effets du stress oxydant sur le fonctionnement des...
TRANSCRIPT
N°: 2005-ISAL-00123 année 2005
THESE Présentée
DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR
Formation doctorale: Biochimie
Ecole doctorale interdisciplinaire sciences-santé
Par
Anísio Francisco SOARES
EFFETS DU STRESS OXYDANT SUR LE FONCTIONNEMENT DES ADIPOCYTES :
ADIPONECTINE ET PROSTAGLANDINES
Soutenance le 13 décembre 2005
Jury de thèse : M. le Dr. C. CARPENE (Rapporteur)
M. le Pr. M. LAGARDE (Président)
M. le Dr. C.L. LEGER (Rapporteur)
M. le Dr. A. GELOËN (Directeur de thèse)
M. le Pr. J.M. PEQUIGNOT (Examinateur)
Cette thèse a été préparée au laboratoire de Physiopathologie des Lipides et des Membranes de l’INSA (INSERM UMR585)
2
Novembre 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AMGHAR Y. LIRIS AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASKURT A. LIRIS BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSE P. LAMCOS BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** BUREAU J.C. CEGELY* CAMPAGNE J-P. PRISMA CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHAMPAGNE J-Y. LMFA CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COURBON GEMPPM COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUBUY-MASSARD N. ESCHIL DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES FAZEKAS A. GEMPPM FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLEURY E. CITI FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE
3
GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION Novembre 2003 JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** NELIAS D. LAMCOS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORMAND B. GEMPPM NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PECORARO S. GEMPPM PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RICHARD C. LGEF RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS**
4
VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : KOBAYASHI T. PLM PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS
5
SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
CHIMIE DE LYON
M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 [email protected]
E2MC
ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS
M. Alain BONNAFOUS Université Lyon 2 14 avenue Berthelot MRASH Laboratoire d’Economie des Transports 69363 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 [email protected]
E.E.A.
ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE
M. Daniel BARBIER INSA DE LYON Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.64.43 [email protected]
E2M2
EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2
M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive Equipe Dynamique des Populations Bactériennes Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS Tél : 04.78.86.31.50 [email protected]
EDIIS
INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis
M. Lionel BRUNIE INSA DE LYON EDIIS Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 [email protected]
EDISS
INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE http://www.ibcp.fr/ediss
M. Alain Jean COZZONE IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 Tél : 04.72.72.26.75 [email protected]
MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml
M. Jacques JOSEPH Ecole Centrale de Lyon Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des Surfaces 36 Avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél : 04.72.18.62.51 [email protected]
Math IF
MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE http://www.ens-lyon.fr/MathIS
M. Franck WAGNER Université Claude Bernard Lyon1 Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 [email protected]
MEGA
MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html
M. François SIDOROFF Ecole Centrale de Lyon Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 [email protected]
6
A mes parents et à mes frères et soers,
Pour l’amour qu’ils m’apportent et leur soutien.
A Beatriz et Vinícius,
Les meilleurs cadeaux que la vie m’a apporté.
A Célia
Pour ton amour, ta tendresse, ta compréhension et tes encouragements
de tous les jours pendant toute cette épreuve et tout le reste…
7
REMERCIEMENTS
Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisées au sein de l’unité mixte INSERM
585-INSA de Lyon « Physiopathologie des Lipides et Membranes » dirigée par le Professeur
Michel LAGARDE. Je lui suis reconnaissant de m'avoir accueilli au sein de son unité de recherche.
Je voudrais témoigner ma reconnaissance au Docteur Alain GELOEN pour avoir encadré cette
thèse. Je le remerci particulièrement pour sa rigueur scientifique, son exigence, sa disponibilité et
ses encouragements, en me faisant partager son expérience et ses connaissances scientifiques, et
aussi pour m'avoir supporté durant ces années.
J'exprime ensuite mon estime et mes remerciements aux membres de mon jury :
Le Docteur Christian CARPENE et Docteur Claude Louis LEGER qui m'ont fait l'honneur de
juger ce travail de thèse et de me faire ainsi bénéficier de leurs compétences et de leurs
connaissances.
Le Professeur Jean Marc PEQUIGNOT pour sa collaboration efficace à ce travail, ses
explications pertinentes et sa participation à mon jury de thèse.
Je voudrais remercier le Gouvernement Brésilien, plus précisément la CAPES pour m’avoir soutenu
financièrement.
Je souhaite également remercier très chaleureusement tous les membres du laboratoire, et plus
particulièrement à :
A Bader, sans qui ces deux dernières années auraient été bien mornes. Toujours prêt à nous rendre
service, avec sa bonne humeur et sa profonde gentillesse.
A Amal, Hiba et Saïda, pour leur générosité et leur patience face à mon incompréhension
linguistique et tous les bons moments qu’on a partagé. Merci.
8
A Delphine, pour son acceuille chaleureux, les grosses manips qu’on enduré et pour son amitié.
Aux anciens thésards (les Dr. Laurent, Pierre, Sandrine, Olivier, Elodie, Karen) qui m’ont fait
profiter de leur expérience.
A Christophe et Marie-caroline, pour leur gentillesse leur soutien et tout simplement pour le
travail qu’on a accomplie ensemble.
A Patrick, pour sa patience, générosité et ses conseils informatiques.
A Annie-France, Catherine, Evelyne, Georges, Madeleine Dubois, Martine, Michel
Guichardant, pour les discussions et conseils scientifiques et surtout pour leur cordialité.
A Véronique, Laurence et Nathalie pour leur calme, gentillesse et disponibilité de toujours.
A Isabelle, Madeleine Pick pour les repas très agréable.
A Valérie pour les cours intensifs de français, pour l’amitié, les conseils domestique, les pauses
café.
A Olga, pour sa vivacité et la bonne humeur qu’elle diffuse autour d’elle.
A Salam, bon courage et bonne chance pour la suite.
A Salim pour son humour, sa disponibilité et ces bonnes blagues.
9
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS ........................................................................................................................................................ 7 TABLE DES MATIERES................................................................................................................................................ 9 INDEX DES FIGURES ET TABLEAU ....................................................................................................................... 12 AVANT-PROPOS .......................................................................................................................................................... 15 ABRÉVIATIONS ........................................................................................................................................................... 17 RESUME......................................................................................................................................................................... 19 SUMMARY..................................................................................................................................................................... 20 I INTRODUCTION.................................................................................................................................................... 21 II RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................................................................... 23
II.1 LE TISSU ADIPEUX .......................................................................................................................................... 24 II.1.1 Le tissu adipeux blanc.......................................................................................................................... 24 II.1.2 Le tissu adipeux brun ........................................................................................................................... 25 II.1.3 L’adipocyte .......................................................................................................................................... 26
II.1.3.1 Morphologie .....................................................................................................................................................26 L'adipocyte blanc est composé d'une gouttelette de lipides. Le noyau est refoulé en périphérie de la cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des lipides intracellulaires. .....................................................................................26 II.1.3.2 Les triglycérides ...............................................................................................................................................26 II.1.3.3 Les acides gras .................................................................................................................................................27 II.1.3.4 Lipogenèse - Synthèse des triglycérides............................................................................................................28 II.1.3.5 La lipolyse ........................................................................................................................................................29
II.1.4 L’adipocyte, cellule sécrétrice ............................................................................................................. 31 II.1.4.1 Les adipokines ..................................................................................................................................................31
II.1.4.1.1 Leptine ........................................................................................................................................................31 II.1.4.1.2 Adiponectine ...............................................................................................................................................32 II.1.4.1.3 Résistine ......................................................................................................................................................33
II.2 LE STRESS OXYDANT ...................................................................................................................................... 35 II.2.1 Définition ............................................................................................................................................. 35 II.2.2 Mécanismes pro oxydants .................................................................................................................... 36 II.2.3 Mécanismes anti-oxydants ................................................................................................................... 37
II.2.3.1 Les Enzymes : ...................................................................................................................................................37 II.2.3.1.1 Les superoxydes dismutases (SOD)............................................................................................................37 II.2.3.1.2 Les catalases ...............................................................................................................................................37 II.2.3.1.3 Les peroxydases ..........................................................................................................................................38
II.2.3.1.3.1 Glutathion peroxydase à sélénium (GPx) .............................................................................................38 II.2.3.1.3.2 La glutathion peroxydase cytosolique ..................................................................................................38 II.2.3.1.3.3 La glutathion peroxydase plasmatique .................................................................................................38 II.2.3.1.3.4 La glutathion peroxydase membranaire (HPGPx) ...............................................................................39
II.2.3.1.4 La thiorédoxine (TRX) ...............................................................................................................................39 II.2.3.2 Les molécules antioxydantes.............................................................................................................................40
II.2.3.2.1 La vitamine C..............................................................................................................................................40 II.2.3.2.2 La vitamine E..............................................................................................................................................40 II.2.3.2.3 Le sélénium.................................................................................................................................................40 II.2.3.2.4 Le zinc.........................................................................................................................................................41
II.3 LE STRESS OXYDANT ET LES MALADIES METABOLIQUES: ............................................................................... 41 II.3.1 Le stress oxydant et l’obésité. .............................................................................................................. 41
II.4 LE STRESS OXYDANT DANS LA CELLULE......................................................................................................... 42 II.5 LE STRESS OXYDANT DANS L'ADIPOCYTE: LA PRODUCTION DE ROS. ............................................................. 43 II. 6 LES PROSTAGLANDINES.................................................................................................................................. 44
II.6.1 Synthèse et dégradation des cyclooxygénases...................................................................................... 45 II.6.2 Biologie fonctionnelle des prostaglandines. ........................................................................................ 45 II.6.3 Prostaglandines et adipocytes.............................................................................................................. 47
II.7 LE STRESS OXYDANT ET LE METABOLISME DES ACIDES GRAS POLYINSATURES. ............................................. 47 III MATERIEL ET METHODES............................................................................................................................. 50
10
III.1 MATERIELS GENERALES ................................................................................................................................. 51 III.1.1 Produits pour la culture cellulaire....................................................................................................... 51 III.1.2 Réactifs et solvants pour le dosage de prostaglandine ........................................................................ 51 III.1.3 Réactifs, solvants et solutions pour les Western blotting ..................................................................... 52 III.1.4 Réactifs et solvants pour les RT-PCR .................................................................................................. 52 III.1.5 Appareils .............................................................................................................................................. 53
III.2 METHODES ..................................................................................................................................................... 54 III.2.1 Les adipocytes 3T3-L1 ......................................................................................................................... 54 III.2.2 Culture cellulaire ................................................................................................................................. 54
III.2.2.1 Différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes.....................................................................................55 III.2.2.2 L’induction du stress oxydant avec la glucose oxydase ....................................................................................55 III.2.2.3 L’incubation des adipocytes 3T3-L1 avec 4-HNE ............................................................................................55
III.2.3 Dosage de l’adiponectine..................................................................................................................... 56 III.2.4 Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène............................................................................. 56 III.2.5 Evolution de la concentration de glucose en présence de glucose oxydase......................................... 56 III.2.6 Dosage de Lactate................................................................................................................................ 56 III.2.7 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) .................................................................. 57 III.2.8 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). ......... 57
III.2.8.1 Electrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et "western-blotting". ...............................................58 III.2.9 Mesure de l’expression des gènes par RT-PCR :................................................................................. 59
III.2.9.1 Extraction des ARN ..........................................................................................................................................59 III.2.9.2 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR)........................................................59 III.2.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose .....................................................................................................................60
III.2.10 Dosage du 4-HNE par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). .... 60 III.2.11 Dosage des prostaglandines E2, D2, F2α et 6 céto-F1α par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC- MS ............................................................................................................................. 61
III.2.11.1 Extraction des prostaglandines à partir des adipocytes en culture .................................................................61 III.2.11.2 Séparation des prostaglandines par chromatographie en couche mince (CCM) .............................................62 III.2.11.3 Dérivation chimique des prostaglandines : E2, D2, F2α et 6-céto-PGF1α ........................................................63 III.2.11.4 Analyse des prostaglandines par GC-MS .........................................................................................................63 III.2.11.5 Chromatographie en phase gazeuse (GC) ........................................................................................................64 III.2.11.6 Structure et analyse des prostaglandines..........................................................................................................64 III.2.11.7 Limite de détection du GC-MS..........................................................................................................................66
III.2.12 Dosage de la Prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 par GC-MS et GC-MS-MS. .............................. 66 III.2.12.1 Extraction, séparation, dérivation et l’analyse de la 15dPGJ2.........................................................................66 III.2.12.2 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS ...........................................................................................................68
III.2.13 Liaison covalente de la prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 et son récepteur nucléaire le peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARgamma) ...................................................................... 68
III.2.13.1 Incubation de la 15dPGJ2 avec PPARgamma ................................................................................................68 III.2.13.2 Extraction et analyse au GC-MS ......................................................................................................................68 III.2.13.3 Analyse de binding radioligand ........................................................................................................................69 III.2.13.4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)...................69
III.2.14 Analyse statistique................................................................................................................................ 70 IV RESULTATS ......................................................................................................................................................... 71
IV.1 CELLULES....................................................................................................................................................... 72 IV.1.1 Effet du stress oxydant sur les adipocytes ............................................................................................ 72 IV.1.2 Effet de la glucose oxydase sur la dégradation du............................................................................... 72 IV.1.3 Effet de la glucose oxydase sur la production du peroxyde d’hydrogène :.......................................... 74 IV.1.4 Chromatogramme du 4-HNE en GC-MS après dérivation au PFB-TMS ............................................ 74 IV.1.5 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la production du 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 :................................................................................................................................................. 75 IV.1.6 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 :................................................................................................................................................. 77 IV.1.7 Comptage des adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de glucose oxydase par fluorescence CyQuant. ............................................................................................................................................ 79 IV.1.8 Effet de la glucose oxydase et de la catalase sur la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. ............................................................................................................................................................. 79 IV.1.9 Effet de la glucose oxydase dénaturée sur la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.80 IV.1.10 Effet du 4-HNE sur production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. ........................................ 81 IV.1.11 Expression des ARNm codant l’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 soumises à un stress oxydant. ............................................................................................................................................................. 83 IV.1.12 Evolution de la concentration cellulaire en prostaglandines dans les adipocytes 3T3-L1 en réponse à des concentrations croissantes de glucose oxydase. ............................................................................................... 85 IV.1.13 Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au 4-HNE. ........................................... 89
11
IV.2 ANIMAL.......................................................................................................................................................... 91 IV.2.1 Production des prostaglandines PGF2α, PGD2, PGE2, 6 Céto PGF1α et 15dPGJ2 dans les tissus adipeux épididymal et rétropéritonéal chez le rat Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines. ................................. 91 IV.2.2 Dosage de la prostaglandine 15dPGJ2 dans l’urine de rat Lou C âgés de 4 et 8 semaines. ............... 97
IV.3 ETUDES IN VITRO............................................................................................................................................. 98 IV.3.1 Prostaglandine 15d PGJ2 et liaison covalente..................................................................................... 98 IV.3.2 Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma .................................................................................... 99 IV.3.3 Cinétique de dissociation de différents agonistes de PPAR............................................................... 100 IV.3.4 Analyse de spectrométrie de masse au MALDI-TOF......................................................................... 100 IV.3.5 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS............................................................................................. 102
V DISCUSSION .................................................................................................................................................. 106 VI CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................................... 114 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................................................... 116 PUBLICATIONS.......................................................................................................................................................... 133
12
INDEX DES FIGURES ET TABLEAU
Figure 1: Représentation schématique d’un adipocyte blanc …………………………………………………………. 26
Figure 2: Représentation schématique de l’hydrolyse des triglycérides (TG) du tissu adipeux………………………. 30
Figure 3: Relation existant entre les radicaux issus de l’oxygène (en rouge) et ceux issus de l’azote (en vert)………35
Figure 4: Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques
(d’après Matés, 1999)……………………………………………………………………………………………………39
Figure 5: Voie de synthèse des prostaglandines à partir de l’acide arachidonique (modifié d’après Chew, 2005)…..49
Figure 6: Structure de prostaglandines analysées………………………………………………………………………65
Figure 7: Structure de la 15dPJ2 et 15dPJ2 derivée……………………………………….…………………………...67
Figure 8: Dosage du glucose dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1 incubées avec des concentrations
croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………………………….. 73
Figure 9: Dosage du peroxyde d'hydrogène dans le milieu de 3T3-L1 après 30 minutes en présence de
concentrations croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………….74
Figure 10: Chromatogramme du 4-HNE par GC-MS après dérivation au PFB-TMS. Deux pics apparaissent
correspondant aux isomères syn et anti…………………………………………………………………………………75
Figure 11: Production de 4-HNE par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de glucose
oxydase pendant 16 heures d’incubation à j17 après le début de la différentiation……………………………………76
Figure 12: Sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 exposés pendant 16 heures à des concentrations
croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………………………….. 77
Figure 13: Sécrétion d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 en culture. L’adiponectine a été mesurée par western
blotting…………………………………………………………………………………...………………………………. 78
Figure 14: Quantification du nombre de cellules en présence de concentrations croissantes de glucose oxydase…...79
Figure 15: Effets de la glucose oxydase et de la glucose oxydase plus catalase sur la sécrétion d’adiponectine par les
adipocytes 3T3-L1………………………………………………………………………………………………………...80
Figure 16: Effet de la glucose oxydase et de la glucose oxydase dénaturée sur la production d’adiponectine par les
cellules 3T3-L1, à j17 après la différenciation…………………………………………………………………………..81
Figure 17: Production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 exposés à des concentrations croissantes de 4-HNE
pendant 16 heures………………………………………………………………………………………………………...82
Figure 18: Corrélation entre la production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 soumis à des concentrations
croissantes de glucose oxydase et la concentration intracellulaire en 4-HNE…………………………………………83
Figure 19: Inhibition de l’expression des ARNm codant l’adiponectine dans les adipocytes 3T3-L1 exposés à des
concentrations croissantes de glucose oxydase………………………………………………………………………....84
13
Figure 20: Concentrations en prostaglandine E2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation) exposées à
deux concentrations de glucose oxydase………………………………………………………………………………...85
Figure 21: Concentrations en prostaglandine D2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation) exposées à
deux concentrations de glucose oxydase………………………………………………………………………………...86
Figure 22: Concentrations en prostaglandine F2 alpha dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation)
exposées à deux concentrations de glucose oxydase…………………………………………………………………….87
Figure 23: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la différenciation)
exposées à deux concentrations de glucose oxydase…………………………………………………………………….88
Figure 24: Production basale de lactate par les adipocytes 3T3-L1, effet d’un stress oxydant (100mU/mL) sur la
production de lactate et d’une supplémentation en acide lipoïque (10-4M), pendant deux heures…………………….89
Figure 25: Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations croissantes de 4-HNE
pendant 2 heures………………………………………………………………………………………………………… 90
Figure 26: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4
et 8 semaines……………………………………………………………………………………………………………...92
Figure 27: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés
de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………………...92
Figure 28: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4
et 8 semaines ……………………………………………………………………………………………………………..93
Figure 29: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés
de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………………...93
Figure 30: Concentrations en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4
et 8 semaines……………………………………………………………………………………………………………. .94
Figure 31: Concentrations tissulaires en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et
Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 94
Figure 32: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux épidydimal de rats Lou C et Wistar
âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………………….. 95
Figure 33: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et
Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 95
Figure 34: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14 prostaglandine J2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et
Wistar âgés de 4 et 8 semaines………………………………………………………………………………………….. 96
Figure 35: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14-prostaglandine J2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats Lou
C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines……………………………………………………………………………………... 96
Figure 36: Concentrations urinaires en 15dPGJ2 de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines…………………..97
Figure 37: Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma après prè-incubation avec différentes concentrations de
15dPGJ2 el lavage. ………………………………………………………………………………………………………..99
Figure 38: Cinétique de dissociation de deux ligands de PPARgamma : pioglitazone et 15dPGJ2………………… 100
14
Figure 39: Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des produits de digestion à la trypsine d’un fragment du
domaine de liaison (Ligand Binding Domain) de PPARgamma couplé à la GST…………………………………...101
Figure 40: Chromatogramme obtenu par GC-MS-MS du standard interne de la 15dPGJ2 dérivé sous forme de PFB-
TMS …………………………………………………………………………………………….………………………103
Figure 41: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des adipocytes et sa
dérivation sous forme de PFB-TMS….…………………………………………………………….………………….104
Figure 42: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des l’urine humaine et sa
dérivation sous forme de PFB-TMS..…………………………………………….……………………………………105
Tableau 1: Prostaglandine 15 désoxy-delta12,14-J2 libre dosée par GC-MS …………..………………………….……98
15
AVANT-PROPOS
Publications scientifiques :
- Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Delphine Cozzone, Natalie Bernoud-Hubac, N Bouzaïd-
Tiali, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effects of oxidative stress on adiponectin secretion and lactate
production in 3T3-L1 adipocytes.
Free Radic Biol Med., 2005 Apr 1;38(7):882-9.
- Anísio F. Soares, Olivier Nosjean, Delphine Cozzone, D. D’Orazio, Michel Becchi, Michel
Guichardant, G. Ferry, J.A. Boutin, Michel Lagarde, Alain Géloën. Covalent binding of 15-deoxy-
delta 12,14-prostaglandin J2 to PPARγ .
Biochem Biophys Res Commun., 2005 Nov (337): 521-525.
- Marie-Caroline Michalski, Anísio F. Soares, Christelle Lopez, Nadine Leconte, Valérie Briard,
Alain Géloën. The supramolecular structure of milk fat affects plasma triacylglycerol and fatty acid
profile in the rat.
European Journal of Nutrition., 2006 (In press).
- Christophe Soulage, Anísio F. Soares, Catherine Girotti, G. Paire, F.E. Demarne, Michel Lagarde,
Alain Géloën. Antioxidant effect of cirsimarin, a flavonoid extacted from Microtea debilis
(Phytolaccaceae)
Planta medica., (soumis à publication).
- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. COX
expressions and activities in 3T3-L1 adipocytes in response to oxidative stress. (en préparation).
Communication orale:
- Anísio F. Soares. Adipocytes et obésité. Les ingrédients minceur: dernières avancées scientifiques
dans le domaine de la perte de poids. Société Française des Antioxydants, Paris, France, 1-2 juin,
2005.
16
Communications affichées:
- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effet du
stress oxydant sur l’expression des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1. 2émé Congrès
annuel de la nouvelle Société Française d’Athérosclérose. Biarritz, France, 9-11 juin, 2005.
- Bader Zarrouki, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effets du
stress oxydatif sur l’expression d’adiponectine et des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1.
9émé Journée Scientifique du EDISS, Villeurbanne, 7 avril, 2005.
- Anísio F. Soares, Bader Zarrouki, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën. Effets du
stress oxydatif sur l’expression d’adiponectine et des cyclooxygénases dans les adipocytes 3T3-L1.
5ème Journée Scientifique du IMB, Villeurbanne, France, 13 septembre, 2004.
- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.
Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1. 6ème Journée Scientifique du IMBL,
Villeurbanne, France, 25 novembre, 2003.
- Delphine Cozzone, Anísio F. Soares, Nathalie Bernoud-Hubac, Michel Guichardant, Michel
Lagarde, Alain Géloën. Production of 15-deoxy-∆12,14-prostaglandin J2 a PPARγ natural ligand, by
3T3-L1 adipocytes. 44th International Conference on the Bioscience of Lipids – ICBL, Oxford,
United Kingdom, 7-11 septembre, 2003.
- Delphine Cozzone, Anísio F. Soares, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.
Production de 15-désoxy-∆12,14-prostaglandine J2, un ligand endogène de PPARγ, au cours de la
diffèrenciation adipocytaire des cellules 3T3-L1. Congrès du GERLI, Paris, France, 2-5 septembre,
2003.
- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.
Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1 Federation of European Biochemical
Societes 2003 – FEBS, Brussels, Belgique, 3-8 juillet, 2003.
- Anísio F. Soares, Delphine Cozzone, Michel Guichardant, Michel Lagarde, Alain Géloën.
Oxidative stress decreases adiponectin production by 3T3-L1. 7ème journée de l’ Ecole Doctorale
Interdisciplinaire Sciences et Santé - EDISS, Villeurbanne, France, 16 avril, 2003.
17
ABRÉVIATIONS
AA : Acide arachidonique ou 20:4n-6 ACS : Acyl-CoA synthétase AGPIs : Acides gras polyinsaturés AG : Acide gras ARNm : Acide ribonucléique messager ATGL : Adipose triglycéride lipase ATP : Adénosine triphosphate BF3 : Trifluorure de bore BSA : Albumine sérique bovine BSTFA : N,O-Bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide CCM : Chromatographie sur couche mince COX : Cyclooxygénase DAG : Diacylglycérol DGAT: Diacylglycérol transférase DHA : Acide docosahexaénoïque ou 22:6n-3 DMSO : Diméthylsulfoxyde ECL : Enhanced chemiluminescence EDTA : Acide éthylènediamine tétra acétique FABP : “Fatty acid binding protein” FAT : “Fatty acid translocase” (ou FAT/CD36) FATP : Protéine de transport des acides gras EGTA : acide éthylèneglycol tétra acétique GC : Chromatographie en phase gazeuse GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse G6PDH : Glucose 6 phosphate déshydrogénase GPx : Glutathion peroxydase GSH : Glutathion GR : Glutathion réductase HIF: “Hypoxia induced factor” HO : Radical hydroxyle H2O2 : Peroxyde d'hydrogène 15-HETE : 15-hydroxyéicosatétraénoïque 13-HODE : 13-hydroxyoctadécadiénoïque 15-HpETE : 15-hydroperoxyeicotétraénoique 13-HpODE : 13-hydroperoxyoctadécadiénoïque 4-HNE : 4-hydroxynonénal LCFA : Acides gras à longues chaînes LHS : Lipase hormono-sensible LPL : Lipoprotéines lipase NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate (Forma réduite) MAO : Monoamine oxydase NICI : Ionisation chimique négative NO : Monoxyde d’azote ONOOH : Nitroperoxyde PAGE : Electrophorèse en gel de polyacrylamide PG : Prostaglandine
18
PGH synthase: Prostaglandine H synthase PIPES : Acide pepérazine-N-N’-bis [2-éthanesulfonique] PIP2 : Phosphatidylinositol 4,5-diphosphate PIP3 :Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate PKC : Protéine kinase C PLA2 : Phospholipase A2 PLD : phospholipase D PPAR : Peroxisome proliferator-activated receptor ROO : Radicaux peroxyles ROS : Espèces réactives dérivés de l’oxygène (ou ‘reactive oxygen species’) SSAO: Semicarbazide-sensitive amine oxidase SDS : dodécylsulfate de sodium SI : Standard interne SOD : Superoxyde dismutase TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(dimethylamino)ethane TG : Triglycérides TRX : Thiorédoxine TNF : “Tumor Necrosis Factor” Ucp-1 : Protéine découplante-1 VEGF : “Vascular endothelial cell growth factor” VLCFA : Acides gras à très longue chaîne
19
RESUME
Le stress oxydant est impliqué dans de nombreuses pathologies: athérosclérose, diabète de
type 2, maladies neurodégénératives ainsi que dans le vieillissement. Il favorise le développement
de la résistance à l’insuline dans les tissus impliqués dans le métabolisme énergétique. Les
prostaglandines sont issues de l’action des cyclooxygénases (COX) sur l’acide arachidonique libéré
à partir des membranes cellulaires par la phospholipase A2. Elles jouent un rôle important dans la
différenciation adipocytaire, par l’intermédiaire de la 15dPGJ2, le ligand endogène le plus efficace
de PPARgamma, un récepteur nucléaire dont l’activation induit la différenciation en cellule
adipeuse. Notre objectif était de mesurer l’effet du stress oxydant sur la différenciation et le
fonctionnement adipocytaire. Nous avons mesuré la sécrétion d’adiponectine, l’expression de ses
ARNm, le 4 hydroxynonénal (4-HNE) dans les adipocytes 3T3-L1 en réponse à un stress oxydant
produit par la glucose oxydase. Une part importante de notre travail a été consacrée à la
quantification de la 15dPGJ2, à la mise en évidence de son rôle dans la différenciation des cellules
3T3-L1 et dans le tissu adipeux de rats. Nous avons également dosé les prostaglandines: PGD2,
PGE2, 6-céto-PGF1α, et PGF2α au cours du développement des tissus adipeux épididymal et
rétropéritonéal. Parmi les résultats les plus importants, nous avons démontré que le stress oxydant
induit par la glucose oxydase, objectivé par la libération de 4-HNE, diminue la production
d’adiponectine, une adipokine insulino-sensibilisante produite principalement par les adipocytes.
Nous avons également mis en évidence l’existence d’une liaison covalente entre la prostaglandine
15dPGJ2 et PPARgamma. Cette observation a de nombreuses implications sur, non seulement le
rôle de cette prostaglandine, mais également sur les moyens à mettre en oeuvre pour étudier son
rôle. En conclusion, nos travaux soulignent l’importance du stress oxydant dans le développement
du diabète de type 2, en diminuant la production d’adiponectine. La mise en évidence d’une liaison
covalente entre la 15dPGJ2 et PPARgamma atteste de l’importance de cette prostaglandine. Cette
observation amènera à reconsidérer le rôle physiologique de cette prostaglandine, rôle jusqu’à
présent sous-estimé sous prétexte que les concentrations en 15dPGJ2 libre mesurées sont très
faibles.
20
SUMMARY
Oxidative stress has been suspected to play a major role in numerous pathophysiological
states, such as : atherosclerosis, type 2 diabetes, neurodegenerative deseases as well as ageing. It is
involved in the development of insulin resistance in peripheral tissues involved in energy
metabolism. Prostaglandins are produced by cyclooxygenases (COX) from arachidonic acid
released from cell membrane by phospholipase A2. Prostaglandins are key players in adipose cell
differentiation through 15dPGJ2, the most efficient endogenous ligand to PPARgamma, a nuclear
receptor which is able to induce adipose cell differentiation. Our main goal was to measure the
effects of oxidative stress on adipose cell differentiation and functions. We measured adiponectin
production, the expression of mRNA coding adiponectin and 4 hydroxy-nonenal (4-HNE) a marker
of lipid peroxidation, in 3T3-L1 adipocytes in response to oxidative stress induced by glucose
oxidase. An important part of the present work was dedicated to the quantification of 15dPGJ2, the
demonstration of its role in 3T3-L1 adipose cell differentiation and in adipose tissue of rats. We
also measured the prostaglandins of the 2 series: PGD2, PGE2, 6 céto-PGF1α, and PGF2α during the
development of epididymal and retroperitoneal adipose tissues. Amongst the most important results,
we show that oxidative stress induced by glucose oxidase, increased 4-HNE production and
decreased adiponectin secretion, an adipokin mainly produced by adipocytes which improves
insulin sensitivity. We also showed that 15dPGJ2 covalently binds PPARgamma. That observation
has numerous implications, not only concerning the role of that prostaglandin but also on the
methods required to fully elucidate its functions. In conclusion, our results underline the importance
of oxidative stress in the development of type 2 diabetes through the decreased production of
adiponectin by adipose cells. The demonstration of a covalent binding between 15dPGJ2 and
PPARgamma points out the important physiological role of that prostaglandin. That observation
may result in the reconsideration of its physiological role, which has been under estimated since its
tissular free concentrations were found to low to be efficient.
21
I INTRODUCTION
22
L’oxygène n’était pas présent dans l’atmosphère originelle de la terre. La production
d’oxygène libre a commencé il y a environ 3,5 milliards d’années avec l’arrivée des premières
bactéries capables de faire de la photosynthèse, les cyanobactéries. La production d’O2 a permis la
formation de la couche d’ozone (O3) bloquant les rayons ultraviolets (U.V.). Cette couche d'ozone a
alors servi d'écran protecteur en interceptant les U.V. nocifs et permis le développement de formes
pluricellulaires aérobies même en dehors des océans.
L’histoire a retenu le nom de Joseph Priestley comme découvreur de l’oxygène, mais il avait
été découvert quelques temps auparavant par le pharmacien Carl Wilhelm Scheele en 1772. Antoine
Laurent Lavoisier l'a nommé en 1774. Le mot oxygène est formé du grec oxys (acide) et gennan
(engendrer) et provient du fait qu’en brûlant du soufre au feu de l'oxygène on obtient de l'acide
sulfurique et qu'en brûlant du phosphore on obtient de l'acide phosphorique. À cause de son
électronégativité, l'oxygène établit facilement des liaisons chimiques avec de nombreux autres
éléments (ce qui est à l'origine de la définition initiale du terme oxydation).
Indispensable à la vie aérobie, l’oxygène est utilisé par les mitochondries pour produire de
l’énergie. Les conséquences de l’activité mitochondriale sont doubles et paradoxales. D'une part, les
mitochondries fournissent à la cellule, grâce à l’oxygène, une source d'énergie importante sous
forme d'adénosine triphosphate (ATP) à haut potentiel énergétique. D’autre part, une faible fraction
de l’oxygène (environ 0,4 à 4%) n’est pas correctement convertie en eau suite à des imperfections
de la chaîne respiratoire mitochondriale. L'oxygène donne alors naissance à des espèces oxygénées
activées parmi lesquelles figurent des radicaux libres comme l'anion superoxyde ou le radical
hydroxyle. Un radical libre est un atome ou une molécule dont la structure chimique est caractérisée
par la présence d'un électron libre rendant cette espèce chimique beaucoup plus réactive que l'atome
ou la molécule dont il (elle) est issu(e). D'autres entités non radicalaires de l'oxygène peuvent être
produites comme le peroxyde d'hydrogène ou l'oxygène singulet. Les radicaux libres réagissent
avec de nombreux composés des cellules : protéines, lipides, ADN. Le stress oxydant ainsi généré
a été au cours des dernières années de plus en plus impliqué dans des pathologies diverses telles que
les cancers, l’hypertension, le diabète de type 2, l’obésité… La fréquence de l’obésité, qui
correspond à un excès de tissu adipeux, augmente considérablement dans les pays aux modes de vie
occidentalisé. L’objectif de notre travail de recherche était de mettre en évidence les effets du stress
oxydant sur le fonctionnement des cellules adipeuses dont le rôle est de stocker l’énergie
métabolique excédentaire sous forme de triglycérides. Notre hypothèse expérimentale, issue des
données de la littérature, était que le stress oxydant pourrait jouer un rôle dans les complications
métaboliques associées à l’obésité.
23
II RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
24
II.1 Le tissu adipeux
Chez les Mammifères les adipocytes sont organisés en multi dépôts appelés tissus adipeux. Ce
tissu est spécialisé dans la mise en réserve d’énergie. C’est un réservoir d’énergie régulé par des
nerfs, des hormones, des nutriments, organisés en mécanismes autocrines et paracrines. Le tissu
adipeux représente la principale réserve énergétique des organismes. Il joue un rôle essentiel dans le
maintien de la vie en permettant aux organismes de se protéger des variations journalières en
apports alimentaires. Lorsque les apports énergétiques sont supérieurs aux dépenses de l’organisme,
l’excès calorique est mis en réserve sous forme de triglycérides stockés dans les différents dépôts
adipeux. A l’inverse, lorsque les apports caloriques sont insuffisants, les acides gras du tissu
adipeux sont mobilisés et mis en circulation dans l’organisme où ils sont oxydés dans les tissus
consommateurs d’énergie.
Il existe deux types de tissus adipeux bien distincts, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux
brun. Le premier constitue la plus grande réserve d’énergie de l’organisme, son rôle essentiel est
d’assurer le maintien de l’équilibre énergétique, le second est présent chez presque tous les
endothermes nouveau-nés, son rôle majeur est de produire de l’énergie sous forme de chaleur à
partir des triglycérides mis en réserve ou des acides gras provenant du tissu adipeux blanc.
II.1.1 Le tissu adipeux blanc
Ces cellules sont caractérisées par une grande et unique vacuole contenant les lipides (aspect
uniloculaire). Les quantités relatives et la distribution des tissus adipeux blanc dépendent des états
de contrainte, d'âge, de sexe, d’environnement et d’alimentation (Cinti, 2001). Ce tissu possède des
fonctions biochimiques spécialisées, comme la synthèse et le stockage des triglycérides (lipogenèse)
et la production d’acides gras (lipolyse).
Fonctionnellement le rôle principal du tissu adipeux blanc est le stockage et la mobilisation de
l'énergie mise en réserve. Les localisations du tissu adipeux blanc changent selon le sexe. Les
hommes accumulent la majeure partie des graisses dans la région abdominale (au-dessus des
vertèbres lombaires L4-L5). Chez les femmes, le tissu adipeux est surtout localisé dans la partie
inférieure de l’organisme (en dessous des vertèbres L4-L5: hanches, bassin, cuisses). Ces
différences ont probablement eu une signification fonctionnelle pendant l’évolution. En plus d’une
localisation différente, il faut noter que les femmes ont environ 50% plus de tissu adipeux que les
25
hommes. Chez les femmes, le tissu adipeux fournit l’énergie nécessaire au développement du fœtus,
principalement pendant la dernière partie de la gestation. L'homme pré-historique, étant chasseur-
cueilleur, était soumis à des périodes aléatoires plus ou moins longues de disettes. Egalement
soumis à la prédation, il devait développer des mécanismes d’apports énergétiques rapides
indispensables à son système locomoteur lui permettant d’échapper aux prédateurs. En son temps,
cette capacité de mise en réserve de l’énergie a sans aucun doute constitué un avantage adaptatif,
cible d’une sélection génique. De nos jours, le tissu adipeux d'une personne normale contient assez
d’énergie pour jeûner plus de deux mois (Björntorp, 2000).
II.1.2 Le tissu adipeux brun
Ce tissu est présent chez tous les Mammifères, y compris l’espèce humaine. Il joue un rôle
important à la naissance, qui représente un choc thermique, en assurant une production de chaleur
importante, permettant ainsi l’homéothermie. Le tissu adipeux brun joue un rôle déterminant chez
les espèces hibernantes, chez lesquelles la température corporelle diminue au cours de l’hibernation.
Il assure le réchauffement de l’organisme au cours des épisodes de réveil, correspondant à un
changement de température corporelle de 4°C à 37°C. De plus, les Mammifères de petites tailles
sont contraints d’avoir un métabolisme énergétique important car les déperditions caloriques
dépendent du rapport surface volume qui est très défavorable aux espèces de petites tailles (petit
volume, grande surface), car les pertes caloriques dépendent de la surface de l’organisme. Chez ces
espèces, le tissu adipeux brun joue un rôle décisif tout au long de la vie. Heldmaier (2004)
considère que jusqu’à 10 kilogrammes de masse corporelle, le tissu adipeux brun joue un rôle
important dans le maintien de l’homéothermie. A la différence du tissu adipeux blanc, le tissu
adipeux brun est fortement vascularisé et les adipocytes bruns sont directement innervés par des
fibres sympathiques. Les adipocytes bruns contiennent plusieurs gouttelettes de graisse, ce qui leur
confère un aspect multiloculaire et sont principalement caractérisés par la présence d’un très grand
nombre de mitochondries dans leur cytoplasme. Cette observation indique que ces cellules ont une
forte capacité d’oxydation des substrats (Nicholls et Locke, 1984) et donc de production de chaleur
grâce à la présence d’une protéine découplante-1 (Ucp-1) appelée de la sorte car elle assure le
découplage entre oxydations et phosphorylations.
26
II.1.3 L’adipocyte
II.1.3.1 Morphologie
L'adipocyte blanc est composé pour l’essentiel d'une gouttelette de lipides. Le noyau est
refoulé en périphérie de la cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des
lipides intracellulaires. La membrane plasmique possède de nombreux récepteurs dont les
récepteurs α et β adrénergiques. Les récepteurs α2-adrénergiques sont anti-lipolytiques tandis que
les récepteurs β-adrénergiques sont lipolytiques. Les adipocytes mettent en réserve les acides gras
libres sous forme de triglycérides qui sont stockés dans une gouttelette lipidique (lipogenèse). La
taille des adipocytes est capable de varier grandement, jusqu’à 20 fois. A l’inverse en cas de besoin
énergétique, les triglycérides sont hydrolysés, ce qui libère des acides gras libres dans la circulation
(lipolyse). Les adipocytes stockent essentiellement des triglycérides représentant plus de 90% de la
fraction lipidique. Le tissu adipeux contient aussi de 5-15% d'eau et une faible quantité de protéines
cellulaires et protéines formant la trame conjonctive (Girard et al., 1988).
Figure 1 : Représentation schématique d’un adipocyte blanc.
L'adipocyte blanc est composé d'une gouttelette de lipides. Le noyau est refoulé en périphérie de la
cellule et le cytoplasme est limité à une mince couronne autour des lipides intracellulaires.
II.1.3.2 Les triglycérides
Les triglycérides sont des formes de mise en réserve hautement concentrée d’énergie. Le
rendement de l’oxydation complète des acides gras est d’environ 9 kcal/g, par comparaison aux 4
kcal/g environ des glucides et des protéines. La raison de cette grande différence de rendement
calorique est que les acides gras sont beaucoup plus réduits. De plus, les triglycérides sont très
polaires et ainsi sont-ils mis en réserve sous une forme pratiquement anhydre, tandis que les
Noyau
Cytoplasme
Gouttelette lipidique
Membrane plasmique
Noyau
Cytoplasme
Gouttelette lipidique
Membrane plasmique
27
protéines et les glucides sont beaucoup plus apolaires et donc beaucoup plus hydratés. Les
triglycérides sont constitués de trois molécules d’acides gras reliées à un glycérol par des liaisons
esters. Ils diffèrent selon la nature et la position des acides gras estérifiés que les constituent. Les
triglycérides (triacylglycérols) n’ont aucune charge et sont insolubles dans l’eau, fusionnant en
gouttelettes, qui occupent presque tout le volume cellulaire des adipocytes. Les triglycérides
représentent 95% de la fraction lipidique, à côté de composés mineurs, saponifiables ou non (Girard
et al., 1988). Ces gouttelettes se réunissent pour former un gros globule qui occupe la plus grande
partie du volume de la cellule. Les cellules adipeuses sont spécialisées dans la synthèse et la mise en
réserve des triglycérides et dans leur mobilisation sous forme d’acides gras libres qui sont
transportés vers d’autres tissus par le sang. L’événement initial dans l’utilisation des graisses
comme source d’énergie est l’hydrolyse des triglycérides par des lipases, qui produisent du glycérol
et des acides gras libres.
II.1.3.3 Les acides gras
Une molécule d’acide gras possède deux régions distinctes : une longue chaîne hydrocarbonée
hydrophobe (de 4 à 36 carbones) chimiquement peu réactive, et un groupement acide carboxylique
ionisé en solution, extrêmement hydrophile formant facilement des esters et des amides. En fait, la
quasi-totalité des molécules d’acides gras d’une cellule sont liées de manière covalente à d’autres
molécules par leur groupement carboxyle. Les nombreux acides gras différents trouvés dans les
cellules se distinguent par la longueur de leur chaîne hydrocarbonée, le nombre et la position de
leurs doubles liaisons. Dans certains acides gras, cette chaîne est totalement saturée et non ramifiée,
dans d’autres elle contient une ou plusieurs doubles liaisons. Une nomenclature simplifiée de ces
composés indique la longueur de chaîne et le nombre de doubles liaisons séparées par deux points,
par exemple l’acide palmitique; saturé à 16 carbones, est abrégé par 16:0, et l’acide oléique à 18
carbones, avec une double liaison par 18:1.
Les acides gras, dont la dégradation peut produire, pour le même poids, plus du double
d’énergie sous forme d’ATP que le glucose, constituent une source alimentaire précieuse. Ils sont
stockés dans le cytoplasme de nombreuses cellules sous la forme de gouttelettes de triglycérides,
formées de trois chaînes d’acides gras chacune liée à une molécule de glycérol. En cas de besoin,
les acides gras sont libérés des triglycérides et dégradés en unités à deux carbones. Ces unités à
deux carbones, représentant le groupement acétyle d’une molécule appelée acétyl CoA, subissent
des dégradations ultérieures au cours des diverses réactions produisant de l’énergie.
28
II.1.3.4 Lipogenèse - Synthèse des triglycérides
Dans les cellules adipeuses, la synthèse de novo d’acides gras est très faible (Sjöström, 1972).
La source principale des acides gras est issue de l’activité des lipoprotéines lipases (LPL) qui
hydrolysent les lipoprotéines plasmatiques riches en triglycérides pour produire des acides gras et
du monoacylglycérol. Les LPL sont synthétisées dans l’adipocyte, sécrétées et transportées sur la
paroi interne des capillaires où se produit l’hydrolyse des triglycérides. Les mécanismes impliqués
dans le transport transmembranaire des acides gras à longues chaînes (LCFA) sont encore
controversés (Hamilton, 1998). Il est suggéré que les LCFA sont capturés passivement par les
cellules en fonction de l’intensité de leur métabolisme, par un mécanisme de flip-flop dans la
bicouche de phospholipides membranaires, correspondant à un mécanisme de diffusion passive
(Trigatti et Gerber, 1996; Civelek et al., 1996). Par ailleurs, certains travaux suggèrent l’existence de
protéines spécifiques dont le rôle est de faciliter le mouvement des LCFA à travers la membrane
plasmique (Stremmel, 1988). En effet, un traitement des cellules avec des protéases diminue
fortement la capture des acides gras. De plus, le transport des acides gras présente les
caractéristiques cinétiques d’un transport facilité (Abumrad et al., 1984). Trois protéines distinctes
ont été identifiées et caractérisées dans le transport des LCFA: une acide gras translocase (FAT =
fatty acid translocase, aussi appelée FAT/CD36), une protéine membranaire de transport des acides
gras (FABP-pm) et une protéine de transport des acides gras (FATP) (Stremmel et al., 1985;
Abumrad et al., 1993; Schaffer et Lodish, 1994). La protéine FAT/CD36 a été observée sur la
membrane mitochondriale, ce qui suggère un nouveau rôle pour cette protéine (Campbell et al.,
2004). Concernant les FATP, il serait plus juste de parler de famille de protéines. En effet, jusqu’à
présent 6 protéines ont été identifiées et nommées FATP1-6. Les FATP1, 2 et 6 possèdent une
région de fixation de l’AMP très conservée qui participe à l’activation des acides gras à très longues
chaînes (VLCFA) en dérivés acyl-CoA (Pohl et al., 2004). Les mécanismes par lesquels les FATP
transportent les LCFA ne sont pas encore bien compris mais certains travaux suggèrent que le
transport transmembranaire est étroitement associé à l’activité acyl-CoA synthétase. Les protéines
de transports membranaires d’acides gras sont différentes des protéines de transport des acides gras
(FABP = fatty acid binding proteins). Les FABPs appartiennent à une famille de protéines
cytosoliques de petites tailles (14-16kDa) capables de fixer avec une forte affinité de nombreux
ligands hydrophobes comme des acides gras, des éicosanoïdes, des rétinoïdes. Les FABPs
possèdent des sites de fixations spécifiques des acides gras, ce qui n’a pas été mis en évidence pour
les transporteurs membranaires.
29
Le transport des acides gras à travers la membrane plasmique est un processus bidirectionnel.
En activant les LCFA en acyl-CoA esters, l’acyl-CoA synthétase (ACS) joue un rôle important dans
le métabolisme des acides gras car elle empêche l’efflux de ces derniers. L’ACS est présente dans
différents organites cellulaires: les microsomes, les peroxisomes, les mitochondries. Les acyl-CoA
esters sont associés au glycérol sous la forme de glycérol-3-phosphate. Ce dernier est formé à
partir du dihydroxyacétone issu de la glycolyse. Les adipocytes ont besoin de glucose pour former
des triglycérides. L’absence de glycérokinase dans les adipocytes blancs empêche l’utilisation et le
recyclage du glycérol. Les acyl-CoA forment des lysophosphatidates en se combinant avec le
glycérol-3-phosphate, puis des phosphatidates qui en perdant le phosphate deviennent des
diacylglycérides. La dernière étape de formation des triacylglycérols à partir des diacylglycérols est
contrôlée par l’acyl-CoA: diacylglycérol transférase (DGAT), un enzyme membranaire présent dans
les microsomes (Cases et al., 1998). Deux enzymes DGAT1 et DGAT2 sont présentes, codées par
des gènes appartenant à des familles différentes. Les deux gènes sont exprimés de façon ubiquiste et
les enzymes ont les mêmes spécificités de substrats (Cases et al., 2001). Les souris DGAT1-/- ont
une croissance normale et sont résistantes à l’obésité induite par le régime. Ces souris ont une
sensibilité à l’insuline et à la leptine augmentée et une diminution du contenu en triglycérides ce qui
suggère que DGAT1 joue un rôle important dans l’homéostasie énergétique (Chen et al., 2004).
Les souris DGAT2-/- présentent une forte réduction en triglycérides et en acides gras libres dans
l’organisme, suggérant un rôle critique de cet enzyme dans la lipogenèse, cependant les rôles
physiologiques de DGAT2 chez l’adulte n’ont pas été élucidés car les souris transgéniques
n’exprimant pas ce gène meurent rapidement après la naissance (Stone et al., 2004).
II.1.3.5 La lipolyse
Les triglycérides du tissu adipeux blanc sont hydrolysés lorsque les besoins énergétiques de
l’organisme ne sont pas satisfaits par l’alimentation. Le catabolisme des triglycérides (lipolyse)
aboutit à la libération des 3 acides gras et d’un glycérol. Jusqu’à très récemment, le paradigme de
cette régulation donnait à la lipase hormono-sensible (LHS) un rôle clé dans l’hydrolyse des
triglycérides. L’activation de la lipolyse est mise en jeu par les hormone ou médiateurs activants le
système adénylate cyclase (adrénaline, noradrénaline, glucagon) entraînant l’augmentation de la
concentration intracellulaire en AMPcyclique qui phosphoryle une protéine kinase A qui à son tour
active en phosphorylant la LHS et les périlipines, protéines entourant la gouttelette de lipides. La
présence d’une lipase autre que la LHS a été démontrée par trois équipes indépendantes travaillant
sur des souris dont le gène codant pour la LHS a été inhibé (Jenkins et al., 2004; Villena et al.,
2004; Zimmermann et al., 2004). Ainsi, adipose triglycéride lipase, desnutrin et iPLA2ζ doivent
30
être considérés comme synonymes. L’inhibition de l’expression de la LHS chez la souris se traduit
par une accumulation de diacylglycérols au lieu de triacylglycérols. Ceci suggère que, bien que la
LHS soit capable d’hydrolyser les triglycérides, son substrat essentiel sont les diacylglycérols. Ces
données sont corroborées par le fait que l’affinité de la LHS est dix fois supérieure pour les
diacylglycérols que pour les triacylglycérols (Fredrikson et al., 1981).
L’inhibition simultanée de l’adipose triglycéride lipase (ATGL) et de la LHS se traduit par
une inhibition de plus de 90% de l’hydrolyse des triglycérides dans le tissu adipeux (Zimmermann
et al., 2004). L’activité transacylase de ATGL suggère un rôle dans la resynthèse des
triacylglycérides. Si ceci est confirmé elle pourrait jouer un rôle décisif dans le recyclage des acides
gras et des triglycérides. Selon les derniers travaux, l’hydrolyse des triglycérides est d’abord et
majoritairement dépendante de l’ATGL et accessoirement sous la dépendance de la LHS,
l’hydrolyse des diacylglycérol est assurée par la LHS puis une monoacylglycéride lipase produit le
dernier acide gras et un glycérol. Il est admis que la monoacylglycéride lipase représente l’étape
limitante de la libération de glycérol et d’acide gras libre.
Figure 2 : Représentation schématique de l’hydrolyse des triglycérides (TG) du tissu adipeux.
La triglycéride lipase du tissu adipeux (adipose triglycéride lipase, ATGL) hydrolyse les
triglycérides. Les diglycérides sont hydrolysés par la lipase hormono-sensible (LHS). La dernière
étape de la lipolyse est assurée par une monoglycéride lipase qui libère le dernier acide gras et le
glycérol. (Modifié d’après Zechner et al., 2005).
Les mécanismes de régulation de l’expression et de l’activation de l’ATGL sont pour
l’essentiel à découvrir. La LHS est activée par une phosphorylation catalysée par une protéine
kinase AMPc dépendante. Le gène de la LHS est situé sur le chromosome 19 sur lequel sont
également localisés les gènes de la régulation du métabolisme lipidique (apos C1, C2, E et récepteur
des LDL) et de l'insuline. Un consensus règne pour reconnaître que l’intensité de la lipolyse est
directement dépendante de la concentration intracellulaire en AMPcyclique (Honnor et al., 1985;
Londos et al., 1985). Cette concentration est elle-même dépendante de l’activité du système
Lipolyse : TG
AG AGAG
ATGLLHS
DAG MGLHS MGL
Glycérol Lipolyse : TG
AG AGAG
ATGLLHS
DAG MGLHS MGL
Glycérol
31
adénylate cyclase qui intègre les nombreuses influences stimulatrices (récepteurs béta
adrénergiques) et inhibitrices (récepteurs alpha 2 adrénergiques, adénosine, prostaglandines E1, E2)
auxquelles les adipocytes sont soumis. Cet aspect de la régulation ne faisant pas partie de nos
travaux ne sera pas développé ici, pour revue consulter (Lafontan, 2005; Lafontan et Berlan, 1995).
Il est également important de souligner le rôle déterminant de l’insuline qui exerce son effet anti-
lipolytique en activant la phosphodiestérase responsable de la dégradation de l’AMPcyclique et en
inhibant une PKA responsable de la phosphorylation des périlipines (Eriksson et al., 1995; Carey,
1988).
II.1.4 L’adipocyte, cellule sécrétrice
Le rôle du tissu adipeux blanc a, depuis les origines de la biologie, été considéré
essentiellement du point de vue de la mise en réserve et de la mobilisation des acides gras. De ces
travaux est émergé l’idée que ce tissu était métabolique peu actif à l’exception du métabolisme des
graisses. Plus récemment il est apparu que les interrelations entre les tissus se faisaient
principalement à travers les échanges d’acides gras qui pouvaient induire dans les autres tissus des
dysfonctionnements par accumulation d’acides gras ou de triglycérides. Actuellement, il est évident
que le tissu adipeux interagit avec les autres organes et tissus par l’intermédiaire de molécules
sécrétées, désignées sous l’appellation générale d’adipokines. Ces molécules ont des effets sur les
métabolismes glucidiques et lipidiques, sur l’homéostasie énergétique et la sensibilité à l’insuline.
Selon les auteurs une distinction est faite entre adipokines produites principalement par les
adipocytes et les adipocytokines regroupant les cytokines produites par les adipocytes.
II.1.4.1 Les adipokines
II.1.4.1.1 Leptine
La leptine est une protéine de 16kDa. Le gène codant la leptine a été identifié comme la cause
de l’obésité chez la souris ob/ob (Zhang et al., 1994). L’administration centrale de leptine diminue
la prise alimentaire et augmente la dépense énergétique, ce qui se traduit par une diminution des
triglycérides et des acides gras plasmatiques chez le rat (Dobbins et al., 2003). La leptine stimule la
lipolyse d’adipocytes de souris, cet effet n’est pas observé sur des adipocyte de souris dépourvues
de récepteurs à la leptine (Fruhbeck et al., 1997). Une surexpression de la leptine diminue
l’expression de l’acétyl CoA carboxylase (Bai et al., 1996), montrant de la sorte un effet
32
périphérique de la leptine résultant en une diminution de la masse grasse. La leptine augmente
l’oxydation des acides gras et inhibe la lipogenèse dans les tissus autres que le tissu adipeux. Elle
agit par l’intermédiaire de son récepteur qui est couplé au système Jak/Stat ou directement sur la
stimulation de la 5’-AMP activated protein kinase (AMPK) qui phosphoryle et inhibe l’acétyl CoA
carboxylase (Minokoshi et al., 2002) La leptine inhibe également l’expression du sterol response
element binding protein-1c (SREB-1c) dans le foie, le pancréas et le tissu adipeux, inhibant de la
sorte la lipogenèse dans ces tissus (Kakuma et al., 2000).
II.1.4.1.2 Adiponectine
L’adiponectine (ACRP30, adipoQ, apM1 ou GBP28) a été identifiée comme le produit d’un
gène dont l’expression est induite au cours de la différenciation adipocytaire (Arita et al., 1999).
C’est une protéine de 30kDa synthétisée principalement et sécrétée par le tissu adipeux. Un
domaine collagénase est présent sur son extrémité N-terminale, suivie par un domaine C-terminal
globulaire capable de s’organiser en homotrimérisation (Pajvani et al., 2003). L’adiponectine
circule dans le plasma sous forme de trimère, d’hexamère (également appelé forme de faible masse
moléculaire, LMW) ou sous forme multimèrique de 12 ou 18 sous-unités (appelée forme de forte
masse moléculaire HMW). La forme de forte masse moléculaire peut être clivée pour produire des
formes de faibles masses moléculaires qui peuvent elles-mêmes donner des éléments plus légers
capables d’induire les effets de l’adiponectine aux cellules, en particulier aux hépatocytes (Pajvani
et al., 2003). Par ailleurs, la partie globulaire de l’adiponectine peut augmenter l’oxydation des
acides gras dans le muscle de souris, probablement par une activation de AMPK (Fruebis et al.,
2001; Yamauchi et al., 2003).
Trois récepteurs différents pour l’adiponectine ont été clonés, un principalement dans le foie,
un autre dans les muscles squelettiques et un dans les cellules endothéliales et les muscles lisses
(Yamauchi et al., 2003; Hug et al., 2004). Les agonistes de PPARgamma augmentent, tandis que
TNF alpha et l’interleukine 6 inhibent l’expression du gène codant l’adiponectine (Maeda et al.
2001; Bruun et al., 2003). Des souris déficientes en adiponectine deviennent résistantes à l’insuline
en réponse à un régime hyperlipidique (Maeda et al., 2002). L’expression transgénique
d’adiponectine dans le tissu adipeux se traduit par une inhibition de la production hépatique de
glucose et une meilleure tolérance au glucose (Combs et al., 2004). L’administration d’adiponectine
à des souris lipodystrophiques ou obèses diminue les concentrations plasmatiques en acides gras et
en triglycérides (Combs et al., 2004). La concentration plasmatique en adiponectine est élevée
33
comparée à celles des autres adipokines. Elle diminue chez les obèses, les patients résistants à
l’insuline, diabétiques ou dyslipidémiques (Artia et al., 1999; Kadowaki et al., 2003).
L’adiponectine est anti-athérogène et anti-inflammatoire (Glodstein et Scala 2004). Elle
augmente la vasodilatation (Tan et al., 2004) et joue un rôle dans la réorganisation tissulaire
cardiaque après ischémie (Ishikawa et al., 2004). La concentration plasmatique en adiponectine est
inversement corrélée à celle de la C-réactive protéine (Ouchi et al., 2003). Une adiponectinémie
élevée est associée à un faible risque d’infarctus du myocarde chez l’homme (Pischon and Girman
2004). Une hypoadiponectinémie est un facteur de risque d’hypertension (Iwashima et al., 2004).
Une mutation du gène codant l’adiponectine a été identifiée comme un facteur de maladie
cardiovasculaire et de syndrome métabolique (Ohashi et al., 2004). Ces effets sont sans doute en
partie dus au fait que l’adiponectine diminue la transformation des macrophages en cellules
spumeuses dans la plaque d’athérome (Ouchi et al., 2001).
II.1.4.1.3 Résistine
La résistine est une protéine de 12kDa synthétisée et sécrétée par le tissu adipeux. Elle a été
découverte chez la souris en étudiant les gènes inhibés par l’activation de PPARgamma (Steppan et
al., 2001). Elle tient son nom du fait qu’elle induit une résistance à l’insuline. L’administration de
résistine recombinante à des souris augmente la résistance à l’insuline. Elle augmente la production
hépatique de glucose pendant un clamp hyperinsulinémique-euglycémique chez le rat (Rajala et al.,
2003). Bien que les effets de la résistine soient très probants chez les modèles animaux, ses effets
sur l’obésité et la résistance à l’insuline chez l’homme sont moins évidents. Il n’y a que 64%
d’homologie entre les résistines humaine et murine (Steppan et al., 2001). Le rôle de la résistine
dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline n’est pas clairement établi chez l’homme.
II.1.4.2 Les Adipocytokines
Les réponses d’un organisme à une infection ou une blessure se caractérisent par un
changement de la répartition des substrats énergétiques comprenant des augmentations de la
glycémie, des triglycérides et des acides gras plasmatiques, accompagnées d’une résistance à
l’insuline. Il est admis que cette réponse métabolique aigue est initiée au moins en partie par des
cytokines pro inflammatoires. Par ailleurs, une inflammation chronique a été décrite au cours des
34
dyslipidémies, de la résistance à l’insuline, de l’athérosclérose, de l’obésité (Weisberg et al., 2003;
Furukawa et al., 2004). Les cytokines ne sont pas seulement produites par les cellules du système
immunitaire. Les adipocytes sont capables d’en sécréter une grande variété (d’où le nom
d’adipocytokines). Parmi les plus significatives, citons le TNFalpha, l’interleukine 6. Citons
également IL 1, IL 8, IL 10.
Les activités sécrétrices des adipocytes ne se limitent pas à ces derniers, en effet, au cours de
dernières années de nombreuses molécules produites par les adipocytes ont été identifiées : alpha1-
acid glycoprotéine (AGP), plasminogen activator inhibitor-1, monocyte chemo attractant protein 1
(MCP-1), fibrinogène, adipsine (complement factor D), complement factor B and C3, 24p3 , Neu
related calin (NRL), neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL) (member of lipocalin
family), macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 alpha), nerve growth factor (NGF),
haptoglobin, zinc alpha2 glycoprotéine (ZAG).
Il n’est pas de notre propos de faire le point sur l’importance relative de ces molécules
produites par les adipocytes. Nous tenons simplement à souligner l’importance (sans doute encore
actuellement sous-estimée) du rôle sécréteur des adipocytes.
35
II.2 Le stress oxydant
II.2.1 Définition
Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant est la conséquence d'un déséquilibre entre la
production de radicaux libres et leur destruction par des systèmes de défenses anti-oxydantes. Les
radicaux libres peuvent engendrer des dommages importants sur la structure et le métabolisme
cellulaire en dégradant de nombreuses cibles: protéines, lipides et acides nucléiques. Les radicaux
libres sont une forme particulière d’espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent un
électron célibataire (ou non apparié). Le champ magnétique créé par sa rotation, ou spin, n’est donc
pas compensé par la rotation en sens inverse d’un électron apparié. Cette propriété rend les radicaux
libres aptes à réagir avec différentes molécules, notamment lors de réactions en chaîne dont
l’exemple le plus connu est celui de la peroxydation des lipides. La réactivité des radicaux de
l'oxygène ne doit pas non plus être exagérée car elle est très variable selon la nature du radical.
Ainsi parmi les radicaux formés chez les êtres vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2°-), comme
le monoxyde d'azote (°NO) ne sont pas très réactifs mais constituent des radicaux précurseurs
pouvant être activés en d'autres espèces plus réactives.
Figure 3 : Relations existant entre les radicaux issus de l’oxygène (en rouge) et ceux issus de
l’azote (en vert).
Les espèces à l’état radicalaire sont désignées par un point symbolisant l’électron célibataire.
36
La faible réactivité de ces deux radicaux O2°- et NO° permet d'ailleurs leur utilisation par
l'organisme comme médiateurs régulant des fonctions biologiques telles la respiration et la
vasodilatation capillaire (Angelos et al., 2005; Wolin et al., 2005; Wolin, 1996). Par contre des
radicaux comme les radicaux peroxyls (ROO°) ou surtout le radical hydroxyl (HO°) sont
extrêmement réactifs, et ce avec la plupart des molécules des tissus vivants. D'autres espèces
dérivées dites « espèces actives de l'oxygène » comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le
nitropéroxyde (ONOOH) ne sont pas des radicaux mais sont elles aussi réactives et peuvent être des
précurseurs de radicaux. L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé
« espèces réactives de l'oxygène ».
Les dommages liés à un stress oxydant se traduisent par diverses altérations biochimiques
intracellulaires telles que l’oxydation de l’ADN (Wiseman et Halliwell, 1996; Marnett, 2000;
Cooke et al., 2003), des protéines (Satdtman et Oliver 1991; Refsgaard et al., 2000; Davies 2003), la
pertubation de l’homéostasie du calcium intracellulaire (Farber et al., 1990) ou encore la
peroxydation des lipides.
II.2.2 Mécanismes pro oxydants
Une production continue d’anions superoxydes se produit lorsque la chaîne respiratoire
mitochondriale fonctionne. Si cette production de radicaux superoxydes reste faible et ne concerne
que quelques pourcents de l’oxygène utilisé par la respiration, elle peut s’amplifier lorsque la
respiration devient plus intense (effort physique) ou lorsque intervient des désordres
mitochondriaux génétiques, inflammatoires ou nutritionnels. L’inflammation est par ailleurs une
source importante de radicaux oxygénés produits directement par les cellules phagocytaires activées
soumises à un phénomène appelé explosion oxydative et qui consiste en l’activation du complexe
de la NADPH oxydase capable d’utiliser de l’oxygène pour produire de grandes quantités d’anion
superoxyde dans la membrane cellulaire. D’autres cellules comme les lymphocytes B possèdent sur
leur membrane des systèmes NADPH oxydase similaires produisant des radicaux en quantité plus
faible comme médiateurs intercellulaires. De plus, les cellules inflammatoires et immunes peuvent
produire des cytokines comme le TNFα qui est capable de faire produire des radicaux par la
mitochondrie des cellules cibles.
37
II.2.3 Mécanismes anti-oxydants
II.2.3.1 Les Enzymes :
II.2.3.1.1 Les superoxydes dismutases (SOD)
La SOD est un enzyme antioxydant primaire essentiel qui réagit en défense de l’organisme
contre les produits toxiques du métabolisme cellulaire. Il est capable d’éliminer l’anion superoxyde
par une réaction de dismutation. Son rôle est de transformer dans les mitochondries, les radicaux
superoxydes en peroxydes d’hydrogène, ce dernier, étant beaucoup moins réactifs (Moumen et al.,
1997). Il existe différents cofacteurs sur son site actif, qui sont classés par isoenzymes, dont la
structure d’ensemble est très bien conservée lors de l’évolution. Les isoenzymes forment un puit
hydrophobe au centre de la protéine, dans lequel se glisse l’anion superoxyde. Le mécanisme
réactionnel est catalysé par un métal situé au centre de l’enzyme dont la nature permet de distinguer
les différentes SODs : la SOD à Cuivre-Zinc (CuZn-SOD), possèdent deux sous-unités identiques
avec une structure moléculaire de 32 kDa, les atomes de Cu et Zn sont liés par un pont dans la
position His 61 (Banci et al., 1998). Les CuZn-SOD sont aussi classées selon leur rôle dans
l’organisme en (cCuZn-SOD) protégeant le cytosol, (ecCuZn-SOD) située sur la face externe de la
membrane des cellules endothéliales, l’espace interstitiel des tissus et les fluides extracellulaires, et
encore (pCuZn-SOD) pour celle présente dans le plasma sanguin (Kaynar et al., 2005). La SOD à
manganèse (Mn SOD) et au Fer (Fe SOD) sont homologues avec un hème tétramère de 96 kDa qui
contient un atome de manganèse ou de fer par sous unité, son rôle biologique est la protection de la
mitochondrie (Fridovich, 1998), et la SOD au nickel (Ni-SOD), (Barondeau et al., 2004).
II.2.3.1.2 Les catalases
Les catalases sont présentes dans un grand nombre de tissus mais sont particulièrement
abondantes dans le foie et les globules rouges. Parmi les enzymes connus c’est un des plus
efficaces. Ce sont des enzymes tétramériques, chaque unité portant une molécule d’hème et une
molécule de NADPH, avec une masse moléculaire de 240 kDa. Elles catabolisent les peroxydes
d’hydrogènes en molécules d’eau pour prévenir la formation de radicaux hydroxyles (Matés et al.,
1999).
La réaction se fait en deux étapes:
1) 2 H2O2 Catalase → 2H2O + O2
2) ROOH + AH2 Catalase → H2O + ROH + A
38
II.2.3.1.3 Les peroxydases
II.2.3.1.3.1 Glutathion peroxydase à sélénium (GPx)
Ces enzymes ont en commun une structure tétramèrique, chaque tétramère possédant un
atome de sélénium dans son site actif, très fortement fixé à la chaîne peptidique, puisque incorporé
sous forme de sélénocystéine dans la séquence primaire. L’introduction du sélénium se faisant selon
un mécanisme particulier dit péri-traductionel. La GPx est inactivée par H2O2, le
terbutylhydroperoxyde, et HO- quand elle est incubée sans glutathion. L’enzyme natif n’est pas
sensible à la trypsine ni à la chymotrypsine. Cet enzyme fait 80 kDa, sa sensibilité à la protéolyse
augmente après traitement par des radicaux ou des peroxydes. Le rôle de la glutathion peroxydase à
sélénium est très important dans la plupart des tissus où elle réalise la quasi-totalité de l’élimination
de H2O2 comme dans les globules rouges ou les plaquettes.
II.2.3.1.3.2 La glutathion peroxydase cytosolique
Il s’agit d’un tétramère dont chaque sous unité porte une molécule de sélénocystéine sur son
site actif. Le fonctionnement de l’enzyme nécessite un flux de glutathion recyclé par la coopération
de plusieurs enzymes dont la glutathion réductase (GR) qui réduit le glutathion oxydé en
consommant du NADPH, lui-même régénéré grâce à la glucose 6 phosphate deshydrogénase
(G6PDH) alimentée par le shunt des pentose phosphates (Matés et al., 1999).
II.2.3.1.3.3 La glutathion peroxydase plasmatique
La glutathion peroxydase présente dans le plasma et dans le cytosol sont différentes et
proviennent des globules rouges ou des cellules endothéliales, les séquences et le poids moléculaire
sont différents, 23 kDa pour la sous unité GPx plasmatique, contre 22 kDa pour la sous unité
érythrocytaire. Le mécanisme d’action est identique, mais il y a un effet plus fort du zinc sur la GPx
plasmatique.
39
II.2.3.1.3.4 La glutathion peroxydase membranaire (HPGPx)
Cette glutathion peroxydase est capable de réduire les peroxydes membranaires, seulement,
après action de la phospholipase A2. Elle agit sur les acides gras hydroperoxydés. La HPGPx réduit
directement les hydroperoxydes du cholestérol, des cholestéryl-esters, et des phospholipides
présents dans les membranes des globules rouges oxydées ou des lipoprotéines oxydées.
II.2.3.1.4 La thiorédoxine (TRX)
Cet enzyme a une structure proche de celle de la glutathion réductase. Il consomme aussi du
NADPH dans son fonctionnement. Il joue un rôle protecteur contre une grande variété de stress
oxydatifs grâce à ses propriétés de capture des radicaux libres. Des données biochimiques montrent
que les thiorédoxines réduisent des protéines clefs pour le développement, la division cellulaire ou
la réponse au stress oxydatif (Reichheld et al., 2005).
Figure 4: Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs
cofacteurs métalliques (d’après Matés, 1999).
40
II.2.3.2 Les molécules antioxydantes
II.2.3.2.1 La vitamine C
La vitamine C (ou acide ascorbique) n’est pas synthétisée par l’organisme. Elle est
hydrosoluble à la concentration physiologique. La vitamine C empêche l’oxydation des LDL
produites par divers systèmes générateurs d’espèces réactives de l'oxygène (ROS) (neutrophiles
activés, cellules endothéliales activées, myéloperoxydase). Lors de son oxydation en acide
déhydroascorbique, elle passe par une forme radicalaire intermédiaire (radical ascorbyl) qui joue un
rôle essentiel dans la régénération de la vitamine E oxydée (Chen et al., 2000).
II.2.3.2.2 La vitamine E
La vitamine E est le nom commun utilisé pour toutes les molécules possédant des activités
biologiques identiques à celles de la famille des tocophérols. La forme naturelle de la vitamine E
inclut quatre tocophérols isomères α, β, γ, δ, avec une activité antioxydante variable. L’alpha-
tocophérol (α-TocH) est la forme la plus active de la classe des tocophérols. Sa structure
moléculaire comporte une extrémité hydrophile et une extrémité hydrophobe. Il est admis que les
radicaux tocophéryles sont régénérés par l'acide ascorbique et que, sans cette synergie, les
tocophérols sont inactifs (Carr et al., 2000). Lors de l’initiation de la peroxydation lipidique, suite à
une attaque radicalaire, l’α-TocH, connu comme inhibiteur de la propagation lipidique, cède son
hydrogène situé dans le noyau phénolique, réduisant ainsi le radical RO2, et constitue par ce biais le
seul antioxydant liposoluble assurant cette protection (Khalil 2002).
II.2.3.2.3 Le sélénium
Le sélénium est un constituant de la glutathion péroxydase, enzyme qui joue un rôle
intracellulaire antioxydant, voisin de celui de la vitamine E. Cet effet antioxydant est capital dans la
détoxication des radicaux libres produits par le métabolisme cellulaire. Cet effet de détoxication
serait responsable des effets anti-cancéreux et anti-vieillissement, attribués au sélénium (Wolters et
al., 2005).
41
II.2.3.2.4 Le zinc
Cet oligo-élément est un des co-facteurs essentiels de la SOD. La prise de zinc conduit à long
terme à l’induction de protéines antioxydantes comme les métallothionéines. Le zinc protège
également les groupements thiols des protéines. Le zinc peut inhiber partiellement les réactions de
formation d’espèces oxygénées induites par le fer ou le cuivre (Mezzetti et al., 1998).
II.3 Le stress oxydant et les maladies métaboliques:
Des travaux récents ont mis en évidence que le stress oxydant est impliqué dans de
nombreuses pathologies, incluant l'obésité (Suzuki et al., 2003; Urakawa et al., 2003), le diabète
de type 2 (Elmerson et al., 2003), l’athérosclérose (Stentz et al., 2004). Le rôle du stress oxydant
a également été évoqué dans des processus physiologiques tel que le vieillissement
(Holzenberger et al., 2003). Notre objectif est de mesurer les effets du stress oxydant sur le
fonctionnement adipocytaire et les répercussions de ce stress sur l'homéostasie énergétique et les
complications métaboliques associées à l'obésité.
II.3.1 Le stress oxydant et l’obésité.
Le stress oxydant systémique augmente avec le degré d'obésité. En effet, les augmentations
des TBARs et de la 8-epi-prostaglandine F2alpha dans le plasma sont corrélées avec l'indice de
masse corporelle et le tour de hanche (Keany et al., 2003; Olusi, 2002). De même, la
concentration plasmatique en adiponectine, une protéine produite par les adipocytes et possédant
des propriétés anti-inflammatoire et protectrice des vaisseaux, est inversement corrélée aux
indicateurs du stress oxydant (Furukawa et al., 2004).
La production de H2O2 est augmentée seulement dans le tissu adipeux blanc de souris
KKAy obèses et pas dans les autres tissus (foie, muscle, aorte) suggérant que le tissu adipeux est
le site principal de production de ROS (Furukawa et al., 2004). L'utilisation d'inhibiteurs
spécifiques de la NADPH oxydase diminue la production de ROS dans le tissu adipeux de souris
KKAy et améliore l'hyperinsulinémie, l'hyperglycémie, l'hypertriglycéridémie et la stéatose
hépatique; de même on observe une diminution du TNFalpha et une augmentation de l'expression
42
d'adiponectine, suggérant que la diminution du stress oxydant pourrait améliorer la production de
cytokines par le tissu adipeux.
II.4 Le stress oxydant dans la cellule.
Le stress oxydant se définit comme un déséquilibre entre les espèces chimiques pro-
oxydantes et les systèmes de défenses antioxydantes, avec comme conséquences des altérations
du fonctionnement cellulaire. Le stress oxydant a plusieurs origines. Il peut provenir de
l'environnement. Exposition prolongée au soleil, à l'ozone, tabagisme, consommation excessive
d'alcool, contact avec des agents cancérigènes, consommation de médicaments, pollution, sont
autant de situations qui génèrent un stress oxydant. Par ailleurs, plusieurs systèmes biochimiques
de l'organisme sont à l'origine de la production d'agents pro-oxydants. C'est la découverte en
1969 de la superoxyde dismutase (SOD) (McCord et Fridovich, 1969), un enzyme qui dégrade le
peroxyde d'hydrogène, qui a fait prendre conscience que la production de ROS est le corollaire
inévitable de la vie en aérobie. La production de peroxyde d'hydrogène par les mitochondries
avait été démontrée auparavant (Jensen, 1966; Hinkle et al., 1967), amenant à citer une fuite de la
chaîne mitochondriale comme la source probable de ROS. En effet, il est généralement accepté
que le complexe III mitochondrial est un générateur important d’anion superoxyde (O2.- ) dans la
cellule et que le changement d'activité de la chaîne respiratoire altère la production de ce radical
libre (Poderoso et al., 1996). Cependant pour certains auteurs, la production de O2.- a une
constante d'équilibre très en défaveur de sa production, qui est donc thermodynamiquement
défavorable, ce qui signifie que la production de O2.- n'est pas spontanée, contrairement à ce qui
est généralement affirmé (Furchgott, 1999) et ne peut survenir que lorsque l'équilibre est déplacé
par le couplage à une seconde réaction comme la dismutation de O2.- en H2O2. Ainsi, O2
.- est un
intermédiaire éphémère alors que la production de H2O2 est catalysée par la SOD. La production
de H2O2 par les mitochondries est dépendante de la concentration en oxygène. L'augmentation de
la production de H2O2 n'est observée que pour des concentrations en oxygène très supérieures
aux concentrations physiologiques. Par ailleurs, la fixation de NO sur la cytochrome c oxydase
inhibe le flux d'électron à travers le complexe III ce qui augmente la réduction à travers la chaîne
respiratoire et accroît la production de O2.-. La production de O2
.- par les mitochondries a
traditionnellement été considérée comme incontrôlée et O2.- perçu comme un sous-produit
toxique de la respiration.
43
De faibles concentrations en NO se fixent sur la cytochrome c oxydase ce qui peut
augmenter l'oxygène dans la membrane interne des mitochondries et stimuler la production de
O2.- par la réduction du complexe III. Mais si la concentration en NO augmente, il peut réagir
avec O2.-, ce qui est plus rapide que la dismutation en H2O2, et produire du peroxynitrite. Il a
également été suggéré que le peroxynitrite et NO peuvent inhiber le complexe III et de la sorte
augmenter la production de O2.- et de H2O2. Cette dernière est une molécule de signalisation aux
propriétés variées dont une des propriétés est sa diffusibilité dans la cellule. Elle a d'ailleurs été
impliquée dans plusieurs systèmes de signalisation (Bogoyevitch et al., 2000; Iles et al., 2002;
Ramachandran et al., 2002). La question reste posée de savoir si le H2O2 produit par les
mitochondries correspond ou non à un système de signalisation. La relation entre NO et la
production de radicaux oxygénés par les mitochondries reste pour l'essentiel incomprise.
II.5 Le stress oxydant dans l'adipocyte: la production de ROS.
Des travaux récents ont montré que la production de radicaux oxygénés très réactifs
augmente en réponse à l'hypoxie. Ces travaux ont mis en évidence une augmentation des facteurs
de transcription HIFalpha 1 et 2 (hypoxia induced factor), qui modulent les adaptations à
l'hypoxie par une inhibition de l’hydroxylation des résidus proline et asparagine des HIF ce qui
augmente leur stabilité et leur transcription (Lando et al., 2002). En effet, l’hypoxie (1%
d’oxygène) stimule fortement la production de radicaux libres par les mitochondries de
préadipocytes 3T3-F442A en culture, et augmente fortement l’expression de HIF1alpha, ce qui
inhibe fortement la différenciation cellulaire en adipocytes. Les effets de l’hypoxie sont
partiellement inhibés en réponse au traitement par des antioxydants (Carrière et al., 2004).
Cependant, EPAS 1 (endothelial PAS protein1, également appelée HIF2alpha, HLF, MOP2) qui
est fortement exprimé dans les cellules endothéliales et dans le tissu adipeux est entre autre
impliqué dans la maintenance des ROS (Scortegagna et al., 2003). Or une étude récente suggère
que HIF2alpha est un facteur de transcription important de la différenciation adipocytaire
(Shimba et al., 2004).
Par ailleurs, des travaux récents ont mis en évidence la présence d'une NADPH oxydase sur
la membrane des adipocytes (protéines NOX, Krieger-Brauer et al., 1997). Le complexe NADPH
oxydase est constitué d'un flavocytochrome b558 membranaire composée des protéines pg91phox
et p22phox et des protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. L'expression des ARNm
44
codant chacune de ces sous-unités a été observée dans le tissu adipeux. L'expression de ces
ARNm a été trouvée augmentée spécifiquement dans le tissu adipeux de souris obèses (KKAy)
comparé à d'autres tissus (foie, muscle squelettique). Il en est de même pour les ARNm codant
PU.1 un facteur de transcription connu pour stimuler la transcription de la NADPH oxydase qui
joue un rôle important dans la production de H2O2 (Mahadev et al., 2004). L'expression d’ARNm
codant NOX4 est augmentée dans le tissu adipeux de souris obèses.
Dans l’adipocyte, la production de peroxyde d'hydrogène par les adipocytes est utilisée
comme un signal de transduction de l'insuline (Mahadev et al., 2004), produite par la
semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) qui dégrade les amines endogènes et exogènes
(Visentin et al., 2003) et par la NADPH oxydase présente sur la membrane des adipocytes
(Krieger-Brauer et Kather, 1992 ; Krieger-Brauer et Kather, 1995), comme nous venons de le
voir. Toutes ces études suggèrent un rôle important du stress oxydant dans le fonctionnement
adipocytaire. Si le stress oxydant est aussi important pour les adipocytes que les travaux
précédents le suggèrent, d'autres processus cellulaires doivent être altérés par ce stress,
notamment la peroxydation lipidique. La NADPH oxydase étant membranaire, les lipides
membranaires devraient être directement exposés à la production de ROS. Parmi les lipides
membranaires les plus réactifs aux ROS se trouvent les plasmalogènes et les acides gras
polyinsaturés et notamment l'acide arachidonique qui est à l'origine des prostaglandines dont les
effets sont impliqués dans de nombreuses régulations cellulaires.
II. 6 Les prostaglandines
Les prostaglandines jouent un rôle important dans le développement du tissu adipeux
blanc. La voie de synthèse des prostaglandines commence par une étape initiale qui comprend la
libération d’acide arachidonique des phospholipides de la membrane plasmique par l’action
d’une phospholipase A2. L’acide arachidonique est ensuite converti en PGG2 puis en PGH2 par
des activités cyclooxygénase et peroxydase au sein d’enzymes appelées PGH synthase ou
cyclooxygénase. Il existe deux formes de PGH synthase, une forme constitutive (PGH synthase 1
ou COX 1) et une forme inductible (PGH synthase 2 ou COX 2). L’expression de la COX 2 est
inductible par des cytokines pro inflammatoires. COX 2 est un site d’action majeur des anti-
inflammatoires non stéroïdiens comme l’aspirine et l’indométacine. On admet que l’expression
des deux isoformes de COX est régulée et qu’elles jouent un rôle essentiel dans la synthèse à
45
long terme des prostanoïdes (Smith et Dewitt, 1996). La structure cristalline des deux isoformes
a été établie, COX 2 possède un site actif plus large que celui de COX 1 ce qui est en accord avec
la moindre spécificité de COX 2 pour les substrats. En effet, COX 2 métabolise des substrats tels
que l’anandamide et l’acide linoléique (Picot et al., 1994; Kurumbail et al., 1996). Une troisième
isoforme de COX (COX 3) a été récemment clonée et possède un site catalytique présentant les
caractéristiques identiques à ceux de COX 1 et COX 2. Les prostaglandines sont produites par
l’action de synthases spécifiques PGE2, PGD2 PGF2alpha synthases. PGH2 peut également être
convertie en thromboxane (TxA2) ou en prostacycline (PGI2).
II.6.1 Synthèse et dégradation des cyclooxygénases.
Les gènes codant COX 1 et COX 2 sont finement régulés. Le gène de COX 1 est
généralement induit par la quiescence cellulaire et la différenciation tandis que celui de COX 2
est induit par une variété de stimuli comprenant des hormones, des facteurs de croissance, des
cytokines, des effets de cisaillements (Hla et al., 1993). On observe une diminution rapide des
ARNm codant COX 2 en réponse à la dexaméthasone, à cause d’une déstabilisation des ARNm
(Ristimaki et al., 1996). Plusieurs protéines, ligands d’ARN ont été décrites comme des
régulateurs de la stabilité des ARNm. Il reste à définir par quels mécanismes moléculaires la
stabilité des ARNm codant COX 2 peut-être régulée et comment ces régulations affectent
l’expression du gène en conditions physiologiques et physiopathologiques.
II.6.2 Biologie fonctionnelle des prostaglandines.
Dans les conditions de repos, les cellules expriment COX 1 tandis que COX 2 est induite
en réponse à une activation cellulaire ou par des stimuli pathologiques. Dès que PGH2 est
produite, elle est rapidement convertie en prostaglandines plus stables telles que PGE2, PGD2,
PGI2, PGF2alpha par des isomérases spécifiques des différents tissus. Ces médiateurs sont
rapidement secrétés dans le milieu extracellulaire par des transporteurs spécifiques (Schuster
1998).
De nombreuses prostaglandines agissent par l’intermédiaire de récepteurs membranaires
couplés aux protéines G. Ces récepteurs interagissent à leur tour avec des systèmes de
46
signalisations cytosoliques pour provoquer de nombreuses réponses physiologiques rapides
comme l’agrégation plaquettaire, la relaxation/contraction des muscles lisses, la plasticité
neuronale, la perméabilité vasculaire. Par exemple la PGE2 est un facteur angiogénique puissant.
Dans l’arthrite rhumatoïde, l’activation de COX 2 est corrélée avec une angiogenèse synoviale
importante, un processus pathologique très destructeur. PGE2 active ses récepteurs sur les
fibroblastes synoviaux et augmente l’expression de VEGF (vascular endothelial cell growth
factor) qui est un angiogéne puissant. Le récepteur de sous-type EP2 des récepteurs de PGE
active des protéines Gs/cAMP et les protéines kinases A, qui vraisemblablement augmentent la
transcription de VEGF (Ben-Av et al., 1995). A l’inverse des prostaglandines comme la 15-
désoxy-delta12,14-prostaglandine J2 (15dPGJ2) agissent à l’intérieur de la cellule en se fixant sur
des récepteurs nucléaires comme les peroxisome proliferator activated receptor (PPAR). Après
leur activation par des ligands endogènes telle que la 15dPGJ2, les PPAR s’hétérodimérisent avec
RXR pour induire des réponses transcriptionnelles spécifiques. Certains travaux ont montré que
l’activation nucléaire par certaines prostaglandines inhibe la réplication virale (Santoro et al.,
1980) et la croissance tumorale (Negeshi et al., 1995). Des travaux plus récents ont également
mis en évidence le rôle des PPAR et de la 15dPGJ2 dans la différenciation des cellules
spumeuses en réponse aux LDL oxydés (Tontonoz et al., 1998) et l’inhibition de gènes pro-
inflammatoires, NFkB-dépendants dans les monocytes (Jiand et al., 1998). Dans l’endothélium
vasculaire, l’activation de la voie des PPAR provoque l’apoptose, suggérant que cette voie de
signalisation est un médiateur de la blessure vasculaire. Le fait que la 15dPGJ2 soit le ligand
endogène le plus efficace des PPAR suggère que la voie COX / PGD synthase est responsable de
l’activation des PPAR. Cependant, d’autres acides gras et éicosanoïdes sont également des
ligands de PPAR. Il est important pour le futur de définir si COX 1 et/ ou COX 2 sont impliqués
dans la régulation des PPAR.
Les prostaglandines sont des modulateurs de nombreux processus physiologiques et
physiopathologiques tels que l’inflammation, la réponse immunitaire, l’arthrite, les cancers. Des
travaux récents montrent également que des prostaglandines jouent un rôle déterminant dans la
différenciation des cellules en adipocytes.
47
II.6.3 Prostaglandines et adipocytes.
Le rôle des différentes prostaglandines dépend du stade de différenciation des cellules.
Ainsi, la prostacycline (PGI2) a été positivement associée à la différenciation terminale des
adipocytes (Reichert et Eick, 1999). L’analogue stable de PGI2, la carbaprostacycline induit la
différenciation terminale des adipocytes en augmentant la concentration cellulaire en
AMPcyclique et la libération intracellulaire de calcium (Aubert et al. 2000) De plus, PGI2
augmente l’expression de C/EBP β et δ des préadipocytes. Les effets de la PGE2 sur
l’adipogenèse ont été décrits comme stimulateur (Shillabeer et al., 1998) ou inhibiteur (Lepak et
Serrero, 1993), alors que cette prostaglandine exerce des effets lipolytiques sur les adipocytes
différenciés (Richelsen, 1991). Récemment Fajas et al., (2003) ont suggéré que l’inhibition de
COX 2 inhibe la différentiation des adipocytes en inhibant la phase d’expansion clonale qui
précède la différenciation cellulaire. La 15dPGJ2 a été décrite comme exerçant des effets
stimulateurs sur la différenciation adipocytaire. Ces effets sont médiés par l’intermédiaire des
récepteurs nucléaires PPARgamma.
II.7 Le stress oxydant et le métabolisme des acides gras polyinsaturés.
Le stress oxydant induit une peroxydation lipidique des acides gras polyinsaturés des séries
n-6 et n-3. Les acides gras de la famille des n-6 sont des précurseurs de ligands de PPARgamma.
Le plus important, l’acide arachidonique (20:4n-6) peut être converti par la cyclooxygénase en
prostaglandines. Parmi celles-ci, la PGD2 est le précurseur de la 15dPGJ2, ligand naturel qui se
fixe avec une forte affinité aux PPARgamma. Cette fixation est une étape préliminaire de
l’activation de ces récepteurs nucléaires qui induisent l’expression des gènes de la différenciation
adipocytaire.
Les acides arachidonique et linoléique peuvent aussi être transformés par la 15-
lipoxygénase respectivement en acides 15-hydroperoxyeicotétraénoique (15-HpETE) et en 13-
hydroperoxyoctadécadiénoïque (13-HpODE). Ces composés sont normalement réduits par la
glutathion peroxydase en leurs acides gras monohydroxylés correspondants: les acides 15-
hydroxyéicosatétraénoïque (15-HETE) et 13-hydroxyoctadécadiénoïque (13-HODE) qui sont
tous deux des ligands de PPARs et notamment de PPARgamma.
48
Plus globalement, les acides gras polyinsaturés (n-3 et n-6), qu’ils soient libres ou estérifiés
dans les phospholipides, peuvent s’oxyder chimiquement ou par voie enzymatique via les
lipoxygénases pour former différents hydroperoxydes toxiques pour les cellules. Ces composés
sont normalement réduits en acides gras monohydroxylés correspondant par les glutathions
peroxydases, mais leur durée de vie s’accroît si ces peroxydases sont moins actives comme
observé dans le diabète par exemple. Les hydroperoxydes se décomposent alors spontanément
pour former des aldéhydes tels que le 4-hydroxynonénal (4-HNE) (Pryor et Porter, 1990; Porter
et al., 1995). L’acide docosahexaénoïque (DHA-22:6n-3) est particulièrement oxydable du fait de
la présence de 6 doubles liaisons. L’un de ses produits d’oxydation est l’aldéhyde 4-
hydroxyhexénal (4-HHE) (Van Kuijk et al., 1990; Van Kuijk et al., 1995).
Le 4-HNE se lie de façon covalente aux aminophospholipides et en particulier aux
phosphatidyléthanolamines (PE) pour former des produits d’addition, identifiés par
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (Guichardant et al., 1998;
Guichardant et al., 2001) comme étant des adduits de Michael et des bases de Schiff cyclisées ou
non. Les adduits de Michael qui sont majoritairement formés ne sont pas substrats de différentes
phospholipases (phospholipase C de bactérie, phospholipase D de chou) et mauvais substrats de
la phospholipase A2 de venin (Guichardant et al., 2001). La formation de tels adduits dans les
adipocytes pourrait donc avoir pour conséquence une diminution de la disponibilité du 20:4n-6
pour la synthèse des ligands de PPARgamma (15dPGJ2 et 15-HETE).
En résumé, tous ces composés porteurs d’un groupement carbonyle très réactif, aussi bien
avec les résidus aminés qu’avec les thiols, sont susceptibles d’apparaître lors d’un stress oxydant.
Ils peuvent alors agir de différentes façons en modifiant des récepteurs, des enzymes, en
perturbant la synthèse de ligands de PPARs. Nous faisons l’hypothèse qu’ils pourraient modifier
le fonctionnement des adipocytes.
L’équilibre redox intracellulaire peut être facilement rompu lors d’un stress oxydant et
entraîner une élévation des hydroperoxydes (13HpODE, 15HpETE). Ces derniers sont connus pour
stimuler l’activité cellulaire/cytosolique des phospholipases A2 et les enzymes clé de la
peroxydation lipidique spécifique (cyclooxygénase et lipoxygénase). Ils peuvent ainsi accroître la
quantité de ligands de PPARgamma. A l’inverse, un stress oxydant plus important conduit à une
formation encore accrue d’hydroperoxydes qui s’accumulent. Ces derniers, très instables, se
dégradent et forment des aldéhydes très réactifs (4-HNE, 4-HHE) qui devraient diminuer la
49
production de ligands naturels de PPARγ si les phospholipides réservoir d’acides gras polyinsaturés
(n-6) sont modifiés par les aldéhydes.
Figure 5 : Voie de synthèse des prostaglandines à partir de l’acide arachidonique (modifié
d’après Chew, 2005).
La cyclooxygénase convertit l’acide arachidonique (20:4n-6) en endoperoxyde cyclique de
prostaglandine, PGG2, qui est aussitôt réduit en dérivé 15-Hydroxylé correspondant, PGH2, par
une hydroperoxydase. Les activités cyclooxygénases et hydroperoxydases sont portées par une
même protéine, la PGH synthase. La PGH2 formée est ensuite transformée en plusieurs composés :
le thromboxane A2 (TxA2) par la thromboxane synthétase, la prostaglandine 6-céto PGF1α par la
prostacycline synthétase, la prostaglandine F2α (PGF2α) par la PGFα synthétase et les
prostaglandines E2 et D2 (PGE2 et PGD2) par les PGE et PGD isomérase. La 15dPGJ2 est un
produit de la déshydratation de la PGJ2, elle-même issue de la PGD2.
Phospholipase A2Acide Arachidonique
PGG/H synthases
Cyclooxygénases 5-, 12-, ou 15-
Lipoxygénases
Cytochrome P-450
Epoxygénase
PGG2
PGH2
Prostanoïdes
Acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque
(HPETEs)
202
2e-
O2 O2
NADPH
5,6-, 8,9-, 11,12-, ou 14,15
Acide époxy-eicosatriénoïque
(EETs)
Leucotriènes
PGD2
Isomérase
PGE2
isomérase
PGFα
synthétase
Pros
tacy
clin
esy
nthé
taseThromboxa
ne
synthé
tase
PGD2
PGE2PGF2α6-cétoPGF1α
TxA2
PGJ2
15 désoxy-∆12,14-PGJ2
Phospholipase A2Acide Arachidonique
PGG/H synthases
Cyclooxygénases 5-, 12-, ou 15-
Lipoxygénases
Cytochrome P-450
Epoxygénase
PGG2
PGH2
Prostanoïdes
Acide hydroperoxy-eicosatétraénoïque
(HPETEs)
202
2e-
O2 O2
NADPH
5,6-, 8,9-, 11,12-, ou 14,15
Acide époxy-eicosatriénoïque
(EETs)
Leucotriènes
PGD2
Isomérase
PGE2
isomérase
PGFα
synthétase
Pros
tacy
clin
esy
nthé
taseThromboxa
ne
synthé
tase
PGD2
PGE2PGF2α6-cétoPGF1α
TxA2
PGJ2
15 désoxy-∆12,14-PGJ2
50
III MATERIEL ET METHODES
51
III.1 Matériels générales
Kit CyQUANT cell proliferation assay (C7026) Molecular Probes
Kit Glucose Reagent (671640) Beckman Coulter
Kit Hydrogen Peroxide Assay (706011) Cayman Chemicals
Kit RIA pour l’adiponectine, coffret 125 tubes (MAD-60HK) Linco Research, Inc/USA
4 hydroxynnonénal (4-HNE) – Prof. Doutheau (Chimie Organique INSA-Lyon)
III.1.1 Produits pour la culture cellulaire
Acide ascorbique (Sigma A4034)
Adipocytes 3T3-L1 obtenue par American Type Culture Collection (ATCC CL-173).
Déxamethazone (Sigma D2915)
D (-) fructose (sigma F0127)
Flasque 75 mL (Falcon)
Glutamine (Sigma G7513)
Hepes (Sigma H0887)
IBMX - 3-isobutyl,1-méthylxanthine (Sigma I7018)
Insuline (Novo-Nordisk Actrapid 100UI/mL)
Milieu de culture «Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium» (Sigma D5671)
Pest – (SigmaA5955)
Plaque 6 puits pour culture cellulaire, fond plat. (Falcon 353046)
Sérum de veau nouveau-né (Sigma N4637)
III.1.2 Réactifs et solvants pour le dosage de prostaglandine
Acétate d’éthyle, Acétone, Diéthyl éther, Ethanol, Méthanol, Hexane,(SDS)
Acétonitrile CH3CN (Aldrich 27100-A)
Acide phosphomolybidique (Riedel-de Haën ACS31426)
Hexane (Aldrich 29609-0)
Methoxylamine hydrochloride (MOX) (Aldrich 22690-4)
N-éthyl diisopropylamine (DIPE) (Fluka Chemica 03440)
N,N-Dimethylformamide (DMF) (Aldrich 200-679-5)
N,O-Bis(trimethyl)trifuorocetamide (BSTFA) (Fluka Chemica 15198)
PentaFluoroBenzylbromide (PFB) (Fluka Chemica 17910)
52
Plaque de chromatographie sur couche mince - silica gel 60 (Merk 200x200x0,25mm)
Prostaglandine D2 (Cayman Chemical 12010)
Prostaglandine D2-d4 (Cayman Chemical 312010)
Prostaglandine E2 (Cayman Chemical 14010)
Prostaglandine E2-d4 (Cayman Chemical 314010)
Prostaglandine 6 céto F1α (Cayman Chemical 15210)
Prostaglandine 6 céto F1α-d4 (Cayman Chemical 315210)
Prostaglandine F2α (Cayman Chemical 16010)
Prostaglandine F2α-d4 (Cayman Chemical 316010)
Prostaglandine 15-deoxy-∆12,14-J2 (Cayman Chemical 18570)
Prostaglandine 15-deoxy-∆12,14-J2-d4 (Cayman Chemical 318570)
III.1.3 Réactifs, solvants et solutions pour les Western blotting
CellyticTM-M (C2978) Sigma
Solution stock acrylamide/BIS (30%) prête à l’emploi
Solution SDS 10%
Solution persulfate d’ammonium 10%
Tampon Tris-HCl 1,5 M pH 8.8
Tampon Tris-HCl 0,5 M pH 6.8
Tampon de migration
Tampon de dépot
III.1.4 Réactifs et solvants pour les RT-PCR
Amorces d’adiponectine sens et antisens (n° U37222) 5’-AAGGACAAGGCCGTTCTCT–3’
et 5’–TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG–3’ Invitrogen.
Amorces de β-actine sens et antisens (n° X03672) 5’–CCAGGGTGTGATGGTGGGAATG–
3’ et 5’–CGCACGATTTCCCTCTCAGCTG–3’. Invitrogen
Eau Rnase free
Tampon 5x Qiagen
dNTP Mix
Enzyme Mix
53
III.1.5 Appareils
Centrifugeuses Jouan
Centrifugeuse réfrigérée Bioblock Scientific
Evaporateur rotatif Bioblock Scientific
Incubateur BB16 Heraeus
Lecteur RIASTAR Packard Instrument Co.
Lecteur de microplaques FLUOstar BMG Labtechnologies
Lecteur de plaques multipuits PowerWavex Bio-Tek Instruments
pH-mètre Radiometer Copenhagen/Tacussel
Spectrophotomètre Kontron Instruments
Système d’électrophorèse Mini-protein II et d’électrotransfert Mini-Trans Blot Bio-rad
Système d’imagerie ImageMaster VDS-CL (logiciel Imagem Quant) Amersham Pharmacia
Système de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
(Chromatrographe en phase gazeuse Hewlett Packard Séries 6890, colonne capillaire silice
(HP-5MS) (30m x 0,25 mm), gaz vecteur : hélium (0,5 bar), Spectromètre de masse
quadrupolaire Hewlett Packard Séries 5973, gaz réactant : méthane, système informatique
(pilotage, acquisition en traitement de données)).
54
III.2 Méthodes
III.2.1 Les adipocytes 3T3-L1
Les cellules utilisées sont des fibroblastes issus d’embryons murins. Elles proviennent d’une
lignée cellulaire: 3T3-L1 obtenue chez American Type Culture Collection (ATCC CL-173). Ces
fibroblastes sont capables de se différencier spontanément en adipocytes, c’est pourquoi ils sont
aussi appelés préadipocytes. Cette différenciation spontanée concerne 5% des cellules au bout de 6
jours et plus de 60% à 28 jours. Les fibroblastes sont des cellules polygonales qui adhèrent au fond
des boites de culture et forment un tapis cellulaire monocouche et jointif à confluence. Lorsque la
confluence est atteinte, la différenciation en adipocytes peut être stimulée. Les adipocytes sont
caractérisés par la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et la forme arrondie des
cellules. Deux jours après la fin de la stimulation de la différenciation, 50% des cellules présentent
une à deux gouttelettes lipidiques et huit jours plus tard 80% des cellules présentent cinq à dix
gouttelettes lipidiques. De la même façon, Fong et al., (1999) observent 90% de cellules
différenciées 8 jours après la fin du traitement.
III.2.2 Culture cellulaire
Les fibroblastes 3T3-L1 sont mis en culture dans un milieu constitué de DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium Sigma D5671) à 85%, de sérum de veau fœtal (Sigma N4762) à 10%,
d’insuline (Novo-Nordisk Actrapid 100UI/mL) à 40nM, de D(-) fructose (sigma F0127) à 10 mM,
de tampon Hepes (Sigma H0887) à 10 mM, d’acide L-ascorbique (Sigma A4034) à 25µg/mL et
d’une solution anti-biotique et anti-mycotique (Sigma A5955). Les cellules se divisent dans des
flasques de 75 cm2 à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2. Lorsque les cellules sont à
confluence (arrêt de la division cellulaire dû à l’inhibition de contact), elles sont rincées par 5 mL
de DMEM sans sérum et trypsinées à raison de 9 mL de trypsine (Trypsine-EDTA 1x Sigma
T3924) pour une flasque. La réaction a lieu pendant 5 minutes sous agitation douce et en vérifiant
sous microscope que les cellules sont décollées. La réaction est stoppée par l’ajout de 9 mL de
sérum de veau nouveau-né (sigma NA4637) à une concentration finale de 10%. On récupère le
milieu que l’on centrifuge à 1400t/min pendant 5 minutes, on ôte le surnageant et on suspend le
55
culot dans 4 mL de milieu de culture. Les cellules sont réensemencées à raison de 100 µL par puits
de plaque de 6 puits, dans 1,5 mL de milieu par puits.
III.2.2.1 Différenciation des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes
Lorsque les fibroblastes sont à confluence, on induit leur différenciation en adipocytes en les
incubant pendant 72 heures dans du milieu de culture supplémenté en insuline (20 µg/mL), IBMX
(3-isobutyl, 1-méthylxanthine, Sigma I7018) à 1 mM, et déxamethazone (dexamethazone water
soluble, Sigma D2915) à 20 µM. L’état de différenciation des adipocytes est contrôlé au
microscope optique en vérifiant l’apparition de gouttelettes lipidiques très réfringentes, dans le
cytoplasme des cellules en culture. Toutes ces manipulations doivent être réalisées stérilement sous
une hotte à flux laminaire et les plaques doivent être conservées dans un incubateur à 37°C.
III.2.2.2 L’induction du stress oxydant avec la glucose oxydase
Dix-sept jours après la fin de la différenciation, les adipocytes 3T3-L1 ont été incubés pendant
16 heures avec différentes concentrations de glucose oxydase (GO: 0, 1, 5, 12.5, 25, 50 et 100
mU/mL). Pour cela, le milieu de culture a été enlevé et les cellules rincées deux fois avec du
tampon krebs. Les cellules sont alors incubées avec l’enzyme dans du tampon Krebs ou du tampon
Krebs seul pour les témoins. La glucose oxydase produit du peroxyde d’hydrogène; celui-ci génère
du 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) en peroxydant les lipides (hydroperoxydes d’acides gras 4-
HNE). Le stress oxydant a été quantifié par la mesure du 4-HNE par GC-MS.
III.2.2.3 L’incubation des adipocytes 3T3-L1 avec 4-HNE
Nous avons également testé les effets du 4-HNE (0 ; 0,1 ; 1 ; 10 ; 25 et 50 µM). Pour cela, le
milieu de culture a été enlevé et les cellules rincées deux fois avec du tampon krebs. Les cellules
sont alors incubées avec du 4-HNE dans du tampon Krebs pendant 16 heures. L’adiponectine
libérée pendant l’incubation a été mesurée dans le surnageant.
56
III.2.3 Dosage de l’adiponectine
Nous avons utilisé le surnageant dans lequel les adipocytes ont été incubés pour doser
l’adiponectine sécrétée et libérée pendant la période d’incubation. L’adiponectine a été dosée à
l’aide d’un kit RIA (LINCO) selon les recommandations du fabricant.
III.2.4 Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène
Le dosage du peroxyde d’hydrogène (H202) est réalisé par un Kit (Cayman biochemicals), le
principe est basé sur l’oxydation de l’ion ferreux Fe2+ en ion ferrique Fe3+ en présence de H202.
L’ion Fe3+ réagit avec le réactif xylenol orange pour former un composé coloré stable mésuré à 595
nm. Le dosage se fait dans les plaques 96 puits dans volume total de 230 µL par puits, dont 200 µL
de réactif, 20 µL d’échantillon et 10 µL de glutathion peroxydase. La gamme étalon et les réactifs
sont préparés selon les recommandations du fournisseur. Après 30 minutes d’incubation des cellules
avec des concentrations croisssantes de glucose oxydase, 20 µL du milieu de culture sont prélevés
pour doser le H202.
III.2.5 Evolution de la concentration de glucose en présence de glucose
oxydase
La glucose oxydase utilise le glucose présent dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1.
Afin de s’assurer que les cellules ne sont pas soumises à des concentrations trop faibles de glucose,
nous avons mesuré sa concentration à l’aide d’un analyseur de glucose (Glucose Analyser Beckman
II).
III.2.6 Dosage de Lactate
Le lactate est dosé par une méthode fluorimètrique qui consiste à mesurer l’apparition de
NAPDH provenant de la réaction suivante :
LACTATE + NAD+ ↔ PYRUVATE + (NADH+H+)
57
Cette enzyme transfère deux atomes d’hydrogène sur le NAD qui acquiert des propriétés de
fluorescence pour une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et pour une longueur d’onde
d’émission de 460 nm. La solution de dosage se compose de 10% de 2-amino-2-méthyl propanol,
5% de solution d’hydrazyne, 2% de solution de nicotinamide adénine dinucléotide et de 83% d’eau
ultra pure. Cette procédure de dosage est basée sur la mesure de la formation de NADH due à
l’oxydation du lactate catalysée par la LDH et utilisant l’hydrazine comme agent de captation du
pyruvate (Gutmann et Wahlefeld 1974). Les mesures sont effectuées à l’aide d’un fluorimètre
automatisé dans des plaques 96 puits. Chaque puits continent 200 µL de la solution de dosage, 20
µL d’échantillon à doser et 10 µL de l’enzyme c’est-à-dire la LDH. Sur la plaque de mesure, nous
réalisons une courbe standard de lactate préparée à partir d’une solution de lactate standard (Sigma
826-10) d’une concentration initiale de 400 mg/L. L’incubation est faite sous agitation douce
pendant 30 min à 37°C. Les résultats de l’analyse sont collectés par un ordinateur couplé au
fluorimétre. Le logiciel donne les résultats en unité arbitraire de fluorescence qui sont ensuite
transformées en concentration de lactate à partir de la courbe standard.
III.2.7 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)
Pour réaliser ce dosage, on utilise le kit “Bio-rad’s protein assay”. Ce dosage est basé sur le
changement de coloration du bleu de Coomassie en présence de concentrations variables de
protéines. Une fraction aliquote de la solution à doser est prélevée et complétée à 50 µL avec de
l’eau ou le tampon constituant la solution à doser. On ajoute 200 µL de solution “BioRad protein
assay” diluée 5 fois dans l’eau. Après agitation, la densité optique à 595 nm est lue en microplaque
96 puits à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (powerWave X, BIOTEK
INSTRUMENTS) et la concentration est déterminée par comparaison à une gamme étalon
d’albumine sérique bovine (1-20 µg de protéines) réalisée dans les mêmes conditions.
III.2.8 Préparation des échantillons pour l’électrophorèse en conditions
dénaturantes (SDS-PAGE).
Les adipocytes 3T3-L1, sont cultivés dans des plaques de 6 puits, puis traités ou non à la
glucose oxydase pendant 16 heures. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du PBS à 37°C
puis récoltées. Ensuite, elles sont lysées dans du tampon de lyse (Cellytic M Sigma) supplémenté en
58
inhibiteur des protéases (Sigma) (1/4 v/v), à raison de 120 à 150 µL/puits pendant 15 min à 4°C et
sous agitation. Les homogénats cellulaires sont centrifugés à 14000g pendant 15 min. Le surnageant
est récupéré. Le dosage des protéines (par méthode de Bradford) est réalisé sur un aliquote de
chaque échantillon. 20 µg de protéines, sont repris dans du tampon de Laemmli (composition finale
: Tris 125mM, pH=6,8, saccharose 10%, SDS 2%, mercaptoéthanol 1% et bleu de bromophénol
0,05%), la dénaturation se fait pendant 5 min à 100°C.
III.2.8.1 Electrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et
"western-blotting".
Les électrophorèses sont réalisées sur un gel de polyacrylamide dont la concentration dépend
de la taille des protéines à séparer, en présence de 0,1% de SDS grâce à un appareil
d’électrophorèse pour minigels Biorad. Brièvement, pour deux mini gels on prépare le gel de
séparation en mélangeant dans un tube 4ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 2,5ml de Tris 1,5M
pH8,8, 0,10ml de SDS 10%, 0,10ml d'ammonium persulfate 10% et 0,004ml de TEMED. Le
mélange est vortexé avant d'être coulé. Après polymérisation, on prépare un gel de concentration en
mélangeant dans un tube 2,7ml d'eau, 0,67ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 0,5ml de Tris 1M
pH6,8, 0,04ml de SDS 10%, 0,04ml d'ammonium persulfate 10% et 0,004ml de TEMED. Le gel de
concentration est coulé au-dessus du gel de séparation. Après polymérisation les gels sont placés
dans la cuve de migration du système. Les échantillons préparés comme décrit précédemment sont
déposés dans les puits. La migration électrophorétique s’effectue sous une tension de 120V à
voltage constant. La migration peut être suivie grâce au dépôt de marqueurs moléculaires précolorés
dans un puits de référence. Les masses moléculaires des protéines étudiées sont déterminées en
référence à ces marqueurs moléculaires. L’électrotransfert sur membrane de nitrocellulose
(Amersham) est effectué pendant 1 heure à 140 V et ampérage constant de 300 mA, dans du
tampon de transfert réfrigéré (25mM de TrisHCl, pH=8,3, 0,19 M de glycine, 20% de méthanol). Le
transfert effectué, les marqueurs de masse moléculaire sont également transférés et peuvent servir
de contrôle d’efficacité du transfert. La membrane est rincée par un tampon salin TBS-T 1% (Tris-
HCl 20mM, NaCl 137mM, pH=7,6, Tween 20 à 0,1%) puis saturée dans un bain TBS-T/BSA 1%
pendant une nuit à 4°C. La membrane est ensuite rincée trois fois par du TBS-T 1% durant 10 min,
puis incubée à température ambiante avec l'anticorps primaire dilué mille fois, pendant 1 heure. Elle
est rincée 5 fois par du TBS-T 1% puis incubée avec l'anticorps secondaire anti-IgG couplé à la
peroxydase à la concentration (1 /10000) pendant 1 heure. La membrane est soumise à une dernière
série de lavages avant révélation spécifique des protéines par chimiluminescence (kit ECL
59
Amersham). La lecture se fait par caméra VDS et les bandes sont quantifiées par un densitomètre en
utilisant le logiciel Image Quant.
III.2.9 Mesure de l’expression des gènes par RT-PCR :
III.2.9.1 Extraction des ARN
Les ARN totaux des cellules sont extraits à l'aide de la solution d'extraction Tri Reagent
(SIGMA). Les cellules sont placées dans un tube eppendorff et centrifugées 5 min à 350 g. Le culot
cellulaire est repris dans 1ml de réactif Tri Reagent le tout est homogénéisé par pipettage. Les
homogénats obtenus sont laissés 5 min à température ambiante pour dissocier l'ensemble des
complexes nucléoprotéiques. On ajoute ensuite 20 µL de chloroforme avant agitation vigoureuse
pendant 15 sec. Les échantillons sont laissés 15 min à température ambiante puis centrifugés à
12000g pendant 15 min à 4°C. Le mélange se sépare alors en une phase organique rouge contenant
les protéines, une interphase contenant les ADN et une phase aqueuse incolore contenant les ARN.
La phase aqueuse est transférée dans un autre tube à laquelle on ajoute 500 µL d'isopropanol
pendant 5 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés à 12000g pendant 10 min à
4°C. L'ARN précipité forme un culot au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé
avec 1ml d'éthanol 75%. L'échantillon est de nouveau centrifugé à 7500 g, le surnageant est éliminé
et le culot est séché à l'air, avant d'être repris dans un volume minimum d'eau stérile. La
quantification des ARN se réalise par dilution dans l'eau stérile et par lecture à la longueur d'onde
de 260nm et 280 nm. Afin de vérifier la pureté des ARNm le rapport DO 260/DO 280 est mesuré et
doit être entre 1,7 et 2 pour estimer qu’il n’y a pas de contamination par de l’ADN. Les ARNm sont
ensuite conservés à -80°C.
III.2.9.2 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase
(RT-PCR)
La réaction est réalisée en utilisant le Kit One-step de Qiagen, dans un volume total de 50 µL.
Dans des eppendorfs de 250 µL on rajoute 10 µL Tampon 5x Qiagen, 2 µL dNTP 400 µM de
chaque dNTP Mix , 3 µL d’amorce sens 0.6 µM , 3 µL d’amorce antisens 0.6 µM, 2 µL Enzyme
Mix, un volume correspondant à 1 µg des ARN étudiés et de l’eau Rnase free pour compléter le
60
volume à 50 µL. Les amorces spécifiques pour l’amplification des transcrits d’adiponectine ont été
préparées sur la base de séquences publiées. Les amorces sens et antisens sont : (n° U37222) 5’-
AAGGACAAGGCCGTTCTCT–3’ et 5’–TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG–3’
respectivement. Le transcrit de la β-actine a été amplifié en utilisant les amorces sens et antisens
(n° X03672) 5’–CCAGGGTGTGATGGTGGGAATG–3’ et 5’–
CGCACGATTTCCCTCTCAGCTG–3’ respectivement. L’appareil de PCR est préchauffé à 50°C
avant de placer les tubes. Ensuite la réaction, se fait suivant deux étapes : une première étape de
transcription inverse, qui se fait 30 min à 50°C. Ensuite une deuxième étape d’inactivation de la
transcriptase inverse et initiation de la réaction de PCR se fait à 95°C pendant 15 min et 40 cycles.
Cela consiste en une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, hybridation à 61°C pendant 45 sec, et
l’extension à 72°C pendant 10 min. L’amplification et le nombre de cycles ont été déterminés au
cours d’essais préliminaires.
III.2.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose
Les différents fragments d’ADN complémentaires issus de l’amplification par PCR sont
séparés par électrophorèse sur gel d’agarose 2% contenant 0,005% de bromure d’éthidium (10 mg/
mL) dans du tampon TAE (Tris 40 mM, sodium acétate 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3). Les
échantillons sont préparés dans une solution de dépôt (0,25% de bleu de Bromophénol, 30% de
glycérol, 0,75% SDS) puis déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration se fait sous tension
constante à raison d’environ 5 Volts/cm de gel, et en présence d’un marqueur de taille. La position
des fragments d’ADN ayant fixé du bromure d’éthidium (BET) est révélée sous UV (310 nm), et le
gel est photographié à l’aide d’une caméra CCD (ImageMaster VDS-CL, Amersham Biotech) .
III.2.10 Dosage du 4-HNE par chromatographie gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS).
Cette méthode mesure le 4-hydroxynonénal (4-HNE) libre formé au cours du stress oxydant.
15 ng de 4-HNE deutéré (4-HNE-CD3), utilisé comme standard interne, est ajouté à 500 µL du
milieu d’incubation des adipocytes. L’échantillon est dérivé par 1 mL d’hydrochlorure de
pentafluorobenzyl hydroxylamine (PFBHA, HCl) préparé à 50 mM dans un tampon PIPES 0,1 M,
61
pH = 6.5, pendant 30 min sous agitation (Van Kuijk et al., 1995, Bacot et al., 2003). Cette réaction
convertit les groupements carbonyles en pentafluorobenzyloximes (O-PFB-oximes).
Les protéines sont précipitées par 2,5 mL de méthanol et les aldéhydes dérivés sous forme de
PFB oximes sont extraits par 5 mL d’hexane pestipur. L’excès de réactif est détruit par 60 µL
d’acide sulfurique concentré. Le surnageant récupéré après centrifugation de 5 min à 900 g est
évaporé à sec. Le résidu est traité par 100 µL de N,O-bis-(triméthylsilyl)-trifluoroacétamide
(BSTFA) pendant 24h à température ambiante afin de convertir les groupements hydroxylés en
triméthylsilyléthers (TMS). Le 4-HNE dérivé sous forme de O-pentafluorobenzyl oxime,
trimethylsilyléther- (O-PFB-TMS-4-HNE) est mesuré par GC-MS, en mode Selective Ion
Monitoring (SIM) et Ionisation chimique négative (NICI).
Le standard interne correspond à la molécule native marquée au deutérium, elle est constituée
d’une masse de 3 g/mole plus important que la molécule non marquée. Cette différence engendre
une augmentation du rapport masse/charge (m/z), détectée en spectrométrie de masse, de 3 unités
par rapport au 4-HNE ce qui permet de les différencier lors de l’analyse en GC-MS. L’effet
isotopique engendre ainsi, pour les molécules deutérées, un temps de rétention en chromatographie
en phase gazeuse plus court que pour les molécules non marquées. Leur structure chimique et les
fragments caractéristiques une fois le 4-HNE dérivé au (O-PFB-TMS-4-HNE), sont: ion m/z 423
correspond à l’ion moléculaire, ion m/z 403 correspond au [M-20] perte du l’acide fluorhydrique
(HF), ion m/z 333 correspond au [M-90] perte TMSOH, ion m/z 313 correspond [M-110] perte
TMSOH et HF et ion m/z 283 correspond au [313-30] perte HCOH.
III.2.11 Dosage des prostaglandines E2, D2, F2α et 6 céto-F1α par
chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC-
MS
III.2.11.1 Extraction des prostaglandines à partir des adipocytes en
culture
Le tapis cellulaire de chacun des cinq puits d’une plaque de culture cellulaire est rincé deux
fois avec 1mL de tampon Krebs, puis incubé pendant 30 minutes à 37°C dans 1,5mL de tampon
Krebs contenant de l’acide acétylsalicylique à 2 10-4M pour inhiber les cyclooxygénases et stopper
62
la synthèse des prostaglandines avant la récolte du tapis cellulaire. Après avoir éliminer le Krebs
contenant l’acide acétylsalicylique, les tapis cellulaires sont décollés avec 0,5mL de tampon Krebs
chacun, puis transvasés dans un tube en verre, le sixième puits est conservé à -80°C pour doser les
protéines.
Les standards internes nécessaires à la quantification en GC-MS sont ajoutés à la suspension
cellulaire, à raison de 300 pg par µL finaux injectés en GC-MS, de PGE2 deutérée, de PGD2
deutérée, de PGF2α deutérée et de 6-céto-PGF1α deutérée, plus l’acétate d’éthyle (AE). Les
prostaglandines sont extraites de la suspension cellulaire avec AE à raison de 5 mL par mL de
suspension. Le mélange cellules-AE est agité puis centrifugé à 750 g pendant 10 min à température
ambiante. La phase organique supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est
réextraite 2 fois comme précédemment.
III.2.11.2 Séparation des prostaglandines par chromatographie en
couche mince (CCM)
Une fois regroupée, les phases organiques sont évaporées à sec sous azote avant d’être
reprises dans 250µL d’AE pour être déposées sur une plaque de silice de chromatographie en
couche mince (CCM) préalablement lavée au méthanol. Les standards de migration sont déposés
simultanément à raison de 4 µg pour chaque prostaglandine étudiée (PGD2, PGE2, PGF2α et 6-céto-
PGF1α), sur le bord de la plaque de silice. La migration, a lieu dans un mélange de solvants :
diéthyléther / hexane / méthanol 50:40:15 (v/v/v). La révélation des standards de migration se fait
par vaporisation de molybdate puis chauffage à 50°C. Les standards de migration apparaissent ainsi
sous la forme de tâches bleues sur la plaque. La zone de silice correspondant au dépôt et située à la
même hauteur que le standard de migration plus 1 cm au dessus et au dessous est récupérée par
grattage. La silice est réhydratée par 2mL d’AE afin d’extraire les prostaglandines de la silice.
L’échantillon est centrifugé à 650 g pendant 5 min à température ambiante. La phase organique
supérieure est récupérée dans un tube conique L’extraction est répétée trois fois. Les phases
organiques sont rassemblées et évaporées à sec.
63
III.2.11.3 Dérivation chimique des prostaglandines : E2, D2, F2α et 6-
céto-PGF1α
Ces prostaglandines subissent trois dérivations successives : 1) une dérivation de leur
groupement carbonyle (C=O); 2) une dérivation de leur fonction carboxylique (COOH) ; et 3) une
silylation de leur groupement hydroxyle (OH) au TMS.
Pour la dérivation du groupement C=O, les échantillons secs sont incubés 45 min à
température ambiante avec 300 µL de méthoxylamine hydrochloride (MOX) à 3% dans l’eau et 75
µL d’acétonitrile. Pour extraire, on ajoute 1 mL d’AE, puis on agite vigoureusement chaque
échantillon avant d’éliminer la phase aqueuse inférieure. La phase organique restante est ensuite
évaporée à sec. Pour la dérivation de la fonction COOH, les échantillons secs sont incubés avec 60
µL d’acétonitrile, 20 µL de pentafluorobenzylbromide (PFB), à 35% dans l’acétonitrile et 20 µL de
N-éthyl diisopropylamine (DIPE), qui permet de capter les protons formés par la réaction. La
réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Enfin, la silylation des groupements OH, les
échantillons sont incubés pendant 60 min à 60°C en présence de 8 µL de N,N-dimethylformamide
(DMF) et 20 µL de N,O-bis(trimethyl)trifuorocetamide (BSTFA). Les échantillons sont évaporés à
sec et repris dans 50 µL de mélange hexane (pur et anhydre) /BSTFA 9:1 (v:v) et vigoureusement
agités avant d’être transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS.
III.2.11.4 Analyse des prostaglandines par GC-MS
Les échantillons de prostaglandines sont analysés en GC-MS en introduisant 1 µL dans un
injecteur split-splitless. La colonne capillaire HP-5MS utilisée a une longueur de 30 m et un
diamètre de 0,25 mm. Elle est recouverte d’un film de phase stationnaire apolaire (phényl méthyl
siloxane) de 0,25 µm d’épaisseur. Le gaz vecteur utilisé est l’hélium avec un débit de 1 mL/min.
Les injections sont réalisées à 260°C, la température du four étant maintenue à 57°C pendant 2
minutes puis elle augmente jusqu’à 180°C à raison de 20°C/min et jusqu’à 280°C à raison de
4°C/min. Cette température est maintenue constante pendant 15 minutes.
La température de la zone de transfert entre la GC et la MS, la température à la source de la
MS, et celle du quadripôle sont respectivement fixées à 280°C, 150°C et 106°C. Les
prostaglandines sont analysées en mode de sélection d’ion (SIM) qui permet de collecter les ions
d’intérêt : m/z 524.2 et 528.2; m/z 569.2 et 573.2 ; et m/z 614.2 et 618.2 formés au cours de
l’ionisation chimique négative.
64
III.2.11.5 Chromatographie en phase gazeuse (GC)
L’échantillon est injecté à travers un septum à fermeture automatique. La chambre d’injection,
chauffée, vaporise l’échantillon qui est entraîné dans la colonne par un gaz vecteur. Il traverse alors
la colonne de chromatographie en phase gazeuse qui permet de séparer le mélange en ses divers
composants, puis arrive dans le four dont la température permet d’optimiser la résolution des
composés d’un échantillon donné. L’interface entre la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la
spectrométrie de masse (MS) assure le transfert du couple échantillon-gaz vecteur d’une pression
élevée à l’intérieur de la colonne, à une très basse pression dans le spectromètre de masse.
Le système de spectrométrie de masse est placé sous vide car la diminution de la pression
permet d’augmenter la distance entre les molécules et de minimiser le nombre de collisions
intermoléculaires à l’intérieur de la source d’ions. En effet, lorsqu’il traverse la source d’ions,
l’échantillon est soumis à un flux d’électrons, qui casse et ionise les molécules qui la composent.
Les ions produits sont dirigés vers le quadripôle qui sépare les fragments ionisés en fonction de leur
rapport masse/charge. Le système de détection mesure alors la quantité de chaque ion traversant le
quadripôle, dont le signal est amplifié puis enregistré sous forme de spectre de masse.
III.2.11.6 Structure et analyse des prostaglandines
Pour chaque prostaglandine étudiée, le standard interne correspond à la molécule native
marquée au deutérium, et présente une masse de 4 g/mole plus important que la prostaglandine non
marquée (Figure 5). Cette différence engendre une augmentation du rapport masse/charge (m/z),
détectée en spectrométrie de masse, de 4 unités par rapport à la PGD2 et la PGE2 (524.2 contre
528.2), à la PGF2α (569.2 contre 573.2) et à la 6 cétoPGF1α (614.2 contre 618.2) ce qui permet de
les différencier lors de l’analyse en GC-MS.
L’effet isotopique engendre ainsi, pour les molécules deutérées, un temps de rétention en
chromatographie en phase gazeuse plus court que pour les molécules non marquées. Les différentes
prostaglandines sont analysées en mode sélection d’ion SIM qui permet de collecter uniquement les
ions d’intérêt et donc d’augmenter la sensibilité de la méthode. Les signaux de chacun des ions sont
intégrés et la quantité de prostaglandine est calculée à l’aide de la formule : M= (Aire de l’ion de la
prostaglandine deutérée / Aire de l’ion de la prostaglandine non marquée présente dans l’échantillon
dosé) x quantité de standard interne.
65
Figure 6 : Structure des prostaglandines analysées. La prostaglandine à gauche et la prostaglandine deuterée à droite (3,4 d4- PG)
66
III.2.11.7 Limite de détection du GC-MS
Les limites de détection de chaque molécule au GC-MS à partir de son standard interne est de
10 pg pour la 15dPGJ2 ; 100 fg pour la PGF2α et 500 fg pour la PGD2, PGE2 et pour la 6 cétoPGF1α.
III.2.12 Dosage de la Prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 par GC-MS et
GC-MS-MS.
III.2.12.1 Extraction, séparation, dérivation et l’analyse de la 15dPGJ2
La 15dPGJ2 a été dosée dans l’urine humaine à partir de 5mL, dans des échantillons de tissu
adipeux de 20 mg et dans des cellules 3T3-L1 en culture. Pour l’urine, nous avons ajouté à 5 mL
d’urine du matin, 5 mL du l’acétate d’éthyle par mL d’échantillon puis le standard interne, la
15dPGJ2.d4 (200 pg par µL final injecté). Les adipocytes 3T3-L1 sont initialement traités comme
décrit dans le paragraphe III.2.11.1.. Ensuite, on ajoute le standard interne, la 15dPGJ2.d4 (200 pg
par µL finaux injecté), et 5 mL d’AE par mL d’échantillon. Le mélange cellules-AE ou urine-AE
est agité puis centrifugé à 750 g pendant 10 min à température ambiante. La phase organique
supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est réextraite 2 fois comme
précédemment. Les phases organiques sont réunies et évaporées, ensuite les prostaglandines sont
séparées par chromatographie en couche mince, comme décrit dans le paragraphe III.2.11.2. Le
standard de migration pour la séparation de la 15dPGJ2 en CCM, est de 4 µg de 15dPGJ2 par
plaque. La fonction COOH de la 15dPGJ2 est dérivée au PFB. Pour cela, les échantillons secs sont
incubés avec 60 µL d’acétonitrile, 20 µL de PFB, à 35% dans l’acétonitrile et 20 µL de DIPE. La
réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Les échantillons sont évaporés à sec et repris
dans 50 µL de mélange hexane (pur et anhydre)/BSTFA 9:1 (v:v) et vigoureusement agités avant
d’être transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS ou GC-MS-MS.
Les échantillons de 15dPGJ2 sont analysés par GC-MS, selon les même principe présenté dans
le paragraphe III.2.11.4. La 15dPGJ2.d4 est la molécule deutérée qui présente une masse moléculaire
de 4 g/mole de plus que la 15dPGJ2 native. Cette différence engendre un rapport de la masse sur la
charge (m/z) détecté en spectrométrie de masse plus grand de 4 unités par rapport à la 15dPGJ2
(319.2 contre 315.2) ce qui permet de les différencier. L’effet isotopique engendre un temps de
67
rétention en chromatographie gazeuse pour la 15dPGJ2 deutérée plus court d’environ sept centièmes
de minutes (35.55 min contre 35.62 min) par rapport à la 15dPGJ2. Les signaux de chacun des ions
sont intégrés et la quantité de prostaglandine est calculée à l’aide de la formule : M= (aire de l’ion
de la prostaglandine deutérée / aire de l’ion de la prostaglandine non marquée présent dans du
échantillon dosé) x quantité de standard interne.
a)15dPGJ2 :
b) 15dPGJ2-PFB (molécule dérivée) :
c) Standard interne 15dPGJ2 deutérée et dérivée :
Figure 7 : Structure de la 15dPGJ2 et derivée. La 15dPGJ2 et dérivée et la réaction avec le pentafluorobenzylbromide (PFB).
O
C
O
OH
C
O
CH2O
F
FF
F
F
O
D D
DDC
O
CH 2O
F
FF
F
F
O
68
III.2.12.2 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS
La chromatographie en tandem se caractérise par rapport à la GC-MS par le fait que les
fragments de molécules obtenus en soumettant la molécule d’intérêt à un champ d’électrons, au lieu
d’être analysé sont de nouveau soumis à un champ d’électron qui va les casser en fragments plus
petits, plus nombreux, ceci permet de mieux caractériser la molécule d’intérêt.
III.2.13 Liaison covalente de la prostaglandine 15-desoxy-delta12-14-J2 et son
récepteur nucléaire le peroxisome proliferator-activated receptor-
gamma (PPARgamma)
III.2.13.1 Incubation de la 15dPGJ2 avec PPARgamma
La 15dPGJ2 dissoute dans l’AE est icubée avec le PPARγ-LBD (ligand-binding domain) (0,06
nmol) préparé dans un tampon pH 7,9 contenant KCl 100 mM, Tris-HCL 20 mM, mercaptoéthanol
0,2 mM EDTA, et du glycérol. La réaction a lieu pendant 60 min à 37°C. Le ratio entre 15dPGJ2 et
PPAR-LBD est 2,5/1.
III.2.13.2 Extraction et analyse au GC-MS
La 15dPGJ2.d4 est extraite du mélange 15dPGJ2/PPAR-LBD, en ajoutant 500 µL d’AE et 100
µL d’eau ultra pure. On agite puis on centrifuge à 750 g pendant 10 min à température ambiante. La
phase organique supérieure est alors récupérée et la phase aqueuse restante est réextraite 2 fois
comme précédemment. Ensuite, la fonction COOH de la 15dPGJ2 est dérivée au PFB. Pour cela, les
échantillons secs sont incubés avec 60 µL d’acétonitrile, 20 µL de PFB, à 35% dans l’acétonitrile et
20 µL de DIPE. La réaction a lieu pendant 30 min entre 38°C et 40°C. Les échantillons sont
évaporés à sec et repris dans 40 µL du l’hexane (pur et anhydre), vigoureusement agités avant d’être
transvasés dans des tubes spécifiques pour l’injection en GC-MS
69
III.2.13.3 Analyse de binding radioligand
Les essais de binding avec du PPAR-GST (glutathion S-transferase), ont été réalisés selon les
conditions décrites par Dang et al., (2003) et adaptées pour les analyses de cinétique de dissociation.
Le PPAR-GST a été incubé à 4°C pendant 90 min avec la 15dPGJ2 ou d’autre ligands dans 100 µL
du tampon de binding, pH 8,2 contenant Tris 10 mM, KCl 50 mM et DTT 1 mM. Les échantillons
ont ensuite été centrifugés pendant 5 minutes à 4000 g. Le surnageant a été enlevé et le culot repris
avec le même volume de tampon de binding, auquel a été ajouté la rosiglitazone [3H] 12 nM. La
quantité de membrane utilisée par essai était de 32 µg de protéines. Après l’incubation les
échantillons ont été filtrés avec un système Filtermate GF/B (Packard). L’inclusion a été rincée
trois fois avec 2 mL du tampon de filtration à pH 7,4 et Tris 50 mM. Ensuite 30 µL/puits de la
solution de scintillation (Microscint 20, Packard) ont été ajoutés. La radioactivité a été mesurée au
compteur à scintillation β (Top-Count NXT, Packard). Les échantillons témoins ne contenaient ni
15dPGJ2 ni aucun autre ligand au départ, l’incubation finale était faite en présence de rosiglitazone
[3H] (100% du binding total) ou avec addition de rosiglitazone à 10-5 M (0%, binding non-
spécifique). Les constantes d’inhibition (Ki) ont été déterminées comme décrit par (Dang et al.,
2003). Les résultats ont été rapportés au pourcentage des valeurs témoins.
III.2.13.4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS)
L’analyse MALDI-TOF est une technique couplant l’électrophorèse bidimensionnelle à la
sensibilité et à la précision de la spectrométrie de masse. La molécule repérée sur un gel
d'électrophorèse bidimensionnelle après coloration à l'argent, est digérée par la trypsine à l'intérieur
même du gel de polyacrylamide. Le spectromètre de masse utilisé est un MALDI-TOF
(Applied Biosystems Applera Voyager STR MALDI-TOF). Le GST-LDB de PPARgamma a été
préparé selon Ferry et al., (2001). Cinq µM de GST-LDB ont été incubé avec ou sans 100 µM de la
15dPGJ2 à 4°C pendant 90 min dans un tampon de binding. Après l’incubation, la digestion a été
réalisée avec 20 µL de la trypsine [0,025 µg/µL] dans du tampon NH4HCO3 50mM à 37°C pendant
90 minutes. Les peptides ont été analysés par MALDI-TOF MS.
70
III.2.14 Analyse statistique
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne +/- SEM. La significativité a été calculée
au seuil de p<0,05 par une analyse de variance ANOVA suivie d’un test post-hoc Fisher protected
least-significant difference (plsd), à l’aide d’un logiciel Statview pour MacIntosh.
71
IV RESULTATS
72
IV.1 Cellules
IV.1.1 Effet du stress oxydant sur les adipocytes
Nous avons choisi comme stress oxydant d’utiliser la glucose oxydase car cet enzyme produit
en permanence du peroxyde d’hydrogène. Ceci nous est apparu comme une méthode beaucoup plus
physiologique que d’ajouter aux cellules une concentration forte mais éphémère de peroxyde
d’hydrogène. L’utilisation de la glucose oxydase a nécessité quelques expérimentations contrôles,
comme par exemple la mesure de la concentration en glucose. En effet, la glucose oxydase
produisant du peroxyde d’hydrogène à partir de la transformation du glucose, il était indispensable
de s’assurer que la concentration en glucose du milieu de culture restait dans des limites
compatibles avec la culture des cellules.
IV.1.2 Effet de la glucose oxydase sur la dégradation du glucose
La glucose oxydase diminue la concentration du glucose présent dans le milieu de culture en
l’oxydant. La diminution de la concentration de glucose est proportionnelle à la concentration en
glucose oxydase. A partir de 25 mU/mL de glucose oxydase, la concentration du glucose chute
rapidement, mais il reste encore du glucose à 16 heures d’incubation quelque soit la concentration
utilisée (Figure 8). Pour les plus fortes concentrations (50 et 100 mU/mL), il reste environ 2 mM de
glucose, après 16 heures d’incubation.
73
0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 8 12 16
Temps d'incubation (heures)
Glu
cose
(mM
)
0
1
5
12,5
25
50
100
abcd
e
ff
Figure 8 : Dosage du glucose dans le milieu de culture des adipocytes 3T3-L1 incubés avec des
concentrations croissantes de glucose oxydase.
L’analyse statistique montre que l’effet de la glucose oxydase sur la dégradation du glucose est
significatif à partir de 1 mU/mL de glucose oxydase. Il n’y a pas de différence significative entre les
concentrations 50 et 100 mU/mL de glucose oxydase.
74
IV.1.3 Effet de la glucose oxydase sur la production du peroxyde
d’hydrogène :
L’action de la glucose oxydase sur le glucose permet de générer du peroxyde d’hydrogène, qui
atteint des concentrations significatives à partir de 5 mU/mL de glucose oxydase. A 25 mU/mL la
concentration en H2O2 au bout de 30 minutes d’incubation est d’environ 30µM. (Figure 9). Figure 9 : Dosage du peroxyde d'hydrogène dans le milieu de 3T3-L1 après 30 minutes en
présence de concentrations croissantes de glucose oxydase.
Une étoile indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin.
IV.1.4 Chromatogramme du 4-HNE en GC-MS après dérivation au PFB-
TMS
Après dérivation du PFB-TMS, le 4-HNE apparaît sous forme de deux pics, élués vers 13
minutes qui correspondent aux isomères syn et anti (Figure 10A). La surface de deux pics est
prise en compte pour la quantification.
Des isomères identiques sont produits à partir du standard interne de 4-HNE deutéré
(Figure 10B).
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
0 20 40 60 80 100
Glucose oxydase (mU/mL)
Pero
xyde
d'h
ydro
gène
(µM
)
***
**
75
Figure 10 : Chromatogramme du 4-HNE par GC-MS après dérivation au PFB-TMS. Deux
pics apparaissent correspondant aux isomères syn et anti.
(A) Les pics élués à 13.07 et 13.35 correspondent au 4-HNE produit à partir de l’incubation des
adipocytes 3T3-L1 avec la glucose oxydase. (B) Les pics élués à 13.05 et 13.33 correspondent
au 4-HNE-CD3 utilisé comme standard interne.
IV.1.5 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la
production du 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 :
La glucose oxydase engendre une production de 4-HNE par les cellules. Après 16 heures
d’incubation, la concentration en 4-HNE a été dosée par GC-MS dans les 3T3-L1 incubées avec
différentes concentrations de glucose oxydase (Figure 11). La production de 4-HNE est
significativement augmentée à partir de 12,5 mU/mL de glucose oxydase. La glucose oxydase
stimule la production de 4-HNE par les cellules. A partir de 12,5 mU/mL, la concentration en 4-
HNE augmente en fonction de la concentration de glucose oxydase.
0
20000300004000050000
Time-->
Abundance
13.07
13.35
11 11 12 12 13 13 14 14 15 15
11 11 12 12 13 13 14 14 15 150
20000300004000050000
Time-->
Abundance
13.05
13.33
A
B
0
20000300004000050000
Time-->
Abundance
13.07
13.35
11 11 12 12 13 13 14 14 15 15
11 11 12 12 13 13 14 14 15 15
11 11 12 12 13 13 14 14 15 15
11 11 12 12 13 13 14 14 15 150
20000300004000050000
Time-->
Abundance
13.05
13.33
A
B
76
4
5
6
7
8
9
0 20 40 60 80 100 120
Glucose oxydase (mU/mL)
4-H
NE
(pm
ol/m
g pr
otéi
ne)
* * **
Figure 11 : Production de 4-HNE par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations
croissantes de glucose oxydase pendant 16 heures d’incubation à j17 après le début de la
différenciation.
La concentration en 4-HNE dans les adipocytes 3T3-L1 est augmentée à partir d’une concentration
en GO de 12,5 mU/mL. L’étoile indique une différence significative par rapport au témoin (n=4).
77
IV.1.6 Effet du stress oxydant généré par la glucose oxydase sur la
sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 :
Afin de mesurer les effets du stress oxydant sur les cellules adipeuses, nous avons choisi une
fonction cellulaire directement reliée aux implications du tissu adipeux dans le diabète de type 2.
Nous avons choisi la production d’adiponectine qui est directement impliquée dans la sensibilité à
l’insuline. La sécrétion d’adiponectine est significativement réduite à partir de 25 mU/mL de
glucose oxydase par RIA (Figure 12). Par western blotting, on constate que la sécrétion
d’adiponectine est significativement réduite à partir de 12,5 mU/mL de glucose oxydase (Figure
13).
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80 100 120Glucose oxydase (mU/mL)
Adi
pone
ctin
e (n
g/m
g pr
otéi
ne)
* **
Figure 12 : Sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 exposés pendant 16 heures à
des concentrations croissantes de glucose oxydase.
L’adiponectine a été mesurée dans le liquide extracellulaire. Les résultats sont exprimés sous
forme de moyenne ± SEM (n=4). Une étoile indique une différence significative au seuil de
p<0,05.
78
0
25
50
75
100
125
0 1 5 12,5 25 50 100Glucose oxydase (mU/mL)
% c
ontô
le
**
**
Figure 13 : Sécrétion d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 en culture. L’adiponectine a
été mesurée par western blotting.
Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage par rapport aux témoins. On observe une
diminution significative de la production d’adiponectine à partir de 5mU/mL de glucose oxydase.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± déviation standard (n=3 à 5). Une étoile
indique une différence significative au seuil de p<0,05.
79
IV.1.7 Comptage des adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations
croissantes de glucose oxydase par fluorescence CyQuant.
Afin de nous assurer que la diminution de la production d’adiponectine n’est pas causée en
partie par une mort cellulaire induite par un stress oxydant excessif, nous avons entrepris de
compter les cellules en réponse au stress oxydant (Figure 14).
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Glucose oxydase (mU/mL)
Nom
bre
de c
ellu
les
(% d
u co
ntrô
le)
Figure 14 : Quantification du nombre de cellules en présence de concentrations croissantes de
glucose oxydase.
Les cellules ont été quantifiées en utilisant le marqueur CyQuant. Les mesures de fluorescence
ont été réalisées à l’aide d’un lecteur de plaque à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et
d’émission de 538 nm. Les résultats sont exprimés sous forme de % des valeurs mesurées dans
les conditions témoins (n=3). Le seuil de significativité statistique était de p<0,05.
IV.1.8 Effet de la glucose oxydase et de la catalase sur la production
d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.
Afin de vérifier que la diminution de la sécrétion d’adiponectine est bien causée par le
peroxyde d’hydrogène et non par un sous produit de la réaction causée par la glucose oxydase, ou
par un contaminant présent avec celle-ci, nous avons incubé des cellules 3T3-L1 en présence de
glucose oxydase et de catalase qui dégrade le peroxyde d’hydrogène. Dans ces conditions, nous
80
observons que la production d’adiponectine est totalement restaurée en présence de catalase
(Figure 15). Cette expérience montre que seul le peroxyde d’hydrogène induit la diminution de la
production d’adiponectine.
50
60
70
80
90
100
0 GO 50 mU/mL GO 50 mU+Cat50U/mL
Adi
pone
ctin
e (n
g/m
g pr
otéi
ne)
*
Figure 15 : Effets de la glucose oxydase et de la glucose oxydase plus catalase sur la sécrétion
d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.
La diminution de la production d’adiponectine provoquée par l’addition de glucose oxydase est
totalement inhibée par l’addition de catalase qui dégrade le peroxyde d’hydrogène. L’étoile
indique une différence significative au seuil de p<0,05.
IV.1.9 Effet de la glucose oxydase dénaturée sur la production
d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1.
Une autre façon de tester la spécificité des effets du peroxyde d’hydrogène est d’incuber
les cellules avec de la glucose oxydase dénaturée. Dans ces conditions on ne devrait observer
aucun effet sur la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. C’est en effet ce qui est
observé (Figure 16). Cette expérience montre qu’aucun composé autre que le peroxyde
d’hydrogène n’altère la sécrétion d’adiponectine, ce qui aurait pu être le cas d’impureté présentes
avec la glucose oxydase.
81
50
60
70
80
90
100
0 GO 50 mU/mL GO 50 mU/mLdenaturée
Adi
pone
ctin
e (n
g/m
g pr
otei
ne)
*
Figure 16: Effet de la glucose oxydase et de la glucose oxydase dénaturée sur la production
d’adiponectine par les cellules 3T3-L1, à j17 après la différenciation.
La glucose oxydase intacte diminue très significativement la sécrétion d’adiponectine, alors
qu’une fois dénaturée la glucose oxydase n’a aucune influence (n=6). L’étoile indique une
différence significative au seuil de p<0,05.
IV.1.10 Effet du 4-HNE sur la production d’adiponectine par les
adipocytes 3T3-L1.
Nous avons vu précédemment que le stress oxydant généré par la glucose oxydase
augmente la production de 4-HNE dans les adipocytes. Il n’y a en cela rien de très
révolutionnaire car il est connu que le 4-HNE est produit par peroxydation lipidique à partir des
acides gras polyinsaturés n-6. Cet aldéhyde est par ailleurs connu pour sa forte réactivité qui en
fait un médiateur du stress oxydant impliqué dans de nombreuses pathologies (Poli et Schaur,
2000; Parola et al., 1999). Nous avons testé les effets du 4-HNE, avec l’idée qu’il pourrait être un
intermédiaire important dans la diminution de la production d’adiponectine. En effet, la Figure
17 montre que la production d’adiponectine diminue à l’exposition de 4-HNE. Cette diminution
n’est observée que pour les concentrations les plus élevées : 25 et 50 µM.
82
50
60
70
80
90
100
0 0.1 1 10 25 50
4-HNE (µM)
Adi
pone
ctin
e (n
g/m
g pr
otéi
ne)
**
Figure 17 : Production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 exposés à des concentrations
croissantes de 4-HNE pendant 16 heures.
On observe un effet inhibiteur du 4-HNE aux concentrations les plus élevées sur la production
d’adiponectine. L’étoile indique une différence significative au seuil de p<0,05, (n=6).
Ces résultats sont renforcés par l’observation d’une corrélation négative très significative
entre la quantité d’adiponectine produite par les adipocytes 3T3-L1 soumis à des concentrations
croissantes de glucose oxydase et la concentration en 4-HNE dans ces mêmes cellules (Figure
18).
83
y = -0,1603x + 15,915R2 = 0,8579
0
2
4
6
8
10
45 50 55 60 65 70 75
Adiponectine (ng/mg protéine)
4-H
NE
(pm
ol/m
g P
roté
ine)
Figure 18 : Corrélation entre la production d’adiponectine par des adipocytes 3T3-L1 soumis
à des concentrations croissantes de glucose oxydase et la concentration intracellulaire en 4-
HNE.
On observe une corrélation négative très significative (r=0.9262, p<0,05). Les résultats sont
exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4).
IV.1.11 Expression des ARNm codant l’adiponectine par les
adipocytes 3T3-L1 soumises à un stress oxydant.
Un stress oxydant diminue la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. Nous
avons recherché si cette baisse de la sécrétion d’adiponectine est due à une diminution de la
synthèse d’ARNm codant l’adiponectine. Les ARNm codant l’adiponectine ont été mis en
évidence par RT-PCR. La Figure 19A représente un exemple représentatif de produits de PCR
séparés sur gel d’agarose. Les valeurs obtenues pour l’adiponectine sont normalisées par rapport
à celles obtenues pour la béta-actine. La Figure 19B montre la quantification moyenne à partir de
trois expériences indépendantes. On observe une diminution significative de la production
d’ARNm codant l’adiponectine en réponse à la plus petite concentration de glucose oxydase à
laquelle les cellules ont été exposées (1mU/mL).
84
A
B
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 20 40 60 80 100 120Glucose oxydase (mU/mL)
Ratio
Adip
onec
tine
/ Act
ine
**
* **
*0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Figure 19 : Inhibition de l’expression des ARNm codant l’adiponectine dans les adipocytes
3T3-L1 exposés à des concentrations croissantes de glucose oxydase.
(A) Gel d’électrophorèse des produits de RT-PCR. (B) Analyse densitométrique des bandes
correspondant aux ARNm codant l’adiponectine. Les ARNms codant pour l’adiponectine ont été
normalisés par rapport à ceux de la béta-actine. Les résultats sont exprimés sous forme de
moyenne ± SEM (n=3). L’étoile indique une différence significative au seuil de p<0,05.
0 1 5 12.5 25 50 100GO (mU/mL)
Β-Actine
Adiponectine
0 1 5 12.5 25 50 100GO (mU/mL)
Β-Actine
Adiponectine
85
IV.1.12 Evolution de la concentration cellulaire en prostaglandines dans
les adipocytes 3T3-L1 en réponse à des concentrations croissantes
de glucose oxydase.
Précédemment nous avons vu que le stress oxydant généré par la glucose oxydase
augmente la production de 4-HNE dans les adipocytes. Notre équipe a démontré aussi que ce
stress augmente l’expression de la COX2, pour cela nous avons mesuré la concentration cellulaire
en prostaglandines clés dont la synthèse dépend des COX. Nos résultats montrent que la synthèse
de PGE2 dans les adipocytes 3T3-L1 ne change pas en réponse au stress oxydant (Figure 20).
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Témoin 5mU/mL 25mU/mL
Glucose Oxydase
PG
E2
(ng/
mg
prot
éine
s)
Figure 20 : Concentrations en prostaglandine E2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la
différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5).
86
Parallèlement, dans les mêmes échantillons, nous avons mesuré la PGD2. On observe pour
cette prostaglandine une augmentation de la concentration en réponse au stress oxydant. Cette
augmentation est dose dépendante puisque les concentrations mesurées sont significativement
différentes en présence de 5 et 25mU/mL de GO (Figure 21).
Figure 21: Concentrations en prostaglandine D2 dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la
différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Témoin 5mU/mL 25mU/mL
Glucose Oxydase
PG
D2
(n
g/m
g p
roté
ine
s)
a
b
c
a
87
La Figure 22 représente la concentration en PGF2α dans des cellules non traitées et des
cellules exposées à deux concentrations de GO. On observe une augmentation de la concentration
en PGF2α en réponse à l’exposition à la GO. Cette augmentation est importante car elle
représente prés de 50% de celle des témoins en réponse à la concentration de GO la plus élevée.
Figure 22: Concentrations en prostaglandine F2α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la
différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
Témoin 5mU/mL 25mU/mL
Glucose Oxydase
PGF2
alph
a (n
g/m
g pr
otéi
nes)
ab
c
88
La Figure 23 montre qu’il n’y a aucun effet du stress oxydant sur la production de 6 céto-
PGF1α par les adipocytes 3T3-L1.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Témoin 5mU/mL 25mU/mL
Glucose Oxydase
6 cé
to P
GF1
alph
a (n
g/m
g pr
otéi
nes)
Figure 23: Concentrations en 6-céto-prostaglandine F1α dans les cellules 3T3-L1 (j10 après la
différenciation) exposées à deux concentrations de glucose oxydase.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=5).
89
IV.1.13 Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au 4-HNE.
Le 4-HNE est connu pour réagir avec l’acide lipoïque, un cofacteur essentiel au
fonctionnement de l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase et de la pyruvate déshydrogénase
(Humphries et al., 1998; Humphries et Sweda, 1998). Pour cette raison nous avons examiné la
production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress oxydant et à une
supplémentation avec de l’acide lipoïque. Les résultats montrent que le stress oxydant augmente
la production de lactate alors que la supplémentation en acide lipoïque renverse partiellement cet
effet (Figure 24). L’exposition des adipocytes à des concentrations croissantes de 4-HNE pendant
seulement deux heures stimule la production de lactate par les cellules 3T3-L1.
0
100
200
300
400
500
600
Control GO GO + lipoate
Prod
uctio
n d
e La
ctat
e (µ
M/h
eure
) a b c
Figure 24 : Production basale de lactate par les adipocytes 3T3-L1, effet d’un stress oxydant
(100mU/mL) sur la production de lactate et d’une supplémentation en acide lipoïque (10-4M),
pendant deux heures.
Les résultats montrent que le stress oxydant augmente la production de lactate par les adipocytes.
Cet effet est partiellement corrigé par l’addition d’acide lipoïque. Les résultats sont exprimés sous
forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettes différentes indiquent des différences significatives au
seuil de p<0,05.
90
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4
4-HNE concentration -log[M]
Prod
uctio
n de
Lac
tate
(µM
/heu
re)
control 6 5 4
cbcaba
Figure 25: Production de lactate par les adipocytes 3T3-L1 en présence de concentrations
croissantes de 4-HNE pendant 2 heures.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettes différentes indiquent
des différences significatives au seuil de p<0,05.
91
IV.2 Animal
Une part importante de notre travail expérimental a porté sur la mise en évidence du rôle de
la 15dPGJ2 dans la différenciation adipocytaire. Notre hypothèse était que cette prostaglandine,
décrite comme le ligand endogène le plus efficace de PPARgamma, pourrait jouer le rôle de
facteur de différenciation des cellules souches en adipocytes. Pour tester cette hypothèse nous
avons utilisé les rats Lou C qui présentent la caractéristique de rester très maigre au cours de leur
existence, à la différence des rats Wistar qui sont généralement utilisés comme animaux témoins
bien qu’ils présentent une adiposité sans cesse croissante au cours de leur vie, jusqu’à en faire
des animaux obèses (Newby et al., 1990).
IV.2.1 Production des prostaglandines PGF2α, PGD2, PGE2, 6 Céto PGF1α et 15dPGJ2 dans les tissus adipeux épididymal et rétropéritonéal chez le rat Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Nous avons étudié des rats Lou C et Wistar de 4 et 8 semaines, chez lesquels nous avons
mesuré les concentrations en différentes prostaglandines. La figure 26 montre qu’il n’y a pas de
différence significative dans les concentrations de PGF2α entre les tissus adipeux épididymaux de
rats Lou C et de Wistar, chez les animaux de même âge. Mais on observe une réduction
significative de la synthèse de cette même prostaglandine chez les rats Wistar âgés.
La Figure 27 montre qu’il n’y a pas de différence significative, entre les concentrations de
PGF2α dans les tissus adipeux rétropéritonéaux de rats Lou C et Wistar âgés de 4 semaines. Par
contre, la concentration en PGF2α diminue chez les animaux âgés de 8 semaines comparés à ceux
de 4 semaines.
92
PGF2 alfa Epididydimal
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Age en semaines
PGF2
alfa
(ng/
mg
tissu
) Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
aab
abb
Figure 26 : Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux épididymal de rats
Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
PGF2 alfa Rétropéritonéal
0
1
2
3
4
5
1 2Age en semaines
PGF2
alfa
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
b
b
a a
Figure 27: Concentrations en prostaglandine F2α dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats
Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
93
La concentration en PGD2 n’est pas différente dans les tissus épididymaux de rats Lou C et
Wistar de même âge. Par contre on observe une différence entre les âges 4 et 8 semaines (Figure
28) chez le rat Wistar seulement. Aucune différence n’existe entre les concentrations en PGD2
dans le tissu rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. Par contre on observe une
augmentation entre les âges 4 et 8 semaines (Figure 29) chez le rat Wistar seulement.
PGD2 Epididymal
0
1
2
3
4
5
6
1 2Age en semaines
PGD2
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
aba
b b
Figure 28: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou
C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
PGD2 Rétropéritonéal
0
1
2
3
4
5
6
1 2Age en semaines
PGD2
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
ab
b
bb
Figure 29: Concentrations en prostaglandine D2 dans le tissu adipeux rétropéritonéal de rats
Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
94
La Figure 30 montre qu’il n’y a aucune différence significative entre les concentrations de
PGE2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe par
contre une forte augmentation de la concentration tissulaire en PGE2 chez les animaux de 8
semaines. Aucune différence significative n’existe entre les concentrations de PGE2 dans le tissu
adipeux rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe par contre une forte
augmentation de la concentration tissulaire en PGE2 chez les animaux de 8 semaines (Figure 31).
PGE2 Epididymal
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
1 2Age en semaines
PGE2
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
a a
b b
Figure 30: Concentrations en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou
C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sou forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes indiquent
des différences significatives au seuil de p<0,05.
PGE2 Rétropéritonéal
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1 2Age en semaines
PGE2
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
aa
b b
Figure 31: Concentrations tissulaires en prostaglandine E2 dans le tissu adipeux
rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sou forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes indiquent
des différences significatives au seuil de p<0,05.
95
Il n’y a pas de différences entre les concentrations en 6-céto-PGF1α dans le tissu
épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe une forte augmentation entre les
animaux de 4 et 8 semaines (Figure 32). Il n’y a pas de différences entre les concentrations en 6
céto-PGF1α dans le tissu rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar de même âge. On observe une
forte augmentation entre les animaux de 4 et 8 semaines (Figure 33)
6-céto PGF1 alfa Epididymal
0
1,5
3
4,5
6
7,5
9
1 2Age en semaines
6 Cét
o PG
F1 al
fa (n
g/m
g tis
su)
Lou CWistar
4-5 semaines 8 semaines
a a
b b
Figure 32: Concentrations en 6 céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux épididymal de
rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
6-céto PGF1 alfa Rétropéritonéal
0
1,5
3
4,5
6
7,5
9
1 2Age en semaines
6 Cét
o PG
F1 al
fa (n
g/m
g tis
su)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
a a
bb
Figure 33: Concentrations en 6 céto-prostaglandine F1α dans le tissu adipeux rétropéritonéal
de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4). Des lettres différentes
indiquent des différences significatives au seuil de p<0,05.
96
La Figure 34 montre qu’il n’y a pas de différence significative entre les concentrations en
15dPGJ2, dans le tissu adipeux épididymal de rats Lou C et Wistar de même âge. La
concentration tissulaire en 15dPGJ2 a tendance à augmenter chez les rats Lou C en fonction de
l’âge alors qu’elle tend à diminuer chez les rats Wistar. Les mêmes différences s’observent dans
le tissu adipeux rétropéritonéal (Figure 35), que dans le tissu épididymal, les différences ne sont
cependant pas significatives.
15dPGJ2 Epididymal
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2Age en semaines
15dP
GJ2
(ng/
mg
tissu
)
Lou C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
Figure 34: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14 prostaglandine J2 dans le tissu adipeux
épididymal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM (n=4).
15dPGJ2 Rétropéritonéal
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2Age en semaines
15dP
GJ2
(ng/
mg
tissu
)
LOU C
Wistar
4-5 semaines 8 semaines
Figure 35: Concentrations en 15 déoxy-delta12, 14-prostaglandine J2 dans le tissu adipeux
rétropéritonéal de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8 semaines.
Les résultats sont exprimés sous formes de moyenne ± SEM (n=4).
97
IV.2.2 Dosage de la prostaglandine 15dPGJ2 dans l’urine de rat Lou C âgés de 4 et 8 semaines.
La Figure 36 montre qu’il n’existe aucune différence entre les concentrations de 15dPGJ2
d’urines provenant des rats Lou C et Wistar de mêmes âges. Par contre on observe une très forte
diminution de la concentration en 15dPGJ2 en fonction de l’âge chez les deux souches de rats.
Figure 36: Concentrations urinaires en 15dPGJ2 de rats Lou C et Wistar âgés de 4 et 8
semaines.
Les résultats sont exprimés sous formes de moyenne ± SEM (n=4). L’étoile indique une
différence significative au seuil de p<0,05 par rapport aux aux animaux âgés de 4 semaines.
Concentration urinaire en 15dPGJ2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
4 semaines 8 semainesAges en semaines
15dP
GJ2 (
ng/m
molcr
éatin
ine)
Lou CWistar
**
98
IV.3 Etudes in vitro
IV.3.1 Prostaglandine 15d PGJ2 et liaison covalente
Nous avons dans un premier temps dosé la quantité de la 15dPGJ2 libre (nmoles) après
l’incubation avec son récepteur nucléaire, le PPARgamma.
Tableau 1 : Prostaglandine deoxy-delta12,14-J2 libre dosée par GC-MS. Les valeurs sont
exprimés en moyenne ± SEM.
15dPGJ2 + PPARγ Sans incubation
(n=10)
15dPGJ2 + PPARγ Avec incubation
(n=10)
0,151 ±0,01
0,111 ±0,03 *
*P<0,05
99
IV.3.2 Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma
Au cours de ces expérimentations, PPARgamma a été incubé en présence de différentes
concentrations de 15dPGJ2. Dans ces conditions, on observe après lavage que la fixation
postérieure de rosiglitazone est d’autant plus faible que la concentration de 15dPGJ2 était élevée
lors de la pré incubation. Ces résultats suggèrent que la 15dPGJ2 se fixe de façon irréversible sur
le domaine de liaison du PPARgamma, empêchant la rosiglitazone de se fixer ultérieurement, car
les domaines de fixation sont déjà occupés par la 15dPGJ2. De façon très intéressante, on observe
que la constante d’inhibition de la fixation de 15dPGJ2 sur PPARgamma n’est pas modifiée par
l’addition de rosiglitazone après la pré-incubation, lorsque celle-ci est remplacée par un lavage.
Figure 37: Fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma après pré-incubation avec différentes
concentrations de 15dPGJ2 et lavage.
Gauche: PPARgamma a été pré-incubé pendant 90 min avec de la 15dPGJ2 à 10-8M (triangles),
10-7M (cercles), 10-6M (carrés) or 10-5M (triangles inversés). Droite: représentation logarythmique
de la liaison. La prostaglandine non fixée a été éliminée par centrifugation et les sites de fixation
inoccupés ont été mesurés par la [3H]-Rosiglitazone. L’évolution temporelle indique que la fixation
de la rosiglitazone sur PPARgamma après élimination de l’excès de prostaglandine, est rapide et
dépendante de la concentration initiale en 15dPGJ2. Droite Les valeurs finales de la constante de
dissociation de la [3H]-Rosiglitazone sont reportées selon la concentration initiale de 15dPGJ2
concentration. Dans ces conditions, la constante de dissociation est Ki = 453nM, ce qui est
comparable à celle trouvée par une méthode de fixation classique (Ki = 470 nM).
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
20
40
60
80
100
120
140
Time (min)
boun
d [3 H
]-R
osig
litaz
one
(%)
-8 -7 -6 -5 -40
20
40
60
80
100
120
140
log [15d-PGJ2] (M)
100
IV.3.3 Cinétique de dissociation de différents agonistes de PPAR
Lorsque PPARgamma est pré incubé en présence de deux agonistes différents (pioglitazone
ou 15dPGJ2), on observe que la rosiglitazone occupe la totalité des sites de fixation de PPAR
malgré la pré-incubation avec la pioglitazone, alors que sa fixation est très réduite après la pré-
incubation avec la 15dPGJ2. Ces résultats suggèrent l’existence d’une liaison irréversible entre la
15dPGJ2 et le PPARgamma.
Figure 38: Cinétique de dissociation de deux ligands de PPARgamma: pioglitazone et 15dPGJ2.
La fixation de la rosiglitazone sur PPARgamma a été mesurée après pré-incubation du
PPARgamma avec deux agonistes.
Les conditions d’incubation sont identiques à celles de la figure 1. PPARγ a été incubé en présence
de 10-5M de pioglitazone (triangles) ou de 15dPGJ2 à 10-5M (triangles inversés). La constante de
dissociation du 15dPGJ2 sur PPARgamma est très faible, tandis que celle de la pioglitazone est
rapide et complète.
IV.3.4 Analyse de spectrométrie de masse au MALDI-TOF
Puisque ces deux séries d’expériences suggèrent l’existence d’une liaison irréversible entre
15dPGJ2 et PPARgamma, nous avons testé cette hypothèse en recherchant en utilisant la
spectrométrie de masse MALDI-TOF, l’existence d’adduit entre PPARgamma et la 15dPGJ2.
0 20 40 60 80 100 120 140 1600
25
50
75
100
125
15d-PGJ2 10-5M
Pioglitazone 10-5M
Time (min)
boun
d [3 H
]-Ros
iglit
azon
e (%
)
101
A
B Figure 39: Analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des produits de digestion à la
trypsine d’un fragment du domaine de ligation (Ligand Binding Domain) de PPARgamma
couplé à la GST.
(A) Le fragment de GST-LBD (5µM) a d’abord été incubé en absence, (B) puis en présence de
15dPGJ2 (100µM). Une flèche indique la présence (B) d’un fragment correspondant à l’addition
d’une molécule de 15dPGJ2 par protéine, caractérisé l’ion m/z = 1314,699 (998,481 + 316,203).
699.0 1106.6 1514.2 1921.8 2329.4 2737.0Mass (m/z)
0
1.0E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC[BP = 2327.1, 9955]
2327.1272
2200.1120
1509.7424
1984.0093
998.48362329.13531314.6986
699.0 1106.2 1513.4 1920.6 2327.8 2735.0Mass (m/z)
0
6485.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC[BP = 2327.1, 6486]
2327.1213
1983.99811509.7447 2200.10751293.7377
998.4807
102
La première partie (A) de la Figure 39 représente les fragments de digestion du domaine de
liaison de PPARgamma seul c’est-à-dire en absence de 15dPGJ2, par la trypsine. Dans la seconde
partie (B) de la Figure 39 un nouveau peptide (m/z = 1314,699) apparaît qui correspond à
l’association d’un peptide de rapport m/z= 998,481, présent dans la partie A, plus la masse de la
15dPGJ2 (m/z=316,203). La seule explication possible de la présence de ce nouveau peptide est
qu’il existe une liaison forte entre la 15dPGJ2 et ce fragment issu de la digestion du domaine de
liaison de PPARgamma. Ces dernières expériences démontrent l’existence d’une liaison
covalente entre 15dPGJ2 et PPARgamma. D’une façon très intéressante, la masse du peptide
liant la 15dPGJ2 correspond aux effets de la trypsinolyse et produit la séquence IFQGCQFR qui
contient une cystéine pouvant former un adduit de Michael avec 15dPGJ2.
IV.3.5 Analyse de la 15dPGJ2 par GC-MS-MS
Nous avons détecté la 15dPGJ2 par GC-MS-MS. Cette technique est basée sur l’isolement
d’un ion parent [M-181]- (ion m/z 315). L’énergie de cet ion est ensuite augmentée afin d’induire
sa fragmentation par collision avec l’hélium présent dans la source d’ionisation. On observe
alors, dans la Figure 40A un ion fils majoritaire à m/z 271. En parallèle nous avons mesuré l’ion
275 qui est formé à partir de la 15dPGJ2 deuterée utilisée comme standard interne. La Figure 40B
représente les chromatogrammes des ions fils m/z 271 et m/z 275 correspondant respectivement à
la 15dPGJ2 et à la 15dPGJ2 deuterée. Ce chromatogramme montre bien le faible signe de la
15dPGJ2 par rapport à la molécule deuterée et en plus accompagné d’autres signes moins intense.
103
A
B
Figure 40: Chromatogramme obtenu par GC-MS-MS du standard interne 15dPGJ2 dérivé sous
forme de PFB-TMS.
(A) Le spectre de masse correspond aux ions fils qui résultent de la fragmentation de l’ion parent
m/z 315; l’ion 271 correspond au ion majoritaire pour la 15dPGJ2. (B) Les chromatogrammes des
ions fils m/z 271 et m/z 275 correspond respectivement à la 15dPGJ2 et à la 15dPGJ2 deuterée,
utilisée comme standard interne.
104
Dans la Figure 41, on observe les chromatogrammes des ions fils majoritaire à m/z 271 et m/z
275 correspondant respectivement à la 15dPGJ2 contenu dans les adipocytes 3T3-L1, et à la
15dPGJ2 deuterée, utilisée comme standard interne Dans ce chromatogramme on constate que le pic
est faible et qu’il se trouve avec d’autres petits pics, ce qui rend difficile la quantification de la
molécule.
Figure 41: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction des
adipocytes et sa dérivation sous forme de PFB-TMS.
Le dosage a été réalisé à partir d’adipocytes 3T3-L1 différenciés à j10.
105
La Figure 42 montre les chromatogrammes des ions fils majoritaire à m/z 271 et m/z 275
correspondant respectivement à la 15dPGJ2 contenue dans l’urine humaine, et à la 15dPGJ2
deuterée, utilisée comme standard interne Sur la partie supérieure de cette figure (échantillon
biologique), on observe la présence de deux pics aux temps de rétention voisins. Il n’y a pas de
doute que ces deux pics de même masse (271) ne sont pas diférenciés en GC-MS. Dans la partie
inférieure (correspondant aux ions de masse 275), on n’observe qu’un seul pic.
Figure 42: Chromatogramme de la 15dPGJ2 obtenu par GC-MS-MS après son extraction de
l’urine humaine et sa dérivation sous forme de PFB-TMS.
106
V DISCUSSION
107
Pendant des années, les adipocytes ont été considérés comme des cellules ayant une faible
activité métabolique. En effet, ces cellules semblaient seulement capables d’augmenter ou de
réduire leur taille en accord avec leur métabolisme lipidique global, résultant de l’équilibre entre
lipogenèse et lipolyse. Plus récemment, avec l’augmentation de la prévalence de l’obésité dans la
population occidentale, la recherche sur les tissus adipeux a connu un essor important. Parmi les
plus importantes découvertes, il a été montré que les adipocytes produisent de nombreux facteurs de
régulation dont des protéines parmi lesquelles les plus connues sont la leptine et l’adiponectine. Il
est intéressant de noter que ces protéines produites par le tissu adipeux agissent sur des tissus cibles
différents de leur site de production, ce qui correspond à la définition des hormones. Le tissu
adipeux a donc récemment acquis le statut de tissu sécréteur.
En premier lieu, nos résultats montrent que les adipocytes sont des cellules très réactives au
stress oxydant. Une première partie de notre travail expérimental a consisté en la validation du
stress oxydant dans les conditions de la culture cellulaire. Nous avons décidé de privilégier
l’utilisation de la glucose oxydase car elle permet une production régulière, prolongée et
parfaitement quantifiable de peroxyde d’hydrogène. Cette approche nous a semblé très supérieure à
l’addition directe de peroxyde d’hydrogène qui aurait nécessité des concentrations initiales
importantes qui auraient rapidement disparues au cours du temps. La glucose oxydase utilise le
glucose du milieu de culture sans toutefois priver les cellules de ce substrat essentiel (Figure 8). Elle
assure une production de peroxyde d’hydrogène dépendante de sa concentration initiale, ce qui
permet de générer un stress oxydant parfaitement quantifiable (Figure 9). Les effets de ce stress
oxydant ont été objectivés par la production de 4-HNE (Figure 11), un aldéhyde très réactif issu de
l’oxydation des acides gras de la série de n-6 (acides arachidonique et linoléique).
Le plus important résultat de cette étude montre que le stress oxydant diminue la production
d’adiponectine de manière dose-dépendante. Ce résultat a été confirmé peu de temps après notre
publication par Hattori et al., (2005). L’adiponectine est une adipokine produite principalement par
les adipocytes (Pineiro et al., 2005) et circulante dans le sang en concentration élevée.
L’adiponectine est anti-inflammatoire et possède des propriétés athéroprotectives et insulino-
sensibilisante. Sa concentration plasmatique est diminuée chez les patients et les modèles animaux
d’obésité (Arita et al., 1999), de diabète (Hotta et al., 2000) et ceux atteints de maladies cardio-
vasculaires (Kumada et al., 2003). Sachant que l’adiponectine exerce des effets protecteurs des
vaisseaux (Ouchi et al., 2001; Arita et al., 2002; Matsuda et al., 2002; Okamoto et al., 2002; Kubota
et al., 2002), on peut faire l’hypothèse que la diminution de l’adiponectinémie observée chez les
obèses et les diabétiques de type 2, participe aux complications vasculaires fréquentes chez ces
108
patients. Nos résultats montrent que le stress oxydant est responsable de la diminution de
production d’adiponectine par les adipocytes. Cette conclusion est confortée par l’augmentation du
stress oxydant observée chez les obèses (Furukawa et al., 2004) et les diabétiques de type 2
(Dandona et al., 2005).
La diminution de la production d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress
oxydant est confirmée par l’observation que cette diminution se produit également en réponse au 4-
HNE. En effet, une corrélation inverse entre la production de 4-HNE et la sécrétion d’adiponectine
a été trouvée. Nous avons montré que la production de cet aldéhyde très réactif est augmentée en
réponse à la glucose oxydase, ce qui pourrait faire de ce dernier un médiateur du stress oxydant.
Supposant que le volume intracellulaire des adipocytes soit de l’ordre de 8 µL/mg de protéines
(Whitesell et al., 1990), la concentration cellulaire en 4-HNE dans les conditions basales serait de
l’ordre de 0,1 à 1 µM. Selon nos résultats, elle serait presque doublée en réponse à la glucose
oxydase. Il est important de réaliser qu’avec la méthode que nous avons utilisée, seulement le 4-
HNE libre a été mesurée. Attendu que le 4-HNE est une molécule très réactive, il est probable que
la concentration mesurée soit sous-estimée par rapport à la quantité totale produite par cellule. Le 4-
HNE à 25 et 50 µM réduit sensiblement la production d’adiponectine, mais l’addition de 4-HNE en
une dose unique à l’extérieur de la cellule est de loin moins efficace que le 4-HNE produit sans
interruption à l’intérieur de la cellule. Par ailleurs, des travaux rapportent que les concentrations
plasmatiques de 4-HNE sont de l’ordre du micromolaire (0,47 ± 0,12 µM Selley et al., 1998; 0,65 ±
0,39 µM Strohmaier et al., 1995), ce qui est en accord avec nos résultats.
Les cellules adipeuses sont capables de produire de faibles concentrations de peroxyde
d’hydrogène, par exemple en réponse à l’insuline (Czech et al., 1974, May et al., 1977). Les
adipocytes possèdent une NADHP oxydase produisant du peroxyde d’hydrogène en réponse
l’insuline, mécanisme semblant faire partie de la propagation du signal insulinique (Krieger-Brauer
et Kather, 1992). D’autres types cellulaires produisent du peroxyde d’hydrogène en réponse à
différents facteurs de croissance et cytokines (Finkel, 2000). Du peroxyde d’hydrogène est
également produit par la semicarbazide sensitive amine oxydase (SSAO) et la monoamine oxydase
(MAO) présentes dans les adipocytes dont les activités sont capables de modifier la capture du
glucose par ces cellules (Visentin et al., 2005). De même qu’une activation prolongée de ces
systèmes peut générer des excès de peroxyde d’hydrogène et les altérations métaboliques qui s’en
suivent (Carpené et al., 2003), on peut faire l’hypothèse qu’un excès de peroxyde d’hydrogène
exogène est capable de générer des altérations métaboliques majeures comme une diminution de la
capture de glucose voire une diminution de la lipolyse.
109
Dans nos travaux, nous avons privilégié le 4-HNE qui est produit par la peroxydation des
hydroperoxydes des acides gras polyinsaturés de la famille des n-6. En réponse au stress oxydant,
les cellules produisent des hydroperoxydes d’acides gras à partir des AGPIs, principalement l’acide
arachidonique et l’acide linoléique. Parmi les dérivés hydroperoxydes, le 15-HpETE et le 13-
HpODE sont spontanément dérivés en 4-HNE. Le 4-HNE exogène peut aussi être capté par les
cellules, cela a été confirmé en utilisant des anticorps fluorescents contre le 4-HNE-His dans des
hépatocytes (Parola et al., 1998). L’incorporation de l’aldéhyde dans la cellule est réalisée en 5-10
min, avec le temps, il est possible de démontrer un tropisme nucléaire de l’aldéhyde (Parola et al.,
1998, Leonarduzzi et al., 2000). Un effet transcriptionel direct du 4-HNE ne peut pas être exclu, car
nos résultats démontrent une inhibition de l’expression des ARNm d’adiponectine en réponse au
stress oxydant. Le 4-HNE existe dans les conditions basales (Figure 10). Il s’agit de la première
démonstration que le 4-HNE est présent dans les cellules adipeuses et augmente en réponse au
stress oxydant. Le 4-HNE est un aldéhyde très réactif (Esterbauer et al., 1991) qui peut réagir de
multiples façons sur de nombreux sites cellulaires. Notamment, sa forte réactivité pour les
groupements SH et NH2 le prédestine à des interactions fortes avec certaines biomolécules.
Le 4-HNE est lipophile et rapidement diffusible. Quand il atteint le milieu extracellulaire où
lorsqu’il est produit par la membrane plasmique en réponse au stress oxydant, il est capable de
moduler l’expression génique (Poli et al., 2003). Le 4-HNE module l’activité de protéines kinases C
dans tous les types cellulaires où une migration intracellulaire a été observée. Le 4-HNE active la
voie de signalisation des MAP kinases, soit par l’intermédiaire des protéines kinases C soit par
l’activation des récepteurs EGF. La modulation de l’activator protein 1 (AP1) et peut-être la
fixation du 4-HNE sur NF-kB sont responsables de la modulation de l’expression de nombreux
gènes dont COX2 (Poli et al., 2003).
Des études précédentes ont montré que le 4-HNE joue un rôle d’inhibition de la respiration
mitochondriale liée au NADH, d’autre part il est établi que l’acide lipoïque est un cofacteur
commun à l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase et à la pyruvate déshydrogénase. Les études de
spectrométrie de masse ont suggéré que le 4-HNE réagit avec l’acide lipoïque pour former des
adduis de Michael (Humphries et Szweda, 1998). L’insuffisance en pyruvate déshydrogénase
provoqué par l’interaction de l’acide lipoïque avec le 4-HNE, pourrait résulter dans une
augmentation de la synthèse de lactate à partir du pyruvate, comme a été observé dans notre étude
(Figure 24). L’addition d’acide lipoïque dans les adipocytes 3T3-L1 diminue significativement la
production du lactate. Nos résultats apportent des évidences sur le mécanisme cellulaire proposé par
Humphries et Szweda, (1998). Plus généralement, l’acide lipoïque libre peut interagir sur des
110
nombreuses voies biochimiques (Bustamante et al., 1998). Des études récentes in vivo ont démontré
qu’une supplémentation en acide lipoïque, empêche le développement de l’hypertension et
l’hyperglycémie (Midaoui et al., 2003) ce qui suggère l’importance du stress oxydant dans les
complications de l’obésité.
La concentration plasmatique en adiponectine est significativement inférieure chez les patients
atteints de pathologies coronaires comparée aux témoins (Ouchi et al., 1999), de même chez les
sujets obèses comparés aux personnes normo-pondérées (Arita et al., 1999). Une perte de poids
entraîne une augmentation de la concentration plasmatique en adiponectine (Hotta et al., 2000). De
plus, une étroite corrélation a été observée entre l’adiponectinémie, l’obésité et la résistance à
l’insuline (Hotta et al., 2001; Weyer et al., 2001; Yamauchi et al., 2001). Par ailleurs, des doses
physiologiques d’adiponectine et leptine corrigent totalement la résistance à l’insuline de souris
lipoatrophiques (Yamauchi et al., 2001). La raison pour laquelle la concentration plasmatique en
adiponectine est réduite chez les patients obèses est encore inconnue. Le rôle du stress oxydant a été
suggéré dans de nombreux états pathologiques, parmi lesquels la résistance à l’insuline dans les
adipocytes et d’autres types cellulaires (Tirosh et al., 2001). Nos résultats démontrent que le stress
oxydant réduit nettement la sécrétion d’adiponectine par les adipocytes 3T3-L1. Plusieurs études
suggèrent l’existence d’un stress oxydant lié à l’obésité (Dandona et al., 2002; Dobrian et al., 2001;
Furukawa et al., 2004). Nos résultats soulignent le rôle du stress oxydant dans les complications de
l’obésité comme la résistance à l’insuline, le diabète du type 2, l’hypertension et l’athérosclérose,
ce qui pourrait être une cible thérapeutique importante, pour la prévention de telles complications.
Le stress oxydant est une importante cause du vieillissement (Holzenberger et al., 2003). Il est
impliqué dans la plupart des maladies métaboliques dégénératives comme les maladies
cardiovasculaires, le diabète de type 2 (Davi et al., 2004) et le cancer (Larsson et al., 2004).
L’obésité représente un important facteur de risque pour les maladies métaboliques, d’autre part, le
stress oxydant et l’inflammation sont liés aux pathologies associées à l’obésité. L’augmentation de
la concentration plasmatique en acides gras libres est une caractéristique des patients obèses. Une
concentration élevée en acides gras libres induit une inflammation chez les individus sains
(Tripathy et al., 2003). Parmi les nombreuses cytokines qui sont produites par le tissu adipeux, le
TNFα induit la lipolyse dans les adipocytes (Boeck et al., 1993; Green et al., 1994) et réduit la
concentration plasmatique d’adiponectine en diminuant l’expression du gène d’adiponectine. Dans
les adipocytes 3T3-L1 le traitement avec le TNFα mène à une translocation nucléaire du NF-kB
avec des effets sur l’expression sélective du gène (Ruan et al., 2002). En effet, le stress oxydant
peut activer le NF-kB par la phosphorylation de Ik, lequel est dissocié de sa forme active (Zhang et
111
al., 2001). Nos résultats ont démontré une diminution des ARNm en présence d’un stress oxydant
obtenu par ce modèle d’étude.
L’impossibilité pour les ligands de PPARgamma comme la rosiglitazone de se fixer sur ceux-
ci après une pré-incubation avec la 15dPGJ2 suggère une fixation irréversible de la 15dPGJ2 sur ce
PPARgamma. La démonstration indiscutable d’une liaison covalente entre PPARgamma et la
15dPGJ2 est apportée par la mise en évidence, après digestion à la trypsine, à l’aide de la
spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, d’un adduit formé entre un peptide de 8 acides
aminés (IFQGCQFR) et la prostaglandine. Cet octapeptide contient la seule cystéine du domaine de
liaison de PPARgamma, ce qui suggère que la prostaglandine se fixe probablement sur cet acide
aminé. Le fait que la 15dPGJ2 forme une liaison covalente avec une autre molécule n’est pas
exceptionnel, d’autres cas sont connus dans la littérature. Ainsi la 15dPGJ2 se lie de façon covalente
avec des protéines aussi différentes que IkB (Rossi et al., 2000), la sous-unité p50 de NF-kB
(Cernuda-Morollon et al., 2001), la thiorédoxine réductase (Moos et al., 2003), la thiorédoxine
(Shibata et al., 2003), et AP1 (Perez-Sala et al., 2003). Cette capacité de former des liaisons
covalentes est probablement due à la présence d’un centre électrophile de la 15dPGJ2 qui possède
une fonction cétone insaturée qui permet à la molécule de former un adduit de Michael avec les
résidus thiols (Murphy et Zazani et al., 2002). Nos résultats, comme ceux de la littérature montrent
que la fixation de la 15dPGJ2 par liaison covalente n’est pas un phénomène rare, ce qui souligne les
effets pléïotropes de cette prostaglandine.
Il est important de souligner que le dosage de la 15dPGJ2 ne prend en compte que la fraction
libre de cette prostaglandine. Il n’est en aucun cas possible de mesurer la fraction liée de 15dPGJ2
sans étapes spéciales visant à casser la liaison covalente formée. Il s’agit là d’une cause importante
de sous-estimation de la concentration cellulaire de 15dPGJ2, qui pourrait rendre compte de valeurs
très faibles trouvées par Bell-Parikh et al., (2003). La mise en évidence d’une liaison covalente de la
15dPGJ2 est de nature à reconsidérer le rôle de cette prostaglandine.
La fixation d’un ligand induit un changement de conformation de PPARgamma qui permet
son association avec RXR. L’existence d’une liaison covalente entre la 15dPGJ2 et PPARgamma
implique que ce changement de conformation est irréversible, ce qui laisse au récepteur nucléaire
plus de temps pour s’associer avec RXR. Bien que la constante d’association de la 15dPGJ2 sur
PPARgamma reste très informative, la liaison irréversible de la 15dPGJ2 sur PPARgamma change
considérablement les relations entre cette prostaglandine et les autres ligands de PPARgamma. En
112
effet, les ligands classiques qui ne se lient pas de façon covalente, peuvent être déplacés par d’autres
agonistes, ce qui n’est pas le cas de la 15dPGJ2.
Les différentes thialozidinediones en se fixant sur PPARgamma induisent l’expression de
nombreux gènes qui ne sont pas toujours les mêmes (Camp et al., 2000). Cette observation a donné
naissance au concept d’activation sélective modulée des PPARs (« selective PPAR modulator
model »), sans qu’une hypothèse ait été émise sur les mécanismes possibles d’une telle activation
sélective après la fixation de ligand sur PPARgamma (Olefsky, 2000). Nos résultats suggèrent que
selon la nature de la liaison entre PPARgamma et un ligand (par une liaison covalente ou non) les
activations des expressions géniques soient différentes. Ceci pourrait être possible soit par un
changement de conformation de PPAR différent selon la nature de la liaison avec le ligand
spécifique ou en assurant au complexe PPARgamma/ligand une durée de vie prolongée. Enfin,
l’existence d’une liaison covalente entre PPARgamma et son ligand pose la question de l’arrêt de
l’activation de PPARgamma et de son recyclage.
Une énergie importante a été dépensée au cours de notre travail de thèse pour doser la
15dPGJ2. Il s’est avéré après de nombreux dosages de prime abord satisfaisants que le signal que
nous obtenions n’était pas uniquement dépendant de cette prostaglandine (Figure 40). L’intérêt de
cette prostaglandine est d’avoir été décrite comme le ligand endogène de PPARgamma le plus
efficace. Ce PPARgamma est lui-même d’une efficacité redoutable car il est capable non seulement
d’induire la différenciation de fibroblastes en adipocytes mais également de provoquer la
dédifférenciation de myoblastes pour les faire se différencier en adipocytes. Notre hypothèse initiale
était que la 15dPGJ2 soit le signal de différenciation des cellules adipeuses souches. En effet,
l’augmentation de la masse grasse est le résultat de deux mécanismes intimement dépendants,
l’augmentation de la taille des adipocytes (mais cette augmentation ne peut pas être indéfinie) et
l’augmentation du nombre des adipocytes. Lorsque les adipocytes différenciés ont atteint une taille
critique, on observe une prolifération puis une différenciation des cellules souches jusqu’alors
dormantes. Une partie des cellules souches se différencie alors en préadipocytes qui se transforment
ensuite en adipocytes. Ces mécanismes de prolifération et de différenciation sont coordonnés. Le(s)
signal(ux) de prolifération et de différenciation sont jusqu’à présent inconnus. Les effets majeurs de
la 15dPGJ2 sur la différenciation adipocytaire faisaient de cette prostaglandine un candidat potentiel
pour la régulation in vivo de la différenciation adipocytaire. C’est pour cette raison que nous avons
entrepris de mesurer la 15dPGJ2 et d’autres prostaglandines dans les tissus adipeux de rats Lou C et
Wistar. Les rats Lou C ont la particularité de rester maigres et d’avoir des dépôts adipeux peu
développés, à la différence des rats Wistar qui deviennent obèses en vieillissant. Les résultats de ce
113
travail n’ont pas été totalement concluants, car il apparaît que le dosage de la 15dPGJ2 n’est pas
totalement fiable. En effet, les mesures en GC-MS-MS de cette prostaglandine montrent que le pic
obtenu après séparation n’est pas constitué d’une seule molécule (Figure 39). Il n’est donc pas
possible de certifier la quantité de 15dPGJ2 mesurée. Cependant, la présence de la 15dPGJ2 est
attestée par la présence des ions caractéristiques. Il s’agit d’un résultat important, surtout après ceux
de Bell-Parikh et al., (2003) qui a conclu que la 15dPGJ2 n’étant pas produite en quantité suffisante
ne devait pas être considérée comme un ligand de PPARgamma. Cette conclusion de Bell-Parikh
est à reconsidérer car les dosages ne prennent pas en compte la fraction de 15dPGJ2 qui se lie de
façon covalente au PPARgamma. Les travaux de quantification tissulaire de la 15dPGJ2 devront
être repris en faisant appel à des techniques plus sophistiquées que la simple GC-MS, comme par
exemple la GC-MS-MS.
114
VI CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
115
Notre premier résultat significatif concerne la diminution de la production d’adiponectine par
les adipocytes 3T3-L1 en réponse au stress oxydant. Cette observation permet de proposer pour la
première fois une hypothèse pour expliquer la diminution de l’adiponectinémie chez les obèses. En
effet, l’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux, l’adiponectine étant produite
principalement par les adipocytes, la diminution de l’adiponectinémie apparaît paradoxale.
L’existence d’une inflammation chronique de faible intensité accompagnée d’un stress oxydant
chez l’obèse conforte nos résultats et place le stress oxydant dans les acteurs majeurs des
complications métaboliques associées à l’obésité. La poursuite de ces travaux nécessitera de
mettre en évidence les voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la diminution de
l’adiponectine en réponse au stress oxydant. A plus long terme, la mise au point d’un modèle in
vivo de stress oxydant permettrait de mesurer ses effets métaboliques indépendamment des
complications dues à l’obésité. La mesure des effets du stress oxydant sur des sujets maigres et
obèses permettrait d’objectiver l’importance de la masse grasse dans les complications
métaboliques induites par le stress oxydant. Le second apport de nos travaux réside dans la
démonstration d’une liaison covalente entre la 15PGJ2 et PPARgamma. Cette démonstration
souligne l’importance de cette prostaglandine dont le rôle est minoré depuis les travaux
de Bell-Parikh et al. (2003) qui ont mesuré des concentrations très éloignées de la concentration
efficace. Dans la mesure où les méthodes de mesure de chromatographie gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse ne permettent de mesurer que la fraction libre de la prostaglandine, il est
probable que la quantité de 15dPGJ2 produite soit très fortement sous-évaluée, d’autant que
cette prostaglandine forme des liaisons covalentes avec de nombreuses molécules présentes dans la
cellule. A court terme, il semble très difficile d’espérer pouvoir mesurer la fraction fixée de
15dPGJ2 car ceci nécessiterait des traitements pour briser les liaisons covalentes avec, de toute
évidence, des rendements aléatoires et de toute façon difficiles à évaluer. Par ailleurs le
dosage de la 15dPGJ2 dans les milieux biologiques n’est pas encore totalement satisfaisant.
L’utilisation de technologies plus avancées du type spectrométrie de masse en tandem pourra peut-
être résoudre les problèmes rencontrés. Il nous apparaît au terme d’un travail important sur le
dosage des prostaglandines, qui n’a malheureusement pas pu être concrétisé en terme de
publication, que la pleine mesure de l’importance du rôle physiologique des prostaglandines ne sera
acquise que par une approche de type lipidomique, c’est–à-dire en prenant en compte les évolutions
des concentrations de toutes les prostaglandines, de leurs précurseurs et de leurs métabolites, dans
un contexte physiologique et/ou physiopathologique donné.
116
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
117
ABUMRAD N.A., EL-MAGHRABI M.R., AMRI E.Z., LOPEZ E., GRIMALDI P.A. Cloning of a rat adipocyte membrane protein implicated in binding or transport of long-chain fatty acids that is induced during preadipocyte differentiation. Homology with human CD36. J Biol Chem., 1993, vol 268(24), p.17665-17668. ABUMRAD N.A., PARK J.H., PARK C.R., Permeation of long-chain fatty acid into adipocytes. Kinetics, specificity, and evidence for involvement of a membrane protein. J Biol Chem., 1984, vol 259(14), p.8945-8953. ANGELOS M.G., KUTALA V.K., TORRES C.A., HE G., STONER J.D., MOHAMMAD M., PERIANNAN K. Hypoxic Reperfusion of the Ischemic Heart and Oxygen Radical Generation. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 2005, vol 26( ), p. ARITA Y., KIHARA S., OUCHI N., MAEDA K., KURIYAMA H., OKAMOTO Y., KUMADA M., HOTTA K., NISHIDA M., TAKAHASHI M., NAKAMURA T., SHIMOMURA I., MURAGUCHI M., OHMOTO Y., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell. Circulation., 2002, vol 105(24), p.2893-2898. ARITA Y., KIHARA S., OUCHI N., TAKAHASHI M., MAEDA K., MIYAGAWA J., HOTTA K., SHIMOMURA I., NAKAMURA T., MIYAOKA K., KURIYAMA H., NISHIDA M., YAMASHITA S., OKUBO K., MATSUBARA K., MURAGUCHI M., OHMOTO Y., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity. Biochem Biophys Res Commun., 1999, vol 257(1), p.79-83. AUBERT J., SAINT-MARC P., BELMONTE N., DANI C., NÉGREL R., AILHAUD G. Prostacyclin IP receptor up-regulates the early expression of C/EBPbeta and C/EBPdelta in peradipose cells. Mol. Cell. Endocrinol., 2000, vol 160, p.149-156. BACOT S., BERNOUD-HUBAC N., BADDAS N., CHANTEGREL B., DESHAYES C., DOUTHEAU A., LAGARDE M., GUICHARDANT M. Covalent binding of hydroxy-alkenals 4-HDDE, 4-HHE, and 4-HNE to ethanolamine phospholipid subclasses. J Lipid Res., 2003, vol 44(5), p.917-926. BAI Y., ZHANG S., KIM K.S., LEE J.K., KIM K.H. Obese gene expression alters the ability of 30A5 preadipocytes to respond to lipogenic hormones. J Biol Chem., 1996, vol 271(24), p.13939-13942. BANCI L., BENEDETTO M., BERTINI I., DEL CONTE R., PICCIOLI M., VIEZZOLI M.S. Solution structure of reduced monomeric Q133M2 copper, zinc superoxide dismutase (SOD). Why is SOD a dimeric enzyme?. Biochemistry., 1998, vol 37(34), p.11780-11791. BARONDEAU D.P., KASSMANN C.J., BRUNS C.K., TAINER J.A., GETZOFF E.D. Nickel superoxide dismutase structure and mechanism. Biochemistry., 2004, vol 43(25), p.8038-8047. BELL-PARIKH L.C., IDE T., LAWSON J.A., MCNAMARA P., REILLY M., FITZGERALD G.A. Biosynthesis of 15-deoxy-delta12,14-PGJ2 and the ligation of PPARgamma. J Clin Invest., 2003, vol 112(6), p.945-955.
118
BEN-AV P., CROFFORD L.J., WILDER R.L., HLA T. Induction of vascular endothelial growth factor expression in synovial fibroblasts by prostaglandin E and interleukin-1 : a potential mechanism for inflammatory angiogenesis. FEBS Lett., 1995, vol 372(1), p.83-87. BJORNTORP P. Adipose tissue distribution, eJIFCC, 2000 vol 12(3), [en ligne]. Disponible sur: <www.ifcc.org/ejifcc/vol12no3/adipose.HTM > (consulté le 30.09.2005). BOECK M.A., CHEN C., CUNNINGHAM-RUNDLES S. Altered immune function in a morbidly obese pediatric population. Ann N Y Acad Sci., 1993, vol 699, p.253-6. BOGOYEVITCH M.A., NG D.C., COURT N.W., DRAPER K.A., DHILLON A., ABAS L. Intact mitochondrial electron transport function is essential for signalling by hydrogen peroxide in cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol., 2000, vol 32, p.1469-1480. BRUUN J.M., LIHN A.S., VERDICH C., PEDERSEN S.B., TOUBRO S., ASTRUP A., RICHELSEN B. Regulation of adiponectin by adipose tissue-derived cytokines: in vivo and in vitro investigations in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab., 2003, vol 285(3), p.:E527-E533. BUSTAMANTE J., LODGE J.K., MARCOCCI L., TRITSCHLER H.J., PACKER L., RIHN B.H. Alpha-lipoic acid in liver metabolism and disease. Free Radic Biol Med., 1998, vol 24(6), p.1023-1039. CAMP H.S., LIO O., WISE S.C., HONG Y.H., FRANKOWSKI C.L., SHEN X., VANBOGELEN R., LEFF T. Differential activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by troglitazone and rosiglitazone. Diabetes., 2000, vol 49 (4), p.539-547. CAMPBELL S.E., TANDON N.N., WOLDEGIORGIS G., LUIKEN J.J., GLATZ J.F., BONEN A. A novel function for fatty acid translocase (FAT)/CD36: involvement in long chain fatty acid transfer into the mitochondria. J Biol Chem., 2004, vol 279(35), p.36235-36241. CAREY G.B. Mechanisms regulating adipocyte lipolysis. Adv Exp Med Biol., 1988, vol 441, p.157-170. CARPENE C., VISENTIN V., MORIN N., PREVOT D., SMIH F., ROUET P., JAYAT D., FONTANA E., LIZCANO J.M. Characterization of semicarbazide-sensitive amine oxidase in human subcutaneous adipocytes and search for novel functions. Inflammopharmacology., 2003, vol 11(2), p.119-126. CARR A.C., ZHU B.Z., FREI B. Potential antiatherogenic mechanisms of ascorbate (vitamin C) and alpha-tocopherol (vitamin E). Circ Res., 2000, vol 7(5), p.349-354. CARRIERE A., CARMONA M.C., FERNANDEZ Y., RIGOULET M., WENGER R.H., PENICAUD L., CASTEILLA L. Mitochondrial reactive oxygen species control the transcription factor CHOP-10/GADD153 and adipocyte differentiation: a mechanism for hypoxia-dependent effect. J Biol Chem., 2004,vol 279(39), p.40462-40469. CARRIERE A., FERNANDEZ Y., RIGOULET M., PENICAUD L., CASTEILLA L. Inhibition of preadipocyte proliferation by mitochondrial reactive oxygen species. FEBS Lett., 2003, vol 550(1-3), p.163-167.
119
CASES S., SMITH S.J., ZHENG Y.W., MYERS H.M., LEAR S.R., SANDE E., NOVAK S., COLLINS C., WELCH C.B., LUSIS A.J., ERICKSON S.K., FARESE R.V.JR. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, akey enzyme in triacylglycerol synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A., 1998, vol 95(22), p.13018-13023. CASES S., STONE S.J., ZHOU P., YEN E., TOW B., LARDIZABAL K.D., VOELKER T., FARESE R.V.JR. Cloning of DGAT2, a second mammalian diacylglycerol acyltransferase, and related family members. J Biol Chem., 2001, vol 276(42), p.38870-38876. CERNUDA-MOROLLON E., PINEDA-MOLINA E., CANADA F.J., PEREZ-SALA D. 15-Deoxy-Delta 12,14-prostaglandin J2 inhibition of NF-kappaB-DNA binding through covalent modification of the p50 subunit. J Biol Chem., 2001, vol 276, p.35530-35536. CHEN H.C., RAO M., SAJAN M.P., STANDAERT M., KANOH Y., MIURA A., FARESE R.V.JR., FARESE R.V. Role of adipocyte-derived factors in enhancing insulin signaling in skeletal muscle and white adipose tissue of mice lacking Acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase. Diabetes., 2004, vol 53(6), p.1445-1451. CHEN K., SUH J., CARR A.C., MORROW J.D., ZEIND J., FREI B. Vitamin C suppresses oxidative lipid damage in vivo, even in the presence of iron overload. Am J Physiol Endocrinol Metab., 2000, vol 279(6), p.E1406-1412. CINTI S. The adipose organ: morphological perspectives of adipose tissues. Proc Nutr Soc., 2001, vol 60(3), p.319-328. CIVELEK V.N., HAMILTON J.A., TORNHEIM K., KELLY K.L., CORKEY B.E. Intracellular pH in adipocytes: effects of free fatty acid diffusion across the plasma membrane, lipolytic agonists, and insulin. Proc Natl Acad Sci., 1996, vol 93(19), p.10139-10144. COMBS T.P., PAJVANI U.B., BERG A.H., LIN Y., JELICKS L.A., LAPLANTE M., NAWROCKI A.R., RAJALA M.W., PARLOW A.F., CHEESEBORO L., DING Y.Y., RUSSELL R.G., LINDEMANN D., HARTLEY A., BAKER G.R., OBICI S., DESHAIES Y., LUDGATE M., ROSSETTI L., SCHERER P.E. A transgenic mouse with a deletion in the collagenous domain of adiponectin displays elevated circulating adiponectin and improved insulin sensitivity. Endocrinology., 2004, vol 145(1), p.367-383. COOKE M.S., EVANS M.D., DIZDAROGLU M., LUNEC J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J., 2003, vol 17(10), p.1195-1214. CZECH M.P., LAWRENCE J.C.JR., LYNN W.S. Evidence for the involvement of sulfhydryl oxidation in the regulation of fat cell hexose transport by insulin. Proc Natl Acad Sci U S A., 1974, vol 71(10), p.4173-4177. DANDONA P., ALJADA A., CHAUDHURI A., MOHANTY P., GARG R. Metabolic syndrome: a comprehensive perspective based on interactions between obesity, diabetes, and inflammation. Circulation., 2005, vol 111(11), p.1448-1454. DANDONA P., ALJADA A. A rational approach to pathogenesis and treatment of type 2 diabetes mellitus, insulin resistance, inflammation, and atherosclerosis. Am J Cardiol., 2002, vol 90(5A), p.27G-33G.
120
DANG Z.C., AUDINOT V., PAPAPOULOS S.E., BOUTIN J.A., LOWIK C.W. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) as a molecular target for the soy phytoestrogen genistein. J Biol Chem., 2003, vol 278(2), p.962-967. DAVI G., FALCO A., PATRONO C. Determinants of F2-isoprostane biosynthesis and inhibition in man. Chem Phys Lipids., 2004, vol 128(1-2), p.149-163. DAVIES M.J. Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences. Biochem Biophys Res Commun., 2003, vol 305(3, p.761-770. DOBBINS R.L., SZCZEPANIAK L.S., ZHANG W., MCGARRY J.D. Chemical sympathectomy alters regulation of body weight during prolonged ICV leptin infusion. Am J Physiol Endocrinol Metab., 2003, vol 284(4), p.E778-E787. DOBRIAN A.D., DAVIES M.J., SCHRIVER S.D., LAUTERIO T.J., PREWITT R.L. Oxidative stress in a rat model of obesity-induced hypertension. Hypertension., 2001, vol 37(2), p.554-560. ERIKSSON H., RIDDERSTRALE M., DEGERMAN E., EKHOLM D., SMITH C.J., MANGANIELLO V.C., BELFRAGE P., TORNQVIST H. Evidence for the key role of the adipocyte cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase in the antilipolytic action of insulin. Biochim Biophys Acta., 1995, vol 1266(1), p.101-107. ESTERBAUER H., SCHAUR R.J., ZOLLNER H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic Biol Med., 1991, vol 11(1), p.81-128. FAJAS L., MIARD S., BRIGGS M.R., AUWERX J. Selective cyclo-oxygenase-2inhibitors impair adipocyte differntiation through inhibition of the clonal expansion phase. J. Lipid Res., 2003, vol 44, p.1652-1659. FARBER J.L., KYLE M.E., COLEMAN J.B. Mechanisms of cell injury by activated oxygen species. Lab Invest., 1990, vol 62(6), p.670-679. FERRY G., BRUNEAU V., BEAUVERGER P., GOUSSARD M., RODRIGUEZ M., LAMAMY V., DROMAINT S., CANET E., GALIZZI J.P., BOUTIN J.A. Binding of prostaglandins to human PPARgamma: tool assessment and new natural ligands. Eur J Pharmacol., 2001, vol 417(1-2), p.77-89. FINKEL T. Redox-dependent signal transduction. FEBS Lett., 2000, vol 476(1-2), p.52-54. FONG J.C., CHEN C.C., LIU D., TU M.S., CHAI S.P., KAO Y.S. Synergistic effect of arachidonic acid and cyclic AMP on glucose transport in 3T3-L1 adipocytes. Cell Signal., 1999, vol 11(1), p.53-58. FREDRIKSON G., STRALFORS P., NILSSON N.O., BELFRAGE P. Hormone-sensitive lipase of rat adipose tissue. Purification and some properties. J Biol Chem., 1981, vol 256(12), p.6311-6320. FRIDOVICH I. The trail to superoxide dismutase. Protein Sci., 1998, vol 7(12), p. 2688-2690.
121
FRUEBIS J., TSAO T.S., JAVORSCHI S., EBBETS-REED D., ERICKSON M.R., YEN F.T., BIHAIN B.E., LODISH H.F. Proteolytic cleavage product of 30-kDa adipocyte complement-related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss in mice. Proc Natl Acad Sci U S A., 2001, vol 98(4), p.2005-2010. FRUHBECK G., AGUADO M., MARTINEZ J.A. In vitro lipolytic effect of leptin on mouse adipocytes: evidence for a possible autocrine/paracrine role of leptin. Biochem Biophys Res Commun., 1997, vol 240(3), p.590-594. FURCHGOTT R.F. Endothelium-derived relaxing factor: discovery, early studies and identification as nitric oxide (Nobel lecture) Angew. Chem. Int. Ed., 1999, vol 38, p.1870-1880. FURUKAWA S., FUJITA T., SHIMABUKURO M., IWAKI M., YAMADA Y., NAKAJIMA Y., NAKAYAMA O., MAKISHIMA M., MATSUDA M., SHIMOMURA I. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest., 2004, vol 114(12), p.1752-1761. GIRARD J.P., BOUT J., SALORT D. Lipides et qualités du tissu adipeux, facteurs de variation. I. Lipides et qualités du tissu adipeux. II. Lipides et qualité du tissu musculaire. Journées Rech. Porcine en France., 1988, vol 20, p.255-278. GOLDSTEIN B.J., SCALIA R. Adiponectin: A novel adipokine linking adipocytes and vascular function. J Clin Endocrinol Metab., 2004, vol 89(6), p.2563-2568. GREEN A., DOBIAS S.B., WALTERS D.J., BRASIER A.R. Tumor necrosis factor increases the rate of lipolysis in primary cultures of adipocytes without altering levels of hormone-sensitive lipase. Endocrinology., 1994, vol 134(6), p.2581-2588. GUICHARDANT M., BERNOUD-HUBAC N., CHANTEGREL B., DESHAYES C., LAGARDE M. Aldehydes from n-6 fatty acid peroxydation. Effects of aminophospholipids. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids., 2002, vol 67(2-3), p.147-9. GUICHARDANT M., TAIBI-TRONCHE P., FAY L.B., LAGARDE M. Covalent modifications of aminophospholipids by 4-hydroxynonenal. Free Radic. Biol. Med., 1998, vol 25, p.1049-1056. GUTMANN I., WAHHLEFELD A. A methods of enzymatic analysis. 2e édition New York, NY: Academic Press Inc., 1974, p.1464. HAMILTON J.A. Fatty acid transport:difficult or easy? J. Lipid Res., 1998, vol 39, p.467-481. HATTORI Y., AKIMOTO K., GROSS S.S., HATTORI S., KASAI K. Angiotensin-II-induced oxidative stress elicits hypoadiponectinaemia in rats.Diabetologia., 2005, vol 48(6), p.1066-1074. HELDMAIER G., ORTMANN S., ELVERT R. Natural hypometabolism during hibernation and daily torpor in mammals. Respir Physiol Neurobiol., 2004, vol 141(3), p.317-329. HELMERSSON J., VESSBY B., LARSSON A., BASU S.Association of type 2 diabetes with cyclooxygenase-mediated inflammation and oxidative stress in an elderly population. Circulation., 2004, vol 109(14), p.1729-1734.
122
HINKLE P.C., BUTOW R.A., RACKER E., CHANCE B. Partial resolution of the enzymes catalazing oxidative phosphorylation.XV Reverse electron transfert in the flavin-cytochrome beta region of the respiration chain of beef heart submitochondrial particules. J. Biol. Chem., 1967, vol 242, p. 5169-5173. HLA T., A. RISTIMAKI S., APPLEBY J., BARRIOCANAL G. Cyclooxygenase gene expression in inflammation and angiogenesis. A. N. Y. Acad. Sci., 1993, vol 696(197), p.197-204. HOLZENBERGER M., DUPONT J., DUCOS B., LENEUVE P., GELOEN A., EVEN P.C., CERVERA P., LE BOUC Y. IGF-1 receptor regulates lifespan and resistance to oxidative stress in mice. Nature., 2003, vol 421(6919), p.:182-187. HONNOR R.C., DHILLON G.S., LONDOS C. cAMP-dependent protein kinase and lipolysis in rat adipocytes. II. Definition of steady-state relationship with lipolytic and antilipolytic modulators. J Biol Chem., 1985, vol 260(28), p.15130-8. HOTTA K., FUNAHASHI T., ARITA Y., TAKAHASHI M., MATSUDA M., OKAMOTO Y., IWAHASHI H., KURIYAMA H., OUCHI N., MAEDA K., NISHIDA M., KIHARA S., SAKAI N., NAKAJIMA T., HASEGAWA K., MURAGUCHI M., OHMOTO Y., NAKAMURA T., YAMASHITA S., HANAFUSA T., MATSUZAWA Y. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2000, vol 20(6), p.1595-1599. HOTTA K., FUNAHASHI T., BODKIN N.L., ORTMEYER H.K., ARITA Y., HANSEN B.C., MATSUZAWA Y. Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkeys. Diabetes., 2001, vol 20(5), p.1126-1133. HU E., LIANG P., SPIEGELMAN B.M. AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity. J Biol Chem., 1996, vol 271(18), p.10697-10703. HUG C., WANG J., AHMAD N.S., BOGAN J.S., TSAO T.S., LODISH H.F. T-cadherin is a receptor for hexameric and high-molecular-weight forms of Acrp30/adiponectin. Proc Natl Acad Sci U S A., 2004, vol 101(28), p.10308-10313. HUMPHRIES K.M., SZWEDA .LI. Selective inactivation of alpha-ketoglutarate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase: reaction of lipoic acid with 4-hydroxy-2-nonenal. Biochemistry., 1998, vol 37(45), p.15835-15841. HUMPHRIES K.M., YOO Y., SZWEDA L.I. Inhibition of NADH-linked mitochondrial respiration by 4-hydroxy-2-nonenal. Biochemistry., 1998, vol 37(2), p.552-557. ILES K.E., DICKINSON D.A., WATANABE N., IWAMOTO T., FORMAN H.J. AP-1 activation through endogenous H2O2 generation by alveolar macrophages Free Radic. Biol. Med., 2002, vol 32, p.1304-1313. ISHIKAWA Y., AKASAKA Y., ISHII T., YODA-MURAKAMI M., CHOI-MIURA NH., TOMITA M., ITO K., ZHANG L., AKISHIMA Y., ISHIHARA M., MURAMATSU M., TANIYAMA M. Changes in the distribution pattern of gelatin-binding protein of 28 kDa (adiponectin) in myocardial remodelling after ischaemic injury. Histopathology., 2003, vol 42(1), p.43-52.
123
IWASHIMA Y., KATSUYA T., ISHIKAWA K., OUCHI N., OHISHI M., SUGIMOTO K., FU Y., MOTONE M., YAMAMOTO K., MATSUO A., OHASHI K., KIHARA S., FUNAHASHI T., RAKUGI H., MATSUZAWA Y., OGIHARA T. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension., 2004, vol 43(6), p.1318-1323. JENKINS C.M., MANCUSO D.J., YAN W., SIMS H.F., GIBSON B., GROSS R.W. Identification, cloning, expression, and purification of three novel human calcium-independent phospholipase A2 family members possessing triacylglycerol lipase and acylglycerol transacylase activities. J Biol Chem., 2004, 279(47), p.48968-48975. JENSEN P.K. Antimycin-insensitive oxidation of succinate and reduced nicotinamide-adenine dinucleotide in electron-transport particles . I. Ph dependency and hydrogen peroxide formation. Biochem. Biophys. Acta., 1966, vol 122, p.157-166. JIANG C., TING A.T., SEED B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory citokines. Nature., 1998, vol 391, p.82-86. KADOWAKI T., HARA K., YAMAUCHI T., TERAUCHI Y., TOBE K., NAGAI R. Molecular mechanism of insulin resistance and obesity. Exp Biol Med., 2003, vol 228(10), p.1111-1117. KAKUMA T., LEE Y., HIGA M., WANG Z., PAN W., SHIMOMURA I., UNGER R.H. Leptin, troglitazone, and the expression of sterol regulatory element binding proteins in liver and pancreatic islets. Proc Natl Acad Sci U S A., 2000, vol 97(15), p.8536-8541. KAYNAR H., MERAL M., TURHAN H., KELES M., CELIK G., AKCAY F. Glutathione peroxidase, glutathione-S-transferase, catalase, xanthine oxidase,Cu-Zn superoxide dismutase activities, total glutathione, nitric oxide, and malondialdehyde levels in erythrocytes of patients with small cell and non-small cell lung cancer. Cancer Lett., 2005, vol 28;227(2), p.133-9. KEANEY J.FJR., LARSON M.G., VASAN R.S., WILSON P.W., LIPINSKA I., COREY D., MASSARO J.M., SUTHERLAND P., VITA J.A., BENJAMIN E.J. Obesity and systemic oxidative stress: clinical correlates of oxidative stress in the Framingham Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2003, vol 23(3), p.434-9. KHALIL A. [Molecular mechanisms of the protective effect of vitamin e against atherosclerosis] Can J Physiol Pharmacol., 2002, vol 80(7), p.662-669. KRIEGER-BRAUER H.I., KATHER H. Antagonistic effects of different members of the fibroblast and platelet-derived growth factor families on adipose conversion and NADPH-dependent H2O2 generation in 3T3 L1-cells. Biochem J., 1995, vol 307( Pt 2), p.549-556. KRIEGER-BRAUER H.I., KATHER H. Human fat cells possess a plasma membrane-bound H2O2-generating system that is activated by insulin via a mechanism by passing the receptor kinase. J Clin Invest., 1992, vol 89(3), p.1006-1013. KRIEGER-BRAUER H.I., MEDDA P.K., KATHER H. Insulin-induced activation of NADPH-dependent H2O2 generation in human dipocyte plasma membranes is mediated by Galphai2. J.Biol Chem., 1997, vol 272(15), p.10135-10143.
124
KUBOTA N., TERAUCHI Y., YAMAUCHI T., KUBOTA T., MOROI M., MATSUI J., ETO K., YAMASHITA T., KAMON J., SATOH H., YANO W., FROGUEL P., NAGAI R., KIMURA S., KADOWAKI T., NODA T. Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation. J Biol Chem., 2002, vol 19;277(29), p.25863-25866. KUMADA M., KIHARA S., SUMITSUJI S., KAWAMOTO T., MATSUMOTO S., OUCHI N., ARITA Y., OKAMOTO Y., SHIMOMURA I., HIRAOKA H., NAKAMURA T., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y., OSAKA CAD Study Group. Coronary artery disease. Association of hypoadiponectinemia with coronary artery disease in men. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2003, vol 23(1), p.85-89. KURUMBAIL R.G., STEVENS A.M., GIERSE J.K., MCDONALD J.J., STEGEMAN R.A., PAK J.Y., GILDEHAUS D., MAYASHIRO J.M., PENNING T D., SEIBERT K., ISAKSON P.C., STALLINGS W.C. Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents. Nature., 1996, vol 384 (6610), p.644-648. LAFONTAN M., BERLAN M. Fat cell alpha 2-adrenoceptors: the regulation of fat cell function and lipolysis. Endocr Rev., 1995, vol 16(6), p.716-38. LAFONTAN M. Fat cells: afferent and efferent messages define new approaches to treat obesity. Annu Rev Pharmacol Toxicol., 2005, vol 45, p.119-146. LANDO D., PEET D.J, WHELAN D.A., GORMAN J.J.,. WHITELAW M.L. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science., 2002, vol 295, p.858-861. LARSSON S.C., KUMLIN M., INGELMAN-SUNDBERG M., WOLK A. Dietary long-chain n-3 fatty acids for the prevention of cancer: a review of potential mechanisms. Am J Clin Nutr., 2004, vol 79(6), p.935-945. LEONARDUZZI G., ARKAN M.C., BASAGA H., CHIARPOTTO E., SEVANIAN A., POLI G. Lipid oxidation products in cell signaling. Free Radic Biol Med., 2000, vol 1;28(9), p.1370-1378. LEPAK N.M., SERRERO G. Inhibition of adipose differentiation by 9 alpha, 11beta-prostaglandin F2 alpha. Prostaglandins., 1993, vol 46, p.511-517. LIVINGSTON J.N., GURNY P.A., LOCKWOOD D.H. Insulin-like effects of polyamines in fat cells. Mediation by H2O2 formation. J Biol Chem., 1977, vol 252(2), p.560-562. LONDOS C., HONNOR R.C., DHILLON G.S. cAMP-dependent protein kinase and lipolysis in rat adipocytes. III. Multiplemodes of insulin regulation of lipolysis and regulation of insulin responses by adenylate cyclase regulators. J Biol Chem., 1985, vol 260(28), p.15139-15145. MAEDA K., OKUBO K., SHIMOMURA I., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y., MATSUBARA K. cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen-like factor, apM1 (AdiPose Most abundant Gene transcript 1).Biochem Biophys Res Commun., 1996, vol 221(2), p.286-289.
125
MAEDA N., SHIMOMURA I., KISHIDA K., NISHIZAWA H., MATSUDA M., NAGARETANI H., FURUYAMA N., KONDO H., TAKAHASHI M., ARITA Y., KOMURO R., OUCHI N., KIHARA S., TOCHINO Y., OKUTOMI K., HORIE M., TAKEDA S., AOYAMA T., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nat Med., 2002, vol 8(7), p.731-737. MAEDA N., TAKAHASHI M., FUNAHASHI T., KIHARA S., NISHIZAWA H., KISHIDA K., NAGARETANI H., MATSUDA M., KOMURO R., OUCHI N., KURIYAMA H., HOTTA K., NAKAMURA T., SHIMOMURA I., MATSUZAWA Y. PPARgamma ligands increase expression and plasma concentrations of adiponectin, an adipose-derived protein. Diabetes., 2001, vol 50(9), p.2094-2099. MAHADEV K., MOTOSHIMA H., WU X., RUDDY J.M., ARNOLD R.S., CHENG G., LAMBETH J.D., GOLDSTEIN B.J. The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulin-stimulated generation of H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol., 2004, vol 24(5), p.1844-1854. MARNETT LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis., 2000, vol 21(3), p.361-370. MATÉS J.M., PEREZ-GOMEZ C., NUNEZ DE CASTRO I. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem., 1999, vol 32(8), p.595-603. MATSUDA M., SHIMOMURA I., SATA M., ARITA Y., NISHIDA M., MAEDA N., KUMADA M., OKAMOTO Y., NAGARETANI H., NISHIZAWA H., KISHIDA K., KOMURO R., OUCHI N., KIHARA S., NAGAI R., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Role of adiponectin in preventing vascular stenosis. The missing link of adipo-vascular axis. J Biol Chem., 2002, vol 277(40), p.37487-37491. MCCORD J.M., FRIDOVICH I. Superoxide dismutase. An enzymatic function for erythrocuprin (hemocuprein). J. Biol. Chem., 1969, vol 244, p.6049-6055. MEZZETTI A., PIERDOMENICO S.D., COSTANTINI F., ROMANO F., DE CESARE D., CUCCURULLO F., IMBASTARO T., RIARIO-SFORZA G., DI GIACOMO F., ZULIANI G., FELLIN R. Copper/zinc ratio and systemic oxidant load: effect of aging and aging-related degenerative diseases. Free Radic Biol Med., 1998, vol 25(6), p.676-681. MIDAOUI A.E., ELIMADI A., WU L., HADDAD P.S., DE CHAMPLAIN J. Lipoic acid prevents hypertension, hyperglycemia, and the increase in heart mitochondrial superoxide production. Am J Hypertens., 2003, vol 16(3), p.173-179. MINOKOSHI Y., KIM Y.B., PERONI O.D., FRYER L.G., MULLER C., CARLING D., KAHN B.B. Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase. Nature., 2002, vol 415(6869), p.339-343. MOOS P.J., EDES K., CASSIDY P., MASSUDA P., FITZPATRICK F.A. Electrophilic prostaglandins and lipid aldehydes repress redox-sensitive transcription factors p53 and hypoxia-inducible factor by impairing the selenoprotein thioredoxin reductase, J. Biol. Chem., 2003, vol 278, p.745-750. MOUMEN R., NOUVELOT A., DUVAL D., LECHEVALIER B., VIADER F. Plasma superoxide dismutase and glutathione peroxidase activity in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci., 1997, vol 151(1), p.35-39.
126
MURPHY R.C., ZARINI S. Glutathione adducts of oxyeicosanoids, Prostaglandins Other Lipid Mediat., 2002, vol 68-69, p.471-482. NAKANO Y., TOBE T., CHOI-MIURA N.H., MAZDA T., TOMITA M. Isolation and characterization of GBP28, a novel gelatin-binding protein purified from human plasma. J Biochem (Tokyo)., 1996, vol 120(4), p.803-812. NEGESHI M., KOIZUMI A., ICHIKAWA A. Biological actions of delta 12 prostaglandin J2. J. Lipid Mediat Cell Signal., 1995, vol 12(23), p.443-448. NEWBY F.D., DIGIROLAMO M., COTSONIS G.A., KUTNER M.H. Model of spontaneous obesity in aging male Wistar rats. Am J Physiol., 1990, 259(6 Pt 2), p.R1117-R1125. NICHOLLS D.G., LOCKE R.M. Thermogenic mechanisms in brown fat. Physiol Rev., 1984, vol 64(1), p.1-64. OHASHI K., OUCHI N., KIHARA S., FUNAHASHI T., NAKAMURA T., SUMITSUJI S., KAWAMOTO T., MATSUMOTO S., NAGARETANI H., KUMADA M., OKAMOTO Y., NISHIZAWA H., KISHIDA K., MAEDA N., HIRAOKA H., IWASHIMA Y., ISHIKAWA K., OHISHI M., KATSUYA T., RAKUGI H., OGIHARA T., MATSUZAWA Y. Adiponectin I164T mutation is associated with the metabolic syndrome and coronary artery disease. J Am Coll Cardiol., 2004, vol 43(7), p.:1195-200. OKAMOTO Y., KIHARA S., OUCHI N., NISHIDA M., ARITA Y., KUMADA M., OHASHI K., SAKAI N., SHIMOMURA I., KOBAYASHI H., TERASAKA N., INABA T., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Adiponectin reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation., 2002, vol 106(22), p.2767-70. OLEFSKY J.M. Treatment of insulin resistance with peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. J. Clin. Invest., 2000, vol 106, p. 467-472. OLUSI S.O. Obesity is an independent risk factor for plasma lipid peroxidation and depletion of erythrocyte cytoprotectic enzymes in humans. Int J Obes Relat Metab Disord., 2002, vol 26(9), p.1159-1164. OUCHI N., KIHARA S., ARITA Y., MAEDA K., KURIYAMA H., OKAMOTO Y., HOTTA K., NISHIDA M., TAKAHASHI M., NAKAMURA T., YAMASHITA S., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Novel modulator for endothelial adhesion molecules: adipocyte-derived plasma protein adiponectin. Circulation., 1999, vol 100(25), p.2473-2476. OUCHI N., KIHARA S., ARITA Y., NISHIDA M., MATSUYAMA A., OKAMOTO Y., ISHIGAMI M., KURIYAMA H., KISHIDA K., NISHIZAWA H., HOTTA K., MURAGUCHI M., OHMOTO Y., YAMASHITA S., FUNAHASHI T., MATSUZAWA Y. Adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, suppresses lipid accumulation and class A scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages. Circulation., 2001, vol 103(8), p.1057-1063. OUCHI N., KIHARA S., FUNAHASHI T., NAKAMURA T., NISHIDA M., KUMADA M., OKAMOTO Y., OHASHI K., NAGARETANI H., KISHIDA K., NISHIZAWA H., MAEDA N., KOBAYASHI H., HIRAOKA H., MATSUZAWA Y. Reciprocal association of C-reactive protein with adiponectin in blood stream and adipose tissue. Circulation., 2003, vol 107(5), p.671-674.
127
PAJVANI U.B., DU X., COMBS T.P., BERG A.H., RAJALA M.W., SCHULTHESS T., ENGEL J., BROWNLEE M., SCHERER P.E. Structure-function studies of the adipocyte-secreted hormone Acrp30/adiponectin. Implications fpr metabolic regulation and bioactivity. J Biol Chem., 2003, vol 278(11), p.9073-9085. PAJVANI U.B., HAWKINS M., COMBS T.P., RAJALA M.W., DOEBBER T., BERGER J.P., WAGNER J.A., WU M., KNOPPS A., XIANG A.H., UTZSCHNEIDER K.M., KAHN S.E., OLEFSKY J.M., BUCHANAN T.A., SCHERER P.E. Complex distribution, not absolute amount of adiponectin, correlates with thiazolidinedione-mediated improvement in insulin sensitivity. J Biol Chem., 2004, vol 279(13), p.12152-12162. PAROLA M., BELLOMO G., ROBINO G., BARRERA G., DIANZANI M.U. 4-Hydroxynonenal as a biological signal: molecular basis and pathophysiological implications. Antioxid Redox Signal., 1999, vol 1(3), p.255-284. PAROLA M., ROBINO G., MARRA F., PINZANI M., BELLOMO G., LEONARDUZZI G., CHIARUGI P., CAMANDOLA S., POLI G., WAEG G., GENTILINI P., DIANZANI M.U. HNE interacts directly with JNK isoforms in human hepatic stellate cells. J Clin Invest., 1998, vol 102(11), p.1942-1950. PEREZ-SALA D., CERNUDA-MOROLLON E., CANADA F.J. Molecular basis for the direct inhibition of AP-1 DNA binding by 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2, J Biol Chem., 2003, vol 278, p.51251-51260. PICOT D., LOLL P.J., GARAVITO R.M. The X-ray crystal structure of the membrane protein protaglandin H2 synthase-1. Nature., 1994, vol 367(6460), p.243-249. PINEIRO R., IGLESIAS M.J., GALLEGO R., RAGHAY K., EIRAS S., RUBIO J., DIEGUEZ C., GUALILLO O., GONZALEZ-JUANATEY J.R., LAGO F. Adiponectin is synthesized and secreted by human and murine cardiomyocytes. FEBS Lett., 2005, vol 579(23), p.5163-5169. PISCHON T., GIRMAN C.J., HOTAMISLIGIL G.S., RIFAI N., HU F.B., RIMM E.B. Plasma adiponectin levels and risk of myocardial infarction in men. JAMA., 2004, vol 291(14), p.1730-1737. PODEROSO J.J., CARRERAS M.C., LISDERO C., RIOBO N., SCHOPFER F., BOVERIS A. Nitric oxide inhibits electron transfer superoxide production in rat heart mitochondria and submitochondrial particles. Arch. Biochem. Biophys., 19963, 28, p.85-92. POHL J., RING A., EHEHALT R., HERRMANN T., STREMMEL W. New concepts of cellular fatty acid uptake: role of fatty acid transport proteins and of caveolae. Proc Nutr Soc., 2004, vol 63(2), p.259-262. POLI G., SCHAUR R.J. 4-hydroxynonenal in the pathomechanisms of oxidative stress IUBMB life., 2000, vol 50, p.315-321. PORTER, N.A., CADWELL, S.E., MILLS K.A. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids. Lipids., 1995, vol 30, p.277-290.
128
PRYOR, W.A., PORTER, N.A. Suggested mechanisms for the production of 4-hydroxy-2-nonenal from the autoxidation of polyunsaturated fatty acids Free Radic. Biol. Med., 1990, vol 8, p.541-543. RAJALA M.W., OBICI S., SCHERER P.E., ROSSETTI L. Adipose-derived resistin and gut-derived resistin-like molecule-beta selectively impair insulin action on glucose production. J Clin Invest., 2003, vol 111(2), p.225-230. RAMACHANDRAN A., MOELLERING D., GO Y.M., SHIVA S., LEVONEN A.L., JO H., PATEL R.P., PARTHASATHY S.. DARLEY-USMAR V.M. Activation of c-Jun N-terminal kinase and apoptosis in endothelial cells mediated by endogenous generation of hydrogen peroxide. Biol. Chem., 2002, vol 383, p.693-701. REFSGAARD H.H., TSAI L., STADTMAN E.R. Modifications of proteins by polyunsaturated fatty acid peroxidation products. Proc Natl Acad Sci U S A., 2000, vol 97(2), p.611-616. REICHERT M., EICK D. Analysis of cell cycle arrest in aadipocyte differentiation. Oncogene., 1999, vol 18, p.459-466. REICHHELD J.P., MEYER E., KHAFIF M., BONNARD G., MEYER Y. AtNTRB is the major mitochondrial thioredoxin reductase in Arabidopsisthaliana. FEBS Lett., 2005, vol 579(2), p.337-342. RICHELSEN B. Prostaglandin in adipose tissue – sith special reference to triglyceride metabolism Dan. Med. Bull., 1991, vol 38, p.228-244. RISTIMAKI A., NARKO K., HLA T. Down-regulation of cytokine induced cyclo-oxygenase-2 mRNA transcript isoforms by dexamethasone : evidence for post-translational regulation. Biochem. J., 1996, vol 318, p.325-331. ROSSI A., KAPAHI P., NATOLI G., TAKAHASHI T., CHEN Y., KARIN M., SANTORO M.G. Anti-inflammatory cyclopentenone prostaglandins are direct inhibitors of IkappaB kinase. Nature., 2000, vol 403(6765), p.103-108. RUAN H., HACOHEN N., GOLUB T.R., VAN PARIJS L., LODISH H.F. Tumor necrosis factor-alpha suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-alpha is obligatory. Diabetes., 2002, vol 51(5), p.1319-1336. SANTORO M.G., BENEDETTO A., CARRUBA G., GARACI E.,. JAFFE B.M. Prostaglandin A compounds as antiviral agents. Science., 1980, vol 209, p.1032-1034. SCHAFFER J.E., LODISH H.F. Expression cloning and characterization of a novel adipocyte long chain fatty acid transport protein. Cell., 1994, vol 79(3), p.427-436. SCHERER P.E., WILLIAMS S., FOGLIANO M., BALDINI G., LODISH H.F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem., 1995, vol 270(45), p.26746-26749. SCHUSTER V.L. Molecular mechanisms of prostaglandin transport. Annu Rev. Physiol,. 1998, vol 60(221), p.221-242.
129
SCORTEGAGNA M., DING K., OKTAY Y., GAUR A., THURMOND F., YAN L.J., MARCK B.T., MATSUMOTO A.M., SHELTON J.M., RICHARDSON J.A., BENNETT M.J., GARCIA J.A. Multiple organ pathology, metabolic abnormalities and impaired homeostasis of reactive oxygen species in Epas1-/- mice. Nat Genet., 2003, vol 35(4), p.331-40. SELLEY M.L. (E)-4-hydroxy-2-nonenal may be involved in the pathogenesis of Parkinson's disease. Free Radic Biol Med., 1998, vol 25(2), p.169-174. SHIBATA T., YAMADA T., ISHII T., KUMAZAWA S., NAKAMURA H., MASUTANI H., YODOI J., UCHIDA K. Thioredoxin as a molecular target of cyclopentenone prostaglandins, J Biol Chem., 2003, vol 278, p.26046-26054. SHILLABEER G., KUMAR V., TIBBO E., LAU D.C. Arachidonic acid metabolites of the lipoxygenase as well as the cyclooxygenase pathwayy may be involved in regulating preadipocyte differentiation. Metabolism., 1998, vol 47, p.461-466. SHIMBA S., WADA T., HARA S., TEZUKA M. EPAS1 promotes adipose differentiation in 3T3-L1 cells. J Biol Chem., 2004, 279(39), p.40946-53. SJOSTROM L. Adult human adipose tissue cellularity and metabolism with special reference to obesity and fatty acid synthesis de novo. Acta Med Scand Suppl., 1972, vol 544, p.1-52. SMITH W.L., GARAVITO R.M., DEWITT D.L. Prostaglandin endoperoxide H synthases (cyclooxygenases)-1 and -2. J Biol Chem., 1996, vol 271(52), p.33157-60. STADTMAN E.R., OLIVER C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences. J Biol Chem., 1991, vol 266(4), p.2005-2008. STENTZ F.B., UMPIERREZ G.E., CUERVO R., KITABCHI A.E. Proinflammatory cytokines, markers of cardiovascular risks, oxidative stress, and lipid peroxidation in patients with hyperglycemic crises. Diabetes., 2004, vol 53(8), p.2079-286. STEPPAN C.M., BAILEY S.T., BHAT S., BROWN E.J., BANERJEE R.R., WRIGHT C.M., PATEL H.R., AHIMA R.S., LAZAR M.A. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature., 2001, vol 409(6818), p.307-312. STEPPAN C.M., BROWN E.J., WRIGHT C.M., BHAT S., BANERJEE R.R., DAI C.Y., ENDERS G.H., SILBERG D.G., WEN X., WU G.D., LAZAR M.A. A family of tissue-specific resistin-like molecules. Proc Natl Acad Sci U S A., 2001, vol 98(2), p.502-506. STONE S.J., MYERS H.M., WATKINS S.M., BROWN B.E., FEINGOLD K.R., ELIAS P.M., FARESE R.V.JR. Lipopenia and skin barrier abnormalities in DGAT2-deficient mice. J Biol Chem., 2004, vol 279(12), p.11767-11776. STREMMEL W., STROHMEYER G., BORCHARD F., KOCHWA S., BERK P.D. Isolation and partial characterization of a fatty acid binding protein in rat liver plasma membranes. Proc Natl Acad Sci., 1985, vol 82(1), p.4-8. STREMMEL W. Fatty acid uptake by isolated rat heart myocytes represents a carrier-mediated transport process. J Clin Invest., 1988, vol 81(3), p.844-852.
130
STROHMAIER H., HINGHOFER-SZALKAY H., SCHAUR R.J. Detection of 4-hydroxynonenal (HNE) as a physiological component in human plasma. J Lipid Mediat Cell Signal., 1995, vol 11(1), p.51-61. SUZUKI K., ITO Y., OCHIAI J., KUSUHARA Y., HASHIMOTO S., TOKUDOME S., KOJIMA M., WAKAI K., TOYOSHIMA H., TAMAKOSHI K., WATANABE Y., HAYAKAWA N., MARUTA M., WATANABE M., KATO K., OHTA Y., TAMAKOSHI A. Relationship between obesity and serum markers of oxidative stress and inflammation in Japanese. Asian Pac J Cancer Prev., 2003, vol 4(3), p.259-266. TAN K.C., XU A., CHOW W.S., LAM M.C., AI V.H., TAM S.C., LAM K.S. Hypoadiponectinemia is associated with impaired endothelium-dependent vasodilation. J Clin Endocrinol Metab., 2004, vol 89(2), p.765-769. TIROSH A., RUDICH A., POTASHNIK R., BASHAN N. Oxidative stress impairs insulin but not platelet-derived growth factor signalling in 3T3-L1 adipocytes. Biochem J., 2001, vol 355(3), p.757-63. TONTONOZ P., NAGY L., ALVAREZ J.G., THOMAZY V.A., EVANS R.M. PPARgamma promotes monocyte/macrophage differntiation and uptake of oxidized LDL. Cell., 1995, vol 93(2), p.241-252. TRIGATTI B.L., GERBER G.E. The effect of intracellular pH on long-chain fatty acid uptake in 3T3-L1 adipocytes: evidence that uptake involves the passive diffusion of protonated long-chain fatty acids across the plasma membrane. Biochem J., 1996, vol 313(2), p.487-494. TRIPATHY D., MOHANTY P., DHINDSA S., SYED T., GHANIM H., ALJADA A., DANDONA P. Elevation of free fatty acids induces inflammation and impairs vascular reactivity in healthy subjects. Diabetes., 2003, vol 52(12), p.2882-2887. URAKAWA H., KATSUKI A., SUMIDA Y., GABAZZA E.C., MURASHIMA S., MORIOKA K., MARUYAMA N., KITAGAWA N., TANAKA T., HORI Y., NAKATANI K., YANO Y., ADACHI Y. Oxidative stress is associated with adiposity and insulin resistance in men. J Clin Endocrinol Metab., 2003, vol 88(10), p.4673-4676. VAN KUIJK F.J., SIAKOTOS A.N., FONG L.G., STEPHENS R.J., THOMAS D.W. Quantitative measurement of 4-hydroxyalkenals in oxidized low-density lipoprotein by gas chromatography-mass spectrometry. Anal Biochem., 1995, vol 224(1), p.420-424. VILLENA J.A., ROY S., SARKADI-NAGY E., KIM K.H., SUL H.S. Desnutrin, an adipocyte gene encoding a novel patatin domain-containing protein, is induced by fasting and glucocorticoids: ectopic expression of desnutrin increases triglyceride hydrolysis. J Biol Chem., 2004, vol 279(45), p.47066-47075. VISENTIN V., BOUR S., BOUCHER J., PREVOT D., VALET P., ORDENER C., PARINI A., CARPENE C. Glucose handling in streptozotocin-induced diabetic rats is improved by tyramine but not by the amine oxidase inhibitor semicarbazide. Eur J Pharmacol., 2005, vol 522(1-3), p.139-146. VISENTIN V., PREVOT D., MARTI L., CARPENE C. Inhibition of rat fat cell lipolysis by monoamine oxidase and semicarbazide-sensitive amine oxidase substrates. Eur J Pharmacol., 2003, vol 466(3), p.235-43.
131
WEISBERG S.P., MCCANN D., DESAI M., ROSENBAUM M., LEIBEL R.L., FERRANTE A.W.JR. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest., 2003, vol 112(12), p.1796-808. WEYER C., FUNAHASHI T., TANAKA S., HOTTA K., MATSUZAWA Y., PRATLEY R.E., TATARANNI P.A. Hypoadiponectinemia in obesity and type 2 diabetes: close association with insulin resistance and hyperinsulinemia. J Clin Endocrinol Metab., 2001, vol 86(5), p.1930-1935. WHITESELL R.R., REGEN D.M., PELLETIER D., ABUMRAD N.A. Evidence that downregulation of hexose transport limits intracellular glucose in 3T3-L1 fibroblasts. Diabetes., 1990, vol 39(10), p.1228-1234. WISEMAN H., HALLIWELL B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem J., 1996, vol 313(1), p.17-29. WOLIN M.S., AHMAD M., GUPTE S.A. Oxidant and redox signaling in vascular oxygen sensing mechanisms: basic concepts, current controversies, and potential importance of cytosolic NADPH. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 2005, vol 289(2), p.L159-L173. WOLIN M.S. Reactive oxygen species and vascular signal transduction mechanisms. Microcirculation., 1996, vol 3(1), p.1-17. WOLTERS M., HERMANN S., GOLF S., KATZ N., HAHN A. Selenium and antioxidant vitamin status of elderly German women. Eur J Clin Nutr., 2005, vol 24; YAMAUCHI T., KAMON J., ITO Y., TSUCHIDA A., YOKOMIZO T., KITA S., SUGIYAMA T., MIYAGISHI M., HARA K., TSUNODA M., MURAKAMI K., OHTEKI T., UCHIDA S., TAKEKAWA S., WAKI H., TSUNO N.H., SHIBATA Y., TERAUCHI Y., FROGUEL P., TOBE K., KOYASU S., TAIRA K., KITAMURA T., SHIMIZU T., NAGAI R., KADOWAKI T. Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects. Nature., 2003, vol 423(6941), p.762-9. Erratum in: Nature., 2004, vol 431(7012), p.1123. YAMAUCHI T., KAMON J., WAKI H., IMAI Y., SHIMOZAWA N., HIOKI K., UCHIDA S., ITO Y., TAKAKUWA K., MATSUI J., TAKATA M., ETO K., TERAUCHI Y., KOMEDA K., TSUNODA M., MURAKAMI K., OHNISHI Y., NAITOH T., YAMAMURA K., UEYAMA Y., FROGUEL P., KIMURA S., NAGAI R., KADOWAKI T. Globular adiponectin protected ob/ob mice from diabetes and ApoE-deficient mice from atherosclerosis. J Biol Chem., 2003, vol 278(4), p.2461-2468. YAMAUCHI T., KAMON J., WAKI H., TERAUCHI Y., KUBOTA N., HARA K., MORI Y., IDE T., MURAKAMI K., TSUBOYAMA-KASAOKA N., EZAKI O., AKANUMA Y., GAVRILOVA O., VINSON C., REITMAN M.L., KAGECHIKA H., SHUDO K., YODA M., NAKANO Y., TOBE K., NAGAI R., KIMURA S., TOMITA M., FROGUEL P., KADOWAKI T. The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat Med., 2001, vol 7(8), p.941-946. ZECHNER R., STRAUSS J.G., HAEMMERLE G., LASS A., ZIMMERMANN R. Lipolysis: pathway under construction. Curr Opin Lipidol., 2005, vol 16(3), p.333-40. ZHANG J., JOHNSTON G., STEBLER B., KELLER E.T. Hydrogen peroxide activates NFkappaB and the interleukin-6 promoter through NFkappaB-inducing kinase. Antioxid Redox Signal., 2001, vol 3(3), p.493-504.
132
ZHANG Y., PROENCA R., MAFFEI M., BARONE M., LEOPOLD L., FRIEDMAN J.M. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature., 1994, vol 372(6505), p.425-32. Erratum in: Nature 1995, vol 374(6521), p.479. ZIMMERMANN R., STRAUSS J.G., HAEMMERLE G., SCHOISWOHL G., BIRNER-GRUENBERGER R., RIEDERER M., LASS A., NEUBERGER G., EISENHABER F., HERMETTER A., ZECHNER R. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science., 2004, vol 306(5700), p.1383-1386.
133
PUBLICATIONS