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7/24/2019 Technique d'tude de la cellule
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BIOLOGIE CELLULAIREPr TAHIRI JOUTI N.
UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCAFacult de Mdecine et de Pharmacie
Anne Universitaire 2014-2015
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METHODES DETUDE DE LA CELLULE
LE NOYAU INTERPHASIQUELES CHROMOSOMES
LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES
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METHODES DETUDE DE LA
CELLULE
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- La connaissance des cellules dpend desinstrumentsdont nous disposons
- les progrs majeurs de la biologie cellulairesouvent arrivs aprs lintroduction denouvelles techniques
Pour comprendre la biologie cellulaire, il estdonc ncessaire de connatre ces mthodes
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METHODES DETUDE MICROSCOPIQUES
- MICROSCOPIE OPTIQUE (MO)
- MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)
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- Utilis en mdecine pour analyser des
prlvements tissulaires effectus chez le maladepour poser et/ou complter un diagnostic donn.
- Il existe plusieurs types de prlvements:
- cytologique: frottis, aspiration, liquides
- histologique: biopsie, pice opratoire
en fonction de la nature du prlvement
Microscopie Optique
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Techniques Cytologiques Pour LaMicroscopie Optique (1)
1. FrottisUtilis pour des cellules libres, en
suspension:
- Sang
- Moelle osseuse
- Cellules de la muqueuse
vaginale (frottis vaginal)
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1 23 4
Lame
Lamelle
Inclinaison de la lamelle (45) contrela goutte de sang
Mettre la lamelle incline en contactde la goutte du sang
Le sang stale par capillaritFaire glisser la lamelle
entranement du sang par capillaritfrottis
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Cytocentrifugeusepermet:
- La concentration cellulaire et-Ltalement en monocouche
2. Cytocentrifugation
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Techniques Cytologiques Pour LaMicroscopie Optique (2)
Technique :- Fixation par dessication
(schage par agitation lame)
- Coloration panoptique(MGG)* May Grnwald 3 min,* Eau tamponne (pH 7) 1
min,* Giemsa 10 min,* Lavage eau courante)
- Schage et observation auMO.
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La Microscopie
Microscopie:
- utilise un flux ondulatoire de particulesondulatoires: non chargs: photons
Microscopie photonique ou optique chargs : lectrons
Microscopie lectronique
- Ce flux traverse un systme de lentilles qui
permet dobserverune image agrandie.
Rsolution : Distance minimale entre deux pointsvoisins qui permet de les observer spars.
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Ou Microscopephotonique
- utilise la lumire visible(photons)
- rsolution= 0.2m
- grossissement = 1000
Le Microscope Optique (1)
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Le Microscope Optique (2)
Le Microscope Optiqueest constitu:
-dune lampe
photons- de trois lentilles en
verre:
- Le Condenseur-L Objectif
-L Oculaire
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1. Oculaires2. Glissire de rglage del'cartement inter-pupillaire
3. Tube binoculaire4. Potence5. Tourelle porte-Objectif6. Vernier de positionnement avecvis de dplacement bidirectionnel
du chariot7. Chariot de fixation et depositionnement de la lame porte-objet8. Platine porte-objet9. Vis macromtrique de mise aupoint10. Vis micromtrique de mise aupoint11. Vis de rglage de la hauteur duCondenseur
12. Pied
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diamtre : 15m
noyau: polylob (3 ou 4 lobes
Cytoplasmes : grains
azurophiles = Fines granulations
pourpres = granulations Ires =
grands lysosomes
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Techniques Histologiques pour laMicroscopie Optique (1)
Biopsie et coupe histologique
Technique utilise pour les tissus
(foie, peau, muscle) qui
ncessite la ralisation de coupes
minces avant l'observation aumicroscope.
La biopsie:
prlvement in vivo, d'un fragment
d'organe, dans le but de lesoumettre un examen
histologique, le prlvement
n'emportant pas la lsion dans sa
totalit.
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La Biopsie
Techniques Histologiques pour laMicroscopie Optique (2)
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Prlvement tissulaire
Diffrentes tapes techniques
Lame coloreinterprtable au microscope
Techniques Histologiques
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La Fixation (1)
- Dfinition : conservationdu prlvement dansun tat aussi proche que possible de lETAT
VIVANT
- Mcanismes:
- inhibition de lautolyse cellulaire
- inhibitionde la putrfaction- ponts intermolculaires entre lesmacromolcules
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La Fixation (2)
Deux types de fixateurs:
- Fixateurs chimiques sont les plus utiliss ; ce sontdes composs qui font prcipiter ou coaguler lesmacromolcules ;
Fixateurs simples: Formol, alcool thylique, acide actique,acide picrique,
Fixateurs composs: mlange de Bouin, mlange de Carnoy, etc.
- Fixateurs physiques les plus utiliss en mdecine sontlazoteliquide (-196C) et la neige carbonique (-60C).
Principe: Conglation
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Fixation formole
Circulation
Inclusion
Microtomie et coloration
Ralisation dune coupe histologiqueAprs fixation chimique (Formol)
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La Circulation (1)
-Ncessit de rigiditdu tissu
But : permettre la microtomie et laralisation decoupes minces
- Fixation durcit insuffisamment
Ncessitdimprgnationdu tissu
par une matire rigide
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milieux dinclusion: pas daffinitpour leauNon miscibles leau
- Milieu dinclusion le plus utilis : la paraffine
(liquide 56C)
Il faut donc remplacer leau (fixateur en phaseaqueuse) parun solvant de la paraffine
permettre limprgnation laparaffine
La Circulation (2)
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Paraffine : pas daffinit pour leau
Non miscible leau
Prlvement Imprgnation la paraffine
Ethanol Tolune
H2O
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La Circulation (3)
La paraffine nest pas miscible leau,
linclusiondoit donc tre prcde par :
- une Dshydratationdans des bains dalcools concentration croissante
suivie
- de bains de tolune.
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Cassette pour prlvement
- en plastique jetables pour tissus sont utilises pour contenir
et identifier les chantillons de tissus lors des procdures detraitement, d'inclusion et de sectionnement.
- Surface inclinepermettant l'identification d'chantillons dans
toutes les tapes d'inclusion
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La Circulation (4)
Dfinition: passage du prlvement dans une sriede liquides intermdiaires
But: permettre limprgnation du prlvement par la
paraffine liquide
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LInclusion (1)
- Dfinition: enrobage du prlvement
dans un bloc de paraffine
- But : permettre la manipulation et la
fixation du prlvement au niveaudu microtome
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Station dEnrobage
Moule dInclusion
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LInclusion (2)
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LInclusion (3)
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LInclusion (4)
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Microtomie et Coloration
- confection et talement de coupes
tissulaires fines
- Colorations histochimiques des coupes
lame colore
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Microtomie (1)
Les coupes
- doivent tre trs fines (3-4
m) afin que la lumire
(photons) du microscope puisse
les traverser.
- sont ralises par un
microtome quip dunelame
Mi t i (2)
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Microtomie (2)
Coupe aumicrotome
Mi t i (3)
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Microtomie (3)
Coupes au microtome
Mi t i t Et l t
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Coupes : (2-4m)
Etalement des coupes sur la lame
Coupes
Porte-objet Bloc de paraffine + pice Bloc deparaffine pice
Lame
coupes
Microtomie et Etalement
Lame
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Etalement des coupes (1)
Les coupes obtenues
sont tales et colles
sur des lames en verre
laide deau
glatineuse oualbumineuse sur une
platine chauffante
Et l t d (2)
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Etalement des coupes (2)
Etalement des coupes sur la
lame
Collage et schage des coupes
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La Coloration (1)
Permet daugmenter le contraste entre les structurescellulairesqui ont des indices de rfraction trs voisinset sont donc translucides au MO.
Un colorant est une substance colore qui transmet sacouleur ; on rencontre des :
- colorants acides : ex. : osine colore le cytoplasme
en rose- colorants basiques : ex.: hmatinecolore le noyauen bleu (autre: bleu de mthylne)
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Coloration (2)
Il faut procder la rhydratationdes coupesparun:
1/ dparaffinagedes coupes par un solvant de la
paraffine (tolune) ;
2/ passage dans ensuite des bains dalcools titredcroissant (100, 95, 70) qui permettent leremplacement progressif de la paraffine par leau.
Car
Les colorantssont en phase aqueuse
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Coloration (3)
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Coloration (4)
C l ti (5)
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Coloration (5)
On distingue:
- les colorations de base (HmatineEosine, Trichromede Masson)
- des colorations spciales* Imprgnation argentique / fibres de rticuline(Fibrose)
* Coloration de Perls/fer (Hmosidrose)
* Coloration PAS (Priodic Acid Schiff) /glucides
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Coloration Hmatine-Eosine ou H&E
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Biopsie hpatique:L'hmosidrose est unesurcharge anormale des
organes(particulirement du foie)par l'hmosidrine, qui est unpigment insoluble contenantde l'hydroxyde de fer.
Coloration de Perls
Tissu Hpatique: Les capillairessinusodes sont entours par unrseau de fibres rticuliniques,soulignes ici par une
imprgnation argentique
Coloration au nitrate dargent
M t (1)
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Montage (1)
La coupe tissulaire se retrouve protge
entre lame et lamelle, colles lune lautre
laidedunliquide/rsine de montage = colle
Eukitt, No-Entellan
Mais ces colles ne sont pas miscibles leau
M t (2)
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Montage (2)
Aprs coloration:
* Dshydratation dans des bains croissants
dalcool suivie
* par un passage dans des bains de tolune
M t (3)
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Montage (3)
Periodic Acid Schiff: PASColoration des structures contenant
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Trichrome de Masson
Coloration des structures contenantune haute proportion deglucides tels que le glycogne, lesglycoprotines et les protoglycanes
Utilise pour la dtection de certainstroubles du stockage de glycognedans les muscles stris
L'hmaluncolore le noyau et lessubstances basophiles eu bleu-
violet; le ponceau-fuchsinecolore le cytoplasme en rouge-ros et le vert lumire ou le bleud'aniline colore les fibresconjonctives respectivement en
vert ou bleu.
( )
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LExamen Extemporan (1)
L'examen extemporan
- consiste raliser une coupe histologique dunprlvement ralis durant une intervention afind'orienterau mieux l'acte chirurgical.
- est indiqu pour :* un choix immdiatentre deux gestesthrapeutiqueschirurgicaux
* Apprciation des limites ou de l'extension d'unetumeurlors de son exrse
(2)
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Cet examen doit tre ralis dans des dlais
rduits (moins d'une demi-heure) alors que la
technique histopathologique standard est de
l'ordre de 24 heures aprs fixation.
LExamen Extemporan (2)
LE E t (3)
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Technique* Fixation par conglationpermet:
La fixation Le durcissement de
lchantillontissulaire.
* Ceci permet dviterltapedinclusion.
LExamen Extemporan (3)
L Mi O i S i (MOS)
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Les Microscopes Optiques Spciaux (MOS)
Les MOS les plus utiliss en mdecine sont
le microscope fluorescence
le microscope contraste de phase
Microscope fluorescence (1)
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Microscope fluorescence (1)
Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications
qui portent sur la source lumineuse: UV au lieu de Visible
- Microscope fluorescence: microscope classique avec une
lampe vapeur de mercure sous pression.- Certaines substances: Fluorochromes ont la proprit
dmettreune lumire visible lorsquellesreoivent un flux
de rayons ultra-violets.
- Le tissu peut mettre directement cette lumire ou bien
aprs avoir t imprgn de substances fluorochromes.
Microscope fluorescence (2)
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Microscope fluorescence (2)
- Fluorescein IsoThioCyanate: FITC fluorescence verte,- Tetramethyl Rhodamine IsoThioCyanate: TRITC ,fluorescence rouge- Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndolse fixe spcifiquement sur l'ADN
Microscope fluorescence (3)
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Microscope fluorescence (3)
1- il faut clairer la coupe histologique pour
exciter les molcules dont on veut obtenir lafluorescence.
2- Une molcule fluorescente ne pourra treexcite que par des radiations qu'elle peutabsorber.
3- Aprs avoir absorb la lumired'excitation, les molcules fluorescentes sedsexcitent en mettant des photons.
Microscope fluorescence (4)
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Microscope fluorescence (4)
Unsystme d'illumination sur le tube,
sous le bloc porte oculaire. Il comprend:
- une lampe vapeur de mercure entourd'un miroir collecteur et d'une lentillecollectrice pour rcuprer un maximum la
lumire d'excitation.
- la lumire rencontre le filtred'excitation.
- unintervalle spectral troit arrive sur lemiroir dichroquequi le rflchit vers lebas, sur la prparation.
- La lumire d'excitation claire laprparation par l'intermdiaire del'objectif.
Microscope fluorescence (5)
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Microscope fluorescence (5)
- Unepartiedes rayons diffusset mis par fluorescencerentrent dans l'objectif etremontent dans le tube o ils
rencontrent le miroirdichroque qui laisse passer lalumire sous cette incidence.
- Lefiltre d'arrt bloque enfin lalumire diffuse et seule lalumire misepar fluorescenceremonte pour former l'image.
Microscope fluorescence (6)
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Microscope fluorescence (6)
FILTREDEXCITATION
FILTREDARRET
Rsolution = 0.1m
Techniques dImmunofluorescence (1)
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La protine cellulaire mettre en videnceestrvle grce un anticorps- spcifique cette protine- coupl un fluorochrome:fluorescine, rhodamine
- La raction antigne-anticorps sur coupehistologique est rvle par lmission de lafluorescence
- La lecture de la lame se fait au microscope fluorescence
Techniques dImmunofluorescence (1)
Techniques dImmunofluorescence (1)
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Techniques d Immunofluorescence (1)
Techniques dImmunofluorescence (1)
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- Couplage direct de lAc un fluorochrome: mthodedirecte
- Application de lAc coupl au fluorochrome sur
coupe histologique susceptible de contenir lAgspcifique
- Lavage liminant les Ac fluorescents non fixs par
lAg spcifique
- Observationau microscope fluorescence
du complexe Ac-Ag rendu fluorescent
Techniques d Immunofluorescence (1)
Estomac de souris Noyaux colors au DAPI
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Neurones
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Neurones du cervelet
Le Microscope Contraste de Phase (1)
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Le Microscope Contraste de Phase (1)
- La diffraction est le comportement
des ondes lumineuses lorsquelles rencontrent unobjet
- londeest diffusepar les points de l'objet.
- La diffraction se manifeste par le fait qu'aprs larencontre dunobjet, la densit de l'onde lumineuse
nestpas conserve
- La diffraction est le rsultat de linterfrence desondesdiffuses par chaque point.
Le Microscope Contraste de Phase (2)
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Le Microscope Contraste de Phase (2)
- Le microscope contraste de phase possde un
systme optique conu pour exploiter les propritsde diffraction des cellules vivantes.
- La lumire traversant les parties relativement denses
ou paisses de la cellule est retarde par rapport celle qui traverse une rgion voisine plus mince.
Cration des effets dinterfrences
produits par la recombinaison de cesdeux sries dondes
Images fortement contrastes
Le Microscope Contraste de Phase (2)
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Le Microscope Contraste de Phase (2)
Quand les ondes lumineuses traversent
un objet non color:
- leur amplitude est trs peu change
- leur phase est modifie, ce qui cre
des interfrences.Les effets de ces interfrences sont
exploits pour crer une image
Le MCP est quip dobjectifsspciaux qui transforme lesdiffrences d'amplitude endiffrences de phase.
Le Microscope Contraste de Phase (3)
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o op o ( )
La lame de phase a deux effetssur la composante de rflexion :
elle attnue considrablement sonintensit de manire la ramenerdans l'ordre de grandeur del'intensit de la diffusion
Un dispositif imageur faitconverger les deux ondes au pointimage P'.
L'intensit du point image est lersultat de l'interfrence des deux
ondes.- deux ondes sont en phase lepoint est brillant.
- deux ondes sont en oppositionde phase le point est sombre.
Les dfauts responsables de ladiffusion par diffraction apparaissentainsi par contraste.
Le Microscope Contraste de Phase (4)
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Le Microscope Contraste de Phase (4)
Kratinocyte de la muqueuse
buccale observ aumicroscope lumiretransmise. Seul le noyau estclairement observable
Kratinocyte de la muqueuse
buccale observ au microscope contraste de phase .Le noyau, ainsi que de nombreuxconstituants cytoplasmiques,probablement principalement des
mitochondries, sont observables.
Le Microscope Contraste de Phase (5)
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Le Microscope Contraste de Phase (5)
Cellules pithliales de Hamster
en culture observes aumicroscope contraste de phase
Microscopie Electronique (ME)
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principal intrt:Augmenter lagrandissement
Permettre lobservation
de lultrastructure
(organites) et desreliefs cellulaires.
Rsolution = 1 2 nm
Microscopie Electronique (ME)
Microscope Electronique Transmission (1)
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Au lieu dtreclair, lobjet
est bombardpar un faisceau
dlectrons.
Limagemettra en videnceles structures plus ou moins
opaques aux lectrons.
Le condenseur, lobjectif etloculaire sont des bandesmagntiques
Microscope Electronique Transmission (1)
Microscope Electronique Transmission (2)
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Microscope Electronique Transmission (2)
Un systme de lentilles
magntiques permet de dvierou focaliser le rayond'lectrons sur un chantillon"extrmement fin".
L'image ou clich de diffractionobtenue peut tre vue sur uncran phosphorescent,enregistre sur un filmphotographique ou biendtecte par un capteur CCD.
Capteur CCD
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Capteur CCD
- Le capteur CCD est une mmoire analogique quiaccumule des charges proportionnellement son tempsdexposition.
- Les trois lettres CCD signifie Charged Coupled Device
en franais DTC:dispositif transfert de chargesquiproduit un signal vido partir des charges accumulesdans les lments du capteur.
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Grille porte-objet
Tube sous vide
MET
MET
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Prparations biologiques pour le MET :
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Lobjet doit tre pralablement:
* coup en tranches ultrafines
* imprgn de sels de mtauxlourds qui vont:
- se fixer diffrentiellement surles diffrentes structures
intracellulaires
- les rendre plus ou moinsopaques aux lectrons.
Prparations biologiques pour le MET :Coupe ultramince (1)
Prparations biologiques pour le MET :
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Fixation: double fixation au glutaraldhyde puis auttroxyde dosmiumLe glutaraldhyde pontages covalents
entre molcules protiques
Le ttroxyde dosmium stabilisation desdoubles couches lipidiques et des protines mal ounon fixes par le glutaraldhyde.
Inclusion : fait intervenir des rsines de synthse,trs dures et transparentes aux lectrons (rsinesEpoxy, Araldite).
Coupe ultramince (2)
Prparations biologiques pour le MET :
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Ultramicrotomie: coupes ultraminces (50-80 nm)ralises par lultramicrotome quip dun couteauen verre ou en diamant. Coupes recueillies sur desgrilles mtalliques.
Contrastage : Par des sels de mtaux lourds(osmium, plomb, uranium) qui sont denses auxlectrons.
Les structures cellulaires apparaissent plus ou moinsdenses (noir et blanc) sur un fond clair
Coupe ultramince (3)
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Pour augmenter le contraste des constituantscellulaires, les coupesultraminces sont trempesdans une solution de sels de mtaux lourds(actate duranyl et citrate de plomb)
Aspect Ultrastructural, MET
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REG
Noyau
Aspect Ultrastructural, MET
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Mitochondrie
Citernes deREG
Prparations biologiques pour le MET :Coloration Ngative (1)
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Rappel:En microscopie lectronique Transmission:
- lobjet ne peut tre visibleque si, aprs fixation, ilest imprgnde substances contenant des atomesde mtaux lourds opaques aux lectrons.
- La fixation et les ractions ultrieures peuventmodifier notablement la structure de l'objetbiologique.
Coloration Ngative (1)
Prparations biologiques pour le MET :Coloration Ngative (2)
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Le contraste ngatif permet
d'assombrir le fond sans
colorer l'objet lui-mme et
donc de le rendre visible sans
le modifier,par simple
contraste.
Coloration Ngative (2)
Nuclocapside virusde la rougeole
Prparations biologiques pour le MET :Coloration Ngative (3)
-
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Technique :
- Suspension dans une
solutionopaque aux e- :
Acide Phosphotungstique
- dptdunegoutte de
cette suspension sur
une grille mtallique
- schage
Coloration Ngative (3)
Immunoglobine G: IgG
Prparations biologiques pour le MET :Coloration Ngative (4)
-
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Technique :
la substance opaque aux
e- se dpose autour de la
particule qui apparatra
clairesur un fond sombre
contrasteinverse oungatif
Coloration Ngative (4)
Papillomavirus Humain
Prparations biologiques pour le MET :
-
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a) Particules virales,isoles d'une verrue,observes aprs colorationngative l'acide
phosphotungstique.
b) Virions observs dans lenoyau d'un kratinocyte des
couches superficielles del'pithlium malpighien.Coloration par l'actated'uranyl et le citrate deplomb.
Coloration Ngative (5)
Microscope Electronique Balayage (1)
-
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-
Permet lobservation desreliefs ou images cellulairesen 3 dimensions (3D).
Il est constitu :
-dunmicroscope faisceaulectronique
- dundtecteur de-
- dunconvertisseur de-
- dunmoniteur (cran tl)
p q y g ( )
Microscope Electronique Balayage (2)
-
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- Le microscope
lectronique balayage
utilise un faisceau trsfin qui balaie point par
point la surface de
l'chantillon.
p q y g ( )
Microscope Electronique Balayage (3)
-
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Matriel biologique :cellules, bactries et virus.
Ces structures sont:- fixes- dshydrates
- recouvertes dune mincecouche de mtal (Or-Palladium, Platine)vaporisesous vide.
Prparations biologiques pour le MEB
p q y g ( )
Microscope Electronique Balayage (4)
-
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- la surface mtallise de lchantillonsubit un balayagergulier par un faisceau dlectrons
- les surfaces en reliefs entranent lmissiondlectronssecondaires(points lumineux)
- Les dpressionssont sansmission dlectrons(pointssombres)
- Les lectrons mis sont collects par un dtecteurdlectrons puis convertis en image par unconvertisseur dlectrons. Limagefinale apparat en 3dimensionssur un cran de tlvision.
Prparations biologiques pour le MEB
p q y g ( )
Microscope Electronique Balayage (5)
-
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p q y g ( )
Globules Rouges
Chromosomes X et Y
-
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METHODES DETUDE
- BIOCHIMIQUE
- DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE
-
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METHODES DETUDE BIOCHIMIQUE
Fractionnement cellulaire par
-
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Spare en fractionsles diffrents organites dela cellule (noyau, mitochondries, etc.) en vuedunetude biochimique.
Se droule en quatre tapes :- Dissociation
- Isolement- Eclatement- Fractionnementcellulaire ou
subcellulaire
ultracentrifugation
La Dissociation cellulaire
-
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- Consiste dissocier les cellules
dun mme tissu- ralise mcaniquement ou
chimiquement.
Dissociation mcanique : dansun milieu isotonique 0C avecun broyeur cellulaire ou Potter.
Dissociation enzymatique : par
des enzymes protolytiques(trypsine ou collagnase) et desChlateurs de calcium (EDTA :Ethylne Diamine Ttractique
Acide).
Broyeur dePotter
LIsolement / Tri cellulaire (1)
-
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Spare les diffrentes catgories cellulaires rsultantde la dissociation cellulaire.
Fait intervenir des anticorps fluorescents spcifiques
chaque catgorie cellulaire
Lisolement des cellules couples lanticorps
marqu est ralis par un appareil spcial pour le tricellulaire, le cytofluorimtre ou cytomtre en flux.
Cytomtrie en Flux: CMF
LIsolement / Tri cellulaire (2)
-
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Principe et but de la
CMF:
Mesure (-mtrie) desproprits optiques de
cellules (cyto-)transportes par unliquide vecteur (flux)
jusquune source
dexcitation lumineuse(souvent un laser)
Puis Tri Cellulaire
LEclatement cellulaire
-
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Permet de recueillir le contenu de la cellule par lune
des techniques suivantes :
- Broyagemcanique au Potter
- Choc osmotique en milieu hypotonique (0,5% NaCl)- Vibration ultrasonique
- Passage des cellules travers un petit orifice.
Au terme de cette tape, un lysat (homognat) avecles diffrents organites mlangs est obtenu.
Le Fractionnement cellulaire
-
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Les organites cellulaires sont sparsen plusieurs
fractions contenant chacune un seul typedorganites
La sparation se base sur la forme, la tailleet ladensitdes organites.
Deux procds diffrents sont utiliss :
- ultracentrifugation diffrentielle- ultracentrifugation en gradient dedensit
Ultracentrifugation diffrentielle
d f d l l
-
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- Cestune successionde centrifugationsde plus en plusrapideset de plus en plus prolonges.
- On retire le culot chaque tape et onrecentrifuge le surnageant.
- Lordrede sdimentation des organites est :
1. noyaux,2. mitochondries,
3. lysosomes,
4. microsomes,5. ribosomes,
6. ARN et cytosol
Ultracentrifugation en gradient de densit (1)
-
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Ultracentrifugation :
- dans une solution (saccharose, chlorure dcsium) prsentant un gradient de concentratio
dcroissant du bas vers le haut
- dans un tube essai avec des graduations d
concentrationsralises artificiellement.
Ultracentrifugation en gradient de densit (2)
-
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Les organites mlangs sont
- introduits dans le tubegradu- centrifugs une seule foisen utilisant le temps et la
vitesse les plus levs.
chaque type dorganites se rpartit- sous forme dune bande spare- dans la zone de gradient de densit voisine ou gale
la sienne.
Coefficient de sdimentation
-
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- unit de vitesse de sdimentation (VS)dans un champs centrifuge
- est exprime en Svedberg(S)
- propre chaque organite cellulaire.Ex:
Ribosome procaryote : 70 S ;Ribosome eucaryote : 80 S.
-
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METHODES DETUDE DU
FONCTIONNEMENT CELLULAIRE
Culture cellulaire (1)
-
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Technique permettant demaintenir des cellulesvivanteshors de lorganisme(in vivo) dans des rcipients
de culture (in vitro)contenant des milieuxnutritifs (pour la
prolifration cellulaire) touten respectant les conditionsadquates de strilit, detemprature et de pH.
Kratinocytes en culture
Culture cellulaire (2)
-
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Technique*Prlvement dun fragment tissulaire vivant
*Digestion par une enzyme dissociant les cellulesex : trypsine, collagnase
*Numration cellulaire
*Addition dun milieu de culture (106cellules/10ml)
*Repiquage des cellules
Culture cellulaire (2)
Milieux de culture
liquides ou solides (gel)
-
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- liquides ou solides (gel)
- composition chimique de base : eau, sels minraux,
vitamines, acides amins ou protines, glucose,antibiotiques, srum de veau ftal(SVF) et facteurs decroissance.
Ex. de milieu de culture : MEM , RPMI 1640
Facteur de croissance
- petit peptide scrt par un tissu pour stimuler lacroissance, la multiplication et la diffrenciation de ses
cellules et ou des cellules dautrestissus- non vhicul par le sang et possde un rcepteurspcifique au niveau des cellules de ce tissu ; ex. :EGF, NGF (Epidermal Growth Factor, Nerve GrowthFactor).
Rcipients de culture
-
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- sont en verre ou en plastique(mono-usage).
- Exemples: les flacons, les
botes de Ptri, les tubes essai, les plaques de puits.
Microscope invers- La lumire arrive sur lchantillon
l h l d l
-
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par le haut: la source de lumireest place au-dessus de
lchantillon- Lobservationse fait par le dessus- les objectifs en dessous.
Cette configuration non-standard
dobservation peut tre adapte toutes les mthodes de microscopie(fluorescence, contraste de phase).
Utilisation du microscope inversCe microscope est utilis pour lobservationde cellules en culturein vitro, mais peut ltre en gnral pour observer des objetspaisou situs sur le fond de botes de culture.
Conditions de culture
Strilit : maximum en
-
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Strilit : maximum enutilisant une hotte flux
laminaire, des lampesUV germicides.
pH : 7 7, 4
Temprature : + 37C(tuve)
Ambiance : 95 % dairet 5 % de CO2 (tuve)qui permet le maintiendu pH.
-
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Comportement des cellules en culture (1)
Les cellules normales se divisent un certain
nombre de fois puis meurent (50 100 fois pourles cellules de la peau) alors que les cellulescancreuses sont immortelles in vitro; ellesconstituent des lignes cellulaires spciales.
Ex de lignes cellulaires communes et immortelles invitro :
-
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vitro :- souche Hla : cellules pithliales du col de
lutrusdHenriette Lacks dcde en 1953.- souche KB : carcinome oral humain- souche MRC-5 : poumon ftushumain.
Comportement des cellules en culture (2)
-
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LInhibition de Contact : proprit des
cellules normales in vitro et qui se manifestepar un arrt de leurs divisions lorsquellesconfluent(se touchent).
Marquage cellulaire (1)
-
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Marquage par les isotopes radioactifs (IR)
Les IR sont des corps naturels qui
- diffrent lgrement par la masse de leurs noyaux- ont le mme nombre dlectronspriphriques- sont instables- subissent des dsintgrations et des missions de particules
nergtiques ou radiations.
Les IR sont des traceurs du mtabolisme cellulaire. Ilspermettent de suivre la synthse dunemolcule donne dans lacellule.
Permet la dtection dune molcule cellulaire prcise aprs
marquage soit par des isotopes radioactifs soit par des anticorps.
Marquage cellulaire (2)
-
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Dtection des IR
Compteur Geiger : les radiations desIR ionisent un gaz qui se trouve danslappareil. La dtection se fait alors pardes bip Sonores.
Compteur scintillation ou
scintigraphe- permet la dtection visuelle desradiations des IR qui ionisent un liquidescintillant dans lappareil
- Il y a mission de petits clairslumineux.
- Autoradiographieou autohistoradiographie : permet dedtecter et de localiser les radiations des
IR sur des coupes histologiques.
Technique
Marquage cellulaire (3)
-
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Technique
- Injection de lIR lanimalou additionaux cellulesen culture
- Prlvement des intervalles varis (t0, t1, t2, ...) de cellules ayantintgres les IR
- Fixation et prparation des cellules pour le MOou pour le ME
- Application dunemulsion photographique sur les coupes
- Maintien des coupes lobscurit pendant une dure (des jours ou dessemaines) ncessaire la dsintgration des IR
Observationdes coupes au
- MO ou- ME (dpts sombres sur leszones de la coupe prsentantdes IR).
Marquage cellulaire (4)
-
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Explication :
- Lmulsionphotographiqueest compose de bromuredargent(Br-, Ag+).
- Les radiations mises parles IR rduisent les grainsde bromure dargent
invisibles en grains dargentvisibles au niveau de la zone