enzymologie appliquéemaster 1 spécialité biochimie appliquée, s’intéresse beaucoup plus aux...
TRANSCRIPT
0
اط�� ا�������� ا�����ر � ا���ا� � ا�� وزارة ا������ ا����� وا���� ا�����
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
Cours de:
Enzymologie Appliquée
Cours destiné aux étudiants de:
Master 1 Biochimie Appliquée
Préparé par Dr. BOUDOUKHA Chahra
Année universitaire : 2017-2018
Université Ferhat Abbas Sétif1
Faculté des sciences de la nature
et de la vie
"�ت ��س# ��$�% - &�'(1
*��� ��م ا�'���� وا����ة
1
CONTENU DE LA MATIERE
1. Introduction…………………………………………………………………….2
2. Rappel de la cinétique enzymatique…….………………………………………4
3. Enzymes immobilisée………..……………………………………………….....13
3.1. Propriétés des enzymes immobilisées.………………………………...........13
3.2. Méthodes d’immobilisation ………….……………………………………14
4. Modification chimique…………………………………………………….……22
4.1. Solubilité en milieu organique………………………………………..........22
4.2. Transformation de la catalyse………………………………………….......23
5. Domaines d’application des enzymes……………………………………….......24
5.1. Applications agro-alimentaires……………………………………………..24
5.2. Applications médicale et pharmaceutique…………………………………28
5.3. Applications industrielles……………………………………………..……32
6. Production des enzymes……………………………………………………........34
7. Enzymes arificielles……………………………………………………….…......37
Conclusion…………………………………………………………………… ..….39
Références……………………………………………………………………........40
2
1. Introduction
Ces dernières décennies ont vu de nombreuses avancées dans le domaine des
biotechnologies. Reproduire, du moins mimer, les processus biologiques n’est plus tout à fait
du domaine de l’impossible, et à ce titre, les protéines, et plus particulièrement les enzymes,
en tant que catalyseurs, constituent un sujet d’étude privilégié pour le développement de
nouveaux procédés de synthèse sélectifs. Les nombreux progrès en termes d’isolation, de
purification et de stabilisation de ces protéines, mais également le développement de
l’ingénierie génétique, ont conduit à une intensification de la recherche dans ce domaine, qui
n’intéresse plus seulement la biologie mais aussi le génie des procédés.
En effet, les enzymes sont susceptibles de catalyser une grande variété de réactions
conduisant à des fonctions aussi diverses que les alcools, les hydroxyacides, les acides
aminés, les aldéhydes ou les cétones. Là où les synthèses chimiques classiques nécessitent
souvent plusieurs étapes de catalyses, d’extractions et de purifications, les synthèses
enzymatiques permettent l’obtention de composés complexes, en une seule étape, le plus
souvent en milieu aqueux. De plus, elles fonctionnent à température et pression ambiante, ce
qui diminue le coût énergétique d’un procédé de synthèse. A l’heure actuelle, ce type de
catalyse est appliqué à la préparation de synthons pharmaceutiques, de compléments et
d’additifs alimentaires, de produits cosmétiques ou encore d’herbicides ou d’insecticides.
Historiquement, les premières biotransformations sont utilisées empiriquement depuis
des millénaires, il s’agit des procédés de fermentation, qui mettent en œuvre des réactions
enzymatiques en cascade. Ces procédés ont fait l’objet d’améliorations considérables ces
dernières décennies, notamment grâce au progrès du génie génétique. Ainsi, il est possible de
sélectionner une souche de micro-organisme particulièrement adaptée a la biotransformation
envisagée, voire de sur exprimer le gène codant pour une enzyme particulière. Néanmoins, les
micro‐organismes contiennent de nombreux catalyseurs biologiques différents qui conduisent
à autant de réactions secondaires. Le produit d’intérêt doit donc être extrait d’un milieu
complexe contenant la biomasse, les substrats et les produits secondaires. Au contraire,
extraire l’enzyme du microorganisme qui l’a produit, avant de la mettre en œuvre dans un
procédé de synthèse, permet d’exploiter à plein la sélectivité unique de ces protéines.
L’enzymologie appliquée, ou appelée encore, le génie enzymatique est une branche de
l’ingénierie des bioprocédés qui relève de l’exploitation des enzymes en passant par
l'identification de leurs spécificités, les conditions de leur purification, leur modification dans
3
le but d’améliorer leurs propriétés et les conditions optimales de la catalyse enzymatique et
enfin la production a grande échelle a des fins appliquées.
Le contenu de cette matière d’enzymologie appliquée, destinée aux étudiants de
Master 1 spécialité biochimie appliquée, s’intéresse beaucoup plus aux enzymes
immobilisées, leurs méthodes d’immobilisation et leurs applications dans les différents
domaines (pharmaceutique, médicale et industrielle).
4
2. Rappel de la cinétique enzymatique
2.1. Définition et généralités
Les enzymes, catalyseurs biologiques des organismes vivants, sont des
macromolécules majoritairement de nature protéique et chirale. Elles sont constituées de
plusieurs acides α-aminés de la série L unis entre eux par une liaison formée par condensation
entre le groupement carboxyle d’un acide aminé et le groupement amine d’un autre acide
aminé afin de former une liaison amide. Les enzymes sont donc des polypeptides de masses
moléculaires élevées entre 10 à 1 000 kDa. L’ordre, dans lequel sont arrangés les acides
aminés, constitue ce que l’on appelle la structure primaire des enzymes (figure 1).
Figure 1. Représentation schématique de la structure primaire d'une protéine.
Ces protéines vont avoir tendance à se replier sur elles-mêmes afin de former des
arrangements secondaires principalement en hélices α et en feuillets β (figure 2); cette
structure est stabilisée grâce à la génération de liaisons hydrogènes.
5
Figure 2. Représentation schématique de la structure secondaire d'une protéine.
L’arrangement de ces structures secondaires les unes par rapport aux autres forme une
structure tertiaire qui, elle, sera stabilisée par des ponts disulfures (figure 3).
Figure 3. Représentation schématique de la structure tertiaire d'une protéine (la glucose
oxydase.
Une structure quaternaire peut même être décrite pour les très grosses enzymes (figure
4). Cette structure tridimensionnelle de l’enzyme lui donnera sa spécificité permettant à celle-
ci de reconnaitre un substrat en particulier via une région distincte de l’enzyme, appelée le site
actif.
6
Figure 4. Représentation schématique de la structure quaternaire d'une protéine (la glucose
deshydrogénase.
2.2. Classification des enzymes
Le pouvoir catalytique des enzymes permet de produire de nouvelles substances et de
l’énergie, indispensables au bon fonctionnement des organismes vivants. C’est en fonction de
leur activité catalytique que celles-ci sont classées. Une nomenclature a été proposée par la
Commission des Enzymes de l'Union Internationale de Biochimie divisant les enzymes en six
grandes classes (tableau 1). Chaque classe est divisée en sous-classe et chaque sous-classe en
sous-sous-classe. Un "numéro" de classification est associé à chaque enzyme et est appelé
"EC number". Il se présente de la manière suivante : EC [numéro de la classe].[numéro de la
sous-classe].[numéro de la sous-sous-classe].[numéro individuel de série dans la sous-sous
classe].
Exemple: Glucose oxydase : EC 1.1.3.4. Ce chiffre est explicité ci-dessous :
EC 1 : Oxydoréductase
EC 1.1 : Agissant sur le groupe CH-OH du donneur
EC 1.1.3 : Avec l'oxygène comme accepteur
Le dernier chiffre est le numéro individuel de l’enzyme
7
Tableau 1. Classification des enzymes.
2.3. Cinétique Enzymatique
Les réactions chimiques dans les cellules sont faites par des enzymes. Les mesures
cinétiques sont parmi les outils les plus puissants pour élucider les mécanismes enzymatiques.
C'est donc un des aspects les plus importants de l'enzymologie; ces mesures nous informent
sur la spécificité de la réaction enzymatique et sur les caractéristiques physiques de l'enzyme.
En pratique, ces mesures sont essentielles en biochimie clinique, puisqu'elles permettent de
détecter des anomalies pathologiques.
L'étude de la cinétique enzymatique a commence en 1902 quand Adrian Brown a
examine la vitesse d'hydrolyse de saccharose par l'enzyme invertase
saccharose + H2O ⇌ glucose + fructose Brown a démontré que lorsque la concentration de saccharose S dépasse celle de
l'enzyme, la vitesse de la réaction devient indépendante de la concentration de saccharose ou
ordre zéro par rapport au saccharose.
8
Il a donc proposé que la réaction globale est composée de deux réactions élémentaires
le substrat forme d'abord un complexe avec l'enzyme, puis ce complexe se décompose en
produit et enzyme, où E, S, ES, et P symbolisent l'enzyme, substrat, le complexe enzyme-
substrat et le produit, respectivement
Selon ce modèle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment
importante afin de capter toute l’enzyme sous forme ES, la deuxième étape de la réaction est
limitante et la réaction globale devient insensible aux augmentations supplémentaires en
concentration de substrat.
- Dans une réaction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dépendent de la
concentration du produit final par unité de temps.- La vitesse de la réaction est donc
représentée par :
9
- La vitesse de production de ES est la différence entre les vitesses des deux réactions
élémentaires décrivant la formation de ES et sa disparition:
- Cette équation différentielle ne peut pas être intégrée de façon explicite pour tous les
cas sans des approximations qui la simplifient:
1. Équilibre rapide
En 1913, Léonure Michaelis et Maud Menten ont fait l’approximation que k-1
>> k2 pour que la première étape de la réaction soit toujours en équilibre rapide.
Donc, KS = k-1 / k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante de dissociation du
substrat de l'enzyme. Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu
par le nom de complexe Michaelis.
2. État stationnaire
La concentration d’ES est relativement constante pendant la majorité de la réaction, si [S] >>
[E] (figure 5). Ceci implique que la vitesse de formation de ES doit être égale à sa disparition.
Par conséquent, d[ES]/dt = 0.
Désignation connue sous forme d'approximation de l'état stationnaire proposé d'abord
par Briggs et Haldane en 1925. L'approximation de l'état stationnaire en assumant que la
réaction est à l'état stable, c'est-à-dire que [ES] est stable est moins restrictive que celle de
Michaelis-Menten et sera utilisée dans le développement de la relation entre [S] et v.
L’approximation simplifiée permet la dérivation mathématique d’une relation explicite
entre la vitesse d’une réaction catalysée enzymatiquement (v) et la concentration du substrat
(S); cette relation est connue sous le nom de Michaelis- Menten (figure 6).
L'équation de Michaelis-Menten est l'équation de base des cinétiques enzymatiques est
connue mathématiquement comme une courbe hyperbolique. Selon l'équation, lorsque [S] est
égale à KM, v = Vmax/2. C'est donc dire que KM est égal à la concentration du substrat à
laquelle le taux de catalyse est la moitié du taux maximal. La valeur du KM varie avec les
enzymes, la nature du substrat, le tissu où l'enzyme a été isolé, le pH, la température, etc.
10
Figure 5. Courbe d’évolution. L’évolution des composés lors d’une réaction de Michaelis-Menten
simple. A l’exception de la phase transitoire de la réaction, qui précède le rectangle ombré, les pentes
des courbes d’évolution de [E] et [ES] sont pratiquement égales à 0 tant que [S] >> [E]T (à l’intérieur
du rectangle ombré).
Figure 6. Représentation et équation de Michaelis-Menten.
La constante de Michaelis peut être exprimée comme
11
2.4. Facteurs affectant l’activité enzymatique
1. Effet de la température
Une augmentation de la température: - augmente la vitesse de la réaction chimique. -
augmente la vitesse de dénaturation de l’enzyme (une protéine), diminuant ainsi son activité
catalytique. La somme de ces deux effets donne une courbe caractéristique de l’activité
enzymatique température qui passe par un maximum, montrant ainsi l'existence d'une
température optimale.
2. Effet du pH
Les enzymes sont très sensibles aux variations du pH et fonctionnent bien sur une
gamme limitée du pH. Les mesures de nombreuses activités enzymatiques en fonction du pH
donnent des courbes qui passent par un maximum, montrant ainsi l'existence d'un pH
optimum. Le pH peut agir sur plusieurs facteurs : - l'ionisation des résidus de l’enzyme et du
substrat et/ou du produit - la structure tertiaire des protéines et donc la stabilité de l'enzyme -
la liaison du substrat à l'enzyme - l'activité catalytique de l'enzyme ;
12
(A) Activité catalytique vs. pH (B) Activité mesurée à pH 7.4 après incubation de l’enzyme
pendant 1 h à différents pH
3. Effet de la concentration du substrat
Pour une quantité fixe d’enzyme:
- À faible concentration du substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à la
concentration du substrat.
- À des concentrations de substrat élevées, la vitesse de réaction est indépendante de
la concentration du substrat et tend vers une valeur constante (vitesse maximale). Le choix
de la concentration du substrat est une considération importante dans le développement
des essais enzymatiques.
13
4. Enzymes immobilisées
Pour de nombreuses applications, il n’est pas souhaitable pour des raisons
économiques par exemple, d’utiliser les enzymes en solution. L’immobilisation des enzymes
peut alors induire une modification de leur activité et généralement une augmentation de leur
stabilité. La stabilité de l’enzyme immobilisée dépend de la nature intrinsèque de l’enzyme,
des conditions d’immobilisation, de la nature du matériau support utilisé et des conditions de
réactions. Cependant le modèle de Michaelis-Menten reste valide à condition de lui appliquer
quelques corrections afin de l’adapter aux milieux hétérogènes. Les constantes diffusionnelles
du substrat et des produits doivent être prises en compte ce qui permettra de définir une
nouvelle constante KM, appelée KMapp pour constante apparente. La variation de l’activité va
dépendre de plusieurs paramètres et notamment de la nouvelle conformation du système qui
pourra être favorable ou pas à la catalyse enzymatique. Une enzyme peut donc présenter aussi
bien une augmentation qu’une diminution de son activité après immobilisation.
La méthode d’immobilisation est également un paramètre important. En effet, la
diffusion des différents substrats va être fortement modifiée par rapport aux systèmes
homogènes mais également en fonction de la méthode d’immobilisation.
4.1. Propriétés des enzymes immobilisées
L’immobilisation des enzymes conduit souvent à un changement de leurs propriétés
physiques, chimiques et cinétiques
• Propriétés physico-chimiques:
Une des propriétés importantes et caractéristiques de l’immobilisation est
l’amélioration de la stabilité dans le temps et de la résistance vis-à-vis de la dénaturation. La
stabilité de l’enzyme immobilisée dépond beaucoup du microenvironnement imposé par le
support. Ainsi, les enzymes fixées par la liaison sulfonamide sont moins stables que celles
fixées par liaison azo.
• Propriétés cinétiques:
L’immobilisation des enzymes affecte leurs propriétés cinétiques. En effet, à la
vitesse de la réaction enzymatique proprement dite, il faut ajouter l’effet du
microenvironnement qui conditionne toute l’activité catalytique. Ainsi, les phénomènes de
diffusion l’accès du substrat au niveau du site actif. Ceci a pour conséquence une variation de
la vitesse maximale VM et de la constante de Michaelis KM de l’enzyme ; cette dernière
constante pouvant avoir une valeur 10 fois supérieure. De même, le pH de l’enzyme peut être
14
modifié, en particulier lorsque la réaction enzymatique met en jeu une libération ou une
consommation de protons.
3.2. Méthodes d’immobilisation des enzymes
Les enzymes présentent un fort intérêt dans le domaine de la biocatalyse. Cependant,
leur coût et leur stabilité limitée dans le temps sont des facteurs limitant leur utilisation
industrielle. Afin de palier ces inconvénients, une stratégie fut proposée : l’immobilisation des
enzymes qui permet de stabiliser celles-ci au cours de leur utilisation, de pouvoir les réutiliser
et de séparer l’enzyme des produits de la réaction enzymatique. En 1916, Nelson et Griffin
seront les premiers à démontrer qu’une enzyme, en l’occurrence l’invertase, conserve son
activité catalytique et ce même après avoir été immobilisée par adsorption sur du charbon
actif. Cette technique connaîtra un véritable essor à partir des années 1950 avec les premières
applications dans divers domaines. Il existe différentes techniques d’immobilisation pouvant
être aussi bien chimiques que physiques. Ces méthodes, couramment utilisées, présentant
chacune leurs avantages et leurs inconvénients.
3.2.1. Immobilisation par adsorption
C’est la méthode la plus simple et la plus rentable. Il s'agit de retenir l'enzyme à la
surface d'un support insoluble, par interaction faible (intermédiaire ou secondaire) entre les
groupes fonctionnels de l’enzyme et du support (figure 7). L’interaction enzyme-support
pourrait impliquer l’ensemble des liaisons non covalentes ou secondaires de bas niveau
énergétique telque les liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogène,...). Les matières
utilisées sont organiques ou minérales.
• Supports organiques: les polyosides comme l’acétate de cellulose, nitrate de
cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène et le
polyéthylène.
• Supports inorganiques ou minéraux: sont généralement plus stables et résistent aux
agents chimiques et aux bactéries. Les matériaux actifs peuvent être des argiles, Verre
poreux ou silice poreuse.
• Autres supports : nylon, oxyde céramique, collagène et charbon actif.
15
Figure 7. Adsorption des enzymes sur un support.
Avantages
1. C’est une méthode très simple à mettre en œuvre nécessitant seulement de mettre en
contact l’enzyme et le support dans des conditions de pH, température et de force ionique
données.
2. Possibilité de régénérer les complexes enzyme-support (si l’enzyme perd son activité en
cours de son fonctionnement, il est possible de la remplacer par une préparation active).
3. Méthode économique et ne requiert aucun réactif chimique pouvant dénaturer l’enzyme.
Inconvénients
1. La fragilité de la fixation (les enzymes peuvent facilement se désorber sous l’action de
variation de pH, température…
2. L’orientation de l’enzyme et mauvaise accessibilité au site actif (figure 8).
16
Figure 8. Possibilités d’orientation de l’enzyme.
3.2.2. Immobilisation par inclusion
Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un polymère
insoluble dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou emprisonnées dans des
microcapsules délimité par une membrane semi perméable dont les pores sont suffisamment
larges pour permettre le passage des molécules du substrat ou des produits de la réaction
(figure 9).
Figure 9. Inclusion dans un réseau de polymère insoluble.
17
A. Inclusion dans un gel
L’enzyme est incorporée dans un gel insoluble. Ce gel peut être constitué d’une
matrice organique (polymère) ou inorganique. L’enzyme est retenu à l'intérieur du réseau
tridimensionnel d'une matrice, schématisé comme suit:
La maille de la matrice assure de manière purement physique la rétention de l’enzyme
tout en permettant la diffusion du substrat jusqu’au site actif de l’enzyme grâce à une porosité
du gel suffisante. Les matières les plus utilisées sont les gels: de polyacrylamide, d'alginates,
d'amidon et les fibres de polyacétate de cellulose.
Le choix du type de polymères va être dépend de:
- Propriétés mécaniques du gel: compression, forces de cisaillement
- Propriétés chimiques: toxicité, condition de stabilité en fonction de pH
- Propriétés physiques: perméabilité du gel (figure10)
18
Figure 10. Inclusion dans le gel de polyacrilamide
B. Encapsulation
La méthode consiste à inclure l’enzyme à l’intérieur de la membrane semi-perméable.
Le diamètre des micro-capsules peut varier de quelques microns à une centaine de microns
(figure 11). Les membranes semi-perméables Assurent la rétention des molécules d’enzyme
dans un volume déterminé en vue d’une utilisation continue (les hydrolase). Elles sont
utilisées dans la dégradation des macromolécules (amidon, protéine). Les produits obtenus
après hydrolyse peuvent franchir les membranes, ce que permet de les récupérer dans
l’effluent. L’immobilisation dans ce cas se fait de manière physique et pas de manière
chimique contrairement au greffage covalent. La membrane doit permettre la diffusion des
petites molécules seulement afin que les enzymes ne puissent pas s’en échapper. Ces
membranes peuvent être inorganiques (gels de silice), organiques (nafion), polymères
(polyacrylamide, polyuréthanes) ou composites (pâte de carbone).
Avantages
1. Réaction de polymérisation et de gélification bien connues.
2. Réaction chimiques avec l’enzyme limitée (inclusion dans des gels naturels).
3. Application à toutes les enzymes (utilisation de mélanges).
4. Obtention de supports de forma adaptables (films, billes, fibre…)
5. Elle permet en une seule étape d'immobiliser la totalité de l'enzyme
6. Elle ne présente aucun caractère de spécificité et est applicable à n'importe quelle
enzyme.
7. Elle ne met pas en jeu les groupements actifs de l'enzyme.
19
Figure 11. Encapsulation des enzymes.
Inconvénients
1. La localisation de l'enzyme à l'intérieur du polymère pose des problèmes stériques
(efficacité limitée par accès délicat du substrat vers l'enzyme et du produit en dehors du
polymère).
2. Les conditions de polymérisation (ex: pH élevé) peuvent s'avérer dénaturantes pour
l'enzyme.
3. Certaines polymérisations font appel à des agents dénaturants ou à des radicaux.
3.2.3. Immobilisation par liaison covalente
Le principe de cette méthode d’immobilisation est de faire réagir un groupement
fonctionnel libre de l’enzyme avec un groupement fonctionnel du réactif. En général, les
groupements fonctionnels du réactif sont des fonctions carboxyliques, thiols, hydroxyles ou
encore amines. Ces groupements sont très peu réactifs et doivent de ce fait être activés afin de
pouvoir réagir avec les groupements de l’enzyme, n’intervenant pas dans la catalyse
enzymatique, dans des conditions dites douces afin de ne pas dénaturer la biomolécule.
On peut diviser les méthodes d’immobilisation d’enzymes par liaison covalente en
deux groupes:
A. Immobilisation par liaisons covalentes sur support
Elle est réalisée par l’intermédiaire de liaisons irréversibles et covalentes entre les
groupements fonctionnels de l’enzyme et les groupes réactifs du support. Ces groupes, en
20
général insuffisamment réactif, nécessiteront une activation préalable. Apriori, il faut activer
soit l’enzyme, soit le support. L’activation des groupes fonctionnels de l’enzyme peut
conduire à la dénaturation de l’enzyme (figure 12).
Figure 12. Immobilisation par liaison covalente sur support. 1ère étape: Activation du support, 2ème
étape: fixation de l’enzyme.
La figure 13 représente un exemple d’immobilisation au bromure de cyanogène
Figure 13. Immobilisation au bromure de cyanogène BrCN étape1: activation du support, étape 2:
fixation de l’enzyme.
21
B. Immobilisation par réticulation
La réticulation repose sur l’utilisation d’agents dit réticulants qui vont permettre de
lier les enzymes entre elles par des liaisons chimiques. Il existe deux méthodes de réticulation,
soit les enzymes sont reliées entre elles par des agents réticulant de façon directe, soit en plus
de l’agent réticulant une protéine inerte peut être utilisée afin de faciliter ou améliorer la
réticulation, on parle alors de co-réticulation (figure 14). Les enzymes, après avoir été
adsorbées sur un support, sont mises en contact avec un agent réticulant afin de donner un
réseau enzymatique tridimensionnel et qui contrairement à l’enzyme seule est insoluble.
Figure 14. Réticulation et co-réticulation des enzymes.
Avantages
1. Stabilité accrue à cause de la liaison covalente
2. Grand choix de méthodes différentes
3. Grande variété de support minéraux (verre, silice, céramique…) et organiques
(cellulose, polymère synthétiques…)
4. Possibilité d’effectuer l’immobilisation en présence de substrat pour éviter
l’inactivation (protection du site actif)
5. Solidité de la liaison enzyme-substrat.
Inconvénients
1. Mise en œuvre de réactions chimiques souvent complexes
2. Longueur des expériences (étape de l’activation du support)
3. Risques de modifications chimiques de l’enzyme (perte d’activité)
4. Nécessité de purifier l’enzyme préalablement
5. Immobilisation plus complexe à réaliser (choix des groupements a activer...).
22
6. Les quantités d'enzymes immobilisées sont inferieures par rapport aux deux
précédentes méthodes. Rendements de fixation inferieurs à 100%
4. Modifications chimiques
4.1. Solubilité en milieu organique
Différentes stratégies peuvent être utilisées pour effectuer des catalyses enzymatiques
en milieu organique ou hydrophobe. L’une des méthodes emploie le polyéthylène glycol
(PEG) pour éviter la précipitation et l’inactivation de l’enzyme dans un tel milieu. Ce
polymère et linéaire possède des propriétés amphiphiles capables d’isoler l’enzyme du milieu
organique à l’instar des détergents (figure 15).
Figure 15. Couplage du PEG à l’enzyme
La glucose-6-phosphate déshydrogénase, la peroxydase ou la catalase, modifiées par le
PEG, conservent une activité élevée en milieu organique. Toutefois, les propriétés
catalytiques des lipases ou des protéases modifiées par le PEG, sont transformées puisqu’au
milieu hydrophobe es enzymes effectuent préférentiellement une réaction inverse à celle de
l’hydrolyse qui est, dans ce cas, exploitée pour la synthèse. La réaction de couplage est
effectuée avec un dérivé du PEG. Pour minimiser la formation de ponts le
méthoxypolyéthylène glycol (mPEG) est souvent employé à la place du PEG. (figure 16).
23
Figure 16. Exemple de couplage avec le méthoxyPEG (mPEG).
4.2. Transformation de la catalyse
D’autres modifications peuvent être effectuées au site actif de l’enzyme comme la
transformation de la subtilisine en «peroxydase synthétique». Cette modification consiste à
transformer la sérine 221 du site actif par une forme oxydée de séléno-cystéine (figure 17).
Figure 17. Transformation de la subtilisine en séléno-subtilisine.
A l’origine, l’enzyme hydrolysant les liaisons peptidiques est alors capable de
catalyser sélectivement la réduction des hydroperoxydes en présence de groupes thiol.
L’étude cinétique a montré que la séléno-subtilisine et la peroxydase du raifort possèdent des
activités catalytiques comparables. Par ailleurs, la diffraction aux rayons X a indiqué que la
subtilisine et la séléno-subtilisine partagent la même structure et le même site de fixation du
24
substrat. La résolution des hydroperoxydes racémiques en formes chirales par la séléno-
subtilisine constitue une voie spéciale pour l’obtention d’alcool époxy à partir d’alcool
allylique (figure 18) .
Figure 18. Résolution des hydroperoxydes par la sélino-subtilisine. R1 et R2 sont des groupes alkyle
ou aryles.
Cette « mutation chimique » n’est pas un cas isolé puisque l’activité de la trypsine a
été transformée par le même procédé en activité péroxydase.
5. Domaines d’application des enzymes
L’utilisation des enzymes sous leurs principales formes (préparation enzymatique ou
purifiée) connait son essor essentiellement au XXe siècle. Le développement et la maîtrise des
procédés d’extraction des enzymes des cellules (microbienne, végétales et animale) ont
permis les diverses utilisation largement connues aujourd’hui.
5.1. Applications agro-alimentaires
Les enzymes sont utilisées depuis des siècles dans la production alimentaire mais ne
sont connues et maitrisées que depuis le XXème siècle. Elles sont naturellement présentes
dans des ingrédients utilisés pour produire des aliments.
Les utilisations dans l’alimentaire ne se restreint pas à l’exploitation des propriétés
catalytiques des enzymes, elle regroupe également les opérations visant à contrôler voir
inhiber des enzymes pouvant altérer les qualités organoleptique d’un aliment ou d’un
constituants alimentaires. Exemple des brunissements enzymatiques observés dans certains
aliments (exemple de la pomme de terre ou de la banane tranchée) dû à la formation des
quinones issus de l’oxydation des polyphénols.
25
5.1.1. Raffinage enzymatique d’huiles alimentaires
Le dégommage enzymatique est la méthode la plus récente pour dégommer les huiles
végétales, y compris l’huile de soja. Elle constitue une technique adéquate pour le raffinage
physique qui requiert de faibles teneurs en phosphore et qui ne peuvent être atteintes grâce
aux méthodes conventionnelles de démucilagination (traitement à l’acide, dégommage à
l’eau, super-dégommage, etc.). Cette technique a initialement été développée par la
compagnie allemande LurgiGmbh, elle est également connue sous le nom de procédé
Enzymax®.
Le but de ce procédé est de convertir grâce à une phospholipase, les phospholipides non
hydratables en une forme hydratable avec pour avantages un accroissement du rendement en
huile, des coûts de fabrication réduits ainsi que la diminution des effluents. Les huiles
obtenues à la suite de ce procédé de dégommage poursuivent un raffinage physique. Elles sont
ainsi envoyées directement à la section de décoloration sans passer par l’étage de
neutralisation. En effet, l’élimination des AGL dans ce cas se fera par distillation sous vide au
cours de la désodorisation.
5.1.2. Enzyme et qualité hygiénique des aliments
Des produits agricoles, en particulier, ceux d’origine animale comme l’œuf et le lait
contiennent des protéines qui ont un pouvoir bactéricide ou bactériostatique. Ces
biomolécules sont soit lytiques (lysozyme E.C.3.2.1.17), soit inhibitrices de micro-organismes
(peroxydase E.C.1.11.1.7). Ces propriétés sont exploitées pour maîtriser la qualité hygiénique
des aliments. Par ailleurs, certaines enzymes comme la catalase (E.C.1.11.1.6) ou la b-
lactamase (E.C.3.5.2.6) peuvent détruire des molécules qui ont été introduites dans le milieu
(peroxyde d’hydrogène, antibiotique); d’autres biocatalyseurs (par exemple, la glucose
oxydase E.C.1.1.3.4) génèrent dans le milieu des produits inhibiteurs.
Le lysozyme est utilisé pour améliorer la conservation des produits marins congelés
comme les huîtres ou les crevettes. Des travaux récents ont, par ailleurs, montré que
l’utilisation du lysozyme permettait d’inhiber la croissance de Listeria monocystogenes à une
température de 5 °C.
Les lactoperoxydase : Exemple d’utilisation du pouvoir bactéricide ou bactériostatique
: La peroxydase agit de manière indirecte par la production de molécules intermédiaire
bactéricide ou bactériostatique le cas de la transformation du thiocyanate (SCN-) en ion
hypothiocyanate (OSCN-). L’ion hypothiocyanate (OSCN-) est le principe actif selon le
mécanisme suivant:
26
5.1.3. La synthèse d’ester de sucres (Sucroester)
Les esters de sucres sont des esters d'acides gras et de sucres simples. Se sont des
tensioactifs non-ioniques présentant de nombreux avantages dont notamment la diversité des
structures disponibles et le caractère inoffensif, tant pour la santé que pour l’environnement.
Toutes les fonctions hydroxylées du sucre en question peuvent être estérifiées.
Principales applications des sucroesters:
- alimentation humaine
- formulation de médicaments
- produits phytosanitaires
- étude des protéines membranaires.
- activités biologiques
Exemples d’application alimentaires:
- les sauces épaisses car ils évitent la précipitation des matières solides améliorent la
dispersion,
- le lait concentré pour éviter la séparation de phase et améliorer la dispersion,
- les crèmes foisonnées afin d'obtenir une émulsion stable,
- les crèmes glacées pour préserver la cohésion de la matière grasse pendant la
surgélation, donner une texture lisse et douce,
- les gâteaux, génoises pour améliorer le volume et donner une croûte fine et
homogène,
- le chocolat afin de diminuer la viscosité et éviter la déformation à la chaleur.
Principe de la synthèse enzymatique des scuroesters:
27
Utilisation d’enzyme hydrolytique (le plus souvent une lipase, nom abrégé d’une
triacylglycérol acylhydrolase) dans un milieu non aqueux. Dans ces conditions, l’activité de la
lipase est inversée, passant de l’hydrolyse à l’estérification. Trois aspects sont à prendre en
compte, à savoir le rendement réactionnel, la rentabilité et le respect de la législation
concernant l’utilisation des solvants dans le domaine alimentaire.
5.1.4. Clarification enzymatique des jus de fruits
La transformation des fruits en jus clairs, en jus troubles ou en jus concentrés nécessite
dans la plupart des cas un traitement enzymatique. Utilisées en extraction (avant pressage) les
enzymes permettent d’augmenter les rendements en jus et d’optimiser le pressage (gain
économique important). Sur jus, elles favorisent une clarification rapide par diminution de la
viscosité et améliorent la filtrabilité. Erbslöh Geisenheim a mis au point une large gamme de
formulations enzymatiques permettant de répondre à chaque problématique et ce qu’elles que
soient les caractéristiques de la matière première à traiter.
Les industriels spécialisés dans les jus (de pommes notamment) utilisent largement les
systèmes enzymatiques afin de garantir aux consommateurs une qualité organoleptique
optimale des jus. C'est particulièrement le cas avec les pectinases qui sont très utilisées en
industries végétales car elles permettent d'avoir de meilleurs rendements au niveau des
filtrations et stabilités des jus, spécifiquement sur les fruits tropicaux.
5.1.5. Les enzymes en panification
Dans le secteur de la boulangerie, la recherche des causes du pourrissement ou du
durcissement du pain reste sans réponses. De nombreuses fabriques de pain utilisent des
émulsionnants chimiques, par exemple les monoglycérides, afin de retarder le durcissement
du pain. Cependant, depuis quelques années, les enzymes, substances plus naturelles,
remplacent les monoglycérides. On obtient avec l’amylase un pain à l’aspect plus frais
qu’avec les agents chimiques.
Les enzymes participent au processus de panification. Certaines sont aujourd’hui
ajoutées en quantités très faibles (entre 10 et 100 g/tonne de farine) pour l’optimiser.
Cependant, le développement de nouvelles méthodes de production plus performantes et
l’utilisation de nouvelles sources d’enzymes telles que les micro-organismes produisant une
source spécifique d’enzymes utilisés dans l’industrie agroalimentaire ont conduit à
l’utilisation d’enzymes plus complexes. Leurs domaines d’application sont très variés et on
les retrouve non seulement en panification mais aussi en pâtisserie et en viennoiserie.
28
5.1.6. Additifs
Les additifs alimentaires sont des substances ajoutées en faibles quantités aux aliments
industriels pour en améliorer la saveur, la texture, l'apparence... Composés d'une molécule
simple (contrairement aux ingrédients souvent plus complexes) ils possèdent tous un code,
Exxx, attribué par la Commission du Codex Alimentarius.
Classes des additifs alimentaires
Les additifs alimentaires se décomposent en plusieurs groupes en fonction de leur rôle
•les colorants
•les conservateurs
•les antioxydants
•les agents de texture (dont les émulsifiants et les amidons modifiés)
•les édulcorants
•les exhausteurs de goût
•les acidifiants.
Les enzymes alimentaires sont des produits contenant une ou plusieurs enzymes
capables de catalyser une réaction biochimique spécifique. Ces produits sont obtenus à partir
de plantes, d’animaux, de micro-organismes ou de produits dérivés, y compris un produit
obtenu par un procédé de fermentation à l’aide de micro-organismes. Elles sont ajoutées à des
denrées alimentaires à des fins technologiques à toute étape de leur fabrication,
transformation, préparation, traitement, conditionnement, transport ou entreposage. Les
fonctions technologiques de ces enzymes alimentaires peuvent être par exemple d’agir sur la
coagulation de la caséine pour la fabrication de fromages, ou encore de dégrader l’amidon en
sucres fermentescibles
5.2. Applications médicales et pharmaceutiques
Le développement des applications médicales pour les enzymes a été au moins aussi
important que celui des applications industrielles, reflétant l'ampleur des récompenses
potentielles: par exemple, les enzymes pancréatiques sont utilisées depuis le XIXe siècle pour
le traitement des troubles digestifs. La variété des enzymes et leurs applications
thérapeutiques potentielles sont considérables. A l'heure actuelle, les applications les plus
29
réussies sont extracellulaires: utilisations purement topiques, l'élimination des substances
toxiques et le traitement des troubles de la vie en danger dans la circulation sanguine.
5.2.1. Enzymes utilisées dans les méthodes d’analyses de biologie moléculaire
L’utilisation des enzymes dans les méthodes de biologies moléculaire est bien ancrée
dans les principes méthodes analytique de la biologie moléculaire. Les propriétés
extraordinaires que possèdent certaines enzymes, en l’occurrence leur action sur les acides
nucléique (synthèse, restrction, ligation, transcription…) font d’elles des outils
incontournables dans le génie génétique. Ici, nous développerons quelques exemples
d’utilisation d’enzymes dans les techniques de clonage et d’amplification de l’ADN.
Enzymes de restriction: Les enzymes de restriction agissent au niveau de site bien
précis au niveau au niveau de l’ADN. Elles sont dites endonucléase car elles coupent à
l’intérieur de l’AND et non pas au niveau de ces extrémités. Les coupures donnent des « bouts
francs » ou extrémité cohésives.
ADN Polymérase: L’utilisation la plus connue est la réplication de l’ADN. Ainsi, en
présence des bases ACTG+enzyme+ADN, le fragment d’ADN peut être dupliqué. En in vivo,
cette enzyme est responsable de la synthèse de l’ADN à partir des monomères
deoxynucléotides. Cette enzyme est utilisée dans toutes les étapes in vitro de techniques de
biologie moléculaire faisant appel à la réplication du brin d’ADN. La PCR (Polymerase chain
reaction) est une méthode d’amplification de l’ADN, permettant ainsi d’avoir plusieurs copies
utilisable dans les techniques d’analyse de l’expression de gène ou dans le génie génétique.
Transcriptase inverse: Enzyme servant à synthétiser de l’ADN complémentaire
ADNc à partir de l’ARN. Etape cruciale dans la RT-PCR (revers transcription-PCR). Le
principe de son fonctionnement est lié à sa composition. En effet, elle comprend en général
une polymérase de l'ADN ARN-dépendante et une polymérase de l'ADN ADN-dépendante,
lesquelles travaillent en synergie pour réaliser la transcription en sens inverse de la direction
standard. Cette transcription inverse ou rétrotranscription permet comme son nom l'indique de
transcrire à l'envers c’est-à-dire d'obtenir de l'ADN à partir d'ARN.
5.2.2. Enzymes utilisées en thérapie et analyse.
Le tableau 2 regroupe les principales applications des enzymes dans le domaine
thérapeutique.
30
aHyaluronoglucosaminidase ; bthiosulphate sulfurtransferase ; streptococcal cysteine roteinase ;durate
oxidase ;e plasminogen activator.
5.2.3. Les biocapteurs
Un biocapteur est un système analytique alliant des technologies différentes issues par
exemple de la biologie moléculaire, la microélectronique, l'optique et l'informatique. Il se
compose d’un élément biologique, que l’on appelle « ligand » ou biorécepteur, lui-même lié à
un transducteur (pouvant être optique ou plus généralement électromagnétique,
électrochimique, piézoélectrique, calorimétrique ou acoustique) permettant de transformer un
signal biochimique en un signal physique quantifiable (figure 19). Selon l'Union
Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC), un biocapteur est un appareil qui utilise
des réactions biochimiques spécifiques médiées par des enzymes isolées, des immuno-
systèmes, des tissus, organites ou des cellules entières pour détecter des composés chimiques
en général par des signaux électriques, thermiques ou optiques.
Figure 19. Représentation schématique du principe de fonctionnement d'un biocapteur.
31
Ils existent différents types de biocapteur. Les biocapteurs enzymatiques sont les plus
utilisées et les plus commercialisées. En effet, elles présentent un grand nombre d’avantages
notamment la reproductibilité des lots mais par contre il peut y avoir une instabilité de leur
fonctionnement et la nécessite d’utiliser un cofacteur ou plusieurs enzymes associées pour un
même biocapteur. Les enzymes utilisées sont les enzymes REDOX (réductases, oxydases,
oxydo-réductases) et les enzymes hydrolytiques (protéases, lipases, estérases) (tableau 3).
Tableau 3. Enzymes utilisées dans l’élaboration d’un biocapteur.
Biocapteur à glucose (glucomètre): Utilise la glucose oxydase (GOD ou GOx) immobilisée
(figure 20) selon la réaction suivante:
β D Glucose + O2 => Acide gluconique + H2O2
Figure 20. Biocapteur à glucose (glucomètre).
32
5.3. Applications industrielle
5.3.1. Industrie du papier
Le blanchiment est l’élimination de la lignine des pulpes chimiques du papier. Cette
étape de la fabrication du papier est nécessaire pour des raisons esthétiques ainsi que pour
améliorer les qualités du produit final. Le blanchiment est constitué de diverses étapes et varie
en fonction du type de substances utilisées. On utilise traditionnellement pour le blanchiment
de la pâte kraft des composés chlorés. Cette méthode produisant des déchets toxiques
(mutagènes, cancérigènes, bioaccumulables) qui entraînent de nombreuses altérations des
systèmes biologiques, l’utilisation de ces agents blanchissants est interdite dans divers États
développés.
Les enzymes sont une bonne alternative aux agents blanchissants chlorés. L’utilisation
de xylanases dans l’étape de blanchiment de la pâte kraft permet d’éviter le chlore et de
réduire les déchets toxiques, d’éliminer l’étape du goulot de bouteille (en raison de la capacité
limitée des cuves de dioxyde de chlore), d’augmenter le degré de blanc de la pâte et de
diminuer les coûts de l’opération, notamment dans les usines qui utilisent de grandes quantités
de dioxyde de chlore. Enfin, le prétraitement aux enzymes permet également d’augmenter le
degré de blanc final de la pâte et de réduire la présence des agents chimiques dans l’étape du
blanchiment.
Le désencrage est une étape nécessaire si l’on souhaite utiliser comme matières premières des
fibres récupérées dans la fabrication de papier et de carton ; la réutilisation de ces fibres
dépend de l’élimination des encres et des autres polluants. Le désencrage présente néanmoins
des inconvénients, notamment dans le cas du papier recyclé et produit de nouveaux déchets
solides et liquides. Voici les enzymes utilisées dans les étapes du désencrage : les lipases, les
estérases, les pectinases, les hemicellulases, les cellulases et les enzymes lignitiques. Les deux
premières, les lipases et les estérases, dégradent les encres à base d’huiles végétales. Les
autres (les pectinases, les hemicellulases, les cellulases et les enzymes lignitiques), modifient
la surface de la fibre de cellulose ou les unions proches des particules d’encre, ce qui libère la
teinture de la fibre et permet de la séparer par flottation ou lavage.
33
5.3.2. Industrie Des détergents
L’industrie des détergents utilise le plus gros volume d’enzymes, c’est-à-dire 45 % du
total du marché. Les enzymes utilisées dans ce secteur sont les protéases, bactériennes et
fongiques, les amylases, les cellulases et les lipases. Les enzymes les plus présentes sur le
marché sont les protéases bactériennes, dont il existe actuellement une grande variété. Ces
enzymes possèdent des propriétés nettoyantes croissantes et une grande stabilité face aux
oxydants. Les alpha-amylases sont très efficaces en ce qui concerne la dégradation des
chaînes d’amidon, ce qui est la raison pour laquelle elles améliorent l’élimination des
particules de poussière et de terre qui restent présentes dans les tissus à cause de la trame des
polymères de l’amidon. Utiliser les protéases et les amylases conjointement permet d’obtenir
un meilleur lavage des tissus ; en effet, il y a diminution de la charge des produits chimiques
dans le détergent et de la température de lavage.
Les cellulases sont quant à elles utilisées à la place des tensioactifs ioniques pour
améliorer la douceur des tissus en coton. Elles sont également actives dans l’élimination des
particules de poussière et de terre car elles éliminent les microfibrilles des fibres de coton, ce
qui produit de plus un effet de brillantage de la couleur.
Les lipases catalysent l’hydrolyse des triglycérides présentes dans les taches de
graisse, ce qui les rend hydrophiles et permet une élimination facile au lavage. Il faut signaler
que les enzymes utilisées dans les détergents ont un impact sur l’environnement positif. Elles
entraînent en effet des économies énergétiques dues à la réduction des températures du
lavage, permettent la réduction de la teneur en produits chimiques des détergents, sont
biodégradables, n’ont pas d’impact négatif dans les processus d’épuration des eaux et ne
présentent pas de risques pour la vie aquatique.
5.3.3. Désencollage de textile
L’amidon est la substance naturelle dont on recouvre le fil à coudre pour augmenter sa
résistance avant le tissage. Cet amidon doit être éliminé avant de procéder aux traitements
finaux du tissu: blanchiment, teinture, traitements spéciaux, etc. L’élimination traditionnelle
s’effectuait auparavant en milieu acide. Aujourd’hui, le désencollage enzymatique utilise des
amylases en remplacement de l’acide. L’industrie textile utilise ce procédé biotechnologique
depuis le début du XXe siècle. Les amylases sont très efficaces dans le désencollage et ne
génèrent pas de problèmes
de déchets dangereux pour l’environnement comme c’est le cas des acides minéraux, des
bases ou des oxydants.
34
5.3.4. Industrie de cuir
Le tannage des peaux est l’un des processus industriels aux enzymes les plus anciens.
En voici les étapes traditionnelles : séchage, trempage, élimination des poils et de la laine,
raclage et tannage. Le tannage utilise de nombreux produits chimiques pour éliminer les poils,
les graisses et les protéines non-désirées (élastine, kératine, albumine et globuline), laissant
intact le collagène dans l’étape précédant le tannage de la peau. Les produits chimiques
utilisés nuisant considérablement à l’environnement, on utilise aujourd’hui des protéases
telles que la trypsine et les lipases. Ces substances, qui réduisent l’utilisation des sulfites, des
solvants organiques et des tensioactifs synthétiques, permettent d’obtenir un produit doté de
meilleures propriétés finales.
6. Production des enzymes
Au XXe siècle, on a commencé à isoler les enzymes des cellules vivantes, ce qui a
conduit à leur production commerciale à grande échelle et à leur plus large utilisation dans
l'industrie alimentaire. Aujourd'hui, les microorganismes constituent la principale source
d'enzymes commerciales. Même si les microorganismes ne contiennent pas les mêmes
enzymes que celles des végétaux ou des animaux, on peut habituellement trouver un
microorganisme qui produira une enzyme associée, laquelle catalysera la réaction désirée. Les
fabricants d'enzymes ont optimisé les microorganismes en vue de la production d'enzymes
grâce à la sélection naturelle et aux méthodes classiques de reproduction.
La modification génétique directe (biotechnologie) englobe les méthodes les plus
précises pour optimiser les microorganismes en vue de la production d'enzymes. Ces
méthodes sont utilisées pour obtenir des organismes producteurs à haut rendement. La
biotechnologie donne également les outils pour transférer une séquence génétique d'un
végétal, d'un animal ou d'un microorganisme à partir de laquelle la production à l'échelle
commerciale n'est pas adéquate vers un microorganisme qui a un historique sécuritaire de
production d'enzymes à des fins alimentaires.
6.1. Extraction des enzymes
Dans le cas des enzymes animales ou végétales, ou encore les enzymes intracellulaires
des microorganismes, une opération supplémentaire est au moins nécessaire pour rompre les
barrières cellulaires. Le choix de la procédure d’extraction dépend de la localisation de
l’enzyme:
35
Méthodes mécaniques:
- Extraction d’enzymes par haute pression suivie de dépression (French-press),
- Broyage ou écrasement (éventuellement en présence de billes),
- Ultrasons à des fréquences déterminées.
Méthodes non-mécaniques:
- Séchage ou traitement par congélation-décongélation pour la la destruction
des barrières,
- Lyse physique des barrières cellulaires par choc osmotique,
- Lyse chimique par l’emploi de détergent,
- Lyse enzymatique (exemple: lysozyme).
6.2. Séparation des enzymes
L’étape suivante consiste à éloigner les débris cellulaires pour obtenir une préparation
enzymatique brute. Cette opération est difficile lorsque la densité des cellules bactériennes de
petite taille est proche de la densité du milieu de fermentation. Les méthodes suivantes sont
utilisées:
- Décantation adaptée aux cellules de grande taille comme les levures,
- Filtration continue, largement utilisée en industrie,
- Des centrifugeuses continues sont de plus en plus utilisées.
6.3. Concentration des enzymes
Puisque les enzymes dans les extraits sont souvent insuffisamment concentrées, le
volume doit être réduit par concentration. Les méthodes de concentration ne doivent pas
altérer l’activité enzymatique. Les méthodes utilisées sont:
- Méthodes thermiques, comme la « thin-layer evaporator » : méthodes douces à cause de la
thermolabilité des enzymes.
- Précipitation aux sels, comme le sulfate d’ammonium entre 20 et 80%. Le sel à forte
concentration agit sur les molécules entourant la protéine et change les forces électrostatiques
assurant leur solubilité. Plus le sel est concentré plus il cause la précipitation des petites
protéines. On peut donc procéder à une précipitation fractionnée.
- Précipitation aux solvants organiques comme l’éthanol ou l’acétone. Les solvants
affaiblissent la liaison entre l’eau et la protéine et encouragent donc les liaisons entre
36
protéines qui agglomèrent et précipitent. Les solvants présentent cependant une source de
toxicité.
- Précipitation aux polymères comme les polyéthylenimines et les polyéthylène glycols entre
15 et 20%.
- Précipitation au point isoélectrique. La solubilité d’une protéine est minimale au pH où leur
charge nette est nulle.
- Ultrafiltration utilisant une membrane semi-perméable laissant passer des molécules
inférieures à une certaine taille. Les membranes disponibles ont des pores qui laissent passer
des molécules de 1000 à 300 000 Da.
6.4. Purification des enzymes
Dans certains domaines comme celui médical ou analytique, les enzymes doivent être
hautement purifiées. Dans d’autres domaines industriels les enzymes peuvent être
partiellement purifiées. Les méthodes utilisées dans la purification sont:
- Méthode de cristallisation: c’est la formation de particules solides de l’enzyme de forme et
taille définies, sous certaines conditions du milieu qui favorisent les interactions protéine-
protéine. La cristallisation d’enzymes sert plus pour les analyses par diffraction aux rayons X
plutôt qu’un procédé de purification. On note cependant la commercialisation de certaines
enzymes sous forme cristallisée comme des cellulases ou alcool-oxydase.
- Electrophorèse: utilisée pour isoler des enzymes pures à l’échelle de laboratoire. Les
méthodes utilisées sont de type électrophorèse zonale, isotachophorèse ou gradient de
porosité. Le Scale-up de l’électrophorèse est limité par le chauffage généré par le procédé et
l’interférence causée par la convection.
- La chromatographie est d’une importance fondamentale dans la purification d’enzymes. Les
principales méthodes de purification des enzymes par chromatographie sont représentées dans
le tableau 4. Les enzymes sont commercialisées sous forme de concentré liquide stabilisé ou
de solide (poudre ou particules).
37
Tableau 4. Les méthodes chromatographiques et leurs principes.
7. Enzymes artificielles
Une enzyme artificielle est une molécule synthétique relativement petite créée pour
imiter le site actif d´une enzyme naturelle. Elle est bâtie à partir d´une molécule hôte,
responsable de la liaison sélective avec le substrat, et à laquelle on ajoute des groupes
fonctionnels pour obtenir une activité catalytique.
Initialement, les molécules hôtes utilisées étaient essentiellement des cyclodextrines,
des éthers couronnes ou des calixarènes. Même si les systèmes artificiels sont capables
d´accélérer une réaction par un facteur 1000, leurs performances restent encore très en
dessous des performances réalisées par les enzymes naturelles (x106). Depuis, d´autres
approches ont suivi telles que l´utilisation de peptides ou d´anticorps (abzymes).
7.1. Les abzymes
Les anticorps catalytiques (aussi appelés abzymes) sont des anticorps capables de
catalyser une réaction chimique. Ils sont normalement produits artificiellement. Par rapport à
une enzyme normale, ils possèdent une meilleure spécificité par rapport au substrat. Un autre
avantage est qu´ils peuvent être produits pour catalyser toute sorte de réactions, comme la
réaction de Diels-Alder. Leur nom a été construit à partir des mots antibody (anticorps en
anglais) et enzyme.
Comme toutes les enzymes, ils fonctionnent en stabilisant l´état de transition de la
réaction. En pratique, ils sont développés et sélectionnés à l´aide d´une molécule ressemblant
à cet état. Les premières abzymes obtenues en utilisant des analogues d'états de transition
furent décrites simultanément, en 1986, par les équipes américaines de Richard Lerner et de
Peter Schultz. Ces abzymes catalysaient l'hydrolyse de liaisons chimiques simples, esters et
carbonates. Depuis lors, de très nombreuses abzymes ont été produites, catalysant des
38
réactions très diverses d'hydrolyse (de liaisons esters, carbonates, amides ou glycosidiques),
de formation de liaisons (amides ou imines), d'isomérisation ou encore des réactions pour
lesquelles aucun catalyseur biologique n'était connu, comme la réaction chimique de Diels-
Alder. Actuellement, des recherches sont menées dans l´espoir de pouvoir utiliser des
abzymes à des fins thérapeutiques (figure 21).
Figure 21. Abzyme anticancéreux ciblant les tumeurs.
7.2. Cyclodextrines
Les cyclodextrines sont des molécules cycliques naturelles constituées de sous-unités
glucopyranose liées en α-(1,4) (des oligosaccharides cycliques). Ces produits naturels
provenant de la dégradation enzymatique de l'amidon par la bactérie Bacillus macerans, ont
été découverts en 1891 par Villiers. Les trois cyclodextrines naturelles les plus courantes se
composent de 6,7 ou 8 unités α D-glucopyranose en configuration chaise reliées entre elles
par des liaisons α-(1,4). Elles sont dénommées respectivement α-, β- et γ-cyclodxtrine (figure
22). Des familles de plusieurs dizaines de sous-unités ont été synthétisées dans des buts de
recherche.
La cavité des cyclodextrines est tapissée de fonctions hydroxyles qui, selon le pH de
la solution, peuvent être sous forme acide (OH) ou sous forme basique (O-). Il en résulte une
potentialité de catalyse acido-basique assimilable à celle d'enzymes comme la ribonuléase et
les protéases.
39
Figure 22. Structure des α-, β- et γ-cyclodextrines.
La conversion des cyclodextrines en molécules catalytiques ou enzymes artificielles a
été également envisagée en utilisant la β-cyclodextrine à la quelle a été fixé un groupement:
O-[4(5)-mercaptométhyl-4(5)-méthyl imidazol-2-yl] benzoate, on obtient une molécule dont
le groupe hydroxyle, un noyau imidazole et un groupe carboxylate miment le site actif de la
chymotrypsine (chymotrypsine de R. Breslow). Ces molécules sont capables de reconnaître et
fixer un substrat parmi un ensemble de molécules et de catalyser une réaction. La spécificité
de cette catalyse pouvant être modifiée par variation de leur architecture interne.
Conclusion
L’utilisation des enzymes dans divers domaines industriels présente donc un fort
intérêt et explique les efforts faits ces dernières années par la communauté scientifique dans
ce sens. Cependant, elles restent des entités faisant partie du domaine du vivant et leur emploi
nécessite de prendre certaines précautions notamment afin de conserver leur propriétés
catalytiques. De plus chaque enzyme présente des particularités, il n’existe pas de solution
universelle applicable à l’ensemble de cette classe de protéines.
40
REFERENCES
1. H. Bisswanger (2008). Enzyme Kinetics. Wiley-VCH Verlag, Weinheim.
2. J. Bjerre, C. Rousseau, L. Marinescu and M. Bols (2008). Artificial enzymes,
“Chemzymes”: current state and perspectives. Applied Microbiologie and
Biotechnologie 81:1-11.
3. R. Breslow (2005). Artificial enzymes. Wiley-VCH Verlag, Weinheim.
4. M. Delvaux and S. Demoustier-Champagne (2003). Immobilisation of glucose oxidase
within metallic nanotubes arrays for application to enzyme biosensors. Biosensors and
Bioelectronics 18: 943-951.
5. V. Leskovac (2003). Comprehensive Enzyme Kinetics. Kluwer Academic/Plenum
Publishers, New York.
6. T.T. Ngo (1980). Bioanalytical applications of immobilized enzymes. International
Journal of Biochemistry 11: 459-465.
7. J.J. Pancrazio, J.P. Whelan, D.A. Borkholder, W. Ma and D.A. Stenger (1999).
Development and Application of Cell-Based Biosensors. Annals of Biomedical
Engineering 27: 697-711.
8. A.K. Poulsen, A.M. Scharff-Poulsen and L.F. Olsen (2007). Horseradish peroxidase
embedded in polyacrylamide nanoparticles enables optical detection of reactive
oxygen species. Analytical Biochemistry 366: 29-36.
9. J.P. Sine (2010). Enzymologie et application. Ellipses, Paris.
10. D. Voet and J. G. Voet (1998). Biochimie, De Boeck Université, Bruxelles.