effet des apports proteique et énergétique sur le métabolisme

GASTON RAGGIO

EFFET DES APPORTS PROTEIQUE ETÉNERGÉTIQUE SUR LE MÉTABOLISME

PROTEIQUE CHEZ LA VACHE LAITIÈRE

Thèse de doctorat en cotutelle présentéeà la Faculté des études supérieures de l'Université Laval, Québec

dans le cadre du programme de doctorat en Sciences animalespour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D)

DEPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALESFACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVALQUÉBEC

Et

ÉCOLE NATIONALE SUPERIEURE AGRONOMIQUE (ENSAR)DE RENNES, FRANCE

Pour l'obtention du grade de Docteur

2006

© Gaston Raggio, 2006

II

RÉSUMÉ

Cette recherche avait pour but d'étudier le métabolisme protéique aux niveaux

splanchnique et mammaire en fonction d'apport en protéines ou en énergie. Les apports

protéiques ont été modifiés en augmentant les protéines métabolisables fournies par la

ration ou par la perfusion duodénale de caséine. Les apports d'énergie ont été modulés

par la perfusion ruminale d'acide propionique. Pour appréhender les modifications du

métabolisme protéique engendrées par l'apport de protéines et/ou d'énergie, nous avons

à la fois mesuré des débits nets des acides aminés et des débits dynamiques en utilisant

des traceurs, 13C-leucine et 2Hs-phénylalanine. Nos résultats démontrent qu'une

augmentation de l'approvisionnement en protéines métabolisables diminue l'efficacité

globale de transformation de l'apport protéique en protéines du lait. Cette diminution

d'efficacité est reliée à une augmentation du catabolisme avec des sites d'extraction se

partageant selon deux groupes d'acides aminés, soit hépatique pour l'histidine, la

méthionine, la phénylalanine et la tyrosine, soit par les tissus périphériques incluant la

glande mammaire, pour la lysine et les acides aminés à chaîne ramifiée. Quant à une

augmentation de l'apport énergétique sous forme d'acide propionique dans le rumen,

elle affecte le métabolisme protéique à deux niveaux : au niveau corporel en diminuant

l'oxydation des acides aminés indispensables et au niveau mammaire en augmentant

principalement l'extraction des acides aminés (AA) non indispensables. Ainsi, les

apports protéique et énergétique stimulent la production de protéines laitières par des

mécanismes différents, d'où l'effet additif observé sur ce paramètre. Ces résultats

confirment qu'un facteur fixe de conversion des acides aminés absorbés en sécrétion de

ces acides aminés dans le lait ne devrait pas être utilisé tel qu'il l'est actuellement dans

les différents modèles de prédiction de la production de protéines du lait. Ce facteur

varie selon le bilan nutritionnel de l'animal et selon chaque acide aminé.

III

AVANT-PROPOS

Pendant mes années de doctorat en cotutelle, j 'ai eu la chance de travailler et d'étudier

dans quatre différents endroits du monde :

- Centre de recherche d'Agriculture et Agroalimentaire Canada, Lennoxville,

Québec, Canada,

- Université Laval, Québec, Canada,

- Institut national de la recherche agronomique (INRA), dans l'unité mixte de

recherches sur la production du lait, St-Gilles, France,

- Rowett Research Institute, Aberdeen, Royaume-Uni.

Dans chaque centre, j 'ai eu la possibilité de travailler avec plusieurs personnes,

lesquelles m'ont toujours démontré leur confiance, et nous avons vraiment formé une

très bonne équipe de travail. À vous, tous les techniciens, personnes responsables

d'étable, animaliers : Merci beaucoup. Sincèrement, vous avez fait beaucoup pour moi.

Directeurs de programme d'étude:

À Doris Pellerin, mon directeur de thèse à l'Université Laval, un grand merci pour

m'avoir donné la possibilité d'être son étudiant à la maîtrise ainsi qu'au doctorat. Je

vous en remercie sincèrement.

À Jean-Louis Peyraud, mon directeur de thèse de l'INRA, merci beaucoup pour m'avoir

accepté comme son étudiant et pour votre accueil à la station de recherche de St-Gilles.

Directeurs de programme de recherche et chercheurs impliqués :

À Henri Rulquin, Jocelyne Guinard-Flament, David Pacheco Rios et Guy Allard, pour

leurs conseils et bonnes discussions, je dis merci beaucoup.

IV

À Gerald Lobley, mon superviseur et responsable au Rowett Research Institute, merci

beaucoup pour m'avoir donné l'opportunité de travailler avec vous, pour le temps que

vous m'avez dédié, pour nos nombreuses discussions et pour m'avoir communiqué

votre passion de la recherche.

À Sophie Lemosquet-Simon, je voudrais te remercier pour ton excellent accueil au

centre de recherche de même que chez ta famille. Nos discussions et les nombreuses

heures de travail que nous avons partagées, tes conseils et ta passion pour la recherche

m'ont servi énormément. Sincèrement, ton encadrement a été fondamental pour moi.

À Hélène Lapierre «LA PATRONA », sincèrement, je ne trouve pas les mots pour te

remercier pour toutes ces extraordinaires années de travail passées ensemble (6). Ta

capacité pour t'exprimer et te faire comprendre est extraordinaire, et ton amour pour la

recherche sur les acides aminés est indescriptible. Merci pour m'avoir donné le

privilège d'être ton étudiant. Aussi, PATRONA, je te remercie immensément pour me

faire sentir comme si ta famille était la mienne.

A MI FAMILIA:

Esta tesis esta dedicada a mi querida abuela FIFI, ella es una de las personas que

siempre me dio su carino incondicional en todo momento, alguien muy especial para

mi. Aunque fisicamente ya no esta con nosotros, ella siempre va a estar a mi lado.

ABUELA ESTO ES PARA VOS.

Ignacio, Caria, Justina y Tiago: Les agradezco todo corazôn lo que hicieron por mi, si

ustedes no me hubiesen recibido y ayudado durante los primeros anos en Canada este

sueno no se habria convertido en realidad.

Santiago y Maria Elena: Sinceramente le agradezco todos esos momentos que hemos

compartido juntos.

Papa y Mamâ: Ustedes me dieron la vida y la fuerza de hacer todo lo que estoy

haciendo en estos momentos. Les agradezco de corazôn todo ese carino que me han

dado y todos los valores que me inculcaron.

V

A mi mujer Anik: Amor de mi vida, te agradezco por todos estos anos juntos, toda tu

comprensiôn y el esfuerzo que hiciste para que nuestro inséparable amor siga.

Sinceramente, sos un ejemplo de perseverancia y de trabajo. Te amo para siempre.

VI

TABLE DES MATIERES

RÉSUMÉ II

AVANT-PROPOS III

TABLE DES MATIÈRES VI

LISTE DES TABLEAUX XII

LISTE DES FIGURES XV

LISTE DES ABRÉVIATIONS XVII

CHAPITRE I INTRODUCTION 1

CHAPITRE II REVUE DES TRAVAUX ANTÉRIEURS 5

2.1 Techniques de mesure du métabolisme protéique 5

2.1.1 Introduction 5

2.1.2 Mesures au niveau corporel 5

2.1.2.1 Bilan net 6

2.1.2.2 Bilan dynamique 6

2.1.2.2.1 Perfusion de traceur en bolus 8

2.1.2.2.2 Perfusion de traceur en continu 9

2.1.2.2.3 Choix du pool précurseur 11

2.1.3 Mesures au niveau tissulaire 12

2.1.3.1 Concentrations des acides aminés 12

2.1.3.2 Estimation du débit sanguin 13

2.1.3.2.1 Méthode de dilution 14

2.1.3.2.2 Sondes débitmétriques 14

2.1.3.2.3 Principe de Fick 15

2.1.3.2.4 Comparaison des méthodes 16

2.1.3.3 Débit net des acides aminés 17

VII

2.1.3.3.1 Sang entier ou plasma 17

2.1.3.4 Débit dynamique 17

2.1.3.4.1 Choix du pool précurseur 19

2.2 Métabolisme protéique chez la vache laitière 20

2.2.1 Distribution de la synthèse protéique au niveau corporel 20

2.2.2 Facteurs qui régulent la synthèse protéique 21

2.2.2.1 L'apport en protéines 22

2.2.2.2 L'apport d'énergie 23

2.3 Métabolisme mammaire des acides aminés 24

2.3.1 Introduction 24

2.3.2 Matériel et méthode 26

2.3.2.1 Formation de la base de données 26

2.3.2.2. Recalculs effectués 28

2.3.2.3 Modèle du calcul utilisé 29

2.3.3 Résultats 29

2.3.3.1 Concentrations artérielles 32

2.3.3.2 Différences artério-veineuses mammaires 34

2.3.3.3 Le prélèvement mammaire des AA 36

2.3.3.4 Le ratio prélèvement mammaire sur sécrétion en protéines du lait 38

2.3.4 Discussion 40

2.3.5 Conclusion 43

2.4 Objectifs de thèse 45

2.5 Liste des ouvrages cités 47

CHAPITRE III EFFECT OF LEVEL OF METABOLIZABLE PROTEIN ON

SPLANCHNIC FLUX OF AMINO ACIDS IN LACTATING DAIRY COWS 58

3.1 Résumé 59

3.2 Abstract 60

3.3 Introduction 61

3.4 Material and Methods 62

VIII

3.4.1 Animais and Treatments 62

3.4.2 Sampling 63

3.4.3 Laboratory Analyses 63

3.4.4 Calculations and Statistical Analyses 65

3.5 Results 66

3.5.1 Milk Production and Composition 66

3.5.2 Net Flux of Essential Amino Acids 66

3.5.3 Urea and Ammonia 67

3.5.4 N Balance 67

3.6 Discussion 68

3.6.1 Amino Acid Flux 68

3.6.2 Urea and Ammonia 71

3.6.3 Milk Production 72

3.6.4 Nitrogen Balance 73

3.7 Conclusion 74

3.8 Acknowledgements 74

3.9 Références 85

CHAPITRE IV EFFECT OF PROTEIN SUPPLY ON HEPATIC SYNTHESIS

OF CONSTITUTIVE AND PLASMA PROTEINS IN LACTATING DAIRY

COWS 91

4.1 Résumé 92

4.2Abstract 93

4.3 Introduction 94

4.4 Materials and Methods 95

4.4.1 Animais, Treatments and Sampling 95

4.4.2 Laboratory Analyses 96

4.4.3 Calculations and Statistical Analyses 97

4.5 Results 99

IX

4.6 Discussion 99

4.7 Conclusion 102

4.8 Aknowledgments 103

4.9 Références 109

CHAPITRE V EFFECT OF CASEIN AND PROPIONATE SUPPLY ON

WHOLE BODY PROTEIN METABOLISM IN LACTATING DAIRY COWS..112

5.1 Résumé 113

5.2 Abstract 114

5.3 Introduction 115

5.4 Material and Methods 116

5.4.1 Animais 116

5.4.2 Feeding and Treatments 117

5.4.3 Sampling and Laboratory Analyses 119

5.4.4 Calculations 120

5.4.5 Statistical Analyses 122

5.5Results 122

5.5.1 Milk Production 122

5.5.2 Leucine Kinetics 122

5.5.3 Amino Acid and Urea Concentrations 123

5.6 Discussion 124

5.6.1 Milk Production and Composition 124

5.6.2 Whole body leucine kinetics 125

5.6.3 Carbon Balance 127

5.7 Conclusion 128

5.8 Acknowledgments 128


X

CHAPITRE VI EFFECT OF CASEIN AND PROPIONATE SUPPLY ON

MAMMARY PROTEIN METABOLISM IN LACTATING DAIRY COWS 141

6.1 Résumé 142

6.2 Abstract 143

6.3 Introduction 144

6.4 Materials and Methods 146

6.4.1 Animais and Treatments 146

6.4.2 Sampling and Laboratory Analyses 148

6.4.3 Calculations 149

6.4.4 Expérimental Design and Statistical Analyses 153

6.5 Results 153

6.5.1 Mammary Leucine Kinetics 153

6.5.2 Amino Acid Arterio-Venous Concentration Différences 154

6.5.3 Amino Acid Uptake and Uptake : Output Ratio 154

6.5.4 Nitrogen Balance Across the Mammary Gland 155

6.6 Discussion 156

6.6.1 Protein Metabolism 156

6.6.1.1 Leucine Net Uptake 156

6.6.1.2 Leucine Kinetics 157

6.6.1.3 Net Uptake of Amino Acids 158

6.6.1.3.1 EffectofCasein 158

6.6.1.3.2 Effect of propionate 160

6.6.1.4 Peptide Release 161

6.7 Conclusion 161

6.8 Acknowledgements 161


CHAPITRE VII DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE 175

7.1 Discussion 175

XI

7.2 Conclusion 178

7.3 Liste des ouvrages cités 180

ANNEXE 1 181

1. Débit net des acides aminés (AA), mmol/h 181

2. Mouvement dynamique 181

2.1 Utilisation corporelle 181

2.2 Utilisation au niveau d'un organe 182

2.3 Glande mammaire 182

2.3.1 L'oxydation au niveau mammaire 183

2.4 Synthèse des protéines plasmatiques 184

2.5 Liste de références 185

XII

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 2.1. Variation inter-essai, de la composition en AA des PDI dans les essais

utilisés pour constituer la base de données 30

Tableau 2.2. Caractéristiques zootechniques de la base de données 30

Table 3.1. Composition of the three dietary treatments with différent levels of

metabolizable protein (MP) 75

Table 3.2. Chemical composition of the feed ingrédients 76

Table 3.3. Effect of metabolizable protein (MP) supply on milk production and

composition in Holstein cows 77

Table 3.4. Effect of metabolizable protein (MP) supply on arterial concentration

of amino acids (uM) in Holstein cows 78

Table 3.5. Effect of metabolizable protein (MP) supply on net fluxes of amino

acids (mmol/ h) in Holstein cows 79

Table 3.6. Effect of metabolizable protein (MP) supply on net fluxes of amino

acids (mmol/ h) in Holstein cows. (continued) 80

Table 3.7. Effect of metabolizable protein (MP) supply on the ratio of amino acids

in milk protein relative to portai absorption 81

Table 3.8. Effect of metabolizable protein (MP) supply on the ratio of the hepatic

net removal of amino acids relative to portai absorption and total

influx 82

Table 3.9. Effect of metabolizable protein (MP) supply on arterial concentrations

(mM) and splanchnic flux (mmol/h) of urea and ammonia in Holstein

cows 83

Table 3.10. Effect of metabolizable protein (MP) supply on nitrogen balance (g/d)

in Holstein cows 84

XIII

Table 4.1. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on concentrations and

protein synthesis rates of plasma albumin and total proteins 105

Table 4.2. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on Phe concentration

and isotopic enrichment plasma samples during a 8-h infusion of 2H5-

Phe1 106

Table 4.3. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on net transfers of Phe

(mmol/h) 107

Table 4.4. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on Phe kinetics

(mmol/h) 108

Table 5. 1. Chemical composition of the feed ingrédients 129

Table 5.2. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on DMI, milk yield

and composition 130

Table 5.3. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on whole body (WB)

leucine kinetics 131

Table 5.4. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on 13CO2 isotopic

enrichment (IE), carbon dioxide entry rate (CER) and carbon balance 132

Table 5.5. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on plasma arterial

concentration of amino acids andurea 133

Table 6.1. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on milk yield and

composition of the right half udder in dairy cows 163

Table 6.2. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on leucine kinetics

and plasma flow of the right half udder in dairy cows 164

XIV

Table 6.3. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on plasma

arteriovenous différence of amino acids on the right half udder in dairy

cows 165

Table 6.4. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on amino acid uptake

by the right half udder in dairy cows 166

Table 6.5. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on amino acid

uptake: milk output ratio in dairy cows 166

Table 6.6. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on the nitrogen

balance across the right half udder in dairy cows 168

XV

LISTE DES FIGURES

Figure 2.1. Représentation de l'utilisation totale des AA 10

Figure 2.2. Représentation de l'oxydation de la leucine 10

Figure 2.3. Différentes possibilités de choisir le pool précurseur (PP) dans un

modèle pour l'étude de la synthèse de protéines avec trois

compartiments 20

Figure 2.4. Contribution des différents tissus à la masse protéique (Protein mass),

la synthèse protéique (protein synthesis). et à l'utilisation nette

d'oxygène (oxygen uptake) indicateur de l'énergie utilisée (tiré de

Lobley et al., 2002) 21

Figure 2.5. Augmentation de la production de protéines brutes dans le lait en

fonction des apports PDI 31

Figure 2.6. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles des AA du

groupe 1 32

Figure 2.7. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles des AA du

groupe 2 33

Figure 2.8. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles d'AA non

indispensables 34

Figure 2.9. Effet des apports en PDI sur les différences arterio-veineuses

mammaires (DAVM) des AA du groupe 1 34


mammaires (DAVM) des AA du groupe 2 35


mammaires (DAVM) des AA non indispensables 36

Figure 2.12. Effet des apports en PDI sur le prélèvement mammaire (PM) des AA

du groupe 1 36


du groupe 2 37

XVI


non indispensables 38

Figure 2.15. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire et

sécrétion en protéines du lait (PM: PL) des AA du groupe 1 38

Figure 2.16. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire sur

protéines du lait (PM : PL) des AA du groupe 2 39

Figure 2.17. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire et

protéines du lait (PM : PL) des AA non indispensables 40

Figure 4. 1. Average of the enrichment (MPE= molar percent excess x 1000) of

Phe in plasma total proteins and albumin during a continuous infusion

of 2H5-Phe at Low (la) or High (lb) metabolizable protein (MP)

supply 104

Figure 5.1. Effect of extra leucine intake on leucine oxidation, leucine in milk and

leucine in tissues 134

XVII

LISTE DES ABRÉVIATIONS

Françaises:

AA = acides aminés, AA-DI = AA digestible, El = enrichissement isotopique, pAH =

para-aminohippurate, DAV = différence arterio-veineuse, DAVM = DAV mammaire,

MOP =4-methyl 2-oxopentanoate, UT AA = utilisation totale d'AA, PDI = protéines

digestibles dans l'intestin, PM = prélèvement mammaire

Anglaises:

AA = amino acids, ASR = absolute synthesis rate, AV = arterio-venous, C3 =

propionate, CER = carbon dioxide entry rate, Cas = casein, Ctrl = control, Cas+C3 =

casein and propionate, BCAA = branched-chain AA, EAA = essential AA, FO =

fractional oxidation, IE = isotopic enrichment, ILR = irréversible loss rate, MG =

mammary gland, MP = metabolizable protein, MOP = 4-methyl 2-oxopentanoate,

NEAA - non-essential amino acids, PDV = portal-drained viscera, pAH = para-

aminohippurate, PS = protein synthesis; WB, whole body.

CHAPITRE I

INTRODUCTION

L'augmentation de l'efficacité alimentaire a été et sera le défi de tous les

nutritionnistes impliqués dans le secteur laitier. L'idée de produire une plus grande

quantité de protéines à un coût de production moindre exige de produire avec une

meilleure efficacité globale. Une étape essentielle pour atteindre cet objectif est la

compréhension du métabolisme protéique animal, non seulement pour améliorer la

production, mais aussi pour réduire l'impact de la production animale sur

l'environnement, relié à l'azote éliminé dans les fèces et l'urine.

L'amélioration de l'efficacité de la conversion des aliments en lait implique une

meilleure adéquation entre les nutriments fournis par la ration et ceux nécessaires au

fonctionnement optimal des tissus. Généralement, une augmentation de l'apport

protéique, soit par la perfusion de caséine (Clark et al., 1977; Guinard et Rulquin,

1994a; Hanigan et al., 1998), soit par une augmentation de protéines métabolisables par

la ration (Blouin et al., 2002) résulte en une augmentation de la production de protéines

dans le lait. Aussi, une augmentation de l'apport énergétique a un effet positif mais de

moindre envergure sur la production de protéines du lait (Clark et al., 1977; Coulon et

al., 1991; Rigout et al., 2003). Pour comprendre les mécanismes responsables de cette

augmentation, il faut comprendre comment les apports de protéines ou d'énergie vont

affecter le métabolisme des AA chez la vache laitière.

Nos connaissances sur le métabolisme des AA chez la vache laitière sont

limitées, comme le démontre notre difficulté à prédire la réponse à un accroissement

d'apports protéiques ou d'AA (Hanigan et al., 1998) ou la récupération relativement

faible d'acides aminés perfusés au niveau digestif ou vasculaire dans la lait produit

(MacRae et al., 1993). Alors que les modèles actuels prédisent une utilisation marginale

d'environ 67 % pour un supplément protéique vers la protéine du lait (NRC, 2001) si

les besoins ne sont pas rencontrés, l'efficacité marginale moyenne mesurée dans une

série de projets se situait plutôt autour de 21 % (Hanigan et al., 1998) ou aux environ de

30 % selon les données de l'INRA.

L'absorption portale nette ou apparente d'AA chez la vache laitière représentait

plus de 50 % de l'azote digéré (Blouin et al., 2002), ce qui est supérieur à ce qui est

rapporté chez le bovin en croissance où la proportion d'AA absorbés par rapport à

l'azote digéré est inférieure à 40 % (Lapierre et Lobley, 2001). L'efficacité nette

d'utilisation de ces AA absorbés pour être transformés en protéines du lait varie entre 40

et 80 % dépendant de l'AA concerné (Blouin et al., 2002). Elle diminue avec une

augmentation des apports en protéines métabolisables, ce qui indique une très grande

variation de l'utilisation des AA au niveau des tissus.

Après avoir été absorbés dans la veine porte, les AA sont dirigés vers le foie, qui

occupe une position stratégique anatomiquement, faisant l'interface entre l'apport

nutritionnel et les tissus périphériques. L'extraction hépatique des AA indispensables

varie énormément d'un AA à l'autre. En général, le foie extrait 45 % du total des AA

absorbés (Lapierre et al., 2005), mais cette extraction est très variable selon chaque AA.

Par exemple, l'extraction d'AA comme l'histidine, la méthionine, la phénylalanine, la

tyrosine et la thréonine varie de 13 à 50 % de leur absorption portale alors que d'autres

AA tels que la leucine, l'isoleucine, la valine et la lysine ne sont pas ou très peu extraits,

sur une base nette, par le foie (Blouin et al., 2002 ; Hanigan, 2005; Lapierre et al.,

2005). Ces derniers AA peuvent être catabolisés par la glande mammaire et d'autres

tissus périphériques, en accord avec la présence des différents enzymes de dégradation

de ces acides aminés dans différents tissus (Lobley et Lapierre, 2003).

De façon évidente, le foie joue un rôle de détoxication des AA lorsqu'ils sont

fournis en excès de la demande. Cependant, le foie a aussi un rôle de synthèse de

protéines d'exportation qui pourraient constituer un niveau d'extraction obligatoire

diminuant d'autant l'approvisionnement aux tissus périphériques en AA libres. En effet,

le foie fabrique des protéines plasmatiques qui vont être exportées dans la circulation

générale (Connell et al., 1997) et qui sont d'importance vitale pour les animaux.

L'importance de cette production de protéines n'est pas connue chez la vache, ni si elle

est modulée par l'apport en protéines de la ration. De plus, le foie extrait une proportion

importante d'AA non indispensables à des fins de néoglucogenèse. Jusqu'à 17 % de la

néoglucogenèse peut provenir de carbones d'AA (Reynolds et al., 1994). Ainsi, une

limitation en AA non indispensables pourrait avoir un effet négatif sur

l'approvisionnement en énergie à la glande mammaire, ou un surplus d'énergie pourrait

avoir pour effet d'épargner des AA non indispensables et se traduire par une plus grande

quantité d'AA arrivant à la glande mammaire.

L'approvisionnement post-hépatique en AA est utilisé par les tissus

périphériques, incluant la glande mammaire, un des organes les plus actifs dans

l'extraction de ces AA, pour supporter une production de protéine du lait pouvant

dépasser 1 kg par jour. La glande mammaire pourrait réguler le prélèvement des AA en

contrôlant le débit du sang ainsi qu'en augmentant l'efficacité de son extraction, tel

qu'observé par Bequette et al. (2002) chez la chèvre laitière. Une façon de mieux

comprendre ces phénomènes est par des études dynamiques avec traceurs (Bequette et

al, 1996a; Lapierre et al., 2002) ou en évaluant le ratio net du prélèvement mammaire

d'un AA sur la sécrétion de cet AA dans la protéine du lait (Clark et al., 1977; Guinard

et Rulquin, 1994a; Vanhatalo et al., 2003a). La combinaison des deux techniques

aiderait à avoir une vision plus globale.

Le ratio des AA prélevés par la glande mammaire sur la protéine sécrétée dans le

lait varie selon des groupes d'AA. Selon la classification de Mepham (1982), les AA

indispensables suivants : l'histidine, la méthionine, la phénylalanine (et la tyrosine) et la

thréonine, sont prélevés et sécrétés dans un ratio 1 : 1 . Ces AA sont ceux qui sont

principalement extraits par le foie. Dans le cas des AA indispensables qui ne sont pas

extraits par le foie (la leucine, l'isoleucine, la valine et la lysine), la glande mammaire

les extrait en excès (Mepham, 1982) par rapport aux besoins directs de synthèse de

protéines du lait : cela implique qu'ils doivent y être oxydés (Bequette et al., 1996a et b;

Lapierre et al., 2005), ou qu'il existe la possibilité d'une production intra-mammaire et

d'un largage de peptides dans le drainage mammaire (Guinard et Rulquin, 1994a:

Rulquin et al., 2004).

En conclusion, à travers différents projets de recherche, nous avons l'intention

de comprendre plus en profondeur une partie de ce complexe univers du métabolisme

des AA chez la vache laitière.

Les objectifs spécifiques de la thèse sont donc :

1- D'analyser comment différents apports de protéines métabolisables

vont affecter le métabolisme des acides aminés au niveau hépatique

et post-hépatique en se basant sur le bilan net des acides aminés au

niveau de ces tissus.

2- De déterminer si la synthèse de protéines plasmatiques au niveau

hépatique va être compromise par une restriction de l'apport de

protéines métabolisables. Un AA marqué sera perfusé pour mesurer

son incorporation dans les protéines plasmatiques.

3- D'établir si un apport variable en énergie et/ou en protéines affecte le

métabolisme corporel et mammaire des acides aminés par des

mécanismes différents. Pour cela, des bilans nets d'AA seront

effectués et un des bilans dynamiques sera mesuré en utilisant un AA

marqué.

CHAPITRE II

REVUE DES TRAVAUX ANTERIEURS

2.1 Techniques de mesure du métabolisme protéique

2.1.1 Introduction

Une meilleure compréhension du métabolisme des acides aminés (AA) dans

différents tissus et la coordination (ou compétition) entre ces tissus pour l'utilisation de

ces AA requiert de faire des mesures de façon quantitative in vivo dans un contexte

physiologique où l'on essaie de ne pas modifier les organes étudiés. Pour réaliser ce

type de travail, nous devons utiliser des méthodologies qui nous permettront de

quantifier différents phénomènes. Aux niveaux corporel et tissulaire, les bilans nets

peuvent être faits à partir des différences entre les quantités entrant et sortant du

système, soit en azote (N) total au niveau corporel ou plus spécifiquement en AA au

niveau tissulaire. Cependant, que ce soit au niveau corporel ou tissulaire, l'estimation

des voies dynamiques d'utilisation des AA pour des fins d'oxydation, de synthèse ou

provenant de dégradation protéique nécessite l'utilisation de molécules marquées dont

le devenir métabolique pourra être suivi par leur différence de masse (isotope stable) ou

par rayonnement radioactif (isotope radioactif). Cette revue a pour objectif de décrire

les techniques utilisées et le type d'information qu'elles génèrent dans la mesure du

métabolisme protéique, soit au niveau corporel ou tissulaire.

2.1.2 Mesures au niveau corporel

La masse protéique corporelle est régulée à partir d'un changement dynamique

constant entre la synthèse et la dégradation protéique appelé « turnover » protéique. La

différence entre ces deux composantes correspond au bilan net, qui représente soit la

rétention azotée pour les animaux en croissance, soit la somme de la rétention azotée et

de la production de protéines laitières pour un animal en lactation.

2.1.2.1 Bilan net

Le bilan net représente la différence entre l'ingestion totale d'azote et la somme

des excrétions sous forme urinaire ou fécale, à laquelle on ajoute la production de

protéines laitières chez la vache en lactation. On obtient le bilan azoté en mesurant sur

une période de quelques jours l'azote ingéré (alimentation servie moins refus) et l'azote

excrété (en faisant une collecte totale de fèces et d'urine et la mesure de la production

laitière). Les échantillons des différentes fractions sont analysés pour leur contenu en

azote total. La somme de l'azote retenu plus l'azote sécrété sous forme de lait représente

la différence entre la synthèse et la dégradation protéique. En production animale, c'est

ultimement le bilan net que nous voulons augmenter, mais une variation de celui-ci ne

nous renseigne pas du tout sur les mécanismes qui en sont responsables.

2.1.2.2 Bilan dynamique

Un suivi de la dynamique protéique plutôt que la mesure de son seul résultat

final peut, par une meilleure compréhension des facteurs régulant chacune de ces

fonctions, nous indiquer les meilleures stratégies à adopter pour améliorer l'efficacité de

l'utilisation de l'azote alimentaire. La synthèse corporelle de protéines représente la

somme de la synthèse protéique de tous les organes et tissus. La croissance, la nutrition,

la gestation, la lactation, les maladies et les blessures vont affecter ce processus

dynamique à différents niveaux, mais toutefois, avec flexibilité et coordination pour

maintenir leur fonction métabolique par les différents organes.

Cependant, la mesure de la dynamique protéique exige une méthodologie plus

élaborée que la simple mesure du bilan net. Elle exige l'utilisation de molécules

marquées, communément appelées « traceurs ». Pour étudier le métabolisme protéique,

les traceurs sont des AA marqués par la substitution de l'un de leurs atomes (ou

plusieurs) par un isotope de cet atome. Un isotope est un atome ayant le même nombre

de protons que l'élément original, mais avec un nombre plus élevé de neutrons, lui

conférant une masse plus grande. Il y a les isotopes stables, qui ne diffèrent que par leur

masse et les isotopes radioactifs, qui, en plus de la différence de masse, dégagent un

rayonnement radioactif qui peut être mesuré. Les techniques de mesure de turnover

protéique ont d'abord été développées avec les isotopes radioactifs (Garlick et al., 1973;

James et al., 1973; Golden et Waterlow, 1977; Reeds et al., 1978; Lobley et al., 1980;

Lobley et al., 1987) mais l'amélioration de la sensibilité des analyses en spectrométrie

de masse de même que le risque environnemental élevé à utiliser des produits

radioactifs chez des animaux de ferme (récolte et mise au rebut des produits terminaux

et des carcasses) ont grandement incité l'utilisation d'isotopes stables (Simon et al.,

1978; Liu et al., 1995; Lapierre et al., 1999) dans la recherche sur les grands animaux.

Les isotopes principalement utilisés sont le 2H, le 13C, le 15N et le 18O pour

isotopes stables et le 3H et le 14C pour les isotopes radioactifs.

Avec l'un ou l'autre des types d'isotopes, on doit prendre en considération les points

suivants (Wolfe, 1984):

- La perfusion de traceurs ne doit pas altérer la cinétique de la molécule « tracée »,

- L'animal doit être dans un état stable d'équilibre nutritionnel dans notre modèle du

métabolisme protéique,

- Le traceur est utilisé par les voies métaboliques comme la molécule tracée endogène,

- Le traceur ne doit pas être recyclé, c'est-à-dire qu'il ne doit pas revenir dans le pool

initial, pendant la période de mesure,

- Les sites de perfusion et d'échantillonnage doivent être situés de manière à refléter

l'enrichissement isotopique (El) du pool précurseur, suite à un mélange parfait

« traceur-tracé ».

- Le substrat marqué apparaît ou disparaît directement du compartiment échantillonné.

Pour les isotopes radioactifs, la mesure d'enrichissement se fait en comptant le

nombre de désintégrations par minute de la molécule étudiée, appelée radioactivité

spécifique. Pour les isotopes stables, l'EI est la mesure de la proportion de molécules

marquées dans le système étudié (habituellement sous perfusion continue ou après une

dose bolus) par rapport à l'abondance naturelle, car tous les atomes sont présents

naturellement sous forme d'isotopes stables dans des proportions variables. Ainsi, l'EI

est toujours exprimé par rapport à des taux de base mesurés avant la perfusion du

traceur. L'EI s'exprime en « atome pourcent excès (ape) ou « mole pourcent excès »

(mpe) » et est calculé des façons suivantes :

1) El (ape ou mpe) = (traceur / traceur + tracée) x 100

2) El (ape ou mpe) = (Ri - Ro) / ((1 + (Ri - Ro)) x 100

où Ri et Ro sont respectivement le ratio entre la surface sous la courbe de la masse M +

x / M + 0 (ou x représente la masse enrichie et 0 la masse sans isotope) de l'échantillon

analysé (Ri) et de l'échantillon du taux de base (Ro). Cette équation tient compte du fait

que l'AA, avant d'être séparé par chromatographie en phase gazeuse puis détecté sur le

spectromètre de masse, doit être dérivatisé, ce qui lui ajoute un nombre important

d'atomes de C, H et N ayant chacun une probabilité naturelle de contenir des isotopes

stables (Wolfe, 1984).

Afin d'estimer l'utilisation totale d'un AA, il y a différentes techniques: 1)

perfusion en bolus ou 2) perfusion en continu de traceurs.

2.1.2.2.1 Perfusion de traceur en bolus

L'utilisation d'un traceur en injection bolus permet d'évaluer sa disparition du

compartiment échantillonné, correspondant à son utilisation totale dans un état

d'équilibre (Garlik et al., 1980). Elle demande une injection en bolus, suivi de

prélèvements répétés à intervalles très courts, dus à la très courte demi-vie des AA. En

reliant le logarithme naturel de l'EI en fonction du temps, on obtient une courbe à deux

exponentiels dont les paramètres sont utilisés pour estimer l'utilisation totale (Holtrop et

al., 2004). Cette approche offre l'avantage de l'utilisation de doses beaucoup plus

faibles que la perfusion continue, mais ne permet pas de mesurer l'oxydation, paramètre

essentiel pour une estimation correcte de la synthèse protéique (c.f section 2.2.2). Chez

les ruminants, la perfusion en bolus a été relativement peu utilisée au niveau corporel

(Holtrop et al., 2004; Borucki Castro et al., 2006).

2.1.2.2.2 Perfusion de traceur en continu

Cette méthode pour mesurer la synthèse de protéines est la plus répandue chez

les animaux de ferme et a été utilisée par de nombreux scientifiques chez différentes

espèces (humain : Steffee et al., 1976; mouton : Lobley et al., 1980; porc : Reed et al.,

1981; bovin : Lapierre et al., 1999; chèvre : Bequette et al., 2002 ; vache laitière:

Bequette et al., 1996). Elle consiste en la perfusion continue, habituellement dans une

veine, du traceur durant quelques heures (4-12h), au cours desquelles l'animal en étude

doit être dans un état d'équilibre métabolique stationnaire. Celui-ci peut être atteint par

exemple en fractionnant l'alimentation (toutes les deux heures chez les ruminants). Pour

obtenir un plateau d'EI plus rapidement, il est possible d'administrer une dose

d'amorçage du traceur équivalant à une heure de perfusion (Wolfe, 1984). Dans ces

conditions, un plateau de l'EI dans le plasma est habituellement observé après deux

heures de perfusion alors qu'autrement ce plateau est atteint après 4-6 heures.

L'utilisation totale de l'AA étudié est calculée en faisant l'hypothèse qu'il y a un

équilibre entre l'entrée du traceur (perfusion) et sa sortie du compartiment

échantillonné. L'utilisation totale (UT), habituellement désignée sous le terme de

« Irréversible Loss Rate - ILR » en anglais, représente l'utilisation totale de l'AA étudié

au niveau corporel, ce qui signifie que tous les organes et tissus sont pris en compte.

L'UT est calculée avec l'équation qui suit:

3)UT= (EI inf/EIpp-l)*Inf

= synthèse protéique (SP) + oxydation (OX)

= absorption + dégradation de protéines

où El inf est l'EI de la perfusion, Inf est la dose de perfusion du traceur (mmol/h),

EIpp, l'EI de l'AA perfusé au site de prélèvement (soit artériel ou veineux en amont de

la perfusion) utilisé comme étant représentatif de l'EI du pool précurseur. Dans le cas de

la leucine, l'EI du céto-acide de la leucine, le 4-méthyl 2-oxopentanoate (MOP), formé

au niveau intracellulaire et relargué au niveau veineux est souvent utilisé comme

représentatif du pool précurseur, plutôt que la leucine elle-même (Figure 2.1)

10

Oxydation

î Synthèse

Absorption

Infusion

AA libres AAdansprotéines

Dégradation

Figure 2.1. Représentation de l'utilisation totale des AA

Cette première étape nous donne, comme dans le cas de la perfusion en bolus,

l'UT. Pour vraiment déterminer la synthèse protéique (UT - oxydation), l'oxydation de

l'AA doit aussi être mesurée : la mesure se fait à partir de l'EI du 13CO2 produit pendant

la perfusion de l'AA marqué, en combinaison avec une mesure de la production totale

de CO2 quantifiée à partir d'une perfusion de bicarbonate marqué (l3C). Un exemple

suit en utilisant la leucine comme AA traceur (Figure 2.2).

Isovaleryl CoA

13C leucine (Infusion)

13C- methyl oxopentanoate (MOP)

Oxydation

Figure 2.2. Représentation de l'oxydation de la leucine

À l'aide d'une perfusion de 13C-bicarbonate, il est possible d'estimer la

production totale de CO2 (TCO2) au niveau corporel. Normalement, cette mesure se fait

une journée avant la mesure de l'UT. La TCO2 est calculée avec l'équation qui suit :

4) T C O 2 = (El 13C-bicarbonate/ El 13CO2-bicarbonate - 1) * M l3C-bicarbonate

11

En combinant la TCO2 avec l'EI du 13CC>2 obtenu durant la perfusion de l'AA, il

est possible de calculer l'oxydation du traceur

5) Leucinetraceur oxydation = TCO2 x El 13CO2-leucine

En utilisant l'oxydation de la leucinetraceUr, la perfusion du traceur et l'EI de ce

dernier, il est possible de calculer la proportion de la leucine qui est oxydée (POx) par

l'équation :

6) POx = Leucinelraceur oxydation / (Inf 13C Leucine x El int)

On fait l'hypothèse qu'une quantité équivalente à la quantité de la leucine

perfusee comme traceur est en excès dans l'animal et sera ainsi oxydée (Lobley et al.,

2003), alors l'oxydation corporelle de la leucine se calcule comme suit :

7) Oxydation corporelle leucine (mmol/h)= POx x (UT Leucine + Inf) - Inf

À partir de ces calculs, il est possible d'estimer la synthèse protéique (SP)

comme suit :

8) SP (mmol/h) = UT (mmol/h) - Oxydation (mmol/h)

La conversion de l'utilisation de la leucine pour la synthèse protéique (mmol/h)

en kg de protéines par jour, se fait à partir de la composition moyenne de la leucine dans

le corps, soit 63 g de leucine par kg de protéines chez la vache laitière (Lobley et al.,

1980) et 98 g de leucine par kg de protéine du lait (Swaisgood, 1995).

2.1.2.2.3 Choix du pool précurseur

Le choix du pool précurseur est critique dans le calcul de l'utilisation totale des

AA, que ce soit au niveau corporel ou dans un organe déterminé. L'hypothèse est que

l'EI utilisé est représentatif de l'EI du pool précurseur réel au lieu des réactions

biochimiques. Ceci indique immédiatement une contrainte majeure pour les estimations

au niveau corporel, où de manière générale un seul El représentatif de tous les pools

précurseurs de chacun des tissus est utilisé, bien que chaque tissu ait son métabolisme

propre et en conséquence un El du pool précurseur probablement différent (ex : El

leucine au niveau artériel : 1,7 ape, portai : 1,28 ape, et hépatique : 1,22 ape : Lapierre et

12

al., 2002). L'EI au niveau artériel est choisi avec des animaux multicathétérisés où

l'accès au sang artériel est facile alors que dans les études limitées au métabolisme

corporel, un pool veineux, prélevé en amont ou de l'autre côté du site de perfusion

(Bequette et al., 1996a; Lapierre et al., 2002) est habituellement utilisé

2.1.3 Mesures au niveau tissulaire

La méthodologie décrite ci-dessus permet de déterminer l'utilisation totale, qui

est composée de l'oxydation et de la synthèse au niveau corporel, mais ne permet pas de

déterminer la contribution de chacun des tissus à ces phénomènes. Tout comme au

niveau corporel, des bilans de mouvements nets ou dynamiques peuvent être effectués

au niveau des tissus en mesurant les entrées et les sorties. Les principaux tissus étudiées

chez la vache sont : les tissus drainés par la veine porte, le tissu hépatique, la glande

mammaire et les tissus musculaires. La détermination des concentrations des AA dans

le sang artériel et veineux de même que l'estimation du débit sanguin sont deux mesures

conjointes à ces deux types de bilans et critiques pour une estimation adéquate de ceux-

ci.

2.1.3.1 Concentrations des acides aminés

La mesure des variations de concentration des AA à l'entrée et à la sortie de

l'organe étudié exige le placement de cathéters situés aux niveaux artériel et veineux.

L'implantation de cathéters artériels se fait sur une artère carotide ou une autre artère en

se basant sur l'hypothèse que la composition du sang artériel est identique, peu importe

l'artère choisie (Linzell, 1974). L'implantation du cathéter veineux se fait dans la veine

de drainage de l'organe étudié : veine porte et veine hépatique pour l'étude du

métabolisme au niveau du tissu intestinal et du foie, respectivement (Huntington et al.,

1989), et veine mammaire pour l'étude du métabolisme mammaire (Cant et al., 1993;

Guinard et Rulquin., 1994a). Il y a aussi certains auteurs comme Vanhatalo et al. (2003a

et b), Mackle et al. (2000) et Koronen et al.(2002), qui ont utilisé la technique de

ponctions veineuses mammaires et de la veine caudale pour estimer l'extraction

mammaire des AA.

13

L'utilisation de cette méthodologie est très délicate. Il faut considérer que des

problèmes concernant le positionnement du cathéter, des mouvements après le

placement et l'inflammation de la veine peuvent avoir des effets sur la mesure finale.

Par exemple, pour l'étude au niveau mammaire, des recherches ont démontré qu'il faut

considérer l'âge de l'animal et son passé reproductif parce qu'ils vont avoir une

influence sur le sang prélevé dans la veine mammaire selon la fonctionnalité des valves

de la veine mammaire et de la veine pudique externe. En général, après la deuxième

lactation, les valvules de la veine pudique externe deviennent incompétentes : ainsi du

sang veineux d'origine extra mammaire peut arriver jusqu'à la veine mammaire,

provoquant une contamination par du sang ne provenant pas du métabolisme mammaire

(Linzell, 1974; Thivierge et al., 2000). Pour prévenir ce problème, certains auteurs (ex :

Linzell, 1974; Peeters al., 1979; Mepham, 1982) recommandent l'occlusion de la veine

pudique externe ou de choisir des vaches de lere et 2e lactation (Thivierge et al., 2000).

Un autre point important dans les mesures de différences artério-veineuses

(DAV) est la précision des analyses pour déterminer la concentration des AA.

Traditionnellement, les analyses d'AA se font par colonnes échangeuses d'ions qui

séparent les AA suivies par une réaction à la ninhydrine pour quantifier les

concentrations (Guinard et al., 1994). Dans une telle analyse, habituellement, un

standard externe est ajouté et la récupération de tous les AA est ajustée à ce standard. Le

coefficient de variation (CV) de ces analyses est de 3 à 5 %, au mieux. Une nouvelle

méthode a été récemment développée afin d'améliorer la précision des analyses d'AA,

la méthode de dilution isotopique. Pour chaque analyse d'AA, le même AA marqué est

ajouté comme standard interne et les concentrations sont estimées en mesurant l'EI de

l'échantillon traité (Calder et al., 1999). Cette méthode donne des CV qui se situent

entre 0.1 et 0.3 %, beaucoup plus bas que l'analyse traditionnelle.

2.1.3.2 Estimation du débit sanguin

La mesure du débit sanguin est essentielle pour le calcul du débit des nutriments.

Il est donc important que la méthode utilisée pour mesurer le débit sanguin ne perturbe

pas ou peu l'animal. Les méthodes utilisées ont évolué au cours du temps et sont basées

14

sur différents principes physiques ou biochimiques. Les plus utilisées sont : la méthode

de dilution, les sondes débitmétriques et le principe de Fick.

2.1.3.2.1 Méthode de dilution

La méthode de dilution utilise des teintures inertes, comme le para-

aminohippurate (pAH). Elle a été décrite initialement par Katz et Bergman (1969) au

niveau splanchnique. Cette méthode consiste à infuser de façon continue du pAH au

niveau d'une (ou deux) veine mésentérique, ainsi qu'à faire des prélèvements sanguins

en amont (artère) et en aval (veine porte et veine hépatique) du site de perfusion

(Huntington 1984; Huntington et al., 1989; Ortigues et al, 1994; Lapierre et al., 1999;

Blouin et al., 2002). Lorsque la veine porte est très courte, un débit laminaire au niveau

portai peut empêcher un mélange adéquat du pAH, ce qui peut parfois fausser la mesure

de débit (Seal et Reynold, 1993).

Le calcul du débit se fait en tenant compte du débit de perfusion du pAH, et la

DVA de concentration du pAH en utilisant l'équation suivante :

9) Débit sanguin = débit de perfusion du pAH / [DVA] du pAH.

Cette méthode est aussi utilisée, mais à un degré moindre, pour estimer le débit

mammaire. Dans ce cas, le pAH est perfusé dans l'artère pudique et les prélèvements se

font en amont du site de perfusion dans l'artère pudique externe et en aval dans une

veine mammaire (Metcalf et al., 1992 ; Bequette et al., 1999).

2.1.3.2.2 Sondes débitmétriques

II existe plusieurs types de sondes débitmétriques. Les premiers modèles étaient

de type électromagnétique et demandaient un alignement perpendiculaire au vaisseau

sanguin pour donner une bonne lecture, position quasiment impossible à maintenir

stable à l'intérieur d'un animal et surtout impossible à vérifier. Cette sonde semblait

aussi très sensible aux perturbations. Ces types de sondes ont donné des estimations qui

n'avaient pas de bonne corrélation avec les débits mesurés par dilution au niveau

splanchnique (e.g. Eisemann et al., 1987) et ont finalement été peu utilisées. Par contre,

les sondes à ultrason se sont avérées beaucoup plus précises dans l'animal. Ce type de

15

sondes a été utilisé par Drost (1978) : elles contiennent deux cristaux à 4 cristaux, l'un

émet l'ultrason et l'autre les reçoit ; le temps mis par l'ultrason pour rejoindre le cristal

récepteur est fonction du débit du sang dans le vaisseau sanguin.

Les sondes à ultrason ont été utilisées pour mesurer le débit sanguin mammaire

(Guinard et al., 1994 ; Bequette et al., 1996b). Elles ont aussi été utilisées pour mesurer

le débit en veine porte chez le mouton (Rémond et al., 2000) et la vache laitière (Girard,

communication personnelle). Cette méthode présente moins de variabilité que la

méthode de dilution, les mesures étant faites continuellement (Rémond et al., 1993)

mais a cependant le désavantage, au niveau splanchnique, que la contribution artérielle

au débit hépatique n'est pas mesurée directement mais doit être considérée comme une

proportion fixe du débit sanguin portai. Par contre au niveau mammaire, Bequette et al.

(1999), Mabjeesh et al. (2000), Thivierge et al. (2002) ont comparé cette méthode avec

d'autres comme le principe de Fick ou la méthode de dilution et ont observé une sous-

estimation du débit de 15-30 % avec la sonde à ultrason. Ceci pourrait s'expliquer par

trois raisons. Premièrement, les sondes à deux cristaux (type S) sous-estiment les débits

turbulents comparativement aux sondes à 4 cristaux (Rémond, communication

personnelle). Deuxièmement, le sous-dimensionnement de la taille de la sonde par

rapport à la taille de l'artère peut aussi fausser les mesures de débit (par exemple des

sondes de 16 mm à 20 mm de diamètre sont parfois posées sur l'artère pudique de

vaches laitières). Troisièmement, la mise en place d'artéiroles collatérales après la pose

de la sonde peut entraîner une diminution du débit dans l'artère pudique sous étude.

2.1.3.2.3 Principe de Fick

À cause de sa facilité d'utilisation, il s'agit de la méthode la plus utilisée pour

estimer le débit plasmatique mammaire (Linzell, 1974). Cette méthode considère que,

pour une composante donnée, le prélèvement par le tissu (DAV x débit plasmatique) est

équivalent à la quantité sécrétée dans le lait. On considère ainsi un transfert

stœchiométrique du prélèvement mammaire dans la protéine du lait pour certains AA

tels que l'histidine, la méthionine, la phénylalanine et la tyrosine. En connaissant la

sécrétion des AA en protéines du lait (mmol/h) et la DAV mammaire des AA dans le

plasma (mmol/1), on peut donc estimer le débit plasmatique. Les AA les plus utilisés

16

sont la phénylalanine + tyrosine, la tyrosine étant tenue à compte puisqu'elle peut être

dérivée du catabolisme de la phénylalanine (Cant et al., 1993; Thivierge et al., 2002;

Korhonen et al., 2002; Vanhatalo et al., 2003a et b). Dans cette méthode, on fait une

correction du 3,5 % pour les protéines qui sont directement transportées du sang dans le

lait (Cant et al., 1993). Les quantités d'acides aminés libres dans le lait sont

négligeables et ignorées dans ce calcul.

10) Débit plasmatique = ((Phe + Tyr dans la protéine du lait) * 0,965 ) / ( DAV Phe

dans plasma + DAV Tyr dans le plasma).

2.1.3.2.4 Comparaison des méthodes

Le tableau ci-dessous décrit les caractéristiques les plus importantes et les

organes où les différentes méthodes ont été utilisées pour estimer le débit sanguin.

Sondes à ultrason

Mesure de variation dans le

temps mais semble

présenter une sous-

estimation systématique

Vie utile limitée

Coût élevé

Demande une chirurgie

Tissus splanchnique

Glande mammaire

Erreur : 20 1/h (Guinard etal , 1994)

Méthode de dilution pAH

Précision de mesure

mineure

Vie utile longue

Coût moyen

Demande l'implantation

d'un cathéter

supplémentaire - contrainte

de perfusion (pompes,

lignes de perfusion)

Tissus splanchniques

Glande mammaire

Erreur : 30 à 40 1/h

Principe de Fick

II peut y avoir

surestimation s'il y a des

peptides prélevés par la

glande mammaire

Vie utile illimitée

Coût minime

Demande une

quantification des AA du

lait (mais souvent des

valeurs de références sont

utilisées)

Glande mammaire

Erreur : 30 à 40 1/h

17

2.1.3.3 Débit net des acides aminés

Le calcul du débit net se fait par multiplication de la DAV de la concentration du

nutriment étudié et du débit plasmatique ([DAV] x DP). Ce résultat représente le

mouvement net des AA dans le tissu, qu'ils soient prélevés ou relargués. Par exemple,

dans le cas du débit net au niveau portai, il représente la quantité d'AA digérés

rejoignant la circulation après qu'aient été utilisés les AA (de source artérielle ou

provenant de la digestion) par les viscères drainés par la veine porte. Le flux net

splanchnique représente l'approvisionnement post-hépatique net d'acides aminés qui

sont disponibles pour tous les autres tissus (exemple : muscle et glande mammaire)

après l'utilisation au niveau portai et hépatique. Le flux net mammaire représente la

quantité nette d'acides aminés prélevés par la glande mammaire.

2.1.3.3.1 Sang entier ou plasma

Dans la plupart des travaux, le flux plasmatique associé à des concentrations

plasmatiques a été utilisé pour les calculs de débit des AA. Cependant, une sous-

estimation d'environ 16 % a été proposée (Heitmann and Bergman, 1980 ; Danilson et

al., 1987 ; Hanigan et al., 1991) en calculant l'extraction au niveau plasmatique vs.

sanguin par différents tissus. Pourtant, des publications récentes ont démontré au niveau

de la glande mammaire (Pacheco-Rios et al., 1999 ; Macke et al., 2000 ; Thivierge et al.,

2002) et au niveau splanchnique (Lobley et al., 1994) que le plasma est la source

principale des AA.

2.1.3.4 Débit dynamique

Le débit dynamique total représente l'utilisation totale d'un AA, qui dans le cas

le plus simple est égale à la somme de la synthèse de protéines et de l'oxydation dans

les tissus étudiés. Cette estimation ne peut se faire qu'en utilisant un AA marqué et le

calcul est basé sur l'extraction de cet AA marqué par un organe actualisé en AA non

marqué en divisant par l'EI de cet AA. Cela donne le mouvement total unidirectionnel

de la molécule (tracée + traceur) vers l'organe qui est égale à sa sortie dans un système

à l'équilibre.

L'UT-AA a été calculée a partir de l'équation suivante :

18

11) L'UT-AA au niveau d'un organe = (([AA]A x EIA) - ([AA]V

x EIV)) x DP/

Elv

où EIAA et [AA] représentent respectivement l'enrichissement isotopique (El:

mpe) de la molécule perfusée et la concentration plasmatique de l'AA étudié (uM), soit

au niveau artériel (A), soit au niveau veineux (V) et DP, le débit plasmatique de

l'organe étudié. Pour un AA ayant une voie métabolique simple, il est possible

d'estimer l'utilisation pour la synthèse protéique en soustrayant de l'utilisation totale

l'oxydation et la quantité dirigée vers d'autres métabolites. La leucine est souvent

utilisée comme un AA-traceur à cause de la simplicité de ses voies métaboliques avant

son oxydation (Figure 2.2). Nous l'utiliserons donc comme exemple.

Le MOP transformé en leucine et relargué dans la veine mammaire ou en CO2 a

été calculé comme suit:

12) MOP vers Leu ou CO2 (mmol/h) = (([MOPA] x EIMOP-A - [MOPV] x EIMOp-

v) x DPV) / (EIMOP-V)

L'oxydation est calculée en mesurant la différence entre les sites veineux et

artériel de la quantité de molécules de CO2 enrichies au 13C et en actualisant cette

quantité en CO2 total en utilisant l'EI du pool précurseur. L'oxydation est calculée de la

façon suivante :

13) Oxydation (organe ou tissu) = ((([CO2]V x El Co2-v) - ([CO2]A

x El CO2-A)) X

DS) / El MOP-V •) - correction pour l'oxydation du traceur.

Comme on fait l'hypothèse qu'une quantité équivalente à la quantité de la

leucine perfusée comme traceur est en excès dans l'animal et sera oxydée au niveau

corporel, on doit aussi soustraire de l'oxydation tissulaire une proportion de l'oxydation

corporelle que l'on estime équivalente au rapport des oxydations tissulaires sur

l'oxydation corporelle brute.

19

14) Finalement la synthèse protéique se calcule par différence entre UT-AA +

MOP vers Leu - Oxydation

La synthèse de protéines totales est utilisée pour fabriquer les protéines structurales,

fonctionnelles telles que les enzymes ainsi que les protéines d'exportation.

2.1.3.4.1 Choix du pool précurseur

Le choix du pool précurseur pour la mesure du métabolisme protéique au niveau

d'un tissu est aussi critique qu'au niveau corporel, mais demande toutefois une moins

grande généralisation et offre des options supplémentaires. Il est possible d'utiliser des

biopsies de tissus et d'y mesurer l'EI directement au niveau de l'ARN de transfert

(Airhart et al., 1974), lequel serait le précurseur le plus représentatif de la synthèse

protéique (Figure 2.3). Cette mesure étant techniquement très difficile à réaliser à cause

de très courte demi-vie de l'ARN, l'EI de l'AA au niveau intracellulaire est plutôt

utilisé lorsqu'il y a des biopsies (Connel et al., 1997). Il est aussi possible de mesurer

l'EI de l'AA étudié dans le drainage veineux (Figure 2.3) du tissu qui comporte, au

moins en partie, un apport d'AA provenant directement du tissu lui-même. Finalement

pour certains AA, il est possible de déterminer dans le drainage veineux l'EI d'un

métabolite formé intra-cellulaire qui devrait être un bon reflet de l'EI de l'AA au niveau

intra-cellulaire, tel le MOP pour la leucine (Matthews et al., 1982) ou l'homocystéine

pour la méthionine.

20

Absorption

Infusion

ArtèrePP

Intra-cellulaire

!Syntfièse

protqique

Oxydation

im

DégradationI

Protéines

Figure 2.3. Différentes possibilités de choisir le pool précurseur (PP) dans un modèlepour l'étude de la synthèse de protéines avec trois compartiments

2.2 Métabolisme protéique chez la vache laitière

L'utilisation totale des acides aminés comprend globalement la synthèse de

protéines et l'oxydation des AA. La synthèse protéique au niveau corporel est la somme

de la synthèse de protéines au niveau de tous les tissus et organes.

2.2.1 Distribution de la synthèse protéique au niveau corporel

Chez la vache laitière, la synthèse protéique totale varie de 3,5 à 5 kg/jour

(Bequette et al., 1996b ; Lapierre et al., 2002; Thivierge et al., 2002). En comparaison,

la quantité de protéines sécrétée dans le lait représente seulement 25 à 30 % de la

production corporelle totale de protéines. En supposant une rétention azotée nulle, la

différence de 70 à 75 % représente le turnover protéique, soit la synthèse de protéine et

la dégradation correspondante, indiquant l'importance du mouvement dynamique du

métabolisme protéique au niveau corporel.

La contribution du tissu gastro-intestinal et du foie à la synthèse corporelle de

protéines est d'environ 25 à 45 % chez le petit ruminant (Lobley et al., 1993; Lobley et

al., 1994), la vache laitière (Lapierre et al., 2002) et les non-ruminants (Sève et Ponter,

21

1997). Le tissu musculaire contribue seulement à 15 à 20 % de la synthèse protéique

chez un animal en croissance (Lobley et al., 1980), tandis que la synthèse protéique au

niveau mammaire représente 35 à 45 % (Bequette et al., 1996b ; Thivierge et al., 2002 )

de la synthèse protéique corporelle (Figure 2.4).

Comme nous l'avons mentionné dans cette section, la synthèse totale de

protéines par un organe, mesurée lors d'une perfusion continue, représente non

seulement les protéines constitutives mais aussi les protéines d'exportation. Dans la

glande mammaire, la proportion des protéines du lait sur la synthèse de protéines

d'exportation est d'environ 75 à 85 % (Bequette et al., 1996b ; Thivierge et al., 2002).

mammarygland

~ j % Protein mass

~1[% Pratein synthesis

':% Oxygen uptake

Figure 2.4. Contribution des différents tissus à la masse protéique (Protein mass), lasynthèse protéique (protein synthesis) et à l'utilisation nette d'oxygène (oxygen uptake)indicateur de l'énergie utilisée (tiré de Lobley et al., 2002).

2.2.2 Facteurs qui régulent la synthèse protéique

La synthèse de protéines est un processus très complexe. Il existe une série de

facteurs et de mécanismes pouvant la réguler. L'objectif de cette section est de discuter

des aspects fondamentaux impliqués dans la synthèse de protéines en relation avec les

facteurs liés à notre recherche. Chez le ruminant, une augmentation de l'ingestion

22

résulte en une augmentation de la synthèse totale de protéines (Lobley et al., 1987 ;

Lapierre et al., 1999). Mais est-ce la protéine ou l'énergie supplémentaire qui est

davantage responsable de ces modifications ?

2.2.2.1 L'apport en protéines

Une augmentation de l'ingestion de protéines entraîne habituellement une

augmentation de la synthèse de protéines au niveau corporel. Une perfusion post-

ruminale de caséine a entraîné une augmentation de la synthèse totale de protéines de 27

% chez le mouton (Liu et et al., 1995). De même, une augmentation de l'apport en

protéines métabolisables chez la vache laitière d'environ 15 % (Lapierre et al., 2002) et

de 26 % chez la truie (Reed et al., 1981), ainsi qu'une augmentation de l'ingestion de

protéines chez les non-ruminants (Garlick et al, 1991) ont entraîné une augmentation

substantielle de la synthèse protéique.

Chez la vache laitière, une mesure indirecte de la synthèse protéique peut être la

production de matières protéiques laitières. Une augmentation de l'apport en protéines

métabolisables par la ration (Blouin et al., 2002) ou la perfusion de caséine dans le

duodénum (Clark et al, 1977; Guinard et al., 1994; Vanhatalo et al., 2003a) entraîne

généralement une augmentation des protéines sécrétées dans le lait de 20 à 30 %. Tous

ces travaux nous indiquent que la synthèse protéique au niveau corporel est sensible à

l'apport protéique.

Des études in vitro ont démontré que les AA peuvent stimuler la synthèse de

protéines indépendamment des hormones (e.g insuline, IGF-1, somatotrophine et

glucagon; Campbell et al., 1999; Beugnet et al., 2003). Cet effet passerait via la

phosphorylation de la 4E-binding protéine-1 (4E-BP1) et de la 70-kDa protéine

ribosomal S6 kinase (p70 s6k) via la rapamycine mammalienne (mTOR). Ces

mécanismes sont les principaux mécanismes de régulation de la synthèse de protéines

au niveau cellulaire (Liu et al., 2006). Ces voies de signalisation sont présentes au

niveau du tissu mammaire (Choie et al, 2004; Hang et Rillema, 1997). Ce mécanisme

pourrait être celui par lequel les AA stimuleraient la synthèse et la production des

protéines chez la vache.

23

2.2.2.2 L'apport d'énergie

Qu'en est-il de l'impact de l'apport énergétique sur le métabolisme protéique ?

Les études sur le sujet sont beaucoup plus limitées que dans le cas précédent. En

utilisant la production de matières proteiques laitières comme un indice de la synthèse

protéique, il a été rapporté qu'un apport d'énergie sous forme de glucose (perfusé au

niveau du duodénum) ou d'acide propionique (perfusé au niveau ruminai) entraîne aussi

une augmentation de la production de matières proteiques du lait, mais moins prononcée

qu'avec l'accroissement de l'apport protéique (Clark et al., 1977 ; Lemosquet et al.,

1997; Hurtaud et al., 1998; Huhtanen et al., 2002; Sherperd et Combs, 1998). Le

mécanisme proposé est une meilleure utilisation des AA digérés, qui pourrait provenir

d'une diminution de l'oxydation des AA.

Au niveau corporel, Garlick et al. (1991) ont démontré une réduction de

l'utilisation totale des AA avec l'ajout d'énergie. Avec une perfusion d'acide

propionique, cette réduction était associée à une réduction de la dégradation protéique

(Abdul-Razzaq et Bickerstaffe, 1989). Reeds et al. (1981) ont aussi observé une

réduction du catabolisme de la leucine avec l'apport d'énergie.

Au niveau mammaire, les mécanismes par lesquels l'énergie pourrait affecter le

métabolisme protéique n'ont pas été étudiés directement avec des apports d'énergie.

Une perfusion intestinale de glucose à 2398 g/jour en substitution iso énergétique

(Rulquin et al., 2004) a résulté en une augmentation avec un effet quadratique de la

production des protéines du lait mais aussi une augmentation du prélèvement des AA

indispensables, ce qui suggère un autre destin de l'utilisation des ces surplus d'AA. Par

contre, une étude avec perfusion d'acide propionique ou de glucose sur une base

isoénergétique (Rigout et al., 2003) montre une augmentation des protéines dans le lait,

ce qui peut aussi suggérer des réponses similaires indépendamment de la nature du

précurseur énergétique.

Chez les monogastriques, l'insuline peut être liée à la synthèse de protéines,

principalement dans le muscle des animaux en croissance (Garlick et al., 1983). Par

contre, chez les animaux adultes, Melville et al. (1989) rapportent un effet non

significatif de l'insuline sur la synthèse protéique au niveau corporel, mais observent

24

cependant une réduction dans la dégradation des protéines. Aucun effet de l'insuline n'a

été observé sur les DAV mammaires chez la chèvre (Tesseraud et al., 1992), à l'opposé

de Mackle et al. (2000) qui ont observé une diminution des DAV pour l'histidine, la

méthionine et la phénylalanine plus la tyrosine, accompagnée d'une augmentation du

taux d'extraction et de la production de protéines du lait. Par ailleurs, Lemosquet et al.

(2004) suggèrent que l'IGF-1 pourrait être impliquée dans des mécanismes régulant

l'utilisation du glucose et indirectement les AA au niveau mammaire, l'IGF-1

intervenant dans la régulation du débit sanguin.

2.3 Métabolisme mammaire des acides aminés

2.3.1 Introduction

La production de lait et de protéines est très sensible à l'apport protéique dans

les rations (Doepel et al., 2004). Pour maximiser cette production, les producteurs

augmentent l'apport en protéines métabolisables. Cependant, les pressions sociales

exigeant de diminuer l'impact des productions animales sur l'environnement demandent

une réévaluation de cette pratique. Effectivement, lorsque l'on augmente l'apport en

protéines métabolisables, les rendements de transformation de la protéine ingérée en

protéines du lait diminuent selon une loi des rendements décroissants (INRA, 1989;

Doepel et al., 2004) et l'excès d'azote est principalement éliminé sous forme d'urée

excrétée dans l'urine, urée synthétisée lors du catabolisme que subissent les AA

absorbés. Les AA sont métabolisés au niveau de différents tissus, principalement au

niveau du foie, premier organe producteur d'urée, mais aussi, pour certains AA, au

niveau des tissus périphériques incluant la glande mammaire (Lapierre et al., 2005).

Ainsi à l'intérieur de chaque étude, l'augmentation de la production de protéines du lait

provoquée par la perfusion de caséines ou de certains AA (Clark et al., 1977; Rulquin,

1987; Rulquin, 1992; Guinard et Rulquin, 1994a; Bach et al., 2000) affectait de façon

variable les prélèvements nets mammaires des AA. Ces différences de réponses peuvent

en grande partie être liées à des différences de conditions expérimentales entre les

études. Notre objectif est de dégager des lois plus générales de réponses reliant l'apport

en protéines digestibles dans l'intestin (PDI) ou AA digestibles dans l'intestin (AA-DI ;

25

sommes des AA-DI = PDI) aux concentrations artérielles, aux DAV mammaires

(DAVM) et aux prélèvements mammaires (PM) des différents AA.

Pour raisonner sur le métabolisme intra-mammaire des AA, Mepham (1982) a

établi une première classification des AA selon les rapports entre la quantité nette

prélevée par la glande mammaire et celle sécrétée dans les protéines du lait. Cette

classification distingue 3 groupes. Le groupe 1 est composé d'AA sécrétés en quantité

quasi-équivalente à leur PM indiquant un transfert stoechiométrique, donc un ratio

prélèvement : sécrétion d'environ 1. Ce groupe comprend la méthionine, la

phénylalanine et un AA (partiellement) issu de son métabolisme la tyrosine, l'histidine

et le tryptophane. Pour ces AA, la quantité prélevée sur une base nette sert à expliquer la

quantité produite sous la forme de protéines du lait. Ce niveau de transfert rend

relativement improbable leur utilisation, sur une base nette, dans des voies métaboliques

autres que l'incorporation dans les protéines du lait.

Le groupe 2 correspond à des AA prélevés en excès par rapport à leur sécrétion,

qui peuvent donc être oxydés dans la glande mammaire : isoleucine, leucine, valine (les

AA à chaîne ramifiée), arginine, lysine et thréonine. L'excès représente une source

d'azote a-aminé et de squelettes de carbone, qui peuvent être utilisés pour la synthèse

des AA non indispensables (Lapierre et al., 2005) et possiblement d'autres métabolites

tels que l'acétyl-CoA et le succinyl-CoA et pouvant être oxydés comme source

d'énergie intra-mammaire (Clark et al., 1977; Bequette et al., 2005). Le groupe 3

correspond aux autres AA non indispensables (alanine, arginine, aspartate, cystéine,

glutamate, glutamine, proline et serine). Les AA de ce groupe sont prélevés de façon

très variable, et souvent en quantité insuffisante par rapport à leur sécrétion en protéines

du lait. Cette classification correspond-elle à une loi générale s'appliquant à une plage

de variation des apports de PDI allant d'apports ne couvrant pas les besoins en PDI à

des apports largement excédentaires aux besoins ?

Afin de décrire de manière quantitative les lois de rendements décroissants du

métabolisme des AA en réponse à l'accroissement d'apport de PDI ou en AA-DI, et de

déterminer la contribution de la glande mammaire à cette diminution de rendement,

nous avons choisi d'intégrer les résultats publiés de plusieurs études rapportant des

26

bilans nets mammaires avec une méta-analyse permettant d'éliminer l'effet lié aux

publications. Ce type d'approche quantitative a déjà été mené pour établir les lois de

réponses à l'augmentation d'apports d'AA perfusés individuellement dans la revue de

Rulquin et al. (1993 : pour lysine et méthionine). L'originalité de ce travail de méta-

analyse réside dans le fait que les lois seront établies sur un apport variable de PDI (un

ensemble d'AA-DI) et que les relations seront étudiées pour chacun des AA

individuellement mais aussi en considérant les familles décrites par Mepham (1982).

Les objectifs poursuivis ont été les suivants :

1) Déterminer la relation entre les concentrations artérielles en AA et l'apport en

AA-DI. Notre hypothèse était que la concentration artérielle reflétait en partie la

disponibilité de cet AA. Il s'agissait aussi de voir si cet accroissement de

disponibilité mesurée au niveau périphérique variait selon le groupe d'AA

considéré.

2) Déterminer si une augmentation d'AA-DI a un impact sur la DAVM qui, avec le

débit sanguin, compose le prélèvement net mammaire.

3) Déterminer comment évolue le prélèvement net mammaire des AA (individuels

ou en groupes) en fonction de l'augmentation des apports en AA-DI.

4) Vérifier si les groupes d'AA proposés par Mepham (1982) en relation avec leur

ratio prélèvement : sécrétion maintiennent le comportement suggéré lorsque

l'apport en protéines présente une large plage de variation.

2.3.2 Matériel et méthode

2.3.2.1 Formation de la base de données

Une première base de données a été constituée de 25 articles scientifiques, tous

portant sur le métabolisme mammaire des AA chez la vache laitière et publiés dans

différentes revues scientifiques internationales. À partir de cette base, notre principal

critère de sélection était que l'étude devait porter sur des traitements augmentant de

façon appréciable l'apport en PDI. Une première analyse a permis de montrer que

l'apport PDI n'était pas modifié dans les articles de Rulquin et al., 2004; Vanhatalo et

27

al., 2003b (sur le traitement de glucose), Huhntanen et al. (2002), Korhonen et al.

(2000), Metcalf et al. (1994), Lykos et Varga. (1997), Cant et al. (1993), Guinard et

Rulquin, (1994b et 1995), et Mackle et al. (2000). Dans les publications sélectionnées,

l'augmentation de l'apport en PDI a été obtenue par la perfusion post-ruminale de

caséine ou par un apport alimentaire en protéines très peu dégradées au niveau ruminai

(Prolak© et farine de poisson).

Les critères supplémentaires de sélection ont d'abord été basés sur les variables

mesurées rapportées dans les articles et sur les possibilités de recalculer les paramètres

manquants. Les articles devaient rapporter :

1. Les résultats zootechniques : ingestion des aliments et composition de la ration,

production laitière et de protéines du lait.

2. Contenir l'information pertinente sur les AA (indispensables et non

indispensables) : les concentrations artérielles, les DAVM et/ou les prélèvements

nets mammaires. Seuls les travaux de Metcalf et al. (1991 et 1994) présentaient

des données manquantes sur les concentrations. On notera que différentes

techniques de mesure et d'estimation du débit plasmatique ont été employées :

sonde débitmétrique à ultrasons (Guinard et Rulquin, 1994a), méthode de

dilution du para-aminoahippurate (Metcalf et al., 1991 et 1996) ou principe de

Fick utilisant deux « AA marqueurs » (Phe-Tyr ; Raggio et al., 2004 et 2006,

Miettinen et Huhtanen. (1997), Vanhatalo et al, 2003 a et b, Korhonen et al.,

2002).

Finalement, une vérification a été faite sur la base de données restantes pour

déterminer s'il y avait des articles dont les données étaient en dehors de l'intervalle

déterminé par la moyenne des observations ± 2 écart-types. Aucun article n'a été

enlevé sur cette base.

Compte tenu du nombre restreint de publications disponibles (8), nous avons

inclus les résultats de nos deux essais (Raggio et al, 2004 et 2006) dans cette méta-

analyse. Finalement, dix articles ont été retenus qui rencontraient nos critères de

sélection: Clark et al. (1977), Metcalf et al. (1991, 1994), Guinard et Rulquin.

(1994a), Korhonen et al., (2002), Miettinen et Huhtanen (1997), Vanhatalo et al.

(2003a, b), Raggio et al. (2004, 2006).

2.3.2.2. Recalculs effectués

Les recalculs ont permis de compléter des donnés manquantes (ex : le débit

plasmatique, les prélèvements nets d'AA). Ils ont aussi été effectués pour comparer les

résultats sur une base homogène.

a. Mesures du métabolisme mammaire

Dans les articles où le débit plasmatique n'était pas rapporté, il a été calculé avec le

principe de Fick appliqué à Phe+Tyr (Clark et al., 1977), en utilisant les DAVM et la

production des protéines rapportées. Pour cela, nous avons utilisé la composition des

AA des protéines brutes du lait proposée par Swaisgood (1995), considérant que les

protéines synthétisées par la glande mammaire représentaient 96,5 % des protéines du

lait (Cant et al., 1993).

Lorsque les prélèvements nets des AA n'ont pas été publiés ou donnés par les

auteurs (Guinard, communication personnelle), ils ont été recalculés en utilisant les

débits plasmatiques et les DAVM : Clark et al. (1977), Metcalf et al. (1991), Miettinen

et al. (1997), Vanhatalo et al. (2003a et b). Tous les prélèvements nets des AA ont été

recalculés pour une demi-mamelle, de manière à obtenir des données homogènes. Pour

pouvoir analyser de façon homogène le ratio prélèvement mammaire : sécrétion dans les

protéines du lait, ces ratios ont tous été recalculés en prenant une composition unique en

AA des protéines sécrétées dans le lait (Swaisgood, 1995). Nous avons également re-

exprimé l'ensemble des matières protéiques du lait sous forme de protéines brutes

(Guinard et Rulquin, 1994a; Raggio et al., 2006).

b. Calcul des valeurs alimentaires

Les apports en AA-DI ont été estimés à l'aide du système d'alimentation INRA, les

valeurs des tables d'alimentation INRA ainsi que les tables des AA-DI des aliments des

ruminants (Rulquin et al., 2001). Nous avons utilisé les articles rapportant la

composition biochimique des aliments à titre de référence pour réaliser le choix des

29

aliments à retenir dans les tables de référence. À défaut, toutes les valeurs relatives à la

composition des PDI, des AA-DI apportés par jour et à l'énergie apportée ont été

recalculées à partir des valeurs des tables de référence (Rulquin et al., 2001).

2.3.2.3 Modèle du calcul utilisé

Par l'intermédiaire de ces premières représentations graphiques des données

brutes, nous avons pu constater qu'il existait des relations intra-essai cohérentes entre

l'apport PDI et les paramètres du métabolisme des AA avec des pentes intra-essai

proches.

Notre objectif était de chercher une loi générale décrivant l'ensemble des

relations intra-essai observées en se départissant de différences liées au niveau de

production des vaches, à leur conduite expérimentale, aux techniques de mesure et

d'analyse de l'équipe.

C'est pourquoi à partir de ces dix articles, nous avons introduit dans le modèle

statistique d'analyse, le facteur «essai». Ce facteur est considéré comme «fixe». Dans ce

cas, chaque essai est considéré comme issu d'une population différente. L'apport PDI

était alors introduit comme une covariable :

Réponse linéaire : Yy = ESSAI + Ao + Bi X + e y

Réponse curvilinéaire: Yy = ESSAI + Ao + Bj X + Bi X2 + e y

Où X = est l'apport PDI ou l'apport AA-DI

Y = le paramètre étudié

2.3.3 Résultats

Sur cette base de données, la composition en AA exprimée en pourcentage de

PDI dans la ration a varié mais seulement entre essais (Tableau 2.1). Cette composante

ne pourra donc pas être prise en compte dans la présente analyse, vu le faible niveau de

variation à l'intérieur de chacune des études. Dans la base de données utilisée, la

production laitière (PL) variait de 20,8 à 36,2 kg/j avec une production de protéines du

lait de 686 à 1109 g/j et une augmentation de PDI de 1323 à 3090 g/j (Tableau 2.2).

Dans cette base de données obtenues chez des vaches opérées multi-cathérisées, nous

30

avons obtenu un rendement d'augmentation de la production de matières protéiques du

lait de 28 en réponse à l'apport PDI (Figure 2.5). Ce rendement est tout à fait

comparable à celui obtenu dans la littérature plus abondante sur vaches non opérées,

recevant une alimentation protéique conforme aux recommandations (Doepel et al.,

2004; Hanigan, 2005).

Acides aminés, %PDI

ArginineAspartateGlutamineGlycinePralineSerineHistidineIsoleucineLeucineLysineMéthioninePhénylalanineThréonineTyrosineValine

Minimum4,49,912,34,94,44,62,04,88,36,41,64,74,74,15,4

Maximum5,311,417,86,67,35,62,65,710,18,32,65,76,05,06,4

Variation ( %)211545346623331922286322272418

Tableau 2.1. Variation inter-essai, de la composition en AA des PDI dans les essaisutilisés pour constituer la base de données

VariableIngestion1, kg/dPL2, kg/dPDI3 g/dPB4, %

g/d

Moyenne18,828,3

1882,832,0

896,9

Minimum15,320,8

1323,924,6

686,4

Maximum24,736,2

3090,538,2

1109,0

É. Type2,44,4

415,73,24,6

CV %12,915,622,1

9,811,2

n2727272727

'Matière sècheProduction du lait2Protéines digestibles dans l'intestin estimées par le système PDI (INRA, 1989)'Protéine brute du lait ( % et g par jour)

Tableau 2.2. Caractéristiques zootechniques de la base de données

C.Pioteine biule [

1000 1500 2000 2500 3000 3500

! 27 ports / 27 données | PDI (g/j)

1300

I2IXI

11(10

1000

31»

1100

m

1)00

tProleine biule (g'i l

1000 1500127 ponts/27 durées |

2(100 2500 3000 350O

PDI W,i

Concentration en protéines brutes du lait (%) = 0.0034 X (P < O.OO1) + 26.116 (P < 0.001), r2 0.96, Syx 0.36, essai P < 0.001.Production de protéines brutes du lait (g/d) = 0.2782 X (/>< 0.001) + 358.45 (P < 0.001), r20.96, Syx 0.35, essai P< 0.001.

Figure 2.5. Augmentation de la production de protéines brutes dans le lait en fonctiondes apports PDI

Comme une des questions était de vérifier si la classification de Mepham (1982)

sur le comportement des AA se maintenait avec des apports variables en protéines, nous

avons examiné les relations étudiées à l'intérieur de chaque groupe, c'est-à-dire pour

chaque AA pris individuellement et en faisant la somme de tous les AA du même

groupe. Comme le comportement des AA à l'intérieur de chaque groupe était

effectivement relativement similaire, nous avons choisi pour simplifier la présentation,

de présenter les résultats d'un AA de chaque groupe avec la somme de chaque groupe

pour les AA indispensables. Quant aux AA non indispensables du groupe 3, les

comportements étant tellement variables d'un AA à l'autre, nous avons voulu éviter de

faire une somme de groupe mais présentons plutôt deux AA ayant des comportements

très différents : l'arginine et la glutamate. Pour le glutamate, il est important de savoir

que le glutamate DI représente la somme du glutamate et la glutamine. Il est à noter que

comme l'arginine n'est pas un AA indispensable dans le sens strict du terme (il y a une

synthèse endogène importante), et que de plus elle avait un comportement différent des

autres AA du groupe 2 dans le ratio PM : PL, nous l'avons exclue de ce groupe et

incluse dans le groupe 3.

32

2.3.3.1 Concentrations artérielles

Les AA des trois groupes répondent de façon différente à une augmentation de

la quantité d'AA-DI. A titre d'exemple, l'histidine, classée dans le groupe 1, retrouve

une réponse curvilinéaire (P < 0,01) d'augmentation des concentrations artérielles avec

un accroissement des AA-DI, avec un coefficient de détermination (r2) égal à 0,94

(Figure 2.6). Pour la somme des AA du groupe 1, pour des augmentations d'apport en

AA-DI de ce groupe allant jusqu'à 80 mmol/h, la réponse de la concentration artérielle

augmente de 2,27 uM par mmol/h d'AA DI du groupe 1 apporté. Pour des apports

supérieurs, cette réponse diminue, ce qui traduit un effet curvilinéaire (P < 0.01) avec

un coefficient de détermination élevé de 0,97.

CJliilHliwAluMl

7.0 9.5 12.0 14.5 17.0 19.5( 27 ports / 27 données ] Hitlidine DI [mmo/h)

m

225

200

1/5

150

175

100

C.Groupe 1 A |uM)

45 50 55 60 65 70 75 90 95 90 95 100127 ponts / 27 données | Groupe 1 DI (mnol/h]

|A| jiM Histidine = -0,456 X2 (P < 0,01 )+ 16,174 X (P < 0,001) - 83,412 (P < 0,01 ), r2= 0,94, Syx 5,59, essai P = 0,06.Groupe 1 = -0,002 X2 (P = 0,007) + 5,635X (P = 0,02) - 94,679 (P = 0,02), r2= 0,97, Syx 7,86, essai P < 0,01.

Figure 2.6. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles des AA du groupe1

Pour la leucine et la somme des AA du groupe 2, il existe une relation linéaire

positive (P < 0,001 : r2 = 0,92 et r2 = 0,97) entre les concentrations artérielles et l'apport

d'AA-DI (Figure 2.7). Une des différences avec le groupe 1 reste cependant l'amplitude

de l'augmentation d'AA-DI du groupe 2, variant de 120 à 250 mmol/h et résultant en

une augmentation linéaire de la concentration artérielle de 4,37 uM par mmol/h d'AA

DI du groupe 2 (Figure 2.7).

33

250 r

« I

150

II»

C.LeuciiwA|uM)

35 45 55 G5

[ 27 ponls/27 donnés!]

75 85

l.eucine Dl |m»nl/h]

) ( 0 ) C_G.om.2A[uM|

875

750

625

500

250

100 125 150 175 200 225 250 275 300

127 ports/27 données] Groupe 2 Dl (maol/h]

[A] jiM Leucine = 3,5601X (P < 0,001) - 55,786 (P < 0,01), r = 0,92, Syx 15,20, essai P = 0,07.Groupe 2 = 4,3757X (P < 0,001) - 173,84 (P < 0,001), r2 = 0,97, Syx 36,93, essai P < 0,001.

Figure 2.7. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles des AA du groupe2

Les concentrations artérielles des deux AA du groupe 3 que nous avons décidé

d'étudier ne répondent pas de façon similaire aux augmentations d'apports. Dans le cas

de l'arginine, nous observons aussi une relation positive en réponse à une augmentation

en arginine Dl (P < 0,001), l'augmentation de concentration étant comprise entre 45 et

105 uM en réponse à une augmentation de l'arginine Dl de 12,5 à 25 mmol/h (P <

0,001; r2 = 0,94. Figure 2.8). Par contre, la réponse de la concentration artérielle du

glutamate est une courbe curvilinéaire négative (P = 0,02), avec un coefficient de

détermination plus faible (r2 = 0,60. Figure 2.8).

105

95

m

m

65

59

C.Aig«»A(uM]1,1111

57.S

550

52.5

5(1.11

4/.!i

C_GUamatsA[uM]

12.5 15.0

124 poinls / 24 données ]

20.0 22.5 25.0

Aigimne Dl («raol/h]

55 G0 G5 70 75 80 05 90 95 100 105 110

124ports/24données ] i i lul • Dl (ramal/h)

34

[A| 11M Arginine = 4,0415 X (P = <0,001) - 5,3716 (P = 0,6), r2 = 0,938, Syx 4,49, essai P < 0,001Glutamate = 0,0066 X2 (P = 0,02) - 1,1761 X (P = 0,01) + 102,99 (P < 0,001), r2 = 0,60, Syx 2.9, essai P =

0,02

Figure 2.8. Effet des apports en PDI sur les concentrations artérielles d'AA nonindispensables

2.3.3.2 Différences artério-veineuses mammaires

Avec les AA du groupe 1 (et histidine), on observe une distribution curvilinéaire

(P — 0,10) de la DAVM en réponse à l'augmentation d'AA-DI, mais plus hétérogène,

avec un r2 =0,73, qu'avec la concentration artérielle (Figure 2.9).

C^HiilidineAVIuM)

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0127 ports / 27 données | Hillidi» PDI [mnol/h]

80

75

71)

1,5

60

56

M

45

41)

127

C.Groupe 1 AV |uM|

45 50 55 C0 69 70 75 80 85 90 35 100

ohls / 27 données | Groupe 1 Dl (mmal/h)

|DAVM|nM Histidine =-0,091 X2 (P = 0,05) + 2,782 X (P = 0,02) - 7,046 (P = 0,02), r2 = 0,68, Syx 1.7, essaie P = 0,01Groupl = -0,0122 X2 (P = 0,10)+ 2,286 X (P = 0,04) - 34,399 (P = 0,1), r2= 0,73, Syx 7,3, essaie P = 0,07

Figure 2.9. Effet des apports en PDI sur les différences artério-veineuses mammaires(DAVM) des AA du groupe 1

Pour les AA du groupe 2, la réponse des DAVM en fonction de l'apport en AA-

DI reste linéaire (P < 0,001) avec un coefficient de détermination élevé (r2 = 0,90:

Figure 2.10). Il en résulte une augmentation linéaire de la DAVM augmentant de 1,34

uM par mmol/h des AA-DI du groupe 2 apportés. La leucine suit un schéma très

similaire, tout comme les autres AA de ce groupe (Figure 2.10).

35

100 r

CJ.eucineAV[uMl

35 40 «5 50 55[ 27 point/ 27 (tonnées ]

65 70 75 80 85

Leucine PDI (mnal/hl

300

150

C_Gioupe2 AV (uM)

100 150[ 27 ports / 27 données ]

250 300

Gii«i|>e2 PDI |mm)l/h)

IDAVM) uM Leucine = 1,195 X (P < 0,001) - 3,2402 (P = 0,3), r2l= 0,90, Syx 6,76, essaie P = 0,01.Groupe 2 = 1,3426 X (P < 0,001) - 21,675 (P = 0,5), r2 = 0.90, Syx 22,27, essaie P < 0,01.

Figure 2.10. Effet des apports en PDI sur les différences artério-veineuses mammaires(DAVM) des AA du groupe 2

Dans le cas de l'arginine, on observe que les DAVM ont augmenté de façon

linéaire (P < 0,01) de 15 à 40 uM pour une augmentation d'arginine DI d'environ 12

mmol/h, avec un r2 de 0,79 (Figure 2.11). Le glutamate montre une réponse

curvilinéaire négative (P = 0,07; Figure 2.11) entre les DAVM et les apports en

glutamate DI, mais avec un faible coefficient de détermination de (0,36).

C_ArgraeAV|uM|

12.5 15.0

12* poils H4 données |

17.5 20.0 22.5 250

AiginneDIImnolAi)

CGMamaleAVIuM]

8S 95 105

Glutamate 01 lranol/h|

|DAVM] jiM Arginine = 1,6499 X (P < 0,01 ) - 0,1912 (P = 0,8), r2 = 0,79, Syx 3,68, essaie P = 0,26Glutamate = 0,0047 X2 (P = 0,07) - 0,7915 X (P = 0,06) + 70.64 (P = 0.6), r2 = 0,35, Syx 2,27, essaie P = 0,03

36

Figure 2.11. Effet des apports en PDI sur les différences artério-veineuses mammaires(DAVM) des AA non indispensables.

2.3.3.3 Le prélèvement mammaire des AA

Pour l'ensemble des AA, les formes de courbes obtenues reliant les apports en

AA-DI et les prélèvement sont proches de celle obtenues sur les DAVM, mais les

relations avec les débits sont mieux corrélées (valeurs de P plus significatives et r2 plus

élevés) que les relations avec les DAVM seulement. Pour l'histidine et la somme de

tous les AA du groupe 1, on observe une réponse curvilinéaire (P - 0,02) du

prélèvement mammaire en fonction de l'augmentation de l'AA-DI. Toutefois, la

curvilinéarité (P = 0,02) de la réponse est moins accentuée (coefficient du X2 0,024 vs

0,003 pour le PM de l'histidine vs Groupe 1 respectivement ; Figure 2.12) quand on

tient compte de tout le groupe 1, mais toujours avec la même tendance (r2 = 0,87).

4.5

1.0

C_Hiitidine UP (nnol/hi

5.0 7.5 W.0 12.5 15.0 17.5 20.0

[ 27 pouls / 27 données | Hiilidm Dl [mnuil/h]

C_Gioi*e1UP|mnDl/h)

«5 55

|27 pouls/27 données |

65 75 85 95

Groupe 1 Dl (mnol/hl

PM mmol/h Histidine = - 0,0241 X2 (P = 0,02) + 0,749 X (P < 0,01) - 1,784(P = 0,1), r2 = 0.791, Syx 0,36, essai P <0,01.Groupe 1 PM = - 0,0029 X2 (P = 0,04) + 0,5579 X (P < 0,01) - 6,2935 (P = 0,3), r2 = 0.87, Syx 1.26, essai P < 0,01

Figure 2.12. Effet des apports en PDI sur le prélèvement mammaire (PM) des AA dugroupe 1

Par contre, pour tous les AA du groupe 2, la seule réponse sur le PM net que

nous avons observée était linéaire (P < 0,001; r2 = 0,92), ce qui indique une relation qui

ne diminue pas à des apports élevés, comme on l'avait observé pour les AA du groupe 1

(Figure 2.13).

37

C_LeucmeUP|iMiol/h| C.Gioupe 2 UP (nnol/h)

35 45

[ 27 pmnls / 27 dcnnées 1

75 86I eucine Dl (nmnf/h)

100 125 150 175 200 225 250 275

|?7 ponts/27 domées] Groupe 2 Dl (mnoWll

PM mmol/h Leucine = 0,315 X (P < 0,001 ) + 0,291 (P =0,6), r2 = 0,86, Sxy 1,98, essai P < 0,01Groupe 2 = 0,0891 X (P <0,001 ) - 0,4497 (P = 0,7), r2 = 0,92, Sxy 1,32, essai P < 0,001

Figure 2.13. Effet des apports en PDI sur le prélèvement mammaire (PM) des AA dugroupe 2

Dans le cas de l'arginine, la réponse est linéaire et positive (P = 0,05), aussi avec

un coefficient modéré de détermination (r2 = 0,58; Figure 2.14). Pour les acides aminés

non indispensables, par exemple pour le glutamate, on observe une relation globale

négative mais non significative linéaire puisque la pente négative n'est pas différente de

zéro (P = 0,12) avec un faible r2 de 0,23 (Figure 2.14).

C_Aiginine UP [nanol/hl

12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0

124 parts / 24 données ] Arginine Dl |mnnl/h)

13.50

12.75

12.10

11.26

10.M

9.B

9.00

C.GMamalsUP[mnl/h]

J

50 GO 70

) 21 points / 24 donnéES ]

90 100 110GlutamaleDI[wnoiyh|

PM mmol/h Arginine = 0,3337 X (P = 0,05) + 2,4621 (P = 0,36), rz = 0,58, Sxy 1,22, essai P = 0,02

Glutamate PM = -0,034 X (P= 0,12) + 14,002 (P = 0,02), r2 = 0,23, Sxy 1,43, essai P = 0,03

Figure 2.14. Effet des apports en PDI sur le prélèvement mammaire (PM) des AA nonindispensables

2.3.3.4 Le ratio prélèvement mammaire sur sécrétion en protéines du lait

Dans le groupe 1, on observe une réponse curvilinéaire (r2 = 0,37) entre le ratio

PM sur la sécrétion en protéines du lait (PM: PL) en fonction de l'apport en AA-DI

quand on utilise l'histidine comme représentant du groupe (Figure 2.15). Dans tout le

groupe 1, la relation entre le ratio et l'apport PDI est linéaire, avec aussi un faible

coefficient de détermination (r2 = 0,26; Figure 2.15). Les ratios sont compris entre 0,7 et

1,2 pour la moyenne de tous les AA du groupe 1, avec une pente qui a tendance à être

différente de zéro (P = 0,08), mais un très faible r2 de 0,26. Cependant, pour la majorité

des AA du groupe 1, le ratio se distribue de 0,89 à 1.1. Il y a deux observations

provenant d'une même expérience où le débit a été mesuré avec une sonde à ultrason

(Guinard et Rulquin, 1994a) qui se situait en dehors des autres : sans ces deux

observations, la pente n'est plus différente de zéro (P = 0,89).

i! il 8.5 11.0 13.5 11,11 18.5[ 31 ponts / 31 données ] Hitlidine Dl (mmol/h)

C. Groupe 1 rai»

1.2

1.1

1.0

0.3

11.»

0 7

45 55[ 27 porits / 27 données ]

85 95Groupe 1 Dl {imnl/h)

Ratio PM:PL Histidine = -0,006 X2 (P = 0,08) + 0,17 X (P = 0,05) - 0,57 (P = 0.9); r2 0,37, Sxy 0,13, essai P <0,01

Groupe 1 = -0,0027 X (P = 0,08) + 0,799 (P = 0,8); r2 = 0.26, Syx 0,08, essai P = 0,01

Figure 2.15. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire et sécrétion enprotéines du lait (PM: PL) des AA du groupe 1

Pour le groupe 2, on observe une réponse linéaire positive avec un r2 = 0,76

(Figure 2.16). Cette réponse a une pente différente de zéro (P < 0,01) qui indique que le

prélèvement net mammaire est bien supérieur aux quantités sécrétées dans les protéines

du lait. Cette relation linéaire traduit un accroissement plus rapide du prélèvement net

d'AA par rapport à la quantité sécrétée dans le lait lorsque l'apport en AA-DI augmente.

1.75

1.M

1.25

1.00

0 7!,

II.M

200

1.75

1.50

1.K

100

0.75

II Ml

CJiloupe 2 tdln

35 « 45 50 55 60 E5 70 75 G0 85

127 pointe / 27 données ] Leucine DI [mniol/h]

100 125 150 175 200 225 250 275

127 ports / 27 données | Bioupe 2 Dl (mnol/h)

Ratio PM:PL Leucine = 0,0149 X (P < 0,01) + 0,4242 (P = 0,08;, r2= 0,77, Syx 0,14, essai P = 0,03Groupe 2 = 0,0048 X (P < 0,01) + 0,5336 (P= 0,02), r2 = 0,76, Syx 0,13, essai P < 0,01

Figure 2.16. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire sur protéinesdu lait (PM : PL) des AA du groupe 2

Pour les AA non indispensables, les ratios PM : PL sont variables. L'arginine

présente un prélèvement supérieur à sa sécrétion dans le lait, avec des valeurs entre 1,52

à 2,78, mais avec aucune relation entre l'apport en arginine DI et le prélèvement (r2 =

0,003; Figure 2.17). Par contre, pour le glutamate, les valeurs sont inférieures à 1 (0,6 à

0,99) et négativement reliées (r2 = 0,58) à l'apport en glutamate DI (Figure 2.17).

40

3.00

2.75

2.50

2.25

2.00

1.75

1 50

CAiginine ratio

-

-

-

-

-

m126 ports/ 26 données!

l«

t i

• .

*

*|

1b

•

1 1

4 * •

i t

20 25Aiginine Dl (nmnl/h]

1.1

1.0

0.9

C_Slula<i>ate iatn

0.5

50 60124 ponts/2« données |

90 nui 110Glutamate Dl (nmolVhl

Ratio PM:PL Arginine = 0,0052 X (P = 0,91 ) + 2,1441 (P = 0,02), r2 = 0,003, Syx 0.30, essai P = 0,09Glutamate = - 0,0059 X (P< 0,01) + 1,2254 (P <0,01), r2 = 0,58, Syx 0.14, essai P =0,10

Figure 2.17. Effet des apports en PDI sur le ratio prélèvement mammaire et protéines dulait (PM : PL) des AA non indispensables

2.3.4 Discussion

La concentration artérielle en réponse à une augmentation de l'apport en PDI (ou

AA-DI) varie selon le groupe d'AA. Pour les acides aminés du groupe 1, la réponse est

curvilinéaire, avec une première partie de réponse linéaire. Les AA de ce groupe qui

sont prélevés par la glande mammaire en quantité équivalente à la sécrétion en protéines

du lait sont principalement métabolisés par le foie (Hanigan, 2005; Lapierre et al.,

2005). À des apports plus faibles, l'approvisionnement post-hépatique augmenterait

jusqu'à l'atteinte d'une certaine limite au-delà de laquelle le foie régulerait de façon

plus serrée le catabolisme de façon à éviter une hyperaminoacidémie. Avec le groupe 2,

avec les niveaux d'apport dans ces études, la réponse des concentrations artérielles à des

apports croissants de AA-DI demeure strictement une réponse linéaire. Ces AA ne sont

que peu catabolisés par le foie (Hanigan, 2005; Lapierre et al., 2005) mais plutôt par les

tissus périphériques, ce qui permettrait à une augmentation de l'apport en AA-DI

d'atteindre la circulation périphérique avant d'être catabolisée. La raison métabolique

de ces différences dans les principaux sites de catabolisme des AA indispensables n'est

pas claire, mais il a été proposé que certains AA, spécialement la leucine, agissent

comme un signal métabolique indiquant aux organes périphériques le niveau

41

d'approvisionnement en AA, agissant même en interaction avec les hormones pour

stimuler la synthèse protéique (Wray-Cahen et al., 1998). Cette démonstration a été

clairement faite chez le non ruminant, mais n'a pas été aussi clairement démontré chez

le ruminant (Wester et al., 2004). Il n'y a pas une réponse unique pour les AA du groupe

3, qui sont absorbés mais aussi produits par l'organisme. Les concentrations artérielles

des deux AA présentés (arginine et glutamate) ne reflètent plus seulement l'absorption

mais traduisent aussi le métabolisme corporel (demande et synthèse).

Les concentrations artérielles de l'arginine, bien que la synthèse de novo puisse

représenter jusqu'à 40 % de l'approvisionnement global, sont très reliées à l'arginine

DI, suggérant qu'une augmentation de l'apport digestif ne supprime pas la synthèse

endogène. Le glutamate offre une relation toute autre entre ses concentrations et

l'apport digestif. La diminution des concentrations en glutamate suite à une

augmentation de l'apport digestif en glutamate, parallèle à l'augmentation en PDI, peut

être reliée au rôle des AA non indispensables comme la glutamine à servir de «

réservoir azoté » lors de carence en azoté (Bergen, 1979; Lacey et Wilmore, 1990)

expliquant ainsi l'augmentation observée à des apports plus faibles. Cette diminution

observée avec l'augmentation en PDI pourrait aussi être associée à une demande plus

importante en glucose suite à l'augmentation de la production de lait (lactose) et aussi à

l'augmentation des besoins énergétiques pour couvrir l'accroissement de la synthèse

protéique.

Pour les AA du groupe 1, la DAVM et la quantité prélevée répondent de façon

curvilinéaire à l'apport d'AA-DI. En fait, cette relation curvilinéaire s'explique en partie

par une relation linéaire entre la concentration artérielle et la DAVM qu'il sera

intéressant d'exploiter dans le futur. La forme curvilinéaire de ces réponses reste à

expliquer par rapport à la relation linéaire entre l'apport PDI et la protéine du lait et le

ratio PM : PL s'approchant de l'unité. Les réponses curvilinéaires ne sont pas en

relation parfaite entre l'apport PDI et la protéine sécrétée dans le lait et l'analyse de la

relation PM : PL, peut-être à cause d'une accumulation des erreurs expérimentales et

aussi d'une grande variabilité de données observées. De tout manière, on n'observe pas

de relation (r2 = 0,26) entre l'augmentation de AA-DI et le ratio PM : PL, ce ratio nous

42

indiquant que le prélèvement mammaire des AA du groupe 1 s'ajuste bien avec la

quantité nécessaire pour la production lactée. Cette classification correspond à celle de

Mepham (1982) du groupe 1. Bien que la variabilité des ratios aille de 0,7 à 1,2

(Guinard et Rulquin 1994a), si on supprime 2 observations extrêmes, la variation

diminue de 0,9 à 1,03, ce qui indique un transfert prélèvement : sécrétion dans le lait

très près de l'unité, confirmée par une pente non différente de zéro (P = 0,89). Donc,

même avec des apports variables en PDI, la relation du transfert stoechiométrique est

maintenue. Cependant, pour le groupe 1, l'une des limites de notre analyse était que sur

les 10 articles, 8 étaient basés sur un débit sanguin estimé par le principe de Fick

appliqué à Phe+Tyr qui ajuste le ratio à 1 pour ceux-ci.

Pour le groupe 2, on observe une réponse linéaire entre les DAVM ou les

prélèvements et l'apport AA-DI. Cette réponse indique qu'avec des apports plus grands,

les prélèvements mammaires continuent d'augmenter de façon linéaire. Ce prélèvement

devient donc bien supérieur aux quantités sécrétées, indiquant un métabolisme intra-

mammaire majeur de ces AA. Cet excès de prélèvement peut être oxydé (Bequette et

al., 1996a) et l'azote des ces AA utilisés pour la synthèse d'AA non indispensables

(Lapierre et al., 2005). Ces résultats indiquent clairement que la glande mammaire peut

devenir un site important de catabolisme des AA du groupe 2, catabolisme qui

augmenterait en fonction de l'apport en AA-DI.

Pour les AA non indispensables, la réponse est très variable et une généralisation

de groupe ne peut être dégagée. Pour l'arginine, largement prélevée en excès par rapport

aux besoins en sécrétion de protéines du lait, l'absence de relation claire entre le ratio du

PM : PL ne permet pas vraiment de tirer de conclusion sur les besoins métaboliques de

la glande mammaire. Le ratio PM : PL du glutamate répond de façon négative, avec une

diminution des prélèvements à mesure qu'augmente l'absorption. Cette variation

pourrait être attribuée au rôle de navette azotée du glutamate, transportant au foie les

excès d'N, devant être détoxifiés en urée, prélevés sur les acides aminés du groupe 2

non-utilisés directement pour la synthèse protéique. Une augmentation du ratio PM : PL

de la lysine augmenterait de façon importante la synthèse de glutamate intra mammaire

(Lapierre et al., 2003 et 2005).

L'une des limites à cette méthode expérimentale est que tous les prélèvements

mammaires sont faits à partir des AA libres. S'il y a prélèvements de peptides par la

glande mammaire, et ce plus vraisemblablement à des apports faibles en PDI, la DAVM

sera sous-estimée. Si tel est le cas, le débit plasmatique calculé à partir du principe de

Fick sera surestimé. L'impact final sur le calcul du prélèvement mammaire sera une

surestimation s'il y a des peptides prélevés et ce biais pourrait donc varier avec l'apport

en PDI. Par contre, les prélèvements mammaires calculés avec les sondes

débitmétriques pourraient être sous-estimés si en plus des AA libres il y a

approvisionnement à la glande mammaire d'AA sous forme de peptides. Le calcul du

débit plasmatique avec le principe de Fick suppose aussi qu'à un apport élevé, il n'y a

pas de catabolisme des AA marqueurs dans la glande mammaire mamelle. Si tel n'était

pas le cas, le débit serait par ailleurs sous-estimé. Dans le travail de Bequette et al.

(1999), il a été estimé chez la chèvre que l'utilisation par la glande mammaire de

peptides contenant de la phénylalanine, de la tyrosine et de la méthionine était

dépendante du niveau circulant d'AA libres. Cependant, la différence de ratio d'EI

artériel et veineux entre le groupe 1 et 2 attribués au prélèvement de peptides pourrait

aussi provenir du prélèvement excédentaire à la sécrétion des AA du groupe 2

comparativement au groupe 1. Cependant ces conclusions restent à démontrer chez la

vache et la différence d'EI observée entres les AA pourrait ne pas impliquer de

prélèvement de peptides, à rencontre de l'hypothèse avancée par ces auteurs.

2.3.5 Conclusion

Dans ce travail de méta-analyse, on a observé que le comportement des groupes des AA

proposés par Mepham (1982) se maintenait sur une large plage d'apport PDI. Il est

intéressant d'observer le même type de réponses à l'intérieur de ces groupes d'AA. Pour

le groupe 1 : la réponse de la concentration artérielle et de prélèvement mammaire a été

curvilinéaire à des apports de PDI, ce qui se traduit par un métabolisme des ces AA au

niveau hépatique. Par contre, pour le groupe 2, la concentration artérielle et le

prélèvement mammaire, montre une réponse linéaire, mais avec un ratio PM : PL qui

augmente, indiquant une oxydation grandissante au niveau mammaire. Le ratio PM : PL

pour le groupe 1 n'est pas significativement différent de 1, ce qui démontre un transfert

44

stoechiometnque du prélèvement de ces AA dans le lait maintenu à des apports

variables d'AA-DI.

45

2.4 Objectifs de thèse

Des travaux antérieurs ont démontré qu'une augmentation des apports protéiques

entraîne généralement une augmentation de la production de matières protéiques du lait,

mais avec une efficacité marginale décroissante (Doepel et al., 2004). Ainsi, elle

entraîne une diminution de l'efficacité de la transformation des protéines digérées en

protéines de lait. Cette diminution d'efficacité doit-elle être reliée à une augmentation

du catabolisme des AA, principalement au niveau hépatique ? Par ailleurs, comment

sera affectée l'utilisation des AA au niveau mammaire ? Les objectifs de la thèse sont

donc :

Objectif 1 : Déterminer comment une augmentation de la protéine

métabolisable par la ration affecte l'extraction hépatique des AA essentiels et

l'utilisation de ces AA par la glande mammaire. Il s'agira de relier l'amplitude des

variations des extractions hépatiques avec l'efficacité «absorption-production de

protéines de lait».

Il n'y a très peu de données dans les travaux antérieurs sur la production des

protéines plasmatiques, principalement synthétisées par le foie et exportées dans le

plasma, chez les ruminants (Connell et al., 1997). Comment va être affecté le taux de

synthèse de ces protéines par différents niveaux de protéines métabolisables ingérées ?

Quelle sera la priorité métabolique de cette synthèse chez une vache laitière exigeant un

apport considérable d'AA pour maintenir sa production laitière ? Par ailleurs, quel sera

le pourcentage d'extraction hépatique d'un AA largement prélevé par le foie qui sera

utilisé pour la synthèse de ces protéines plasmatiques plutôt que d'être catabolisé ?

Nous avons donc émis l'hypothèse que le taux de synthèse des protéines d'exportation

ne varie pas en fonction des apports protéiques.

Objectif 2 : Déterminer comment varie le taux de synthèse de protéines

plasmatiques à des apports bas et élevés en protéines métabolisables et définir la

contribution de l'extraction hépatique d'un AA à cette synthèse plutôt que vers le

46

catabolisme. Il s'agit de définir la priorité métabolique de la synthèse protéique

(synthèse de protéines plasmatiques vs. de protéines du lait) à des apports restreints en

protéines et d'examiner comment le foie réagit, en terme d'extraction hépatique, pour

répondre à cette demande.

Une augmentation des apports protéiques entraîne une augmentation de la

production de protéines de lait. Aussi, il est suggéré qu'une augmentation des apports

d'énergie a un impact sur la production de protéines de lait (Hurtaud et al., 1998).

Cependant, les mécanismes d'action au niveau corporel et mammaire amenant cette

réponse ne sont pas encore bien connus. S'agit-il des mêmes mécanismes ? Existe t-il

un effet additif entre les deux nutriments ? Nous avons donc émis l'hypothèse que la

protéine et l'énergie ont des mécanismes d'action différents pour stimuler la production

de protéines du lait et auront ainsi un effet additif ou synergique sur le métabolisme

protéique chez la vache laitière.

Objectif 3 : Déterminer si des apports en caséine et en acide propionique ont des

effets additifs sur le métabolisme protéique aux niveaux corporel et mammaire. Il s'agit

également de comprendre quelle part des augmentations de production de matières

protéiques du lait s'explique par des modifications du métabolisme mammaire des AA.

En réponse à l'apport individuel ou combiné de ces deux types de nutriments,

l'utilisation totale aux niveaux corporel et mammaire de la leucine et la partition de

cette utilisation vers la synthèse de protéines ou l'oxydation nous permettra d'évaluer le

niveau d'interaction entre ces nutriments sur le métabolisme protéique.

47

2.5 Liste des ouvrages cités

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Wolfe, R. R. 1984. Tracers in metabolic research: Radioisotope and stable isotope/mass

spectrometriymethods. Alan R. Liss, Inc., New York.

Wray-Cahen, D., H. V. Nguyen, D. G. Burrin, P. R. Beckett, M. L. Fiorotto, P. J. Reeds,

T. J. Wester et T. A. Davis. 1998. Response of skeletal muscle protein synthesis to

insulin in suckling pigs decreases with development 1. Am J Physiol 275:E602-E609.

5 S

CHAPITRE III

EFFECT OF LEVEL OF METABOLIZABLE PROTEIN ON SPLANCHNIC

FLUX OF AMINO ACIDS IN LACTATING DAIRY C O W S

Ce chapitre a été publié dans la revue "Journal of Dairy Science" sous la références de

G. Raggio, D. Pacheco, R. Berthiaume, G. E. Lobley, D. Pellerin, G. Allard, P. Dubreuil

and H. Lapierre. 2004. Effect of level of metabolizable protein on splanchnic flux of

amino acids in lactating dairy cows. J. Dairy. Sci. 87:3461-3472.

3.1 Résumé

La réponse du métabolisme splanchnique des acides aminés (AA) à des apports

croissants de protéines métabolisables (PM) a été mesurée avec six vaches laitières

Holstein multicathéterisées. Trois rations, formulées pour fournir le même niveau

d'énergie et 3 différents niveaux de PM (1922, 2264 et 2517 g PM/jour) ont été testées

selon un double carré latin 3 x3 avec des périodes expérimentales de 21 jours. Aux

jours 18, 19 ou 20, des échantillons de sang ont été simultanément prélevés des veines

porte, hépatique et d'une artère. La production de lait, de protéines du lait ainsi que l'N

excrété dans l'urine ont augmenté avec l'augmentation de PM. L'absorption portale des

AA indispensables a augmenté de façon linéaire avec les apports croissants de PM.

L'extraction hépatique a augmenté seulement pour l'His, la Met, et la Phe avec

l'augmentation des PM, alors que l'extraction hépatique des acides aminés à chaîne

ramifiée et de la Lys n'a pas été affectée. L'augmentation de l'apport de PM diminue le

ratio production de protéines du lait / approvisionnement post hépatique pour la Leu,

l'Ileu, la Val, la Thr et la Lys et suggère une augmentation de l'oxydation de ces AA au

niveau des tissus périphériques. Une diminution du catabolisme des AA indispensables,

soit au niveau hépatique (His, Met, Phe, et Thr) soit au niveau des tissus périphériques

(lieu, Leu, Val, Lys et Thr) accompagne la diminution de l'efficacité du transfert des

AA absorbés en protéines du lait, à mesure qu'augmentent les apports de PM.

L'efficacité d'utilisation des AA entre l'absorption des AA et la sécrétion de protéines

dans le lait varie également entre les AA. Ces résultats confirment qu'un facteur fixe de

conversion des AA absorbés en sécrétion de ces AA dans le lait ne devrait pas être

utilisé dans les futurs modèles de prédiction des productions de protéines du lait.

Mot clés: acides aminés, tissus splanchniques, glande mammaire, vache

60

3.2 Abstract

The response of splanchnic tissue metabolism to différent levels of

metabolizable protein (MP) was measured in six catheterized multiparous lactating

Holstein cows. Three diets, balanced to provide similar energy intakes and increasing

amounts of MP (g/d), 1922 (Low), 2264 (Med) and 2517 (High), were fed according to

a replicated Latin Square with 21-d expérimental periods. On d 18, 19 or 20, six hourly

blood samples were collected simultaneously from the portai and hepatic veins plus an

artery to détermine net fluxes of nutrients across the portal-drained viscera and the liver.

Yields of milk and protein increased (P < 0.02), as did urinary N excrétion (P < 0.01)

with increasing MP. Portai absorption of essential amino acid (EAA) increased linearly

(P < 0.01) with increasing MP supply, as did liver removal of His, Met and Phe (P <

0.01). In contrast, liver removal of the branched-chain A A (BCAA) and lysine was

unaffected by diets. With increasing MP, the ratio of milk output to post-liver supply of

BCAA, Thr (P < 0.10) and Lys (P < 0.20) decreased linearly, indicating oxidation of

thèse AA in the peripheral tissues. Concomitant to a decreased catabolism of EAA in

the liver (His, Met, Phe and Thr) and/or in peripheral tissues (BCAA, Lys and Thr), the

effïciency of transfer of absorbed EAA into milk protein decreases markedly as protein

supply increases. The effïciency of transfer of absorbed AA into milk varies also greatly

between AA. Thèse two important factors should be taken into account when building

prédictive schemes for milk protein output.

Key words: amino acid, splanchnic tissue, mammary gland, cow

Abbreviation key: AA = amino acids, BCAA = branched-chain AA, EAA = essential

AA, MP = metabolizable protein, pAH = para-aminohippurate, PDV = portal-drained

viscera.

61

3.3 Introduction

Optimal conditions for milk production can be defined as either when output is

maximized or when the effïciency of transfer of dietary protein into milk protein is

optimized. Maximizing output involves increasing dietary protein supply but as the

supply approaches current recommendations, the effïciency of transfer into milk protein

decreases (Doepel et al., 2004). Highest transfer effîciencies therefore are achieved at

low dietary protein supply but are associated with reduced yields. In practical ternis, a

well-advised feeding strategy would supply protein to achieve a milk production

between extrêmes of maximal output and effîciencies. Prédiction of optimum supply

requires knowledge of how altérations in that supply affect the partition of individual

amino acids (AA) between catabolism and anabolism.

Increasing dietary protein supply usually results in higher portai absorption of

AA in lactating cows (Bach et al., 2000; Blouin et al., 2002), although elevated crude

protein intake may not lead to additional AA absorption if the energy supply is not

adéquate to support rumen microbial protein synthesis (Reynolds et al., 1992). Once

absorbed, the AA flow to the liver. Although hepatic removal of AA was first proposed

as a regulator of peripheral tissue anabolism (Reynolds et al., 1994), other évidence

suggests that hepatic AA catabolism may instead respond to peripheral tissue

requirements (Lobley and Lapierre, 2003; Ortigues-Marty et al., 2003). The question

then is: "To what extent can liver catabolism of AA be decreased, i.e. how much of the

hepatic extraction of AA is obligatory (e.g. to support plasma protein synthesis or

gluconeogenesis) and how much is non-obligate and susceptible to manipulation (e.g.

can the amount removed be reduced)?. This question can be answered by varying

protein supply below and above requirements with examination of changes in the

partition and effïciency of use of AA as supply is altered. An additional considération is

that some AA are not exclusively, or even predominantly, catabolized by the liver.

Therefore, the current study investigates the impact of increasing metabolizable

protein (MP) on hepatic removal of essential AA (EAA) and subséquent utilization of

post-splanchnic supply by the mammary gland. Given that the effïciency of conversion

of absorbed EAA into milk protein will be altered, thèse findings will lead to a better

62

understanding of how splanchnic and post-splanchnic tissues coordinate to regulate AA

metabolism.

3.4 Material and Methods

3.4.1 Animais and Treatments

Six multiparous Holstein cows, averaging 656 + 60 kg BW and 96 ± 8 DIM at

the beginning of the study, were used in a double 3 x 3 Latin Square design, balanced

for residual effects, with 21-d expérimental periods. Ail cows were surgically implanted

with vascular cathéters across the splanchnic tissues (Huntington et al., 1989). Briefly,

Teflon cathéters encased in silastic were implanted into the portai vein and one hepatic

vein while Tygon cathéters were inserted into two mesenteric veins and one in a

mesenteric artery. The right carotid artery was also raised to a subcutaneous position to

provide alternative access to arterial blood if necessary. Surgeries were performed at

least one month before the start of the experiment.

Three diets were formulated using the NRC (2001) to provide equal energy

while increasing MP, averaging 1922 (Low), 2264 (Med) or 2517 (High) g of MP/d.

Feeding différent amounts of MP was achieved by substituting Megalac™ (Church &

Dwight Co., Inc., NJ) with Prolak® (H.J. Baker & Bro. Inc., CO) (Tables 3.1 and 3.2).

The amount of feed offered provided similar energy intake (36.4 Mcal NEL/d)

throughout the study. The quantity of wet feed offered was adjusted weekly, based on

the DM content of the grass silage (determined by drying at 105 °C for 48 h). Daily

allowance was distributed in 12 equal meals every 2 h from automated feeders (Ankom,

Fairport, NY), except long hay that was offered once a day. Orts, when présent, were

recorded daily. Cows had free access to water and were housed in a tie stall barn, which

was lit from 0600 to 2200. They were milked twice daily (0600 and 1800) and

production was recorded at each milking. The expérimental protocol was approved by

the Institutional Committee for Animal Care of the Lennoxville Research Centre and

animais were cared for according to the guidelines of the Canadian Council on Animal

Care (1993).

3.4.2 Sampling

On days 13 to 18 of each period, total collection of fèces and urine were made to

détermine N balance. Urine was collected in stainless steel containers, via a Gouch tube

(BF Goodrich Co., Kitchener, ON, Canada), and acidified twice daily with 50 ml of 10

N sulfuric acid, to maintain pH below 3.0. A 2 % portion of the fèces and urine

collected was sampled daily and frozen. At the end of the period, samples were thawed,

mixed, sub-sampled and frozen for further analyses. Any feed refusais were sampled

daily. Milk samples were taken at each milking and frozen for later analysis.

On day 18, 19 or 20 (two cows sampled per day) sodium p-aminohippurate

(pAH; 100g/l) was infused continuously (14.4 g/h) into one mesenteric vein cathéter

using a syringe pump, preceded by a 2 g priming dose. After at least 40 minutes of pAH

infusion, simultaneous blood collections were taken hourly for 5 h (n=6) from the

arterial plus portai and hepatic vein cathéters. Blood samples were collected from the

mammary vein by venipuncture, every other hour (n=3). Immediately after sampling,

blood was transferred from the syringes to heparinized tubes and kept on ice prior to

centrifugation at 3000 x g for 12 min at 4 °C. The plasma was then sub-sampled for

immédiate analyses and the remainder stored at -20°C for later analyses.

3.4.3 Laboratory Analyses

Feed ingrédients, feed refusais and fèces were freeze-dried and ground to pass

through a 1 mm screen. Nitrogen content of feed ingrédients, refusais and milk samples

collected at each milking was determined by combustion (Nitrogen Determinator,

model FP-428 LECO, St-Joseph, MI). Crude protein contents of feed and milk were

calculated as N x 6.25 and N x 6.38, respectively. Urine and fèces samples were

analyzed for total N using the micro-Kjeldahl method (Tecator 1030, Hoganas Sweden;

AOAC, 1996). Milk fat was measured according to the Roese-Gottlieb method (AOAC,

1996).

Noncasein N and nonprotein N in milk were analyzed with the micro-Kjeldahl

method on pooled samples from the collection period. Noncasein N was obtained by

précipitation of the caseins at pH 4.6. Nonprotein N was obtained by précipitation with

64

trichloroacetic acid (TCA), final concentration of 12 %. Casein N is calculated by

différence between total N and noncasein N, while whey protein is estimated by

différence between noncasein nitrogen and nonprotein N. The N content was transposed

into protein using the 6.38 factor. Casein profile was determined by inverse phase

HPLC on the pellet obtained when precipitating caseins at pH 4.6 (Jaubert et al., 1992).

Packed cell volume of each blood sample was determined by the

microhematocrit method. Plasma concentrations of pAH, urea and ammonia were

measured with an automatic analyzer (Technicon Autoanalyser II, Technicon

Instruments Corporation, NY) as previously described (Huntington, 1984) on fresh

samples on the day of sampling.

For AA détermination, samples of feed were pre-digested with performic acid to

stabilize Met and Cys, treated with hydrobromic acid to destroy the performic acid and

then were acid-hydrolysed with 67V-HC1 (AOAC, 1996: method # 994-12) and AA were

quantified by ion exchange chromatography (Beckmann 6300, Palo Alto, Ca). A

separate acid hydrolysis (6iV- HCl) digestion procédure, was conducted for Phe and His,

because those AA are destroyed during the oxidation process and by reaction with

bromine.

Plasma concentrations of EAA plus tyrosine were measured by the isotope

dilution method (Calder et al., 1999). On the day of sampling, 0.2 g of an internai

standard solution was added to 1 g of plasma. The internai standard solution was

prepared with labeled AA diluted in 0.1N HCl with the following concentration (uM):

DL-His-a-15N (182), L-Ile-15N (713), L-Leu-l-13C (877), DL-Lys-2-15N-2HCl (308),

DL-Met-l-13C (98), L-Phe-l-13C (226), L-Thr-15N (45), L-Tyr-15N (469), L-Val-15N

(846). Labelled AA (95-99 atom %) were supplied by CDN isotopes (Montréal, QC,

Canada) for His, Leu, Lys, Met and Phe; Cambridge Isotope Lab (Andover, MA) for

Ile, Thr and Tyr; Isotec Inc. (Miamisburg, OH) for Val. Plasma samples with the

internai standard were kept frozen at -20°C until analyses. At the time of analysis the

plasma was deproteinized with sulfosalicylic acid (38 % w/v), the N-(tert-

butyldimethyl) AA derivative prepared (Calder and Smith, 1988) and AA concentration

determined by gas chromatography-mass spectrometry (Model HP6890, S973 mass

65

sélective detector; Hewlett Packard, CA) based on the principles described by Calder et

al. (1999).

3.4.4 Calculations and Statistical Analyses

Mean values for intake, production and composition of milk, fèces and urine

taken during the collection period were used for statistical analyses. Plasma flow across

the splanchnic tissues was calculated from downstream dilution of pAH infusion (Katz

and Bergman, 1969). If, within one sampling day, the CV of the mean plasma flow for

an animal was greater than 15 % due to only one sample, then this value was removed.

Milk protein output was estimated using milk protein yield measured during the

collection period and AA composition reported in the literature (Swaisgood, 1995).

Mammary plasma flow was estimated according to the Fick principle, using Phe and

Tyr as internai markers (Mepham, 1982), with allowance for a 3.5 % contribution from

blood-borne proteins: mammary plasma flow = ((milk Phe + Tyr) x 0.965) / (AV

différence Phe + Tyr) (Cant et al., 1993). Daily net fluxes of AA across the PDV, liver,

total splanchnic tissues and mammary gland were calculated for each cow as the

product of the average venous-arterial concentration différence and the average plasma

flow measured for that day. Blood flow was calculated as plasma flow divided by (1 -

packed cell volume). Net fluxes of ammonia were calculated using plasma

concentrations and blood flow while urea fluxes were calculated using plasma

concentrations and blood water flows. Blood water flow was calculated as blood flow

multiplied by the ratio of the dry matter of blood on plasma (Milano et al., 2000). A

négative flux indicates utilization or removal while a positive flux indicates net

production or release of the nutrient across the tissue. One cow did not hâve a patent

hepatic cathéter and results obtained for portai vein absorption strongly suggested a

misplacement of this cathéter: ail results for this cow were discarded. One cow could

not be used for her third period (treatment was High MP), as she had severe mastitis.

Therefore, n = 5 for Low and Med MP and n = 4 for High MP.

Data were analyzed statistically according to a replicated Latin Square design,

using the GLM procédure (SAS Institute Inc., 1996) with treatment, period and cow as

the main effects. Treatments were compared with linear and quadratic polynomial

66

contrasts. A linear component indicates that the différence between the fïrst and last

levels is significant, while a quadratic component will indicate the lack of fit of the

intermediary level for a linear relationship (Gill, 1978). Treatment différences were

considered significant if P < 0.10 and as a trend for 0.10 < P < 0.20.

3.5 Results

3.5.1 Milk Production and Composition

Milk production and composition data are presented in Table 3.3. Milk

production increased linearly (P = 0.02) with increasing supply of MP. Milk crude

protein yield also increased linearly (P = 0.01), as did each protein fraction yields (P <

0.03). Milk crude protein concentration increased linearly (P = 0.09), but the proportion

of true protein decreased (P < 0.01), mainly due to a decrease in the proportion of the

casein fraction (P = 0.03). The casein profile was not affected by diet (Table 3.3). Milk

fat concentration decreased linearly (P = 0.01) resulting in a decrease in fat yield at the

highest MP level (linear: P = 0.14; quadratic: P - 0.17). In this experiment the low MP

diets contained more Megalac (Table 1) and the yield and percentage of fat were higher

with this diet. Similarly, Petit (2002) reported an incrément of fat percentage in milk

with a diet supplément with Megalac, compared with other isoenergetic and

isonitrogenous diets.

3.5.2 Net Flux of Essential Amino Acids

Plasma flow across the PDV and the splanchnic tissue was not affected by MP

supply and averaged 1321, 1271 and 1236 ± 43.2 and 1676, 1608 and 1647 ± 63.0 L/h,

for Low, Med and High MP respectively. However, plasma flow across the mammary

gland increased at High MP compared with Low and Med MP (linear and quadratic

components, P = 0.04) averaging 515, 491 and 607 ± 24.1 L/h, for Low, Med and High

MP respectively. As MP intake was raised, plasma arterial concentrations (Table 3.4) of

His, Ile, Leu, Lys and Val increased linearly (P < 0.10) with a quadratic effect for Lys

(P = 0.01) and His (P = 0.14). Net fluxes of EAA and Tyr across the PDV, liver,

splanchnic tissue, mammary gland and in milk are presented in Table 3.5. With

increasing MP supply, the PDV net flux increased linearly (P < 0.01) for ail measured

67

AA with a quadratic effect for Met (P = 0.03) and Lys (P = 0.20). Hepatic removal

increased linearly (P < 0.04) for His, Met, Phe, Tyr and tended (P < 0.19) to increase

for Thr. The net flux of EAA across the splanchnic tissue increased linearly (P < 0.10)

for Ile, Leu, Lys, Thr and Val with a quadratic trend (P < 0.20) for His, Ile, Leu, Lys

and Met. Mammary gland uptake increased linearly (P < 0.10) for ail BCAA, Lys and

Phe with a tendency for a linear increase for Met (P < 0.14). Output in milk increased

linearly (P < 0.01) for ail AA, as did milk crude protein yield (Table 3.3). The ratio of

milk output / PDV net flux decreased linearly (P < 0.10) for His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe

and Tyr and tended to decrease linearly (P < 0.20) for Thr and Val (Table 6). In

addition, the ratio of the liver flux / portai flux increased linearly (P < 0.10) with MP

supply for Met, Phe, Tyr or only with a tendency (P < 0.20) for His. Relative to total

hepatic influx, hepatic net removal Met, Phe and Tyr increased linearly (P < 0.10) while

His tended to increase (P = 0.14; Table 3.7).

3.5.3 Urea and Ammonia

Total splanchnic urea flux tended to increase (P < 0.12) with increasing MP

supply, as a resuit of a decreased return of urea into the PDV (P = 0.06) and a numerical

increase in hepatic ureagenesis (P = 0.22; Table 3.8). Accordingly, arterial urea-N

concentration increased linearly (P < 0.01) with increasing supply of MP (Table 3.5).

Arterial ammonia concentrations were unaffected by MP supply, but ammonia flux

across the PDV increased linearly and quadratically (P = 0.03) with increased MP of the

ration. Hepatic removal also increased linearly (P = 0.02) resulting in no effect of the

diet on splanchnic net flux of ammonia.

3.5.4 N Balance

The planned increase in N intake (P < 0.01) was matched by increased N

excrétion in fèces and in urine (linear contrast, P < 0.05; Table 3.9). Apparent N

digestibility also increased linearly (P < 0.02), averaging 53.2, 58.9 and 60.5 % for

Low, Med and High MP, respectively. Nitrogen in milk as a proportion of N intake

decreased (P < 0.02) with increasing N intake, averaging 27.5, 25.6, and 24.1 % of N

intake. In contrast, N rétention was not affected by treatments (Table 3.9).

68

3.6 Discussion

A récent review of studies where AA were infused postruminally in dairy cows

supports the concept that the transfer of incrémental AA supply into milk protein

diminishes as supply approaches requirements (Doepel et al., 2004). Similarly, in this

experiment although the sécrétion of N into milk was elevated by increased MP supply,

the efficiency of conversion of N intake into milk N decreased when N intake increased.

Similar results hâve also been observed by Wright et al. (1998) and Castillo et al.

(2001). The marginal recovery of incrémental MP supply in milk protein averaged 19

% between Low and High MP, which is within the range of recovery from casein

infusions (21 %) reviewed by Hanigan et al. (1998).

Therefore, although most formulation schemes focus on estimating supply of

protein at the duodénum and use fixed factors to predict transfer from absorption to

metabolic usage, metabolic events differ between cows receiving a low versus a high

supply of protein. Examination of the fate of AA between absorption, transit across the

liver and sécrétion in milk will help explain the mechanisms that resuit in higher

transfer efficiency in cows receiving a lower MP supply.

3.6.1 Amino Acid Flux

As expected, increased MP supply resulted in elevated portai absorption of

EAA, consistent with previous reports for dairy cows (Bach et al., 2000; Blouin et al.,

2002). Indeed, the measured portai absorption matched prédiction of digestible AA

(NRC, 2001), corrected for endogenous contribution to the duodenal supply. The ratios

between the NRC prédictions and measured values averaged for His (1.03), Lys (1.02),

Ile (1.14), Leu (1.24), Val (1.13) and Thr (1.27). Thèse ratios would fit with the concept

of little or no catabolism of His and Lys across the gut in the ruminant, but substantial

oxidation of the BCAA and loss of Thr through endogenous sécrétions into the post-

duodenal tract (Lobley and Lapierre, 2003). The ratios (NRC predicted/observed) for

Met (0.84) and Phe (0.79) were lower than unity, which was unexpected as limited

oxidation by the ovine gut has been reported for Met (Lobley et al., 2003). Thus, one

69

explanation would be an underestimation of the duodenal supply of thèse AA with the

NRC (2001) model.

The increased absorption with increased MP was concomitantly associated with

increased hepatic removal, both in absolute amount for His, Met, Phe and Thr, and

relative to portai absorption or total liver influx for His, Met and Phe. On the other

hand, hepatic removals of the BCAA and Lys were unaffected by diet. Thèse data are

consistent with the concept that the liver is a major site of catabolism for His, Met, Phe

and Thr and removes excess AA not used for peripheral anabolism. In contrast, for the

BCAA and Lys, catabolism occurs to a greater extent in non-splanchnic tissues. Thèse

observations agrée well with the localization of enzymes responsible for AA catabolism.

Enzymes for His, Met and Phe catabolism are almost exclusively restricted to hepatic

tissues (see review: Lobley, 2002). In contrast, enzymes responsible for BCAA

catabolism are spread across many tissues (Goodwin et al, 1987; DeSantiago et al.,

1998), and récent studies hâve identified two enzymes involved in Lys catabolism,

lysine ketoglutarate reductase and saccharopine dehydrogenase in the brain, kidney and

muscle of piglets (Pink et al., 2003).

Hepatic removal of EAA varied greatly between EAA, as previously observed in

many species, including dairy cows (Bach et al., 2000; Blouin et al., 2002). Relative to

net portai absorption, the highest fractional hepatic removal was for Phe (0.52) followed

by His (0.42), Met (0.36) and Thr (0.34). With Low MP supply, there was no net

removal of Lys, but with High MP supply, hepatic removal averaged 12 % of portai

absorption. There was no net removal and even a positive numeric flux for the BCAA

across the liver, as previously observed in dairy cows (Wray-Cahen et al., 1997; Bach et

al., 2000; Blouin et al., 2002), but hepatic-portal différences were not différent from

zéro (date not shown). Although the magnitude of hepatic removal relative to portai

absorption was lower in the current study, as would expected due to increased metabolic

demand for absorbed AA during lactation, the ranking amongst EAA agrées with

previous observations in growing cattle (Lapierre et al., 2000), non-lactating cows

(Wray-Cahen et al., 1997) and sheep (Lobley et al., 2001).

70

Only for His, and only at low MP, were mammary uptake and milk output

higher than net splanchnic flux. This means that for ail other measured AA, even at the

low MP supply, post-liver supply was suffïcient to account for mammary uptake and

milk protein output. This maintenance of lactation at a high level when supply was

reduced was achieved by a substantial réduction of AA catabolism, suffïcient to ensure

no need for contribution of body protein "reserves". Such réductions in catabolism will

hâve a fïnite limit, however, based on obligate needs for production of various

metabolites, synthesis of hepatic export proteins (Raggio et al., 2002) and basai ('non-

manipulable') ureagenesis. For His, the limit in the réduction of hepatic removal (3.3 %

of total liver influx at low MP intake) might hâve been reached, as an additional

endogenous source must hâve been necessary to cover mammary gland uptake. This

was not from mobilized body protein reserves as N rétention was not decreased at low

MP intake. One alternative are the His dipeptides, particularly carnosine, présent in mM

quantities in muscle and known to become depleted when animais are fed a diet low in

His (Amend et al., 1979). Such sources would only provide a medium-term store and

obviously such a situation could not be sustained for a whole lactation cycle. Such

constraints are a feature of the AA composition of the MP supply and the current

observation was not surprising considering that His has been found limiting when grass

silage was fed to dairy cows (Vanhatalo et al., 1999). This emphasizes the need to

consider the amount and composition of AA supplied, rather than simply MP, when

attempting to predict dietary responses and efficiencies.

Post-liver supply of the BCAA and Lys substantially exceeded both mammary

gland uptake and milk output. Earlier studies hâve shown that the mammary gland

catabolizes Leu (Bequette et al., 1996; Thivierge et al., 2002) with this oxidation

decreasing when Leu supply was low (Bequette et al., 1996). This is supported by the

current observation, as the ratio of milk output to mammary uptake for the three BCAA

decreased with increasing MP supply. Excess of EAA-N extracted by the mammary

gland relative to milk output is needed to support synthesis of non-essential AA for

which the uptake by the mammary gland is insufficient to account for milk output.

Recently, the incorporation of lysine-15N into non-essential AA within the mammary

gland has been demonstrated in dairy cows (Lapierre et al., 2003).

71

Together, thèse metabolic events across the liver and the mammary gland

explain why the ratios of transfer of absorbed AA into milk protein alter with MP

supply (Table 3.7). At low MP supply, improved efficiency is achieved through a

decreased hepatic removal of His, Met, Phe and Thr, and, probably, decreased oxidation

of the BCAA, Lys and Thr in peripheral tissues. As MP supply is decreased, the liver,

peripheral tissue and mammary gland events combine to increase the partial efficiency

of transfer of absorbed AA into milk. The design of this study does not résolve whether

the liver was responding to, or controlling use by, peripheral tissues (see Lobley and

Lapierre, 2003), but it is obvious that liver catabolism of His, Met and Phe was tightly

related with mammary requirements. Nonetheless, prédiction of milk output based on

duodenal MP or AA supply cannot rely on a fixed ratio of transfer but needs to account

for the efficiency of utilization of individual AA which decreases as supply approaches

requirements. Moreover, use of a common factor of transfer of MP into milk protein

also implies that ail AA are used with similar efficiency. In practice, efficiency of

conversion of absorbed EAA (excluding His) into milk varied widely (0.42-0.78; Table

7) at the low MP supply, where efficiency was greatest. Phenylalanine always ranked

the lowest, probably because supply was in excess of demand with thèse diets. This

variation in efficiency among AA emphasizes the uniqueness of each AA and the

importance of developing prédiction équations for milk protein output based on the

supply of individual AA rather than their total agglomération as protein.

3.6.2 Urea and Ammonia

Net portai flux of ammonia increased with increasing MP supply and increased

rumen degradable protein supply, as previously reported (Bach et al., 2000; Blouin et

al., 2002), although urea recycled to the PDV decreased at High MP. AU the extra

ammonia absorbed was removed by the liver and, combined with increased hepatic

removal of some AA, resulted in a numerically higher hepatic ureagenesis for the cows

fed the High MP diet. Lapierre and Lobley (2001) calculated the ratio between hepatic

ureagenesis and digestible N: in growing cattle, this ranged from 0.49 to 1.78 (mean

0.93) and in lactating dairy cows between 0.43 to 1.23 (mean 0.88). In the current

experiment, the ratio between ureagenesis and digestible N averaged 1.17, again

72

indicating the magnitude of the transit of N into the urea pool and the impact of

recycling. Although arterial urea concentrations were higher with the High MP diet, the

recycling of urea into the PDV decreased with increasing MP, averaging 0.46, 0.28 and

0.14 of hepatic ureagenesis for Low, Med and High MP, respectively. This suggests that

entry of urea into the digestive tract is not simply a function of plasma concentration as

suggested previously (Harmeyer and Martens, 1980). As a resuit of decreased net PDV

flux and increased hepatic flux of urea, the splanchnic net urea flux increased, which

impacted on both arterial urea concentration and élimination of N through the urine.

3.6.3 Milk Production

Increasing the MP supply, by raising the CP content of the diet from 12.7 to 16.6

%, increased both milk production and milk protein yield, in agreement with earlier

reports by Metcalf et al. (1996: 11.3 to 20.1 % CP), Wright et al. (1998: 10.2 to 24.5 %

CP) and Dinn et al. (1998: 15.3 to 18.3 % CP). In ontrast, Castillo et al. (2001) reported

no différence in milk production and composition with variation in CP content (14.0 to

18.3 % CP). On the other hand, Blouin et al. (2002) reported an increase in milk

production and milk protein yield with fixed CP, and varied ruminai undegraded protein

(RUP). Nonetheless, changes in protein degradability and RUP supply alone do not

explain variations in milk production responses (Santos et al., 1998). Together, thèse

data clearly demonstrate that CP intake or RUP supply alone should no longer be used

solely in dairy rations to evaluate the amount of protein delivered to the animal. Use of

CP and RUP has now been superseded by the more informative use of MP and when

earlier data are now re-evaluated by this approach it is clear that changes in milk

production related better to MP rather than either CP or RUP. For example, increasing

MP by 30 % raised both milk production and milk protein yield (Metcalf et al., 1996;

Wright et al, 1998; présent study). In contrast, when MP supply was increased by 18 %,

only milk production was improved (Dinn et al., 1998). In the study of Blouin et al.

(2002), despite a similar crude protein intake, the additional supply in MP (16 %)

generated by increasing RUP resulted in greater milk protein production. However, an

incrément in MP supply does not guarantee by itself an incrément in milk production. In

fact, Castillo et al. (2001), improved MP supply with increased CP or decreased protein

73

degradability did not alter milk production because energy supply would hâve limited

milk output to 22 kg (NRC, 2001).

3.6.4 Nitrogen Balance

The relatively small increase in fecal N compared with the additional N intake

resulted in greater apparent N digestibility. Using a dynamic model based on five N

balance studies with dairy cows, Kebreab et al. (2002) predicted that absolute metabolic

fecal N would increase up to intakes of 420 g N/d and remain near constant thereafter.

Therefore, the increased apparent N digestibility with increasing protein intake observed

in the current study, as in previous reports (Wright et al., 1998; Castillo et al., 2000),

would resuit from a decreased proportion of metabolic fecal N to total fecal N as N

intake increased. Thus, with higher MP more N is apparently digested and, if not used

for anabolic purposes, more should be lost via urine rather than fèces.

This is exactly what was observed, with the ratio of urinary N excrétion to N

intake increasing from 0.16, 0.22 and 0.26 for the Low MP, Med MP and High MP

diets, respectively, similar to the observations of Wright et al (1998) and Dinn et al

(1998). How much N is excreted in urine relates to a number of factors, including MP

(or CP) intake, variations in the degradability of the ration and the ability of the cow to

retain N for anabolic purposes. Indeed, when the anabolic potential is approached or

exceeded then much of the extra digested N is excreted via urine. Thus, in the current

study, although the extra digested N represented increases in portai absorption of both

AA and ammonia, much of thèse were converted to catabolic end-products (notably

urea) with urinary nitrogen excrétion increasing by more than 100 % between low to

high MP. In conséquence, the marginal return of digested N to milk was only 0.16,

compared with an apparent efficiency of 0.52 at the low MP supply. For other studies

where similar increases in digested N were achieved either by increased CP (Castillo et

al., 2001), only 0.15-0.35 of the extra digested N was secreted as milk N. Thèse various

data again reflect the declining return of milk output as maximal requirements are

approached (Doepel et al., 2004).

74

3.7 Conclusion

In dairy cows receiving diets limited in protein supply (1922 g/d MP or 12.7

%CP), increased transfer of absorbed AA into milk protein occurred concomitantly with

a réduction in hepatic removal of His, Met, Phe and Thr and a decreased catabolism /

utilization of the BCAA, Lys and Thr in peripheral tissues compared with higher MP

supply. Therefore, to improve the prédiction of protein supply and its utilization, it is

necessary to appreciate the various metabolic events that occur between absorption and

sécrétion in milk, to allow that the transfer of absorbed AA into milk is not fïxed and

will decrease as supply increases. Furthermore, it is important to take into account that

thèse transfer factors vary widely between AA, as a conséquence of both diet

composition and metabolic events.

3.8 Acknowledgements

The authors gratefùlly thank the staff of the Lennoxville dairy center for taking

care of the animais, M. Léonard and S. Provencher for their dedicated technical support,

D. St-Gelais and S. Haché for analyses of protein milk fractions as well as S. Méthot for

statistical analyses. The authors also wish to acknowledge the financial support of the

Action concertée Fonds FCAR - Novalait - MAPAQ, the National Science and

Engineering Researh Council of Canada and Agriculture and Agri-Food Canada

(Lennoxville Research Contribution Number 829) as well as H. J. Baker & Bro. Inc. for

supplying the Pro-Lak bypass protein supplément.

75

Table 3.1. Composition of the three dietary treatments with différent levels ofmetabolizable protein (MP).

Ingrédients Treatmentsg/kg DMGrass silageProlak1

Soybean hullsCorn grain, groundMegalac2

Grass hayMolasses, beet sugarMinerai & vitamin premixCorn grain, cracked

Estimation from NRC (2001)3

NEL, Mcal/dCP, %DMRDP supplied, g/dRDP balance, g/dRUP supplied, g/dRUP balance, g/dMetabolizable protein, g/d

From microbial proteinFrom undegraded feedFrom endogenous origin

1 H. J. Baker & Bro. Inc., CO2 Church & Dwight Co., Inc., NJ3 Calculated using the intake (Low MP: 23.8, Med MP 24.2, High MP 24.7 kg DM/d)and the production observed during the study, with chemical composition of the feedingrédients reported in Table 3.2

LowMP4290

243148343213217S

36.412.7

2125-162907-39619221156654112

MedMP421282431482331131775

3614

23074

1257-58

22641251899114

High MP423542341431231131575

.4 36.4

.7 16.625011821602317251712611140116

76

Table 3.2. Chemical composition of the feed ingrédients.

Analyses(DM %)CPADFNDFLigninADFIPNDFIPAshStarchLipid

Amino Acid(gAAIOOg/CP)

AlanineArginineAspartateCysteineGlutamateGlycineHistidineIsoleucineLeucineLysineMethioninePhenylalanineProlineSerineThreonineValineTotal AA

Grasssilage17.4033.1041.40

5.200.703.00

10.901.901.50

4.693.09

10.100.717.684.331.483.806.293.741.253.925.823.683.625.40

69.60

Soybeanhulls11.7046.8066.00

8.900.702.904.702.300.80

3.684.478.331.679.647.362.543.245.706.051.143.334.655.263.164.12

74.34

Grass hay

14.2033.8054.20

3.001.104.50

15.002.402.50

5.203.689.391.018.664.261.523.686.063.541.303.978.303.543.615.20

72.92

Crackedcorn8.102.009.500.500.200.701.20

71.502.90

7.784.757.392.77

19.534.093.033.69

12.803.172.374.759.505.153.965.15

99.88

Groundcorn8.302.50

10.400.600.200.801.30

76.001.30

6.634.466.272.05

16.273.732.773.25

11.202.892.054.467.594.583.374.58

86.15

Prolak®

77.609.90

19.708.708.40

12.5013.500.406.90

6.595.849.042.24

10.767.703.462.979.176.141.554.985.945.833.936.76

92.90

77

Table 3.3. Effect of metabolizable protein (MP) supply on milk production andcomposition in Holstein cows

MilkProduction, kg/dCrude protein yield, g/d

True protein yield, g/dCasein yield, g/dWhey protein yield, g/dNonprotein N yield, g/d

Crude protein, %True protein, % of CPCasein, %ofCPWhey protein, %ofCPNonprotein N, %ofCP

Casein profile, % of caseinkappaalpha-slalpha-s2gammabeta, total

Fat yield, g/dFat concentration, %

LowMP33.9

838802629173382.46

95.574.720.84.5

9.445.9

5.64.7

34.41216

3.76

TreatmentsMedMP

35.790585365919452

2.5394.372.821.5

5.7

9.445.7

5.25.1

34.71318

3.65

High MP36.2

96290268921260

2.6593.871.921.96.2

9.345.9

6.84.3

34.21199

3.29

SEM0.49

15.014.16.09.21.50.0690.160.680.680.16

0.320.420.610.300.46

39.70.104

Linear0.02

<0.01<0.01<0.01

0.03<0.01

0.09<0.01

0.030.28

<0.01

0.720.990.190.300.700.140.02

P1

Quadratic0.300.800.950.990.900.100.720.110.550.820.11

0.890.680.180.120.480.170.30

!Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.4. Effect of metabolizable protein (MP) supply on arterial concentration ofamino acids (uM) in Holstein cows.

HistidineIsoleucineLeucineLysineMethioninePhenylalanineThreonineTyrosineValine

TreatmentsLowMP MedMP

49.0121.7155.684.921.857.1

114.156.4

246.0

60.2129.7192.698.522.558.4

116.959.6

315.3

High MP58.7

132.3218.5

95.222.063.1

110.058.9

372.9

SEM3.062.084.111.901.062.743.962.078.45

Linear0.090.02

<0.010.010.910.200.520.45

<0.01

P2

Quadratic0.140.320.310.010.610.630.340.460.58

'Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.5. Effect of metabolizable protein (MP) supply on net fluxes of amino acids(mmol/ h) in Holstein cows.

Amino AcidHistidine

Isoleucine

Leucine

Lysine

Methionine

Phenylalanme

Threonine

Tissue2

PDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMILK

LowMP7.8

-3.04.8

-6.66.1

21.02.6

23.5-17.015.735.6

1.036.6

-28.326.129.1-0.129.0

-24.919.910.0-3.07.0

-6.66.6

24.4-11.812.6

-11.110.420.4-6.713.7

-11.812.6

TreatmentsMedMP

12.0-4.47.5

-6.66.6

26.64.4

30.8-19.917.043.2

6.049.1

-32.128.238.00.9

38.5-26.521.413.5-4.29.3

-6.97.0

29.8-15.114.7

-12.011.223.8-6.617.5

-13.813.6

High MP14.2-7.27.0

-6.97.0

28.81.6

30.5-22.418.049.6

2.452.0

-38.329.940.2-4.935.5

-30.122.714.3-6.67.7

-7.97.5

35.4-20.714.8

-13.111.934.5

-14.519.9

-13.214.5

SEM0.920.800.890.380.111.271.470.920.960.281.622.681.821.720.471.952.441.260.360.040.380.590.620.480.121.351.251.380.620.192.703.481.870.840.23

P*Linear<0.01

0.010.170.64

<0.01<0.01

0.69<0.01

0.01<0.01<0.01

0.75<0.01

0.01<0.01<0.01

0.240.020.01

<0.01<0.01

0.010.500.14

<0.01<0.01<0.01

0.350.09

<0.01<0.01

0.190.070.33

<0.01

Quadratic0.390.480.180.720.800.310.230.020.890.800.750.230.070.560.570.200.29

<0.010.410.800.030.440.040.620.800.960.470.570.960.800.300.360.770.260.80

80

Table 3.6. Effect of metabolizable protein (MP) supply on net fluxes of amino acids(mmol/ h) in Holstein cows. (continued)

Tyrosine

Valine

PDVHEPTSPMGMILKPDVHEPTSPMGMIL

K

18.5-8.69.8

-8.8

10.828.4

1.329.7

-20.0

19.7

21.6-11.410.1-9.9

11.734.45.3

39.5-27.0

21.2

24.1-14.010.1-9.8

12.440.5

6.246.8

-28.0

22.6

1.111.330.830.70

0.19

3.512.774.512.40

0.35

0.020.040.850.41

<0.01

0.070.290.050.07

<0.01

0.840.990.860.49

0.80

0.980.650.820.33

0.80

1 Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2 PDV: portal-drained viscera; HEP: hepatic; TSP: total splanchnic tissue; MG:mammary gland.3 Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.7. Effect of metabolizable protein (MP) supply on the ratio of amino acids inmilk protein relative to portai absorption.

Amino AcidHistidineIsoleucineLeucineLysineMethioninePhenylalanineThreonineTyrosineValine

LowMP0.840.810.770.740.670.440.670.810.61

TreatmentsMedMP

0.530.620.640.560.540.360.630.590.53

High MP0.480.570.560.530.490.320.400.520.49

SEM0.070.070.060.070.060.030.100.090.05

P2

Linear0.010.080.060.080.070.030.140.060.19

Quadratic0.250.520.770.450.560.740.510.550.87

1 Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2 Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.8. Effect of metabolizable protein (MP) supply on the ratio of the hepatic netremoval of amino acids relative to portai absorption and total influx.

Amino AcidHistidine

Methionine

Phenylalanine

Threonine

Tyrosine

Ratio2

PDVINFLUXPDVINFLUXPDVINFLUXPDVINFLUXPDVINFLUX

LowMP0.3460.0330.2800.0650.4660.0930.2830.0380.4450.075

TreatmentsMedMP

0.3800.0410.2960.0820.5130.1220.1930.0370.5260.099

High MP0.5060.0650.4430.1260.5810.1460.4440.0650.5760.111

SEM0.0630.0120.0400.0130.0300.0070.1200.0180.0910.009

Linear0.150.140.080.030.09

<0.010.420.380.080.05

Quadratic0.560.590.320.470.810.740.290.530.770.62

1 Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP; given for AA showing a net hepatic removal.2 Ratio of hepatic removal on PDV: net portai flux; or on INFLUX: total liver influx =(portai plasma flow*portal concentration) + (arterial plasma flow*arterialconcentration).3 Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.9. Effect of metabolizable protein (MP) supply on arterial concentrations (raM)and splanchnic flux (mmol/h) of urea and ammonia in Holstein cows.

MetaboliteAmmonia

Urea-N

ConcentrationFlux

ConcentrationFlux

Tissue2

PDVHEPTSP

PDVHEPTSP

LowMP0.10

265-249

16

4.4-404881476

TreatmentsMedMP

0.08383

-36122

6.3-3331202869

High MP0.10

396-390

6

8.7-17412581083

SEM0.02

15.429.329.8

0.2764.3

183.0218.5

PLinear0.99

<0.010.020.84

<0.010.060.220.12

3

Quadratic0.440.030.280.76

0.430.580.560.74

1 Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2 PDV: portal-drained viscera; HEP; hepatic; TSP: total splanchnic tissue.3 Probability corresponding to the null hypothesis with linear and quadratic contrasts.

Table 3.10. Effect of metabolizable protein (MP) supply on nitrogen balance (g/d) inHolstein cows.

NitrogenIntakeFècesDigestedUrineMilkRetained in tissues

LowMP475222253

7913141

TreatmentsMedMP

55022632412214159

High MP62424637816515159

SEM6.19.31.52.72.4

11.5

pi

Linear Quadratic<0.01

0.050.02

<0.01<0.01

0.35

0.980.320.300.910.880.55

1 Least squares means presented with pooled SEM (given for n = 4); n = 5 for Low andMed HP and n = 4 for High MP.2 Probability corresponding to the null hypothesis, with linear and quadratic contrasts.

85

3.9 Références

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Effects of rumen-undegradable protein and feed intake on nitrogen balance and milk

protein production in dairy cows. J. Dairy Sci. 81:784-793.

91

CHAPITRE IV

EFFECT OF PROTEIN SUPPLY ON HEPATIC SYNTHESIS OF

CONSTITUTIVE AND PLASMA PROTEINS IN LACTATING DAIRY COWS

Ce chapitre a été soumis dans la revue "Journal of Dairy Science" sous la référence de

Raggio, G., G. E. Lobley, R. Berthiaume, D. Pellerin, G. Allard, and H. Lapierre. 2006.

Effect of protein supply on hepatic synthesis of constitutive and plasma proteins in

lactating dairy cows. J. Dary Sci. (soumis)

4.1 Résumé

L'effet de l'apport de protéines métabolisables (PM) sur la synthèse de protéines

plasmatiques totales et de l'albumine, principalement fabriquées et exportées par le foie,

a été étudié chez la vache laitière. Six vaches multicathéterisées ont reçu deux rations

apportant deux niveaux de PM, 1922 g ou 2517 g/jour de PM, mais fournissant le même

niveau d'énergie. À la fin de chaque période expérimentale, au jour 21, les vaches ont

reçu une perfusion continue avec de 2H5[phénylalanine] (d5-Phe) dans la veine jugulaire

durant 8 h (1,3 mmol/h). Des échantillons de sang ont été prélevés au niveau artériel,

portai et hépatique entre 3 et 8 h. La phénylalanine libre plasmatique, l'albumine et la

protéine plasmatique totale ont été analysées pour déterminer leurs concentrations et

leurs enrichissements isotopiques en d5-Phe. Une diminution de la concentration de

l'albumine (P = 0,02; 32,3 versus 33,7 g/1: 0,11 SEM) a été observée au bas niveau de

PM, mais la concentration en protéines totales plasmatiques n'a pas varié (P > 0,36;

74,1 versus 75,6 g/1; 1,13 SEM). L'incorporation de d5-Phe au cours du temps dans les

protéines plasmatiques et l'albumine totale était linéaire (R2 > 0,98). Ni les taux de

synthèse absolue ou fractionnelle de l'albumine (3,4 vs. 3,4 ± 0,1 % / j ; 36,3 vs. 36,5 ±

1,11 g/j; pour les bas et haut niveaux de PM respectivement) et des protéines

plasmatiques totales (6,8 versus 6,5 ± 0,38 % / j ; 168 vs. 154 ± 19,9 g/j) n'ont été

modifiés (P > 0,20) par l'approvisionnement en PM. L'extraction hépatique nette de

phénylalanine était plus basse avec un régime faible en PM (P = 0,05; -12,3 vs. -20,2 +

1,98 mmol/h). Par conséquent, une plus grande proportion la phénylalanine extraite par

le foie a été utilisée pour la synthèse de protéines d'exportation (P = 0.07; 17,9 versus

11,1 ± 1,83 %) et la synthèse d'albumine (P = 0,09; 4,6 versus 2,9 ± 0,54 %) pour la

ration à bas niveau de PM. Ces résultats suggèrent que la synthèse hépatique de

l'albumine et des autres protéines d'exportation est maintenue chez les vaches laitières

en lactation même lorsque l'alimentation en protéines est réduite.

Mots clés : foie, albumine, synthèse protéique, vache laitière, apport en protéines

4.2 Abstract

The effects of metabolizable protein (MP) supply on synthesis of plasma total

proteins and albumin, as well as total hepatic protein synthesis, were determined in six

multicatheterized, lactating cows. Three TMR formulated to supply the same amount of

energy but différent amounts of MP, 1922 (Low), 2264 (Médium) and 2517 (High) g

MP/day, were fed every 2 h according to a double 3 x 3 Latin Square design. For the

Low and High MP treatments, the cows were continuously infused with 2H5[Phe] (d5-

Phe) into a jugular vein for 8 h (1.3 mmol/h) on d 21 of each period. Concentration and

isotopic enrichment of d5-Phe were measured for free plasma Phe, plasma total proteins

and albumin on hourly samples collected between 3 to 8 h. Low MP decreased plasma

albumin concentration (32.3 vs. 33.7 ± 0.11 g/L) but plasma total protein concentration

was unchanged (74.1 vs. 75.6 ± 1.13 g/L). Incorporation of d5-Phe over time into both

plasma total proteins and albumin was linear (R2 > 0 .98). Neither fractional nor

absolute synthesis rates of plasma total proteins (6.8 vs. 6.5 ± 0.65 %/d; 167 vs. 154 ±

19.9 g/d) or albumin (3.4 vs. 3.4 ± 0.10 %/d; 36.3 vs. 36.5 ±1.11 g/d) were affected by

MP supply. Net hepatic removal of Phe was lower with the Low MP diet (-12.3 vs. -

20.2 ± 1.98 mmol/h). As a resuit, net hepatic Phe removal used for total export protein

synthesis (17.9 vs. 11.1 ± 1.83 %) and albumin synthesis (4.6 vs. 2.9 ± 0.54 %) was

greater at Low MP. Thèse results suggest that hepatic synthesis of plasma proteins,

including albumin, is maintained in lactating dairy cows even when protein supply is

reduced.

Key words: liver, albumin, protein synthesis, dairy cow, protein intake

94

4.3 Introduction

The liver is the major site of removal of certain AA in both ruminants and non-

ruminants (Rérat et al., 1992; Lobley and Lapierre, 2003; Hanigan, 2005). In dairy

cows, for example, approximately 45 % of net portai appearance of total AA is

extracted by the liver (Lapierre et al., 2005). This composite value, however, masks the

considérable variation between AA, with fractional removals of net portai appearance of

essential A A varying between 0 (for the branched-chain A A) and 50 % (Phe). Despite

the fact that the liver is the principal site of ureagenesis in the body (Lapierre and

Lobley, 2001) thèse hepatic extractions do not encompass only catabolism. Instead, part

of the net removal can also be used for synthesis of export proteins (Jahoor et al., 1996;

Connell et al., 1997) plus any net accretion of liver protein during growth (Burrin et al.,

1990).

The différent hepatic export proteins play a variety of rôles, including

maintenance of vascular osmotic pressure (e.g. albumin), coagulation (fibrinogen),

immunity (C reactive protein) and anti-phagocytic mechanisms (ool-antitrypsin, ool-

antichymotrypsin, oo2-macroglobulin). Thèse functions are vital to the metabolic

integrity of the animal and, therefore, synthesis of export proteins is maintained even

under conditions of nutritional deprivation, including low protein intakes and fasting in

sheep and humans (Hunter et al., 1995; Connell et al., 1997; Barber et al., 2000). This is

important because the contribution of export proteins to total hepatic synthesis can be

considérable, e.g. albumin accounted for 18 % of total liver protein synthesis in

fattening lambs (Connell et al., 1997). Such synthesis may hâve implications for AA

supply beyond the liver and support of anabolic processes. For example, the unusual

AA composition of export proteins has led to the suggestion that post-hepatic supply of

free AA to support peripheral anabolism may be compromised, particularly in the case

of Phe and Cys (Reeds et al., 1992). Of course, thèse export proteins may provide an

anabolic source of AA to peripheral tissues, many of which hâve the ability to dégrade

albumin (Eskild et al., 1989; Maxwell et al., 1990). Protein sources, including those in

blood, can provide short-term réservoirs of AA and hâve the advantage of not inducing

95

regulatory mechanisms that would accompany supply of similar quantities of the free

AA.

Therefore, the objectives of this study were, in lactating dairy cows: 1) to

quantify the rate of synthesis of plasma protein synthesis; 2) to estimate the maximum

proportion of net hepatic removal Phe the liver could use to synthesize export proteins;

3) to establish the maximum proportion of hepatic protein synthesis directed towards

export proteins vs. constitutive proteins; and 4) to détermine how thèse parameters are

affected by protein supply.

4.4 Materials and Methods

4.4.1 Animais, Treatments and Sampling

Six multiparous Holstein cows, averaging 656 ± 60 kg BW and 96 ± 8 DIM at

the beginning of the study were used in a double 3 x 3 Latin square design balanced for

residual effects with 21-d expérimental periods. Ail cows were surgically implanted

with cathéters in the portai vein, one hepatic and two mesenteric veins and in a

mesenteric artery. In addition, the right carotid artery was surgically raised to a

subcutaneous position (see Raggio et al., 2004). Three diets were balanced to provide

the same amount of energy (36.4 Mcal NF^/d) but with increasing amounts of

metabolizable protein (MP), averaging 1922 (Low), 2264 (Médium), and 2517 (High)

g MP/d (NRC, 2001). Diets were as detailed previously (Raggio et al., 2004) and

offered in equal quantities every 2 h from automated feeders (Ankom, Fairport, NY),

except for 1 kg of long hay that was offered once a day. The cows had free access to

water and were housed in a tie stall barn, lit from 0600 to 2200. Cows were milked

twice daily (0600 and 1800) and yield was recorded at each milking.

On day 18, 19 or 20 of each expérimental period, measurements were made of

splanchnic plasma flows by downstream dilution of p-aminohippurate and of mammary

plasma flow using the Fick principle, as reported previously (Raggio et al., 2004). At

0600 on the last day of each period (d 21), cows on Low and High MP diets received an

8-h (1.3 mmol/h) infusion of 2H5-Phe (d5-Phe; Cambridge Isotope Laboratories,

Andover, MA, 99 atom %), preceded by a priming dose (1.3 mmol). Infusions of d5-

96

Phe were limited to the Low and High treatments due to the cost of the tracer. Blood

samples were collected simultaneously every hour from the artery plus portai and

hepatic veins starting 3 h after initiation of the infusion (n = 6). Blood samples from the

mammary vein were obtained by venepuncture every other hour (n = 3). Two blood

samples were taken from each cathéter prior to the start of infusion for détermination of

natural abundance.

The expérimental protocol was approved by the Committee for Animal Care of

the Lennoxville Research Centre and conducted according to the guidelines of the

Canadian Council on Animal Care (1993).

4.4.2 Laboratory Analyses

Plasma was obtained immediately following blood sampling by centrifugation at

1000g for 15 min at 4°C. Plasma Phe concentrations were measured by the gravimétrie

isotope dilution method (Calder et al., 1999). On the day of sampling, 0.2 g of an

internai standard (226 uM of l-13C-Phe, 99 atom %; C/D/N isotopes, Montréal, QC,

Canada) was added to 1 g of plasma and the mixture was stored at -20°C for later

analysis. At the time of analysis, thèse samples, as well as plasma taken for isotopic

enrichment analysis, were thawed, mixed, deproteinized with sulfosalicylic acid (380

g/1) and desalted on AG-50 H+ resin. The freeze-dried eluate was derivatized with N-

(tert-butyldimethysilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA): acetronile (1:1) to

form the N-(tert-butyldimethyl) AA derivative (Calder and Smith, 1988). The Phe

isotopic enrichments (IE) were quantified by gas chromatography-mass spectrometry

(GC-MS) as either m/z ions 321, 322 (to détermine concentrations on samples with the

internai standard, l-13C-Phe) or as m/z ions 336, 341 (to détermine the IE of plasma free

d5-Phe; GC-MS, Hewlett Packard, Model GC6890-MS973, Agilent Technologies,

Willmington, DE).

In addition, détermination of the enrichment of d5-Phe incorporated into plasma

total proteins and albumin was determined as described by Connell et al. (1997) as m/z

ions 336, 341 (GC-MS Voyager, Thermoquest, Wythenshawe, Lancashire, UK).

Détermination of the concentration of plasma total proteins and of albumin was

performed on a clinical analyzer (KONE Instruments Corporation, Espoo, Finland)

calibrated with appropriate standard supplied by manufacturer (Thermo Electron

Systems, Waltham, MA).

4.4.3 Calculations and Statistical Analyses

During the infusion of d5- Phe, the temporal increase in IE of d5-Phe

incorporated into plasma total proteins and albumin were plotted against time (between

3 and 8 h) to détermine linear régressions, as described previously (Connell et al.,

1997). The slope was used in conjunction with the appropriate precursor pool (taken as

the IE of free d5-Phe in the hepatic vein at plateau, i.e. from 3 to 8 h of infusion, see

Connell et al., 1997) to calculate the fractional rate of protein synthesis of both plasma

total proteins and albumin.

Daily fractional rates (FSR) of plasma total proteins (PTP) and albumin (Alb)

were calculated as follows:

FSR (%/day) = slope (IE of PTP or Alb vs. time (h)) / IEH * 24 * 100

where IE was expressed as mole percent excess (mpe).

Half-life (d) was estimated from Ln(2)/(FSR/100).

The absolute rates of PTP and Alb synthesis (ASR) were calculated as:

ASR (g/d) = FSR (PTP or Alb) * [ PTP or Alb ] * PV

where [ PTP or Alb ] refers to the plasma concentrations of plasma total proteins

or albumin (g/L), respectively, and PV to the plasma volume (L), assumed to average

49.9 mL/kg of body weight (Girard et al., 1989). To estimate the requirement of Phe for

the ASR of plasma total proteins or albumin, we assumed that plasma total proteins

contain 5 % Phe (Connell et al., 1997) and albumin contains 6 % Phe (Peters et al.,

1985)

Net fluxes of Phe across the portal-drained viscera (PDV), liver, and splanchnic

tissues (TSP = PDV plus liver) as well as mammary gland were calculated for each cow

as the product of the average of the venous-arterial concentration différence and the

plasma flow, estimated on the day prior to the d5-Phe infusion (see Raggio et al., 2004).

A négative flux means utilization or removal, while a positive flux indicates net

production or release.

Whole body (WB) Phe irréversible loss rate (ILR; mmol/h) was calculated as

follows:

WB-ILR = (IEinf / IEA - 1) x Inf

where IEjnf and IEA are the IE of the infusate and the mean IE of d5-Phe in

arterial plasma free Phe, and Inf is the infusion rate (mmol/h) of the d5-Phe.

Phenylalanine ILR (mmol/h) through the liver was calculated as follows:

Hepatic-ILR = ((([PheH] x IEphe.H - [PheP] x IEPhe.p) x PFP) + (([Pheh] x IEPhe.H -

[PheA]xIEPhe.A)xPFA)))/IEH

where the subscript indicate the site of plasma collection (A for artery, P for

portai vein, H for hepatic vein), IEPhe, [Phe] and PF represent, respectively, the IE (mpe)

and concentration (mM) of plasma free Phe and the plasma flow (L/h) in the

corresponding vessel.

Since the cows were in mid-lactation, changes in liver protein mass were

assumed to be zéro and, therefore, hepatic Phe oxidation (mmol/h) was estimated to be

the différence between net Phe liver removal minus Phe used for plasma total protein

synthesis. Then Phe used in the liver for protein synthesis was calculated as:

Hepatic protein synthesis = hepatic ILR - hepatic oxidation

Phenylalanine used for the synthesis of constitutive protein in the liver was

calculated as the différence between that used for total hepatic protein synthesis and that

used for the synthesis of plasma total proteins.

Data were analyzed statistically using the MIXED procédure of SAS (SAS

Institute Inc. 2004). One cow did not hâve a patent hepatic cathéter and her portai

cathéter was also misplaced. Therefore data for this cow were discarded from ail

analyses. In addition, one cow suffered from severe mastitis during her last period (on

High MP) and this cow period was also excluded. Therefore, n = 5 for Low MP and n =

99

4 for High MP. Treatment différences were considered significant if P < 0.05 and as a

tendency with 0.05 < P < 0.10.

4.5 Results

The increase in MP supply resulted in a 15 % improvement in milk protein yield

(848 vs. 980 g/d, P = 0.05) as reported previously (Raggio et al., 2004). For both plasma

total proteins and albumin there was a linear (R2 > 0.98) incorporation of d5-Phe

between 3 to 8 h of the d5-Phe infusion (Fig 1). Synthesis rates, both fractional and

absolute, of plasma total proteins and albumin plus their concentrations are presented in

Table 1. Albumin concentration increased with the High MP diet, by 4 % (P = 0.02).

Concentrations and 1E of plasma free Phe are presented in Table 2. The

concentration of Phe increased (P < 0.07) in ail blood vessels with the High MP diet,

whereas the 1E of Phe decreased (P < 0.03). Phenylalanine net flux across the PDV

increased (23.5 vs. 32.6; P = 0.06) with the High MP diet (Table 3). This was

accompanied by increased (P = 0.05) net hepatic Phe removal with, as a resuit, no

change (P = 0.72) in net supply beyond the total splanchnic tissues. The maximum

proportion of hepatic Phe removal used for export of plasma total protein synthesis

(17.9 vs. 11.1 ± 1.83 %; P = 0.07) and for albumin synthesis (4.6 vs. 2.9 ± 0.54 %; P =

0.09) tended to decrease at the higher MP supply. There was only a numerical increase

(P = 0.18) in mammary gland net uptake of Phe between the two diets and this uptake

matched net Phe supply beyond the liver and milk output.

Phenylalanine kinetics are presented in Table 4. The High MP diet increased (P

< 0.01) WB 1LR while Phe hepatic 1LR increased by 51 % (P = 0.04). This latter effect

was due to a combination of increased hepatic oxidation (P = 0.05) and hepatic protein

synthesis (P = 0.04). The synthesis of constitutive proteins increased with High MP (P

= 0.03), with a tendency for thèse to represent a higher proportion of total hepatic

protein synthesis (83.3 vs. 88.4 ± 1.39 %; P = 0.06).

4.6 Discussion

The objectives were to examine whether MP supply alters 1) synthesis of plasma

proteins, including albumin, mainly synthesized by the liver; 2) the proportion of net

100

hepatic Phe removal not catabolized but used to support synthesis of export proteins

(which could support milk protein production); and 3) the proportion of hepatic protein

synthesis directed towards constitutive proteins vs. export proteins. Interprétation of the

results, however, requires considération of the limitation of the techniques used.

Because multicatherized animais were used, liver biopsies were not performed and,

therefore, the IE of the hepatic precursor pool for protein synthesis was assumed similar

to the IE of plasma free d5-Phe in the hepatic vein. In sheep, this has been shown to be a

valid assumption for estimation of the synthesis of export proteins (Connell et al.,

1997), formed on the rough endoplasmic reticulum in close contact with the

extracellular pools. For constitutive protein synthesis, however, the precursor IE is

probably lower and close to that in the hepatic cytosol (Fern and Garlick, 1976; Smith

and Sun, 1995; Connell et al., 1997). As this intracellular IE could not be estimated in

the current study, the values of the constitutive protein synthesis are underestimated.

Based on data from fed sheep, this underestimate would approximate to 25 % (Connell

et al., 1997). Furthermore, plasma total proteins involve a mixture derived from liver

(including albumin, fibrinogen and 60 to 80 % of plasma globulins) and other sources

(e.g. the y globulins are synthesized in lymphoid tissues and other cells of the

reticuloendothelial System; Guyton, 1981). Therefore, assuming that plasma total

proteins are ail hepatic-derived will yield an over-estimation of liver activity.

Nonetheless, provided that the two MP supplies do not influence either the relationship

between intracellulanvascular IE or in the proportion of export proteins derived from

liver, then the relative responses to diet can be properly considered.

The absolute synthesis rates of both plasma total proteins and albumin were

unaltered by the change in MP supply. Studies in other species hâve reported albumin

synthesis to be sensitive to nutrient supply, with decreases in both 3-d starved sheep

(Connell et al., 1997) and overnight-fasted humans (Hunter et al., 1995). In addition,

low protein supply also decreases albumin synthesis in humans (Barber et al., 2000) and

pigs (Jahoor et al., 1999). Thèse reported experiments exerted moderate to severe

nutrient deprivations whereas in the current study the lowest MP supply still supported

over 30 kg of milk/d. Therefore, the lack of response in export protein synthesis in thèse

lactating cows may reflect the relatively mild nature of the nutrient différences or,

101

alternatively, may indicate the demands on the lactating cow require maintenance of

plasma protein synthesis to ensure biological integrity and function. Indeed, in

comparative terms, plasma total protein synthesis, expressed on a metabolic BW basis,

is slightly higher in the lactating dairy cow than in the non-lactating sheep (1.24 vs. 1.04

g/kg BW0'75; current study and Connell et al., 1997). A similar différence was observed

for albumin (0.28 vs. 0.21 g/kg BW075). This latter différence may reflect the need for

export albumin (and other plasma proteins) in the milk which averages 14 g of albumin

(based on 0.4 g albumin/kg milk protein), representing 38 % of albumin synthesis.

Hepatic export protein synthesis did not change even though net portai

absorption of Phe was decreased on the Low MP diet, as was the hepatic extraction.

Therefore, at the lower MP supply the proportion of the Phe removed by the liver used

for export protein synthesis increased. while Phe oxidation decreased by 33 %.

Interestingly, although export protein synthesis was not affected by protein supply, the

estimate of constitutive protein synthesis was reduced markedly (39 %, P = 0.03) at the

lower MP. This meant a substantial change occurred in the proportion of total liver

protein synthesis represented by export protein between High and Low MP supply (17

vs. 12 %). Nonetheless, thèse proportions are still much lower than in non-lactating

sheep (38-51 %; Connell et al., 1997) and reflects, for the dairy cow, a higher estimated

FSR for constitutive proteins, 0.51-0.70/d (based on 788 and 1089 g of constitutive

protein per day for Low and High MP, respectively, liver size of 1.47 % BW (Reynolds

et al., 2004) and 16.7 % of CP in the liver (Girard, personal communication)) compared

with 0.19/d in sheep (Connell et al., 1997). As the FSR of hepatic constitutive proteins

is sensitive to protein intake, the différence between thèse cows and the values observed

in sheep may reflect a combination of greater metabolic aetivity of the liver at higher

protein intakes and species différences.

As a resuit of increased MP supply, the net portai appearance of Phe increased

and this led to a 14-30 % increase in plasma Phe concentrations and conséquent

elevated net Phe hepatic removal, as observed in other studies (Bach et al., 2000; Blouin

et al., 2002). Net hepatic extraction represented 55 % and 61 % of net portai absorption

atLow and High MP intake, respectively, with Phe usually one of the AA extracted in

102

the greatest proportion relative to portai absorption in lactating cows (Hanigan, 2005;

Lapierre et al., 2005). However, the fraction of removal relative to total inflow to the

liver, i.e., total flow from the portai vein plus the hepatic artery, did not differ between

MP supply, representing 10 % vs. 13 % of total inflow for Low vs. High MP,

respectively. Hanigan (2005) and Lapierre et al. (2005) hâve previously suggested that

the fractional hepatic removal of AA relative to total inflow is relatively constant in

lactating cows. Post-splanchnic free Phe supply matched both uptake and output (milk)

by the mammary gland, as observed in a number of récent reports (see Lobley and

Lapierre, 2003; Lapierre et al., 2005). Such findings negate the need to invoke plasma

protein as a potential source of AA, at least for milk synthesis.

Based on the présent findings, the hypothesis that synthesis of hepatic export

proteins may limit free Phe supply post-liver for anabolism (Reeds et al., 1992) does not

apply in the healthy, lactating cow. Furthermore, while export proteins can provide a

source of AA to tissues, as reported for skin, muscle and liver (Eskild et al., 1989;

Maxwell et al., 1990), this does not seem to be necessary to support mammary gland

metabolism, as assessed from the close quantitative agreement between supply and

utilization for milk protein sécrétion. Whether AA from export proteins are utilized in

the dairy cow for anabolic purposes by non-hepatic tissues or enter catabolic pathways

beyond the liver (e.g. dégradation within the intestinal tract; Poppi et al., 1986) cannot

be identified from the current study. If they do provide an anabolic component, this

would supply, at maximum, an additional 18-20 % above that available as free Phe.

4.7 Conclusion

In healthy, mid-lactation dairy cows, synthesis of either plasma total proteins or

albumin is not altered by metabolizable protein supply. Their constant synthesis, across

a 30 % change in MP intake, suggests their metabolic priority is maintained even

though milk protein yield altered by 15 %. Although a larger proportion of Phe

extracted by the liver was used to support export protein synthesis at Low MP supply

this was offset by lower hepatic oxidation and so the amount of free Phe available to

support milk protein production remained unchanged.

103

4.8 Aknowledgments

The authors gratefully thank the staff of the Dairy and Swine R&D Centre for

taking care of the animais, M. Léonard, S. Provencher and J. Renaud for their dedicated

technical support, as well as S. Méthot for statistical analyses. Grateful thanks are

extended to F. Boutachkourt for isolation of the plasma albumin and total proteins and

to S. Anderson for the mass spectrometric analyses of the protein bound enrichments.

The authors also wish to acknowledge H.J. Baker & Bro. Inc. for supplying the Pro-Lak

bypass protein supplément and the financial support of the Action concertée Fonds

FCAR - Novalait - MAPAQ, the National Science and Engineering Research Council

of Canada, a grant to the Rowett Research Institute from the Scottish Executive

Environmental and Rural Affairs Department and Agriculture and Agri-Food Canada

(Contribution number xxx).

104

Figure 4. 1. Average of the enrichment (MPE= molar percent excess x 1000) of Phe inplasma total proteins and albumin during a continuous infusion of 2H5-Phe at Low (la)or High (lb) metabolizable protein (MP) supply.

Figure a. Low MP

1 5 G 1 B 9

houii al irfuiion

Albumin: R2~ 0.998, SE = 1.8 Total proteins: R = 0.998, SE= 2.2

Figure b. High MP

2 3 4 5

Albumin: R2 = 0.987, SE = 1.5 Total proteins: R2 = 0.989, SE = 2.9

105

Table 4.1. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on concentrations and proteinsynthesis rates of plasma albumin and total proteins.

Concentration, g/1

FSR2, %

ASR3, g/d

AlbuminTotal plasma proteinAlbuminTotal plasma proteinAlbuminTotal plasma protein

TreatmentsLow MP High

32.374.1

3.46.8

36.3168

MP33.775.63.46.4

36.5154

SEM1

0.111.130.090.651.11

19.9

P0.020.360.790.680.870.64

'Least square présentée! with pooled SEM (given for n = 4) Low MP, n = 5 and High MP, n = 4.2Fractional synthesis rate3Absolute synthesis rate

106

Table 4.2. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on Phe concentration andisotopic enrichment plasma samples during a 8-h infusion of 2Hs-Phe1.

PhenylalanineConcentration, uM

Isotopic enrichment, mpe2

SiteArterialPortaiHepaticMammaryArterialPortaiHepaticMammary

TreatmentsLowMP

59.777.766.638.3

3.52.32.33.5

High MP71.698.279.350.12.92.01.92.8

SEM1

2.612.502.072.640.090.070.060.11

P0.040.010.020.070.010.030.030.03

'Least square presented with pooled SEM (given for n = 4) Low MP; n = 5 and High MP; n = 4.2 mpe: molar percent excess

107

Table 4.3. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on net transfers of Phe(mmol/h)

TissuePortal-drained visceraHepaticTotal splanchnic tissueMammary glandMilk

TreatmentsLowMP

23.5-12.311.2

-11.310.5

High MP32.6

-20.212.5

-12.912.1

SEM2.341.982.640.560.43

P0.060.050.720.180.05

'Least square presented with pooled SEM (given for n=4) Low MP; n = 5 and High MP; n = 4.

108

Table 4.4. Effect of supply of metabolizable protein (MP) on Phe kinetics (mmol/h)

ItemWhole body-ILR2

Hepatic-ILRHepatic OxidationHepatic total protein synthesisHepatic constitutive protein constitutiveProtein synthesis: constitutive/total

TreatmentsLowMP

35.4-23.3-10.2-13.0-10.9

0.83

High MP42.9-35.3-18.2-17.1-15.1

0.88

SEM0.872.661.890.920.810.01

P<0.01

0.040.050.040.030.06

'Least square presented with pooled SEM (given for n=4) Low MP; n = 5 and High MP; n = 4.2ILR = irréversible loss rate

109

4.9 Références

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112

CHAPITRE V

EFFECT OF CASEIN AND PROPIONATE SUPPLY ON WHOLE BODY

PROTEIN METABOLISM IN LACTATING DAIRY COWS

Ce chapitre a été publié dans la revue "Canadian Journal of Animal Science " sous la

référence de G. Raggio, G.E. Lobley, S. Lemosquet, H. Rulquin, and H. Lapierre. 2006.

Effect of casein and propionate supply on whole body protein metabolism in lactating

dairy cows. Can. J. Anim. Sci. 86: 81-89.

113

5.1 Résumé

Les effets de perfusions de caséine (Cas) et de propionate (C3) sur le

métabolisme corporel de la leucine (Leu) ont été étudiés. Pour cela, trois vaches

Holstein multipares, fistulisées aux niveaux ruminai et duodénal ont été utilisées selon

un double carré de Youden avec des périodes expérimentales de 14 jours. Les vaches

recevaient une ration à base de balles rondes enrubannées, apportant 124,1 MJ/jour

d'ENL et 1593 g/jour de protéines digestibles dans l'intestin (PDI ; INRA 1989). Les

effets de perfusions de Cas (743 g/jour au duodénum) et de C3 (1041 g/jour au rumen)

ont été étudiés selon un plan factoriel. À chaque période, de la L[l-13C]Leu (4.3

mmol/h) a été perfusé au jour 11 et du [13C]bicarbonate de sodium (4.2 mmol/h) a été

perfusée au jour 13 dans une veine jugulaire. Des prélèvements sanguins carotidiens ont

été effectués pour mesurer l'enrichissement isotopique du 13C[4-methyl 2-

oxopentanoate] (MOP, jour 11) et du 13CO2 (jour 11 & 13). Les traitements de Cas et de

C3 ont augmenté le taux protéique du lait et la production de matières protéiques, mais

seuls les traitements de Cas ont augmenté le volume de lait (18 %). L'augmentation du

flux corporel de la Leu (26 %), de son oxydation (146 %), de son utilisation pour la

synthèse protéique (15 %) et sa sécrétion dans la protéine du lait (21 %) suggèrent une

stimulation générale du métabolisme protéique par les traitements Cas. Les traitements

C3 ont tendance à augmenter le flux corporel de Leu (5 %), la synthèse protéique (7 %)

et la Leu sécrétée dans le lait (7 %). Cependant sur l'oxydation corporelle de la Leu, il y

avait une tendance à une interaction entre Cas et C3. Ceci suggère que l'impact de

l'énergie sur le métabolisme protéique est tributaire du niveau de protéines fournies à

l'animal.

Mots-clés: vache laitière, leucine, caséine, propionate, flux corporel.

114

5.2 Abstract

The effects of Casein (Cas) and propionate (C3) on whole body (WB) leucine

(Leu) metabolism were determined in three multiparous Holstein cows, fitted with both

duodénum and rumen cannulas, used in a Youden replicated square with 14 d-periods.

Cows were fed a grass silage-based diet estimated to supply 124.1 MJ/d of NEL and

1593 g /d of protein digested in the intestine (INRA 1989). Cas (743 g/d in the

duodénum) and C3 (1041 g/d in the rumen) infusions were tested in a factorial

arrangement. For each period, on d 11, L[l-13C]leucine (4.3 mmol/h) and on d 13,

[13C]sodium bicarbonate (4.2 mmol/h) were infused into a jugular vein. Blood samples

were taken from a carotid artery to measure enrichments of 13CC>2 (d 11 & 13) and of13C[4-methyl 2-oxopentanoate] (MOP, d 11). Both Cas and C3 treatments separately

increased milk protein concentration and yield, but only Cas treatments increased milk

yield (18 %). The overall incréments in Leu irréversible loss rate (ILR) (26 %),

oxidation (146 %), protein synthesis (15 %), and output in milk protein (21 %) suggest a

gênerai response in protein turnover to Cas treatments. C3 treatments tended to increase

Leu WB ILR (5 %), protein synthesis (7 %) and in milk (7 %), with also a tendency for

a Cas x C3 interaction on WB Leu oxidation. The latter suggests that the impact of

energy on protein metabolism dépends on the level of protein supply.

Key words: Dairy cow, leucine, casein, propionate, whole body irréversible loss rate.

115

5.3 Introduction

In dairy cows, milk protein yield can be manipulated by varying either energy or

protein intakes (de Peters and Cant 1992). Thèse responses may reflect changes in

whole body (WB) protein metabolism (including synthesis and oxidation), as observed

when total food supply is altered in growing cattle (Lobley et al. 1987; Lapierre et al.

1999). Of more interest is to know whether, and how, individual macronutrients,

particularly energy or protein, might impact on protein metabolism and animal

performance. This is important because, in mechanistic terms, either protein/amino

acids (AA) or energy (glucose or precursors such as propionate) may act differently.

In the non-lactating state, there appears to be consistent responses in WB

metabolism to increased protein supply across a wide range of species. For example, in

sheep, infusion of casein into the abomasum (Liu et al. 1995) elevated WB protein

turnover, as did increased protein intake in humans (Garlick et al. 1991). In such cases,

the increased WB protein turnover was the resuit of a combined incrément in both

oxidation and protein synthesis. In contrast, for the lactating dairy cow, changes in WB

protein metabolism appear to be less consistent. For example, WB leucine kinetics can

be either unaffected by an incrément in crude protein supply (Bequette et al. 1996b),

numerically increased with a caseinate infusion (Oldham et al. 1980) or signifïcantly

improved with additional metabolisable protein supply (Lapierre et al. 2002). The

reasons for thèse différent responses are unclear and need to be understood in order to

build better prédictive models of dairy cow metabolism.

The effect of energy on WB protein metabolism is even more unclear. Compared

with the effect of additional protein supply, supplementation of pigs with non-protein

energy sources increased WB protein synthesis to a lesser extent but reduced leucine

catabolism (Reeds et al. 1981). Similarly, in humans, energy also had a smaller effect on

WB protein turnover than did protein supply (Garlick et al. 1991) while in sheep,

Abdul-Razzaq and Bickerstaffe (1989) observed a reduced protein turnover with

infusion of propionic acid, linked with decreased protein breakdown. Thèse data in

other species show that although energy supply can potentially impact protein

metabolism, the exact mechanisms may vary with expérimental conditions.

116

Although no data are available on the effect of energy supply on protein kinetics

in dairy cows, milk represents an important export protein and is probably associated

with increased rates of protein synthesis, at least for the mammary gland. Increasing

energy supply either through infusions of propionic acid into the rumen or glucose into

the duodénum can elevate milk protein output (Hurtaud et al. 1998b). Such responses

must involve more efficient use of dietary AA supply, i.e. decreased oxidation. In

ruminants, the major glucogenic source is propionate (McBride et al. 1998). Besides

acting as a precursor for glucose, in vitro studies demonstrated that this nutrient can be a

potential inhibitor of the other glucogenic pathways (Demigné et al. 1991) leading to

sparing effect on AA for a potential increase in milk protein output. This mechanism,

that should be linked to decreased ureagenesis, has not been convincingly demonstrated

in vivo in sheep (Kim et al. 1999).

In terms of interactions, none were observed between glucose and protein supply

on protein milk yield (Clark et al. 1977; Vanhatalo et al. 2003), and similarly a

combination of glucose and histidine showed additive responses (Huhtanen et al. 2002).

Surprisingly, the interaction between the main glucose precursor, propionate, and

protein has not been tested.

In an attempt to résolve some of the current uncertainties about the separate and

interactive effects of protein and propionate on metabolism in the lactating cow, the

current study was designed to examine the impact of casein and propionic acid supply

on milk production, and on mammary and WB kinetics of leucine and glucose. This

manuscript describes the findings that relate to WB leucine metabolism.

5.4 Material and Methods

5.4.1 Animais

Three multiparous Holstein cows, averaging 615 ± 24 kg BW and 65 ± 4 days in

milk at the beginning of the study, had been fitted, before calving, with both a proximal

T-shaped duodenal cannula, placed 10 to 15 cm from the pylorus, and a ruminai cannula

(Hurtaud et al. 1998a). One month before the beginning of the experiment, the cows

were further prepared with two permanent cathéters (Polyurethane cathéter tubing, i.d.

117

1.0 mm, o.d. 1.7 mm, UNO, Roestvaststaal BV, Holland), one inserted in the right

carotid artery and the other in the right subcutaneous abdominal vein as described

previously (Guinard et al. 1994). Thèse two permanent cathéters were protected in a

silicone rubber tubing (Silclear TM grade médical silicone tubing, i.d. 1.57, o.d. 3.18

mm, VWR International SAS, Briare, France). One ring of Dacron (Mersutures, TS53,

Ethicon, France) was placed around the cathéters at the point of extériorisation to

prevent infection. During the experiment, problems were encountered with one arterial

cathéter and a replacement was inserted in the left carotid artery. For the tracer

infusions, a silicone rubber cathéter (length, 21 cm; i.d., 1.02 mm; o.d., 2.16 mm;

Silclear tubing, Degania, Israël) was inserted in the left jugular vein before the

beginning of the experiment. Cathéter maintenance was performed as described

previously (Guinard et al. 1994). The expérimental procédures were reviewed and

approved by the Animal Care Committee of the French Ministry of Agriculture.

5.4.2 Feeding and Treatments

The diets were formulated with the INRA model (Institut National de la

Recherche Agronomique 1989) The same diet, 55 % grass silage and 45 % concentrate

(on DM basis: 54 % peas; 30 % dried sugar beet pulp; 1 % cane molasses; 4 % soybean

oil; 4 % NaCO3; 3 % CaCO3; 3 % CaHPO4, 1 % minerai and vitamin premix) was fed

to ail the cows (Table 5.1). The basai diet supplied 124 MJ là NEL and 1593 g/d of

protein digested in the intestine (PDI: INRA 1989) to the cows on the control treatment,

équivalent to 97 % of energy and protein requirements. When estimated using NRC

(2001), the supply on the basai diet was 119 MJ/d NEL and 1624 g/d metabolizable

protein. This diet, the same as that used by Rigout et al. (2003), was estimated to supply

little intestinal glucose. The quantity of wet feed offered was adjusted every day to

insure the same delivery of DM on each expérimental day, after détermination of DM

content of the grass silage.

Superimposed on the basai diet, four treatments were tested in a factorial

arrangement: duodenal infusion of calcium caseinate (743 + 7 g/d: 687 g/d PDI) and

estimated to provide 7.9 MJ/dof NEL (Guinard et al. 1994) and/or ruminai infusions of

propionic acid (1041 ±8 g/d), estimated to provide 15.6 MJ/d of NEL, as used in Rigout

118

et al. (2003). Therefore, treatments were: 1) control (Ctrl), 2) casein (Cas) 3) propionic

acid (C3) and 4) the casein and propionic acid combined (Cas+C3). The infusion dose

of casein was the highest dose used by Guinard et al. (1994), but within the range of

protein supply for a dairy ration. Propionate was chosen as the energy source as it is the

primary glucose precursor in dairy cow diets and should hâve the strongest effect on

sparing AA for gluconeogenesis. It is also less metabolically characterized than glucose

in dairy cows. Propionate was infused at the dose that yielded the maximal effect on

milk protein observed by Rigout et al. (2003). The original design was a 4 x 4 Latin

square but the loss of one cow led to a re-design of the experiment as two incomplète 4

x 3 Youden squares with 3 periods each for a total of 18 observations distributed as

follows: Ctrl: n = 5; Cas: n = 4; C3: n = 5; Cas+C3: n = 4. One cow had problems with

the arterial cathéter during the third period (Cas treatment), therefore, n = 3 for Cas for

the blood measurements. Each treatment period lasted 14 d, and the fïrst two days of

each period included transition for the infusions (the cows received on day 1, 0.33, and

on day 2, 0.66 of the total subséquent infusion).

The casein infusate (Armor Proteins, St Brice en Cobles, France) was prepared

daily at 30°C in 15 kg of tap water. The dose of C3 (Langlois S.A., Saint Jacques de la

Lande, France) was dissolved daily in 40 kg of tap water. A buffer solution (540 ± 4 g

of NaHCO3 plus 280 ± 2 g of KHCO3) was prepared daily in 10 kg of tap water. This

buffer was used to limit ruminai pH decrease with C3 to avoid acidosis, and the buffer

was infused in ail cows to maintain constant anion-cation balance between treatments.

Urea (average daily supply of 99 g) was added to this buffer solution as a dietary

supplément. Ail the cows in ail treatments received a similar volume in the rumen (total

of 49.5 ± 0.6 kg including 9.95 ± 0.07 kg of buffer and 39.5 ± 0.7 kg of water or

propionic acid solution) and in the duodénum (14.8 ± 0.14 kg of water or casein

solution). Thèse solutions were infused continuously by means of peristaltic pumps.

The concentrate was supplied every 3h in equal portions from automatic

feeders, starting at 0715h. Grass silage was fed three times per day: 25 % at 0715h, 25

% at 1315h, 50 % between 1715h and 1915h, except during the kinetic days (days 11

and 13) when the silage was fed four time per day: 12.5 % at 0715h, 1015h, 1315h and

119

1615h and then 50 % at 1915h. Throughout the whole study, access to the diet was

limited to lh after the concentrate distribution times. Cows had free access to water and

were housed in individual tie stalls. Every day before 0715h, any feed refusais were

weighed.

5.4.3 Sampling and Laboratory Analyses

Cows were milked twice daily (0630 and 1830 h) with yield recorded at each

milking and each sample was assayed for fat and true protein compositions by infrared

analysis (Milkoscan, Foss Electric, Hillerad, Denmark). During the second week of the

expérimental period, cows were milked from each half udder separately and milk

samples (each half udder) were assayed for fat and protein composition by infrared

analysis. Samples of the grass silage and concentrate mixture were taken every day. The

DM of the grass silage was determined on daily samples, while the DM of the

concentrate was determined every week on a pooled sample by oven drying at 80°C for

48 h. Feed samples for other analyses were stored at -20°C until analysis, where they

were pooled by period.

On day 11, L[1-13C] leucine (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA.

99 ape) was infused at 4.3 mmol/h (14.20 mg/ml dissolved in stérile 0.9 % NaCl; 0.66 g

solution/min) for 7.5 h (starting 3.5h after the morning milking), preceded by a priming

dose of 4.3 mmol, équivalent to an hour of infusion (Wolfe, 1984). On day 13, a

mixture (in stérile 0.9 % NaCl) of [1-13C] bicarbonate (Cambridge Isotope Laboratories,

Andover, USA. 99 ape; 4.7 mg/ml) and [6.6-2H2] glucose (Cambridge Isotope

Laboratories, Andover, USA. 99 ape; 60 mg/ml) was infused. Within this mixture the

rate of [1-13C] bicarbonate infusion was 4.2 mmol/h (1.26 g solution/min) for 4 h

between 1200 to 1600 h, preceded by a priming dose équivalent to 3.2 mmol. Glucose

kinetics will be described in a separate paper.

On both days, cows were made to stand for at least 15 min before blood

sampling. On day 11, hourly samples were taken from the carotid artery starting 3 h

after the initiation of the infusion at lOOOh (1300, 1400, 1500, 1600 and 1700h) and

were analyzed for isotopic enrichment (IE) of leucine, 4-methyl 2-oxopentanoate

(MOP) and of CO2. On the same day, samples for AA analysis were taken at 0700,

120

0900, 1100, 1300, 1400, 1500, 1600 and 1700h and for urea at 0700, 0900, 1100, 1300,

1500 and 1700h. On day 13, samples were collected starting 1.45h after the initiation of

the infusion at 1200 (1345, 1430, 1515 and 1600h) and were analyzed to détermine the

IE of CO2. On both days 11 and 13, samples were also collected prior to the initiation of

stable isotope infusion to détermine natural abundance of leucine, MOP (2 samples:

0700 and 0900h) and CO2 (3 samples: 0800, 0900 and lOOOh).

Blood samples (7.5 ml) for AA concentrations were collected in heparinized

syringes and kept on ice. Plasma was prepared by centrifugation (2000 x g at 4°C for 15

min), 0.7g plasma was weighed, then 0.4 g of the internai standard solution was added

and the mixture was stored at -80°C. The internai standard solution was prepared at the

following concentrations: 501 nmol/g [5-I5N] Gin, 252 nmol/g [indole-15N] Trp, 260

nmol/g [1-13C] Cys, 8.8 umol/g [15N2] Urea, plus a U-13C Algal hydrolysate. This

follows the methodology for détermination of AA concentration by isotope dilution as

previously described (Calder et al. 1999). Plasma samples for urea were pooled per cow

and period and stored at -20°C until analysis on a multiparameter analyzer (KONE

Instruments Corporation, Espoo, Finland) using an enzymatic kit (KONE, urea UV

kinetic kit n°l 1703, KONE diagnostics, KONA Instruments S.A., Evry, France)

For MOP and [l-13C]leucine IE (expressed as molar percent excess, mpe), 0.7 g

plasma was weighed and 0.3g of an oxohexanoic acid solution (33.3 nmol/g) added, and

the mixture was stored at -80°C until analysis. Déterminations of MOP and leucine IE

were as described by Calder and Smith (1988). For CO2 IE, triplicate 1 ml of blood

samples were injected into evacuated vacutainers containing 1 ml of lactic acid,

immediately mixed and kept at room température until analysis was performed.

Détermination of IE (mpe) was as previously described (Lobley et al. 2003) based on

Read et al. (1984) and Reeds and Hutchens (1994).

5.4.4 Calculations

In ail équations, WB irréversible lost rate (ILR) and infusion rates are expressed

in mmol/h and IE in mpe. Tracer refers to 13C-leucine or 13C-bicarbonate and tracée is

the unlabelled leucine and bicarbonate.

121

Whole body leucine ILR or carbon dioxide entry rate (CER) were calculated as

follows:

WB-ILRtraCee or CERtracee = (IEinf / IEa - 1) x Inf

where IEjnf and IEa are the IE of the infusate and the mean enrichment of arterial

plasma MOP, leucine or 13CO2, respectively and Inf is the infusion rate of the 13C-

Leucine or 13C-bicarbonate.

Leucine tracer oxidation (mmol/h) was calculated as:

Leutracer oxidation = CER x IEa 13CC>2-Leu

Where CER is the CO2 entry rate measured during bicarbonate infusion

(described above) and IE 13CO2-Leu is the mean arterial enrichment of 13CÛ2 during

leucine infusion. For this calculation, it is assumed that the CER production during the

bicarbonate infusion day is the same as during the day of leucine infusion.

The fractional oxidation (FO) was calculated as:

FO = Leutracer oxidation / (Inf 13C-Leu x IEjnf)

For tracer kinetics, it is assumed that the animal does not distinguish between13C- and 12C-AA and it is further assumed that ail leucine tracer infused is in excess and

that a corresponding amount of leucine will be oxidized by the animal (Lobley et al.

2003). Therefore to calculate the WB leucine oxidation (WBLO)

WB-LO = FO x (ILRtracee + Inf ) - Inf

Leucine used for WB protein synthesis was calculated as the différence between

WB leucine ILR and leucine oxidation. The conversion into protein (g/d) was based on

63 g of leucine/kg of synthesized tissue protein (Lobley et al. 1980) and 98 g of

leucine/kg of CP in milk (Swaisgood 1995).

122

5.4.5 Statistical Analyses

Analyses of variance were made using the MIXED procédure of SAS (SAS

Institute Inc., 1999) according to the expérimental plan using the following statistical

model:

yijki =[i + SQUAREj + PERIODj (SQUAREj) + COWk + TREAT, + eijkl

Différences among treatments were compared using orthogonal contrasts

according to the factorial arrangement. Results are expressed as least square means with

the highest standard error of mean (SEM).

5.5 Results

5.5.1 Milk Production

Dry matter intake, milk production and composition reported are the average of

the second week of expérimental periods (Table 5.2). The DMI was not affected by

treatments. There was no interaction between Cas and C3 on milk parameters. Milk

yield increased with Cas treatments (P < 0.01). Milk fat concentration (P - 0.04) and

yield (P = 0.02) were reduced with C3 infusions, while fat yield increased with Cas

infusions (P = 0.001). True protein concentration increased with Cas (P < 0.01) and C3

(P = 0.01), as did true protein yield with Cas (P < 0.001) and C3 infusions (P = 0.02).

Similar results for true protein concentration (data not shown) and yield (see leucine in

milk, Table 5.3) were obtained on the day of WB leucine kinetics.

5.5.2 Leucine Kinetics

The WB ILR (Table 5.3), using arterial MOP IE as représentative of the

precursor pool, increased with Cas treatments (P < 0.001) and tended to increase with

C3 (P = 0.06). With arterial leucine IE selected as precursor pool to estimate WBILR,

only Cas treatments remained signifïcant (P < 0.001). Absolute ILR values were, on

average, 25 % lower with arterial leucine than MOP as precursor, due to the higher IE

of leucine. There was a tendency for an interaction (P = 0.09) between Cas and C3 on

leucine oxidation, with a slight increase when C3 was added to the Ctrl diet, but a

123

decrease by 14 % when C3 was added to the Cas infusion. There was a similar trend (P

= 0.07) for fractional oxidation.

Leucine used for WB protein synthesis increased with Cas treatments (P < 0.01),

both for milk protein (P < 0.001) and non-milk protein synthesis (tissues; P = 0.02).

Leucine used for total protein synthesis tended (P = 0.08) to increase with C3

treatments, but the effect was due to changes in leucine for milk protein (P = 0.06).

Whole body protein synthesis followed the same trend as leucine used for protein

synthesis and averaged 4.1, 4.6, 4.2 and 5.1 kg/d (SEM; 0.16) for Ctrl, Cas, C3 and Cas

+ C3, respectively.

Data for blood bicarbonate IE during the [1-13C] leucine and [NaH13CO3]

infusion and the CER are presented in Table 5.4. The blood 13CC>2 IE during the

NaH13CO3 infusion was reduced with both Cas (P = 0.02) and C3 (P = 0.02)

supplementation. In conséquence, the CER increased with Cas (P < 0.01) and C3 (P <

0.01) treatments. In contrast, the 13CC>2 enrichment measured during [1-13C] leucine

administration increased with Cas infusions (P < 0.01) with a tendency (Cas x C3

interaction, P = 0.08) for a smaller increase when Cas was added to C3 infusion.

5.5.3 Amino Acid and Urea Concentrations

Arterial AA concentrations are presented in Table 5.5. With Cas infusions

arginine, cysteine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine,

proline, tryptophan, tyrosine and valine increased (P < 0.05), while glutamate and

glycine decreased (P < 0.01). During C3 infusion, glutamine and serine (P < 0.01) and

threonine, tryptophan and tyrosine (P < 0.04) increased but isoleucine, leucine and

valine (P < 0.01) decreased, with a similar tendency (P = 0.09) for lysine. There was

also a trend (P < 0.11) for an interaction between Cas and C3 on the concentrations of

the branched-chain AA with a greater increase when Cas was added to the Ctrl diet

compared with Cas+C3 responses. Arterial concentrations of urea increased (P < 0.001)

with Cas infusions but decreased (P = 0.03) with C3 (Table 5.5).

124

5.6 Discussion

In the présent experiment, C3 and Cas infusions had différent impacts on milk

yield and fat yield but both nutrients increased protein concentration and protein yield,

albeit to différent extents. The kinetic data obtained allow some of the WB interactions

on protein turnover to be considered in the light of thèse various modifications of milk

yield and composition.

5.6.1 Milk Production and Composition

The incrément in milk production with Cas treatments (18 %) is at the upper end

of numerous previous reports (Clark et al. 1977; Rulquin 1982; Guinard et al. 1994;

Choung and Chamberlain 1995; Vanhatalo 2003). As a resuit of the improved milk

yield at similar fat concentrations, milk fat yield increased with Cas infusions,

confirming earlier reports (Guinard et al. 1994; Vanhatalo et al. 2003).

Milk protein yield increased as previously observed (e.g. Guinard et al. 1994)

with Cas infusion, with approximately 25 % of the infused casein recovered as milk

protein. The observed incréments in milk and protein yields indicated that, as designed,

the control diet was not optimal to support maximum milk yield. In the présent

experiment Cas and Cas + C3 treatments provided 121 % and 112.5 % of protein

requirements, compared with 97 % for the control diet (INRA, 1989). The marginal

casein recovery (25 %) is in the range of the 30 % reported by INRA (1989) for such a

protein supply. It is also within the range from previous studies (21 % ± 15; see

Hanigan et al. 1998) with casein infusion and similar to that observed for incrément in

metabolisable protein supply from 1922 to 2517 g/d (19 %; Raggio et al. 2004).

Différences in the actual recoveries between studies probably relate to how close the

basai rations were to the requirements of the animal.

Less energy was transferred into milk lactose and fat from C3 infusions

compared with Cas treatments because C3 infusions did not change milk yield and

decreased both milk fat concentration and yield. The milk fat concentration response

was similar to other experiments when the cows received C3 infusions into the rumen,

as summarized by Rigout et al. (2003). This earlier study also reported a modest

125

improvement (0.7 kg/d) in milk yield, with dairy cows receiving 115 % of

recommended protein allowances. A similar numerical increase was observed in the

current experiment when C3 was added to Cas. This occurred despite the fact that, in

the current study the increased on milk yield was seen when the C3 was added to the

Ctrl diet, while in Rigout et al. (2003) the response occurred when C3 was substituted to

a similar amount of energy infused as volatile fatty acids for the control cows.

Protein in milk also increased (6 %) with C3 infusions. This incrément is smaller

than with Cas treatments (20 %) but is in accordance with previous experiments (see

Rigout et al. 2003). In the présent study, there were modest increases in milk protein

yield with C3 infusions in cows receiving protein supply below (97 %) or above (113

%) requirements. This suggests that part of the C3 effect on milk protein yield links to a

change in WB protein metabolism rather than major effects on intestinal AA

availability. This effect may be due to an increase of mammary blood flow favoring AA

uptake as already seen with duodenal glucose infusion (Rulquin et al. 2004). It may also

be due to less AA used as glucose precursors with, in conséquence, more available for

milk protein production.

5.6.2 Whole body leucine kinetics

The WB ILR increased with both Cas and C3 infusions. Whole body ILR is

known to be sensitive to the inflow of nutrients such as différent MP supply in dairy

cows (Lapierre et al. 2002) and at différent intake levels in both growing beef steers

(Lobley et al. 1987; Lapierre et al. 1999; Wessels et al. 1997) and sheep (Liu et al.

1995; Savary-Auzeloux et al. 2003).

In ternis of overall protein dynamics what do thèse changes in WB ILR mean?

For essential AA, such as leucine, ILR is equal to protein synthesis plus oxidation and

also to protein digested plus protein breakdown. So changes in WB ILR must reflect

altérations in at least two of thèse processes. In the current study, the increase in WB

ILR with casein infusion exceeded the additional leucine supply, similar to previous

reports in dairy cows (Lapierre et al. 2002) and growing pigs (Reeds et al. 1980),

indicative of a stimulation in tissue protein metabolism. Thus, despite increased leucine

oxidation, there was an increase in protein synthesis, linked to the improved milk

126

protein yield. Similarly, increases in both WB protein synthesis and oxidation in

response to casein supply hâve been observed in goats (Bequette et al. 1996a) and sheep

(Liu et al. 1995) with the response hypothesized as mediated via hormonal actions

involving insulin and insulin like growth factor-1 (Bequette et al. 2002). However, in a

similar dairy cow study, with the same rate of infusion (762 g/d) of casein, there was no

change in arterial plasma insulin concentrations (Guinard et al. 1994).

The impacts of C3 were weaker, with tendencies to increase WB leucine ILR

and decrease oxidation when infused with Cas. The pattern of urea concentrations

followed that of leucine oxidation, i.e. a large incrément from casein infusion, while C3

was effective in reducing oxidation only when the animais were concomitantly infused

with Cas. To our knowledge, there are no reports on the impact of C3 on WB IRL of

AA in lactating ruminants. However, in sheep, Abdul-Razzaq et al. (1989) observed a

reduced leucine oxidation with C3 infusion, but only in comparison with acétate

supplementation. In the current study, there was a tendency for WB protein synthesis to

be increased by C3, with this trend driven by the significant improvement in milk

protein output. Three mechanisms may contribute to this tendency. First, arterial

concentrations of branched-chain AA were reduced by C3 infusions, as already

observed with C3 and glucose infusions (Clark et al. 1978; Lemosquet et al. 2004). This

réduction in the branched-chain AA is often linked to an increase in insulin (Griinari et

al. 1997; Gross et al. 1990; Mackle et al. 2000) which could allow diversion of more

substrate for milk protein synthesis. Second, C3 effects on milk protein may also be due

to less AA used for glucose synthesis with, in conséquence, more available for milk

protein production. During the C3 infusions, plasma concentration of some glucogenic

AA and two essential AA (threonine and tryptophan) increased as previously observed

(Lemosquet et al. 2004). Threonine is a glucogenic AA (via serine) and may be spared

if other sources of glucose synthesis are available. Substantial quantities of tryptophan

are removed across the gut (Lobley et al. 2003), as is propionate to fuel the energy

needs of this tissue (Seal and Parker 1994). In steers, intra-ruminal infusion of

propionate (1 mol/d) led to increased tryptophan absorption and higher arterial

concentration (Seal and Parker 1996). A third possibility is increased uptake of essential

AA as observed with duodenal glucose infusion in dairy cows (Rulquin et al. 2004), a

127

process driven mainly through increased mammary plasma flow (Bequette et al. 2001;

Vanhatalo et al. 2003; Rulquin et al. 2004).

Overall, although both energy and protein independently altered WB leucine

ILR and milk protein output, there were subtle différences in the mechanisms involved.

Casein exerted a much stronger impact on WB protein synthesis, with 30-45 % of the

incrément directed towards extra milk protein. As total mammary gland protein

synthesis has been reported to average 1.3 times milk protein output (Bequette et al.

1996; Thivierge et al. 2002), not only was mammary gland protein synthesis increased

by casein supply but other tissues must also hâve responded. In contrast, C3 had a

smaller effect on protein synthesis and reduced oxidation of leucine only when added to

Cas and thus helped increased milk protein yield further. This may be through changes

in the hormone milieu, increased energy supply to support mammary gland metabolism

or from sparing of AA use for glucogenic purposes. Some of thèse issues will become

clearer from the companion measurements on glucose and mammary gland metabolism.

Effïciency of nutrient use can be considered from the leucine net balance (Figure

5.1). Any extra AA infused has three main net fates; oxidation, conversion into milk

protein and rétention in the body (mainly as tissue gain). The infusion of casein

increased leucine absorption by 20.9 mmol/h, with part recovered as extra milk protein

(5.1 mmol/h with Cas and 5.3 mmol/h with Cas + C3 infusions). Most of the remainder

was oxidized, 13.9 and 10.4 mmol/h for Cas and Cas + C3 respectively. The slight

increased transfer into milk with Cas + C3 was more than compensated by less

oxidation and, in conséquence, net balance increased from 1.9 to 5.1 mmol/h (obtained

by différence). The actual values, but not the partition, dépend on the assumption that

plasma MOP truly reflects the precursor for both oxidation and protein synthesis.

5.6.3 Carbon Balance

Casein and C3 had différent impacts on carbon effïciency (i.e. conversion of

infused C to milk C). Less of the C3 infused was converted into milk products as milk

yield did not increase and milk fat decreased. Thus, the carbon balance showed that only

5 % (0.08 mol C/h) of infused (1.74 mol C/h) C3 appeared in milk while 77 % (1.4 mol

C/h) appeared as extra CO2 production. The remaining carbon, 18 % (0.31 mol C/ h),

128

may be incorporated into body tissues other than mammary epithelial cells (e.g. liver

fat) or may represent measurement error. In contrast, for casein infusion alone (0.97 mol

C/h), 25 % (0.24 mol C/h) of the carbon intake appeared in milk with 73 % (0.70 mol

C/h) oxidized to CO2, the remaining 2 % may represent measurement error. The

incrémental ratio milk carbon / intake carbon was 0.12 for Cas + C3, therefore a better

C effïciency was obtained from Cas supply alone. Across ail treatments, most of the

infused extra carbon was recovered (90 %) either as CO2 or milk products.

5.7 Conclusion

While both Cas and C3 independently increased WB leucine ILR, protein synthesis and

leucine exported in milk, the magnitude of the responses differed, being greater with

Cas. Furthermore, Cas treatments increased oxidation while C3 decreased leucine

oxidation when infused in the présence of casein. Cas increased the arterial

concentrations of ail the essential AA, whereas C3 elevated concentrations of

glucogenic AA. Together, thèse data suggest that C3 and Cas improve milk protein

output by différent mechanisms, with an additional energy supply as C3 being also

effective when sufficient protein is supplied.

5.8 Acknowledgments

The authors gratefully thank from the UMR PL, INRA, France, Y. Lebreton for

surgeries, P. Lamberton and his team for technical support and animal care during the

experiment and C. Nahuet, L. Finot, N. Huchet, I. Jicquel, and S. Rigault for their help

in laboratory analyses and from the Rowett, A. G. Calder and S. E. Anderson for mass

spectrometry analyses.The authors also wish to acknowledge the financial support of the

INRA, the European Union for the award of Marie Curie Training Site funding to the

Rowett Research Institute, SEERAD and the National Science and Engineering

Research Council of Canada and Agriculture and Agri-Food Canada (Lennoxville

Research Centre Contribution number 874).

129

Table 5. 1. Chemical composition of the feed ingrédients.

Analysisg/kg DMCPNDFADFLigninFatOrganic MatterNDF-NZ

ADF-Ny

NEL, MJ/ kg DM

Grass silage

129536285

1931

91612.74.16.7

Concentrate

156207118

1228

88119.07.37.1

z Neutral détergent fiber insoluble nitrogenyAcid détergent fiber insoluble nitrogen

130

Table 5.2. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on DMI, milk yield andcomposition

DMI, kg/dMilk, kg/d

Fat, g/kg

g/dTrue Protein, g/kg

g/d

Ctrl

19.26.45.

1212

29792

5

93

.6

Treatments

Cas

19.731.445.0

139330.7

958

C3

19.327.1

43.01155

30.8828

Cas + C3

19.632.1

40.61287

32.81043

SEMZ

0.170.711.4029.2

0.4322.0

Cas

0.17<0.01

0.36

<0.001

<0.01O.001

C3

0.560.510.04

0.02

<0.010.02

P y

Casx C3

0.810.740.450.41

0.330.27

zLeast square means presented with pooled SEM, given for n=4; based on the secondweek from the total mammary gland (18 observations; Ctrl = 5, Cas = 4, C3 = 5, Cas +C3 = 4)yProbability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts.

131

Table 5.3. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on whole body (WB)leucine kinetics

Leucine, mmol/hFrom the infusion"WB ILR MOPW

WB ILR LEUW

OxidationWB Protein synthesis, PSMilkv

WB non-milk PSU

Fractional oxidation1

Ctrl

95.571.2

7.287.923.364.90.077

TreatmentCas

20.9119.995.321.298.727.971.20.177

C3 Cas

100.168.3

8.891.324.767.00.087

+ C320.9

126.196.118.2

107.930.078.3

0.140

SEMZ

2.771.841.133.500.853.710.01

Cas

O.001<0.001O.001O.001O.001

0.020O.010

Py

C3

0.060.580.560.080.060.220.33

Cas x C3

0.790.310.090.440.610.440.07

zLeast square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations: Ctrl =5, Cas = 3, C3 = 5, Cas + C3 = 4.yProbability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts."Leucine from the infusion calculated as 748 g * casein purity * digestibility (purity as99 %, digestibility as 90 %).WILR: irréversible loss rate, calculated with the arterial enrichment of 4-methyl 2-oxopentanoate (MOP) or leucine (LEU) as représentative of the precursor pool,vLeucine in milk was based on milk production on the half-day of leucine infusion.uWB-non-milk PS = WB protein synthesis - Leucine in milk.' Fractional oxidation : Leucine Oxidation / WB ILR MOP

132

Table 5.4. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on 13CO2 isotopicenrichment (IE), carbon dioxide entry rate (CER) and carbon balance

Treatment Py

Ctrl Cas C3 Cas+C3 SEMZ Cas C3 CasxC313CO2 IE,during leucine inf, mpe 0.0034 0.0056 0.0034 0.0044 O . 0 K 0 . 0 0 1 0.10 0.0813CO2 IE,during bicarbonate inf, mpe 0.0270 0.0261 0.0260 0.0252 <0.01 0.02 0.02 0.31

CER, mol/h 14.50 15.30 15.50 16.10 0.19 <0.01 <0.01 0.61

Extra Carbons"

Intake Carbons, mmol/h

Extra carbons CER, mmol/h

Extra carbons in milk, mmol/h

% accounted

zLeast square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations; Ctrl =5, Cas = 3, C3 = 5, Cas+C3 = 4.yProbability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts."Extra Carbons was calculated as Cas inf = CasCER - CtrlCER or C3inf= C3CER -CtrlCER and Cas + C3inf = (CasCER - CtrlCER) + (C3CER - CtrlCER)

97070724198

174113429082

2710204933188

133

Table 5.5. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on plasma arterialconcentration of amino acids and urea

Amino Acids, |oMEssential

HistidineIsoleucineLeucineLysineMethioninePhenylalanineThreonineTryptophanValine

Non-essentialAlanineArginineAspartic acidCysteineGlutamineGlutamic acidGlycineProlineSerineTyrosine

Urea, mM

Ctrl

20.678.890.658.028.242.8

112.245.6

139.1

187.259.82.7

81.1248.1

62.9294.0

59.691.642.9

2.9

TreatmentCas

54.1131.3169.6106.334.851.5

111.549.6

247.6

198.484.5

3.0100.8236.9

54.9241.8147.192.362.2

4.4

C3

17.761.771.252.229.241.0

127.350.1

115.9

203.057.42.9

69.9286.9

61.7317.2

59.5112.248.7

2.8

Cas + C3

54.492.8

120.896.137.148.1

134.451.8

179.5

224.183.8

3.195.7

286.054.8

269.6138.2112.669.4

3.9

SEMZ

2.716.699.124.411.302.226.611.37

12.90

11.904.360.376.769.442.1915.906.576.572.50

0.11

Cas

O.001<0.001O.001O.001O.001<0.01

0.580.05

O.001

0.15O.001

0.41<0.01

0.47<0.01<0.01O.001

0.92O.001

O.001

P y

C3

0.66<0.01O.01

0.090.220.240.020.04

<0.01

0.100.680.690.23

<0.010.740.130.520.010.03

0.03

Cas x C3

0.510.100.110.570.580.690.510.340.08

0.630.800.840.610.550.770.860.490.980.75

0.15

zLeast square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations: Ctrl:

5, Cas = 3, C3 = 5, Cas+C3 = 4.yProbability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts;

134

Figure 5.1. Effect of extra leucine intake on leucine oxidation, leucine in milk andleucine in tissues

Extra Leucine Intake20.9 mmol/h

Leucine Tissues1.9 mmol/h Cas5.1 mmol/h Cas+ C3

Leucine Oxidation:13.9 mmol/h Cas10.4 mmol/h Cas + C3

Leucine Milk5.1 mmol/h Cas5.3 mmol/h Cas + C3

Extra leucine intake: leucine intake in Cas and Cas + C3 infusion.Leucine-milk: was calculated as leucine in milk in Cas - Ctrl and (Cas + C3) - C3infusion.Leucine-oxidation: was calculated as leucine oxidation in Cas - Ctrl and (Cas + C3) -C3 infusion.Leucine-Tissues: was calculated as (Leucine intake) - (Leucine milk + Leucineoxidation).

135

5.9 Références

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141

CHAPITRE VI

EFFECT OF CASEIN AND PROPIONATE SUPPLY ON MAMMARY

PROTEIN METABOLISM IN LACTATING DAIRY COWS

Ce Chapitre a été accepté pour publication le 07/04/06 dans la revue "Journal of Dairy

Science" sous la référence de G. Raggio, ' S. Lemosquet, G. E. Lobley, H. Rulquin, and

H. Lapierre. 2006. Effect of casein and propionate supply on mammary protein

metabolism in lactating dairy cows. J. Dairy. Sci.

142

6.1 Résumé

Les effets de la caséine (Cas) et du propionate (C3) sur le métabolisme

mammaire des acides aminés (AA) ont été étudiés sur trois vaches Holstein multipares,

possédant des canules ruminale et duodénale, selon un double carré de Youden avec des

périodes expérimentales de 14 jours. Les traitements de Cas (743 g/jour au duodénum)

et de C3 (1041 g/jour au rumen) ont été étudiés selon un plan factoriel. À chaque

période, au jour 11, de la L[l-13C]Leu (4.3 mmol/h) et au jour 13, du [13C]bicarbonate

de sodium (4.2 mmol/h) ont été perfusés dans une veine jugulaire. Des prélèvements

sanguins carotidiens et de la veine mammaire ont été effectués pour déterminer la

cinétique de la leucine (Leu) et les prélèvements mammaires nets des AA. Les

traitements de Cas et de C3 ont augmenté le taux proteique du lait et la production de

matières protéiques. Les traitements de Cas ont induit une réponse générale du

métabolisme proteique mammaire, avec une augmentation du prélèvement net

mammaire de la Leu (30 %), du ratio prélèvement net : Leu dans les protéines du lait (8

%), de la synthèse de protéines (9 %), de la production de protéines du lait (21 %) et de

l'oxydation (259 %). Avec les traitements de C3, il y a une tendance à augmenter les

protéines du lait (7 %). Lorsque le C3 est combiné avec la Cas, la Leu utilisée pour la

synthèse de protéines augmente moins que lorsque le C3 est ajouté seulement à la ration

témoin. Pour tous les traitements, la totalité des prélèvements mammaires nets de la Leu

a été utilisée pour la production de protéines du lait et l'oxydation, sans reste non

expliqué par ces deux voies métaboliques. Par conséquent il n'y a pas besoin

d'impliquer un prélèvement ou une production de peptides pour équilibrer le bilan de

prélèvement net mammaire de la Leu. Le prélèvement net des acides aminés du groupe

1 a augmenté avec les deux types de nutriments perfusés et s'équilibrait avec la quantité

d'AA sécrétés dans les protéines du lait. Pour les AA du groupe 2, le prélèvement net

mammaire était supérieur à la quantité retrouvée dans le lait, quel que soit le traitement.

Cependant ce phénomène était plus marqué avec les traitements Cas qu'avec les

traitements C3. Pour les AA du groupe 3, leur prélèvement net mammaire augmente

avec les traitements contenant du C3. Ceci suggère des mécanismes différents pour

augmenter la production de protéines du lait avec des apports protéiques (Cas) vs. des

apports énergétiques (C3).

143

Mots-clés: Caséine, propionate, glande mammaire, métabolisme de protéines.

6.2 Abstract

The effects of Casein (Cas) and propionate (C3) on mammary amino acid (AA)

metabolism were determined in three multiparous Holstein cows, fîtted with both

duodénum and rumen cannulas, used in a replicated Youden square with 14 d-periods.

Cas (743 g/din the duodénum) and C3 (1041 g/din the rumen) infusions were tested in

a factorial arrangement. For each period, L-[l-13C]leucine (d 11) and NaH[13C]C>3 (d 13)

were infused into a jugular vein and blood samples were taken from a carotid artery and

a mammary vein to détermine leucine (Leu) kinetics and net uptake of AA. Both Cas

and C3 treatments separately increased milk protein concentration and yield. With Cas

there was a gênerai response in mammary protein metabolism, involving increases in

Leu net uptake (30 %), the uptake:output ratio (8 %), protein synthesis (9 %), sécrétion

in milk protein (21 %) and oxidation (259 %). In contrast, C3 treatments only tended to

increase Leu in milk protein (7 %) and, when in combination with Cas, to reduce Leu

used for protein synthesis (6 %). Across ail treatments, most Leu uptake by the

mammary gland was accounted as Leu in milk or oxidized and therefore the Leu

balance was achieved without involvement of either net peptide utilization or

production. Mammary uptake of Group 1 AA increased to match milk output with ail

infusions. In contrast, mammary uptake of Group 2 AA exceeded output to a greater

extent with Cas compared with C3 infusion, while the incrément in uptake of Group 3

AA was higher with C3 than with Cas treatments. Overall, thèse data suggest that

différent mechanisms operate to improve milk protein production when either protein or

energy are infused.

Key words: Casein, propionate, mammary gland, protein metabolism.

144

6.3 Introduction

In dairy cows during mid-lactation, milk protein yield can be manipulated by

varying either energy or protein intakes (MacRae et al., 2000). In mechanistic terms,

however, changes in either energy or protein supply hâve been shown to exert différent

effects on whole body protein metabolism, as estimated through leucine kinetics

(Raggio et al., 2006). For example, casein infusion increased both whole body protein

synthesis and leucine exported in milk to a greater extent than did propionate (C3).

Furthermore, while leucine oxidation increased with casein treatment this oxidation was

lowered when propionate was added in combination with casein. What was unclear,

however, is whether thèse différent responses at the whole body level reflect altération

in mammary gland (MG) metabolism and the mechanisms that operate to regulate milk

protein yield.

In terms of understanding responses in mammary protein metabolism to changes

in either protein or energy supply, more is known about the impact of AA

supplementation and deficiencies than altération in either glucose or propionate

provision. For example, for dairy cows in late lactation a high protein intake increased

MG leucine irréversible loss rate (ILR) by 5 %, supporting a relatively small increase (6

%) in protein synthesis but with most of the additional leucine uptake catabolized by the

MG (Bequette et al., 1996a). In dairy goats, infusion of an AA mixture devoid of

leucine resulted in stimulation of mammary protein synthesis, with a concomitant

réduction of leucine oxidation to support the increased milk protein yield (Bequette et

al., 1996b). Such data demonstrate that, for leucine at least, the MG can adjust both

uptake and utilization mechanisms to improve milk protein output. Therefore, the

normal situation where leucine MG uptake is in excess of output in milk, usually plus or

minus 30 % (e.g. Guinard and Rulquin, 1994b; Raggio et al., 2004; Rulquin and

Pisulewski, 2000) should be seen as a fonction of availability from the diet and not a

fixed need by the MG (Bequette et al., 1996b). To date, however, no studies hâve

related the impact of energy supply alone, either in the form of glucose or C3, on

mammary protein metabolism in dairy cows. The potential impact of energy supply on

MG metabolism has been raised indirectly during studies involving hyper-insulinemic,

145

euglycemic clamps (Bequette et al., 2002). Although such experiments involved non-

physiological chronic élévation of plasma insulin concentrations, they hâve provoked

intriguing questions about the separate and combined rôles of energy and protein on

metabolism within the MG but, as yet, thèse hâve not been clearly separated and

identified.

Also, few data are available on responses in net mammary uptake of AA and

output as milk protein in response to increased energy supply and thèse hâve provided

equivocal information. For example, despite a moderate incrément in protein yield,

Huhtanen et al. (2002) were unable to detect any effect of glucose infusion (300 g/d) on

mammary net uptake of AA. Furthermore, at higher inputs of glucose (2398 g/d, as an

iso-calorie substitute for an infused VFA mixture) milk protein yield actually decreased

even though mammary uptake of EAA increased (Rulquin et al., 2004). This latter

observation suggests that thèse EAA might undergo metabolic fates within the MG

other than use for protein synthesis, e.g. they may be converted to peptides and returned

to the plasma as implied from other expérimental conditions (Guinard and Rulquin,

1994a; Rulquin et al., 2004). The form of energy supplied may also be critical in any

response as although glucose and C3 infusion both increased milk and milk protein

yield, differential effects were noted on milk fat synthesis (Rigout et al., 2003).

However, in studies with increases in either protein or energy supply there hâve

been some common responses, most notably the observation that the net uptake to

output ratio for certain EAA, notably the branched-chain AA and lysine, was also

increased (Bequette et al., 1996a; Guinard and Rulquin, 1994a; Metcalf et al., 1991;

Raggio et al., 2004; Rulquin et al., 2004; Vanhatalo et al., 2003b). This raises the

important question, what are the fates of this excess AA uptake? Some reports suggest

that thèse may be predominantly oxidized (Bequette et al., 1996a) and/or used to

provide N for synthesis of other AA (Lapierre et al., 2005). It has also been proposed

that the MG, under certain conditions, may release the excess AA taken up as peptides

into the mammary vein (Guinard and Rulquin, 1994a; Rulquin et al, 2004). Thèse

issues need to be resolved in order to better understand the various regulatory

146

mechanisms within the MG involved in the response to separate or combined altérations

in supply of nutrients.

Therefore, the objectives of this study were: 1) to differentiate how increased

milk protein sécrétion in response to change in energy and protein supply relates to

changes in MG protein metabolism and net uptake of AA and 2) quantify, for leucine,

the metabolic fate of that taken up in excess relative to milk output. Thèse objectives

were achieved with a combination of veno-arterio techniques coupled with infusions of

labelled (stable isotope) leucine and bicarbonate. Whole body protein kinetics from this

study hâve been reported previously (Raggio et al., 2006).

6.4 Materials and Methods

6.4.1 Animais and Treatments

Three multiparous Holstein cows, averaging 615 ± 24 kg BW and 65 ± 4 DIM at

the beginning of the study, were fitted with both a proximal T-shaped duodenal cannula,

placed 10 to 15 cm from the pylorus, and a ruminai cannula (Hurtaud et al., 1998)

before calving. Approximately 20 days after calving, cows were surgically prepared

with an ultrasonic flow probe (Transonic type A Systems Inc., Ithaca, NY) implanted

around the right external pudic artery as previously described (Rigout et al., 2002) and

two permanent cathéters were placed in the right carotid artery and in the right

subcutaneous abdominal vein (description of cathéters: Guinard et al., 1994, Raggio et

al., 2006). The right carotid artery was also raised to a subcutaneous position to provide

an alternative access to arterial blood if necessary. During the experiment, problems

were encountered with two cathéters: one arterial cathéter failed and a replacement

cathéter was inserted in the left carotid. In another cow the subcutaneous abdominal

vein cathéter was non functional and a temporary cathéters was inserted (for 3 days)

during the second week of each period. In addition, one ultrasonic flow probe failed

after the second period. For the tracer infusions, a cathéter was inserted in the left

jugular vein for the whole study. Cathéter maintenance was performed as described

previously (Guinard et al., 1994). The surgical préparations were reviewed and

approved by the Animal Care Committee of the French Ministry of Agriculture.

147

The same basai diet (Raggio et al., 2006) was fed during the whole study,

balanced to provide limited intestinal glucose (Rigout et al., 2003). The basai diet was

estimated to supply 119 Mj/d NEL and 1624 g/d metabolizable protein (NRC, 2001), or

1593 g/d of protein truly digested in the small intestine and 124 MJ/d NEL, (INRA,

1989). The quantity of wet feed offered was adjusted every day to ensure the same

delivery of DM on each expérimental day, based on an estimation of DM content of the

silage. The concentrate was supplied every 3h in equal portions from automatic feeders,

starting at 0715h. Grass silage was fed three times per day: 25 % at 0715h, 25 % at

1315h, 50 % between 1715h and 1915h, except during the kinetic days, when the silage

was fed five times per day: 12.5 % at 0715h, 1015h, 1315h and 1615h and then 50 %

at 1915h. Throughout the whole study, access to the diet was limited to lh after the

concentrate distribution times. Cows had free access to water and were housed in

individual tie stalls. Every day before 0715h, any feed refusais were collected, weighed

and sampled for future analyses.

Superimposed on the basai diet, infusion of two nutrients were tested in a 2 X 2

factorial arrangement: duodenal infusion of calcium caseinate (743 + 7 g/d: 687 g/d

protein truly digested in the small intestine (PDI) and estimated to provide 7.9 MJ/d of

NEL; Guinard et al., 1994) and/or ruminai infusions of propionic acid (1042 + 8 g/d,

estimated to provide 15.6 MJ/d of NEL; INRA 1989). Therefore, treatments were: 1)

control (Ctrl), 2) casein (Cas) 3) propionic acid (C3) and 4) the casein and propionic

acid combined (Cas+C3). Infusion of casein was the highest dose used by Guinard and

Rulquin (1994a), and increased the PDI balance from 97 % for the Crtl cows to an

average of 120 % for the cows receiving casein infusions. To optimize any effect, C3

was infused at the dose that yielded the maximal effect on milk protein observed by

Rigout et al. (2003). Each treatment period lasted 14 d, and the first two days of each

period included transition for the infusions (the cows received on day 1, 0.33, and on

day 2, 0.66 of the total subséquent infusion). Préparation of the infusions is detailed in

chapter V (Raggio et al., 2006).

148

6.4.2 Sampling and Laboratory Analyses

Cows were milked twice daily (0630 and 1830 h) with yield recorded at each

milking and assayed for fat and true protein composition by infrared analysis

(Milkoscan, Foss Electric, Hillerod Denmark). During the second week of the

expérimental period, cows were milked for each half udder separately and milk samples

(each half udder) were assayed for fat and true protein composition by infrared analysis

(Milkoscan, Foss Electric, Hillerad Denmark). Samples of the grass silage and

concentrate mixture were taken every day. Feed samples for analyses were stored at -

20°C until analysis, when they were pooled by period.

On day 11 of each expérimental period, leucine kinetics were determined with

an infusion of L[l-13C]leucine (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA. 99

atom percent excess (ape), at 4.3 mmol/h: 14.20 mg/ml dissolved in stérile 0.9 % NaCl;

0.66 g solution/min) for 7.5 h (starting at lOOOh, 3.5h after the morning milking),

preceded by a priming dose of 4.3 mmol, équivalent to an hour of infusion (Wolfe,

1984).

Cows were made to stand for at least 15 min before blood sampling. Hourly

samples were taken from the carotid artery and mammary vein starting 3 h after

initiation of the infusion (1300, 1400, 1500, 1600 and 1700h) and were analyzed to

détermine the concentration and the isotopic enrichment (IE) of leucine, 4-methyl 2-

oxopentanoate (MOP) and CO2. In addition, samples for amino acid (AA) and urea

concentrations were taken at 0700, 0900, 1100, 1300, 1500 and 1700h.

On day 13, a mixture (in stérile 0.9 % NaCl) of [I3C]bicarbonate (Cambridge

Isotope Laboratories, Andover, USA. 99 ape; 4.7 mg/ml) and [6.6 2H2]glucose

(Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA. 99 ape; 60 mg/ml) was infused. The

rate of [13C]bicarbonate infusion was 4.2 mmol/h (1.26 g solution/min) for 4 h between

1200 to 1600h, preceded by a priming dose équivalent to 3.2 mmol. Glucose kinetics

will be described in a separate paper. Samples were taken from the carotid artery and

mammary vein starting 1.75h after the initiation of the infusion (1345, 1430, 1515 and

1600h) and were analyzed to détermine the concentration and the isotopic enrichment

149

(IE) of CO2. On both days, samples were also collected prior to the infusions to

détermine natural abundance of leucine and MOP (2 samples) and CO2 (3 samples).

Blood samples for AA concentrations were collected in heparinized syringes and

kept on ice. Plasma was prepared by centrifugation (2000 x g at 4°C for 15 min), 0.7 g

plasma was weighed, then 0.4 g of an internai standard solution was added and the

mixture was stored at -80°C. The internai standard solution was prepared at the

following concentrations: 501 nmol/g [5-15N]glutamine, 252 nmol/g [indole-15N]tryptophan, 260 nmol/g [l-13C]cysteine, 8.8 umol/g [15N2]urea, plus a U-13C algal

hydrolysate. This follows the methodology for détermination of AA concentration by

isotope dilution as previously described (Calder et al., 1999).

For MOP and [l-13C]leucine IE (expressed as molar percent excess, mpe), 0.7 g

plasma was weighed and 0.3 g of an oxohexanoic acid solution (33.3 nmol/g) added,

and the mixture was stored at -80°C until analysis. Déterminations of MOP and leucine

IE were as described by Calder and Smith (1988). For CO2 IE, triplicate 1 ml of blood

samples were injected into evacuated Vacutainers containing 1 ml of lactic acid,

immediately mixed and kept at room température until analysis was performed.

Détermination of IE was as previously described (Lobley et al., 2003) based on Read et

al. (1984).

6.4.3 Calculations

In addition to the blood flow probe, mammary plasma flow (PF) was estimated

according to the Fick pnnciple, using phenylalanine and tyrosine as internai markers

(Cant et al., 1993), with an allowance for a 3.56 % contribution from blood-derived

proteins. For this paper, the Fick principle was adopted to estimate plasma flow and

calculate mammary AA fluxes because the probe was not functional for one cow. For

the two functional cows, the probe measurements were 24 % lower than mammary flow

estimated with the Fick principle. Similar underestimates with ultrasound probes hâve

been observed previously when compared either with the Fick principle (Thivierge et

al., 2002) or with p-aminohippurate (Bequette et al., 1999). Nevertheless, there was no

effect of treatment on the uptake to output ratio of phenylalanine and tyrosine when the

150

uptake was estimated with the plasma flow from the probe for the two functional cows.

Sécrétions of AA into milk were calculated using published AA concentration in milk

(Swaisgood et al., 1993) except for leucine, phenylalanine and tyrosine for which milk

samples were acid-hydrolysed with 6 N phenol-HCl for 18 h at 110°C (AOAC, 2000)

and AA concentrations of the hydrolysates were determined by the isotope dilution

method (Calder et al., 1999). Concentrations leucine, phenylalanine and tyrosine

averaged 98, 49 and 56 mg of per g of crude protein, respectively.

For the following équations, infusion rates and fluxes of leucine, MOP or CO2

are in mmol/h, concentration of leucine, MOP are in uM, concentration of CO2 in mM,

IE of 13C leucine, 13C MOP and 13CO2) in mpe, with m referring to the mammary vein,

and a to the artery.

Mammary gland leucine kinetics were studied using a three compartment model

with leucine, CO2 and MOP as previously described by Bequette et al. (2002), but with

the IE of MOP from the mammary vein taken as représentative of the IE of the

precursorpool.

The MG irréversible loss rate (ILR) of leucine was calculated as follows:

MG Leu ILR = (([Leu-a] x IELeu-a - [Leu-m] x IELeu.OT) x PF ) / (IEMOp-w))

CorOx

MOP converted to Leucine was calculated as:

MG MOP to Leu = (([MOP-a] x IEMOp-a - [MOP-w] x IEMop-m) x PF ) / (IEMOp-

,«))

where [Leu] and [MOP] refer to concentrations of leucine and MOP

respectively, IE to their isotopic enrichment and PF to plasma flow. The factor CorOx

corrects for the extra oxidation in the MG due to the infusion of the tracer and is

described below.

151

Blood flow was used to calculate MG 13CO2 fluxes and was estimated as

follows:

Blood flow (BF) = PF / (1- Hematocrit-a)

The MG 13CO2 flow was calculated as follows:

MG13CO2 = ([CO2-/w] x IE13CO2-w - [CO2-fl] x IE13CO2-a ) x BF

To correct for 13CO2 séquestration (Sq) that occurred during the infusion of 13C

leucine, 13CO2 Sq was estimated during the bicarbonate infusion as the arterial inflow of13CO2 not recovered in mammary vein. During period 6, Sq was not determined due to

technical problems with the measurements of IE of 13CO2 during bicarbonate infusion.

We used an average of Sq for each cow (1.4 %, 1.2 % and 4.8 % respectively) because

no significant différences were observed between treatments.

Therefore, the corrected mammary 13CC>2 flux was calculated as follows:

MG 13CO2 corrected = (Arterial inflow of 13CO2 x Sq) + MG 13CO2

Oxidation of leucine across the MG was calculated as:

MG Leu Ox = MG 13CO2 corrected / IEMOp-m - CorOx

Tracer kinetics assumes the animal does not distinguish between 13C-AA and12C-AA. In addition, at the whole body level, it was assumed that the équivalent of

infused was in excess, and thus a corresponding amount of leucine was oxidized by the

animal (Raggio et al., 2006). Accordingly, it was assumed that mammary leucine

oxidation measured during the tracer infusion included a proportion of this extra-

oxidation, calculated to be in proportion to measured MG oxidation as a fraction of

measured whole body oxidation (before any correction was made to account for the

tracer infusion) multiplied by the infusion rate. This factor (CorOx) was subtracted from

measured leucine oxidation across the MG as well as ILR and net flux, which should

152

hâve both been increased by this amount during the tracer infusion. Fractional oxidation

was calculated as corrected oxidation divided by ILR.

Leucine used for MG protein synthesis was calculated as the différence between

MG Leu ILR, including any conversion to or from MOP, and MG oxidation. Once

leucine used for milk protein sécrétion was removed from leucine used for protein

synthesis, the remainder was converted into kg of constitutive protein applying the

factor 63 g leucine per kg of constitutive protein (Lobley et al., 1980).

Net leucine uptake was calculated using the 6 samples collected every other

hour, because milk protein yield over the 12 hours has been used to calculate the plasma

flow with the Fick principle. Measurements made during the infusion of the tracer were

corrected for CorOx.

"Residual" leucine was calculated to be the amount of leucine taken up by the

MG plus the amount of MOP converted into leucine minus oxidation and sécrétion as

milk protein, and would represent any net mammary leucine inflow having not been

accounted for in the différent outflows:

Residual = Net Leu uptake + MOP to Leu - MG Leu Ox - Leu in milk

If significantly différent from zéro this "residual" would need to be ascribed

another metabolic fate (e.g. release in peptide form into the mammary vein).

Net mammary uptake of other AA was calculated using the 6 samples collected

every other hour as follows:

net uptake = ([AA-a] - [AA-m] ) x PF

where [AA] refers to concentrations of individual AA.

153

6.4.4 Expérimental Design and Statistical Analyses

The design of the experiment was two incomplète 4 x 3 Youden squares with 3

periods each for a total of 18 observations (Ctrl: n = 5; Cas: n = 4; C3: n = 5; Cas + C3:

n = 4). During the third period, one cow had problem with her cathéter during Cas

treatment, as a conséquence n = 3 for Cas for the blood measurements.

Analyses of variance were made using the MIXED procédure of SAS (SAS

Institute Inc., 1999) according to the following statistical model:

ki =\i + SQUARE; + PERIODj (SQUAREj) + COWk + TREAT; + e iikl

Différences among treatments were compared using orthogonal contrasts

according to the factorial arrangement. Results are expressed as least square means with

the highest standard error of mean (SEM).

6.5 Results

Milk production and composition for the last week of the expérimental periods

were presented in a previous paper (Raggio et al., 2006). In the présent paper, milk

production and composition were based on the right half udder at the evening milking

(12h) of the leucine infusion day (Table 6.1). Milk yield increased with Cas treatments

(P < 0.001). True protein concentration and yield both increased with Cas (P = 0.04; P

< 0.01, respectivaly) and C3 (P = 0.03; P = 0.06 respectively) infusion. Milk fat

concentration was reduced with Cas infusion (P = 0.07), as conséquence of increased

milk yield, as fat yield was not affected by Cas infusion.

6.5.1 Mammary Leucine Kinetics

The mammary plasma flow decreased by an average of 16 % (P = 0.07) when

Cas was infused and increased by 32 % (P = 0.02) when C3 was supplied (Table 6.2).

The MG leucine kinetics are presented in Table 6.2. The net uptake of leucine and MOP

increased with Cas infusion (P < 0.01) but did not show any effect when C3 was

infused. The MG Leu ILR was increased by Cas infusion (P < 0.001) and tended to

increase with C3 (P = 0.09). In addition, there was a Cas x C3 interaction (P < 0.01),

154

because the response with combined treatments was smaller than the sum of each

nutrient supplied separately. MOP converted to leucine (MOP to Leu) and mammary

oxidation of leucme (Leu Ox) increased when Cas was supplied (P = 0.04; P < 0.001

respectively). The mammary fractional oxidation of leucine increased {P < 0.001) with

Cas supply. Leucine used for protein synthesis (Leu PS) increased with Cas (P = 0.02)

but, as with ILR, there was a tendency for Cas x C3 interaction (P = 0.09). Leucine in

milk protein (Leu Milk) increased with Cas (P < 0.001) and tended to increase with C3

(P = 0.06). In addition, différences were observed for Leu derived from protein

dégradation (estimated as Leu PS minus Leu Milk), with an increase with Cas alone

compared with Ctrl but a decrease with Cas and C3 combined compared with C3

(interaction Cas x C3, P < 0.001).

6.5.2 Amino Acid Arterio-Venous Concentration Différences

The AA arterio-venous (AV) concentration différences are presented in Table

6.3. When Cas was supplied, the AV différence increased for ail AA (P < 0.05), except

for aspartate and glutamate, where there was no effect, and for alanine, where there was

a decrease (P = 0.03). In contrast, during C3 infusions AV différences decreased for ail

AA (P < 0.06), except aspartate, cysteine, glutamate, serine and threonine which were

not affected (P > 0.10) and alanine where there was an increase (P < 0.01). There was

also a trend (P < 0.10) for an interaction with the branched-chain (leucine, isoleucine

and valine) AA, with a larger decrease with C3 and Cas were infused together compared

with Cas than when comparing C3 with Ctrl.

6.5.3 Amino Acid Uptake and Uptake : Output Ratio

The MG uptake data are presented in Table 6.4. when Cas infusion the uptake

increased (P < 0.01) for ail the essential AA as well as for glutamine, glycine, and

proline, while uptakes were reduced for alanine (P < 0.001) and glutamate (P = 0.02).

With C3 supply, uptake of alanine, glutamate and proline, as well as methionine,

phenylalanine and threonine increased (P < 0.05). There was also a Cas x C3 interaction

(P = 0.02) for alanine uptake, with a larger decrease when Cas was added to the Ctrl

diet than when Cas was added to C3.

155

The AA uptake: output ratios are présentée in Table 6.5. If the ratio exceeds

unity, then the mammary uptake was more than sufficient to account for milk protein

sécrétion; if smaller than unity then there was a need for either synthesis de novo in the

gland or uptake in peptide forai. Uptake of EAA was sufficient to account for milk

output, except for methionine when Cas was infused. Uptake of the NEAA relative to

milk output varied greatly between AA, from a large excess for arginine to ratios as low

as 0.14 for aspartate. With Cas treatments, the uptake:output ratios decreased (P <

0.001) for alanine, glutamate and glycine with a tendency (P = 0.09) for metionine,

while they increased for proline (P < 0.001), with a tendency to increase (P < 0.08) for

isoleucine and leucine. However, when C3 was supplied, the ratio for alanine increased

(P < 0.001) and tended to either increase (P = 0.07) for glutamate or decrease (P = 0.08)

for glutamine.

6.5.4 Nitrogen Balance Across the Mammary Gland

Nitrogen balances are presented in Table 6.6 This calculation is based on

transfers for the protein bound AA-N, except for asparagine, which was not measured.

Total N uptake increased (P < 0.01) when Cas was supplied (P < 0.01), with a tendency

to increase when C3 was infused (P = 0.07). Nitrogen uptake as EAA (EAA-N)

increased (P < 0.001) with Cas but C3 had no effect. Nitrogen uptake as NEAA

(NEAA-N) was increased by both Cas (P = 0.05) and C3 (P = 0.03). Total-N, EAA-N

and NEAA-N in milk were ail increased for Cas (< 0.001), and tended to increase for

C3 (P = 0.07). In tenus of N balances across the MG, the NEAA-N déficit increased (P

= 0.05) when Cas was infused.

156

6.6 Discussion

There were two objectives within this study. The first was to examine if protein

and energy, in the form of propionate, had similar mechanistic effects on protein and

AA metabolism within the MG to increase milk protein yield. The second issue was to

ascertain the fate of excess AA taken up by the MG and help résolve the issue whether

the MG can produce net sécrétion of peptides or whether oxidative and transamination

pathways are the major routes of removal. In both cases, clear answers to thèse

questions were obtained.

6.6.1 Protein Metabolism

6.6.1.1 Leucine Net Uptake

There were obvious différences in how net uptake of leucine and sécrétion as

milk were affected by supply of Cas and C3. With Cas treatments, the incrément in net

uptake of leucine was greater than the increase in milk protein yield, with only 59 % of

the incrément in net uptake transferred to milk. This supports earlier observations that

the différence between mammary net uptake of leucine and sécrétion in milk protein

becomes greater with increased protein supply (e.g. in terms of the uptake:output ratio

this increased from 1.04 to 1.87 with casein infusion, Guinard and Rulquin, 1994a; from

1.05 to 1.66 with leucine infusion, Rulquin and Pisulewski, 2000; and from 1.10 to 1.40

with a high RUP protein supplément, Raggio et al., 2004). This indicates that

metabolic pathways other than milk protein synthesis are stimulated by protein supply

and thèse can be determined using tracer infusion, as discussed below.

In contrast, when C3 was infused, the non-significant increase in leucine net

uptake (4.4 %) was less than the extra leucine secreted in milk protein. In conséquence

the apparent efficiency of utilization of the extra uptake was 130 %. Similarly,

Vanhatalo et al. (2003a) did not observe an increase in the uptake of leucine, although

milk protein yield was improved by infusion of glucose. Together, thèse data suggest

that when increased energy supply élevâtes milk protein yield, without any concomitant

incrément in protein supply, the MG uses its leucine uptake more efficiently towards

milk protein sécrétion. Energy does not always exert a positive effect, however, because

157

when a very high dose of glucose was infused, as an energy substitution, the uptake to

output ratio of leucine increased, due to a combined decrease in milk protein yield

coupled with increased leucine net uptake (Rulquin et al., 2004).

6.6.1.2 Leucine Kinetics

The current kinetic data are quantified assuming the enrichment of MOP in the

mammary venous plasma is similar to that of the precursor intracellular pool. As MOP

is formed intracellularly from leucine deamination, MOP release into the venous

drainage ideally should reflect intracellular enrichment of leucine. In practice, only part

of the venous metabolite is derived from MG intracellular outflow while the rest arises

from bypass arterial supply (Biolo et al., 1995), and so the IE of venous MOP will be

lower than MOP or Leu in the cells of the MG. Indeed, the intracellular leucine

enrichment will lie between those of MOP and leucine in the venous plasma.

Consequently, use of venous MOP enrichment as precursor will slightly over-estimate

the true rates of protein synthesis but still allows comparison between treatments.

Compared with Crtl, Cas alone increased MG ILR by 23 %, confïrming the

gênerai response observed previously by Bequette et al. (1996a) in dairy cows with

increased dietary protein supply. For the current cows the dynamic increase (5.8

mmol/h) was partitioned approximately equally between oxidation and protein

synthesis, of which 80 % went to exported proteins (milk), and the rest to constitutive

sources.

In contrast, with C3 infusions ail of the ILR incrément (0.96 mmol/h) was

diverted to protein synthesis with a minor effect on oxidation (0.04 mmol/h). This

indicates that the MG adjusts differently to increased protein versus energy supply.

While energy supply is known to impact on plasma insulin concentrations, thèse were

unaltered in the current study (unpublished data) and thus other mechanisms must

operate. As energy appears to induce différent responses than protein and thus the

possibility arises of additive, or even synergistic, effects when both nutrients are

supplied together. In practice, however, the interaction between Cas and C3 on protein

synthesis indicated that co-supply of Cas and C3 was not completely additive.

158

In this study, MG ILR accounted for 0.38 to 0.43 of whole body ILR, as

previously reported in dairy cows (37-44 %, Bequette et al., 1996a; 41-43 %: Thivierge

et al., 2002), confirming the major contribution of the MG to whole body metabolism.

The MG also played a major rôle in whole body leucine oxidation, accounting for 40-50

% across the range of treatments studied. Certainly the gland can remove close to half of

any excess supply and, therefore, in the lactating animal may be more important than

the other ruminant tissues known to be involved in leucine catabolism (Goodwin et al.,

1987). Estimated synthesis of constitutive protein by the MG averaged 980 g/d,

indicating the high turnover rate of constitutive protein in the MG.

6.6.1.3 Net Uptake of Amino Acids

The use of précise analytical techniques to measure AA concentrations in the

current study also allows examination of how Cas and C3 modified the net mammary

uptake of individual AA to support the increased milk protein yield generated.

6.6.1.3.1 Effect of Casein

Treatment effects on arterial AA concentrations hâve already been discussed in a

companion paper (Raggio et al., 2006). Across the MG the AV différences increased for

almost ail essential AA with Cas infusions, as previously reported with infusion of

casein ranging from 177 to 762 g/d (Clark et al., 1977; Guinard and Rulquin, 1994a;

Vanhatalo et al., 2003b). In thèse studies net uptake, calculated from reported AV

différences and plasma flows, increased with Cas infusions. Despite the casein-induced

decrease in plasma flow in the current experiment, Cas treatments also increased net

uptake of ail EAA.

Mepham (1982) divided AA into three groups, each having a différent

metabolism within the MG. Group 1 includes histidine, methionine, phenylalanine &

tyrosine, threonine and tryptophan, and for thèse AA their stoichiometric transfer yields

uptake:output ratios close to unity (e.g. Guinard and Rulquin, 1994a: 1.14; Miettinen et

al., 1997: 1.02; Raggio et al., 2004: 0.95). The différences between studies might be due

to différent energy and/or protein status of the animais as well as différent

méthodologies, including blood flow measurement (probe, Fick principle, p-

159

aminohippurate), AA analyses (number of samples taken, use of individual or pooled

samples, analysis technique), frequency of blood sampling relative to feeding protocols.

Due to uncertainties for Thr to belong to this group (Lapierre et al., 2005), Thr was not

included in Group 1 calculations. In line with the concept of Mepham, MG uptake of

Group 1 A A increased to mamtain at unity (0.99) the uptake :output ratio as milk protein

production changed. This supports previous reports where, with additional protein

supply, the udder extracted thèse AA in ratios equal to their sécrétion in milk protein

(Guinard and Rulquin, 1994a; Raggio et al., 2004; Vanhatalo et al., 2003a).

The second group of Mepham (1982) included EAA usually taken up in excess

by the MG relative to milk output, i.e. isoleucine, leucine and valine (the branched-

chain AA) and lysine (Clark et al., 1977; Guinard and Rulquin, 1994a; Raggio et al.,

2004). Arginine was not considered an EAA and therefore not included in Group 2 for

calculations. Casein infusions resulted in an increased uptake:output ratio for the Group

2 AA from 1.28 to 1.34 comparable to other findings e.g. Clark et al. (1977) from 1.41

to 1.53, Guinard and Rulquin (1994a) from 1.21 to 1.64, Vanhatalo et al. (2003a) from

1.57 to 1.61 and Vanhatalo et al. (2003b) from 1.33 to 1.50.

For many of the AA of the third group, which comprises the NEAA except

tyrosine, uptake was far less than output under basai conditions (Table 5), except for

glutamine and alanine (close to balance) and glycine (net release). For arginine (hère

considered as a non-essential AA) uptake was consistently in excess of output. Casein

infusions increased net uptakes of glutamine, glycine and proline, while alanine and

glutamate net uptake decreased. Vanhatalo et al. (2003a) also observed a decrease of

glutamate uptake with 350 g of Cas but no change in alanine uptake. Overall, for Group

3 AA, net uptake increased less than the output in milk in response to Cas infusions,

leading to a greater déficit in uptake relative to output (Table 6).

Therefore, the MG responded to the increased demand for NEAA for milk

protein synthesis with Cas supply by increasing the uptake of the EAA of group 2 to a

greater extent than the net uptake of the NEAA per se. Based on transfers of AA présent

in milk protein, thèse increases were enough to achieve a close overall balance for N

transactions in the MG. Why the gland increases uptake of Group 2 AA to restore

160

balance instead of extracting more NEAA from the blood during Cas supplementation

remains a mystery. Obviously this is not due to lack of NEAA as both NEAA and EAA

were supplied through infusion of casein. In addition, it has been shown, using tracer

kinetics, that for certain NEAA where the net uptake to output ratios were less than

unity across the caprine MG there was isotopic dilution between the artery and vein

(Bequette et al., 1997). This means that although the MG only extracted a proportion of

the NEAA needed to support milk protein output, there was sufficient synthesis de novo

of thèse within the MG to create an excess that was then released into the mammary

vein. This may suggest that synthesis de novo is an important process within the MG

when there is a gênerai excess of AA. Whatever the reason, the metabolism of the MG

adjusts to produce more milk protein from extra protein supply by using additional N

from those EAA extracted in excess to synthesize NEAA more than increasing, on a net

basis, extraction of NEAA.

6.6.1.3.2 Effect of propionate

When C3 was infused there were différences in how the MG achieves N

balance. Hère, plasma flow increased, regardless of whether determined by the Fick

principle (Clark et al., 1977; Huhtanen et al, 2002; Vanhatalo et al., 2003b), or

through use of flow probes (Rulquin et al., 2004). Although net uptake of Group 1 AA

increased to parallel the extra milk protein output, the largest changes were observed

with Group 3 AA. The uptake:output ratio of both alanine and glutamate increased to

considerably exceed unity. Thèse changes, coupled with increased net uptake of some of

the other NEAA, as also observed for alanine (Clark et al., 1977) and proline

(Vanhatalo et al., 2003b; Rulquin et al., 2004), were sufficient to reduce the déficit for

Group 3 AA (Table 6). Therefore, the mechanisms that operate to stimulate milk protein

output in the absence of extra protein supply, i.e. solely with energy provision, involve

increased MG uptake of some AA of Group 3. This contrasts with the response to

increased protein supply, where uptake of Group 2 AA is augmented and again this

suggests that the MG may be an important site within the body for removal of excess

Group 2 AA and the transfer of their N and C structures to form Group 3 AA may be

part of the homeostatic process. Confirmation of this concept requires more detailed

161

studies on transport kinetics and N transfers within the MG. Such approaches would

also help unravel how différent pathways respond to changes in protein and energy

supply.

6.6.1.4 Peptide Release

The second objective was to examine the fate of leucine uptake under similar

conditions to those reported where uptake of leucine was in large excess of milk output

and where there was an unaccounted AA balance, hypothesized as a release of peptides

by the MG (Guinard and Rulquin, 1994a; Rulquin et al., 2004). Within the current

study, the various metabolic fates of leucine were quantified, permitting a complète

balance for this AA. In the Ctrl cows, ail the leucine extracted by the MG was secreted

as milk or oxidized. Furthermore, the extra uptake observed with increased protein

supply was also directed towards thèse two metabolic pathways. In ail treatments, the

unaccounted leucine across the MG (the différence between uptake plus movement

from MOP minus oxidation minus milk) was small and not signifïcantly différent from

zéro. Similarly, the N balance across the MG for AA used for protein synthesis (without

asparagine) was not différent from 0. Thus, there was no need to invoke an additional

metabolic route via peptide release into the mammary vein. This is similar finding

where increased lysine-N uptake was quantitatively used for mammary synthesis of

NEAA (Lapierre et al., 2005) and where it was also unnecessary to hypothesize export

of peptides.

6.7 Conclusion

The responses in milk protein output when Cas or C3 were supplied to a basai

ration involve différent mechanisms within the MG. Both treatments increased

mammary Leu ILR, but the response was greater when Cas was infused, accompanied

by increased oxidation. During Cas infusions, N balance across the MG was mainly

achieved by increased uptake of Group 1 and 2 AA but during C3 supplementation this

was accomplished by increased uptake of AA from Group 1 and 3. No évidence was

found for release of peptides by the MG.

6.8 Acknowledgements

162

The authors gratefully thank from the UMR PL, INRA, France, Y. Lebreton for

surgeries, P. Lamberton and his team for technical support and animal care during the

experiment and C. Nahuet, L. Finot, N. Huchet, I. Jicquel, and S. Rigault for their help

in laboratory analyses and from the Rowett, A.G. Calder and S.E. Anderson for mass

spectrometry analyses. The authors also wish to acknowledge the financial support of

the INRA, the European Union for the award of Marie Curie Training Site funding to

the Rowett Research Institute, SEERAD and the National Science and Engineering

Research Council of Canada and Agriculture and Agri-Food Canada (Lennoxville

Research Centre Contribution number XXX).

163

Table 6.1. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on milk yield andcomposition of the right half udder in dairy cows.

Milk, kg/12 hFCM,kg/12hFat, g/kg

g/12hTrue Protein,

g

g/kg/12h

Ctrl6.386.7844.828229.3186

TreatmentsCas7.397.5342.330430.2222

C36.557.1146.129930.6197

Cas + C37.387.2439.028632.8240

SEM1

0.190.402.7124.310.767.12

CasO.001

0.240.070.820.04

<0.01

P2

C30.680.960.710.970.030.06

Cas x C30.600.400.360.400.350.59

'Least square means présentée! with pooled SEM, given for n=3; from the half udder in theevening (12h) of the leucine kinetic day (17 observations; Ctrl = 5, Cas = 3, C3 = 5, Cas + C3 =4).2Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and CasxC3 contrasts.

164

Table 6.2. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on leucine kinetics andplasma flow of the right half udder in dairy cows.

mmol/hNet Leu 3

Net MOP 4

Leu ILR5

MOP to LeuLeu Ox6

Fractional OxLeu PS7

Leu Residual8

Leu Milk 9

Leu Milk / Leu PSLeu PS - Leu Milk9

MG Leu Ox / WB Leu Ox10

MGILR/WBILR11

Leu Efficiency 12

Leu PS for constitutiveprotein, g/d3

Plasma flow, 1/h

Ctrl13.480.22

18.650.131.520.08

17.250.53

11.640.754.540.490.420.85

868307

TreatmentCas

17.630.37

24.480.294.280.18

20.49-0.2113.930.774.990.430.430.78

1031241

C314.110.19

21.070.161.690.08

19.540.28

12.340.716.020.400.430.87

983386

Cas+C318.370.29

23.970.254.040.16

20.18-0.3815.010.833.620.470.380.81

1015338

SEM1

0.830.030.510.060.380.010.760.760.430.010.330.110.020.03

38.6731.50

CasO.001<0.01<0.001

0.04O.001O.001

0.020.30

O.001O.001<0.01

0.980.220.06

0.020.07

P2

C30.400.190.090.840.900.550.210.770.060.620.850.850.400.42

0.210.02

Casx C30.940.390.010.450.540.540.090.950.610.02

<0.0010.490.100.90

0.090.75

1 Least square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations; Ctrl =5, Cas = 3, C3 = 5, Cas + C3 = 4.2 Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts.3 Based on the six samples collected every other hour, corrected for increased oxidationdue to tracer infusion.4 Net 4-methyl 2-oxopentanoate (MOP) uptake during leucine kinetics measurement.5 ILR: irréversible loss rate corrected for increased oxidation due to tracer infusion.6 Leu oxidation (Ox) corrected for increased oxidation due to tracer infusion.7 Leu used for protein synthesis (PS)8 Calculated as Net Leu + Net MOP - Leu Ox - Leu Milk 12 h.9 Leu in milk protein, from milk collected from the right half udder at the eveningmilking on the day of kinetics measurements.10 Mammary gland (MG) oxidation (half udder x 2) / whole body (WB) oxidation,adjusted to use the same precursor pool.11 MG ILR (half udder x 2) / WB ILR, adjusted to use the same precursor pool.12 Leu Efficiency = Leu Milk / Net Leu Uptake corrected by Leu infusion13 Calculated as Leu PS - Leu in milk, transferred as protein using 63 mg Leu per g ofconstitutive proteins

165

Table 6.3. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on plasma arteriovenousdifférence of amino acids on the right half udder in dairy cows.

Amino AcidsHMAlaArgAspCysGinGluGlyProSerTyrHisIleLeuLysMetPheThrTrpVal

Ctrl28.524.5

1.82.4

36.239.5-3.99.36.9

14.59.5

29.945.637.79.7

15.619.63.4

37.1

TreatmentCas16.532.4

2.53.4

54.236.54.2

20.415.221.613.547.673.156.913.422.427.1

5.857.4

C333.422.3

2.32.2

26.140.6-5.48.37.4

11.78.2

25.238.432.2

8.113.817.33.2

30.5

Cas+C333.127.8

2.52.9

40.236.9

0.118.011.716.711.337.658.148.211.219.323.64.4

44.5

SEM1

2.641.340.400.304.272.611.620.793.141.780.751.602.603.000.781.070.000.321.73

Cas0.03

<0.010.270.01

<0.010.17

<0.01O.01

0.05O.001O.01O.001<0.001O.001O.001<0.01O.01<0.01<0.001

P2

C3<0.01

0.030.540.250.020.740.100.050.610.060.04

<0.01<0.01

0.040.040.040.150.01

O.001

CasxC30.390.320.630.730.600.880.370.330.490.500.490.100.120.550.650.470.710.180.07

' Least square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations; Ctrl = 5, Cas= 3, C3 = 5, Cas+C3 = 4.2 Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and CasxC3 contrasts.

166

Table 6.4. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on amino acid uptake bythe right half udder in dairy cows.

Amino Acidsmmol/h

AlaArgAspCysGinGluGlyProSerTyrHisIle

Leu3

LysMetPheThrTrpVal

Ctrl8.87.40.50.7

11.112.1-1.32.72.04.42.99.1

13.511.42.94.75.91.2

11.2

TreatmentCas

3.68.10.60.8

13.78.91.05.13.65.43.3

11.917.614.13.35.56.71.5

14.3

C312.88.50.90.89.8

15.6-2.43.22.64.43.19.5

14.112.33.15.26.51.2

11.5

Cas+C310.99.30.80.9

13.212.2

-0.015.83.85.43.7

12.418.415.93.76.37.81.4

14.7

SEM1

0.640.830.180.090.661.290.510.230.890.250.170.570.830.840.100.200.370.090.69

Cas<0.001

0.330.990.11

O.0010.02

<0.01O.001

0.11<0.01

0.01O.001O.001<0.001O.001<0.01

0.010.01

<0.01

?z

C3O.001

0.180.130.240.210.030.070.020.670.890.120.340.400.140.050.010.050.920.59

CasxC30.020.940.710.660.520.950.990.450.760.980.690.930.940.510.260.430.520.640.94

1 Least square means presented with pooled SEM, given for n=3; 17 observations; Ctrl5, Cas = 3, C3 = 5, Cas+C3 = 4.2 Probability corresponding to thi3 Corrected for increased oxidation due to tracer infusion.

2 Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and CasxC3 contrasts.

Table 6.5. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on amino acid uptake: milkoutput ratio in dairy cows.

Amino AcidsMmol/h

AlaArgAspCysGinGluProSerHisIleLeuLys

Ctrl1.052.440.140.801.090.930.200.211.061.291.161.29

TreatmentCas0.502.230.120.781.140.580.310.321.021.411.271.33

C32.082.640.210.830.921.140.220.261.081.281.141.30

Cas + C31.462.330.160.831.020.740.330.301.061.371.221.40

SEM1

0.090.240.040.070.070.090.010.080.050.050.050.07

CasO.001

0.230.390.860.30

O.001O.001

0.300.500.070.080.29

P'C3

O.0010.530.230.630.080.070.160.890.640.610.500.51

l

Cas x C30.060.830.610.840.670.730.930.700.910.760.760.59

167

MetThrTrpVal

1.001.051.021.28

0.950.991.071.36

0!11

.99

.09

.00

.24

0.971.060.971.29

0.020.040.070.06

0.090.270.880.23

0.940.260.430.36

0.420.720.520.78

'Least square means présentée with pooled SEM, given for n=3; milk output wasestimated from milk collected from the half udder on the evening of the leucine kineticday (17 observations; Ctrl = 5, Cas = 3, C3 = 5, Cas + C3 = 4).2Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and Cas x C3 contrasts.3Phe and Tyr were not included because they were used to calculated plasma flow.

168

Table 6.6. Effect of casein (Cas) and propionate (C3) supply on the nitrogen balanceacross the right half udder in dairy cows.

NitrogenMmolhUptake

Total-N3

EAA-N4

NEAA-N5

Groupe l6

Groupe 27

Groupe 38

MilkTotal-NEAA-NNEAA-NGroupe 1Groupe 2Groupe 3

BalanceTotal-NEAA-NNEAA-NGroupe 1Groupe 2Groupe 3

Ctrl

163.081.381.723.056.779.6

156.168.987.122.545.384.9

6.912.3-5.40.5

11.4-5.3

TreatmentCas

189.5100.788.827.072.186.4

186.882.6

104.326.954.2

101.7

2.718.2

-15.50.1

17.9-15.3

C3

178.086.491.724.559.789.7

165.273.092.223.947.989.9

12.813.3-0.50.6

11.8-0.2

Cas + C3

212.8109.2103.629.577.4

101.1

200.988.8

112.229.058.3

109.3

11.820.3-8.60.5

19.1-8.3

SEM1

9.434.894.810.883.704.98

5.742.543.200.831.673.11

8.334.174.510.543.20

4.8

Cas

0.01<0.01

0.05<0.01<0.01

0.09

<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

0.720.110.050.540.040.01

?2

C3

0.070.180.030.050.260.03

0.070.070.070.070.070.07

0.360.690.200.600.790.21

Cas x C3

0.620.690.570.540.730.59

0.610.610.610.610.610.61

0.830.880.790.810.890.82

1 Least square means presented with pooled SEM, given for n=3; milk output was estimatedfrom milk collected from the half udder on the evening of the leucine kinetic day (17observations; Ctrl = 5, Cas = 3, C3 = 5, Cas + C3 = 4).2 Probability corresponding to the null hypothesis with Cas, C3 and CasxC3 contrasts.3 Total-N = N-His + N-Ileu + N-Leu + N-Lys + N-Met + N-Phe + N-Thr + N-Trp +

N- Val + N-Ala + N-Arg + N-Asp + N-Cys + N-Glu + N-Glm + N-Gly +N-Pro + N-Ser + N-Tyr.

4 EAA-N = N-His + N-Ileu + N-Leu + N-Lys + N-Met + N-Phe + N-Thr + N-Trp +N- Val.

5 NEAA-N = N-Ala + N-Arg + N-Asp + N-Cys + N-Glu + N-Glm + N-Gly + N-Pro +N-Ser + N-Tyr.

6Groupe 1 = N-His + N-Phe + N-Met + N-Tyr + N-Trp.7Groupe 2 = N-Ileu + N-Leu + N-Val + N-Lys.8Groupe 3= N-Ala + N-Arg + N-Asp + N-Cys + N-Glu + N-Glm + N-Gly + N-Pro +

N-Ser + N-Tyr.

169

6.8 Références

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175

CHAPITRE VII

DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE

7.1 Discussion

Ce programme doctoral avait pour objectif de mieux comprendre comment le

métabolisme protéique aux niveaux corporel, splanchnique et mammaire était modulé

par des apports de protéine et/ou d'énergie. Pour cela, nous avons fait varier l'apport

protéique par des rations avec des niveaux différents de protéines métabolisables, ou par

la perfusion de caséine au niveau duodénal. L'apport d'énergie a été modulé par la

perfusion d'acide propionique au niveau ruminai. Ce projet a permis de mieux définir,

dans un premier temps, l'effet des apports protéiques sur les débits nets des AA aux

niveaux splanchnique et mammaire. Par ailleurs, la combinaison de perfusions de

caséine et d'acide propionique avec l'utilisation d'isotopes stables nous a permis

d'approfondir notre connaissance du métabolisme des AA aux niveaux corporel et

mammaire. Il s'agissait également de mieux comprendre les différents mécanismes

d'action par lesquels l'énergie et les protéines augmentent la production de protéines

laitières. Globalement, le projet visait l'objectif général qui est de mieux manipuler les

apports nutritionnels chez la vache laitière afin d'améliorer l'efficacité du transfert de la

protéine alimentaire en protéine laitière.

Deux expériences, lesquelles comportaient deux volets chacune, ont été réalisées

afin de pouvoir répondre aux questions de recherche posées. Dans la première

176

expérience, nous avons étudié l'effet d'apports croissants de protéines métabolisables

sur les débits nets des AA. Cette première expérience a bien démontré que l'efficacité

du transfert des AA digérés au niveau intestinal et convertis en protéines laitières

diminue à mesure que l'on augmente la quantité de protéines métabolisables dans la

ration, tel que proposé par Doepel et al., 2004. Cette diminution de l'efficacité est

directement reliée à une augmentation du prélèvement hépatique d'un groupe d'AA

indispensables (groupe 1) incluant l'histidine, la méthionine, la phénylalanine (et la

tyrosine) et la thréonine et à une augmentation du catabolisme au niveau périphérique

incluant la glande mammaire d'un autre groupe d'AA (groupe 2) composé de la leucine,

l'isoleucine, la valine et de la lysine. Ces résultats expérimentaux confirment qu'un

facteur fixe de conversion des AA absorbés en AA des protéines du lait ne devrait pas

être utilisé tel qu'il l'est actuellement dans les différents modèles de prédiction de

production de protéines du lait. Ce facteur varie selon le bilan nutritionnel de l'animal et

selon chaque AA.

Une extraction aussi importante au niveau hépatique traduit-elle directement un

catabolisme des AA ainsi prélevés ? Comme le foie est un organe où la majorité des

protéines plasmatiques sont produites, une fraction de cette extraction est effectivement

utilisée pour fabriquer des protéines qui seront exportées hors du foie, donc

potentiellement utilisées à des fins anaboliques. Chez des moutons (Connell et al.,

1997), une restriction alimentaire n'a pas réduit le taux de synthèse de ces protéines

d'exportation. Qu'en est-il d'une restriction protéique chez des vaches laitières dont la

demande mammaire pour les AA est très élevée ? Dans notre expérience, nous avons

déterminé pour la première fois chez la vache laitière en utilisant un traceur (2Hs-

phénylalanine) que le taux de synthèse des protéines plasmatiques, en majorité

exportées par le foie, est plus élevée que chez le mouton (1.24 vs. 1.04 g/kg poids vif075 par jour, notre étude vs Connell et al., 1997). Cette synthèse demeure une priorité

métabolique importante car elle n'est pas diminuée par une réduction de l'apport en

protéines, contrairement à la production de matières protéiques. Cette étude confirme le

rôle régulateur du foie qui répond à une réduction d'extraction hépatique de

phénylalanine suite à une atténuation des apports par une diminution de l'oxydation de

phénylalanine afin de maintenir constante la synthèse des protéines d'exportation.

177

Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons modifié les apports de protéines

et d'énergie par des perfusions de caséine et/ou d'acide propionique selon des quantités

déjà utilisées dans des travaux antérieurs (Guinard et Rulquin 1994a; Rigout et al.,

2003), pour lesquels une réponse sur la production de protéines du lait avait été

observée. Les objectifs étaient de déterminer comment variaient les débits nets d'AA en

fonction d'apports protéique et/ou énergétique. Il s'agissait de plus d'estimer si les voies

métaboliques connues (synthèse protéique et oxydation) étaient suffisantes pour

expliquer l'augmentation du prélèvement mammaire de certains AA en excès par

rapport à leur sécrétion dans la protéine du lait observé avec des augmentations d'apport

en protéine. Pour répondre à ce dernier objectif, nous avons introduit des traceurs (13C-

Leucine et 13C-bicarbonate) pour mesurer le métabolisme total ainsi que l'oxydation de

la leucine aux niveaux corporel et mammaire.

Au niveau corporel, nous avons observé une augmentation de l'utilisation totale

de la leucine avec les apports des deux types de nutriments, mais à un degré moindre

avec le propionate qu'avec la caséine. Pour la répartition de l'utilisation totale de la

leucine, les deux traitements mettent en lumière les réponses suivantes : les deux

traitements entraînent une augmentation de la synthèse totale de protéines, mais la

caséine montre une réponse supérieure. La différence s'explique par l'oxydation : la

caséine l'augmente (Liu et al., 1995; Bequette et al., 1996a) alors que l'acide

propionique la diminue quand la caséine est présente. Nous en venons donc à la

conclusion qu'il y a des régulations différentes sur le métabolisme de la leucine au

niveau corporel quand la caséine et l'acide propionique sont perfusés, et que l'effet de

l'énergie sur la synthèse totale de protéines au niveau corporel dépend du niveau de

protéines. En complément, nous avons mesuré l'effet de la perfusion de caséine ou

d'acide propionique sur le métabolisme de la leucine au niveau mammaire. Nous avons

ainsi analysé l'hypothèse de largage de peptides par la glande dans le drainage veineux,

hypothèse qui semblait expliquer les prélèvements excédentaires de leucine par la

glande mammaire (Guinard et Rulquin, 1994a; Rulquin et al., 2004) à des apports élevés

de protéines. Nous avons observé une augmentation de l'utilisation totale mammaire de

la leucine pour les deux types de nutriments, reliée principalement à une grande

augmentation de l'oxydation avec la perfusion de caséine. Le suivi minutieux des

178

destins de la leucine (vers son céto-acide, vers l'oxydation et vers les protéines du lait)

nous a permis de mettre en évidence que ces voies métaboliques étaient suffisantes,

dans notre étude, pour tenir en compte les excès de prélèvement mammaire de leucine et

que le largage de peptides par la glande mammaire n'avait pas besoin d'être invoqué.

Nous avons examiné aussi les différences de prélèvements d'AA amenés par

l'apport des différents types de nutriments, mesures individuelles complétées par un

bilan mammaire azoté. Dans tous les cas, la glande mammaire maintient un bilan azoté

provenant des AA à peu près nul, ce qui signifie que dans l'ensemble, la quantité

d'azote apportée par les divers AA apporte suffisamment d'azote pour expliquer la

quantité d'azote retrouvée dans les protéines du lait. Ceci dit, sur une base globale, le

prélèvement des AA sur une base individuelle est quant à lui affecté par les deux types

de nutriments étudiés et varie selon les groupes précédemment décrits par Mepham et

al. (1982). Lors des perfusions de caséine, la glande mammaire maintient son bilan

azoté près de zéro en augmentant principalement les prélèvements des AA des groupes

1 et 2, incluant les AA indispensables, en même temps qu'en augmentant la production

de matières protéiques. Cependant, lors des perfusions d'acide propionique, le bilan

azoté est maintenu à zéro avec une augmentation moindre des productions de protéines

du lait couplées à une augmentation des prélèvements nets des AA des groupes 1 et 3.

Nous en venons donc à la conclusion que l'énergie pourrait diminuer l'utilisation d'AA

non indispensables (principalement du groupe 3) au niveau corporel; de cette façon, il y

aura plus d'AA de ce groupe disponible pour la glande mammaire. Couplée à

l'augmentation du débit sanguin mammaire, cette augmentation du prélèvement des AA

du groupe 3 pourrait permettre une amélioration de l'efficacité de l'utilisation des AA

du groupe 2 pour favoriser l'augmentation de production de protéines du lait avec la

perfusion d'acide propionique sans apport additionnel de protéines.

7.2 Conclusion

Au cours de ce travail de recherche, nous avons étudié le métabolisme protéique

aux niveaux splanchnique et mammaire en réponse à des apports de protéines ou

d'énergie. Nous avons démontré qu'une augmentation de l'apport protéique entraîne

179

une baisse de l'efficacité de transformation des AA absorbés en protéines du lait. Cela

s'explique par :

1- une augmentation de l'oxydation hépatique des acides aminés du

groupe 1 constitué de l'histidine, la méthionine, et la phénylalanine (et

la tyrosine).

2- une augmentation de l'oxydation mammaire par les tissus

périphériques des AA du groupe 2 constitué par la leucine,

l'isoleucine, la valine et la lysine.

L'énergie joue un rôle important dans le métabolisme des AA via :

1- une diminution de l'oxydation de la leucine (et probablement des

autres AA indispensables) au niveau corporel

2- une augmentation de l'extraction mammaire des AA non-

indispensables glucogéniques, possiblement par une épargne

hépatique de ces AA.

Les augmentations de matières protéiques en réponse à des apports de protéine

ou d'énergie s'expliquent par des mécanismes différents, d'où une réponse additive sur

la production de protéines du lait lors de l'ajout simultané de ces deux nutriments.

ISO

7.3 Liste des ouvrages cités

Bequette, B. J., J. A. Metcalf, D. Wray-Cahen, F. R. Backwell, J. D. Sutton, M. A.

Lomax, J. C. MacRae et G. E. Lobley. 1996. Leucine and protein metabolism in the



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Rulquin, H., S. Rigout, S. Lemosquet et A. Bach. 2004. Infusion of glucose directs


87:340-349.

181

ANNEXE I

1. Débit net des acides aminés (AA), mmol/h

Débit net AA = [AAV] - [AAA] x DP A OOO

Débit net portai = [AAP ] - [AAA] x DPP/1000

Débit net hépatique = ([AAH ] - [AAP] x DPP ) + ([AAH ] - [AAA] x DPAH)

/1000

Débit net splanchnique = ([AAH ] - [AAA]) x DPH/1000

Débit net mammaire = [AAM] - [AAA] x DPM/1000

où [AA] représente la concentration plasmatique des AA (uM), les vaisseaux sanguins

sont représentés comme suit : A = artère, V= veine, P = veine porte, H = veine

hépatique, M = veine mammaire, et DP indique le débit plasmatique (1/h) au niveau de

chacun des vaisseaux, DPAH étant le débit plasmatique de l'artère hépatique. Le débit

splanchnique représente la somme des débits des viscères drainés par la veine porte

(système digestif, rate, pancréas et gras mésentérique) et du foie.

2. Mouvement dynamique

2.1 Utilisation corporelle

L'utilisation corporelle totale d'un AA (UT-AA) et la production totale de

dioxyde de carbone (CER) ont été calculés ainsi :

1) UT- AA or CER (mmol/h) = (EIinf / EIA - 1) x Inf

où EIinf et EIA représentent respectivement l'enrichissement isotopique (El : mpe) du

traceur perfusé et celui du pool précurseur mesuré au niveau artériel et Inf, le taux de

perfusion du traceur.

182

L'oxydation d'un AA (Ox) au niveau corporel a été calculé ainsi;

2) Ox-Leu (mmol/h) = (CER x EIa-13CO2 /EI-Leu) - Inf

La synthèse de protéines (SP) au niveau corporel a été calcule comme suit :

3) SP (mmol/h) = UT-AA - Ox-Leu

Pour le calcul de synthèses protéines au niveau corporel, nous avons utilisé

comme référence 63 g de leucine par kg de protéines corporelles synthétisées (Lobley et

al., 1980) et 98 g de leucine par kg de protéine laitière, en accord avec nos propres

analyses et la littérature (Swaisgood, 1995).

2.2 Utilisation au niveau d'un organe

4) UT-AA (mmol/h) - (([AAA] x EIAA-A ) - ([AAV] x EIAA-V)) x DP / El AA.V

/1000

où EIAA et [AA] représentent respectivement l'enrichissement isotopique (El : mpe) du

traceur perfusé et la concentration plasmatique de l'AA étudié (uM), soit au niveau

artériel (A) ou veineux (V) et DP, le débit plasmatique de l'organe étudié.

2.3 Glande mammaire

Le métabolisme dynamique de la leucine dans la glande mammaire a été étudié

selon un modèle à trois compartiments (Bequette et al., 2002). L'utilisation totale au

niveau de la glande mammaire (GM) est calculée tel que décrit dans la section

précédente, soit :

5) GM UT-Leu (mmol/h) = ((([LeuA] xEILeu-A)- ([LeuM] xEILeu-M)) x DPM /

IEMOP-M) -CorOx

le céto-acide de la leucine, le 4-methyl 2-oxopentanoate (MOP), formé

intracellulairement et relargué au niveau du plasma veineux étant utilisé comme

représentatif du pool précurseur. Le facteur CorOx corrige pour tenir en compte

l'oxydation supplémentaire au niveau mammaire résultant de la perfusion du traceur.

183

Le MOP transformé en Leucine et relargué dans la veine mammaire (M) a été

calculé comme suit :

6) MOP vers Leu ou CO2 (mmol/h) = (([MOPA] X EI M O P-A - [MOP-M] XEIMOP-M)

x DPM) / (IEMOP-M)

où [Leu] et [MOP] représentent respectivement les concentrations de la leucine et du

MOP et El les enrichissements du MOP.

2.3.1 L'oxydation au niveau mammaire

Le débit sanguin (DS) a été utilisé pour calculer le flux de CO2

7) DS (1/h) = DP / (1- HématocriteA)

où hématocriteA représente l'hématocrite mesuré au niveau artériel (A)

Le flux de 13CO2 au niveau de la glande mammaire (GM) a été calculé :

8) GM13CO2 (mmol/h) = (([CO2M] x EI1 3C02 M j- ([CO2A] ><EI13CO2A )) x DSM

où [CO2] représente les concentrations et El les enrichissements du CO2 et 13CO2

respectivement, et A et M pour la artère et la veine mammaire.

La séquestration (Sq) de 13CO2 a été estimée par le flux artériel de 13CO2 non récupéré

dans la veine mammaire pendant la perfusion de bicarbonate. À partir de la Sq, nous

avons fait une correction sur le flux total de 13CO2 de la glande mammaire mesuré

pendant la perfusion de leucine marquée.

9) GM 13CO2 corrige pour la Sq (mmol/h) = (flux artériel de 13CO2 x Sq) + GM13CO2

L'oxydation de la leucine par la GM a été finalement calculée comme suit :

10) GM Leu Ox (mmol/h) = (GM 13CO2 corrigée pour la Sq /EIMOP-M) - CorOx

La synthèse de protéines (SP) au niveau de la glande mammaire :

184

ll)SP(mmol/h)= GM UT-Leu - MOP - GM Leu Ox

Pour transformer l'utilisation de la leucine pour la synthèse protéique (mmol/h)

en protéines totales synthétisées (g/j), nous avons utilisé comme référence 63 g de

leucine par kg de protéines synthétisées (Lobley et al., 1980), et 98 g de leucine par kg

de protéines dans le lait produit (Swaisgood, 1995).

2.4 Synthèse des protéines plasmatiques

Les taux de synthèse relative de l'albumine (Alb) et des protéines plasmatiques

totales (Prot Tôt) (FSR; %/jour d'Alb ou Prot Tôt) ont été calculés ainsi :

12) FSR ( %/jour) = pente (Alb ou Prot Tôt) / EIH * 24 * 100.

où la pente de l'EI de phénylalanine marquée (d5-Phe) dans l'albumine ou les protéines

totales plasmatiques en fonction du temps de la perfusion de d5-Phe (entre 3 et 8

heures) a été estimée pour chaque vache.

La valeur absolue de la synthèse totale des protéines plasmatiques totales ou

d'albumine (ASR; g/jour d'Alb ou Prot Tôt) a été calculée :

13) ASR (g/jour) = FSR (Alb ou Prot Tôt) * [Alb ou Prot Tôt]* VP

où VP représente le volume plasmatique, calculé comme étant 49.9 ml/kg poids

corporel (Girad al., 1989) et [Alb ou Prot Tôt] représente la concentration d'albumine

ou de protéines plasmatiques totales. Pour la conversion de ASR (g/j : Alb ou Prot Tôt)

en phénylalanine utilisée (mmol/h), nous avons utilisé 5 % de phénylalanine dans les

protéines plasmatiques totales et 6 % de phénylalanine dans l'albumine (Peters et al.,

1985).

185

La proportion maximum de phénylalanine extraite par le foie utilisée pour la synthèse

de protéines plasmatiques totales ou d'albumine a été calcule ainsi :

14) Phe Alb or Prot Tôt ( %) = Phe utilisée pour Alb or Prot Tôt / extraction

nette hépatique de Phe * 100

La phénylalanine oxydée par le foie (mmol/h) a été calculée par la différence

entre l'extraction nette hépatique de phénylalanine moins la quantité utilisée pour les

protéines d'exportation. Ainsi la phénylalanine utilisée pour la synthèse protéique

hépatique a été calculée ainsi :

15) SP Phe hépatique (mmol/h) = UT-Phe hépatique - Ox Phe

La conversion de l'utilisation de la phénylalanine pour la synthèse protéique

hépatique (mmol/h) en synthèse de protéines (g/d) a été basée sur une concentration de

36 g de phénylalanine par kg protéines constitutives du foie (Connel et al., 1997).

2.5 Liste de références

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effet des apports proteique et énergétique sur le métabolisme

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