Outils biologiques hématologiques
• 1) Morphologie
• 2) Cytométrie en flux– immunophénotype– cycle cellulaire
• 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire
• 4) Biologie moléculaire
1) Morphologie
• Frottis sanguin
• myélogramme
• cytochimie
2) Cytométrie en flux• Technologie permettant de faire défiler des cellules à
grande vitesse dans le faisceau d ’un laser• la lumière ré émise (diffusion ou fluorescence)
permet de classer la population suivant différents critères et de les trier
• la lumière diffusée renseigne sur le contenu de la cellule (granularité)
• la lumière absorbée proportionnellement au diamètre de la cellule (taille)
• la fluorescence est apportée par un fluorochrome qui absorbe l ’énergie du laser et émet une fluorescence dans une longueur d ’onde différente– fluorochrome avec affinité pour l ’ADN (contenu en
ADN)– fluorochrome fixé sur un anticorps
Cytomètre en flux
• De 1 à 8 Ac incubés avec les cellules
Applications de la cytométrie en flux: 1) immunophénotypage
• Couplage d ’un fluorochrome sur un Ac• si l ’ Ac se fixe sur une cellule: mise en
évidence de l ’expression de l ’antigène• il existe une batterie de fluorochromes émettant
à des longueurs d ’onde différentes (couleurs)• les analyseurs peuvent étudier jusqu ’à 8
couleurs simultanément, donc 8 marqueurs potentiellement
• permet de déterminer la densité antigénique à la surface (ou intracytoplasmique) des cellules
Spécificité des marqueurs
• Marqueur pan-leucocytaire: CD45• cellules immatures: CD34, CD117, HLA-DR,
TdT• cellules myélo/monocytaires: CD13, CD33,
CD11b, CD15, CD65• lignée plaquettaire: CD4, CD61, CD42b• lymphocytes B: CD19, CD20, CD22, CD10• plasmocytes: CD38, CD138• lymphocytes T: CD3, CD4, CD8, CD5, CD2,
CD7• cellules NK: CD16, CD56, CD57
• Permet le diagnostic des formes pour lesquelles la morphologie seule est insuffisante:– cellules indifférenciées (blastes)– cellules lymphoïdes (score de Matutes)
• appartenance à une lignée• Évalue le degré de différenciation cellulaire• diagnostic des HPN (expression CD55 et CD59 sur GR et
PN)• étude des sous-populations lymphocytaires (CD4 / CD8)• sensibilité 1/1000: maladie résiduelle• recherche des cibles thérapeutiques:
– rituximab – Mabthera® (anti-CD20)– Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52)– gemtuzumab (anti-CD33)
Exemple d ’une leucémie lymphoïde chronique:
CD5+ CD19+ kappa
Applications de la cytométrie en flux: 2) Contenu en ADN
• Utilisation de précurseurs fluorescents des bases nucléaires s'incorporant dans le DNA – 5-bromo-deoxyuridine ou BrdU– 5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd
Cytogénétique
• Conventionnelle: caryotype
• moléculaire: – FISH– multi-FISH– peinture chromosomique
Cytogénétique: 1) Caryotype• réalisé sur sang, moelle ou ganglion• mise en culture de l’échantillon en milieu
nutritif (avec ou sans agents mitotiques)• durée variable 24H ou 48H, parfois 72H• blocage des métaphases• choc hypotonique des cellules: éclatement
de la membrane nucléaire• fixation étalement sur lame, coloration et
analyse au microscope: bandes chromosomiques
• au moins 20 métaphases analysées
ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS
CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN)
CONSEQUENCES MOLECULAIRES DESREMANIEMENTS
CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES
=>ACTIVATION D'ONCOGENES =>INACTIVATION DE GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR -(ANTIONCOGENES)
2) Cytogénétique moléculaire:FISH
• Hybridation in situ fluorescente (FISH)• Visualisation de la région chromosomique
couverte par la sonde: – à l ’échelle d ’un gène (qq dizaines de kilobases)– à l'échelle d ’un chromosome: peinture
chromosomique
• plusieurs couleurs possibles: permet de mettre en évidence des anomalies précises au niveau génomique: ex bcr-abl
Caryotype (cytogénétique conventionnelle)
IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1
Peinture chromosomique
Multi-FISH
Outils moléculaires: PCR +++
• PCR standard • PCR quantitative
sonde fluorescente
Place des analyses moléculaires
• A la différence du caryotype, chaque PCR ne détecte qu ’une et une seule anomalie
• intérêt: pas tant sur le diagnostic (cytogénétique) que sur le suivi: maladie résiduelle
• problème: plusieurs centaines d’anomalies caractérisées
• PCR développées sur les anomalies les plus fréquentes
• examens guidés par les données de la cytogénétique (partenaires de MLL par ex)
Fin du diaporama, des exemples suivent
Hémopathies lymphoides chroniques
LLCLLC
Manteau
Burkitt
L. Folliculaire L. Grandes cell
1) Hémopathies chroniques lymphoïdes B
Tous ont réarrangé leur Ig + anomalies spécifiques
Identification du réarrangement clonal IgH:
•Différentes familles de segments V•Différentes familles de segments J:Plusieurs types de PCR nécéssaires (séquences consensus)
•variabilité clonale
(mutations): absence de détection (10%)Perte du clone pendant l’évolution
LNH du manteau et expression de la cycline D1
• Non exprimée dans les lymphocytes normaux
• Conséquence moléculaire de la t(11;14)(q12; q32) (70% des cas au caryotype)
• Non spécifique du lymphome du manteau:– Leucémie
Prolymphocytaire B
– Myélome
– SLVL
CCND1CCND2CCND3
02-0
20
02-0
21
02-0
22
NE
G C
TR
LP
OS
CT
RL
Sa positivité (taux significatifs) élimine le diagnostic de LLC
Hémopathies lymphoïdes chroniques T: Détection des RR du TCR
• Chronologie des réarrangement TCR– TCR , puis TCR,
TCR en dernier
• Stratégies diagnostiques biologique: – Détection RR et
• Détection d’un clone T (minoritaire)– faux positif?– Clone Réactionnel?– Faible variabilité (V
gamma du sujet agé)Pas de translocations analysables par PCR
Intérêt de la bio. mol. au diagnostic
• 1) mise en évidence d ’une anomalie génétique– en cas de classification difficile:
• Mise en évidence d’une translocation spécifique– IgH-Bcl2, NPM-ALK, …
• Détection de l’expression anormale d’un gène– CCND1
– Point de départ pour l’étude de la maladie résiduelle
• 2) étude de la clonalité lymphoïde:– Étude du profil des réarrangements IgH/TCR
– doute sur une hyperplasie réactionnelle
– pathologies inflammatoires
Syndromes myéloprolifératifs
•LMC
•Splénomégalie myéloïde
•Maladie de Vaquez
•Thrombocytémie essentielle
•LMMC
•t(9;22)(q34;q11): fusion
entre extrémité 5’ de BCR
et 3’ d’ABL•Points de cassure:-dans ABL: intron 1 ou 2-dans bcr:
M-bcr: p210 (b2a2 b3a2)
m-bcr p190 (e1a2)
µ-bcr: p230 (e19a2)•Récemment:
- p200 (e8-int-a2)
Leucémie myéloïde chronique
Utilité de la biologie moléculaire dans la LMC
• Diagnostique (+/-) dans les formes complexes– SMP atypique cytologiquement
– Phi masqué (CG conventionnelle)
• Pronostique: quantification– cinétique de disparition du transcrit: pronostique?
– Maladie résiduelle
– nouvelles thérapeutiques (STI)
– greffes
Bio. Mol des autres syndromes méloprolifératifs
• Pas de marqueur clonal (cellules non lymphoïdes) <=> nouveau marqueur JAK2– >90% des polyglobulies primitives– 50% de TE et des MF
• Analyse de l ’inactivation de l ’X peu (pas) employée:– techniques lourdes– réalisables uniquement chez la femme– démontré dans 70% des cas de SMP– faux positifs 25-50% des femmes agées
Leucémies aigues
Lymphoblastiques
Myéloblastiques
LA myéloblastiques• Classification WHO:
– anomalies récurrentes: translocations +++
• t(15;17) (PML RARA) 5 - 8% / (LAM3)
• t(8;21) (AML1- ETO) 5 - 12% / (LAM2)
• inversion du 16 (CBF-MYH11) 10-12% (LAM4)
• anomalies du 11q23: MLL 5-6% (LAM0-5)
– Autres: classification FAB– + dysplasie– LA de lignée ambiguë
RT-PCRs spécifiques développées
LA lymphoblastiquesanomalies chromsomiques
(oncogéniques)• LAL-B
– t(9;22) BCR-ABL
– t(4;11) AF4- MLL
– t(5,14) IL3-IgH
• LAL-T– HOX11 / HOX11L2
– TAL deletion, SIL-TAL
– CALM-AF10
– t(1;19) E2A-PBX1
– t(8;14) cMyc-IgH
– t(12;21) ETV6-AML1
– t(11;14) LMO1/2
– t(1;7) LCK
– Inv14: TCL1
– …
LA lymphoblastiques : réarrangement clonal du récepteur à l ’Ag
• Lignée lymphoïde:– B: réarrangement IgH– T: réarrangement TCR
• Réarrangements illégitimes– Lignée B: réarrangements TCR+++
• = Marqueurs de clonalité, en dehors (ou en plus) d’anomalies détectables
Clonalité lymphoïde et LAL
• Pas d’intérêt diagnostique mais identification au diagnostic+++
• Suivi = maladie résiduelle = quantification– Genescan
– RQ-PCR
• Protocole GOELAL pilote:– Décisionnel à 10-3
Clonalité TCR