique19 2.2 Facteurs : enzyme20 2.3 Facteurs : autres facteurs indispensables21 2.4 Ligand22 2.5 Cofacteur23 2.6 Coenzyme

25 Partie II : Cintique

27 Chapitre 3 : Effet de la concentration denzyme

28 3.1 Vitesse de raction29 3.2 Phases de la raction30 3.3 Phases de la raction31 3.4 Vitesse initiale32 3.5 Concentration de lenzyme33 3.6 Passage la forme active34 3.7 Dosage enzymatique

35 Chapitre 4 : Effet de la concentration de substrat

36 4.1 Concentration du substrat37 4.2 Cintique michalienne

Plan du cours

38 4.3 Vitesse maximum39 4.4 Constante de Michaelis40 4.5 Exemple de Km : la lactate dshydrognase4/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

41 4.6 Constantes de la raction42 4.7 Exemple de constantes : la fumarase43 4.8 Exemple de constantes : laspartate aminotransfrase = ASAT44 4.9 Exemple de constantes : la cratine phosphokinase45 4.10 Phase stationnaire46 4.11 Equation de la vitesse47 4.12 Equation de la conservation de lenzyme48 4.13 Constante de Michaelis49 4.14 Exemple de Km : la glycrophosphate dshydrognase50 4.15 Exemple de Km : lanhydrase carbonique51 4.16 Exemple de Km : lisocitrate dshydrognase52 4.17 Calculs53 4.18 Calculs54 4.19 Equation de Michaelis & Menten55 4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten56 4.21 Calculs57 4.22 Diagramme de Lineweaver et Burk

59 Chapitre 5 : Effet de la concentration des effecteurs

60 5.1 Facteurs : les effecteurs61 5.2 Effecteur62 5.3 Inhibition comptitive (quation)63 5.4 Inhibition comptitive (hyperbole)64 5.5 Calculs65 5.6 Inhibition comptitive (double inverse)66 5.7 Exemple dinhibition comptitive : la succinate dshydrognase67 5.8 Inhibition non comptitive (quation)68 5.9 Calculs69 5.10 Inhibition non comptitive (hyperbole)70 5.11 Inhibition non comptitive (double inverse)71 5.12 Exemple dinhibition non comptitive : lanhydrase carbonique

73 Chapitre 6 : Effets allostriques

74 6.1 Sous-unit (dune protine)75 6.2 Protomre76 6.3 Symtrie77 6.4 Sites de liaison78 6.5 Conformations79 6.6 Etats de transition80 6.7 Effets sur la raction enzymatique

Plan du cours

81 6.8 Conservation de la symtrie82 6.9 Allostrie83 6.10 Modle symtrique2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 5/131

84 6.11 Modle non symtrique85 6.12 Diagramme de Hill86 6.13 Exemple dallostrie : myoglobine ; hmoglobine87 6.14 Exemple dallostrie : lhexokinase88 6.15 Exemple dallostrie : la phosphofructokinase89 6.16 Effet de lATP sur la PFK90 6.17 Exemple dallostrie : la glycogne phosphorylase91 6.18 Effet de lAMP sur la glycogne phosphorylase92 6.19 Voie mtabolique93 6.20 Voie mtabolique94 6.21 Carrefour mtabolique95 6.22 Enzyme-cl

97 Chapitre 7 : Cintique deux substrats

98 7.1 Mcanisme bibi ordonn99 7.2 Exemple de bibi ordonn : lalcool dshydrognase100 7.3 Exemple de bibi ordonn : la malate dshydrognase101 7.4 Exemple de bibi ordonn : la phosphoglycraldhyde dshydrognase102 7.5 Exemple de bibi ordonn : lUDP-glucose pyrophosphorylase103 7.6 Mcanisme bibi alatoire104 7.7 Exemple de bibi alatoire : la cratine phosphokinase105 7.8 Exemple de bibi alatoire : la citrate synthase106 7.9 Mcanisme ping-pong107 7.10 Exemple de ping-pong : lalanine aminotransfrase = ALAT108 7.11 Exemple de ping-pong : laspartate aminotransfrase = ASAT109 7.12 Exemple de ping-pong : la phosphonolpyruvate carboxykinase = PEPCK

111 Partie III : Effet des constantes physiques

113 Chapitre 8 : Effet du pH

114 8.1 Dnaturation115 8.2 Charges lectriques116 8.3 pH optimum117 8.4 Exemple de pH optimum : la fumarase118 8.5 Exemple de pH optimum : la lactate dshydrognase

119 Chapitre 9 : Effet de la temprature

120 9.1 Temprature optimum

Plan du cours

121 9.2 Activation ; dnaturation122 9.3 Relation dArrhenius123 9.4 Energie dactivation6/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

124 9.5 Exemple dnergie dactivation : la fumarase125 9.6 Energie interne de la fumarase 126 9.7 Energie dactivation127 9.8 Raction couple128 9.9 Exemple de raction couple : lhexokinase129 9.10 Exemple de raction couple : la phosphoglycrate kinase130 9.11 Liaisons riches en nergie131 9.12 Liaison riche en nergie

Objectifs

Objectifs2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 7/131

Dfinir1 les termes denzymologie : enzyme, substrat, produit, coenzyme, activateur, inhibi-teur, raction enzymatique, voie mtabolique, enzyme-cl.

Etudier2 sur un exemple la vitesse dune raction enzymatique en fonction du temps, de laconcentration de lenzyme, de la concentration du substrat, en reprsentation normale ou endouble inverse. Cet objectif peut faire lobjet de problmes numriques.

Dfinir la vitesse initiale, la vitesse maximum, la constante de MICHAELIS. Donner des exemples3 dinhibitions de ractions enzymatiques en expliquant les effets de cet-

te inhibition sur les paramtres de la raction. Donner des exemples deffets allostriques : activation homotrope cooprative et rtroinhibi-

tion htrotrope. Donner des exemples de cintiques deux substrats, ou avec coenzyme libre. Etudier la vitesse dune raction enzymatique en fonction du pH ou de la temprature. Etudier les variations de lnergie libre du complexe enzyme-substrat au cours des phases de

la raction enzymatique. Dfinir lnergie dactivation, la raction enzymatique couple et laliaison riche en nergie.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

2. Etudier : suivre les valeurs dune fonction pour toutes les valeurs de la variable.3. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation o un concept ou un corps dfini joue le

rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

Objectifs8/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Les enzymes

Partie I 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 9/131

Les enzymes

Les enzymes10/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Dfinitions

Chapitre 1 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 11/131

Dfinitions

Dfinitions

1.1 Enzyme12/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 1

LEnzymologie est ltude des enzymes. Le substantif enzyme est du genre fminin. Toutes les enzymes sont des protines. Les protines enzymatiques sont des catalyseurs, cest--dire quen agissant des concentra-

tions trs petites, elles augmentent la vitesse des ractions chimiques, sans en modifier le r-sultat. A la fin de la raction la structure de lenzyme se retrouve inchange.

Une enzyme donne est spcifique dune raction, cest--dire quelle catalyse toujours lamme transformation, se produisant sur les mmes corps chimiques initiaux.

Les protines enzymatiques sont synthtises par des tres vivants. Cette synthse est dter-mine gntiquement : sa conservation dans le gnome est favorise par le besoin quprouvecet tre vivant de faire cette raction.

Dfinitions

1.2 Exemple denzyme : lanhydrase 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 13/131

carbonique

EE 2

Lanhydrase carbonique est une enzyme prsente dans toutes nos cellules. Cest une protinedune masse de 29000 daltons, constitue dune chane de 264 acides amins. La prsencedun atome de Zinc est ncessaire son activit.

Elle catalyse la raction daddition dune molcule deau sur une molcule de gaz carboniquepour donner lacide carbonique qui se dissocie au pH physiologique en un ion bicarbonate etun proton. Cette raction est rversible et aboutit un tat dquilibre que la catalyse enzyma-tique ne change pas.

La nomenclature des ractions enzymatiques est exprime par un ensemble de quatre nombresspars par des points. Le premier de ces nombres dsigne le type de la raction catalyse,parmi les six grandes classes de ractions enzymatiques. Le deuxime et le troisime expri-ment la nature des corps chimiques sur lesquels cette raction se produit. Le quatrime nom-bre est un numro dordre. Ainsi, lanhydrase carbonique catalyse la raction 4.2.1.1, ce quisignifie quelle agit sur une raction daddition au niveau dune liaison double (premier nom-bre 4), que la raction cre une liaison entre des atomes de carbone et doxygne (deuximenombre 2), que le corps ajout est une molcule deau (troisime nombre 1) et quelle est lapremire de cette espce (quatrime nombre 1). Une raction rversible est classe sous unseul numro quel que soit son sens.

Sur cette image et de droite gauche le bicarbonate, rassoci un proton, va perdre avec

Dfinitions

laide catalytique de lenzyme, une molcule deau pour donner lanhydride ou gaz carboni-que. Dans ce sens, on appelle substrat le bicarbonate et produit le gaz carbonique.14/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Dfinitions

1.3 Substrat2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 15/131

EE 3

Toutes les molcules qui entrent dans une raction enzymatique et sont dfinitivement modi-fies sont appeles substrats.

Dfinitions

1.4 Produit16/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 3/1

La nouvelle molcule qui rsulte de cette transformation est appele produit.

La raction enzymatique




2.1 Raction enzymatique18/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 4

Lorsque le sens dune raction enzymatique rversible est chang le produit devient substratet vice-versa.


2.2 Facteurs : enzyme2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 19/131

EE 4/1

Certaines ractions enzymatiques se produisent simplement entre un substrat et lenzyme,aboutissant un produit.


2.3 Facteurs : autres facteurs indispensables20/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 4/2

Dautres fois, un troisime corps chimique est indispensable : nous lappelerons cofacteur. Les cofacteurs sont des atomes ou des molcules qui interviennent dans la raction enzyma-

tique, mais ne sont pas transforms dfinitivement la fin de cette raction : ils interviennentpour transporter le substrat, pour recevoir le produit ou comme participant la structure delenzyme.

La protine enzymatique reconnat spcifiquement les cofacteurs dont elle a besoin. La raction enzymatique ncessite aussi que le complexe enzyme-substrat change de lner-

gie libre avec le milieu environnant.


2.4 Ligand2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 21/131

EE 5

Toutes les molcules ayant une liaison spcifique avec une protine sont appeles ligands. Pour chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protine qui le reoit.


2.5 Cofacteur22/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 6

Les cofacteurs peuvent tre des ions comme latome de Zinc de lanhydrase carbonique ou depetites molcules minrales habituellement prsentes dans les milieux biologiques, com-mencer bien sr par la molcule deau.

Certains cofacteurs sont des molcules plus complexes synthtises par les cellules : nous lesappelerons coenzymes.


2.6 Coenzyme2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 23/131

EE 7

Les coenzymes sont des molcules biologiques cest dire que leur synthse naturelle ne peuttre faite que par des cellules vivantes. Lorsque cette synthse nest pas inscrite dans le patri-moine gntique dune espce, alors tout ou partie de la molcule du coenzyme doit tre ap-port cette espce par son alimentation : cet aliment indispensable sappelle une vitamine.Les coenzymes sont des cofacteurs donc des molcules indispensables la catalyse enzyma-tique.

Lorsque les coenzymes sont lis lenzyme par des liaisons de type lectrostatique ou plusfaiblement encore, cette liaison est renouvele chaque raction effectue : en effet, lnergiemise en jeu par la liaison enzyme-coenzyme est du mme ordre de grandeur que lnergiemise en jeu dans la liaison enzyme-substrat ; dans ce cas, la concentration des coenzymes doittre du mme ordre de grandeur que celle du substrat (on dit stchiomtrique). Ces coenzy-mes sont appels coenzymes libres parce quils se dissocient de lenzyme chaque ractioncatalyse.

Lorsque au contraire les coenzymes sont lis aux enzymes par des liaisons fortes de type co-valentiel, leur concentration est ncessairement la mme que celle de lenzyme, cest diretrs petite (on dit catalytique). Ces coenzymes sont appels coenzymes lis parce quils ne sedissocient pas de lenzyme.

La raction enzymatique24/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Cintique

Partie II 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 25/131

CintiqueRappel des objectifs

Dfinir1 la vitesse initiale, la vitesse maximum, la constante de MICHAELIS. Donner des exemples2 dinhibitions de ractions enzymatiques en expliquant les effets de cet-

te inhibition sur les paramtres de la raction. Donner des exemples deffets allostriques : activation homotrope cooprative et rtroinhibi-

tion htrotrope. Donner des exemples de cintiques deux substrats, ou avec coenzyme libre.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

2. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation o un concept ou un corps dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

Cintique26/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Effet de la concentration denzyme




3.1 Vitesse de raction28/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 08

Pour mesurer lactivit dune raction enzymatique nayant quun substrat et un produit, dansun milieu dfini, on observe les concentrations du substrat ou du produit, qui sont des fonc-tions du temps coul : la concentration du substrat dcroit au cours du temps, celle du produitcroit au cours du temps.

Lorsquon fait ces mesures des temps t1 puis t2 spars par un dlai dt, on appelle S1 et P1les concentrations du substrat et du produit au temps t1, et S2 et P2 les concentrations du subs-trat et du produit au temps t2. La diffrence entre les concentrations du substrat dS est lopposde la diffrence entre les concentrations du produit dP. On appelle vitesse de la raction le rap-port moins dS sur dt, qui est gal au rapport dP sur dt. La vitesse de raction reprsente le nom-bre de moles de substrat transformes en moles de produit, dans un volume donn et dans untemps donn.


3.2 Phases de la raction2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 29/131

EE 9

Dans un premier temps, chaque molcule denzyme va se lier une molcule de substrat. Cecomplexe peut bien sr se redissocier.

Leffet catalytique de lenzyme transforme alors le complexe enzyme-substrat en complexeenzyme-produit. Si la raction aboutit un quilibre, cette phase de la raction est rversible.

Dans un dernier temps, le complexe enzyme-produit peut se dissocier. Si la raction est rver-sible, le produit devient substrat en sassociant lenzyme pour revenir ensuite au point dedpart.

En somme, dans le cas dune raction rversible six ractions chimiques participent cet qui-libre entre les concentrations du substrat et du produit, de lenzyme et des complexes E S etE P.


3.3 Phases de la raction30/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 10

Revenons notre chelle, en mesurant la concentration du produit P en fonction du temps.Dans un milieu o il ny a au temps 0 que des molcules de lenzyme et du substrat, la ractionse droule de faon non uniforme.

On distingue une premire phase trs brve, au cours de laquelle la vitesse de la raction estcroissante. Durant cette phase, les molcules de substrat se lient avec lenzyme : la concentra-tion du complexe enzyme-substrat augmente.

Lorsque toutes les molcules de lenzyme sont occupes par des molcules du substrat la vi-tesse de la raction est maximum et reste constante tant que la concentration du substrat estgrande et celle du produit petite. Cest ce quon observe lors des premires mesures.

Lorsque la concentration du produit augmente, la raction inverse commence concurrencercelle quon mesurait : la vitesse diminue.

Enfin dans une dernire phase, tardive, la vitesse de la transformation inverse devient gale celle de dpart : les concentrations ne changent plus, on est lquilibre.


3.4 Vitesse initiale2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 31/131

EE 11

Durant la phase stationnaire, la vitesse est constante : on lappelle vitesse initiale. Cest une phase de la raction o un nombre maximum des molcules de lenzyme sont lies

des molcules de substrat. Le rapport enzyme li sur enzyme total est maximum. Dans cesconditions, lefficacit catalytique de lenzyme est la plus grande, donc la vitesse initiale estla plus grande de toutes les vitesses quon peut mesurer en fonction des phases de la raction.

Dans la suite de ce cours, la vitesse tudie sera toujours la vitesse initiale.


3.5 Concentration de lenzyme32/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 12

Examinons lvolution de la raction lorsquon change la concentration de lenzyme. Les mesures de la concentration du produit en fonctions du temps sont diffrentes pour cha-

cune des concentrations de lenzyme essayes. Lorsque la concentration de lenzyme est gran-de (par exemple E3) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration delenzyme est petite (par exemple E1).


3.6 Passage la forme active2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 33/131

EE 12/1

Lorsquune enzyme existe la fois sous une forme active (capable de catalyser la raction) etsous une forme inactive, la concentration efficace de lenzyme est celle de la forme active seu-le.

Toutes les modifications de la structure postrieures la synthse de lenzyme, qui font passerles molcules de lenzyme de la forme inactive la forme active, ont pour effet daugmenterla concentration efficace de lenzyme et donc la vitesse de la raction catalyse.

Ces modifications peuvent tre :

lhydrolyse dun fragment de la chane dacides amins: activation des zymognes en en-zymes actives au cours de la digestion, activation des facteurs de la coagulation du sang ;

le transfert dun radical Phosphoryl- sur un acide amin de lenzyme : phosphorylationdes enzymes pour augmenter le taux de glucose dans le sang, dphosphorylation des en-zymes pour diminuer le taux de glucose dans le sang ;

la fixation dun groupement prosthtique sur lenzyme : ion Zinc sur les dshydrogna-ses NAD, flavine sur les flavoprotines, hme sur les cytochromes ;

le transfert de radicaux Acyl- ou Alkyl- sur des acides amins de lenzyme.


3.7 Dosage enzymatique34/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 13

Reprsentons cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations E1, E2 et E3 delenzyme. Il apparat que les vitesses mesures sont linairement proportionnelles aux con-centrations de lenzyme utilises.

Cette constatation est le fondement du dosage enzymatique : en effet, la vitesse initiale duneraction enzymatique dans un milieu o la concentration de lenzyme est inconnue est pro-portionnelle cette concentration. En comparant cette vitesse initiale (quon appelle dosageenzymatique) celles dautres milieux de concentration en enzyme connues, on peut valuerla concentration en enzyme quon cherchait. Ces dosages enzymatiques sont des mesuresdactivits catalytiques quon exprime dans le Systme International en Katal, unit qui repr-sente une quantit denzyme capable de catalyser la transformation dune mole de substrat enune seconde. En pratique mdicale, le microkatal et le nanokatal sont les sous-multiples cor-respondant lordre de grandeur des activits mesures. Pour exprimer des concentrationsdenzyme on rapporte au volume considr et lunit devient le nanokatal par litre par exem-ple.

LUnit Internationale est une ancienne unit de mesure reprsentant la quantit denzyme ca-pable de catalyser la transformation dune micromole de substrat en une minute. Une UnitInternationale gale 15 nanokatal.

Effet de la concentration de substrat




4.1 Concentration du substrat36/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 14

Examinons nouveau lvolution de la raction lorsquon change cette fois-ci la concentra-tion du substrat.

Les mesures de la concentration du produit en fonction du temps sont diffrentes pour chacu-ne des concentrations de substrat essayes. Lorsque la concentration du substrat est grande(par exemple S10) la vitesse initiale est plus grande que lorsque la concentration du substratest petite (par exemple S1).

On peut mesurer ces vitesses initiales en calculant la diffrence de concentration de produitau cours dun temps donn, pour chaque concentration du substrat.


4.2 Cintique michalienne2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 37/131

EE 15

Reprsentons cette fois ces vitesses initiales en fonction des concentrations du substrat quenous avons essayes.

Les vitesses mesures croissent en fonction des concentrations du substrat. Mais cette relationnest pas linaire : le graphe de cette fonction est une hyperbole (tirets longs).

Lorsque la concentration du substrat est nulle la vitesse est videmment 0, donc lhyperbolepasse par lorigine du graphe. La fonction na pas de sens en dessous de cet origine. Lorsquela concentration du substrat tend vers linfini, lhyperbole se rapproche de son asymptote ma-trialise par les tirets courts.

Pour dfinir compltement une telle courbe il suffit dindiquer un de ses points et lasymptote.Nous savons en plus que la courbe passe par lorigine. Lasymptote correspond la vitesseinitiale quon observerait si la concentration du substrat tait infinie, cest dire la vitessemaximum possible. Dfinissons le point de la courbe pour lequel lordonne est gale lamoiti de celle de lasymptote. Labscisse de ce point est une concentration de substrat pourlaquelle on peut mesurer une vitesse initiale gale la moiti de la vitesse maximum. On ap-pelle cette concentration la constante de Michaelis.


4.3 Vitesse maximum38/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 16

La vitesse maximum est donc une vitesse initiale, mais on ne peut pas lobserver puisquil estimpossible de raliser dans le milieu une concentration infinie de substrat.


4.4 Constante de Michaelis2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 39/131

EE 16/1

La constante de Michaelis, au contraire, correspond une grandeur physiquement mesurable,pour laquelle on observe une vitesse initiale la moiti de la vitesse maximum. Ces deux pa-ramtres suffisent dfinir en totalit la fonction qui lie la vitesse initiale la concentrationdu substrat.


4.5 Exemple de Km : la lactate 40/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

dshydrognase

EE 17

La lactate dshydrognase ou LDH est une enzyme trs rpandue dans nos cellules. Cest uneprotine de 140000 daltons constitue de 4 chanes dacides amins. Le Zinc est un cofacteurde cette enzyme et le NADH/NAD+ en est le coenzyme. Elle rduit son substrat le pyruvateen lactate en lui transfrant les hydrognes apports par le coenzyme.

Lorsque la LDH est une concentration de 1 micromolaire la vitesse maximum est de1000 microkatal ; pour raliser la moiti de cette vitesse la concentration du pyruvate doit tre0,8 millimolaire soit 70 mg/L.


4.6 Constantes de la raction2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 41/131

EE 18

Revenons aux tapes molculaires de la raction pour tudier mathmatiquement le sens deces deux paramtres gomtriques. Six ractions chimiques entre les molcules reprsentessont possibles.

La vitesse de chacune delles est fonction des concentrations des molcules au dpart et duneconstante k caractristique de la raction.

Ainsi, dans lassociation de lenzyme avec le substrat (ligne du haut, de gauche droite), lavitesse sera gale au produit de la concentration de lenzyme, de la concentration du substratet dune constante k1. La constante caractristique de la raction inverse (ligne du haut, dedroite gauche) sera appele k -1. Et ainsi de suite dans les autres ractions avec les constantesk2 et k -2, k3 et k -3.


4.7 Exemple de constantes : la fumarase42/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 19

La fumarase est un autre exemple denzyme qui ralise une raction dhydratation voisine decelle de lanhydrase carbonique.

Dans cet exemple la constate k1 de lassociation de lenzyme avec le fumarate est de1 000 000 000, alors que la constante k -1 nest que de 45 000. Ce qui montre encore que las-sociation de lenzyme avec le substrat est beaucoup plus rapide que la dissociation du com-plexe form.


4.8 Exemple de constantes : laspartate 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 43/131

aminotransfrase = ASAT

EE 19/1

Laspartate aminotransfrase est un autre exemple denzyme qui ralise une raction pluscomplexe dans laquelle le glutamate est dsamin en alpha-ctoglutarate.

Dans cet exemple la constate k1 de lassociation de lenzyme avec le glutamate est de10 000 000, alors que la constante k -1 nest que de 100 000. Ce qui montre encore que lasso-ciation de lenzyme avec le substrat est beaucoup plus rapide que la dissociation du complexeform.


4.9 Exemple de constantes : la cratine 44/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

phosphokinase

EE 19/2

La Cratine Phosphokinase (CPK) est une enzyme des muscles des Vertbrs. Elle catalysele transfert dun radical phosphoryl du substrat, la cratine-phosphate vers un coenzyme libretransporteur dnergie : lADP. La raction est rversible.

Dans cet exemple la constante k1 de lassociation de lenzyme avec le coenzyme libre ADPest de 22 000 000, alors que la constante k -1 nest que de 18 000. Ce qui montre encore quelassociation de lenzyme avec le coenzyme libre est beaucoup plus rapide que la dissociationdu complexe form.


4.10 Phase stationnaire2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 45/131

EE 20

Dans les conditions de nos mesures, il nexiste dans le milieu que des molcules denzyme etde substrat qui sassocient en complexes enzyme-substrat.

La concentration du produit est nulle au dpart et ngligeable par rapport celle du substratdurant la phase stationnaire. En consquence, la concentration du complexe enzyme-produitdurant cette phase est trs petite par rapport celle du complexe E S.

La raction de dissociation du complexe E P ( droite de la ligne 1) est donc inexistante et laraction se simplifie comme le montre la ligne 2.

La concentration trs petite du complexe enzyme-produit entrane que la vitesse v -2 de latransformation de ce complexe E P en complexe E S est aussi ngligeable.

La ligne 3 rsume donc les trois ractions rellement en activit au cours de la phase station-naire.


4.11 Equation de la vitesse46/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 21

La vitesse de la raction enzymatique est la vitesse dapparition du produit dans le milieu.Dans les conditions initiales (ligne 3), v = k2 E S. Si la concentration du substrat tait infinie,toutes les molcules de lenzyme seraient lies des molcules de substrat et la concentrationdu complexe [E S] = [Etotal]. La vitesse initiale quon obtiendrait alors (qui est donc la vitessemaximum) est donc Vm = k2 [Etotal].

Nous pouvons donc crire lgalit des rapports des deux membres des quations 4 et 5 ce quidonne lgalit 6 et multiplier les deux membres de celle-ci par la vitesse maximum.

La ligne 7, que nous appelerons quation de la vitesse montre que la vitesse initiale relle estgale la vitesse maximum multiplie par le rapport des concentrations du complexe E S etde lenzyme totale.

Plus le nombre de molcules denzyme qui sont lies au substrat se rapproche de la totalit delenzyme, plus la vitesse relle se rapproche de la vitesse maximum.


4.12 Equation de la conservation de lenzyme2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 47/131

EE 22

Reprenons la ligne 3 pour examiner quelles molcules denzyme sont prsentes durant la pha-se stationnaire.

Lenzyme totale est rpartie en molcules denzyme libre, de complexe E S et de complexeE P.

La quantit de complexe E P avoisine 0 et peut tre nglige. Nous pouvons donc crire laligne 9, dite quation de la conservation de lenzyme pour exprimer que dans un volume don-n, la concentration de lenzyme totale est la somme de la concentration de lenzyme libre etde la concentration du complexe enzyme-substrat.


4.13 Constante de Michaelis48/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 23

Durant la phase stationnaire, la concentration du complexe enzyme-substrat est constante.Donc la vitesse de formation de ce complexe E S doit tre gale celle de dissociation de cemme complexe. Daprs la ligne 3, il ny a quune raction de formation du complexe E Sdont la vitesse est v1 = k1 [E] [S].

Il y a au contraire 2 ractions diminuant la concentration du complexe E S : lune est la dis-sociation dont la vitesse est v -1 = k -1 [E S], lautre est la transformation enzymatique propre-ment dite dont la vitesse est v2 = k2 [E S].

Mettons E S en facteur dans le second membre. Daprs lquation de la conservation de lenzyme (ligne 9), on peut remplacer dans le pre-

mier membre la concentration de lenzyme libre par la diffrence entre la concentration delenzyme totale et celle du complexe E S.

Ce qui donne la ligne 11, dont nous pouvons diviser les deux membres par k1 ou par la con-centration dE S pour aboutir une expression quon appelle constante de Michaelis ou Kmet qui est proche de la constante de dissociation du complexe E S.

Cette constante Km est inversement proportionnelle laffinit de lenzyme pour le substrat.


4.14 Exemple de Km : la glycrophosphate 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 49/131

dshydrognase

EE 24

La glycrophosphate dshydrognase est une enzyme prsente dans le cytoplasme de toutesnos cellules. Elle utilise le coenzyme NAD+/NADH pour oxyder le glycro-phosphate enphosphodihydroxyactone.

La constante Km de cette enzyme pour le glycro-phosphate est de 0,1 millimolaire, constanteplus petite que celle que nous avons vue pour la LDH vis--vis du pyruvate. Cette dshydro-gnase a donc une affinit plus grande pour son substrat que la LDH pour le sien.


4.15 Exemple de Km : lanhydrase carbonique50/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 24/1

Lanhydrase carbonique, que nous avons dj rencontre comme exemple, a pour substrat legaz carbonique.

La constante Km de cette enzyme pour le gaz carbonique est de 8 millimolaire, constante plusgrande que celle que nous avons vue pour la LDH vis--vis du pyruvate. Cette dshydrogna-se a donc une affinit plus petite pour son substrat que la LDH pour le sien.


4.16 Exemple de Km : lisocitrate 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 51/131

dshydrognase

EE 24/2

Lisocitrate dshydrognase est une enzyme prsente dans toutes nos cellules. Elle utilise lecoenzyme NAD+/NADH pour oxyder, puis dcarboxyler lisocitrate en -ctoglutarate.

La constante Km de cette enzyme pour lisocitrate est de 2,6 micromolaire, constante bienplus petite que celle que nous avons vue pour la LDH vis--vis du pyruvate. Cette dshydro-gnase a donc une affinit beaucoup plus grande pour son substrat que la LDH pour le sien.

Loxalosuccinate, produit intermdiaire de la raction, nest pas libr par lenzyme. Inverse-ment, lisocitrate dshydrognase na pas daffinit pour loxalosuccinate libre.


4.17 Calculs52/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 25

Daprs la ligne 12, Km est le produit de la diffrence entre les concentrations de lenzymetotale et de lenzyme-substrat, multiplie par la concentration du substrat et divise par la con-centration du complexe E S. Mettons en facteur la concentration du substrat (ligne 13) puiseffectuons la multiplication (ligne 14) avant de faire passer les termes concentration de subs-trat dans le deuxime membre de lquation.


4.18 Calculs2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 53/131

EE 25/1

En prenant les inverses des deux membres, on aboutit (ligne 17) une expression du rapportde la concentration du complexe E S celle de lenzyme totale en fonction dune constante etde notre variable, la concentration de substrat.


4.19 Equation de Michaelis & Menten54/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 26

Rapprochons enfin les lignes 7 et 17, pour remplacer le facteur E S sur Etotal de lquation dela vitesse par la valeur que nous en avons trouv partir de la constante Km.

Cela nous permet dcrire lquation de Michaelis et Menten (ligne 18) qui est une expressionde la vitesse initiale en fonction de la concentration du substrat et des deux constantes carac-tristiques dune raction enzymatique, la vitesse maximum et la constante de Michaelis.

En tudiant cette fonction on observe quelle est univoque, que la vitesse initiale v est nullesi la concentration du substrat est nulle, que le terme S / Km + S tend vers 1 lorsque la con-centration de S tend vers linfini, ce qui entrane que v tende vers la vitesse maximum, et enfinque lorsque la constante Km est gale la concentration du substrat, la vitesse initiale devientgale la moiti de la vitesse maximum.


4.20 Hyperbole de Michaelis-Menten2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 55/131

EE 27

Le graphe reprsentant cette fonction dans tout le domaine o elle a un sens physique, confir-me ces conclusions mathmatiques.

Le calcul de la vitesse initiale partir de concentrations de substrat gales des multiples en-tiers de Km aboutit des fractions entires de la vitesse maximum. On trace une hyperbole partir des points obtenus, qui permet de voir la signification relle des paramtres gomtri-ques Km et Vmax que nous avons choisis au dbut de cette tude.

Vmax est une vitesse initiale que la raction aurait si la concentration du substrat tait infinie. Km est la concentration du substrat pour laquelle on observe une vitesse gale la moiti de

la vitesse maximum. Malheureusement, lextrapolation dune hyperbole partir de quelques points nest pas facile

et ne permet pas de faire le trac dune telle courbe partir des mesures de vitesses initialesfaites rellement au cours dexpriences avec des concentrations de substrat diffrentes.



EE 28

Pour crire la ligne 19, on a pris les inverses des deux membres de lquation de Michaelis &Menten.

En effectuant le produit des facteurs du second membre (ligne 20) en sparant les deux termesadditifs du numrateur (ligne 21) puis le facteur contenant la variable S (ligne 22) lquationde Michaelis & Menten prend alors une allure de fonction linaire de type y = ax + b . Danscette transformation due LINEWAEVER et BURK, linverse de la vitesse initiale est expri-m en fonction de linverse de la concentration du substrat et des constantes Km et Vmax.


4.22 Diagramme de Lineweaver et Burk2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 57/131

EE 29

Le graphe reprsentant cette fonction linaire est appel graphe en double inverse puisque lesdeux variables sont respectivement les inverses des variables de lhyperbole prcdente. Surlaxe des x , les concentrations croissantes du substrat ont des inverses qui diminuent de sorteque le croisement des axes reprsente linverse dune concentration infinie du substrat, alorsque la plus petite concentration voit son inverse (2 / Km) repouss lextrmit de laxe. Demme sur laxe des y , les inverses des vitesses les plus lentes sont les plus haut situs. Ltudede cette fonction montre que lordonne lorigine est gale linverse de la vitesse maxi-mum. Le double de cette ordonne correspond linverse de la moiti de la vitesse maximumet par consquent labscisse du point de la droite qui a cette ordonne est linverse du Km. Unetelle droite est facile tracer partir des mesures exprimentales pourvu quon exprime lesrsultats en inverses des vitesses initiales en fonction des inverses des concentrations de subs-trat choisies. Cette extrapolation permet de dterminer graphiquement les valeurs cherchesdes constantes Vmax et Km.

Effet de la concentration de substrat58/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Effet de la concentration des effecteurs




5.1 Facteurs : les effecteurs60/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 30

Le substrat et le produit, lenzyme, les ions, les coenzymes et lnergie sont les facteurs indis-pensables la raction enzymatique. Les autres molcules qui entrent en liaison avec lenzy-me, les ligands, peuvent avoir un effet positif ou ngatif. Ils peuvent favoriser ou au contrairecontrarier le droulement de la raction.


5.2 Effecteur2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 61/131

EE 31

Les ligands qui peuvent modifier la vitesse de la raction sans tre des cofacteurs indispensa-bles, nous les appellerons effecteurs. Les effecteurs peuvent tre des molcules ou des atomesquelconques, minraux ou organiques. Ceux des effecteurs qui acclrent la raction sont lesactivateurs. Ceux qui la ralentissent sont les inhibiteurs.


5.3 Inhibition comptitive (quation)62/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 32

Lorsque la liaison dun inhibiteur sur lenzyme a pour effet dempcher la liaison enzyme-substrat, on parle dinhibition comptitive vis vis de ce substrat. Concuremment la liaisonenzyme-substrat il y a une liaison enzyme-inhibiteur qui aboutit un complexe E I inactif. Laconstante de dissociation de ce complexe E I soit K i est dfinie par rapport aux concentrationsde lenzyme libre, de linhibiteur et du complexe E I.

Dans lquation de la conservation de lenzyme (ligne 9*) il apparat une autre forme delenzyme : le complexe E I. Lquation de la vitesse (ligne 7*), qui ne dpend que du comple-xe E S puisque le complexe E I est inactif, reste inchange.

Les calculs conduisent une quation de Michaelis dans laquelle le facteur Km est affectdun coefficient qui dpend de la concentration de linhibiteur et de linverse de la constanteK i cest dire laffinit de lenzyme pour linhibiteur (ligne 18*).


5.4 Inhibition comptitive (hyperbole)2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 63/131

EE 33

Le graphe reprsentant la vitesse initiale en fonction de la concentration du substrat va doncdpendre de la concentration de linhibiteur.

La courbe I0 reprsente la fonction en labsence de linhibiteur. Les courbes I1 et I2 reprsen-tent la fonction deux concentrations dinhibiteur, la seconde double de la premire.

On observe que la vitesse maximum est inchange puisquelle reprsente une situation o latotalit des molcules denzyme sont occupes par des molcules de substrat et quil ny adonc pas de complexes enzyme-inhibiteur. La moiti de cette vitesse maximum est atteintepour des concentrations de substrat croissantes avec la concentration de linhibiteur : le Kmapparent est donc bien une fonction de cette concentration dinhibiteur.



EE 34

En prolongeant les calculs jusqu la ligne 22*, on aboutit toujours une quation de fonctionlinaire.


5.6 Inhibition comptitive (double inverse)2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 65/131

EE 34/1

Le graphe en double inverse montre la droite reprsentant la situation sans inhibiteur (I0) etles droites reprsentant leffet des concentrations I1 et I2 de linhibiteur. Linverse de la vites-se maximum, inchange, reprsente le point commun de toutes ces droites : ceci est caract-ristique des graphes en double inverse en prsence de diffrentes concentrations duninhibiteur comptitif.


5.7 Exemple dinhibition comptitive : la 66/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

succinate dshydrognase

EE 35

La succinate dshydrognase est une enzyme de la membrane interne de la mitochondrie. Sastructure est complexe et comporte plusieurs coenzymes lis.

La raction catalyse est une oxydation du succinate en fumarate avec transfert des hydrog-nes sur le coenzyme Q. Le succinate est un diacide 4 carbones, qui se fixe lenzyme grceaux charges ngatives de ses fonctions acides ; lenzyme peut alors dplacer les deux hydro-gnes des carbones centraux.

Le malonate est aussi un diacide et la distance entre ses deux charges ngatives est voisine decelle qui spare les deux fonctions acides du succinate : le malonate peut se fixer aussi sur lesite actif de lenzyme, mais la structure de son unique carbone intermdiaire ne permet vi-demment pas loxydation ; la liaison de la succinate dshydrognase avec le malonate renddonc lenzyme inactive. Une concentration plus leve de lun de ces deux diacides chasseralautre du site actif de lenzyme, de sorte quil y a bien comptition des deux molcules vis vis de lenzyme.


5.8 Inhibition non comptitive (quation)2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 67/131

EE 36

Lorsque la liaison dun inhibiteur sur lenzyme se fait sur un site tout fait indpendant dusite actif, il ny a videmment aucune comptition entre le substrat et linhibiteur. Linhibiteuren se liant rend la molcule denzyme incapable de catalyser la raction : on parle alors din-hibition non comptitive.

Toutes les molcules denzyme peuvent entrer en liaison avec linhibiteur. Le complexe en-zyme-substrat donne un complexe enzyme-substrat-inhibiteur inactif. Lenzyme libre en sas-sociant avec linhibiteur donne un complexe enzyme-inhibiteur qui peut lui-mme lier unemolcule de substrat, en donnant un complexe E S I, identique celui obtenu partir du com-plexe E S et bien sr inactif. La constante Km de lenzyme vis vis du substrat reprsente tou-jours la constante de dissociation du complexe E S mais aussi celle du complexe E S I en E Iet substrat libre. La constante K i de lenzyme vis vis de linhibiteur reprsente toujours laconstante de dissociation du complexe E I mais aussi celle du complexe E S I en E S et inhi-biteur libre.

Dans lquation de la conservation de lenzyme (ligne 9) il apparait deux autres formes delenzyme : le complexe enzyme-inhibiteur et le complexe enzyme-substrat-inhibiteur.Lquation de la vitesse (ligne 7), qui ne dpend que du complexe E S puisque les complexesE I et E S I sont inactifs, reste donc inchange.



EE 37

Les calculs conduisent une quation de Michaelis (ligne 18) dans laquelle la vitesse maxi-mum est affecte dun coefficient qui dpend de la concentration de linhibiteur et de linversede la constante K i cest dire de laffinit de lenzyme pour linhibiteur.

La constante Km, au contraire reste la mme que dans le cas gnral. En prolongeant les calculs jusqu la ligne 22, on aboutit toujours une fonction linaire.


5.10 Inhibition non comptitive (hyperbole)2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 69/131

EE 37/1

Le graphe reprsentant la vitesse initiale en fonction de la concentration de substrat va doncdpendre de la concentration de linhibiteur.

La courbe I0 reprsente la fonction en labsence de linhibiteur. Les courbes I1 et I2 reprsen-tent la fonction deux concentrations dinhibiteur, la seconde double de la premire. On ob-serve que la vitesse maximum change en fonction de la concentration de linhibiteur puisquela concentration de lenzyme, mme concentration infinie du substrat, se trouve diminuedes molcules denzyme lies linhibiteur, devenues inactives.

La moiti de cette vitesse maximum est atteinte pour des concentrations de substrat toujoursgales puisque linhibiteur naffecte pas la liaison de lenzyme avec le substrat.


5.11 Inhibition non comptitive (double 70/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

inverse)

EE 38/1

Le graphe en double inverse montre la droite reprsentant la situation sans inhibiteur (I0) etles droites reprsentant leffet des concentrations I1 et I2 de linhibiteur.

Linverse de la vitesse maximum augmente avec la concentration de linhibiteur de mme quela pente de la droite. Pour chacune de ces droites, le point qui a pour ordonne le double delordonne lorigine (losanges) correspond toujours la mme abscisse qui est linverse duKm. Le point commun de toutes ces droites est situ gauche de laxe des y , dans une partiedu graphe qui na pas de sens physique puisquon est au-del dune concentration infinie dusubstrat ! Mais le calcul de cette abscisse montre quelle est de - 1/Km ce qui permet une d-termination graphique facile de cette constante. La rencontre de toutes les droites en ce pointde laxe des x est caractristique des graphes en double inverse en prsence de diffrentes con-centrations dun inhibiteur non comptitif.


5.12 Exemple dinhibition non comptitive : 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 71/131

lanhydrase carbonique

EE 39

Lanhydrase carbonique, que nous avons dj rencontre comme exemple, est inhibe parlactazolamide qui est un mdicament.

Cette inhibition est non comptitive vis vis du gaz carbonique, substrat de lenzyme.

Effet de la concentration des effecteurs72/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Effets allostriques


Effets allostriques

Effets allostriques

6.1 Sous-unit (dune protine)74/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 40

Lorsquune protine est compose de plusieurs chanes dacides amins, chacune de ces cha-nes est une sous-unit de la protine.

Larrangement spatial des sous-units constitue la structure quaternaire de la protine.

Effets allostriques

6.2 Protomre2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 75/131

EE 40/1

Les corps chimiques dont la molcule est constitue de rptitions multiples dun mme en-semble datomes sont des polymres. Lunit structurale ainsi rpte est un protomre oumonomre. Lorsque le nombre de rptitions est faible le polymre est appel oligomre.

Une protine constitue de sous-units identiques est un oligomre. Chaque protomre dune protine oligomrique peut tre form de plusieurs sous-units.

Effets allostriques

6.3 Symtrie76/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 41

Le comportement des enzymes que nous avons vues jusque l, lorsque la concentration dusubstrat change, rpond lquation de Michaelis : ce sont des enzymes cintique michae-lienne.

Dautres enzymes de structure plus complexe ont une affinit vis vis du substrat qui nestpas une constante ou bien voient leur vitesse maximum changer en fonction de la concentra-tion des effecteurs : ce sont les enzymes cintique allostrique.

Ces enzymes ont toujours une structure quaternaire compose de plusieurs chanes dacidesamins, formant des sous-units ou protomres presque identiques entre elles. La protine estdonc un oligomre de 2 ou 4 sous-units par exemple. Les protomres sont arrangs dans les-pace de faon que chacun dentre eux ait les mmes liaisons avec les autres. Un tel arrange-ment est dit symtrique. Cest le cas des deux protomres dune paire ou des quatreprotomres placs aux 4 sommets dun ttradre.

Effets allostriques

6.4 Sites de liaison2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 77/131

EE 41/1

Les sites de liaison existent de faon identique sur chaque protomre.

Effets allostriques

6.5 Conformations78/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 41/2

Parce que chaque protomre a des liaisons avec les autres protomres du systme, le plus sou-vent de type lectrostatique, sa structure secondaire et tertiaire et son nergie interne sont mo-difies par ces liaisons.

Effets allostriques

6.6 Etats de transition2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 79/131

EE 41/3

Lorsque lnergie interne dun protomre augmente par suite de la modification de cesliaisons, on dit quil passe un tat tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons lui imposentune structure correspondant une nergie interne diminue, on dit quil passe un tat rela-ch.

Effets allostriques

6.7 Effets sur la raction enzymatique80/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 41/4

Ces changements dnergie interne se traduisent par des modifications de laffinit de lenzy-me vis vis du substrat ou encore de la vitesse initiale de la raction.

Effets allostriques

6.8 Conservation de la symtrie2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 81/131

EE 41/5

Le passage dun protomre de ltat relach ltat tendu implique en gnral la transforma-tion de la structure des autres protomres dans le mme sens pour maintenir la symtrie de lastructure densemble.

Effets allostriques

6.9 Allostrie82/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 42

Lallostrie concerne des protines doues d'activit : enzymes, transporteurs, canaux, pom-pes, rcepteurs, protines contractiles, etc...

Les effecteurs allostriques sont des ligands dont le site de fixation est diffrent du site defixation du substrat (site actif, site catalytique). Cela peut tre une autre molcule de substratou de produit, diffrente de celle qui participe la raction enzymatique ou au transport : onparle alors d'effet allostrique homotrope. Si au contraire l'effecteur est une molcule diff-rente, on parle alors d'effet allostrisque htrotrope.

Lorsqu'une protine allostrique comporte plusieurs sous-units, la fixation du substrat ou del'effecteur sur une sous-unit se traduit par un effet sur les autres sous-units de la protine.

La modification de l'activit est toujours quantitative : augmentation, on parle alors d'activa-tion allostrique ou ralentissement, ou inhibition allostrique.

Effets allostriques

6.10 Modle symtrique2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 83/131

EE 42/1

Ce modle symtrique des enzymes allostriques est d MONOD, WYMAN et CHAN-GEUX.

Supposons pour simplifier quil ny ait que deux tats possibles des protomres : ltat tenduet ltat relach. Dans une protine 4 sous-units la conformation tendue de 2 dentre ellesimposera aux deux autres de prendre cette structure.

Supposons que cet tat relach implique une affinit plus grande pour le substrat et que la pr-sence du substrat lui-mme favorise le passage cet tat : les 4 protomres ltat tendu (enhaut gauche) vont tre contraints si lun dentre eux se lie au substrat, de passer ltat re-lach, ce qui entranera pour les trois autres une affinit plus grande vis vis du substrat etactivera la raction.

Il stablit une coopration entre les protomres pour que le substrat soit plus efficacementtransform.

Effets allostriques

6.11 Modle non symtrique84/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 42/2

KOSHLAND a tendu ce modle des oligomres non symtriques dans la structure desquelschacun des protomres peut tre tendu ou relach, sans cesser de subir la contrainte des autrespour le faire changer dtat.

Effets allostriques

6.12 Diagramme de Hill2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 85/131

EE 43

Le graphe reprsentant la vitesse initiale dune enzyme allostrique nest pas une hyperbolecomme celui des enzymes michaliennes. Les constantes de vitesse et daffinit de telles en-zymes varient en fonction des ligands, de telle sorte que la courbe prend une forme sigmode,caractristique de la coopration qui se fait entre les protomres.

Sur cet exemple, on a reprsent la vitesse initiale dune raction allostrique en fonction dela concentration dun substrat qui lui-mme exerce un effet sur lenzyme tendant diminuerla constante Km. Par comparaison, la courbe en tirets reprsente la mme raction en cintiquemichalienne (sans cet effet allostrique).

Cette cintique allostrique est plus lente que la cintique michaelienne pour les petites con-centrations du substrat et devient plus rapide au-del. Aux environs du point dinflexion decette sigmode la pente de la courbe est plus accuse, ce qui signifie que pour une mme dif-frence entre deux concentrations du substrat, lacclration de la raction sera plus grandedans le cas de lenzyme allostrique. Cette proprit de cooprativit des protomres donneun avantage aux systmes allostriques par rapport aux enzymes cintique michaeliennepour la rgulation de la vitesse des ractions enzymatiques.

Effets allostriques

6.13 Exemple dallostrie : myoglobine ; 86/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

hmoglobine

EE 44

La myoglobine est une protine qui transporte loxygne dans le cytoplasme des cellules. Elleest constitue dune seule chane dacides amins. Sa vitesse de transport de loxygne enfonction de la pression de ce gaz, est de type michalien et la courbe qui la reprsente est unehyperbole.

Lhmoglobine est une protine qui transporte loxygne dans les globules rouges. Elle estconstitue de quatre chanes dacides amins. Sa vitesse de transport de loxygne en fonctionde la pression de ce gaz, est de type allostrique et la courbe qui la reprsente est une sigmo-de. La coopration entre les protomres confre lhmoglobine une grande affinit pourloxygne dans les poumons o il est abondant, et au contraire une faible affinit pour loxy-gne dans les tissus o il est transmis aux cellules.

Lhmoglobine a donc un comportement diffrent dun organe lautre lorsque les pressionsdoxygne sont diffrentes. Cette protine sadapte mieux aux conditions du milieu grce lallostrie.

Effets allostriques

6.14 Exemple dallostrie : lhexokinase2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 87/131

EE 44/1

Lhexokinase est une enzyme de la membrane plasmique de toutes nos cellules. Elle catalyse une raction de transfert de phosphate et dnergie du coenzyme ATP vers le

glucose quelle active en glucose-6-phosphate. Un proton est libr. La raction couple est exergonique et irrversible. Le glucose-6-phosphate, produit de la raction catalyse, est en outre un rgulateur allostri-

que de lhexokinase. Il se fixe sur un site de liaison diffrent du site actif et cette fixation di-minue laffinit du site actif pour le glucose. Il en rsulte un ralentissement de la vitesse deraction.

Effets allostriques

6.15 Exemple dallostrie : la 88/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

phosphofructokinase

EE 44/2

La phosphofructokinase (en abrg PFK) est une enzyme prsente dans toutes nos cellules. Elle comporte 4 sous-units presque identiques, avec 4 sites actifs pour une masse molculaire

de 340000 daltons. Elle catalyse une raction de transfert de phosphate et dnergie du coenzyme ATP vers le

fructose 6-phosphate quelle active en fructose 1,6-diphosphate. Un proton est libr. La raction couple est exergonique et irrversible. La PFK est lenzyme la plus lente de la glycolyse cytoplasmique, voie mtabolique du mta-

bolisme nergtique. Elle catalyse ltape dengagement des glucides dans la productiondnergie. Elle est donc lenzyme-cl de cette voie mtabolique.

La cintique de la PFK est allostrique; elle est rtroinhibe par le produit final de la glycoly-se, lATP. Une molcule dATP (effecteur allostrique), diffrente de celle qui apporte lephosphate et lnergie (coenzyme), se fixe sur un site de liaison de chaque protomre et cettefixation diminue laffinit du site actif pour le fructose 6-phosphate. Il en rsulte un ralentis-sement de la vitesse de raction.

Effets allostriques

6.16 Effet de lATP sur la PFK2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 89/131

EE 44/3

Lorsque on reprsente sur un graphe la constante Km de la PhosphoFructoKinase pour sonsubstrat le Fructose-6-phosphate, en fonction de la concentration de lATP, produit final dumtabolisme nergtique, on montre que cette constante Km est dautant plus leve que cetteconcentration augmente.

Laffinit de la PFK pour le Fructose-6-phosphate diminue avec laugmentation de la concen-tration du produit final : il y a donc rtroinhibition de lenzyme par lATP.

Effets allostriques

6.17 Exemple dallostrie : la glycogne 90/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

phosphorylase

EE 44/4

Les glycogne phosphorylases sont des enzymes qui catalysent la premire raction de la gly-cognolyse. Ce sont de grosses protines dune masse molculaire de 500000 daltons.

On les rencontre dans le cytoplasme des cellules contenant du glycogne (foie, muscles). Laphosphorylase du foie est forme de 4 sous-units, celle du muscle de 2 sous-units.

Elle catalyse la phosphorolyse de la liaison glycosidique -1,4 qui unit le dernier glucosedune branche au reste de la molcule de glycogne. Le glucose ainsi dtach reoit le radicalphosphoryl sur son Carbone 1, tandis que le glucose suivant rcupre la fonction alcool se-condaire sur son Carbone 4. La raction est faiblement endergonique.

La phosphorylation de lenzyme (sur une Srine) est indispensable pour que lenzyme soit ac-tive.

La glycogne phosphorylase du muscle est active allostriquement par deux effecteurs : lephosphate, galement substrat (effet homotrope) et lAMP qui ne prend pas part la raction(effet htrotrope). En outre, ltat actif lenzyme se dimrise, passant de 2 4 sous-unitspar molcule.

Effets allostriques

6.18 Effet de lAMP sur la glycogne 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 91/131

phosphorylase

EE 44/5

Le graphe reprsente la vitesse de la raction en fonction de la concentration du phosphate,qui est la fois substrat et activateur allostrique.

La courbe sigmode traduit un effet coopratif du phosphate sur les sous-units, favorisant lepassage la forme relache, plus rapide : cest un effet homotrope positif.

Ladjonction de lAMP dans le milieu des doses croissantes (10 puis 100 mM) montre uneactivation de la raction pour toutes les concentrations de phosphate. LAMP, activateur al-lostrique, favorise galement le passage des sous-units la forme relache.

Effets allostriques

6.19 Voie mtabolique92/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 45

Les ractions enzymatiques permettent notre organisme de faire la synthse des molculesbiologiques dont il a besoin. Cette synthse seffectue partir de composs simples souventdorigine alimentaire. Un compos A par exemple peut tre le substrat de ractions enzyma-tiques conduisant vers des synthses varies. Cest un carrefour mtabolique. Chacune de cessynthses va se faire en plusieurs tapes (A, B, C, D,...) chacune catalyse par une enzymespcifique (E, F, G,...).

La vitesse de synthse du dernier produit dpend de la vitesse de la plus lente de ces enzymes.Si ce produit final est en quantit insuffisante, il faut que cette enzyme soit active. Si au con-traire il y a une concentration leve du produit D, il faut que cet enzyme soit inhibe.

Il est souhaitable que les composs intermdiaires ne saccumulent pas, donc que lenzyme laplus lente, qui va tre rgule, soit celle qui catalyse la premire des ractions conduisant auproduit final. Dans cet ensemble de ractions enzymatiques lenzyme E, catalysant la trans-formation de A en B, premire tape de la synthse, est celle qui doit tre rgule par des ef-fecteurs qui permettront de contrler la vitesse de lensemble. Par exemple, un excs deproduit final peut aboutir linhibition de cette premire tape : cest la rtroinhibition.

Effets allostriques

6.20 Voie mtabolique2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 93/131

EE 46

Cette unit de production cellulaire dun compos biologique sappelle une voie mtabolique. Elle est constitue de plusieurs ractions catalyses par des enzymes diverses. Chacune de ces

enzymes peut ventuellement participer plusieurs voies mtaboliques. Lorsque le mtabolisme dun compos implique un trs grand nombre dtapes, et plusieurs

carrefours mtaboliques, la synthse totale constitue un ensemble de voies mtaboliques suc-cessives.

Effets allostriques

6.21 Carrefour mtabolique94/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 46/1

Les intermdiaires mtaboliques partir desquels on peut entrer dans des voies mtaboliquesdiffrentes sont les carrefours mtaboliques.

Toute voie mtabolique commence par un substrat initial qui est un carrefour mtabolique, unnutriment ou un aliment.

Toute voie mtabolique sachve par un produit final qui est un carrefour mtabolique ou unproduit scrt par la cellule.

Effets allostriques

6.22 Enzyme-cl2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 95/131

EE 47

Dans une voie mtabolique, celle des enzymes qui a la vitesse la plus lente et qui par cons-quent contrle la vitesse de la synthse est appele lenzyme-cl.

Cest habituellement la premire des enzymes de la voie. Cette enzyme-cl est inhibe pourdiminuer la synthse du produit final de la voie mtabolique ou au contraire active pourlaugmenter. Les enzymes-cls sont toutes des enzymes allostriques contrles par de mul-tiples effecteurs.

Effets allostriques96/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Cintique deux substrats




7.1 Mcanisme bibi ordonn98/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 48

Lorsquune raction enzymatique implique deux substrats ou un substrat et un coenzyme li-bre, les phases de la raction enzymatique au niveau molculaire se compliquent : on parle decintique deux substrats.

Pour certaines enzymes, il se forme dabord un premier complexe entre le premier substrat etlenzyme. Ce complexe Enzyme-Substrat A forme ensuite un complexe avec le secondsubstrat : Enzyme-Substrat A-Substrat B. Ce complexe ternaire est alors transform par lac-tion de lenzyme en un complexe Enzyme-Produit Y-Produit Z qui se dissocie en librant danslordre le produit Y et le produit Z.

Lenzyme libre nayant pas daffinit pour le substrat B, le complexe ne peut pas se formerdans un ordre diffrent : cest ce qui justifie lappellation bibi ordonn quon donne ce m-canisme.


7.2 Exemple de bibi ordonn : lalcool 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 99/131

dshydrognase

EE 49

Lalcool dshydrognase est une enzyme quon trouve dans le cytoplasme de la plupart de noscellules. Elle catalyse loxydation de lthanol en actaldhyde en rduisant simultanmentun coenzyme NAD+ en NADH.

Cette raction se droule selon un mcanisme de type bibi ordonn : lenzyme na pas daffi-nit pour lalcool si elle nest pas pralablement associe au coenzyme NAD+ en un premiercomplexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Ethanol se transforme en un complexeEnzyme-NADH-Actaldhyde ; ce dernier complexe se dissocie en librant lactaldhydepuis le NAD rduit.

De nombreuses autres dshydrognases utilisant le NAD comme coenzyme suivent un mca-nisme de type bibi ordonn.


7.3 Exemple de bibi ordonn : la malate 100/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

dshydrognase

EE 49/1

La malate dshydrognase est une enzyme quon trouve dans toutes les cellules. Elle catalyseloxydation du malate en oxaloactate en rduisant simultanment un coenzyme NAD+ enNADH.

Cette raction se droule selon un mcanisme de type bibi ordonn : lenzyme na pas daffi-nit pour le malate si elle nest pas pralablement associe au coenzyme NAD+ en un premiercomplexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Malate se transforme en un complexeEnzyme-NADH-Oxaloactate ; ce dernier complexe se dissocie en librant loxaloactatepuis le NAD rduit.



7.4 Exemple de bibi ordonn : la 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 101/131

phosphoglycraldhyde dshydrognase

EE 49/2

La phosphoglycraldhyde dshydrognase est une enzyme quon trouve dans toutes les cel-lules. Elle catalyse loxydation du phosphoglycraldhyde en 1,3-diphosphoglycrate en r-duisant simultanment un coenzyme NAD+ en NADH.

Cette raction se droule selon un mcanisme de type bibi ordonn : lenzyme na pas daffi-nit pour le phosphoglycraldhyde si elle nest pas pralablement associe au coenzymeNAD+ en un premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Phosphoglycral-dhyde se transforme en un complexe Enzyme-NADH-Diphosphoglycrate ; ce dernier com-plexe se dissocie en librant le diphosphoglycrate puis le NAD rduit.



7.5 Exemple de bibi ordonn : lUDP-glucose 102/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

pyrophosphorylase

EE 49/3

LUDP-Glucose pyrophosphorylase est une enzyme du foie et du muscle qui active le gluco-se-1-phosphate en transfrant une molcule dacide uridylique provenant de lUTP. Le pro-duit activ est appel UDP-Glucose. Un pyrophosphate est libr.

Cette raction se droule selon un mcanisme de type bibi ordonn : lenzyme na pas daffi-nit pour lUTP si elle nest pas pralablement associe au glucose-1-phosphate en un premiercomplexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-UTP-Glucose-1-phosphate se transforme en uncomplexe Enzyme-UDP-Glucose-Pyrophosphate ; ce dernier complexe se dissocie en lib-rant le pyrophosphate puis lUDP-Glucose.


7.6 Mcanisme bibi alatoire2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 103/131

EE 50

Dautres enzymes deux substrats sont capables de former le complexe Enzyme-Substrat A-Substrat B en fixant les deux substrats (ou coenzyme libre) lun aprs lautre mais sans ordrefixe : la probabilit de commencer par Enzyme-Substrat A ou par Enzyme-Substrat B ne d-pendant que des affinits respectives de lenzyme pour ces deux corps chimiques. Cest ce quijustifie lappellation bibi alatoire quon donne ce mcanisme.


7.7 Exemple de bibi alatoire : la cratine 104/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

phosphokinase

EE 51

La cratine phosphokinase (CPK) est une enzyme des muscles des Vertbrs. Elle catalyse letransfert dun radical phosphoryl du substrat, le phosphate de cratine, vers un coenzymetransporteur, lADP.

Laffinit de lenzyme pour ces deux corps chimiques tant voisine, la liaison de lenzymeavec chacun dentre eux se fait dans un ordre qui dpend uniquement des concentrations.


7.8 Exemple de bibi alatoire : la citrate 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 105/131

synthase

EE 51/1

La citrate synthase est une enzyme des mitochondries. Elle catalyse le transfert dun radicalactyl du premier substrat, lactate transport par le coenzyme A vers lautre substrat, loxa-loactate.

Laffinit de lenzyme pour ces deux corps chimiques tant voisine, la liaison de lenzymeavec chacun dentre eux se fait dans un ordre qui dpend uniquement des concentrations.


7.9 Mcanisme ping-pong106/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 52

Pour dautres enzymes, la raction sera catalyse en deux temps. Le complexe form entre lenzyme et le substrat A est transform dabord en enzyme +

produit Y, mais lenzyme E a t chimiquement modifie en enzyme E au cours de cette pre-mire partie de la raction.

Lenzyme E ayant une affinit pour le deuxime substrat, va former un deuxime complexeEnzyme E-Substrat B qui va tre transform en complexe Enzyme-Produit Z dans une secon-de partie de la raction o lenzyme va retrouver sa forme chimique initiale.

Il ny a jamais de complexe ternaire dans un tel mcanisme, mais lenzyme (ou un coenzymeli sa structure) subit une transformation rversible et provisoire qui permet le lien entre lesdeux substrats.

Cest ce qui justifie lappellation de ping-pong quon donne ce mcanisme.


7.10 Exemple de ping-pong : lalanine 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 107/131

aminotransfrase = ALAT

EE 53

LALAT catalyse le transfert de la fonction amine de lalanine vers l-ctoglutarate quelletransforme en glutamate.

Dans un premier temps, lALAT se lie lalanine puis transfre la fonction amine sur un coen-zyme li : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesser dtreli lenzyme. Lenzyme se dissocie alors du pyruvate.

Dans le second temps, lenzyme lie au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe avecl-ctoglutarate, puis transfre la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate depyridoxal, vers le second substrat qui est transform en glutamate. Enfin, le complexe ALAT-glutamate se dissocie : lenzyme et son coenzyme li ont recouvr leurs structures initiales.


7.11 Exemple de ping-pong : laspartate 108/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

aminotransfrase = ASAT

EE 53/1

LASAT catalyse le transfert de la fonction amine de laspartate vers l-ctoglutarate quelletransforme en glutamate.

Dans un premier temps, lASAT se lie laspartate puis transfre la fonction amine sur uncoenzyme li : le phosphate de pyridoxal qui devient phosphate de pyridoxamine sans cesserdtre li lenzyme. Lenzyme se dissocie alors de loxaloactate.

Dans le second temps, lenzyme lie au phosphate de pyridoxamine, forme un complexe avecl-ctoglutarate, puis transfre la fonction amine du coenzyme qui redevient phosphate depyridoxal, vers le second substrat qui est transform en glutamate. Enfin, le complexe ASAT-glutamate se dissocie : lenzyme et son coenzyme li ont recouvr leurs structures initiales.


7.12 Exemple de ping-pong : la 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 109/131

phosphonolpyruvate carboxykinase = PEPCK

EE 53/2

La PEPCK est une enzyme du foie ou du rein qui catalyse le transfert dun radical phosphoryldu GTP vers loxaloactate puis dcarboxyle ce produit intermdiaire pour aboutir au phos-phonolpyruvate (PEP).

Dans un premier temps, la PEPCK se lie au GTP puis transfre le radical phosphoryl sur unacide amin du site actif. Lenzyme se dissocie alors du GDP.

Dans le second temps, lenzyme phosphoryle forme un complexe avec loxaloactate, puistransfre le radical phosphoryl vers le substrat qui est phosphoryl et dcarboxyl. Enfin, lecomplexe PEPCK-PEP se dissocie : lenzyme a retrouv sa structure initiale.

Cintique deux substrats110/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Effet des constantes physiques

Partie III 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 111/131

Effet des constantes physiquesRappel des objectifs

Etudier1 la vitesse dune raction enzymatique en fonction du pH ou de la temprature. Etudier les variations de lnergie libre du complexe enzyme-substrat au cours des phases de

la raction enzymatique. Dfinir2 lnergie dactivation, la raction enzymatique couple etla liaison riche en nergie.

1. Etudier : suivre les valeurs dune fonction pour toutes les valeurs de la variable.2. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant

toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

Effet des constantes physiques112/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

Effet du pH


Effet du pH

Effet du pH

8.1 Dnaturation114/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 54

Lenzyme, les substrats, les cofacteurs sont les corps chimiques qui interviennent obligatoi-rement dans la raction enzymatique.

Parmi les facteurs qui interviennent il y a aussi des facteurs physiques : le pH et la tempraturepar exemple. Le pH intervient de deux manires diffrentes : soit en modifiant la structure se-condaire ou tertiaire de lenzyme, soit en modifiant les charges lectriques des radicaux desacides amins du site actif.

Lorsquune enzyme est conserve dans un milieu dont le pH est dfavorable au maintien desa structure, elle va subir une dnaturation.

Examinons cet effet sur un graphe reprsentant lactivit rsiduelle dune enzyme qui a tconserve pendant 24 heures une temprature de 30C., en fonction du pH de ce milieu deconservation.

A pH 3 cette enzyme a t conserve dans des conditions optimales et son activit rsiduelleest la plus grande : 100%. A pH 6 lenzyme a subi une dnaturation partielle si bien quaubout de 24 heures son activit nest plus que de la moiti de ce quelle aurait t si on lavaitconserve pH 3. A pH 9 ou bien en dessous de pH 3, cet effet dnaturant est encore plusmarqu.

Effet du pH

8.2 Charges lectriques2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 115/131

EE 55

Le milieu dans lequel se produit la raction enzymatique dtermine la charge lectrique desradicaux des acides amins de la protine.

Aux pH trs acides la plupart des fonctions ionisables de ces radicaux sont sous la forme pro-tone cest dire COOH pour la fonction acide carboxylique et NH3+ pour la fonction amine.

Aux pH les plus alcalins les fonctions ionisables de ces mmes radicaux sont sous la formedprotone cest dire COO- pour la fonction acide carboxylique, et NH2 pour la fonctionamine.

A pH voisin de la neutralit, une trs grande majorit de ces radicaux fonctions ionisablessont chargs ce qui facilite les liaisons enzyme-substrat ou enzyme-coenzyme de type lec-trostatique.

Il existe donc un pH du milieu ractionnel o les charges lectriques des radicaux du site actifde lenzyme seront les plus favorables la liaison enzyme-substrat : on appelle ce pH le pHoptimum de la raction enzymatique.

Effet du pH

8.3 pH optimum116/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 56

Les enzymes de la digestion des protines ont des pH optimums diffrents pour sadapter auxconditions de pH qui rgnent dans la lumire aux diffrents tages du tube digestif. Ainsi lac-tivit de la pepsine est maximum pour un milieu trs acide comme celui de lestomac o elleest secrte. Au contraire les enzymes pancratiques comme lamylase et la trypsine, ont unpH optimum daction plus alcalin car dans le duodnum o elles exercent leur activit le pHest normalement proche de 8.

Effet du pH

8.4 Exemple de pH optimum : la fumarase2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 117/131

EE 57

La fumarase est une enzyme des mitochondries qui catalyse la transformation rversible dufumarate en malate.

Le pH de la matrice mitochondriale o se trouve cette activit enzymatique, varie en fonctiondes circonstances physiologiques.

Le pH optimum de lenzyme est diffrent pour la raction avec le fumarate comme substrat(6,20) ou pour la raction inverse avec le malate (7,50).

De sorte que lorsque le pH de la mitochondrie est bas (acidose) lenzyme favorisera la trans-formation du fumarate en malate.

Le pH agit donc ici comme un effecteur de la raction.

Effet du pH

8.5 Exemple de pH optimum : la lactate 118/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

dshydrognase

EE 57/1

La lactate dshydrognase (LDH) est une enzyme du cytoplasme qui catalyse la transforma-tion rversible du pyruvate en lactate.

Le pH du cytoplasme de la cellule varie en fonction des circonstances physiologiques. Le pH optimum de lenzyme est diffrent pour la raction avec le pyruvate comme substrat

(7,20) ou pour la raction inverse avec le lactate (10,00). De sorte que lorsque le pH du cytoplasme est bas (acidose) lenzyme favorisera la transfor-

mation du pyruvate en lactate. Le pH agit donc ici comme un effecteur de la raction.

Effet de la temprature




9.1 Temprature optimum120/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 58

Examinons maintenant leffet de la temprature du milieu sur la raction enzymatique qui sydroule.

Le graphe qui reprsente les quantits de produit transformes par une enzyme (A) en fonctionde la temprature () du milieu dincubation, est une courbe ascendante jusqu une tempra-ture (ici 45C.) o lactivit de lenzyme est la plus grande, puis rapidement descendante.


9.2 Activation ; dnaturation2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 121/131

EE 59

Ce type de courbe est la somme de deux effets superposs de la temprature sur la vitesse dela raction enzymatique.

Au dessus de 40 ou 45C. la chaleur dnature les structures secondaires et tertiaires de len-zyme et lactivit tend rapidement vers zro.

Pour les tempratures infrieures, la chaleur du milieu apporte un supplment dnergie quifacilite la raction enzymatique.

Pour mesurer cet effet de la temprature sur lactivit de lenzyme on compare lactivit delenzyme pour une temprature t avec lactivit pour une temprature t + 10C.. Cette diff-rence dactivit appele Q10 est le paramtre permettant de mesurer lactivation de lenzymepar la chaleur.


9.3 Relation dArrhenius122/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 60

La vitesse de raction pour les tempratures non dnaturantes (ici en dessous de 45C.) estrelie la temprature par la relation dArrhenius qui montre que le logarithme de cette vites-se est inversement proportionnel linverse de cette temprature.


9.4 Energie dactivation2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 123/131

EE 61

Au cours de la raction enzymatique les corps en prsence, enzyme, substrats, cofacteurs,etc... changent donc de la chaleur avec les autres molcules de ce milieu : on dit quil y achange dnergie libre entre le complexe enzyme-substrat et le milieu.

On reprsente sur un graphe lnergie interne de ce complexe en fonction du temps au coursdes phases de la raction, dans lhypothse o lnergie interne du complexe enzyme substrat(A) est suprieure celle du complexe enzyme-produit (B) ce qui revient dire que la ractionlibrera en fin de compte de la chaleur dans le milieu.

Pour que cette raction soit possible, le complexe enzyme-substrat va dabord recevoir du mi-lieu une quantit de chaleur (dEA nergie dactivation) qui portera ce complexe un tat ac-tiv (A*) o la raction va pouvoir se produire en librant dans le milieu une quantit dechaleur (dEB) gale lnergie dactivation (dEA) augmente de la chaleur de la raction pro-prement dite (dE).


9.5 Exemple dnergie dactivation : la 124/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

fumarase

EE 62

Reprenons lexemple de la fumarase qui dans certaines conditions de milieu catalyse uneraction o la production de malate saccompagne dune libration de chaleur dans le milieude 15 kJ/mol.


9.6 Energie interne de la fumarase 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 125/131

EE 62/1

Suivons donc lvolution de lnergie interne des complexes au cours de laction de cette en-zyme.

Lenzyme et le substrat libre au dbut possdent ensemble une nergie interne E + S. Le milieu va communiquer ces molcules une nergie cintique de 17,5 kJ/mol pour que la

collision dune molcule de substrat sur lenzyme soit assez forte pour faire entrer le fumaratedans la cavit du site de fixation (ES*). Le complexe enzyme-substrat ainsi form va recevoirensuite du milieu une nergie dactivation (25,5 kJ/mol) qui va le porter un tat activ (EX*)qui permettra laddition dune molcule deau sur la double liaison.

Ds que cette raction est faite, une nergie de 63 kJ/mol est libre dans le milieu. Le complexe enzyme-produit (EP) devra tre encore ractiv par le milieu (5 kJ/mol = EP*)

pour arracher la molcule de malate la cavit du site actif. A ltat final, libres dans le milieu, la fumarase et le malate (E + P), ont ensemble une nergie

interne infrieure de 15 kJ/mol lnergie interne du substrat et de lenzyme au dpart de laraction.


9.7 Energie dactivation126/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 64

Lnergie transmise au complexe Enzyme-Substrat par la temprature du milieu est rpartiestatistiquement entre les molcules du complexe qui y sont dissoutes.

Plus la quantit dnergie ainsi transmise est grande, plus nombreux seront les complexes En-zyme-Substrat activs o la raction enzymatique va se produire.

La vitesse de raction va donc augmenter en fonction de lnergie libre que le complexe peutrecevoir du milieu.

La prsence de lenzyme a pour effet de diminuer de faon trs importante lnergie dactiva-tion dune raction chimique.


9.8 Raction couple2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 127/131

EE 65

Une raction A donne Y qui libre dans le milieu plus dnergie quelle nen a reu est diteexergonique. Cette raction est thermodynamiquement possible.

Une raction B donne Z qui reoit du milieu ambiant plus dnergie quelle nen libre est diteendergonique. Une telle raction est thermodynamiquement improbable voire impossible.

Une mme enzyme peut catalyser les deux ractions en utilisant lnergie produite par la pre-mire pour permettre la seconde davoir lieu.

De telle sorte que les deux substrats A et B donnent les deux produits Y et Z en librant unepetite quantit dnergie libre gale la diffrence de lnergie produite et consomme par lesdeux ractions isolment.

Un tel mcanisme sappelle une raction couple.


9.9 Exemple de raction couple : 128/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

lhexokinase

EE 66

Lhexokinase est une enzyme de la membrane plasmique de toutes nos cellules. Elle catalyse dune part la raction trs exergonique de transformation du coenzyme ATP en

ADP, qui libre 31 kJ/mol. Elle catalyse en mme temps la raction endergonique de phosphorylation du glucose en glu-

cose-6-phosphate, qui consomme 16 kJ/mol. En effectuant ces deux ractions en une seule raction couple, lhexokinase ralise une rac-

tion exergonique de 14 kJ/mol.


9.10 Exemple de raction couple : la 2002 - 2003 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 129/131

phosphoglycrate kinase

EE 66/1

La phosphoglycrate kinase est une enzyme du cytoplasme de toutes nos cellules. Elle catalyse dune part la raction trs exergonique dhydrolyse de la liaison de lacide phos-

phorique avec la fonction acide du glycrate, qui libre 50 kJ/mol. Elle catalyse en mme temps la raction endergonique de phosphorylation du coenzyme ADP

en ATP, qui consomme 31 kJ/mol. En effectuant ces deux ractions en une seule raction couple, la phosphoglycrate kinase

ralise une raction exergonique de 19 kJ/mol.


9.11 Liaisons riches en nergie130/131 Enzymologie lmentaire - Pr A. Raisonnier 2002 - 2003

EE 67

Ces ractions couples sont surtout possibles grce des substrats nergtiques dont lhydro-lyse libre une grande quantit dnergie, directement utilisable par les protines de la cellule.

Le coenzyme ATP en est un exemple. Dans ces molcules les liaisons chimiques dont lhydrolyse libre plus de 31 kJ/mol dnergie

biologiquement utilisable, sont appeles liaisons riches en nergie et symbolises dans la for-mule dveloppe par une liaison de forme ondule (~).

Ces liaisons peuvent tre des liaisons anhydrides entre 2 acides phosphoriques ou anhydridesmixtes entre un acide phosphorique et un acide carboxylique, des li

enzymologie

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