suivi de protéines fluorescentes en time lapse chez la...

Suivi de protéines fluorescentes enTime Lapse chez la bactérie E. coli

Jérôme RechSylvain Cantaloube

Seignosse – 30 septembre au 7 octobre 2016

La ségrégation du matériel génétique

Chez les bactériesChez les eucaryotes

Mitose Partition

5 µm

Pour les plasmides à bas nombre de copies : besoin d’un système de partition actif

les loci par (= opéron sop chez le miniF d’E.coli)

Les loci par sont composés de 3 éléments :

Une séquence centromérique : parS (sopC)

Deux gènes qui codent : une protéine motrice A (NTPase) : ParA (SopA)

une protéine B qui se fixe spécifiquement aucentromère : ParB (SopB)

La partition

sopCsopBsopAsop

Psop sopCsopBsopAsop

Psop

1µ

sopCsopBsopAsop


Psop

sop sop+

FROS: tetO/TetR‐Gfp

Nécessaire et suffisant pour la ségrégation du miniF (low copy number)

Système de partition du miniF d’E.coli

sopCsopBsopAsop

sopCsopBsopAsop

- is a very weak ATPase, activated by DNA, ParB and the centromere- binds DNA, ATP-dependent- forms protopolymers, ATP-dependent and stimulated by ParB- conformational changes induces by adenine nucleotide binding, DNA and ParB interactions

SopA:

- centromere binding protein- modulates all the activities of ParA

SopB:

(Leonard et al. 2005; Bouet et al. 2007; Hester & Lutkenhaus, 2007; Castaing et al. 2008)

(Davis et al, 1992; Ah-Seng et al. 2009)

(Barilla et al. 2005; Lim et al. 2005; Bouet et al. 2007)

- centromere-like site, composed of several repeats of 16-bpsopc:

Propriétés biochimiques et activités de sopA & sopB

SopA

SopA-mVenus

Time (30 min.)

~1200 dimers of SopA/cell

Activités de sopA

Oscillations de SopA d’un pole à l’autre de la bactérie, à l’intérieur du nucléoïde.

~8min pour une période d’oscillation de SopA

sopCsopBsopAsop


Psop

SopAoscillation

?Plasmid Fpositioning

1 µm

Comment et pourquoi le pattern d’oscillation de SopA permet la séparation et le positionnement du complexe de partition (plasmide miniF) dans les cellules E.coli ??

Problématique de l’équipe

Microfluidique

« Avant la microfluidique »Sur lames d’agarose‐ Longs timelapse

• « carrés bleus » (gene frame)

Arrêt de la croissance au bout de 7h00‐ Stress cellulaire ?‐Milieu de culture épuisé?‐ Accumulation de déchets?‐ ?????

• Burkholderia cenocepacia: timelapse 14h

Définition

• La microfluidique est l’étude des écoulements de fluides dans des systèmes microfabriqués, tels que les canaux, les capillaires ou les milieux poreux, dont les dimensions sont de l’ordre du micromètre.

• Microscopie sur des cellules vivantes où :• on maitrise les conditions de croissance tout le long de l’acquisition• on injecte à un temps t une drogue, un antibiotique, un milieu différent, etc..• on peut faire des essais dynamiques‐cinétiques dans le temps• Etc, ….

But au LMGM

Microfluidique

ONIX de CellAsic ‐ Description

Système de contrôleEV262

Contrôle par injection d’air flux

continus et dynamiques

Micro incubateurMIC230

Contrôle de la températureet du gaz

Optionnel

Peltier Heated Manifold

Scellé à la plaque microfluidique ilsert à maintenirles conditions de culture grâce au flux continu de

gaz + température

Plaque Microfluidique

4 manips en parallèle

#1.5 LamelleCompatible confocal

FG Software

Programmation du débit d’injectionpour automatiserdes protocolesspécifiques

IntuitifPréconisée pour obj x100

Nikon

Système totalement ouvert, automatisé

Une grande partie de la technologie se trouve dans les plaques!!!!!

ONIX de CellAsicDesign innovant des plaques microfluidiques

• Imagerie haute résolution grâce au fond de plaque d’épaisseur #1.5, soit 170µm: optimum pour nos objectifs X100 Nikon

• Canaux en PDMS(silicone) non agressifspour les bactéries

• Flux laminaire: pas de mélanges, ni de turbulences

Description Plaques BO4

Chambres de visualisation : x4(4 dépôt de cellules différents)

Injection bactéries

Poubellebactéries

Injectionmilieux

Poubellemilieux



« Face de dès »SILLONS


« Face de dès »SILLONS

6 Sillons ‐> 6 profondeurs différentespermettant l’immobilisation des bactéries selon leur taille

De 0,7 à 4µm

3.0 um épaisseur

2.0 um épaisseur

1.1 um épaisseur

0.9 um épaisseur

0.7 um épaisseur

4.0 um épaisseur

Les bactéries seront immobilisées selon leur tailleGrâce au flux, les cellules se positionneront dans le canal correspondant à leur morphologie

“Marqueurs” pour localiser les sites d’accrochage

Immobilisation des bactéries dans les chambres (x4)

L

Lamelle #1.5 ~170nm

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ


L

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ

Double Flux de pression qui fait soulever le couvercle en silicone de quelques nanomètres

Quelques nm


Lamelle #1.5 ~170nm

L

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ

Injection des bactéries par pression


Lamelle #1.5 ~170nm

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ

Injection des bactéries par pression


Lamelle #1.5 ~170nm

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ

Arrêt du flux de pression : le silicone baisse et maintient les cellules dans le «sillon » correspondant à leur morphologie


Lamelle #1.5 ~170nm

X X

I

Silicone (PDMS)

3.0µ 2.0µ 1.1µ 0.9µ 0.7µ 4.0µ

Objectif x100 A.N 1.45


Lamelle #1.5 ~170nm

Injection des molécules d’intérêt via les 5 puits d’injection

Puits d’ensemencement des bactéries

4 séries de puits pour l’ajout de solution et contrôle par perfusion

Chambres de culture pour 4 manips indépendantes

sorties déchets

ONIX de CellAsicDesign innovant des plaques microfluidiques

Possibilité d’injecter 5 solutions différentes

• Ajout du milieu par injection d’air sous pression qui pousse le liquide dans les puits

• Aucun contact avec le liquide – Facile à mettre enplace et à nettoyer

ONIX de CellAsicDesign innovant du « manifold »

Chargement des cellules en 2 étapes:

1) Les bactéries sont déposées dans le puits N°8 , du milieu est ajouté dans le puits N°62) Les cellules sont chargées dans les chambres par une pression simultannée des puits N°6 et 8(Les puits 1‐5 sont sous pression afin d’éviter d’éventuelles contaminations des milieux par les cellules injectées)

Unit Markers

Step 1Step 2 Well 8Well 6

Well 1

Well 2

Well 3

Well 4

Well 5

Well 7

ONIX de CellAsicInjection des bactéries : procédure

Le milieu de culture est injecté depuis les puits 1‐5 via différents canaux pour ensuite diffuser par perfusion dans la chambre où sont cultivées les cellules.

Le flux est représenté par les flêches rouges

Vu le faible volume fluidique de la chambre, le milieu est renouvelé rapidement (30 sec environ)

Well 1

Well 2

Well 3

Well 4

Well 5

Well 7 : poubelle

ONIX de CellAsicInjection des milieux – drogues – antibios

Visualisation du TMA‐DPH dans les canaux d’injection des plaques CellAsic : début du marquage après 40 secondes d’injection.

Vidéos de Bactéries en microfluidique

Escherichia coli ‐ 18h d’acquisition ‐ PAS D’ARRET DE CROISSANCE Céline Mathieu Demaziére

1µ


E.Coli –SopA‐mVenus – PAS DE TOXICITE du SILICONE sur la croissance & signal

E.Coli ‐ SopA‐mVenus ‐ Céline Mathieu Demaziére

Grâce au renouvellement du milieu et élimination des déchets: PAS DE PERTE DU SIGNAL FLUO



Injection à un temps déterminé (ici 120 min) : dégradation de SopA‐mVenus (système degron)


E.Coli ‐ Hu‐mCherry & SopA‐mVenus ‐ Céline Mathieu Demaziére

Injection à un temps déterminé (ici 120 min) : dégradation de SopA‐mVenus (système degron)


Injection à un temps déterminé (ici 78min) : LytA‐Gfp


Streptococcus pneumoniae ‐ LytA‐Gfp – Isabelle Mortier

Injection à un temps déterminé (ici 75min) : LytA‐Gfp

SopB‐mVenus perte & gain de cellules au cours du tempsfluide trop fort?? (1psi)


SopB‐mVenus

Polaromonas naphtalenivorans (~2,2µm)Franck Pasta

Immobilisation de Bactéries en microfluidique

Streptococus pneumoniae (0.7‐0.8µm)Isabelle Mortier & Nathalie Campo

Caulobacter crescentus (bactérie glue) (~1µm)Yves Brun

Stellar+pJYB249‐1min M9GC+20min FM464 10µl dans 200µlM9 injection à 5psi

Chambre N°5 milieu

Début du marquage du bas de la chambre après ~9min d’injection de FM4‐64 (10µl dans 200µl M9GC) , elle est entièrement marquée au bout de 18min (injection 5psi).

Les +

. Immobilisation parfaite des bactéries quelle que soit leur tailleDe Streptococcus pneumoniae 0.7µm àPolaromonas naphtalenivorans 2,2µm

. Ajout / Retrait de milieu, drogues, d’agent perturbateur de manière très précise

. Déchets éliminés en continue‐ Signal Fluo maintenu au cours du temps

. Flux laminaire : pas de mélange, ni de turbulences

. Reproductibilité des expériences (résultats opérateur indépendant)

Les ‐

. Le prix des plaques: 80 eurosSoit 20 euros la manip(4 chambres, stock avec du PBS à 4°C pour une utilisation ultérieure des chambres restantes)

. Remplissage des puits avant le lancement des acquisitions. Pas de modification possible des milieux.

. Temps de remplissage des chambres long et hétérogène. Variation selon le type de molécules. (Molécules Hydrophobes se fixent au PDMS)

ONIX de CellAsicAvantages et Inconvénients

Aligner – Stabiliser les images Time Lapse

Plusieurs outils :

‐ StackregPhilippe Thévenaz, Biomedical Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL)Sub‐pixel registration algorithm that minimizes the mean square difference of intensities between a reference and a test data set.

‐ Image StabilizerKang Li (2008)Méthode similaire. Résultats non satisfaisants sur nos images


Plusieurs outils :

‐ StackregPhilippe Thévenaz, Biomedical Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL)Sub‐pixel registration algorithm that minimizes the mean square difference of intensities between a reference and a test data set.


Plusieurs outils :

‐MultiStackregBrad Busse, http://bradbusse.net/sciencedownloads.html‐ StackReg sur premier Canal‐ Génération d’une matrice de transformation‐ Application de la matrice aux autres canaux

Débruiter les images si nécessaire

Plugin PureDenoise :Florian Luisier at the Biomedical Imaging Group (BIG), EPFL, Switzerland

Signaux faibles : Images de bactéries vivantes : Illuminations courtes, de faible intensité Bruit Poissonien

Débruiter les images si nécessaire

Plugin PureDenoise :Florian Luisier at the Biomedical Imaging Group (BIG), EPFL, Switzerland

Kymograph

Plugin MultipleKymograph :J. Rietdorf FMI Basel + A. Seitz EMBL Heidelberg

Kymograph


E.coli

Kymograph


……..

Kymograph

TempsE.coli

suivi de protéines fluorescentes en time lapse chez la...

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