laquo Universiteacute de Franche-Comteacute - UFR de Meacutedecine et de Pharmacie raquo

DOCTORAT DE LrsquoUNIVERSITE DE FRANCHE-COMTE

Ecole doctorale Homme Environnement Santeacute

Effet de lrsquoassociation des Basses Concentrations drsquoO2 et des Cellules Stromales Meacutesenchymateuses sur lrsquoExpansion ex vivo des Cellules Souches et

Progeacutenitrices Heacutematopoiumleacutetiques

THESE

laquo Preacutesenteacutee publiquement raquo

Le 02 octobre 2012

Par Mohammad HAMMOUD

En vue du grade de Docteur de lrsquoUniversiteacute de Franche-Comteacute

Speacutecialiteacute Sciences de la Vie et de la Santeacute

JURY

Pr Jean-Jacques LATAILLADE (Rapporteur)

Pr Jorge DOMENECH (Rapporteur)

Pr Pierre TIBERGHIEN (Examinateur)

Dr Bruno DELORME (Examinateur- preacutesident de Jury)

Dr Zoran IVANOVIC (Directeur de thegravese)

1

REMERCIEMENTS

Je tiens tout drsquoabord agrave remercier le ministegravere de lrsquoEnseignement Supeacuterieur de Syrie pour sa participation financiegravere fondamentale sans laquelle je nrsquoaurais pu reacutealiser ce travail Je remercie les membres du jury pour le temps consacreacute agrave la lecture de ce manuscrit Monsieur le Professeur Pierre TIBERGHIEN pour sa participation au jury Monsieur le Professeur Jorge DOMENECH pour avoir accepteacute le lourd travail de rapporteur de ce meacutemoire de thegravese et pour ses conseils et ses remarques pertinentes Monsieur le Professeur Jean-Jacques LATAILLADE pour avoir accepteacute drsquoeacutevaluer ce travail eacutegalement en qualiteacute de rapporteur Vos corrections et vos critiques eacutetaient cruciales pour ameacuteliorer ce meacutemoire ainsi que cette recherche Monsieur le Docteur Bruno DELORME preacutesident de Jury pour avoir accepteacute drsquoeacutevaluer ce travail de thegravese Jrsquoadresse mes sincegraveres remerciements au Docteur Zoran IVANOVIC mon Directeur de thegravese pour ses conseils ses encouragements sa disponibiliteacute sa gentillesse sa patience (je sais que jrsquoeacutetais fatiguant) son humaniteacute son appui scientifique et moral ainsi que pour sa personnaliteacute qui marque les esprits Jrsquoen ai beaucoup appris de son esprit critique (CD34+ ne cellule souche basses concentrations drsquoO2 ne hypoxie cellule souche ne pheacutenotype cellule souche = eacutetat fonctionnel hellip) cela fait partie de lrsquoalphabet de Zoran et il est impossible de les oublier Votre raisonnement concernant la culture en hypoxie est seacuteduisant Il y a un an avec mes difficulteacutes personnelles jrsquoai cru ne plus pouvoir continuer ce travail si jrsquoai pu y reacutesister crsquoest gracircce agrave son soutien Je suis vraiment reconnaissant pour vous Zoran Mes remerciements vont eacutegalement agrave Monsieur le Professeur Pierre TIBERGHIEN pour mrsquoavoir accueilli au sein de son eacutequipe Inserm 645 depuis le Master jusqursquoagrave la clocircture de ma thegravese Je remercie le Professeur Jean-Michel BOIRON et le Docteur Azzedine ASSAL de mrsquoavoir autoriseacute agrave reacutealiser cette thegravese agrave lrsquoEFS-AL site de Bordeaux Je tiens agrave remercier les membres du Laboratoire de Recherche amp de Deacuteveloppement de lrsquoEFS-AL- Bordeaux qui ont eacuteteacute pour moi comme une deuxiegraveme famille avec laquelle jrsquoai passeacute le plus clair de mon temps Bien que mon sujet principal soit un peu eacutetouffant (Hypoxie) lrsquoambiance au labo eacutetait tregraves fraiche et pleine drsquooxygegravene A Marija Vlaski je la remercie particuliegraverement de tout mon cœur pour sa contribution agrave lrsquoeacutelaboration de ce travail depuis le deacutebut Tu mrsquoas beaucoup aideacute tant sur le plan scientifique que sur le plan humain Nous nrsquoeacutetions pas bavards au laboratoire mais toutes tes remarques tes commentaires ont toujours eacuteteacute tregraves importants et tregraves utiles pour moi A Philippe Brunet de la Grange je nrsquoai pas eu le temps de te remercier avant drsquoailleurs connaissant ton caractegravere je pense que tu nrsquoen attendais pas plus Je voudrais juste te dire que ta preacutesence eacutetait deacuteterminante indispensable dans les moments cruciaux de cette thegravese Ta participation eacutetait juste essentielle pour la reacutealisation de lrsquoarticle principal de celle-ci A Jean Chevaleyre le vrai expert en cellules meacutesenchymateuses en techniques expeacuterimentales et dans la vie Vous aviez toujours une reacuteponse agrave toutes nos questions Jrsquoai appris beaucoup agrave travers nos discussions agrave la fois passionnantes et tregraves enrichissantes agreacutementeacutee de moments conviviaux et chaleureux

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A Pascale Duchez Crsquoest elle qui a mis au point la technique de culture sur laquelle je me suis baseacute pour effectuer mon expeacuterimentation et obtenir mes reacutesultats A Laura Rodrigues la plus jeune du labo toujours souriante et radieuse malgreacute la charge de travail Merci pour ses retouches feacuteminines magiques sur ma preacutesentation de soutenance A Fontanet Bijou eacutenergie enthousiasme extraordinaire toujours disponible pour nous apporter de lrsquoaidehellip personnaliteacute inoubliable de qualiteacute tregraves rare A Elisabeth Volkman merci surtout pour tes corrections finales Je remercie le personnel de lrsquoEFS de Bordeaux en particulier le service de Controcircle Qualiteacute dirigeacute par le Docteur Xavier Lafarge qui eacutetait tregraves impliqueacute dans notre travail le service HLA dirigeacute par le Docteur Dominique Fizet le service de Theacuterapie Cellulaire dirigeacute par le Docteur Bernard Dazey et le service de Ressource Humaines dirigeacute par le Docteur Philippe Juret Je remercie lrsquoeacutequipe du Professeur Vincent Praloran et tout particuliegraverement Monsieur le Professeur Praloran pour ses remarques pendant mes preacutesentations A Yann agrave Arnaud agrave Ameacutelie hellip Merci au personnel de lrsquoUMR 5164 - partie immuno notamment veacuteronique Conrade qui effectue une partie de ses manipes agrave lrsquoEFS Merci agrave lrsquoeacutequipe du Professeur Patrick Blanco pour la reacutealisation drsquoune partie des mesures des cytokines Il me reste agrave remercier ma petite famille je te remercie Amal ma chegravere eacutepouse drsquoavoir supporteacute mon absence et de mrsquoavoir aideacute dans la reacutealisation de ce manuscrit de mrsquoavoir remplaceacute sur le front syrien Et tout cela malgreacute la preacuteparation de ton Master Je suis deacutesoleacute Lamar mon cher fils je trsquoassure que nous trouverons le temps pour jouer ensemble et trsquoaccompagner pour une fois agrave lrsquoeacutecole Je te remercie Ghoulba mon cousin pour ton aide agrave tous les niveaux Je ne sais pas avec toutes les nouvelles pressions que jrsquoai sur tous les niveaux dans mon environnement et mon micro-environnement ce que je vais devenir Est-ce que cela va mrsquoamener agrave lrsquoautorenouvellement ou agrave lrsquoengagement dans un processus de seacutenescence et drsquoapoptose Ce travail est deacutedieacute agrave ma famille en Syrie ma megravere mon pegravere agrave Raghda Dalal Rima Nidal Ebtissam Nisrin Ali Kinan et surtout agrave Arrouj hellip Une petite penseacutee va agrave mes compatriotes Syriens en espeacuterant qursquoon trouvera une fin heureuse dans la reacutesolution des conflits

3

TABLE DES MATIERES

Liste des Figures helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 Liste des Tableaux helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Abreacuteviations helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11 INTRODUCTIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16 I Heacutematopoiumlegravese 17 IA- Ontogeacutenie des Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17 IB- Hieacuterarchie du systegraveme heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 IB1- Les Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiques 18 IB2- Les progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques 22 IB3- Les preacutecurseurs 23 IB4- Les cellules matures 23 IC- Identification des cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24 IC1- Caracteacuterisation pheacutenotypique des CSH 25 IC11 Marqueurs membranaires positifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC111 Lrsquoantigegravene CD34 helliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC112 Lrsquoantigegravene CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC113 Lrsquoantigegravene CD90 (Thy11)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC114 Lrsquoantigegravene CD117 (c-Kit)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC12 Marqueurs membranaires neacutegatifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC121 Le marqueur Lin-helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC122 Lrsquoantigegravene CD38helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC123 La moleacutecule HLA-DRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC2- Caracteacuterisation meacutetabolique des CSH27 IC21 Lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme ALDHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29 IC22 Lrsquoactiviteacute des moleacutecules ROS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20

IC23 Le pheacutenotype Side Populationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20 IC24 Le cycle cellulairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31 IC3- Caracteacuterisation fonctionnelle 33 IC31 Tests in vitro 33 IC32 Tests in vivo 35 II Microenvironnement meacutedullaire et Cellules SouchesStromales Meacutesenchymateuseshelliphelliphellip40 IIA- La niche heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 IIB- Composants et reacutegulation du microenvironnement meacutedullaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43 IIB1- Le composant cellulaire44 IIB11 Cellules drsquoorigine meacutesenchymateusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44 IIB111 Les Cellules Souches Meacutesenchymateuses (CSM) helliphelliphellip 44 IIB112 Les Osteacuteoblastes 45 IIB113 Les Cellules reacuteticulaires helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

IIB114 Les Adipocytes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB12 Cellules drsquoorigine heacutematopoiumleacutetiquehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB121 Les Osteacuteoclastes 47 IIB122 Les Cellules Endotheacuteliales (CE) 47 IIB123 Les Macrophage48 IIB2- Matrice extracellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

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IIB3- Facteurs de Croissance et Cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49 IIB31 Les cytokines stimulanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB311 Stem Cell Factor (SCF) ou C-kit Ligand (KL)helliphelliphellip50 IIB312- Flt-3 Ligand (FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB313 Thrombopoiumleacutetine (TPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51 IIB314 Lrsquointerleukine 6 (IL-6)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB315 Colony Stimulating Factors (CSF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB316 Lrsquointerleukine 3 (IL-3)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB317 LrsquoErythropoiumleacutetine (EPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB318 Lrsquointerleukine 5 (IL-5)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB319 Autres facteurs stimulateurshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB32 Les cytokines inhibitriceshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB321 Transforming Growth Factor β (TGF-β) helliphellip55 IIB322 Lrsquointerleukine 10 (IL-10)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB323 Tumor Necrosis Factor α (TN F-α)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB324 Platelet Factor 4 (PF4)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB325 Macrophage-Inflammatory-Protein 1α (MIP-1α)helliphelliphellip 55 IIB4- Autres facteurs intervenant dans la reacutegulation de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphellip56 IIB41 Les chimiokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56 IIB42 Les moleacutecules drsquoadheacutesionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip57 IIB43 Signalisations impliqueacutees dans la reacutegulation de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphellip59 IIB431 Les voies morphogegravenes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip59 IIB432 Lrsquoaxe Tie2Ang-1 et Cdh2integrinβ1c-MYC helliphelliphelliphellip61 IIB433 Le signal TPOMpl dans les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB434 Les proteacuteines BMPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB435 Les facteurs de transcriptionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip62 III Cellules Stromales meacutesenchymateuses (CSM) 64 IIIA- Sources et caracteacuteristiques des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65 IIIB- Les proprieacuteteacutes des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67 IIIC- Le rocircle des CSM dans lrsquoheacutematopoiumlegravese in vivo et ex vivo helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69 IIIC1- Meacutecanisme daction de CSM dans lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC11 Seacutecreacutetion de cytokines par les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC111 VEGF-Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC112 FGF-2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC113 HGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72 IIIC114 IL-10helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC115 IL-6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC116 SDF-1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC117 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC118 TGF-βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC12 Interaction directe CSMCSH (contact cellulaire)helliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC121 Rocircle de lrsquoadheacutesion meacutedieacutee par VCAM-1VLA-4helliphelliphellip76 IIIC122 Rocircle des voies morphogegraveneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76 IV Influence des basses concentrations drsquoO2 sur les cellules souches77 IVA- Introductionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVB- HypoxieNormoxie in situhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVC- Les concentrations drsquoO2 dans lrsquoorganisme humainhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

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IVD- Rocircle de lrsquooxygegravene dans les cellules soucheshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD1- Les Facteurs de transcription HIF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD11 Les sous uniteacutes α helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD111 HIF-1αhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD112 HIF-2α et HIF-3αhelliphellip82 IVD12 Les sous uniteacutes β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD121 HIF-1βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD122 HIF-2β et HIF-3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD13 Les cibles de HIFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD2- Les cellules souches et les basses concentrations drsquoO2 ndash Introductionhelliphelliphellip83 IVD3- Cellules souches embryonnaires (CSE) et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip85 IVD4- Cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphellip85 IVD5- Cellules souches neurales (CSN) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86 IVD6- Cellules souches meacutesenchymateuses et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD61 La prolifeacuterationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD62 La diffeacuterenciation helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip88 IVD63 La migrationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89 IVD64 La seacutecreacutetion des facteurs solubles helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90 IVD7- Cellules souches heacutematopoiumleacutetiques et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip92 IVD71 Le cycle cellulaire des cellules heacutematopoiumleacutetiques primitiveshelliphelliphellip93 IVD72 Le stress oxydatifhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip95 IVD73 Lrsquoexpansion ex vivo de CSH et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip96 IVD74 Modulation de lrsquoeffet des cytokines helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 V Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA- La greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA1- Les diffeacuterents types de greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphellip99 VA11 Lrsquoautogreffehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA12 Lrsquoallogreffe helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip100 VA2- Les sources des CSH des greffons allogeacuteniqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA21 La moelle osseuse helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA22 Les cellules souches du sang peacuteripheacuterique mobiliseacuteeshelliphelliphelliphelliphellip102 VA23 Le Sang Placentaire (SP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip103 VA231 Inteacuterecirct du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip104 VA232 Probleacutematique de la greffe du SP helliphelliphellip106 VB- Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip107 VB1- Expeacuteriences agrave partir de Greffon meacutedullaire et du CSP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109 VB2- Expeacuteriences avec Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110 VB3- Ameacutelioration de lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112 VB4- Rocircle du support Stromal dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphellip113 VC- Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphellip115 VC1 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon meacutedullaire et CSPhelliphelliphellip115 VC2 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip116 OBJECTIFShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip120 MATERIELS ET METHODEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip123 I PROTOCOLE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124 II Preacuteparation des cellules et culture cellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA Uniteacute de sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125

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IIA1 Isolement des cellules mononucleacutees (CMN) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA2 Purification des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIB Preacuteparation de la couche adheacuterente de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip126 III Analyse des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip127 IIIA Analyses fonctionnelles - colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)helliphellip127 IIIB Analyse pheacutenotypique des preacuteparations de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128 IV Congeacutelation et Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVA Congeacutelation des cellules helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVB Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 V Culture simple et Co-culture sur CSM des cellules CD34+ - Culture C1helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130 VA Analyses par Cytomeacutetrie en Flux (CMF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA1 Expression des Antigegravenes Membranaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA2 Activiteacute de lrsquoenzyme Aldeacutehyde Deacuteshydrogeacutenase (ALDH)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132 VB Deacutetection des cellules progeacutenitrices CFC ndash culture semi-solidehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VC Deacutetection des progeacuteniteurs primitifs Preacute-CFCs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VD Deacutetection des cellules souches SRC (Scid-Repopulating Cells)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134 VD1 Deacutetection des cellules humaines dans la moelle osseuse des souris par CMF 135 VD2 Deacutetection des progeacuteniteurs humains dans la MO des souris par test CFChellip135 VI La production des cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip136 VII Expansion de cellules CD34+ avec les surnageants de culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137 VIII Tests Statistiques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip138 RESULTATShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip139 I Article principal helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip140 II Reacutesultats Compleacutementaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip152 IIA Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de cellules totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 IIB Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154 IIC Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de CFC helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155 IID Pheacutenotypage en fin de culture (J10) reacutealiseacute sur les cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID1 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID2 Marqueurs myeacuteloiumldes (CD13 et CD33) et marqueur lymphoiumlde B CD19helliphellip157 IID3 Marqueurs de laquo primitiviteacute raquo CD133 ALDH et CD90 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID31 Lrsquoexpression du CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID32 Lrsquoactiviteacute de lrsquoALDH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID33 Lrsquoexpression du CD90helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IID4 Moleacutecules drsquoadheacutesion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IIE Activiteacute (SRC) - analyse de xeacutenogreffe dans les conditions avec ou sans IL-3helliphelliphellip160 IIE1 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions avec IL-3 SRC-CDhelliphelliphellip160 IIE2 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions sans IL-3 SRC-CDhelliphellip163 IIE3 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions avec IL-3 SRC-CFChellip164 IIE4 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions sans IL-3 SRC-CFChellip165 III Travaux sur les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip167 IIIA Caracteacuterisation des preacuteparations de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168 IIIA1 Production de colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)168 IIIA2 Effet de basses concentrations drsquoO2 sur le pheacutenotype des CSMhellip169 IIIA3 Impact des taux dO2 sur la seacutecreacutetion des cytokines par les CSMhelliphelliphelliphellip172 IIIA31 IL-6 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172 IIIA32 VEGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173

7

IIIA33 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173 IIIA34 TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA35 FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA36 IL-3helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175 IIIA37 G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA38 TPOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA39 SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177 IIIA310 IL-4 GM-CSF IL-17A IL-1β IL-10 HGF et TNF-αhelliphelliphelliphellip178 IIIB Impact des surnageants sur la culture de CD34+ SP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip180

IIIB1 Condition 1 10 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 IIIB2 Condition 2 20 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

DISCUSSION helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip184 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip194 BIBLIOGRAPHIEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip198 ANNEXEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip234 Article 1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip236 Article 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip244 Communications aux colloqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip250 RESUMEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip251

8

LISTE DES FIGURES

Figure 1 Les sites de lrsquoheacutematopoiumlegravese fœtale helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figure 2 Scheacutema geacuteneacuterale de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

Figure 3 Divisions symeacutetrique et asymeacutetrique des CSH dans le temps (t)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22

Figure 4 Analyse par Cytomeacutetrie en Flux du pheacutenotypage Side Population sur des CMN Lin-

meacutedullaires humaineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31

Figure 5 Hieacuterarchie des CSH et des progeacuteniteurs deacutependant de meacutethode de deacutetectionhelliphelliphellip35

Figure 6 Niches reacuteticulaires creacuteeacutees par les progeacuteniteurs meacutesenchymateux pouvant maintenir

et reacuteguler les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

Figure 7 Illustration abreacutegeacutee de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figure 8 Concentration en oxygegravene dans les principaux organes du corps humainhelliphelliphelliphellip79

Figure 9 Les niches de certaines cellules souches avec leurs concentrations physiologiques

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip84

Figure 10 Expansion de greffon heacutematopoiumleacutetique en fonction des concentrations

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip97

Figure 11 Evolution de la reacutepartition des indications dallogreffe en Francehelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Figure 12 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques en France

entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 13 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques non-

apparenteacutes en France entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 14 le principe de lrsquoexpansion ex vivo de greffon heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphellip108

Figure 15 Illustration du modegravele expeacuterimental helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip122

Figure 16 Culture de cellules stromales meacutesenchymateuses humaines issues de la moelle

Osseuse avec de diffeacuterents grossissementshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128

Figure 17 Systegraveme de mini-chambre agrave O2 controcircleacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130

Figure 18 La culture secondairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134

Figure 19 Scheacutema repreacutesentant le test in vivo de xeacutenogreffe aux souris NOGSCIDhelliphellip135

Figure 20 Taux dexpansion des cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

Figure 21 Taux dexpansion des cellules CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

9

Figure 22 Taux dexpansion des progeacuteniteurs CFChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155

Figure 23 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip157

Figure 24 Pourcentage de cellules CD133+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip163

Figure 25 Pourcentage de cellules ALDH+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip164

Figure 26 Moleacutecules drsquoadheacutesion VLA-4 LFA-1 et CXCR-4helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165

Figure 27 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CDhellip162

Figure 28 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CFChellip166

Figure 29 Nombre de CFU-F en fonction de concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168

Figure 30 Image repreacutesentative des colonies CFU-F obtenues des CSM agrave diffeacuterentes

concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip169

Figure 31 Concentrations drsquoIL-6 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172

Figure 32 Concentrations de VEGF dans les surnageants des co-cultures et cultures simples

de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 173

Figure 33 Concentrations drsquoIL-8 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Figure 34 Interactions entre CSM et cellules CD34+ agrave BC-O2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip179

Figure 35 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 10 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181

Figure 36 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 20 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

Figure 37 Scheacutema repreacutesentant le greffon avant et apregraves expansion dans nos conditions de

culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip196

10

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 Reacutesumeacute des critegraveres drsquoidentification des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

Tableau 2 Marqueurs des CSM humaines natives de la moelle osseusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

Tableau 3 Pathologies repreacutesentant les indications de la transplantation de cellules

heacutematopoiumleacutetiques allogeacuteniques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Tableau 4 Expansion de greffons issus du sang placentaire sur un support stromalhelliphelliphellip119

Tableau 5 Les anticorps monoclonaux utiliseacutes pour le pheacutenotypage de CSMhelliphelliphelliphelliphellip129

Tableau 6 Liste des anticorps monoclonaux utiliseacutes pour lrsquoanalyse pheacutenotypique du produit

drsquoexpansion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132

Tableau 7 Les diffeacuterentes conditions de cultures agrave partir desquelles les surnageants sont testeacutes

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137

Tableau 8 Analyse pheacutenotypique des CSM apregraves culture agrave 20 et 5 drsquoO2 helliphelliphelliphelliphellip171

Tableau 9 Concentrations de TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Tableau 10 Concentrations de FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 11 Concentrations drsquoIL-3 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 12 Concentrations de G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176

Tableau 13 Concentrations de TPO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177

Tableau 14 Concentrations de SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip178

Tableau 15 Les variations de seacutecreacutetion des cytokines des CSM dans les surnageantshelliphellip179

11

ABREVIATIONS 5-FU 5-FluoroUracile

A ABCG2Brcp1 ATPBinding Cassette G2Breast Cancer Resistance Protein ADN Acide DesoxyriboNucleique AGM Aorte-Gonades-Meacutesoneacutephros ALCAM Activated Lymphocyte Cell Adhesion Molecule ALDH ALdehyde DeHydrogenase AML1 Acute Myeloid Leukemia ASCs Adipose Stromal Cells Ang-1 Angiopoietine-1 ARNm Acide RiboNucleique (RNA) messager ARNT ARyl hydrocarbon Nuclear Translocator

B Baso Basophile BC-O2 Basse Concentration drsquoO2 BFU Burst Forming Unit bHLH basic Helix Loop Helix BMP Bone Morphogenic Protein BMPR Bone Morphogenic Protein Receptor BrdU 5-bromo-2rsquo-deoxyuridine BSA Bovine Serum Albumine

C C-TAD C- Terminal Transactivation Domain C1 Culture primaire CEBPα CCAATenhancer-binding protein α CAFC Cobblestone Area Forming Cell CAK CDKActivating Kinase CAR CXCL12-Abundant Reticular CBP CREB-Binding Protein CD Cluster de Diffeacuterenciation CDK Cyclin-Dependent Kinase CE Cellules Endotheacuteliales CFC Colony Forming Cell CFSE CarboxyFluoresceacuteine Succinimidyl Ester CFU Colony Forming Unit CFU-GEMM CFU Granuleuse- Erythrocytaire-Macrophagique- Megacaryocytaire CFU-Mix Colony Forming Unit-Mixte CFU-S Colony Forming Unit in the Spleen CLP Common Lymphoid Progenitor CMF Cytomeacutetrie en Flux CMN Cellules Mononucleacutees CMP Common Myeloid Progenitor CO Co-culture

12

CO2 Dioxyde de carbone CS Cellules Souches CSE Cellules Souches Embryonnaires CSH Cellule Souche Heacutematopoiumleacutetique CSHPH Cellules Souches et Progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques CSM Cellules SouchesStromales Mesenchymateuses CSP Cellules Souches Peacuteripheacuteriques CSN Cellules Souches Neurales CXCL12 CXC-type Chimiokine Ligand 12 CXCR-4 CXC-type Chimiokine Receptor 4

D DVNA Donneur adulte Volontaire Non Apparenteacute

E E Erythrocytaire ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Eo Eosinophile EPAS Endothelial PAS protein EPO Erythropoietine

F FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FD filtres de deacuteleucocytation FDCP Factor Dependent Cell paterson FGF-2 ou bFGF Fibroblaste Growth Factor- 2 basic Fibroblast Growth Factor FITC FluoreceinIsoThiCyanate FL Flt-3L Flt-3 Ligand FOXO Forkhead transcription factor bOX O

G G Granulocytaire GD2 Ganglioside GATA GATA-binding protein G-CSF Granulocytic- Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocytic Macrophagic- Colony Stimulating Factor GVHd Graft Versus Host disease GVL Graft Versus Leukemia

H H2O2 peroxyde drsquohydrogene HB-EGF Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF Hepatocye Growth Factor HIF Hypoxia Inducible Factor HLA Human Leukocyte Antigen Hox Homeobox HPP-CFC Colony Forming Cells with High Proliferative Potential HRE Hypoxia Response Element HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells

I ICAM InterCellular Adhesion Molecule

13

IDO Indole DiOxygeacutenase IFN InterFiroN IGF Insulin Growth Factor IGF-BP1 IGF-Factor-Binding-Protein IHH Indian Hedgehog Ik Ikaros IL InterLeukine IMDM Iscove Modified Dubelcco Medium iPSC induced Pluripotent Stem Cells ISCT International Society for Cellular Therapy

J Jag1 Jagged 1 JAK Janus Kinase

K KIP Kinase Inhibitor Protein KL C-kit Ligand

L LEFTCF Lymphocyte Enhancer FactorT Cell Factor LFA-1 Lymphocyte Function-associated Antigen 1 LIF Leukemia Inhibitory Factor Lin- Lineage minus LSK Lin-Sca-1+c-Kit+ LTC-IC Long Term Culture-Initiating Cell LT-CSH Long term Hematopoietic Cellule Souche Hematopoietique LTRA Long Term Repopulating Ability LT-SRC Long Term SCID-Repopulation Cell

M Mcl-1 Myeloid leukemia-1 M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Meg Megacaryocytaire MEP Megacaryocyticerythrocytic Progenitor MGDF Megakaryocyte Growth and Development Factor MGG May-Grunwald-Giemsa MIP-1α Macrophage-Inflammatory-Protein 1α MK Megakaryocyte MM Myeacutelome Multiple MMP Matrix MetalloProteinase MO Moelle Osseuse MRA Marrow Repopulating Ability

N N-TAD N-terminal TransActivation Domain NFκB Nuclear-κB Factor NGFR Neural Growth Factor Receptor NICD Notch Intracellular Domain NK Natural Killer NLS Nuclear Localization Signal

1

REMERCIEMENTS

Je tiens tout drsquoabord agrave remercier le ministegravere de lrsquoEnseignement Supeacuterieur de Syrie pour sa participation financiegravere fondamentale sans laquelle je nrsquoaurais pu reacutealiser ce travail Je remercie les membres du jury pour le temps consacreacute agrave la lecture de ce manuscrit Monsieur le Professeur Pierre TIBERGHIEN pour sa participation au jury Monsieur le Professeur Jorge DOMENECH pour avoir accepteacute le lourd travail de rapporteur de ce meacutemoire de thegravese et pour ses conseils et ses remarques pertinentes Monsieur le Professeur Jean-Jacques LATAILLADE pour avoir accepteacute drsquoeacutevaluer ce travail eacutegalement en qualiteacute de rapporteur Vos corrections et vos critiques eacutetaient cruciales pour ameacuteliorer ce meacutemoire ainsi que cette recherche Monsieur le Docteur Bruno DELORME preacutesident de Jury pour avoir accepteacute drsquoeacutevaluer ce travail de thegravese Jrsquoadresse mes sincegraveres remerciements au Docteur Zoran IVANOVIC mon Directeur de thegravese pour ses conseils ses encouragements sa disponibiliteacute sa gentillesse sa patience (je sais que jrsquoeacutetais fatiguant) son humaniteacute son appui scientifique et moral ainsi que pour sa personnaliteacute qui marque les esprits Jrsquoen ai beaucoup appris de son esprit critique (CD34+ ne cellule souche basses concentrations drsquoO2 ne hypoxie cellule souche ne pheacutenotype cellule souche = eacutetat fonctionnel hellip) cela fait partie de lrsquoalphabet de Zoran et il est impossible de les oublier Votre raisonnement concernant la culture en hypoxie est seacuteduisant Il y a un an avec mes difficulteacutes personnelles jrsquoai cru ne plus pouvoir continuer ce travail si jrsquoai pu y reacutesister crsquoest gracircce agrave son soutien Je suis vraiment reconnaissant pour vous Zoran Mes remerciements vont eacutegalement agrave Monsieur le Professeur Pierre TIBERGHIEN pour mrsquoavoir accueilli au sein de son eacutequipe Inserm 645 depuis le Master jusqursquoagrave la clocircture de ma thegravese Je remercie le Professeur Jean-Michel BOIRON et le Docteur Azzedine ASSAL de mrsquoavoir autoriseacute agrave reacutealiser cette thegravese agrave lrsquoEFS-AL site de Bordeaux Je tiens agrave remercier les membres du Laboratoire de Recherche amp de Deacuteveloppement de lrsquoEFS-AL- Bordeaux qui ont eacuteteacute pour moi comme une deuxiegraveme famille avec laquelle jrsquoai passeacute le plus clair de mon temps Bien que mon sujet principal soit un peu eacutetouffant (Hypoxie) lrsquoambiance au labo eacutetait tregraves fraiche et pleine drsquooxygegravene A Marija Vlaski je la remercie particuliegraverement de tout mon cœur pour sa contribution agrave lrsquoeacutelaboration de ce travail depuis le deacutebut Tu mrsquoas beaucoup aideacute tant sur le plan scientifique que sur le plan humain Nous nrsquoeacutetions pas bavards au laboratoire mais toutes tes remarques tes commentaires ont toujours eacuteteacute tregraves importants et tregraves utiles pour moi A Philippe Brunet de la Grange je nrsquoai pas eu le temps de te remercier avant drsquoailleurs connaissant ton caractegravere je pense que tu nrsquoen attendais pas plus Je voudrais juste te dire que ta preacutesence eacutetait deacuteterminante indispensable dans les moments cruciaux de cette thegravese Ta participation eacutetait juste essentielle pour la reacutealisation de lrsquoarticle principal de celle-ci A Jean Chevaleyre le vrai expert en cellules meacutesenchymateuses en techniques expeacuterimentales et dans la vie Vous aviez toujours une reacuteponse agrave toutes nos questions Jrsquoai appris beaucoup agrave travers nos discussions agrave la fois passionnantes et tregraves enrichissantes agreacutementeacutee de moments conviviaux et chaleureux

2

A Pascale Duchez Crsquoest elle qui a mis au point la technique de culture sur laquelle je me suis baseacute pour effectuer mon expeacuterimentation et obtenir mes reacutesultats A Laura Rodrigues la plus jeune du labo toujours souriante et radieuse malgreacute la charge de travail Merci pour ses retouches feacuteminines magiques sur ma preacutesentation de soutenance A Fontanet Bijou eacutenergie enthousiasme extraordinaire toujours disponible pour nous apporter de lrsquoaidehellip personnaliteacute inoubliable de qualiteacute tregraves rare A Elisabeth Volkman merci surtout pour tes corrections finales Je remercie le personnel de lrsquoEFS de Bordeaux en particulier le service de Controcircle Qualiteacute dirigeacute par le Docteur Xavier Lafarge qui eacutetait tregraves impliqueacute dans notre travail le service HLA dirigeacute par le Docteur Dominique Fizet le service de Theacuterapie Cellulaire dirigeacute par le Docteur Bernard Dazey et le service de Ressource Humaines dirigeacute par le Docteur Philippe Juret Je remercie lrsquoeacutequipe du Professeur Vincent Praloran et tout particuliegraverement Monsieur le Professeur Praloran pour ses remarques pendant mes preacutesentations A Yann agrave Arnaud agrave Ameacutelie hellip Merci au personnel de lrsquoUMR 5164 - partie immuno notamment veacuteronique Conrade qui effectue une partie de ses manipes agrave lrsquoEFS Merci agrave lrsquoeacutequipe du Professeur Patrick Blanco pour la reacutealisation drsquoune partie des mesures des cytokines Il me reste agrave remercier ma petite famille je te remercie Amal ma chegravere eacutepouse drsquoavoir supporteacute mon absence et de mrsquoavoir aideacute dans la reacutealisation de ce manuscrit de mrsquoavoir remplaceacute sur le front syrien Et tout cela malgreacute la preacuteparation de ton Master Je suis deacutesoleacute Lamar mon cher fils je trsquoassure que nous trouverons le temps pour jouer ensemble et trsquoaccompagner pour une fois agrave lrsquoeacutecole Je te remercie Ghoulba mon cousin pour ton aide agrave tous les niveaux Je ne sais pas avec toutes les nouvelles pressions que jrsquoai sur tous les niveaux dans mon environnement et mon micro-environnement ce que je vais devenir Est-ce que cela va mrsquoamener agrave lrsquoautorenouvellement ou agrave lrsquoengagement dans un processus de seacutenescence et drsquoapoptose Ce travail est deacutedieacute agrave ma famille en Syrie ma megravere mon pegravere agrave Raghda Dalal Rima Nidal Ebtissam Nisrin Ali Kinan et surtout agrave Arrouj hellip Une petite penseacutee va agrave mes compatriotes Syriens en espeacuterant qursquoon trouvera une fin heureuse dans la reacutesolution des conflits

3

TABLE DES MATIERES

Liste des Figures helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 Liste des Tableaux helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Abreacuteviations helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11 INTRODUCTIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16 I Heacutematopoiumlegravese 17 IA- Ontogeacutenie des Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17 IB- Hieacuterarchie du systegraveme heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 IB1- Les Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiques 18 IB2- Les progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques 22 IB3- Les preacutecurseurs 23 IB4- Les cellules matures 23 IC- Identification des cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24 IC1- Caracteacuterisation pheacutenotypique des CSH 25 IC11 Marqueurs membranaires positifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC111 Lrsquoantigegravene CD34 helliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC112 Lrsquoantigegravene CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC113 Lrsquoantigegravene CD90 (Thy11)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC114 Lrsquoantigegravene CD117 (c-Kit)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC12 Marqueurs membranaires neacutegatifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC121 Le marqueur Lin-helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC122 Lrsquoantigegravene CD38helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC123 La moleacutecule HLA-DRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC2- Caracteacuterisation meacutetabolique des CSH27 IC21 Lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme ALDHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29 IC22 Lrsquoactiviteacute des moleacutecules ROS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20

IC23 Le pheacutenotype Side Populationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20 IC24 Le cycle cellulairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31 IC3- Caracteacuterisation fonctionnelle 33 IC31 Tests in vitro 33 IC32 Tests in vivo 35 II Microenvironnement meacutedullaire et Cellules SouchesStromales Meacutesenchymateuseshelliphelliphellip40 IIA- La niche heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 IIB- Composants et reacutegulation du microenvironnement meacutedullaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43 IIB1- Le composant cellulaire44 IIB11 Cellules drsquoorigine meacutesenchymateusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44 IIB111 Les Cellules Souches Meacutesenchymateuses (CSM) helliphelliphellip 44 IIB112 Les Osteacuteoblastes 45 IIB113 Les Cellules reacuteticulaires helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

IIB114 Les Adipocytes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB12 Cellules drsquoorigine heacutematopoiumleacutetiquehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB121 Les Osteacuteoclastes 47 IIB122 Les Cellules Endotheacuteliales (CE) 47 IIB123 Les Macrophage48 IIB2- Matrice extracellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

4

IIB3- Facteurs de Croissance et Cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49 IIB31 Les cytokines stimulanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB311 Stem Cell Factor (SCF) ou C-kit Ligand (KL)helliphelliphellip50 IIB312- Flt-3 Ligand (FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB313 Thrombopoiumleacutetine (TPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51 IIB314 Lrsquointerleukine 6 (IL-6)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB315 Colony Stimulating Factors (CSF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB316 Lrsquointerleukine 3 (IL-3)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB317 LrsquoErythropoiumleacutetine (EPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB318 Lrsquointerleukine 5 (IL-5)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB319 Autres facteurs stimulateurshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB32 Les cytokines inhibitriceshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB321 Transforming Growth Factor β (TGF-β) helliphellip55 IIB322 Lrsquointerleukine 10 (IL-10)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB323 Tumor Necrosis Factor α (TN F-α)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB324 Platelet Factor 4 (PF4)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB325 Macrophage-Inflammatory-Protein 1α (MIP-1α)helliphelliphellip 55 IIB4- Autres facteurs intervenant dans la reacutegulation de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphellip56 IIB41 Les chimiokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56 IIB42 Les moleacutecules drsquoadheacutesionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip57 IIB43 Signalisations impliqueacutees dans la reacutegulation de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphellip59 IIB431 Les voies morphogegravenes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip59 IIB432 Lrsquoaxe Tie2Ang-1 et Cdh2integrinβ1c-MYC helliphelliphelliphellip61 IIB433 Le signal TPOMpl dans les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB434 Les proteacuteines BMPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB435 Les facteurs de transcriptionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip62 III Cellules Stromales meacutesenchymateuses (CSM) 64 IIIA- Sources et caracteacuteristiques des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65 IIIB- Les proprieacuteteacutes des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67 IIIC- Le rocircle des CSM dans lrsquoheacutematopoiumlegravese in vivo et ex vivo helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69 IIIC1- Meacutecanisme daction de CSM dans lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC11 Seacutecreacutetion de cytokines par les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC111 VEGF-Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC112 FGF-2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC113 HGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72 IIIC114 IL-10helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC115 IL-6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC116 SDF-1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC117 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC118 TGF-βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC12 Interaction directe CSMCSH (contact cellulaire)helliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC121 Rocircle de lrsquoadheacutesion meacutedieacutee par VCAM-1VLA-4helliphelliphellip76 IIIC122 Rocircle des voies morphogegraveneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76 IV Influence des basses concentrations drsquoO2 sur les cellules souches77 IVA- Introductionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVB- HypoxieNormoxie in situhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVC- Les concentrations drsquoO2 dans lrsquoorganisme humainhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

5

IVD- Rocircle de lrsquooxygegravene dans les cellules soucheshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD1- Les Facteurs de transcription HIF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD11 Les sous uniteacutes α helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD111 HIF-1αhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD112 HIF-2α et HIF-3αhelliphellip82 IVD12 Les sous uniteacutes β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD121 HIF-1βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD122 HIF-2β et HIF-3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD13 Les cibles de HIFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD2- Les cellules souches et les basses concentrations drsquoO2 ndash Introductionhelliphelliphellip83 IVD3- Cellules souches embryonnaires (CSE) et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip85 IVD4- Cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphellip85 IVD5- Cellules souches neurales (CSN) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86 IVD6- Cellules souches meacutesenchymateuses et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD61 La prolifeacuterationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD62 La diffeacuterenciation helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip88 IVD63 La migrationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89 IVD64 La seacutecreacutetion des facteurs solubles helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90 IVD7- Cellules souches heacutematopoiumleacutetiques et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip92 IVD71 Le cycle cellulaire des cellules heacutematopoiumleacutetiques primitiveshelliphelliphellip93 IVD72 Le stress oxydatifhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip95 IVD73 Lrsquoexpansion ex vivo de CSH et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip96 IVD74 Modulation de lrsquoeffet des cytokines helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 V Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA- La greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA1- Les diffeacuterents types de greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphellip99 VA11 Lrsquoautogreffehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA12 Lrsquoallogreffe helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip100 VA2- Les sources des CSH des greffons allogeacuteniqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA21 La moelle osseuse helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA22 Les cellules souches du sang peacuteripheacuterique mobiliseacuteeshelliphelliphelliphelliphellip102 VA23 Le Sang Placentaire (SP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip103 VA231 Inteacuterecirct du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip104 VA232 Probleacutematique de la greffe du SP helliphelliphellip106 VB- Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip107 VB1- Expeacuteriences agrave partir de Greffon meacutedullaire et du CSP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109 VB2- Expeacuteriences avec Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110 VB3- Ameacutelioration de lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112 VB4- Rocircle du support Stromal dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphellip113 VC- Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphellip115 VC1 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon meacutedullaire et CSPhelliphelliphellip115 VC2 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip116 OBJECTIFShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip120 MATERIELS ET METHODEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip123 I PROTOCOLE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124 II Preacuteparation des cellules et culture cellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA Uniteacute de sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125

6

IIA1 Isolement des cellules mononucleacutees (CMN) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA2 Purification des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIB Preacuteparation de la couche adheacuterente de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip126 III Analyse des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip127 IIIA Analyses fonctionnelles - colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)helliphellip127 IIIB Analyse pheacutenotypique des preacuteparations de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128 IV Congeacutelation et Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVA Congeacutelation des cellules helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVB Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 V Culture simple et Co-culture sur CSM des cellules CD34+ - Culture C1helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130 VA Analyses par Cytomeacutetrie en Flux (CMF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA1 Expression des Antigegravenes Membranaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA2 Activiteacute de lrsquoenzyme Aldeacutehyde Deacuteshydrogeacutenase (ALDH)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132 VB Deacutetection des cellules progeacutenitrices CFC ndash culture semi-solidehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VC Deacutetection des progeacuteniteurs primitifs Preacute-CFCs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VD Deacutetection des cellules souches SRC (Scid-Repopulating Cells)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134 VD1 Deacutetection des cellules humaines dans la moelle osseuse des souris par CMF 135 VD2 Deacutetection des progeacuteniteurs humains dans la MO des souris par test CFChellip135 VI La production des cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip136 VII Expansion de cellules CD34+ avec les surnageants de culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137 VIII Tests Statistiques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip138 RESULTATShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip139 I Article principal helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip140 II Reacutesultats Compleacutementaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip152 IIA Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de cellules totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 IIB Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154 IIC Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de CFC helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155 IID Pheacutenotypage en fin de culture (J10) reacutealiseacute sur les cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID1 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID2 Marqueurs myeacuteloiumldes (CD13 et CD33) et marqueur lymphoiumlde B CD19helliphellip157 IID3 Marqueurs de laquo primitiviteacute raquo CD133 ALDH et CD90 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID31 Lrsquoexpression du CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID32 Lrsquoactiviteacute de lrsquoALDH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID33 Lrsquoexpression du CD90helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IID4 Moleacutecules drsquoadheacutesion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IIE Activiteacute (SRC) - analyse de xeacutenogreffe dans les conditions avec ou sans IL-3helliphelliphellip160 IIE1 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions avec IL-3 SRC-CDhelliphelliphellip160 IIE2 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions sans IL-3 SRC-CDhelliphellip163 IIE3 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions avec IL-3 SRC-CFChellip164 IIE4 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions sans IL-3 SRC-CFChellip165 III Travaux sur les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip167 IIIA Caracteacuterisation des preacuteparations de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168 IIIA1 Production de colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)168 IIIA2 Effet de basses concentrations drsquoO2 sur le pheacutenotype des CSMhellip169 IIIA3 Impact des taux dO2 sur la seacutecreacutetion des cytokines par les CSMhelliphelliphelliphellip172 IIIA31 IL-6 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172 IIIA32 VEGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173

7

IIIA33 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173 IIIA34 TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA35 FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA36 IL-3helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175 IIIA37 G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA38 TPOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA39 SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177 IIIA310 IL-4 GM-CSF IL-17A IL-1β IL-10 HGF et TNF-αhelliphelliphelliphellip178 IIIB Impact des surnageants sur la culture de CD34+ SP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip180

IIIB1 Condition 1 10 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 IIIB2 Condition 2 20 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

DISCUSSION helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip184 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip194 BIBLIOGRAPHIEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip198 ANNEXEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip234 Article 1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip236 Article 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip244 Communications aux colloqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip250 RESUMEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip251

8

LISTE DES FIGURES

Figure 1 Les sites de lrsquoheacutematopoiumlegravese fœtale helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figure 2 Scheacutema geacuteneacuterale de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

Figure 3 Divisions symeacutetrique et asymeacutetrique des CSH dans le temps (t)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22

Figure 4 Analyse par Cytomeacutetrie en Flux du pheacutenotypage Side Population sur des CMN Lin-

meacutedullaires humaineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31

Figure 5 Hieacuterarchie des CSH et des progeacuteniteurs deacutependant de meacutethode de deacutetectionhelliphelliphellip35

Figure 6 Niches reacuteticulaires creacuteeacutees par les progeacuteniteurs meacutesenchymateux pouvant maintenir

et reacuteguler les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

Figure 7 Illustration abreacutegeacutee de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figure 8 Concentration en oxygegravene dans les principaux organes du corps humainhelliphelliphelliphellip79

Figure 9 Les niches de certaines cellules souches avec leurs concentrations physiologiques

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip84

Figure 10 Expansion de greffon heacutematopoiumleacutetique en fonction des concentrations

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip97

Figure 11 Evolution de la reacutepartition des indications dallogreffe en Francehelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Figure 12 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques en France

entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 13 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques non-

apparenteacutes en France entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 14 le principe de lrsquoexpansion ex vivo de greffon heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphellip108

Figure 15 Illustration du modegravele expeacuterimental helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip122

Figure 16 Culture de cellules stromales meacutesenchymateuses humaines issues de la moelle

Osseuse avec de diffeacuterents grossissementshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128

Figure 17 Systegraveme de mini-chambre agrave O2 controcircleacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130

Figure 18 La culture secondairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134

Figure 19 Scheacutema repreacutesentant le test in vivo de xeacutenogreffe aux souris NOGSCIDhelliphellip135

Figure 20 Taux dexpansion des cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

Figure 21 Taux dexpansion des cellules CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

9

Figure 22 Taux dexpansion des progeacuteniteurs CFChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155

Figure 23 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip157

Figure 24 Pourcentage de cellules CD133+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip163

Figure 25 Pourcentage de cellules ALDH+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip164

Figure 26 Moleacutecules drsquoadheacutesion VLA-4 LFA-1 et CXCR-4helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165

Figure 27 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CDhellip162

Figure 28 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CFChellip166

Figure 29 Nombre de CFU-F en fonction de concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168

Figure 30 Image repreacutesentative des colonies CFU-F obtenues des CSM agrave diffeacuterentes

concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip169

Figure 31 Concentrations drsquoIL-6 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172

Figure 32 Concentrations de VEGF dans les surnageants des co-cultures et cultures simples

de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 173

Figure 33 Concentrations drsquoIL-8 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Figure 34 Interactions entre CSM et cellules CD34+ agrave BC-O2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip179

Figure 35 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 10 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181

Figure 36 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 20 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

Figure 37 Scheacutema repreacutesentant le greffon avant et apregraves expansion dans nos conditions de

culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip196

10

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 Reacutesumeacute des critegraveres drsquoidentification des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

Tableau 2 Marqueurs des CSM humaines natives de la moelle osseusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

Tableau 3 Pathologies repreacutesentant les indications de la transplantation de cellules

heacutematopoiumleacutetiques allogeacuteniques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Tableau 4 Expansion de greffons issus du sang placentaire sur un support stromalhelliphelliphellip119

Tableau 5 Les anticorps monoclonaux utiliseacutes pour le pheacutenotypage de CSMhelliphelliphelliphelliphellip129

Tableau 6 Liste des anticorps monoclonaux utiliseacutes pour lrsquoanalyse pheacutenotypique du produit

drsquoexpansion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132

Tableau 7 Les diffeacuterentes conditions de cultures agrave partir desquelles les surnageants sont testeacutes

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137

Tableau 8 Analyse pheacutenotypique des CSM apregraves culture agrave 20 et 5 drsquoO2 helliphelliphelliphelliphellip171

Tableau 9 Concentrations de TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Tableau 10 Concentrations de FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 11 Concentrations drsquoIL-3 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 12 Concentrations de G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176

Tableau 13 Concentrations de TPO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177

Tableau 14 Concentrations de SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip178

Tableau 15 Les variations de seacutecreacutetion des cytokines des CSM dans les surnageantshelliphellip179

11

ABREVIATIONS 5-FU 5-FluoroUracile

A ABCG2Brcp1 ATPBinding Cassette G2Breast Cancer Resistance Protein ADN Acide DesoxyriboNucleique AGM Aorte-Gonades-Meacutesoneacutephros ALCAM Activated Lymphocyte Cell Adhesion Molecule ALDH ALdehyde DeHydrogenase AML1 Acute Myeloid Leukemia ASCs Adipose Stromal Cells Ang-1 Angiopoietine-1 ARNm Acide RiboNucleique (RNA) messager ARNT ARyl hydrocarbon Nuclear Translocator

B Baso Basophile BC-O2 Basse Concentration drsquoO2 BFU Burst Forming Unit bHLH basic Helix Loop Helix BMP Bone Morphogenic Protein BMPR Bone Morphogenic Protein Receptor BrdU 5-bromo-2rsquo-deoxyuridine BSA Bovine Serum Albumine

C C-TAD C- Terminal Transactivation Domain C1 Culture primaire CEBPα CCAATenhancer-binding protein α CAFC Cobblestone Area Forming Cell CAK CDKActivating Kinase CAR CXCL12-Abundant Reticular CBP CREB-Binding Protein CD Cluster de Diffeacuterenciation CDK Cyclin-Dependent Kinase CE Cellules Endotheacuteliales CFC Colony Forming Cell CFSE CarboxyFluoresceacuteine Succinimidyl Ester CFU Colony Forming Unit CFU-GEMM CFU Granuleuse- Erythrocytaire-Macrophagique- Megacaryocytaire CFU-Mix Colony Forming Unit-Mixte CFU-S Colony Forming Unit in the Spleen CLP Common Lymphoid Progenitor CMF Cytomeacutetrie en Flux CMN Cellules Mononucleacutees CMP Common Myeloid Progenitor CO Co-culture

12

CO2 Dioxyde de carbone CS Cellules Souches CSE Cellules Souches Embryonnaires CSH Cellule Souche Heacutematopoiumleacutetique CSHPH Cellules Souches et Progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques CSM Cellules SouchesStromales Mesenchymateuses CSP Cellules Souches Peacuteripheacuteriques CSN Cellules Souches Neurales CXCL12 CXC-type Chimiokine Ligand 12 CXCR-4 CXC-type Chimiokine Receptor 4

D DVNA Donneur adulte Volontaire Non Apparenteacute

E E Erythrocytaire ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Eo Eosinophile EPAS Endothelial PAS protein EPO Erythropoietine

F FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FD filtres de deacuteleucocytation FDCP Factor Dependent Cell paterson FGF-2 ou bFGF Fibroblaste Growth Factor- 2 basic Fibroblast Growth Factor FITC FluoreceinIsoThiCyanate FL Flt-3L Flt-3 Ligand FOXO Forkhead transcription factor bOX O

G G Granulocytaire GD2 Ganglioside GATA GATA-binding protein G-CSF Granulocytic- Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocytic Macrophagic- Colony Stimulating Factor GVHd Graft Versus Host disease GVL Graft Versus Leukemia

H H2O2 peroxyde drsquohydrogene HB-EGF Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF Hepatocye Growth Factor HIF Hypoxia Inducible Factor HLA Human Leukocyte Antigen Hox Homeobox HPP-CFC Colony Forming Cells with High Proliferative Potential HRE Hypoxia Response Element HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells

I ICAM InterCellular Adhesion Molecule

13

IDO Indole DiOxygeacutenase IFN InterFiroN IGF Insulin Growth Factor IGF-BP1 IGF-Factor-Binding-Protein IHH Indian Hedgehog Ik Ikaros IL InterLeukine IMDM Iscove Modified Dubelcco Medium iPSC induced Pluripotent Stem Cells ISCT International Society for Cellular Therapy

J Jag1 Jagged 1 JAK Janus Kinase

K KIP Kinase Inhibitor Protein KL C-kit Ligand

L LEFTCF Lymphocyte Enhancer FactorT Cell Factor LFA-1 Lymphocyte Function-associated Antigen 1 LIF Leukemia Inhibitory Factor Lin- Lineage minus LSK Lin-Sca-1+c-Kit+ LTC-IC Long Term Culture-Initiating Cell LT-CSH Long term Hematopoietic Cellule Souche Hematopoietique LTRA Long Term Repopulating Ability LT-SRC Long Term SCID-Repopulation Cell

M Mcl-1 Myeloid leukemia-1 M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Meg Megacaryocytaire MEP Megacaryocyticerythrocytic Progenitor MGDF Megakaryocyte Growth and Development Factor MGG May-Grunwald-Giemsa MIP-1α Macrophage-Inflammatory-Protein 1α MK Megakaryocyte MM Myeacutelome Multiple MMP Matrix MetalloProteinase MO Moelle Osseuse MRA Marrow Repopulating Ability

N N-TAD N-terminal TransActivation Domain NFκB Nuclear-κB Factor NGFR Neural Growth Factor Receptor NICD Notch Intracellular Domain NK Natural Killer NLS Nuclear Localization Signal

2

A Pascale Duchez Crsquoest elle qui a mis au point la technique de culture sur laquelle je me suis baseacute pour effectuer mon expeacuterimentation et obtenir mes reacutesultats A Laura Rodrigues la plus jeune du labo toujours souriante et radieuse malgreacute la charge de travail Merci pour ses retouches feacuteminines magiques sur ma preacutesentation de soutenance A Fontanet Bijou eacutenergie enthousiasme extraordinaire toujours disponible pour nous apporter de lrsquoaidehellip personnaliteacute inoubliable de qualiteacute tregraves rare A Elisabeth Volkman merci surtout pour tes corrections finales Je remercie le personnel de lrsquoEFS de Bordeaux en particulier le service de Controcircle Qualiteacute dirigeacute par le Docteur Xavier Lafarge qui eacutetait tregraves impliqueacute dans notre travail le service HLA dirigeacute par le Docteur Dominique Fizet le service de Theacuterapie Cellulaire dirigeacute par le Docteur Bernard Dazey et le service de Ressource Humaines dirigeacute par le Docteur Philippe Juret Je remercie lrsquoeacutequipe du Professeur Vincent Praloran et tout particuliegraverement Monsieur le Professeur Praloran pour ses remarques pendant mes preacutesentations A Yann agrave Arnaud agrave Ameacutelie hellip Merci au personnel de lrsquoUMR 5164 - partie immuno notamment veacuteronique Conrade qui effectue une partie de ses manipes agrave lrsquoEFS Merci agrave lrsquoeacutequipe du Professeur Patrick Blanco pour la reacutealisation drsquoune partie des mesures des cytokines Il me reste agrave remercier ma petite famille je te remercie Amal ma chegravere eacutepouse drsquoavoir supporteacute mon absence et de mrsquoavoir aideacute dans la reacutealisation de ce manuscrit de mrsquoavoir remplaceacute sur le front syrien Et tout cela malgreacute la preacuteparation de ton Master Je suis deacutesoleacute Lamar mon cher fils je trsquoassure que nous trouverons le temps pour jouer ensemble et trsquoaccompagner pour une fois agrave lrsquoeacutecole Je te remercie Ghoulba mon cousin pour ton aide agrave tous les niveaux Je ne sais pas avec toutes les nouvelles pressions que jrsquoai sur tous les niveaux dans mon environnement et mon micro-environnement ce que je vais devenir Est-ce que cela va mrsquoamener agrave lrsquoautorenouvellement ou agrave lrsquoengagement dans un processus de seacutenescence et drsquoapoptose Ce travail est deacutedieacute agrave ma famille en Syrie ma megravere mon pegravere agrave Raghda Dalal Rima Nidal Ebtissam Nisrin Ali Kinan et surtout agrave Arrouj hellip Une petite penseacutee va agrave mes compatriotes Syriens en espeacuterant qursquoon trouvera une fin heureuse dans la reacutesolution des conflits

3

TABLE DES MATIERES

Liste des Figures helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 Liste des Tableaux helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Abreacuteviations helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11 INTRODUCTIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16 I Heacutematopoiumlegravese 17 IA- Ontogeacutenie des Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17 IB- Hieacuterarchie du systegraveme heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 IB1- Les Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiques 18 IB2- Les progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques 22 IB3- Les preacutecurseurs 23 IB4- Les cellules matures 23 IC- Identification des cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24 IC1- Caracteacuterisation pheacutenotypique des CSH 25 IC11 Marqueurs membranaires positifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC111 Lrsquoantigegravene CD34 helliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC112 Lrsquoantigegravene CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC113 Lrsquoantigegravene CD90 (Thy11)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC114 Lrsquoantigegravene CD117 (c-Kit)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC12 Marqueurs membranaires neacutegatifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC121 Le marqueur Lin-helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC122 Lrsquoantigegravene CD38helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC123 La moleacutecule HLA-DRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC2- Caracteacuterisation meacutetabolique des CSH27 IC21 Lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme ALDHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29 IC22 Lrsquoactiviteacute des moleacutecules ROS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20

IC23 Le pheacutenotype Side Populationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20 IC24 Le cycle cellulairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31 IC3- Caracteacuterisation fonctionnelle 33 IC31 Tests in vitro 33 IC32 Tests in vivo 35 II Microenvironnement meacutedullaire et Cellules SouchesStromales Meacutesenchymateuseshelliphelliphellip40 IIA- La niche heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 IIB- Composants et reacutegulation du microenvironnement meacutedullaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43 IIB1- Le composant cellulaire44 IIB11 Cellules drsquoorigine meacutesenchymateusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44 IIB111 Les Cellules Souches Meacutesenchymateuses (CSM) helliphelliphellip 44 IIB112 Les Osteacuteoblastes 45 IIB113 Les Cellules reacuteticulaires helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

IIB114 Les Adipocytes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB12 Cellules drsquoorigine heacutematopoiumleacutetiquehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB121 Les Osteacuteoclastes 47 IIB122 Les Cellules Endotheacuteliales (CE) 47 IIB123 Les Macrophage48 IIB2- Matrice extracellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

4

IIB3- Facteurs de Croissance et Cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49 IIB31 Les cytokines stimulanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB311 Stem Cell Factor (SCF) ou C-kit Ligand (KL)helliphelliphellip50 IIB312- Flt-3 Ligand (FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB313 Thrombopoiumleacutetine (TPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51 IIB314 Lrsquointerleukine 6 (IL-6)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB315 Colony Stimulating Factors (CSF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB316 Lrsquointerleukine 3 (IL-3)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB317 LrsquoErythropoiumleacutetine (EPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB318 Lrsquointerleukine 5 (IL-5)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB319 Autres facteurs stimulateurshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB32 Les cytokines inhibitriceshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB321 Transforming Growth Factor β (TGF-β) helliphellip55 IIB322 Lrsquointerleukine 10 (IL-10)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB323 Tumor Necrosis Factor α (TN F-α)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB324 Platelet Factor 4 (PF4)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB325 Macrophage-Inflammatory-Protein 1α (MIP-1α)helliphelliphellip 55 IIB4- Autres facteurs intervenant dans la reacutegulation de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphellip56 IIB41 Les chimiokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56 IIB42 Les moleacutecules drsquoadheacutesionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip57 IIB43 Signalisations impliqueacutees dans la reacutegulation de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphellip59 IIB431 Les voies morphogegravenes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip59 IIB432 Lrsquoaxe Tie2Ang-1 et Cdh2integrinβ1c-MYC helliphelliphelliphellip61 IIB433 Le signal TPOMpl dans les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB434 Les proteacuteines BMPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB435 Les facteurs de transcriptionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip62 III Cellules Stromales meacutesenchymateuses (CSM) 64 IIIA- Sources et caracteacuteristiques des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65 IIIB- Les proprieacuteteacutes des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67 IIIC- Le rocircle des CSM dans lrsquoheacutematopoiumlegravese in vivo et ex vivo helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69 IIIC1- Meacutecanisme daction de CSM dans lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC11 Seacutecreacutetion de cytokines par les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC111 VEGF-Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC112 FGF-2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC113 HGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72 IIIC114 IL-10helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC115 IL-6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC116 SDF-1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC117 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC118 TGF-βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC12 Interaction directe CSMCSH (contact cellulaire)helliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC121 Rocircle de lrsquoadheacutesion meacutedieacutee par VCAM-1VLA-4helliphelliphellip76 IIIC122 Rocircle des voies morphogegraveneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76 IV Influence des basses concentrations drsquoO2 sur les cellules souches77 IVA- Introductionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVB- HypoxieNormoxie in situhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVC- Les concentrations drsquoO2 dans lrsquoorganisme humainhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

5

IVD- Rocircle de lrsquooxygegravene dans les cellules soucheshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD1- Les Facteurs de transcription HIF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD11 Les sous uniteacutes α helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD111 HIF-1αhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD112 HIF-2α et HIF-3αhelliphellip82 IVD12 Les sous uniteacutes β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD121 HIF-1βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD122 HIF-2β et HIF-3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD13 Les cibles de HIFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD2- Les cellules souches et les basses concentrations drsquoO2 ndash Introductionhelliphelliphellip83 IVD3- Cellules souches embryonnaires (CSE) et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip85 IVD4- Cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphellip85 IVD5- Cellules souches neurales (CSN) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86 IVD6- Cellules souches meacutesenchymateuses et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD61 La prolifeacuterationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD62 La diffeacuterenciation helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip88 IVD63 La migrationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89 IVD64 La seacutecreacutetion des facteurs solubles helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90 IVD7- Cellules souches heacutematopoiumleacutetiques et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip92 IVD71 Le cycle cellulaire des cellules heacutematopoiumleacutetiques primitiveshelliphelliphellip93 IVD72 Le stress oxydatifhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip95 IVD73 Lrsquoexpansion ex vivo de CSH et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip96 IVD74 Modulation de lrsquoeffet des cytokines helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 V Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA- La greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA1- Les diffeacuterents types de greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphellip99 VA11 Lrsquoautogreffehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA12 Lrsquoallogreffe helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip100 VA2- Les sources des CSH des greffons allogeacuteniqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA21 La moelle osseuse helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA22 Les cellules souches du sang peacuteripheacuterique mobiliseacuteeshelliphelliphelliphelliphellip102 VA23 Le Sang Placentaire (SP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip103 VA231 Inteacuterecirct du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip104 VA232 Probleacutematique de la greffe du SP helliphelliphellip106 VB- Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip107 VB1- Expeacuteriences agrave partir de Greffon meacutedullaire et du CSP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109 VB2- Expeacuteriences avec Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110 VB3- Ameacutelioration de lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112 VB4- Rocircle du support Stromal dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphellip113 VC- Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphellip115 VC1 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon meacutedullaire et CSPhelliphelliphellip115 VC2 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip116 OBJECTIFShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip120 MATERIELS ET METHODEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip123 I PROTOCOLE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124 II Preacuteparation des cellules et culture cellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA Uniteacute de sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125

6

IIA1 Isolement des cellules mononucleacutees (CMN) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA2 Purification des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIB Preacuteparation de la couche adheacuterente de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip126 III Analyse des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip127 IIIA Analyses fonctionnelles - colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)helliphellip127 IIIB Analyse pheacutenotypique des preacuteparations de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128 IV Congeacutelation et Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVA Congeacutelation des cellules helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVB Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 V Culture simple et Co-culture sur CSM des cellules CD34+ - Culture C1helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130 VA Analyses par Cytomeacutetrie en Flux (CMF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA1 Expression des Antigegravenes Membranaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA2 Activiteacute de lrsquoenzyme Aldeacutehyde Deacuteshydrogeacutenase (ALDH)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132 VB Deacutetection des cellules progeacutenitrices CFC ndash culture semi-solidehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VC Deacutetection des progeacuteniteurs primitifs Preacute-CFCs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VD Deacutetection des cellules souches SRC (Scid-Repopulating Cells)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134 VD1 Deacutetection des cellules humaines dans la moelle osseuse des souris par CMF 135 VD2 Deacutetection des progeacuteniteurs humains dans la MO des souris par test CFChellip135 VI La production des cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip136 VII Expansion de cellules CD34+ avec les surnageants de culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137 VIII Tests Statistiques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip138 RESULTATShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip139 I Article principal helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip140 II Reacutesultats Compleacutementaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip152 IIA Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de cellules totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 IIB Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154 IIC Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de CFC helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155 IID Pheacutenotypage en fin de culture (J10) reacutealiseacute sur les cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID1 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID2 Marqueurs myeacuteloiumldes (CD13 et CD33) et marqueur lymphoiumlde B CD19helliphellip157 IID3 Marqueurs de laquo primitiviteacute raquo CD133 ALDH et CD90 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID31 Lrsquoexpression du CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID32 Lrsquoactiviteacute de lrsquoALDH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID33 Lrsquoexpression du CD90helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IID4 Moleacutecules drsquoadheacutesion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IIE Activiteacute (SRC) - analyse de xeacutenogreffe dans les conditions avec ou sans IL-3helliphelliphellip160 IIE1 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions avec IL-3 SRC-CDhelliphelliphellip160 IIE2 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions sans IL-3 SRC-CDhelliphellip163 IIE3 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions avec IL-3 SRC-CFChellip164 IIE4 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions sans IL-3 SRC-CFChellip165 III Travaux sur les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip167 IIIA Caracteacuterisation des preacuteparations de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168 IIIA1 Production de colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)168 IIIA2 Effet de basses concentrations drsquoO2 sur le pheacutenotype des CSMhellip169 IIIA3 Impact des taux dO2 sur la seacutecreacutetion des cytokines par les CSMhelliphelliphelliphellip172 IIIA31 IL-6 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172 IIIA32 VEGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173

7

IIIA33 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173 IIIA34 TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA35 FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA36 IL-3helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175 IIIA37 G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA38 TPOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA39 SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177 IIIA310 IL-4 GM-CSF IL-17A IL-1β IL-10 HGF et TNF-αhelliphelliphelliphellip178 IIIB Impact des surnageants sur la culture de CD34+ SP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip180

IIIB1 Condition 1 10 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 IIIB2 Condition 2 20 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

DISCUSSION helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip184 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip194 BIBLIOGRAPHIEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip198 ANNEXEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip234 Article 1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip236 Article 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip244 Communications aux colloqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip250 RESUMEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip251

8

LISTE DES FIGURES

Figure 1 Les sites de lrsquoheacutematopoiumlegravese fœtale helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figure 2 Scheacutema geacuteneacuterale de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

Figure 3 Divisions symeacutetrique et asymeacutetrique des CSH dans le temps (t)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22

Figure 4 Analyse par Cytomeacutetrie en Flux du pheacutenotypage Side Population sur des CMN Lin-

meacutedullaires humaineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31

Figure 5 Hieacuterarchie des CSH et des progeacuteniteurs deacutependant de meacutethode de deacutetectionhelliphelliphellip35

Figure 6 Niches reacuteticulaires creacuteeacutees par les progeacuteniteurs meacutesenchymateux pouvant maintenir

et reacuteguler les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

Figure 7 Illustration abreacutegeacutee de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figure 8 Concentration en oxygegravene dans les principaux organes du corps humainhelliphelliphelliphellip79

Figure 9 Les niches de certaines cellules souches avec leurs concentrations physiologiques

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip84

Figure 10 Expansion de greffon heacutematopoiumleacutetique en fonction des concentrations

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip97

Figure 11 Evolution de la reacutepartition des indications dallogreffe en Francehelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Figure 12 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques en France

entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 13 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques non-

apparenteacutes en France entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 14 le principe de lrsquoexpansion ex vivo de greffon heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphellip108

Figure 15 Illustration du modegravele expeacuterimental helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip122

Figure 16 Culture de cellules stromales meacutesenchymateuses humaines issues de la moelle

Osseuse avec de diffeacuterents grossissementshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128

Figure 17 Systegraveme de mini-chambre agrave O2 controcircleacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130

Figure 18 La culture secondairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134

Figure 19 Scheacutema repreacutesentant le test in vivo de xeacutenogreffe aux souris NOGSCIDhelliphellip135

Figure 20 Taux dexpansion des cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

Figure 21 Taux dexpansion des cellules CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

9

Figure 22 Taux dexpansion des progeacuteniteurs CFChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155

Figure 23 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip157

Figure 24 Pourcentage de cellules CD133+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip163

Figure 25 Pourcentage de cellules ALDH+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip164

Figure 26 Moleacutecules drsquoadheacutesion VLA-4 LFA-1 et CXCR-4helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165

Figure 27 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CDhellip162

Figure 28 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CFChellip166

Figure 29 Nombre de CFU-F en fonction de concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168

Figure 30 Image repreacutesentative des colonies CFU-F obtenues des CSM agrave diffeacuterentes

concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip169

Figure 31 Concentrations drsquoIL-6 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172

Figure 32 Concentrations de VEGF dans les surnageants des co-cultures et cultures simples

de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 173

Figure 33 Concentrations drsquoIL-8 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Figure 34 Interactions entre CSM et cellules CD34+ agrave BC-O2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip179

Figure 35 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 10 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181

Figure 36 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 20 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

Figure 37 Scheacutema repreacutesentant le greffon avant et apregraves expansion dans nos conditions de

culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip196

10

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 Reacutesumeacute des critegraveres drsquoidentification des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

Tableau 2 Marqueurs des CSM humaines natives de la moelle osseusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

Tableau 3 Pathologies repreacutesentant les indications de la transplantation de cellules

heacutematopoiumleacutetiques allogeacuteniques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Tableau 4 Expansion de greffons issus du sang placentaire sur un support stromalhelliphelliphellip119

Tableau 5 Les anticorps monoclonaux utiliseacutes pour le pheacutenotypage de CSMhelliphelliphelliphelliphellip129

Tableau 6 Liste des anticorps monoclonaux utiliseacutes pour lrsquoanalyse pheacutenotypique du produit

drsquoexpansion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132

Tableau 7 Les diffeacuterentes conditions de cultures agrave partir desquelles les surnageants sont testeacutes

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137

Tableau 8 Analyse pheacutenotypique des CSM apregraves culture agrave 20 et 5 drsquoO2 helliphelliphelliphelliphellip171

Tableau 9 Concentrations de TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Tableau 10 Concentrations de FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 11 Concentrations drsquoIL-3 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 12 Concentrations de G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176

Tableau 13 Concentrations de TPO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177

Tableau 14 Concentrations de SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip178

Tableau 15 Les variations de seacutecreacutetion des cytokines des CSM dans les surnageantshelliphellip179

11

ABREVIATIONS 5-FU 5-FluoroUracile

A ABCG2Brcp1 ATPBinding Cassette G2Breast Cancer Resistance Protein ADN Acide DesoxyriboNucleique AGM Aorte-Gonades-Meacutesoneacutephros ALCAM Activated Lymphocyte Cell Adhesion Molecule ALDH ALdehyde DeHydrogenase AML1 Acute Myeloid Leukemia ASCs Adipose Stromal Cells Ang-1 Angiopoietine-1 ARNm Acide RiboNucleique (RNA) messager ARNT ARyl hydrocarbon Nuclear Translocator

B Baso Basophile BC-O2 Basse Concentration drsquoO2 BFU Burst Forming Unit bHLH basic Helix Loop Helix BMP Bone Morphogenic Protein BMPR Bone Morphogenic Protein Receptor BrdU 5-bromo-2rsquo-deoxyuridine BSA Bovine Serum Albumine

C C-TAD C- Terminal Transactivation Domain C1 Culture primaire CEBPα CCAATenhancer-binding protein α CAFC Cobblestone Area Forming Cell CAK CDKActivating Kinase CAR CXCL12-Abundant Reticular CBP CREB-Binding Protein CD Cluster de Diffeacuterenciation CDK Cyclin-Dependent Kinase CE Cellules Endotheacuteliales CFC Colony Forming Cell CFSE CarboxyFluoresceacuteine Succinimidyl Ester CFU Colony Forming Unit CFU-GEMM CFU Granuleuse- Erythrocytaire-Macrophagique- Megacaryocytaire CFU-Mix Colony Forming Unit-Mixte CFU-S Colony Forming Unit in the Spleen CLP Common Lymphoid Progenitor CMF Cytomeacutetrie en Flux CMN Cellules Mononucleacutees CMP Common Myeloid Progenitor CO Co-culture

12

CO2 Dioxyde de carbone CS Cellules Souches CSE Cellules Souches Embryonnaires CSH Cellule Souche Heacutematopoiumleacutetique CSHPH Cellules Souches et Progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques CSM Cellules SouchesStromales Mesenchymateuses CSP Cellules Souches Peacuteripheacuteriques CSN Cellules Souches Neurales CXCL12 CXC-type Chimiokine Ligand 12 CXCR-4 CXC-type Chimiokine Receptor 4

D DVNA Donneur adulte Volontaire Non Apparenteacute

E E Erythrocytaire ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Eo Eosinophile EPAS Endothelial PAS protein EPO Erythropoietine

F FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FD filtres de deacuteleucocytation FDCP Factor Dependent Cell paterson FGF-2 ou bFGF Fibroblaste Growth Factor- 2 basic Fibroblast Growth Factor FITC FluoreceinIsoThiCyanate FL Flt-3L Flt-3 Ligand FOXO Forkhead transcription factor bOX O

G G Granulocytaire GD2 Ganglioside GATA GATA-binding protein G-CSF Granulocytic- Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocytic Macrophagic- Colony Stimulating Factor GVHd Graft Versus Host disease GVL Graft Versus Leukemia

H H2O2 peroxyde drsquohydrogene HB-EGF Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF Hepatocye Growth Factor HIF Hypoxia Inducible Factor HLA Human Leukocyte Antigen Hox Homeobox HPP-CFC Colony Forming Cells with High Proliferative Potential HRE Hypoxia Response Element HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells

I ICAM InterCellular Adhesion Molecule

13

IDO Indole DiOxygeacutenase IFN InterFiroN IGF Insulin Growth Factor IGF-BP1 IGF-Factor-Binding-Protein IHH Indian Hedgehog Ik Ikaros IL InterLeukine IMDM Iscove Modified Dubelcco Medium iPSC induced Pluripotent Stem Cells ISCT International Society for Cellular Therapy

J Jag1 Jagged 1 JAK Janus Kinase

K KIP Kinase Inhibitor Protein KL C-kit Ligand

L LEFTCF Lymphocyte Enhancer FactorT Cell Factor LFA-1 Lymphocyte Function-associated Antigen 1 LIF Leukemia Inhibitory Factor Lin- Lineage minus LSK Lin-Sca-1+c-Kit+ LTC-IC Long Term Culture-Initiating Cell LT-CSH Long term Hematopoietic Cellule Souche Hematopoietique LTRA Long Term Repopulating Ability LT-SRC Long Term SCID-Repopulation Cell

M Mcl-1 Myeloid leukemia-1 M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Meg Megacaryocytaire MEP Megacaryocyticerythrocytic Progenitor MGDF Megakaryocyte Growth and Development Factor MGG May-Grunwald-Giemsa MIP-1α Macrophage-Inflammatory-Protein 1α MK Megakaryocyte MM Myeacutelome Multiple MMP Matrix MetalloProteinase MO Moelle Osseuse MRA Marrow Repopulating Ability

N N-TAD N-terminal TransActivation Domain NFκB Nuclear-κB Factor NGFR Neural Growth Factor Receptor NICD Notch Intracellular Domain NK Natural Killer NLS Nuclear Localization Signal

3

TABLE DES MATIERES

Liste des Figures helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 Liste des Tableaux helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Abreacuteviations helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11 INTRODUCTIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16 I Heacutematopoiumlegravese 17 IA- Ontogeacutenie des Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17 IB- Hieacuterarchie du systegraveme heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 IB1- Les Cellules Souches Heacutematopoiumleacutetiques 18 IB2- Les progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques 22 IB3- Les preacutecurseurs 23 IB4- Les cellules matures 23 IC- Identification des cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24 IC1- Caracteacuterisation pheacutenotypique des CSH 25 IC11 Marqueurs membranaires positifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC111 Lrsquoantigegravene CD34 helliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC112 Lrsquoantigegravene CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25 IC113 Lrsquoantigegravene CD90 (Thy11)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC114 Lrsquoantigegravene CD117 (c-Kit)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip27 IC12 Marqueurs membranaires neacutegatifs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC121 Le marqueur Lin-helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC122 Lrsquoantigegravene CD38helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC123 La moleacutecule HLA-DRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28 IC2- Caracteacuterisation meacutetabolique des CSH27 IC21 Lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme ALDHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29 IC22 Lrsquoactiviteacute des moleacutecules ROS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20

IC23 Le pheacutenotype Side Populationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20 IC24 Le cycle cellulairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31 IC3- Caracteacuterisation fonctionnelle 33 IC31 Tests in vitro 33 IC32 Tests in vivo 35 II Microenvironnement meacutedullaire et Cellules SouchesStromales Meacutesenchymateuseshelliphelliphellip40 IIA- La niche heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40 IIB- Composants et reacutegulation du microenvironnement meacutedullaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43 IIB1- Le composant cellulaire44 IIB11 Cellules drsquoorigine meacutesenchymateusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44 IIB111 Les Cellules Souches Meacutesenchymateuses (CSM) helliphelliphellip 44 IIB112 Les Osteacuteoblastes 45 IIB113 Les Cellules reacuteticulaires helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

IIB114 Les Adipocytes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB12 Cellules drsquoorigine heacutematopoiumleacutetiquehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip47 IIB121 Les Osteacuteoclastes 47 IIB122 Les Cellules Endotheacuteliales (CE) 47 IIB123 Les Macrophage48 IIB2- Matrice extracellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

4

IIB3- Facteurs de Croissance et Cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49 IIB31 Les cytokines stimulanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB311 Stem Cell Factor (SCF) ou C-kit Ligand (KL)helliphelliphellip50 IIB312- Flt-3 Ligand (FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip50 IIB313 Thrombopoiumleacutetine (TPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51 IIB314 Lrsquointerleukine 6 (IL-6)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB315 Colony Stimulating Factors (CSF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB316 Lrsquointerleukine 3 (IL-3)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52 IIB317 LrsquoErythropoiumleacutetine (EPO)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB318 Lrsquointerleukine 5 (IL-5)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB319 Autres facteurs stimulateurshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip54 IIB32 Les cytokines inhibitriceshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB321 Transforming Growth Factor β (TGF-β) helliphellip55 IIB322 Lrsquointerleukine 10 (IL-10)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB323 Tumor Necrosis Factor α (TN F-α)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB324 Platelet Factor 4 (PF4)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55 IIB325 Macrophage-Inflammatory-Protein 1α (MIP-1α)helliphelliphellip 55 IIB4- Autres facteurs intervenant dans la reacutegulation de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphellip56 IIB41 Les chimiokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip56 IIB42 Les moleacutecules drsquoadheacutesionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip helliphelliphelliphelliphelliphellip57 IIB43 Signalisations impliqueacutees dans la reacutegulation de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphellip59 IIB431 Les voies morphogegravenes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip59 IIB432 Lrsquoaxe Tie2Ang-1 et Cdh2integrinβ1c-MYC helliphelliphelliphellip61 IIB433 Le signal TPOMpl dans les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB434 Les proteacuteines BMPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip61 IIB435 Les facteurs de transcriptionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip62 III Cellules Stromales meacutesenchymateuses (CSM) 64 IIIA- Sources et caracteacuteristiques des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65 IIIB- Les proprieacuteteacutes des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67 IIIC- Le rocircle des CSM dans lrsquoheacutematopoiumlegravese in vivo et ex vivo helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip69 IIIC1- Meacutecanisme daction de CSM dans lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC11 Seacutecreacutetion de cytokines par les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip70 IIIC111 VEGF-Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC112 FGF-2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip71 IIIC113 HGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip72 IIIC114 IL-10helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC115 IL-6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC116 SDF-1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 IIIC117 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC118 TGF-βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC12 Interaction directe CSMCSH (contact cellulaire)helliphelliphelliphelliphelliphellip74 IIIC121 Rocircle de lrsquoadheacutesion meacutedieacutee par VCAM-1VLA-4helliphelliphellip76 IIIC122 Rocircle des voies morphogegraveneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip76 IV Influence des basses concentrations drsquoO2 sur les cellules souches77 IVA- Introductionhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVB- HypoxieNormoxie in situhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77 IVC- Les concentrations drsquoO2 dans lrsquoorganisme humainhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip78

5

IVD- Rocircle de lrsquooxygegravene dans les cellules soucheshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD1- Les Facteurs de transcription HIF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip80 IVD11 Les sous uniteacutes α helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD111 HIF-1αhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip81 IVD112 HIF-2α et HIF-3αhelliphellip82 IVD12 Les sous uniteacutes β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD121 HIF-1βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip82 IVD122 HIF-2β et HIF-3βhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD13 Les cibles de HIFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip83 IVD2- Les cellules souches et les basses concentrations drsquoO2 ndash Introductionhelliphelliphellip83 IVD3- Cellules souches embryonnaires (CSE) et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip85 IVD4- Cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphellip85 IVD5- Cellules souches neurales (CSN) et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86 IVD6- Cellules souches meacutesenchymateuses et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD61 La prolifeacuterationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 IVD62 La diffeacuterenciation helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip88 IVD63 La migrationhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip89 IVD64 La seacutecreacutetion des facteurs solubles helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip90 IVD7- Cellules souches heacutematopoiumleacutetiques et Oxygegravene helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip92 IVD71 Le cycle cellulaire des cellules heacutematopoiumleacutetiques primitiveshelliphelliphellip93 IVD72 Le stress oxydatifhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip95 IVD73 Lrsquoexpansion ex vivo de CSH et Oxygegravenehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip96 IVD74 Modulation de lrsquoeffet des cytokines helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 V Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA- La greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA1- Les diffeacuterents types de greffe de cellules souches heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphellip99 VA11 Lrsquoautogreffehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip99 VA12 Lrsquoallogreffe helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip100 VA2- Les sources des CSH des greffons allogeacuteniqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA21 La moelle osseuse helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip102 VA22 Les cellules souches du sang peacuteripheacuterique mobiliseacuteeshelliphelliphelliphelliphellip102 VA23 Le Sang Placentaire (SP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip103 VA231 Inteacuterecirct du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip104 VA232 Probleacutematique de la greffe du SP helliphelliphellip106 VB- Expansion ex vivo de greffon du sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip107 VB1- Expeacuteriences agrave partir de Greffon meacutedullaire et du CSP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109 VB2- Expeacuteriences avec Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip110 VB3- Ameacutelioration de lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip112 VB4- Rocircle du support Stromal dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphellip113 VC- Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon heacutematopoiumleacutetique helliphelliphelliphellip115 VC1 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon meacutedullaire et CSPhelliphelliphellip115 VC2 Rocircle de CSM dans lrsquoExpansion ex vivo de Greffon du SPhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip116 OBJECTIFShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip120 MATERIELS ET METHODEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip123 I PROTOCOLE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124 II Preacuteparation des cellules et culture cellulaire helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA Uniteacute de sang placentairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125

6

IIA1 Isolement des cellules mononucleacutees (CMN) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIA2 Purification des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip125 IIB Preacuteparation de la couche adheacuterente de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip126 III Analyse des CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip127 IIIA Analyses fonctionnelles - colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)helliphellip127 IIIB Analyse pheacutenotypique des preacuteparations de CSM helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128 IV Congeacutelation et Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVA Congeacutelation des cellules helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 IVB Deacutecongeacutelation des celluleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip129 V Culture simple et Co-culture sur CSM des cellules CD34+ - Culture C1helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130 VA Analyses par Cytomeacutetrie en Flux (CMF)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA1 Expression des Antigegravenes Membranaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip131 VA2 Activiteacute de lrsquoenzyme Aldeacutehyde Deacuteshydrogeacutenase (ALDH)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132 VB Deacutetection des cellules progeacutenitrices CFC ndash culture semi-solidehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VC Deacutetection des progeacuteniteurs primitifs Preacute-CFCs helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip133 VD Deacutetection des cellules souches SRC (Scid-Repopulating Cells)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134 VD1 Deacutetection des cellules humaines dans la moelle osseuse des souris par CMF 135 VD2 Deacutetection des progeacuteniteurs humains dans la MO des souris par test CFChellip135 VI La production des cytokineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip136 VII Expansion de cellules CD34+ avec les surnageants de culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137 VIII Tests Statistiques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip138 RESULTATShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip139 I Article principal helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip140 II Reacutesultats Compleacutementaireshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip152 IIA Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de cellules totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 IIB Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion des cellules CD34+ helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154 IIC Effet drsquoIL-3 sur le taux drsquoexpansion de CFC helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155 IID Pheacutenotypage en fin de culture (J10) reacutealiseacute sur les cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID1 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 IID2 Marqueurs myeacuteloiumldes (CD13 et CD33) et marqueur lymphoiumlde B CD19helliphellip157 IID3 Marqueurs de laquo primitiviteacute raquo CD133 ALDH et CD90 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID31 Lrsquoexpression du CD133helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID32 Lrsquoactiviteacute de lrsquoALDH helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 IID33 Lrsquoexpression du CD90helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IID4 Moleacutecules drsquoadheacutesion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip159 IIE Activiteacute (SRC) - analyse de xeacutenogreffe dans les conditions avec ou sans IL-3helliphelliphellip160 IIE1 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions avec IL-3 SRC-CDhelliphelliphellip160 IIE2 Analyses du potentiel de greffe dans les conditions sans IL-3 SRC-CDhelliphellip163 IIE3 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions avec IL-3 SRC-CFChellip164 IIE4 Analyses lieacutees aux CFC humains dans les conditions sans IL-3 SRC-CFChellip165 III Travaux sur les CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip167 IIIA Caracteacuterisation des preacuteparations de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168 IIIA1 Production de colonies CFU-F (Colony Forming Unit - Fibroblast)168 IIIA2 Effet de basses concentrations drsquoO2 sur le pheacutenotype des CSMhellip169 IIIA3 Impact des taux dO2 sur la seacutecreacutetion des cytokines par les CSMhelliphelliphelliphellip172 IIIA31 IL-6 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172 IIIA32 VEGFhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173

7

IIIA33 IL-8helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip173 IIIA34 TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA35 FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174 IIIA36 IL-3helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175 IIIA37 G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA38 TPOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176 IIIA39 SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177 IIIA310 IL-4 GM-CSF IL-17A IL-1β IL-10 HGF et TNF-αhelliphelliphelliphellip178 IIIB Impact des surnageants sur la culture de CD34+ SP helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip180

IIIB1 Condition 1 10 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 IIIB2 Condition 2 20 de surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

DISCUSSION helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip184 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip194 BIBLIOGRAPHIEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip198 ANNEXEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip234 Article 1helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip236 Article 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip244 Communications aux colloqueshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip250 RESUMEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip251

8

LISTE DES FIGURES

Figure 1 Les sites de lrsquoheacutematopoiumlegravese fœtale helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figure 2 Scheacutema geacuteneacuterale de lrsquoheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21

Figure 3 Divisions symeacutetrique et asymeacutetrique des CSH dans le temps (t)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22

Figure 4 Analyse par Cytomeacutetrie en Flux du pheacutenotypage Side Population sur des CMN Lin-

meacutedullaires humaineshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip31

Figure 5 Hieacuterarchie des CSH et des progeacuteniteurs deacutependant de meacutethode de deacutetectionhelliphelliphellip35

Figure 6 Niches reacuteticulaires creacuteeacutees par les progeacuteniteurs meacutesenchymateux pouvant maintenir

et reacuteguler les CSHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42

Figure 7 Illustration abreacutegeacutee de lheacutematopoiumlegravesehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figure 8 Concentration en oxygegravene dans les principaux organes du corps humainhelliphelliphelliphellip79

Figure 9 Les niches de certaines cellules souches avec leurs concentrations physiologiques

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip84

Figure 10 Expansion de greffon heacutematopoiumleacutetique en fonction des concentrations

drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip97

Figure 11 Evolution de la reacutepartition des indications dallogreffe en Francehelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Figure 12 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques en France

entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 13 Evolution de la reacutepartition des sources de greffon des CSH allogeacuteniques non-

apparenteacutes en France entre 1995 au 2010helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip105

Figure 14 le principe de lrsquoexpansion ex vivo de greffon heacutematopoiumleacutetiqueshelliphelliphelliphelliphelliphellip108

Figure 15 Illustration du modegravele expeacuterimental helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip122

Figure 16 Culture de cellules stromales meacutesenchymateuses humaines issues de la moelle

Osseuse avec de diffeacuterents grossissementshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip128

Figure 17 Systegraveme de mini-chambre agrave O2 controcircleacutehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip130

Figure 18 La culture secondairehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip134

Figure 19 Scheacutema repreacutesentant le test in vivo de xeacutenogreffe aux souris NOGSCIDhelliphellip135

Figure 20 Taux dexpansion des cellules totales helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

Figure 21 Taux dexpansion des cellules CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip154

9

Figure 22 Taux dexpansion des progeacuteniteurs CFChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip155

Figure 23 Marqueurs meacutegacaryocytaires CD41 et CD61helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip157

Figure 24 Pourcentage de cellules CD133+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip163

Figure 25 Pourcentage de cellules ALDH+ CD34+helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip164

Figure 26 Moleacutecules drsquoadheacutesion VLA-4 LFA-1 et CXCR-4helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165

Figure 27 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CDhellip162

Figure 28 Impact de basses concentrations drsquoO2 de CSM et drsquoIL-3 sur lrsquoactiviteacute SRC-CFChellip166

Figure 29 Nombre de CFU-F en fonction de concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip168

Figure 30 Image repreacutesentative des colonies CFU-F obtenues des CSM agrave diffeacuterentes

concentrations drsquoO2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip169

Figure 31 Concentrations drsquoIL-6 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip172

Figure 32 Concentrations de VEGF dans les surnageants des co-cultures et cultures simples

de CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 173

Figure 33 Concentrations drsquoIL-8 dans les surnageants des co-cultures et cultures simples de

CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Figure 34 Interactions entre CSM et cellules CD34+ agrave BC-O2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip179

Figure 35 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 10 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181

Figure 36 Taux damplification moyen des cellules CD34+ dans un milieu contenant 20 de

Surnageanthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip182

Figure 37 Scheacutema repreacutesentant le greffon avant et apregraves expansion dans nos conditions de

culturehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip196

10

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 Reacutesumeacute des critegraveres drsquoidentification des CSMhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip66

Tableau 2 Marqueurs des CSM humaines natives de la moelle osseusehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip67

Tableau 3 Pathologies repreacutesentant les indications de la transplantation de cellules

heacutematopoiumleacutetiques allogeacuteniques helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip101

Tableau 4 Expansion de greffons issus du sang placentaire sur un support stromalhelliphelliphellip119

Tableau 5 Les anticorps monoclonaux utiliseacutes pour le pheacutenotypage de CSMhelliphelliphelliphelliphellip129

Tableau 6 Liste des anticorps monoclonaux utiliseacutes pour lrsquoanalyse pheacutenotypique du produit

drsquoexpansion helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip132

Tableau 7 Les diffeacuterentes conditions de cultures agrave partir desquelles les surnageants sont testeacutes

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip137

Tableau 8 Analyse pheacutenotypique des CSM apregraves culture agrave 20 et 5 drsquoO2 helliphelliphelliphelliphellip171

Tableau 9 Concentrations de TGF-β1 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip174

Tableau 10 Concentrations de FGF-2 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 11 Concentrations drsquoIL-3 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip175

Tableau 12 Concentrations de G-CSF helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip176

Tableau 13 Concentrations de TPO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177

Tableau 14 Concentrations de SDF-1α+β helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip178

Tableau 15 Les variations de seacutecreacutetion des cytokines des CSM dans les surnageantshelliphellip179

11

ABREVIATIONS 5-FU 5-FluoroUracile

A ABCG2Brcp1 ATPBinding Cassette G2Breast Cancer Resistance Protein ADN Acide DesoxyriboNucleique AGM Aorte-Gonades-Meacutesoneacutephros ALCAM Activated Lymphocyte Cell Adhesion Molecule ALDH ALdehyde DeHydrogenase AML1 Acute Myeloid Leukemia ASCs Adipose Stromal Cells Ang-1 Angiopoietine-1 ARNm Acide RiboNucleique (RNA) messager ARNT ARyl hydrocarbon Nuclear Translocator

B Baso Basophile BC-O2 Basse Concentration drsquoO2 BFU Burst Forming Unit bHLH basic Helix Loop Helix BMP Bone Morphogenic Protein BMPR Bone Morphogenic Protein Receptor BrdU 5-bromo-2rsquo-deoxyuridine BSA Bovine Serum Albumine

C C-TAD C- Terminal Transactivation Domain C1 Culture primaire CEBPα CCAATenhancer-binding protein α CAFC Cobblestone Area Forming Cell CAK CDKActivating Kinase CAR CXCL12-Abundant Reticular CBP CREB-Binding Protein CD Cluster de Diffeacuterenciation CDK Cyclin-Dependent Kinase CE Cellules Endotheacuteliales CFC Colony Forming Cell CFSE CarboxyFluoresceacuteine Succinimidyl Ester CFU Colony Forming Unit CFU-GEMM CFU Granuleuse- Erythrocytaire-Macrophagique- Megacaryocytaire CFU-Mix Colony Forming Unit-Mixte CFU-S Colony Forming Unit in the Spleen CLP Common Lymphoid Progenitor CMF Cytomeacutetrie en Flux CMN Cellules Mononucleacutees CMP Common Myeloid Progenitor CO Co-culture

12

CO2 Dioxyde de carbone CS Cellules Souches CSE Cellules Souches Embryonnaires CSH Cellule Souche Heacutematopoiumleacutetique CSHPH Cellules Souches et Progeacuteniteurs Heacutematopoiumleacutetiques CSM Cellules SouchesStromales Mesenchymateuses CSP Cellules Souches Peacuteripheacuteriques CSN Cellules Souches Neurales CXCL12 CXC-type Chimiokine Ligand 12 CXCR-4 CXC-type Chimiokine Receptor 4

D DVNA Donneur adulte Volontaire Non Apparenteacute

E E Erythrocytaire ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Eo Eosinophile EPAS Endothelial PAS protein EPO Erythropoietine

F FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FD filtres de deacuteleucocytation FDCP Factor Dependent Cell paterson FGF-2 ou bFGF Fibroblaste Growth Factor- 2 basic Fibroblast Growth Factor FITC FluoreceinIsoThiCyanate FL Flt-3L Flt-3 Ligand FOXO Forkhead transcription factor bOX O

G G Granulocytaire GD2 Ganglioside GATA GATA-binding protein G-CSF Granulocytic- Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocytic Macrophagic- Colony Stimulating Factor GVHd Graft Versus Host disease GVL Graft Versus Leukemia

H H2O2 peroxyde drsquohydrogene HB-EGF Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF Hepatocye Growth Factor HIF Hypoxia Inducible Factor HLA Human Leukocyte Antigen Hox Homeobox HPP-CFC Colony Forming Cells with High Proliferative Potential HRE Hypoxia Response Element HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cells

I ICAM InterCellular Adhesion Molecule

13

IDO Indole DiOxygeacutenase IFN InterFiroN IGF Insulin Growth Factor IGF-BP1 IGF-Factor-Binding-Protein IHH Indian Hedgehog Ik Ikaros IL InterLeukine IMDM Iscove Modified Dubelcco Medium iPSC induced Pluripotent Stem Cells ISCT International Society for Cellular Therapy

J Jag1 Jagged 1 JAK Janus Kinase

K KIP Kinase Inhibitor Protein KL C-kit Ligand

L LEFTCF Lymphocyte Enhancer FactorT Cell Factor LFA-1 Lymphocyte Function-associated Antigen 1 LIF Leukemia Inhibitory Factor Lin- Lineage minus LSK Lin-Sca-1+c-Kit+ LTC-IC Long Term Culture-Initiating Cell LT-CSH Long term Hematopoietic Cellule Souche Hematopoietique LTRA Long Term Repopulating Ability LT-SRC Long Term SCID-Repopulation Cell

M Mcl-1 Myeloid leukemia-1 M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extra-Cellulaire Meg Megacaryocytaire MEP Megacaryocyticerythrocytic Progenitor MGDF Megakaryocyte Growth and Development Factor MGG May-Grunwald-Giemsa MIP-1α Macrophage-Inflammatory-Protein 1α MK Megakaryocyte MM Myeacutelome Multiple MMP Matrix MetalloProteinase MO Moelle Osseuse MRA Marrow Repopulating Ability

N N-TAD N-terminal TransActivation Domain NFκB Nuclear-κB Factor NGFR Neural Growth Factor Receptor NICD Notch Intracellular Domain NK Natural Killer NLS Nuclear Localization Signal