���������������� ��������
�� ������� ������� �������
�������
� � �������������������������������������������� ����� �
� ������ ��� �
������ � ������������ � ������
�� ����� ���� �� ����� ����
� ������ ����
���� � �� ��� ���
� ������ ����
���� � �� ��� ����������� �������
� ��������� ���
�������� �������
� ��������� ���
����������������������������������������������
������������������������ ������������!
���������� � �"���� ����������������� ��������� ��������������� ������ ����������� ��������� ���������������#�
� �!�! ����� ����� �������� ����������������� ����������� �������������"���������� � ���#�
���� �� �����������!������ � ����� �����������$�����"$����������������������� ������
���������������� �����������%����������������������
� � �!������� ����������� ���������������������������� ��������� ���
��� �����������!������ � ���" �!�! ���
# �� �!���$��� � ���%�&'(��)������*������ � ������+%�
,����������-����%�&'.��������� �����/���������� ��
0 ���������� �1 ����� �2 �����%�&'34���* �!�! ��� +����/�� �� � �5)����
6�7�8 ���� /%��������6�������� �0 ������� ��%�4994���!��:�� �7������!������������" ��� �;������� �<��������� �� �����������!������ � ��=�
���� �� �!������ � ���5�� �!�� ����� ����� ��������7�������������������
�&'
� �
� �
�
(�) '�����* �������
� +
� ,
���-
. � �/
� � ��'0102
� � ��3
4�� � � ��3
���������� �
4���� ��5 ��������� ��5 ���
6 � ���7���������������������
��� ������! ��
. ������
∆∆∆∆��
� � ��8
45
� � $>%�?� $
9 ������9 ������
/# :� ��������+��� � ��������;�
4� ������� ���� ����!
-# 9 ��������������� ����� ����� ���� �+�
���� �����!
'# 9 ���������� ��� ������� ������� ��
��������������� ��� ���������
������ ������!
. ����������;������������� ���
/88<=�> ����������� � ����"�
� ���+��������������"� ������������ �������" �������������� ������ �� ����������������������� ������������� ������ ������������" ���� ��
? #�@� �
4���������� ���������4� ����� !
���� ����
. �� ���������"���� ����������
. ���� � �� � ��"����� ������
����������� ����� ��� ���� ����
�������������������� ��� !� �� " ���� ��#��� �� $������ ����
A �����=�B �����-CC-
chloroquine camptothecinetrophozoites daunomycine
. ������ ��4� ������� ���� ���
D� "���� �����. 6 B �E> F B @:G
@+���� �� ���������� ���������
A ����� ��������������������������� �
? ��������
4����������
� @ � A�
,B�?
5 µm
A �!����� C49�D
������<����C4E�D������<����C49�D
1) TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labelling): Fragmentation
internucléosomale de l’ADN
PI
�����������
74A H
C� '� <3�
10%
5% 14%
24% 25%
39%
@+������������� ���� ����� ��. ���+��� ��0�4H
trophozoïtesSSC
FSC
schizontes
���� 6 #�D ���,=�B �����-CC<
%�� &
3) Marquage par l’Annexine V:
Exposition phosphatidylsérines
@+������������� ���� ����� ��. ���+��� ��0�4H
���� ������ �����
74A H
�����������
���4
A ��������� ������� ���������� �EI � /G
�
'�
��
��
(�
)�
*�
+�
,�
-�
. ��������/����
0�1 2
���������
����
Stratégie de Recherche
Approche biochimique in vitro
• Synthèse de protéine recombinante
• Tests d’activité enzymatique avec substrat luminescent
Approche in vivo dans cellule eucaryotes
• Test de surexpression et d’induction d’apoptose
• Test de clivage
Approche in vivo chez P.falciparum
• Test d’activité enzymatique et de clivage après induction d’apoptose!
• Test de survie du parasite en présence d’inhibiteurs de Caspase
Approche bioinformatique
• Recherche d’un gène candidat
• Recherche de site catalytique
• Recherche de domaines
Approche bioinformatique
P20 P10
H C
Domaine catalytique C14
D D
Site de clivage potentiel
CARDDD DED26 72
75 106
211 242
Domaines régulateurs
P20
P10
Métacaspase inactivée
Métacaspase activée
���� �
������������������������ � ���
����
�� � !"#����$�
�� � !"#����%�
�#�!&�" #�� !��
�'����(��('��
���������������������� � ���
����
�� � !"#���$�
�����$��
���)�*+ ,��
�'����(��('��
������������������� � ���
����
. ������ ��� �� "����+������
��!�+"#-!��-
. .� �"�
+ �� � !"#�
+ ���/0� 1 ��#�"�,"2
�3�0�".�!1�
��4
9 ��������� ����� ����� ���� �+����� �����!
etoposide sur 7g8 48 h
0
20
40
60
80
100
120
0 3,75 7,5 15 30 60
etoposide (µg.mL)
%
ring
tropho
schizontes
pycno
etoposide sur 3d7 48 h
0
20
40
60
80
100
120
0 3,75 7,5 15 30 60
etoposide (µg.mL)
%
ring
tropho
schizontes
pycno
. ������ � ��" ���� ���
+3, 4 �5+
����� � ��� '--+� 6��#0� ���� 6���� 1 �$���
���������
9 �������� ������� ������� ����������������� ��� ��������������� ������!�
�"1 0�����!-�
� ������������. ����"�����5
-�!���.� ����"#��#�!� #�����0� 1�. .� �"��
-����-!�"#��"����1"����� 6��� !-�&��!��0!�
-!�"#������&��1�"
��" #
'���7��� �������8 ���#����������� �# ������
7 9����������� �� �#�����:
��2#����� #���; 8 ��������� ��� ���� �# �#��#�7� ��� �
�������� ������ �� �� ����� 7��� �����
8 2#����� ���7�� 8 ���# ���� �� �� �������� ���#���� �� �<��� ��
����!�� ���� �= ������#�#
8 >��#�� �� ���# ���#���� ����# ���������� �� �#�� ���# � ��
���7��
��?�����������! ����# ��! 7 #���##����� �#�
'����� . "��"#/'��2
7 ��1� . "��"��� 9���0�� �
7 '��+'�����:.�����-�"#������� ��#��"#�!-"#��6"-#��;�
&�"#;�����;�1!���;��#- ���"����<
7 ����..� ��-�0 ������1�#�� 0���� #"��#�1"
'���"#����&�"#
7 1�<�� #��# �� ���������8
8 $���������#� ����� ���#��� ������ ���7���� ��7���
�������� ���#� �#������#@
7 >�� ������#8
8 ?���#� ���������� �#������#� ��7��� �������� ���#�
����@
7 0������ 7� �������8
8 $������ �����7� ������ ' A$2B�'C
8 $����������� �����! ���� #���#� 6?B@
7 ������# ��#� ��������� �� ����� �������� ���#
�� ���# �# � ����������������
9 E � . 3
�61 F0 �� ���
B=�7������ 1 � �1
?B���&9. !����� ��
�������� ����� E���������������=����������J G
ABG ABG ABG
������
�� � �����5�
�8 ABG %�?B���9H�F-��I�&49�@ ?F� ���
J9
������ ������
B����� ��� ��%�,�� 7���� ����� ��� %�� ����
&E 4&
6�����5��� �����5�:��
6�����,� 1 ��: ��� ���
�I.9
�I&4
�I&4
� G ������� �:�K �7�����IJ9
��������� "#0����-1"���!��"�� #�� ����'��
��!�����!���""� ����� ���� ����������������
�������- ��
!IG =G G &.
��������� "#0����-1"���!��"�
. ��#�"� #0 !#-"#�0�� ��
��������� "#0����-1"���!��"�
. ��#�"� #0 !#-"#�0�� ��
��-"#.��"��1"
"#�����-&��9��#��+�4�
=���0 -
��-"#.��"��1"
"#�����-&��9��#��+�4�
=���0 -
��-"#9�"��� ��
&��9��#��+�4�=�
�3$>
��-"#9�"��� ��
&��9��#��+�4�=�
�3$>
��-"#��-& -���
��&��9��#��+�4�=�
?�3$>
��-"#��-& -���
��&��9��#��+�4�=�
?�3$>
'��'��
� #�� � #��
8 B�"� ����� 7���� ��� ������ ��� 3�!�� ��5�� ����
����&�!1����&�!1 � ���:� ���: �!#��!#�
����� 7����499�H�
'���+ '����+ ��.����+��.����
1����:.����" #
��E
��3
��E
��3
��E
��3
��E
��3
��� ����� ��� C���� 7���D�" ABG � ��� �� � ��� C7���-�7���D
��� 6"#���1����:.����" #�"#�&�"#
'��'��
� #�� � #��
'��'��
� #�� � #��
��� �:��� �: 6����6����
NS
� ����5�� ��
��� ��� ABG
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
� ����5�� ��
��� ��� ABG
NS
�"��"� :"-��"��"� :"-�
(!11��
?3 '���-����-����0� 1�����&��1�"�"#��1!�"#�1 -�
�3 '���-��������&�"#�"#011� ������. #���� �"#0���" #�/���;�
���;���2
�3 '���.����#�����1 �������"#�����&�"#
���!�����!��?3 ����#��� 0�1!�"#��1 -�
�3 . .� �"�&#��
�3 �#- 1"@�-� #�� �-�"#"���"�
�3 � �� 0����1�#�
?3 ����#��� 0�1!�"#��1 -�
�3 . .� �"�&#��
�3 �#- 1"@�-� #�� �-�"#"���"�
�3 � �� 0����1�#�
>����������� ������# ��� ���� ���� �����
��7��� �������� D��#� � ���� ����� �� �������#
5�#�##� ���*
������ � ������������ � ������
�� ����� ���� �� ����� ����
� ������ ����
���� � �� ��� ���
� ������ ����
���� � �� ��� ���
�������� �������
� ��������� ���
�������� �������
� ��������� ���
G ������ � F�J9��������G ������ � F�J9��������
�. .� �"� 0����1�"�.� � @ #;���1 -"!1�&�����"5��. ��"&��1���#"�1 0 ��"1"�"#�"#��#�"�� 0�"#0���" #�"#����1 � !"� 3��+��#����;��#�3�A3�.��"� ??��+??��
�. .� �"�����-� ������ � !"#����#�"�"�"�� 0�����!1#1�"�.��"�����1 -"!1�0�".�!13��"� ��?%%4;���#�3�� �3�( �3��� .3���-���$%�+$%?3
B ���(�����?;�A�;�?4�5�%��+�%3�����C'�������;��"#�':.�11 ?�45?$?+?$43���������������A��;�?�45?���+%�3�'#- ���"��
. ������ ���� �����������
���������������"����
. ������ ���� �����������
���������������"����
B������ � � ��!�! ��������������!������� � LB������ � � ��!�! ��������������!������� � L
�������6�������6���M �������
����� ������ ��
��������������1 ���"���� 6������0 ��� ��$�������/� ��7� �6��� 1 ����� A�-��
$������<��������7�������� � ���6� ����
� � ������A���� ���� ���������# �������6���
1 � ������ �:���
A1 �J3J4
# ��������� ������ ��������B���� ����
$��� � �����������
����
@ �,��� ,�
N,�����: ��7���%��7� �� � ������ �<��
� �!�����!� ������� ���7�����
A1 �J3J4A1 �J3J4
# ��������� ��# ��������� ������� ��������B���� ������� ��������B���� ����
$��� $��� �� ����������������������
��������
@ �,��� ,�@ �,��� ,�
NN,�����:,�����: ��7�����7���%�%��7� �� ��7� �� � ������������ �<�� �<��
� �� �!�����!� �������!�����!� ������� �����7�����7������